CN115552020A - 用于纯化腺相关病毒颗粒或腺病毒的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于使用选自烷基二甲基氧化胺的去污剂裂解细胞并分离和/或纯化腺相关病毒颗粒或腺病毒颗粒的组合物和方法。

Description

用于纯化腺相关病毒颗粒或腺病毒的方法和组合物
技术领域
本发明涉及用于使用选自烷基二甲基氧化胺的去污剂裂解细胞并因此纯化腺相关病毒颗粒或腺病毒的组合物和方法。
背景技术
腺相关病毒(AAV)以及腺病毒(AdV)已经被表征并开发为体外在培养的细胞中递送基因以及体内递送基因的有效病毒载体。AAV同时是用于体内递送基因疗法的主要平台。AdV用于基因疗法以及用作疫苗。AAV是小的无包膜病毒，其含有大约4.7 kb的单链DNA基因组，由两个能够形成T形二级结构并充当基因组复制起点的反向末端重复(ITR)、一个编码四种重叠复制蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的rep区和一个编码三种结构蛋白VP1、VP2和VP3的帽区(cap region)以及装配激活蛋白(AAP)组成。AAV病毒的天然分离的血清型1-9共享基因组结构，尽管这些血清型可能显示不同的组织嗜性。由于AAV似乎是非致病的，显示出有效的转导和稳定的表达，所以它们被认为是最有前途的基因递送载体之一。腺病毒(AdV)是中等大小的无包膜病毒，具有含有双链DNA基因组的二十面体核衣壳。用于基因疗法和疫苗开发的大多数AdV来源于血清型2 (Ad2)和血清型5 (Ad5)。
AAV载体可以使用瞬时转染或共感染方法在多种细胞系中以贴壁或悬浮细胞培养形式产生。取决于具体的血清型和产生时间，包括完整、部分和空物类的病毒颗粒可以以各种比率从细胞中分泌进入培养基或包含在细胞内部。
最初，通过用含有ITR盒的rAAV转移载体和含有Rep和Cap的包装构建体转染和选择人源细胞(如HeLa或HEK293细胞)产生稳定的AAV生产细胞。然后通过用提供辅助功能的辅助病毒(如腺病毒(AdV))感染来实现重组AAV载体(rAAV)的产生。在鉴定AAV载体包装所需的AdV基因之后，使用由两个或三个质粒包括构建的辅助质粒而不是辅助病毒组成的双重或三重转染方案建立了无辅助病毒的方法。这种系统被广泛用于研究和药物开发。此外，杆状病毒表达载体的开发提供了在昆虫Sf9细胞中产生rAAV病毒的另一种方法。这些不同的技术已显示能够产生足量的rAAV病毒以便在实验室和临床试验中使用。
AdV载体也可以由HEK293或PER.C6细胞或衍生物以贴壁或悬浮细胞培养物形式产生。由于26-45 kb的大基因组，将必需病毒基因重新构建到几个质粒中是不可行的，并且通过相同病毒载体的单次感染已经实现了重组AdV的产生。
收获时通常需要细胞裂解步骤以将病毒颗粒释放到上清液中。对于这种应用，广泛使用典型的细胞裂解试剂，如Triton X-100、Tween 20和NaCl。然而，对于某些血清型(例如AAV2)，病毒颗粒倾向于与不溶性细胞组分紧密结合，因此限制了某些细胞裂解试剂在病毒释放方面的效率。
目前释放病毒、尤其是细胞相关病毒的方法通常是耗时的，例如像物理裂解法难以规模化，或者可能引入不想要的和难以去除的杂质，例如Triton X-100。Triton X-100的降解产物是辛基酚(一种具有已证实的雌激素作用的生态毒素)。因此，将有利的是，具有用以裂解细胞和从产生病毒(如AAV和AdV)的细胞中分离和/或纯化所述病毒的有效试剂和方法，其中所述方法将不必使用生态上有问题的试剂。
发明内容
发明人已经出乎意料地发现，某些群组的生态友好型去污剂特别适合释放细胞相关病毒。与盐(如氯化钠)组合，它们甚至比使用Triton X100的已知程序更有效。
因此，本发明涉及一种用于裂解包封腺相关病毒(AAV)颗粒或腺病毒颗粒的细胞的方法，所述方法通过以下步骤进行：使所述细胞的悬浮液与有效量的包含烷基二甲基氧化胺的组合物接触，以促进细胞裂解和所述AAV颗粒从所述细胞中释放，其中所述病毒颗粒保持不受影响。
典型地，这种裂解方法是用于纯化病毒的方法的一部分，在用于纯化病毒的方法中，除了裂解步骤之外还进行另外的分离或纯化步骤。
