TW201406956A - 類病毒顆粒之純化 - Google Patents

Abstract

本發明係關於純化實質上不含過程污染物及感染物之類病毒顆粒(VLP)之方法。該等方法納入(例如)在收穫期間之低pH處理及/或在VLP捕獲期間藉由溶劑及/或清潔劑進行之不活化。

Description

類病毒顆粒之純化 相關申請案之交叉參考

本申請案主張於2012年6月22日提出申請之美國臨時專利申請案第61/663,218號及於2013年3月15日提出申請之美國臨時專利申請案第61/794,086號之優先權，每一案件之全部內容皆以引用方式併入本文中。

本發明係關於疫苗(包括諾羅病毒(norovirus)之疫苗)之領域。本發明之態樣係關於製備及純化疫苗組合物之方法。

類病毒顆粒(VLP)之產生通常涉及VLP於宿主細胞表現系統中之表現及組裝。對於自所得產生培養物移除感染物，通常使用病毒過濾，但亦可使用其他方法(例如UV不活化或化學不活化)(單獨或結合基於過濾器之方法)。然而，對於較大生物組份(例如VLP)，病毒過濾不可用，此乃因VLP之尺寸過於接近感染物(例如，病毒)以致於單獨藉由過濾不能與該等感染物分離。

在特定實例中，在Sf9昆蟲細胞中之VLP之桿狀病毒表現後，所得主體產生培養物含有高含量之過程污染物，其包括宿主細胞蛋白質、核酸及活感染物(包括桿狀病毒)。儘管低速離心及過濾收穫VLP產生培養物會產生適於下游純化之澄清試樣，但該等方法並不適於移除宿主細胞蛋白質及活病毒(包括桿狀病毒)。因此，需要其他方法使 感染物不活化及/或清除收穫期間之過程污染物，以在製備VLP時有利於下游處理。

本文提供用於自VLP細胞溶胞物清除過程污染物及產生培養物之方法及藉此產生之VLP組合物。在一個實施例中，本發明方法包含產生或獲得含有該等VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液及將溶胞物、上清液或濾液之pH調整至小於約5之pH值以產生調整過pH的溶液。該方法進一步包含自調整過pH的溶液移除非VLP粒子/聚集物以產生包含VLP之純化溶液。

在一些實施例中，本發明之pH處理方法可用於分離結構上不同之VLP群體，其中VLP至少包含VLP之第一子群及第二子群。分離非VLP粒子/聚集物可包含自調整過pH的溶液分離VLP之第二子群以產生純化溶液，其中該純化溶液實質上保留VLP之第一子群。該方法可進一步包含在自純化溶液分離VLP之第二子群後，自純化溶液分離VLP之第一群體。在一些實施例中，VLP係諾羅病毒VLP，其中第一子群包含具有全長VP1亞單元之諾羅病毒VLP，且其中第二子群包含具有經截短VP1亞單元之諾羅病毒VLP。在該處理後，VLP之第一子群對殘餘污染蛋白質之比率增加至至少約50%。在一些實施例中，在該處理後，VLP之第一子群對殘餘污染蛋白質之比率增加至至少約80%。

在一些實施例中，分離包含一或多個以下過程：離心、沈澱、絮凝、沉降及過濾。在一些實施例中，移除VLP包含使用一或多個層析過程自純化溶液分離VLP之第一子群。

在本發明之一些態樣中，純化VLP之方法包含產生或獲得含有VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液及使用多步層析過程純化VLP以產生純化溶液。多步層析過程之至少一個層析過程包含使溶胞物、 上清液或濾液與層析材料接觸，其中VLP結合至該層析材料；用溶劑及/或清潔劑處理層析材料；及在該處理後自層析材料洗脫VLP。每一層析過程獨立地選自：羥基磷灰石層析、疏水性交互作用層析、尺寸排除層析、離子交換層析、混合模式層析、基於膜之層析及親和層析。在一些實施例中，多步層析過程之第一層析過程係離子交換層析，其中離子交換層析係選自陰離子交換層析及陽離子交換層析。

