KR20230011935A - 아데노 연관 바이러스 입자 또는 아데노바이러스를 정제하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알킬디메틸아민 옥시드의 군으로부터 선택되는 세제를 사용하여, 세포를 용해시키고, 아데노-연관 바이러스 입자 또는 아데노바이러스 입자를 단리하고/하거나 정제하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 알킬디메틸아민 옥시드의 군으로부터 선택되는 세제를 사용하여, 세포를 용해시키고, 그에 따라 아데노-연관 바이러스 입자 또는 아데노바이러스를 정제하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
아데노-연관 바이러스 (AAV)를 비롯하여 아데노바이러스 (AdV)는 배양된 세포에서 시험관내에서 및 또한 생체내에서 유전자를 전달하기 위한 강력한 바이러스로서 특징규명되었고 개발되었다. AAV는 한편으로 유전자 요법의 생체내 전달을 위한 유력한 플랫폼이다. AdV는 유전자 요법을 위해서, 그리고 백신으로서 사용된다. AAV는 T-형상 2차 구조를 형성할 수 있고 게놈 복제 기원으로서 작용할 수 있는 2개 반전 말단 반복부 (ITR), 4개의 중복 복제 단백질, Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40을 코딩하는 하나의 rep 영역, 및 3개의 구조적 단백질, VP1, VP2, 및 VP3, 및 조립 활성화 단백질 (AAP)을 코딩하는 하나의 cap 영역으로 이루어진, 대략 4.7 kb의 단일 가닥 DNA 게놈을 함유하는 소형, 비-엔벨로프 바이러스이다. AAV 바이러스의 천연적으로 단리된 혈청형 1-9는 게놈 구조를 공유하지만 이들 혈청형은 상이한 조직 향성을 나타낼 수 있다. AAV는 비병원성인 듯하고, 효율적인 형질도입 및 안정한 발현을 나타내므로, 그들은 가장 유망한 유전자 전달 비히클 중 하나로 간주된다. 아데노바이러스 (AdV)는 이중 가닥 DNA 게놈을 함유하는 정이십면체 뉴클레오캡시드를 갖는 중간 크기의 비-엔벨로프 바이러스이다. 유전자 요법 및 백신 개발에 사용되는 대부분의 AdV는 혈청형 2 (Ad2) 및 5 (Ad5)로부터 유래된다.
AAV 벡터는 일시적 형질감염 또는 동시-감염 방법을 사용하여 부착 또는 현탁 세포 배양 형식으로 다양한 세포주에서 생산될 수 있다. 특별한 혈청형 및 생산 시간에 의존하여, 전체, 부분, 및 비어있는 종을 포함한 바이러스 입자는 세포로부터 배양 배지로 분비될 수 있거나 또는 다양한 비율로 세포 내부에 함유될 수 있다.
초기에, 안정한 AAV 생산 세포는 Rep 및 Cap을 함유하는 패키징 구성체 및 ITR 카세트를 함유하는 rAAV 전달 벡터로, 인간-유래 세포, 예컨대 HeLa 또는 HEK293 세포의 형질감염 및 선택을 통해서 생성되었다. 이후에 재조합 AAV 벡터 (rAAV)의 생산은 헬퍼 기능을 제공하는 보조 바이러스 예컨대 아데노바이러스 (AdV)로 감염을 통해서 획득되었다. AAV 벡터 패키징에 필요한 AdV 유전자의 확인 이후에, 헬퍼 바이러스-무함유 방법이 보조 바이러스 대신에 구축된 헬퍼 플라스미드를 포함하는 2개 또는 3개 플라스미드로 이루어진 이중 또는 삼중 형질감염 프로토콜을 사용하여 확립되었다. 이러한 시스템은 연구 및 약물 개발에서 광범위하게 사용된다. 또한, 배큘로바이러스 발현 벡터의 개발은 곤충 Sf9 세포에서 rAAV 바이러스를 생산하기 위한 다른 방법을 제공한다. 이들 상이한 기술은 실험실 및 임상 시험에서 사용을 위해 충분한 분량의 rAAV 바이러스를 생산할 수 있는 것으로 확인된다.
AdV 벡터는 또한 HEK293 또는 PER.C6 세포 또는 유도체에 의해 부착 또는 현탁 세포 배양 형태로 생산될 수 있다. 26 - 45 kb의 거대한 게놈 덕분에, 몇개 플라스미드로 필수 바이러스 유전자를 재구축하는 것은 실현불가능하였고, 재조합 AdV의 생산은 동일한 바이러스 벡터의 단일 감염에 의해 실현되었다.
세포 용해 단계는 일반적으로 상청액으로 바이러스 입자를 방출하기 위해 수확 시에 필요하다. 이러한 적용을 위해서, 전형적인 세포 용해 시약 예컨대 Triton X-100, Tween 20, 및 NaCl이 광범위하게 이용된다. 그러나, 일정 혈청형 (예를 들어, AAV2) 경우에, 바이러스 입자는 불용성 세포 성분과 단단하게 회합되는 경향이 있으므로, 바이러스 방출 관점에서 일정 세포 용해 시약의 효율을 제한한다.
바이러스, 특히 세포-회합된 바이러스를 방출하는 현행 방법은 종종 시간 소모적인데, 예컨대, 예를 들어, 물리적 용해 방법은 규모 확장이 어렵거나, 또는 원치않는 것을 유입시킬 수 있고 불순물, 예를 들어 Triton X-100을 제거하는 것이 어렵다. Triton X-100의 분해 산물은 옥틸페놀로서, 에스트로겐 효과가 입증된 생태독소이다. 그러므로, 세포를 용해하고 그들을 생산하는 세포로부터 AAV 및 AdV 같은 바이러스를 단리 및/또는 정제하기 위한 효과적인 시약 및 방법을 갖는 것이 바람직하고 그로써 방법은 생태학적으로 의심스러운 시약 사용을 필요로 하지 않아야 한다.
놀랍게도 본 발명자는 일정 그룹의 생태친화적 세제가 세포 회합된 바이러스를 방출시키는데 특히 적합하다는 것을 발견하였다. 소듐 클로라이드 같은 염과 조합하여 그들은 Triton X100을 사용하는 기지 과정에 비해서 훨씬 더 효과적이다.