本发明还涉及一种用于从包含包封病毒颗粒的细胞的样品中纯化腺相关病毒(AAV)或腺病毒(AdV)的病毒颗粒的方法，所述方法通过以下步骤进行：
a) 使所述细胞和所述病毒颗粒的悬浮液与有效量的包含烷基二甲基氧化胺的组合物接触，以促进细胞裂解和从所述细胞中释放AAV或AdV颗粒，
b) 分离和/或纯化所述AAV或AdV颗粒。
在优选的实施方案中，使所述悬浮液与有效量的包含烷基二甲基氧化胺和盐(如氯化钠)的组合物接触。
在非常优选的实施方案中，所述组合物包含LDAO (月桂基二甲基胺-N-氧化物)和/或TDAO (十四烷基二甲基胺-N-氧化物)和氯化钠和/或氯化钾。尤其优选的是包含LDAO(月桂基二甲基胺-N-氧化物)和/或TDAO (十四烷基二甲基胺-N-氧化物)和氯化钠的组合物。
在另一个优选的实施方案中，在步骤a)中，使所述细胞与所述组合物接触30至180分钟、优选60至90分钟。
在另一个实施方案中，所述病毒颗粒是AAV，尤其是AAV2或AAV9血清型。
在一个实施方案中，所述组合物是包含烷基二甲基氧化胺和盐(如氯化钠)的水溶液。优选地，所述组合物仅含有水、一种或多种烷基二甲基氧化胺、氯化钠和任选地缓冲组分。
在优选的实施方案中，所述烷基二甲基氧化胺在所述组合物中的浓度使得在与所述细胞的混合物中的浓度在1%至4% (w/w)之间。
在另一个优选的实施方案中，所述组合物中的盐(如氯化钠)的浓度使得在与所述细胞的混合物中的浓度在0.05 mol/l至1 mol/l之间。
在一个实施方案中，步骤b)通过过滤或离心进行。
在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤中的一个或多个：
-澄清，
-过滤，
-透析/渗滤，
-切向流过滤，
-用核酸酶，例如RNA酶和/或DNA酶处理，
-用氯仿处理，
-离子交换色谱，
-亲和色谱，
-疏水相互作用色谱，
-离心，
-PEG沉淀。
本发明还涉及一种组合物，所述组合物包含一种或多种烷基二甲基氧化胺和盐(如氯化钠)。
在优选的实施方案中，所述组合物是包含5%至30% (w/w) TDAO和/或LDAO和1至6mol/l NaCl的水溶液。
在优选的实施方案中，所述组合物具有在6至9之间的pH。
本发明还涉及一种包含本发明的组合物以及核酸酶的试剂盒。
附图说明
图1示出了用单试剂进行细胞裂解之后的AAV2滴度。更多细节可以在实施例1中找到。
图2示出了用单试剂和双试剂进行细胞裂解之后的AAV2滴度。更多细节可以在实施例2中找到。
图3示出了用NaCl和NaCl/TDAO进行细胞裂解之后的AAV2基因组滴度。更多细节可以在实施例4中找到。
图4示出了完整病毒颗粒(vp)的百分比，其为基因组滴度与物理滴度的比率。更多细节可以在实施例4中找到。
图5示出了用单试剂和双试剂进行细胞裂解之后的AAV9滴度。更多细节可以在实施例5中找到。
图6示出了完整病毒颗粒(vp)的百分比，其为基因组滴度与物理滴度的比率。更多细节可以在实施例5中找到。
具体实施方式
适合裂解病毒生产细胞的烷基二甲基氧化胺是与不同长度的饱和烃链偶联的两亲性的、带电荷的氧化胺。优选地，所述饱和烃链的长度在8至18个碳原子之间。在优选的实施方案中，所述烷基二甲基氧化胺选自二甲基癸基氧化胺、二甲基十一烷基氧化胺、二甲基十二烷基氧化胺(LDAO)、二甲基十三烷基氧化胺和二甲基十四烷基氧化胺(TDAO)。
表1示出了所选的烷基二甲基氧化胺的特性。
化学名称 烷基链长度 CAS MW g/mol CMC * mM CMC wt% 在28天内生物降解
N,N-二甲基辛基胺N-氧化物 C8 2605-78-9 173,3 150 2,60 100%
N,N-二甲基癸基胺N-氧化物 C10 2605-79-0 201,35 15 0,30 97%
N,N-二甲基十二烷基胺N-氧化物 同义词：月桂基二甲基氧化胺(LDAO) C12 1643-20-5 229,40 1,7 0,039 95%
N,N-二甲基十四烷基胺N-氧化物(TDAO) C14 3332-27-2 257,46 0,268 0,0069 88%
N,N-二甲基十六烷基胺N-氧化物 C16 7128-91-8 285,52 0,025 0,00071 <88%
N,N-二甲基十八烷基胺N-氧化物 C18 2571-88-2 313,56