在一些實施例中，多步層析過程之第一層析過程係陽離子交換層析，且該處理步驟係在陽離子交換層析過程之陽離子交換管柱上實施。在一些實施例中，多步層析過程之第一層析過程係羥基磷灰石層析，且該處理步驟係在羥基磷灰石層析過程之羥基磷灰石管柱上實施。在一些實施例中，多步層析過程之第一層析過程係親和層析，且該處理步驟係在親和層析過程之親和管柱上實施。在一些實施例中，多步層析過程之第一層析過程係混合模式層析，且該處理步驟係在混合模式層析過程之混合模式管柱上實施。在一些實施例中，多步層析過程之第一層析過程係疏水性交互作用層析，且該處理步驟係在疏水性交互作用層析過程之疏水性交互作用管柱上實施。在一些實施例中，該方法進一步包含一或多個額外層析過程。

溶劑及/或清潔劑包含以下中之一或多者：磷酸三丁酯(TnBP)、非離子型清潔劑(包括Triton X-100及聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯)、兩性離子型清潔劑(包括CHAPS及Zwittergent 3-12)及離子型清潔劑(包括膽酸鈉及二甲基雙十八烷基溴化銨)。

在一些實施例中，VLP係以下中之一或多者：諾羅病毒基因群I VLP、諾羅病毒基因群II VLP、諾羅病毒基因群IV VLP、嵌合諾羅病毒VLP、經改造諾羅病毒VLP變體及沙波病毒(sapovirus)VLP。在一些實施例中，VLP係一或多種沙波病毒VLP。在一些實施例中，VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約2倍。

在一些實施例中，與溶胞物、上清液或濾液相比，VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約10倍。在一些實施例中，自溶胞物、上清液或濾液移除至少約50%殘餘污染蛋白質。在一些實施例中，在該純化期間，損失不超過約50% VLP。

在一些實施例中，使用重組方法產生溶胞物、上清液或濾液，且在細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞中產生VLP。VLP亦可在植物細胞中產生。

在本發明之一些態樣中，純化VLP之方法包含產生或獲得含有VLP之細胞溶胞物或培養上清液/濾液，該等VLP至少包含VLP之第一子群及第二子群。該方法進一步包含將溶胞物、上清液或濾液之pH調整至小於約5之pH，及使用過濾過程自調整過pH的溶液移除VLP之第二子群，以產生過濾溶液。過濾溶液實質上保留VLP之第一子群。該方法另外包含使用多步層析過程自過濾溶液分離VLP之第一子群，該多步層析過程納入至少一個管柱上溶劑及/或清潔劑處理步驟。在一些實施例中，VLP之第一群體對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約2倍。在一些實施例中，過濾過程包括深度過濾過程。

在一些實施例中，VLP係以下中之一或多者：諾羅病毒基因群I VLP及諾羅病毒基因群II VLP。在其他實施例中，VLP係諾羅病毒基因群IV VLP及經測定將來感染人類之諾羅病毒基因群中之一或多者。

在本發明之一些態樣中，純化VLP之方法包含產生或獲得含有VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液。該方法進一步包含將溶胞物、上清液或濾液之pH調整至小於約5之pH以產生調整過pH的溶液。該方法另外包含自調整過pH的溶液移除非VLP粒子/聚集物以產生純化溶液，該移除包括藉由深度過濾過程澄清調整過pH的溶液以產生經純化之深度過濾溶液。在一些實施例中，深度過濾過程包含使調整 過pH的溶液與一或多個深度過濾器接觸以產生純化溶液。在一些實施例中，深度過濾器中之至少一者係矽藻土深度過濾器。在一些實施例中，一或多個深度過濾器係複數個矽藻土深度過濾器，其各自具有獨立地選自約50升/m²至約1000升/m²之範圍之過濾量。在一些實施例中，一或多個深度過濾器係單一深度過濾器，其各自具有選自約150升/m²至約400升/m²之範圍之過濾量。在一些實施例中，與溶胞物、上清液或濾液相比，自調整過pH的溶液移除至少約95%殘餘污染核酸。在一些實施例中，與溶胞物、上清液或濾液相比，自調整過pH的溶液回收至少約75% VLP。