따라서, 본 발명은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자 또는 아데노바이러스 입자를 내포한 세포를 용해시키기 위한 방법에 관한 것으로서,
세포 용해 및 세포로부터 AAV 입자의 방출을 촉진하기 위해서 상기 세포의 현탁액을 알킬디메틸아민 옥시드를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계에 의하고, 그리하여 바이러스 입자는 영향받지 않은 채로 유지된다.
전형적으로 이러한 용해 방법은 바이러스를 정제하기 위한 방법의 일부로서, 추가 단리 또는 정제 단계가 용해 단계 이외에도 수행된다.
본 발명은 또한 바이러스 입자를 내포한 세포를 포함하는 샘플로부터 아데노-연관 바이러스 (AAV) 또는 아데노바이러스 (AdV)의 바이러스 입자를 정제하기 위한 방법에 관한 것으로서,
a) 세포 용해 및 세포로부터 AAV 또는 AdV 입자의 방출을 촉진하기 위해 바이러스 입자 및 세포의 현탁액을 알킬디메틸아민 옥시드를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계, 및
b) AAV 또는 AdV 입자를 단리 및/또는 정제하는 단계에 의한다.
바람직한 구현예에서, 현탁액은 알킬디메틸아민 옥시드 및 염 예컨대 소듐 클로라이드를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉된다.
매우 바람직한 구현예에서 조성물은 LDAO (라우릴디메틸아민-N-옥시드) 및/또는 TDAO (테트라데실 디메틸아민-N-옥시드) 및 소듐 클로라이드 및/또는 포타슘 클로라이드를 포함한다. LDAO (라우릴디메틸아민-N-옥시드) 및/또는 TDAO (테트라데실 디메틸아민-N-옥시드) 및 소듐 클로라이드를 포함하는 조성물이 특히 바람직하다.
다른 바람직한 구현예에서, 단계 a)에서 세포는 30분 내지 180분, 바람직하게 60분 내지 90분 동안 조성물과 접촉된다.
다른 구현예에서 바이러스 입자는 AAV, 특히 AAV2 또는 AAV9 혈청형이다.
일 구현예에서 조성물은 알킬디메틸아민 옥시드 및 염 예컨대 소듐 클로라이드를 포함하는 수용액이다. 바람직하게, 조성물은 오직 물, 하나 이상의 알킬디메틸아민 옥시드, 소듐 클로라이드 및 임의로 완충제 성분만을 함유한다.
바람직한 구현예에서, 조성물 중 알킬디메틸아민 옥시드의 농도는 세포와의 혼합물 중 농도가 1% 내지 4% (w/w)가 되게 하는 것이다.
다른 바람직한 구현예에서 조성물 중 염 예컨대 소듐 클로라이드의 농도는 세포와의 혼합물 중 농도가 0.05 내지 1 mol/ℓ이 되게 하는 것이다.
일 구현예에서 단계 b)는 여과 또는 원심분리에 의해 수행된다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계 중 하나 이상을 포함한다:
- 청징화
- 여과
- 투석/ 한외여과
- 접선 유동 여과
- 뉴클레아제, 예를 들어 RNase 및/또는 DNase의 처리
- 클로로포름의 처리
- 이온 교환 크로마토그래피
- 친화성 크로마토그래피
- 소수성 상호작용 크로마토그래피
- 원심분리
- PEG 침전
본 발명은 또한 하나 이상의 알킬디메틸아민 옥시드 및 염 예컨대 소듐 클로라이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서 조성물은 5 내지 30% (w/w)의 TDAO 및/또는 LDAO 및 1 내지 6 mol/ℓ의 NaCl을 포함하는 수용액이다.
바람직한 구현예에서 조성물은 6 내지 9의 pH를 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 비롯하여 뉴클레아제를 포함하는 키트에 관한 것이다.
도 1은 단일 시약으로 세포 용해 후 AAV2 역가를 도시한다. 추가 상세사항은 실시예 1에서 확인할 수 있다.
도 2는 단일 및 이중 시약으로 세포 용해 후 AAV2 역가를 도시한다. 추가 상세사항은 실시예 2에서 확인할 수 있다.
도 3은 NaCl 및 NaCl/TDAO로 세포 용해 후 AAV2 게놈 역가를 도시한다. 추가 상세사항은 실시예 4에서 확인할 수 있다.
도 4는 게놈 역가 대 물리적 역가의 비율로서 전체 바이러스 입자 (vp)의 백분율을 도시한다. 추가 상세사항은 실시예 4에서 확인할 수 있다.
도 5는 단일 및 이중 시약으로 세포 용해 후 AAV9 역가를 도시한다. 추가 상세사항은 실시예 5에서 확인할 수 있다.
도 6은 게놈 역가 대 물리적 역가의 비율로서 전체 바이러스 입자 (vp)의 백분율을 도시한다. 추가 상세사항은 실시예 5에서 확인할 수 있다.
도 2는 단일 및 이중 시약으로 세포 용해 후 AAV2 역가를 도시한다. 추가 상세사항은 실시예 2에서 확인할 수 있다.
도 3은 NaCl 및 NaCl/TDAO로 세포 용해 후 AAV2 게놈 역가를 도시한다. 추가 상세사항은 실시예 4에서 확인할 수 있다.
도 4는 게놈 역가 대 물리적 역가의 비율로서 전체 바이러스 입자 (vp)의 백분율을 도시한다. 추가 상세사항은 실시예 4에서 확인할 수 있다.
도 5는 단일 및 이중 시약으로 세포 용해 후 AAV9 역가를 도시한다. 추가 상세사항은 실시예 5에서 확인할 수 있다.
도 6은 게놈 역가 대 물리적 역가의 비율로서 전체 바이러스 입자 (vp)의 백분율을 도시한다. 추가 상세사항은 실시예 5에서 확인할 수 있다.