表1
这些化合物优选以高于其临界胶束浓度的浓度使用。临界胶束浓度(CMC)定义为去污剂的浓度，高于所述浓度时胶束形成并且所有添加到系统中的另外去污剂都进入胶束。给定介质中给定去污剂的CMC值取决于温度、压力，并且(有时强烈地)取决于其他表面活性物质和电解质的存在和浓度。
盐(如氯化钠)的实例是包含金属阳离子如K+、Na+、Li+、Mg2+、Ca2+和阴离子组分如F-、SO4 2-、HPO4 2-、乙酸根、Cl-的盐。优选的是包含单原子离子的盐。特别优选的是氯化物盐，如氯化钠和氯化钾，其中氯化钠是最优选的。
腺相关病毒(AAV)是细小病毒科的成员。AAV基因组由线性单链DNA分子构成，所述线性单链DNA分子含有大约4.7千碱基(kb)并且由编码非结构Rep(复制)蛋白和结构Cap(衣壳)蛋白的两个主要开放阅读框组成。侧接AAV编码区的是两个顺式作用的反向末端重复(ITR)序列，长度为大约145个核苷酸，具有间断的回文序列，所述回文序列可以折叠成发夹结构，在DNA复制起始期间充当引物。除了它们在DNA复制中的作用外，已经显示ITR序列还是病毒整合、从宿主基因组中拯救以及将病毒核酸衣壳化成成熟病毒体所必需的(Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158:97-129)。
存在多种血清型的AAV并且它们提供不同的组织嗜性。已知的血清型包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11。
来源于AAV的载体对于递送遗传物质特别有吸引力，因为它们能够感染(转导)多种多样的非分裂细胞类型和分裂细胞类型(包括肌纤维和神经元)，并且它们缺乏病毒结构基因，从而消除了对病毒感染的天然宿主细胞应答，例如干扰素介导的应答。此外，野生型病毒从未与人类的任何病理相关。
根据本发明，scAAV也在AAV组内。自身互补的腺相关病毒载体(scAAV)是从天然存在的腺相关病毒(AAV)工程化的用于基因疗法的病毒载体。ScAAV被称为“自身互补的”，因为编码区已被设计用于形成分子内双链DNA模板。
因此，在一些实施方案中，“AAV”意指来源于腺相关病毒血清型的载体或病毒，包括而不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10和AAV-11。AAV载体可以具有整体或部分缺失的AAV野生型基因中的一种或多种(例如，rep和/或cap基因)，但保留了功能性侧翼ITR序列。功能性ITR序列是AAV病毒粒子的拯救、复制和包装所必需的。因此，AAV载体在本文中定义为至少包含为病毒的复制和包装而提供的那些序列(例如，功能性ITR)。ITR不需要是野生型核苷酸序列，并且可以例如通过核苷酸的插入、缺失或取代而改变，只要所述序列提供功能性拯救、复制和包装即可。在一个实施方案中，所述载体是AAV-9载体，其具有AAV-2来源的ITR。“AAV”也指蛋白质壳或衣壳，其提供了将载体核酸递送到靶细胞的细胞核的有效载体。
如本文所用的术语“AAV”旨在还涵盖重组AAV。
腺病毒(AdV)是中等大小(90-100 nm)的、无包膜(没有外部脂双层)病毒，其具有含有双链DNA基因组的二十面体核衣壳。它们具有广泛的脊椎动物宿主；在人类中，已经发现了超过50种不同的腺病毒血清型(属于七个物类(A-G))引起广泛的疾病。
制备重组AdV并将其包装到合适的宿主细胞中的方法是本领域已知的。它们用于基因疗法并且用作疫苗以表达外源抗原。腺病毒载体可以是复制缺陷型的；某些必需病毒基因被缺失并被表达外源治疗基因的盒所替代。将可复制型(溶瘤)载体用于癌症基因疗法。溶瘤载体经工程化以在癌细胞中优先复制并通过裂解病毒复制的天然过程破坏癌细胞。许多临床试验表明，复制缺陷型腺病毒载体和可复制型腺病毒载体是安全的并且具有治疗活性。
腺病毒(AdV)和腺相关病毒(AAV)在此也被称为病毒、病毒颗粒或病毒载体。
如本文所用，术语“细胞”或“细胞系”是指能够在体外连续或长时间生长和分裂的单细胞或细胞群。在一些实施方案中，例如术语“HEK293细胞”、“293细胞”或其语法等同物在此可互换使用，并且是指用于本文公开的方法中的宿主/包装细胞系。