在本發明之一些態樣中，本發明溶液包含純化諾羅病毒VLP之群體，其中相對於VLP，該溶液含有不超過10%之殘餘污染蛋白質，如藉由尺寸排除層析及ELISA所量測。在一些實施例中，自含有諾羅病毒VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液純化溶液。在一些實施例中，相對於溶胞物、上清液或濾液，溶液含有不超過35%殘餘污染核酸。在一些實施例中，回收溶胞物、上清液或濾液中之至少約50%諾羅病毒VLP。在一些實施例中，與溶胞物、上清液或濾液相比，諾羅病毒VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約10倍。

在本發明之一些態樣中，本發明溶液包含VLP之純化群體，其中該溶液含有至少約50%具有全長VP1亞單元之VLP。在一些實施例中，溶液含有至多約100%具有全長VP1亞單元之VLP。在一些實施例中，溶液實質上不含具有經截短VP1亞單元之VLP。在一些實施例中，溶液係自含有至少約10%具有經截短VP1亞單元之VLP的起始材料產生。在一些實施例中，起始材料係含有VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液。

在本發明之一些態樣中，清除含有活病毒且進一步含有由活宿主細胞病毒產生之VLP的溶液中之活病毒及/或使其不活化的方法包 含將溶液之pH調整至小於約5之pH值以產生調整過pH的溶液。在一些實施例中，調整過pH的溶液中之活病毒之含量減少至少約10⁴倍。在一些實施例中，調整過pH的溶液中之活病毒之含量減少至少約10⁵倍。活病毒可包括(但不限於)宿主細胞病毒、產生病毒(例如桿狀病毒)及(例如)由於人類操作之其他污染病毒。

在一些實施例中，該方法進一步包含自調整過pH的溶液移除非VLP粒子/聚集物以產生純化溶液，及使用至少一個層析過程純化純化之溶液。至少一個層析過程包含使純化溶液與層析材料接觸(其中VLP結合至該層析材料)及用溶劑及/或清潔劑處理層析材料。至少一個層析過程進一步包含在該處理後自層析材料洗脫VLP以產生洗脫物。在一些實施例中，與含有活病毒之溶液相比，洗脫物中之活病毒之含量減少至少約10²倍。

在本發明之一些態樣中，清除含有活病毒且進一步含有由活病毒產生之VLP的溶液中之活病毒及/或使其不活化的方法包含使用至少一個層析過程純化含有活病毒之溶液。至少一個層析過程包含使含有活病毒之溶液與層析材料接觸(其中VLP結合至該層析材料)及用溶劑及/或清潔劑處理層析材料。至少一個層析過程進一步包含在該處理後自層析材料洗脫VLP以產生洗脫物。在一些實施例中，與含有活病毒之溶液相比，洗脫物中之活殘餘污染病毒之含量減少至少約10⁵倍。在一些實施例中，與含有活病毒之溶液相比，洗脫物中之活病毒之含量減少至少約10⁷倍。

本發明亦包含藉由本文所揭示方法產生之VLP組合物及包含VLP以及一或多種佐劑及/或賦形劑之疫苗組合物。本文產生之VLP組合物之優勢在於其具有較少過程污染物且實質上不含產生期間形成之異常VLP結構。