바이러스 생산 세포를 용해시키는데 적합한 알킬디메틸아민 옥시드는 다양한 길이의 포화된 탄화수소 사슬에 커플링된 양친매성, 하전된 아민 옥시드이다. 바람직하게, 포화된 탄화수소 사슬의 길이는 8 내지 18개 탄소 원자이다. 바람직한 구현예에서, 알킬디메틸아민 옥시드는 디메틸데실아민옥시드, 디메틸운데실아민옥시드, 디메틸도데실아민옥시드 (LDAO), 디메틸트리데실아민옥시드 및 디메틸테트라데실아민옥시드 (TDAO)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
표 1은 선택된 알킬디메틸아민 옥시드의 성질을 표시한다.
이들 화합물은 바람직하게 그들의 임계 미셀 농도를 초과하는 농도에서 사용된다. 임계 미셀 농도 (CMC)는 미셀이 형성되고 시스템에 첨가된 모든 추가 세제가 미셀로 이동하는 세제 농도로서 정의된다. 소정 매질 중 소정 세제에 대한 CMC의 값은 온도, 압력, 및 (때로는 강력하게) 다른 표면 활성 물질 및 전해질의 존재 및 농도에 의존한다.
소듐 클로라이드 같은 염의 예는 금속 양이온 예컨대 K+, Na+, Li+, Mg2+, Ca2+ 및 음이온성 성분 예컨대 F-, SO4 2-, HPO4 2-, 아세테이트, Cl- 를 포함하는 염이다. 바람직하게는 단원자 이온을 포함하는 염이다. 특히 바람직한 것은 클로라이드 염 예컨대 소듐 클로라이드 및 포타슘 클로라이드이고, 소듐 클로라이드가 가장 바람직하다.
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 파보비리다에 (Parvoviridae) 과의 구성원이다. AAV 게놈은 대략 4.7 킬로베이스 (kb)를 함유하고, 비구조적 Rep (복제) 및 구조적 Cap (캡시드) 단백질을 코딩하는 2개의 주요 오픈 리딩 프레임으로 이루어진 선형 단일 가닥 DNA 분자로 구성된다. DNA 복제 개시 동안 프라이머로서 기능하는 헤어핀 구조로 폴딩될 수 있는 팔린드롬 서열이 개재된, 대략 145개 뉴클레오티드 길이인 2개의 시스-작용성 반전 말단 반복 (ITR) 서열이 AAV 코딩 영역에 측접된다. DNA 복제에서 그들 역할 이외에도, ITR 서열은 바이러스 통합, 숙주 게놈으로부터 구제, 및 성숙한 비리온으로 바이러스 핵산의 캡시드화에 필수적인 것으로 확인되었다 (Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158:97-129).
AAV의 다수 혈청형이 존재하고 다양한 조직 향성을 제공한다. 기지의 혈청형은 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11을 포함한다.
AAV로부터 유래된 벡터는 유전 물질 전달을 위해 특히 매력적인데 그들이 근육 섬유 및 뉴런을 포함한 다양한 비분열 및 분열 세포 유형을 감염 (형질도입)시킬 수 있고, 그들이 바이러스 구조적 유전자가 없어서, 바이러스 감염에 대한 천연 숙주 세포 반응, 예를 들어, 인터페론-매개 반응을 제거하기 때문이다. 또한, 야생형 바이러스는 인간에서 임의 병상과 연관된 적이 없다.
본 발명에 따라서, scAAV는 또한 AAV의 그룹 내에 존재한다. 자기-상보성 아데노-연관 벡터 (scAAV)는 유전자 요법에 사용을 위해 천연 발생 아데노-연관 바이러스 (AAV)로부터 조작된 바이러스 벡터이다. ScAAV는 코딩 영역이 분자내 이중-가닥 DNA 주형을 형성하도록 디자인되었기 때문에 "자기-상보성"이라고 한다.
따라서, 일부 구현예에서, "AAV"란 제한없이, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 및 AAV-11을 포함한, 아데노-연관 바이러스 혈청형으로부터 유래되는 벡터 또는 바이러스를 의미한다. AAV 벡터는 전체로 또는 부분이 결실된 하나 이상의 AAV 야생형 유전자, 예를 들어, rep 및/또는 cap 유전자를 가질 수 있지만, 기능성 측접 ITR 서열은 유지한다. 기능성 ITR 서열은 AAV 비리온의 구제, 복제, 및 패키징에 필수적이다. 따라서, AAV 벡터는 본 명세서에서 바이러스의 복제 및 패키징을 제공하는 적어도 그들 서열 (예를 들어, 기능성 ITR)을 포함하는 것으로 정의된다. ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열일 필요는 없고, 예를 들어, 서열이 기능성 구제, 복제 및 패키징을 제공하는 한, 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 통해서 변경될 수 있다. 일 구현예에서, 벡터는 AAV-2 유래 ITR을 갖는, AAV-9 벡터이다. 또한 "AAV"란, 표적 세포의 핵으로 벡터 핵산의 전달을 위해 효율적인 비히클을 제공하는, 단백질 쉘 또는 캡시드를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "AAV"는 또한 재조합 AAV를 포괄하고자 한다.
아데노바이러스 (AdV)는 중간 크기 (90-100 nm)의, 비-엔벨로프 (외부 지질 이중층없음) 바이러스로서, 이중 가닥 DNA 게놈을 함유하는 정이십면체 뉴클레오캡시드를 갖는다. 그들은 광범위한 척추동물 숙주를 가지며, 인간에서, 7개 종 (A-G)에 속하는 50개 초과의 별개 아데노바이러스 혈청형은 광범위한 질병을 초래하는 것으로 확인되었다. 재조합 AdV를 제조하고 그들을 적합한 숙주 세포에 패키징하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 그들은 외래 항원을 발현시키기 위해 백신 및 유전자 요법에 사용된다. 아데노바이러스 벡터는 복제-결함성일 수 있고, 일정한 필수 바이러스 유전자는 결실되고 외래 치료 유전자를 발현하는 카세트에 의해 대체된다. 복제-가능성 (종양용해성) 벡터는 암 유전자 요법에 적용된다. 종양용해성 벡터는 암 세포에서 우선적으로 복제하고 용해성 바이러스 복제의 천연 과정을 통해서 암 세포를 파괴하도록 조작된다. 많은 임상 시험은 복제-결함성 및 복제-가능성 아데노바이러스 벡터가 안전하고 치료적 활성을 갖는다고 시사한다.