已经描述了用于产生AAV和AdV的合适细胞和细胞系。所述细胞本身可以选自任何生物有机体，包括原核(例如，细菌)细胞和真核细胞(包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞)。特别合意的宿主细胞选自任何哺乳动物物种，包括而不限于A549、WEHI、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、WI38、HeLa、HEK 293细胞、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2和衍生自包括人类、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠的哺乳动物的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。
通常，表达盒至少由5' AAV反向末端重复(ITR)、编码合意的治疗剂、免疫原或抗原的核酸序列和3' AAV ITR构成，所述核酸序列与指导其表达的调控序列可操作地连接。在一个实施方案中，使用AAV血清型2的5' ITR和/或3' ITR。然而，可以选择来自其他合适来源的5' ITR和3' ITR。正是这种表达盒被包装到衣壳蛋白中形成AAV病毒或颗粒。
除了表达盒外，所述细胞还含有驱动细胞中AAV表达的序列(cap序列)和具有与表达盒中见到的AAV ITR来源相同的来源或交叉互补来源的rep序列。AAV cap和rep序列可以独立地选自不同的AAV亲本序列，并且被以本领域技术人员已知的合适方式引入宿主细胞中。虽然可以使用全长rep基因，但是已经发现其较小的片段(即，rep78/68和rep52/40)足以允许AAV的复制和包装。
所述细胞还需要辅助功能以便包装本发明的AAV。任选地，这些辅助功能可以由疱疹病毒提供。在另一个实施方案中，必需的辅助功能各自从人类或非人灵长类腺病毒来源提供，诸如可从多种来源获得，包括美国典型培养物保藏中心(ATCC), Manassas, Va.(US)。
缓冲液或缓冲溶液是用于防止pH改变的具有一定pH的溶液。缓冲液的实例是CO2/HCO3 (碳酸盐)、磷酸盐、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPS和TRIS。
在制造AAV期间，一定百分比的衣壳可能未掺入任何转基因，并且被称为空衣壳或空AAV。另外，含有转基因的片段的衣壳被称为部分衣壳或部分AAV。这些不合意的产物相关杂质与含有所需转基因的全长的全衣壳或全AAV共同产生。相同的措辞可以用于AdV。
纯化意指例如通过去除或减少一种或多种杂质的量来增加靶分子(在这种情况下，AAV或AdV)的纯度。
如本文所用的术语“杂质”或“污染物”是指任何外来的或有害的分子或物类，包括生物大分子，如DNA、RNA、一种或多种宿主细胞蛋白质、核酸、内毒素、脂质、合成起源的杂质如去污剂、部分和/或空的AAV或AdV以及一种或多种添加剂，所述添加剂可能存在于含有待纯化并因此有待与一种或多种杂质分离的病毒颗粒的样品中。
生物反应器是可以在其中培养细胞的任何容器或罐。典型地在合适的条件(如合适的温度等)下且用支持细胞生长/培养的合适培养基进行培养。本领域技术人员知道用于支持或维持细胞生长/培养的合适培养条件。
本发明基于以下发现：至少包含基于烷基二甲基氧化胺的去污剂的某种类型的组合物尤其适合裂解细胞和使病毒颗粒游离。AAV或AdV载体可以使用瞬时转染、感染或共感染方法在多种细胞系中以贴壁或悬浮细胞培养形式产生。取决于具体的血清型和产生时间，包括完整、部分和空物类的病毒颗粒可以以各种比率从细胞中分泌进入培养基或包含在细胞内部。收获时通常需要细胞裂解步骤以将病毒颗粒释放到上清液中。有时，病毒颗粒倾向于与不溶性细胞组分紧密结合，这限制了某些细胞裂解试剂在病毒释放方面的效率。
已经发现烷基二甲基氧化胺单独或与盐(如氯化钠)组合尤其适合促进细胞裂解和病毒颗粒的分离和/或纯化。
包含AAV或AdV的细胞的产生是本领域技术人员已知的。典型地，在生物反应器中在合适的条件下在合适的培养基中扩增选择的细胞。所述细胞可以作为贴壁或悬浮培养物生长。例如，在HEK293细胞的悬浮培养物中，转染前的合适接种数量是0.5至1.1 e6个活细胞/ml。