圖1A闡釋低pH處理，其係以Norwalk VP1亞單元作為優勢條帶之染色SDS-PAGE凝膠，其中泳道1係主體Norwalk VLP產生培養物(總)；泳道2係VLP產生培養物-微量離心上清液/濾液；泳道3係VLP產生培養物-微量離心沈澱；泳道4係低pH處理後之主體VLP產生培養物(總)；且泳道5係低pH處理、低速離心及0.2μm過濾後之VLP產生培養物(最終收穫材料)；圖1B闡釋低pH處理，其係以共有VP1亞單元作為優勢條帶之染色SDS-PAGE凝膠，其中泳道1係主體共有VLP產生培養物(總)；且泳道2係低pH處理、低速離心及0.2μm過濾後之VLP產生培養物(最終收穫材料)；圖2A闡釋溶劑/清潔劑處理，其係陽離子交換捕獲層析期間結合及洗脫單元操作之代表性層析圖，其中將Norwalk VLP條件培養基以100mL/min裝載於180mL床體積Sartobind S膠囊上。層析圖顯示：1)條件培養基之裝載；2)溶劑/清潔劑洗滌；及3)Norwalk VLP之洗脫；圖2B闡釋溶劑/清潔劑處理，其係羥基磷灰石捕獲層析期間結合及洗脫單元操作之代表性層析圖，其中將Norwalk VLP條件培養基以80mL/min裝載於250mL床體積羥基磷灰石管柱上。層析圖顯示：1)條件培養基之裝載；2)溶劑/清潔劑洗滌；及3)100mM磷酸鹽洗滌；及4)Norwalk VLP之洗脫；圖3A闡釋VLP完整性之分析，其係分析型尺寸排除層析圖，其中層析圖顯示與組裝顆粒一致之7.4分鐘峰；圖3B闡釋VLP完整性之分析，其係透射式電子顯微照片，其顯示預期為T3二十面體VLP之約30-40nm顆粒。

圖4A闡釋VLP產生及經由離心收穫之流程圖；且圖4B闡釋VLP產生及經由深度過濾收穫之流程圖。

本發明係關於溶液及/或疫苗組合物之製備，且具體而言係關於純化VLP之方法。具體而言，本發明者已發現，VLP產生培養物之低pH處理步驟可有益清除過程污染物(例如活宿主細胞病毒及殘餘污染蛋白質)以及VLP群體之一些變體，同時維持VLP結構之免疫原性及完整性。例如，對於諾羅病毒VLP之純化，本發明者已發現，低pH-處理步驟可實質上移除活病毒及具有經截短VP1亞單元之諾羅病毒VLP及/或使其不活化。

應瞭解，本發明之態樣適用於純化任何VLP及其變體。在一些實施例中，VLP係屬於嵌杯病毒科(Caliciviridae)家族之病毒。在一些實施例中，VLP係諾羅病毒VLP，包括嵌合或經改造變體。在一些實施例中，VLP係沙波病毒VLP。

亦應瞭解，本發明之態樣適用於VLP純化，其可移除活病毒感染物。在一些實施例中，活病毒係無包膜病毒，例如細小病毒(parvovirus)、輪狀病毒(rotavirus)及/或諸如此類。在一些實施例中，活病毒係包膜病毒，例如桿狀病毒、逆轉錄病毒、遊移病毒、蟲媒病毒、呼吸道合胞病毒及/或諸如此類。

另外，本發明者已發現，利用溶劑及/或清潔劑處理係不活化及移除病毒污染物(若使用桿狀病毒表現系統產生VLP，則包括剩餘桿狀病毒)之有用步驟。因此，另外或或者，本發明可包含至少一個層析過程，其包括用溶劑及/或清潔劑處理與包含VLP之組合物接觸之層析材料(例如層析管柱之層析材料)，及/或在與層析材料接觸之前向包含VLP之組合物中添加溶劑/清潔劑。此後自層析材料洗脫VLP並施加SDR Hyper-D以移除殘餘溶劑/清潔劑。

另外，本發明者已發現，利用一或多個深度過濾器(例如矽藻土及/或合成深度過濾器)之深度過濾係(例如)移除殘餘污染核酸(若使用 桿狀病毒表現系統產生VLP，則包括桿狀病毒核酸)之有用步驟。因此，另外或或者，本發明方法可包含藉由深度過濾過程澄清任何含有VLP及殘餘污染核酸之溶液，以產生經純化之深度過濾溶液。

本發明者亦已發現，與任何純化前溶液相比，藉由一或多個上文提及之過程產生之純化溶液可有益地減少純化溶液中相對於VLP之殘餘污染蛋白質。因此，本發明溶液可顯示，由於純化，相對於VLP之殘餘污染蛋白質減少。