아데노바이러스 (AdV) 및 아데노-연관 바이러스 (AAV)는 또한 본 명세서에서 바이러스, 바이러스 입자 또는 바이러스 벡터라고 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포" 또는 "세포주"는 시험관내에서 연속적으로 또는 지속적으로 성장 및 분열할 수 있는 단일 세포 또는 세포 개체군을 의미한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 용어 "HEK293 세포", "293 세포" 또는 그들의 문법적 균등어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고 본 명세서에 개시된 방법에서 사용되는 숙주/팩킹 세포주를 의미한다.
적합한 세포 및 세포주는 AAV 및 AdV의 생산에서 사용을 위해 기술되었다. 세포 자체는 원핵생물 (예를 들어, 박테리아) 세포 및 곤충 세포, 효모 세포 및 포유동물 세포를 포함한 진핵생물 세포를 포함한, 임의의 생물학적 유기체로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 숙주 세포는 제한없이, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 및 햄스터를 포함한 포유동물로부터 유래되는 A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, HEK 293 세포, Saos, C2C12, L 세포, HT1080, HepG2 및 초대 섬유아세포, 간세포 및 근아세포를 포함하는, 임의의 포유동물 종으로부터 선택된다.
일반적으로, 발현 카세트는 최소로, 5' AAV 반전 말단 반복 (ITR), 이의 발현을 유도하는 조절 서열에 작동적으로 연결된 바람직한 치료제, 면역원, 또는 항원을 코딩하는 핵산 서열, 및 3' AAV ITR로 구성된다. 일 구현예에서, AAV 혈청형 2의 5' 및/또는 3' ITR이 사용된다. 그러나, 다른 적합한 공급원으로부터의 5' 및 3' ITR이 선택될 수 있다. AAV 바이러스 또는 입자를 형성하도록 캡시드 단백질에 패키징되는 것이 이러한 발현 카세트이다.
발현 카세트 이외에도, 세포는 세포에서 AAV의 발현을 구동하는 서열 (cap 서열) 및 발현 카세트에서 발견되는 AAV ITR의 공급원 또는 교차-상보성 공급원과 동일한 공급원의 rep 서열을 함유한다. AAV cap 및 rep 서열은 상이한 AAV 부모 서열로부터 독립적으로 선택될 수 있고, 당업자에게 공지된 적합한 방식으로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 전체-길이 rep 유전자가 이용될 수 있지만, 이의 더 작은 단편, 즉 rep78/68 및 rep52/40은 AAV의 복제 및 패키징을 허용하기에 충분한 것으로 확인되었다.
세포는 또한 본 발명의 AAV를 패키징하기 위해서 헬퍼 기능을 요구한다. 임의로, 이들 헬퍼 기능은 헤르페스바이러스에 의해 공급될 수 있다. 다른 구현예에서, 필요한 헬퍼 기능은 각각 인간 또는 비-인간 영장류 아데노바이러스 공급원으로부터 제공되고, 예컨대 미국 생물자원 센터 (American Type Culture Collection) (ATCC) (Manassas, Va. (US))를 포함한, 다양한 공급원에서 입수가능하다.
완충액 또는 완충 용액은 pH 변화를 방지하기 위해 사용되는 일정 pH의 용액이다. 완충액의 예는 CO2/HCO3 (카보네이트), 포스페이트, HEPES, PIPES, ACES, BES, TES, MOPS 및 TRIS이다.
AAV의 제조 동안, 일부 캡시드는 임의의 이식유전자를 도입하지 않을 수 있고 빈 캡시드 또는 빈 AAV라고 한다. 추가로, 이식유전자의 단편을 함유하는 캡시드는 부분 캡시드 또는 부분 AAV라고 한다. 이들 비바람직한 생산물-관련 불순물은 바람직한 이식유전자의 전체 길이를 함유하는 전체 캡시드 또는 전체 AAV와 함께 생산된다. AdV에 대해 동일한 표현이 사용된다.
정제는 예를 들어 하나 이상의 불순물의 양을 제거하거나 또는 감소시켜서, 표적 분자, 이 경우에 AAV 또는 AdV의 순도를 증가시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "불순물" 또는 "오염물"은 정제하여서 하나 이상의 불순물로부터 분리하려는 바이러스 입자를 함유하는 샘플 중에 존재할 수 있는, 생물학적 거대분자 예컨대 DNA, RNA, 하나 이상의 숙주 세포 단백질, 핵산, 내독소, 지질, 합성 기원의 불순물 예컨대 세제, 부분 및/또는 빈 AAV 또는 AdV를 비롯하여 하나 이상의 첨가제를 포함한, 임의의 외래 또는 불쾌한 분자 또는 종을 의미한다.
생물반응기는 세포를 배양할 수 있는 임의의 용기 또는 탱크이다. 전형적으로 인큐베이션은 적합한 조건 예컨대 적합한 온도 등의 하에서, 세포의 성장/배양을 지원하는 적합한 배지에서 수행된다. 당업자는 세포의 성장/배양을 지원하거나 유지하기 위한 적합한 인큐베이션 조건을 알고 있다.
본 발명은 적어도 알킬디메틸아민 옥시드 기반 세제를 포함하는 일정 유형의 조성물이 세포를 용해하고 유리 바이러스 입자를 설정하는데 특히 적합하다는 발견을 기반으로 한다. AAV 또는 AdV 벡터는 일시적 형질감염, 감염 또는 동시-감염 방법을 사용하여 부착 또는 현탁 세포 배양 형식으로 다양한 세포주에서 생산될 수 있다. 특별한 혈청형 및 생산 시간에 의존하여, 전체, 부분, 및 빈 종을 포함한 바이러스 입자는 세포로부터 배양 배지로 분비될 수 있거나 또는 다양한 비율로 세포 내부에 함유될 수 있다. 세포 용해 단계는 일반적으로 상청액으로 바이러스 입자를 방출하기 위해 수확시에 필요하다. 때때로, 바이러스 입자는 바이러스 방출 관점에서 일정 세포 용해 시약의 효율을 제한하는 불용성 세포 성분과 단단하게 회합되는 경향이 있다.