合适的转导方法是本领域已知的。在一个实施方案中，可以通过例如在合适的培养基中组合rAAV或AdV与细胞和使用常规技术(如Southern印迹和/或PCR)或通过使用可选择的标记物筛选携带目标DNA的那些细胞来体外转导细胞。
转染可以使用本领域已知的任何技术进行，所述技术包括但不限于电穿孔、脂质转染，例如用lipofectamine、阳离子聚合物和阳离子脂质。可以使用任何合适的转染培养基。在转染方法的一个实施方案中，用三重DNA质粒聚乙烯亚胺(PEl)共沉淀转染贴壁或悬浮人胚肾(HEK293)细胞。
在实施方案中，本公开提供了一种用于制造基于AAV或AdV的病毒载体的方法，其包括以下步骤：(i) 在生物反应器中培养细胞，(ii) 用质粒转染所述细胞以使得能够产生AAV颗粒，或用AdV载体感染所述细胞以扩增/产生相同的AdV颗粒，(iii) 使所述细胞和所述病毒颗粒的混合物与有效量的包含烷基二甲基氧化胺和任选地盐(如氯化钠)的组合物接触，以促进细胞裂解和病毒颗粒从所述细胞的释放，iv) 分离和/或纯化所述病毒颗粒。
在转染或感染后的合适病毒产生期之后，将细胞裂解并收获病毒颗粒。在一些实施方案中，在细胞裂解过程开始之前，将细胞从生物反应器中解离。在一些实施方案中，将所述细胞原位裂解。
根据本发明，为了裂解，使所述细胞与包含烷基二甲基氧化胺和任选地盐(如氯化钠)的组合物接触。优选地，将裂解溶液添加到包含细胞悬浮液的生物反应器中，从而产生细胞悬浮液和组合物的混合物。
包含细胞和含有烷基二甲基氧化胺和任选地盐(如氯化钠)的组合物的混合物的孵育典型地进行30至180分钟，优选在60分钟至90分钟之间的孵育时间。更短和更长的时间也可以是合适的。
在孵育期间混合物的pH可以在宽范围内变化。例如，其可以在pH 4至pH 10之间，典型地在pH 6至pH 9之间。
孵育期间混合物的温度也可以在宽范围内变化。例如，其可以在20℃至37℃之间。
为了获得有效量的包含烷基二甲基氧化胺的组合物以促进细胞裂解和AAV颗粒从细胞中释放，所述组合物中烷基二甲基氧化胺的浓度使得其有效地诱导细胞裂解，意味着在如上所述的合适条件下与组合物一起孵育之后，至少80%、优选100%的细胞被裂解。为此，在与细胞的最终混合物中烷基二甲基氧化胺的浓度优选高于其CMC。对于TDAO (N,N-二甲基十三烷基胺N-氧化物)，在与细胞的混合物中的浓度典型地在0.1%至5% (w/w)之间、优选在1% (w/w)至4% (w/w)之间。典型地，添加的组合物的体积小于细胞培养物的体积。
因此，烷基二甲基氧化胺、尤其是TDAO在组合物中的合适浓度在10%至30% (w/w)之间。在待添加到细胞悬浮液中的组合物中盐(如氯化钠)的合适浓度在1 mol/l至6 mol/l之间，典型地为约3至5 mol/l，使得在与细胞悬浮液的混合物中的最终浓度在0.05 mol/l至1 mol/l之间。
在优选的实施方案中，所用的去污剂是TDAO (N,N-二甲基十三烷基胺N-氧化物)和/或LDAO，它们作为单一组分或作为与NaCl的混合物。
在非常优选的实施方案中，所述组合物是水溶液。其还可以包含一种或多种缓冲液。
已经发现，如上定义的组合物有效地诱导细胞的裂解，并且尤其是可以将倾向于粘附到细胞和细胞碎片的病毒颗粒与细胞有效地分离。
在与裂解组合物一起孵育之后，随后可以分离和/或纯化释放的AAV或AdV。这可以用任何方法来进行。典型地，其通过包括过滤和/或离心的一个或多个方法步骤来进行。
在一个实施方案中，通过过滤器过滤混合物，所述过滤器去除大分子污染物和细胞碎片，但允许AAV穿过。
在一个实施方案中，可以使用澄清从细胞培养基中分离和纯化释放的病毒颗粒。澄清可以是微滤过程，其中从溶液中去除相对较大的组分，如裂解的细胞和/或杂质。澄清过滤器包括深层过滤、荷电深层过滤和类似的微滤技术。
切向流过滤可以用于浓缩纯化的病毒颗粒的混合物并去除盐和蛋白质。切向流过滤(TFF)是指用于过滤或纯化含有目标产物和/或杂质的溶液的通常快速且有效的方法，在此期间溶液或液体流平行于过滤膜流动。
离心可以是例如低速离心以去除较大的颗粒如细胞碎片。这可以例如在10000 g至12000 g下进行10至30分钟。释放的病毒颗粒可以在上清液中见到。
AAV的分离和/或纯化典型地包括以下工艺步骤中的一个或多个：