알킬디메틸아민 옥시드는 단독으로 또는 염 예컨대 소듐 클로라이드와 조합하여 세포 용해 및 바이러스 입자의 단리 및/또는 정제를 촉진하는데 특히 적합한 것으로 확인되었다.
AAV 또는 AdV를 포함하는 세포의 생산은 당업자에게 공지되어 있다. 전형적으로, 선택된 세포는 적합한 조건 하에서 생물반응기 중에 적합한 배양 배지에서 확장된다. 세포는 부착 또는 현탁 배양으로서 성장될 수 있다. 예를 들어, HEK293 세포의 현탁 배양에서, 형질감염 전에 적합한 씨딩 개수는 mL 당 0.5 내지 1.1 e6 생존 세포이다.
형질도입에 적합한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 일 구현예에서, 세포는 예를 들어, 적절한 배지 중에서, rAAV 또는 AdV를 세포와 배합하고, 통상의 기술 예컨대 서던 블롯 및/또는 PCR을 사용하거나, 또는 선별 마커를 사용하여, 관심 DNA를 보유하는 세포에 대해 스크리닝하여 시험관내에서 형질도입시킬 수 있다.
형질감염은 제한없이, 예를 들어, 리포펙타민, 양이온 중합체 및 양이온 지질을 사용한, 리포펙션, 전기천공을 포함한, 당분야에 공지된 임의의 기술을 사용해 수행될 수 있다. 임의의 적합한 형질감염 매질이 사용될 수 있다. 형질감염 방법의 일 구현예에서, 부착 또는 현탁 인간 배아 신장(HEK293) 세포는 삼중 DNA 플라스미드 폴리에틸렌이민 (PEl) 공-침전으로 형질감염된다.
일 구현예에서, 본 개시는 AAV 또는 AdV 기반 바이러스 벡터를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 방법은 (i) 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계, (ii) AAV 입자를 생산할 수 있도록 플라스미드로 세포를 형질감염시키거나, 또는 동일한 AdV 입자를 증폭/생산하도록 AdV 벡터로 세포를 감염시키는 단계, (iii) 세포 용해 및 세포로부터 바이러스 입자의 방출을 촉진하기 위해서, 세포 및 바이러스 입자의 혼합물을 알킬디메틸아민 옥시드 및 임의로 염 예컨대 소듐 클로라이드를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계, iv) 바이러스 입자를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함한다.
형질감염 또는 감염 후 적합한 바이러스 생산 기간 이후에, 세포를 용해시키고 바이러스 입자를 수확한다. 일부 구현예에서, 세포는 세포 용해 과정을 개시하기 전에 생물반응기로부터 해리된다. 일부 구현예에서, 세포는 원위치에서 용해된다.
본 발명에 따라서, 용해를 위해서, 세포는 알킬디메틸아민 옥시드 및 임의로 염 예컨대 소듐 클로라이드를 포함하는 조성물과 접촉된다. 바람직하게, 용해 용액은 세포의 현탁액을 포함하는 생물반응기에 첨가되어서 세포 현탁액 및 조성물의 혼합물을 생성시킨다.
알킬디메틸아민 옥시드 및 임의로 염 예컨대 소듐 클로라이드를 포함하는 조성물, 및 세포를 포함하는 혼합물의 인큐베이션은 전형적으로 30분 내지 180분 동안, 바람직하게 60분 내지 90분의 인큐베이션 시간 동안 수행된다. 더 짧고 더 긴 시간이 또한 적절할 수 있다.
인큐베이션 동안 혼합물의 pH는 광범위한 범위로 다양할 수 있다. 예를 들어, pH 4 내지 pH 10일 수 있고, 전형적으로 pH 6 내지 pH 9이다.
인큐베이션 동안 혼합물의 온도도 역시 광범위하게 다양할 수 있다. 예를 들어, 20℃ 내지 37℃일 수 있다.
세포 용해 및 세포로부터 AAV 입자의 방출을 촉진하기 위한 알킬디메틸아민 옥시드를 포함하는 조성물의 유효량을 갖기 위해서, 알킬디메틸아민 옥시드의 농도는, 조성물이 세포 용해를 효과적으로 유도되게 하는 것이고, 상기 기술된 바와 같은 적합한 조건 하에서 조성물과 인큐베이션 이후에, 세포의 적어도 80%, 바람직하게 100%가 용해된다는 것을 의미한다. 이를 위해서, 세포와의 최종 혼합물 중 알킬디메틸아민 옥시드의 농도는 바람직하게 이의 CMC 초과이다. TDAO, N,N-디메틸트리데실아민 N-옥시드 경우에, 세포와 혼합물 중 농도는 전형적으로 0.1% 내지 5% (w/w), 바람직하게 1% (w/w) 내지 4% (w/w)이다. 전형적으로 첨가되는 조성물의 부피는 세포 배양물의 부피보다 작다.
결론적으로, 조성물 중 알킬디메틸아민 옥시드, 특히 TDAO의 적합한 농도는 10 내지 30% (w/w)이다. 세포 현탁액에 첨가하려는 조성물 중 염 예컨대 소듐 클로라이드의 적합한 농도는 1 내지 6 mol/ℓ, 전형적으로 대략 3 내지 5 mol/ℓ여서, 세포 현탁액과 혼합물 중 최종 농도는 0.05 내지 1 mol/ℓ이다.
바람직한 구현예에서, 단독 성분으로서 또는 NaCl과 혼합물로서, 사용되는 세제는 TDAO, N,N-디메틸트리데실아민 N-옥시드 및/또는 LDAO이다.
매우 바람직한 구현예에서, 조성물은 수용액이다. 또한 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다.
상기 정의된 바와 같은 조성물은 세포의 용해를 효과적으로 유도하고 특히 세포 및 세포 찌꺼기에 달라붙는 경향이 있는 바이러스 입자는 세포로부터 효과적으로 분리될 수 있는 것으로 확인되었다.
용해 조성물과 인큐베이션 이후에, 방출된 AAV 또는 AdV는 단리 및/또는 정제될 수 있다. 이것은 임의 방법으로 수행될 수 있다. 전형적으로, 여과 및/또는 원심분리를 포함하는 하나 이상의 방법 단계를 통해서 수행된다.
일 구현예에서 혼합물은 필터를 통해 여과되어서 거대 분자 오염물 및 세포 찌꺼기를 제거하지만 AAV는 그를 통해 통과되게 허용한다.
일 구현예에서, 방출된 바이러스 입자는 청징화를 사용하여 세포 배양 배지로부터 분리 및 정제될 수 있다. 청징화는 상대적으로 더 큰 성분 예컨대 용해된 세포 및/또는 불순물이 용액으로부터 제거되는 미세여과 과정일 수 있다. 청징화 필터는 심층 여과, 하전된 심층 여과, 및 유사한 미세여과 기술을 포함한다.
접선 유동 여과는 정제된 바이러스 입자의 혼합물을 농축하고, 염 및 단백질을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 접선 유동 여과 (TFF)는 일반적으로 용액 또는 액체 스트림이 여과막에 평행하게 흐르는 동안 표적 생산물 및/또는 불순물을 함유하는 용액의 여과 또는 정제를 위한 신속하고 효율적인 방법을 의미한다.
원심분리는 예를 들어 더 큰 입자 예컨대 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 저속 원심분리일 수 있다. 이것은 예를 들어 10000 내지 12000 g에서 10분 내지 30분 동안 수행될 수 있다. 방출된 바이러스 입자는 상청액에서 발견될 수 있다.
AAV의 단리 및/또는 정제는 전형적으로 하기 공정 단계 중 하나 이상을 포함한다:
- 청징화
- 여과
- 투석/ 한외여과
- 접선 유동 여과
- 뉴클레아제, 예를 들어 RNase 및/또는 DNase의 처리
- 클로로포름의 처리
- 이온 교환 크로마토그래피
- 친화성 크로마토그래피
- 소수성 상호작용 크로마토그래피
- 원심분리
- PEG 침전
일부 구현예에서, 뉴클레아제, 전형적으로 엔도뉴클레아제는 예를 들어 숙주 세포 DNA의 양을 감소시키기 위해 첨가된다. 이것은 용해 이전, 그 동안, 또는 그 이후에 생물반응기 중 혼합물에 직접적으로 첨가될 수 있다. 뉴클레아제는 DNA 및 RNA 둘 모두를 분해하는 것일 수 있다. 엔도뉴클레아제는 Benzonase(R) (EMD Millipore) 명칭 하에 판매되는 세라티아 마르세스센스 (Serratia marcescens) 유래의 유전자 조작된 엔도뉴클레아제이다.
다양한 구현예에서, 이온 교환 크로마토그래피는 추가 정제를 위해 적용된다. 이것은 예를 들어, 음이온 (AEX) 또는 양이온 교환 (CEX) 포획 크로마토그래피 단계일 수 있다. 이러한 단계는 예를 들어, 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 숙주 세포 지질로부터 바이러스를 분리시키기 위해 사용된다. 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피의 원리는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 샘플을 로딩하고 컬럼은 로딩 완충액으로 세척한다. 마지막으로, 용리 완충액을 사용하여 관심 샘플을 컬럼으로부터 용리하고, 샘플을 함유하는 분획을 수집한다.
다른 적합한 크로마토그래피 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피이다. 결합-용리 방식 대신에, 또한 통과 방식이 적합할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용한 AAV 또는 AdV의 침전이 또한 가능하다. 이를 위해서, PEG가 바이러스 샘플에 첨가된다. PEG의 분자량은 전형적으로 약 3.000 내지 약 15.000 g/mol이다. 침전 용액 중 PEG의 농도는 필요에 따라 조정될 수 있고, 예를 들어, 대략 5% (w/w)일 수 있다.
클로로포름은 지질을 용해시키고 풍부한 단백질을 불활성화시키기 위해 첨가될 수 있다. 바이러스 입자는 이후에 상 분리 및/또는 원심분리를 통해 분리될 수 있는 클로로포름에 의해 영향받지 않는다.
염 예컨대 소듐 클로라이드는 투석에 의해 바이러스 입자로부터 제거될 수 있다. 바이러스 함유 용액은 제거해야 하는 불순물에 의존하여 물 또는 다른 용액에 대해서 투석될 수 있다.
전형적인 AAV 정제 과정은 청징화, 농축, 및 접선 유동 여과를 사용하는 한외여과, 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 크로마토그래피 정제를 포함한다. 일부 과정에서, 초원심분리 및 농도구배 초원심분리는 크로마토그래피 대신에 또는 크로마토그래피에 추가로 사용된다. AAV 정제의 최종 단계는 전형적으로 적합한 부형제 완충 조성물로 농축 및 한외여과 및 멸균 여과를 포함한다.
본 발명은 또한 알킬디메틸아민 옥시드 및 소듐 클로라이드의 수용액을 포함하는 본 발명의 방법에서 사용하려는 조성물에 관한 것이다. 조성물 중 알킬디메틸아민 옥시드의 농도는 전형적으로 1% (w/w) 초과, 바람직하게 10% (w/w) 내지 30% (w/w)여서, 용해시키려는 세포를 포함하는 현탁액에 조성물이 첨가될 때, 알킬디메틸아민 옥시드의 최종 농도는 0.1% (w/w) 초과, 바람직하게 1 내지 4% (w/w)로 조정될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 사용되는 세제는 단일 성분으로서 또는 NaCl과의 혼합물로서, TDAO, N,N-디메틸트리데실아민 N-옥시드 및/또는 LDAO이다. 가장 바람직한 것은 NaCl과 TDAO의 혼합물이다.
매우 바람직한 구현예에서, 조성물은 수용액이다. 또한 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다.
조성물 중 염 예컨대 소듐 클로라이드의 농도는 전형적으로 1 내지 6 mol/ℓ, 바람직하게 대략 3 내지 5 mol/ℓ여서, 세포 현탁액과 혼합물 중 최종 농도는0.05 내지 1 mol/ℓ가 된다.
바람직한 구현예에서, 조성물은 오직 물, 하나 이상의 알킬디메틸아민 옥시드, 소듐 클로라이드 및/또는 포타슘 클로라이드 및 임의로 완충액으로만 제조된다.