-澄清，
-过滤，
-透析/渗滤，
-切向流过滤，
-用核酸酶，例如RNA酶和/或DNA酶处理，
-用氯仿处理，
-离子交换色谱，
-亲和色谱，
-疏水相互作用色谱，
-离心，
-PEG沉淀。
在一些实施方案中，添加核酸酶(典型地内切核酸酶)，例如以减少宿主细胞DNA的量。可以在裂解之前、同时或之后将其直接添加到生物反应器中的混合物中。所述核酸酶可以是降解DNA和RNA两者的核酸酶。在一个实施方案中，所述内切核酸酶是来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的基因工程化内切核酸酶，其以名称Benzonase(R) (EMDMillipore)出售。
在各种实施方案中，应用离子交换色谱进行进一步纯化。这可以是例如阴离子交换(AEX)或阳离子交换(CEX)捕获色谱步骤。使用这一步骤例如以将宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、宿主细胞脂质、去污剂和其他过程相关杂质与病毒颗粒分离。阳离子交换色谱和阴离子交换色谱的原理是本领域熟知的。加载样品并用加载缓冲液洗涤柱。最后，使用洗脱缓冲液将目标样品从柱上洗脱下来，并收集含有样品的级分。
其他合适的色谱方法是疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱或亲和色谱。代替结合-洗脱模式，流通模式也可以是合适的。
用聚乙二醇(PEG)沉淀AAV或AdV也是可能的。为此，将PEG添加到病毒样品中。所述PEG的分子量典型地为约3,000 g/mol至约15,000 g/mol。可以根据需要调节沉淀溶液中PEG的浓度，其可以例如为约5% (w/w)。
可以添加氯仿以溶解脂质并使大量的蛋白质失活。病毒颗粒不受氯仿的影响，氯仿随后可以通过相分离和/或离心分离。
可以通过透析从病毒颗粒中去除盐(如氯化钠)。可以将含病毒的溶液对于水或其他溶液透析，这取决于要去除的杂质。
典型的AAV纯化方法包括澄清、浓缩和使用切向流过滤的渗滤、通过使用亲和色谱和离子交换色谱进行的色谱纯化。在一些方法中，超速离心和梯度超速离心代替色谱使用或除色谱法之外使用。AAV纯化中的最终步骤典型地包括浓缩和渗滤到合适的赋形剂缓冲液组合物中，并无菌过滤。
本发明还涉及一种用于本发明方法的组合物，所述组合物包含烷基二甲基氧化胺和氯化钠的水溶液。在所述组合物中烷基二甲基氧化胺的浓度典型地高于1% (w/w)、优选在10% (w/w)至30% (w/w)之间，使得当将组合物添加到包含待裂解细胞的悬浮液中时，可以将烷基二甲基氧化胺的最终浓度调节到高于0.1% (w/w)、优选在1%至4% (w/w)之间。
在优选的实施方案中，所用的去污剂是TDAO (N,N-二甲基十三烷基胺N-氧化物)和/或LDAO，它们作为单一组分或作为与NaCl的混合物。最优选TDAO与NaCl的混合物。
在非常优选的实施方案中，所述组合物是水溶液。其还可以包含一种或多种缓冲液。
在所述组合物中盐(如氯化钠)的浓度典型地在1 mol/l至6 mol/l之间、优选为约3至5 mol/l，使得在与细胞悬浮液的混合物中的最终浓度在0.05 mol/l至1 mol/l之间。
在优选的实施方案中，所述组合物仅由水、一种或多种烷基二甲基氧化胺、氯化钠和/或氯化钾和任选地缓冲液制成。
本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的本发明的组合物和核酸酶，优选核酸内切酶，最优选benzonase®。所述试剂盒典型地包括具有所述两种组分的两个容器，例如瓶子，但其还可以包括另外的组分，并因此包括另外的容器。
如从实施例可以看出，本发明的方法非常有效。使用本发明的方法，可以裂解至少80%、最优选100%的细胞，同时释放病毒。细胞裂解可以例如经由显微镜成像检测。用本发明的裂解方法释放的病毒颗粒的数目超过通过使用Triton X100或氯化钠或甚至其组合释放的病毒颗粒的数目。这是预料不到的。本发明的方法和组合物尤其适合与细胞紧密结合的AAV血清型。