본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물 및 뉴클레아제, 바람직하게 엔도뉴클레아제, 가장 바람직한 benzonase®을 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 전형적으로 2개 성분을 갖는, 2개 용기, 예를 들어, 병을 포함하지만, 또한 추가 성분 및 따라서 추가 용기를 더 포함할 수 있다.
실시예에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 방법은 매우 효율적이다. 본 발명의 방법을 사용하여, 세포의 적어도 80%, 가장 바람직하게 100%가 용해될 수 있는 한편 바이러스가 방출된다. 세포 용해는 예를 들어 현미경 영상화를 통해 검출될 수 있다. 본 발명의 용해 방법을 사용해 방출되는 바이러스 입자의 수는 Triton X100 또는 소듐 클로라이드 또는 심지어 이의 조합을 사용하여 방출되는 바이러스 입자의 수를 초과한다. 이것은 예상할 수 없었다. 본 발명의 방법 및 조성물은 세포와 단단하게 회합된 AAV 혈청형에 특히 적합하다.
예를 들어, 90분 동안, 모두 37℃에서, 0.5% Triton X-100 (T100) 또는 0.5 M NaCl을 사용하는 세포 용해 단계를 포함하는 AAV2 현탁 상류 과정에서, 유의하게 감소된 바이러스 역가가 관찰되었다 (도 1). 이와 대조적으로, 동일한 시간량 동안 0.5M 소듐 클로라이드 및 1% TDAO를 포함하는 용해 용액을 사용했을 때 훨씬 더 높은 바이러스 역가에 도달할 수 있었다 (도 2 참조).
본 발명의 다른 장점은 세포 용해 및 바이러스 방출에 사용되는 세제 및 임의로 염 예컨대 소듐 클로라이드는 접선 유동 여과를 사용해 제거될 수 있다는 것이다. 접선 유동 여과에서, 한외여과 막을 사용하여 바이러스 입자를 정제 및 농축시킬 수 있고 한외여과를 수행하여 세제를 제거할 수 있다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예를 통해서 더욱 예시되지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 및 하기에 인용되는 모든 출원, 특허, 및 공개물의 전체 개시를 비롯하여, 2020년 5월 14일 출원된 미국 가출원 제63/024,643호를 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 실제 적용을 나타낸다.
실시예 1 - 비교예
AAV2 현탁 상류 과정은 모두 37℃에서, 다양한 농도의 다양한 단일 시약, 예컨대 Triton X-100 (T100) 또는 TDAO 또는 0.5 M NaCl을 사용한 세포 용해 단계를 포함하여, 수행된다. 샘플은 용해 후에 상이한 시점에 5분 동안 ∼13000g에서 원심분리하였고, 상청액을 제거하고 분석을 위해 -70℃에 저장하였다. 물리적 역가는 제조사 프로토콜에 따라서 AAV2 적정 ELISA 키트 (Progen)를 사용하여 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA)를 통해 측정하였고, 게놈 역가는 전달 벡터 내 특별한 서열을 표적화하는 정량적 PCR (qPCR)로 측정하였다. 모든 시약 및 어세이 프로토콜은 달리 명시하지 않으면, MilliporeSigma에서 얻는다. 시험된 모든 조건 중에서, 0.5 M NaCl은 e10 vp/mL의 물리적 역가 및 e9 gc/mL 수준의 게놈 역가로 AAV2의 상당량을 방출할 수 있는 유일한 것이다 (도 1). 게다가, 모든 3개 단일 시약에 대해 용해 후 30분 내지 90분의 시간-의존적 효과, 및 양쪽 단일 세제에 대해 0.5% 내지 1%의 농도-의존적 효과가 관찰되었다 (도 1). 그러나, 어떠한 단일 시약도 전형적으로 e11 vp/mL의 물리적 역가 및 e10 gc/mL의 게놈 역가로 만족할만한 AAV 방출 수준을 보이지 않았다.
도 1에서, 각각의 막대는 2개 희석물 x 2개 어세이 웰 또는 3개 어세이 웰의 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차이다.
실시예 2
실시예 1과 동일한 과정이 수행되지만 NaCl은 상이한 세제와 배합된다.
0.5 M NaCl에 1% TDAO의 첨가는 AAV2 해리의 3-9배 증가를 촉진하였지만, 1% Triton X-100은 그렇지 않다는 것을 입증하였다 (도 2). 또한, 3시간의 더 긴 용해 시간은 90분의 더 짧은 시간과 비교하여 동등한 것으로 평가되었다 (도 2).
도 2에서, 각각의 막대는 2개 희석물 x 2개 어세이 웰 또는 3개 어세이 웰의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차이다.
실시예 3
실시예 1의 일반 절차에 따라 수행된 세포 용해를 상이한 시약으로 수행하였고 탁도 감소 및 용해 효율 관점에서 비교하였다. 특히, 1% TDAO 및 0.5 M NaCl의 조합은 단일 시약 - 0.5 M NaCl 또는 0.5% Triton X-100 단독과 비교하여 더 빠르고 더 완전한 세포 용해를 생성하였다. (표 2).
표 2에서 각각의 탁도는 1-3 생물반응기 x 2 측정의 평균이다. PT = 형질감염후. 용해 이후에, 탁도는 HEK293-유래 세포 경우에 ∼300-400 NTU였고 HEK293T-유래 세포 경우에 ∼500-600 NTU였다. 용해 이전 및 용해 후 30분에 ViCell XR을 통해서 세포 측정을 수행하였고, 세포 용해율 (%)은 용해된 세포 대 용해 전 전체 세포의 비율로서 계산되었다.
실시예 4
0.5 M NaCl과 조합한 TDAO의 최적 농도를 조사하기 위해서, 0 내지 4%의 TDAO를 사용하고 60분의 추가 용해 시간을 포함하여 AAV2 해리 시험을 수행하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 0.5 M NaCl에 TDAO의 첨가에 의해 AAV2 해리의 적어도 3-5배 증가가 이전처럼 확인되었고, 2% TDAO의 최적 농도를 0.5 M NaCl과 조합하여 확인하였다. 더 나아가서, 90분의 최고 용해 시간은 게놈 역가를 기반으로 이전처럼 확인하였다. 게놈 역가 대 물리적 역가의 비율로서 전체 바이러스 입자 (vp) %를 계산했을 때, 2% TDAO가 또한 알려지지 않은 기전 덕분에 용해 후 90분에 ∼100% 전체 VP로, 시간 경과에 따라 전체 바이러스 입자의 더 많은 방출을 촉진하는 것으로 확인되었다 (도 4).
도 3에서, 각각의 막대는 3개 어세이 웰의 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차이다. 도 4에서, 각각의 막대는 1회 실험의 오직 한 데이터를 나타낸다.
실시예 5
AAV9 현탁 상류 과정은 NaCl와 조합한 이중 시약 및 단일 시약 둘 모두를 사용하여, 실시예 1처럼 수행된다.
도 1의 AAV2 결과와 대조적으로, 단일 세제 TDAO 또는 Triton X-100은 0.5 M NaCl 단독과 비교하여 AAV9 해리를 2-5배 증강시켰다 (도 5). 그러나, 도 2의 AAV2 결과와 유사하게, 1% TDAO 및 0.5 M NaCl의 조합은 각각의 단일 시약과 비교하여 AAV9 해리의 2-17배 증가를 촉진하였지만, 1% TDAO와 비교하여 2% TDAO의 이중 시약 경우에 이득이 관찰되지 않았다 (도 5). 이들 결과는 AAV9 및 AAV2가 상이한 방식으로 상이한 세포 성분과 상호작용할 수 있지만, TDAO 및 NaCl의 조합은 이들 상이한 혈청형의 AAV 해리를 촉진할 수 있다는 것을 입증하였다. TDAO 및 NaCl의 조합이 단일 시약에 비해서 훨씬 더 높은 전체 VP%로, 전체 바이러스 입자의 훨신 많은 방출을 촉진하였다는 것은 또한 AAV2 및 AAV9 간에 일관적이다 (도 4 및 6). 그럼에도, 이러한 현상의 근본 기전은 현재 알려지지 않았다.
도 5에서, 각각의 막대는 2개 희석물 x 2개 어세이 웰 또는 3개 어세이 웰의 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차이다. 도 6에서, 각각의 막대는 1회 실험의 오직 한 데이터를 나타낸다.
Claims (15)
- 아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자 또는 아데노바이러스 (AdV) 입자를 내포한 세포를 용해시키기 위한 방법으로서, 세포 용해 및 세포로부터 AAV 또는 AdV 입자의 방출을 촉진시키기 위해 상기 세포의 현탁액을 알킬디메틸아민 옥시드를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계에 의한 것인 용해 방법.
- 바이러스 입자를 내포하는 세포를 포함하는 샘플로부터 아데노-연관 바이러스 (AAV) 또는 아데노바이러스 (AdV)의 바이러스 입자를 정제하기 위한 방법으로서,
a) 세포 용해 및 세포로부터 바이러스 입자의 방출을 촉진하기 위해 바이러스 입자 및 세포의 현탁액을 알킬디메틸아민 옥시드를 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계,
b) 바이러스 입자를 단리 및/또는 정제하는 단계
에 의한 것인 정제 방법. - 제2항에 있어서, 조성물은 LDAO (라우릴디메틸아민-N-옥시드) 및/또는 TDAO (테트라데실 디메틸아민-N-옥시드) 및 소듐 클로라이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 정제 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 단계 a)에서 세포는 조성물과 30분 내지 180분 동안 접촉되는 것을 특징으로 하는 것인 정제 방법.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 바이러스 입자는 재조합 아데노 연관 바이러스 (AAV) 입자인 것을 특징으로 하는 것인 정제 방법.
- 제2항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 a)에서 수득된 조성물의 유효량과 바이러스 입자 및 세포의 현탁액의 혼합물 중 알킬디메틸아민 옥시드의 농도는 1 내지 4% (w/w)인 것을 특징으로 하는 것인 정제 방법.
- 제2항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 a)에서 수득된 조성물의 유효량과 바이러스 입자 및 세포의 현탁액의 혼합물 중 K+, Na+, Li+, Mg2+, Ca2+ 으로부터 선택된 금속 양이온 및 F-, SO4 2-, HPO4 2-, 아세테이트, Cl- 로부터 선택된 음이온 성분을 포함하는 염의 농도는 0.05 내지 1 mol/ℓ인 것을 특징으로 하는 것인 정제 방법.
- 제2항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물은 알킬디메틸아민 옥시드 및 소듐 클로라이드를 포함하는 수용액인 것을 특징으로 하는 것인 정제 방법.
- 제2항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물 중 알킬디메틸아민 옥시드의 농도는 10% 내지 30% (w/w)인 것을 특징으로 하는 것인 정제 방법.
- 제2항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 조성물 중 소듐 클로라이드의 농도는 1 내지 6 mol/ℓ인 것을 특징으로 하는 것인 정제 방법.
- 제2항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 b)는 여과 및/또는 원심분리 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 정제 방법.
- 제2항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 본 발명의 방법은 하기 단계 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 정제 방법:
- 청징화 및 여과
- 투석 및 한외여과
- 뉴클레아제, 예를 들어 RNase 및/또는 DNase의 처리
- 클로로포름의 처리
- 이온 교환 크로마토그래피
- 친화성 크로마토그래피
- 소수성 상호작용 크로마토그래피
- 원심분리
- PEG 침전 - 하나 이상의 알킬디메틸아민 옥시드, 및 K+, Na+, Li+, Mg2+, Ca2+ 으로부터 선택된 금속 양이온 및 F-, SO4 2-, HPO4 2-, 아세테이트, Cl- 로부터 선택된 음이온 성분을 포함하는 염을 포함하는 조성물.
- 제11항에 있어서, 조성물은 10 내지 30% (w/w)의 TDAO 및/또는 LDAO 및 1 내지 6 mol/ℓ의 NaCl을 포함하는 수용액인 것을 특징으로 하는 것인 조성물.
- 제13항 또는 제14항에 따른 조성물 뿐만 아니라 뉴클레아제를 포함하는 키트.
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