例如，在AAV2悬浮液上游方法中，其包括使用0.5% Triton X-100 (T100)或0.5 MNaCl持续90 min的细胞裂解步骤，两者均在37℃下，观察到显著降低的病毒滴度(图1)。与此形成对照，当使用包含0.5 M氯化钠和1% TDAO的裂解溶液持续相同的时间量时，可以达到高得多的病毒滴度(参见图2)。
本发明的另一个优势在于可以使用切向流过滤去除用于细胞裂解和病毒释放的去污剂和任选地盐(如氯化钠)。在切向流过滤中，可以使用超滤膜来纯化和浓缩病毒颗粒，并进行渗滤以去除去污剂。
通过以下附图和实施例进一步说明本发明，然而，本发明不限于此。
上面和下面引用的所有申请、专利和出版物以及在2020年5月14日提交的美国临时专利申请63/024,643的全部公开内容通过引用特此并入。
实施例
以下实施例代表本发明的实际应用。
实施例1-比较例
进行AAV2悬浮液上游方法，其包括使用各种浓度的各种单试剂(如Triton X-100(T100)或TDAO)或0.5 M NaCl的细胞裂解步骤，全部在37℃下。将样品在裂解后的不同时间点在约13000 g下离心5 min，并且将上清液移出并储存在-70℃下以供测定。使用AAV2滴定ELISA试剂盒(Progen)按照制造商的方案通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量物理滴度，通过靶向转移载体内的特定序列的定量PCR (qPCR)测量基因组滴度。除非另有说明，否则所有试剂和测定方案均来自MilliporeSigma。在所有测试的条件中，0.5 M NaCl是唯一能够以e10 vp/mL的物理滴度和e9 gc/mL水平的基因组滴度释放显著量的AAV2的试剂(图1)。此外，已经观察到，对于所有3种单试剂，在裂解后30 min至90 min的时间依赖性效应，以及对于两种单一去污剂，0.5%至1%的浓度依赖性效应(图1)。但是，没有一种单试剂显示出典型地以e11 vp/mL的物理滴度和e10 gc/mL的基因组滴度的令人满意的AAV释放水平。
在图1中，每一条代表2份稀释液×2个测定孔或3个测定孔的平均值，并且误差条是标准偏差。
实施例2
进行与实施例1相同的方法，但NaCl与不同的去污剂组合。
证明了向0.5 M NaCl中添加1% TDAO而不是1% Triton X-100促进AAV2解离增加到3-9倍(图2)。此外，与90 min的较短时间相比，3 h的较长裂解时间被评价为是等效的(图2)。
在图2中，每一条代表2份稀释液×2个测定孔或3个测定孔的平均值，并且误差条是标准偏差。
实施例3
将根据实施例1的一般程序进行的细胞裂解用不同的试剂进行，并在浊度降低和裂解效率方面进行比较。值得注意地，与单试剂-0.5 M NaCl或仅0.5% Triton X-100相比，1% TDAO和0.5 M NaCl的组合产生更快和更完全的细胞裂解(表2)。
Figure 366604DEST_PATH_IMAGE001
表2
表2中的每个浊度是1-3个生物反应器×2个测量值的平均值。PT = 转染后。在裂解之前，HEK293衍生细胞的浊度为约300-400 NTU并且HEK293T衍生细胞的浊度为约500-600 NTU。在裂解前和裂解后30 min时通过ViCell XR进行细胞计数，并且将细胞裂解%计算为裂解细胞与裂解前总细胞的比率。
实施例4
为了研究与0.5 M NaCl组合的TDAO的最佳浓度，进行使用0%至4% TDAO并包括另外60 min的裂解时间的AAV2解离试验。如图3中所示，如前所述，证实了通过将TDAO添加到0.5 M NaCl中使AAV2解离增加到至少3-5倍，并且鉴定出与0.5 M NaCl组合的TDAO的最佳浓度为2%。此外，如前所述基于基因组滴度证实90 min的最佳裂解时间。当将完整病毒颗粒(vp)%计算为基因组滴度与物理滴度的比率时，注意到由于未知的机制，2%的TDAO也促进了完整病毒颗粒随时间的更多释放，在裂解后90 min完整VP%为约100%(图4)。
在图3中，每一条代表3个测定孔的平均值，并且误差条是标准偏差。在图4中，每一条仅表示来自一个实验的一个数据。
实施例5
如实施例1中进行AAV9悬浮液上游方法，但使用单试剂和与NaCl组合的双试剂两者。
与图1中的AAV2结果形成对照，与仅0.5 M NaCl相比，单一去污剂TDAO或TritonX-100使AAV9解离增强到2-5倍(图5)。然而，与图2中的AAV2结果类似，与相应的单试剂相比，1% TDAO和0.5 M NaCl的组合促进AAV9解离增加到2-17倍，尽管与1% TDAO相比，对于具有2% TDAO的双试剂没有观察到益处(图5)。这些结果证明，尽管AAV9和AAV2可能以不同的方式与不同细胞组分相互作用，但TDAO和NaCl的组合可以促进这些不同血清型的AAV解离。在AAV2与AAV9之间同样一致的是，与单试剂相比，TDAO和NaCl的组合促进了具有高得多的完整VP%的完整病毒颗粒的更多释放(图4和图6)。然而，这种现象的根本机制目前是未知的。
在图5中，每一条代表2份稀释液×2个测定孔或3个测定孔的平均值，并且误差条是标准偏差。在图6中，每一条仅表示来自一个实验的一个数据。

Claims (15)

1.一种用于裂解包封腺相关病毒(AAV)颗粒或腺病毒(AdV)颗粒的细胞的方法，所述方法通过以下步骤进行：使所述细胞的悬浮液与有效量的包含烷基二甲基氧化胺的组合物接触，以促进细胞裂解和所述AAV或AdV颗粒从所述细胞中释放。
2.一种用于从包含包封病毒颗粒的细胞的样品中纯化腺相关病毒(AAV)或腺病毒(AdV)的病毒颗粒的方法，所述方法通过以下步骤进行：
a)使所述细胞和所述病毒颗粒的悬浮液与有效量的包含烷基二甲基氧化胺的组合物接触，以促进细胞裂解和从所述细胞中释放所述病毒颗粒，
b)分离和/或纯化所述病毒颗粒。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述组合物包含LDAO (月桂基二甲基胺-N-氧化物)和/或TDAO (十四烷基二甲基胺-N-氧化物)和氯化钠。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，使所述细胞与所述组合物接触30至180分钟。
5.根据权利要求2至4中一项或多项所述的方法，其特征在于，所述病毒颗粒为重组腺相关病毒(AAV)颗粒。
6. 根据权利要求2至5中一项或多项所述的方法，其特征在于，在步骤a)中获得的所述细胞和所述病毒颗粒的悬浮液与有效量的组合物的混合物中烷基二甲基氧化胺的浓度在1%至4% (w/w)之间。
7. 根据权利要求2至6中一项或多项所述的方法，其特征在于，在步骤a)中获得的所述细胞和所述病毒颗粒的悬浮液与有效量的组合物的混合物中，包含选自K+、Na+、Li+、Mg2+、Ca2+的金属阳离子和选自F-、SO4 2-、HPO4 2-、乙酸根、Cl-的阴离子组分的盐的浓度在0.05mol/l至1 mol/l之间。
8.根据权利要求2至7中一项或多项所述的方法，其特征在于所述组合物是包含烷基二甲基氧化胺和氯化钠的水溶液。
9. 根据权利要求2至8中一项或多项所述的方法，其特征在于在所述组合物中所述烷基二甲基氧化胺的浓度在10%至30% (w/w)之间。
10. 根据权利要求2至9中一项或多项所述的方法，其特征在于所述组合物中氯化钠的浓度在1 mol/l至6 mol/l之间。
11.根据权利要求2至10中一项或多项所述的方法，其特征在于步骤b)包括过滤和/或离心步骤。
12.根据权利要求2至11中的一项或多项所述的方法，其特征在于本发明的方法包括以下步骤中的一个或多个：
-澄清和过滤，
-透析和渗滤，
-用核酸酶，例如RNA酶和/或DNA酶处理，
-用氯仿处理，
-离子交换色谱，
-亲和色谱，
-疏水相互作用色谱，
-离心，
-PEG沉淀。
13.一种组合物，所述组合物包含一种或多种烷基二甲基氧化胺和盐，所述盐包含选自K+、Na+、Li+、Mg2+、Ca2+的金属阳离子和选自F-、SO4 2-、HPO4 2-、乙酸根、Cl-的阴离子组分。
14. 根据权利要求11所述的组合物，其特征在于所述组合物是包含10%至30% (w/w)TDAO和/或LDAO以及1 mol/l至6 mol/l NaCl的水溶液。
15.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求13或权利要求14所述的组合物以及核酸酶。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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