本發明者亦已發現，與任何純化前溶液相比，藉由一或多個上文提及之過程產生之純化溶液可有益地相對增加具有全長VP1亞單元之VLP之VLP含量。因此，本發明溶液可顯示，由於純化，具有全長VP1亞單元之VLP之含量增加。

純化類病毒顆粒(VLP)之方法包含產生或獲得含有該等VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液。該方法亦包含將溶胞物、上清液或濾液之pH調整至小於約5之pH值以產生調整過pH的溶液。該方法亦包含自含有VLP之調整過pH的溶液移除非VLP粒子/聚集物以產生純化溶液。

在一些實施例中，VLP之產生產生至少包含VLP之第一子群及第二子群以及其他過程污染物材料之細胞溶胞物、培養上清液或濾液。在一些實施例中，溶胞物、上清液或濾液係主體產生培養物或係自主體產生培養物產生。在一些實施例中，溶胞物、上清液或濾液係自藉由過濾及/或離心預清除之培養上清液獲得。

在一些實施例中，VLP之子群係基於其對pH處理之差異反應、基於所誘發之抗原反應及/或基於結構差別表徵。因此，預期端視病毒而定，可存在兩個以上VLP子群。在一些實施例中，所產生VLP係諾羅病毒VLP，第一子群包含具有全長VP1亞單元之諾羅病毒VLP，且第二子群包含具有經截短VP1亞單元之諾羅病毒VLP。在一些實施 例中，諾羅病毒VLP係以下中之一或多者：諾羅病毒基因群I VLP、諾羅病毒基因群II VLP、諾羅病毒基因群III VLP、諾羅病毒基因群IV VLP及諾羅病毒基因群V VLP。在一些實施例中，VLP係酸穩定之VLP。

本發明方法包括調整溶胞物、上清液或濾液之pH以分離VLP與過程污染物及異常形成之VLP樣結構。過程污染物可包括(但不限於)多糖、殘餘污染蛋白質(例如宿主細胞蛋白質)、殘餘污染核酸(例如宿主細胞核酸)、脂質、培養基組份、活感染物(例如活宿主細胞病毒(例如桿狀病毒)及諸如此類)以及任何前述污染物之總成或聚集物。異常形成之VLP樣結構可為任何基於其對環境條件(例如，pH處理或溫度)之差異反應、所誘發抗原反應、結構差異、分離特性(例如，層析、沈積或過濾)及/或諸如此類而與期望VLP結構區分開之VLP結構。

在一些實施例中，將溶胞物、上清液或濾液之pH調整至小於約5以產生調整過pH的溶液。在一些實施例中，將溶胞物、上清液或濾液之pH調整至小於約4.5、至小於約4、至小於約3.5、至小於約3.4、至小於約3.3、至小於約3.2、至小於約3.1、至小於約3、至小於約2.9、至小於約2.8、至小於約2.7、至小於約2.6、至小於約2.5、至小於約2、至小於約1.5、至小於約1及其中之所有範圍/子範圍。

可藉由熟習此項技術者已知之任何方法調整溶胞物、上清液或濾液之pH。在一些實施例中，藉由向溶胞物、上清液或濾液中添加一或多種產生酸化之試劑調整pH。例示性酸化試劑可包括：氫氯酸、乙酸、硫酸及磷酸。所添加試劑之pH、體積及組成可適宜地經選擇，如業內所知。

在一些實施例中，pH調整及/或溶胞物、上清液或濾液之處理之持續時間係約30分鐘。在一些實施例中，pH調整及/或溶胞物、上清液或濾液之處理之持續時間係約1小時，係約2小時，係約3小時，係 約4小時，係約5小時，係約10小時，係約15小時，係約20小時，係約25小時，係約30小時，係約35小時，係約40小時，係約45小時，係約46小時，係約47小時，係約48小時及其之間之所有範圍/子範圍。

在一些實施例中，溶胞物、上清液或濾液包含如前文所論述VLP之第一子群及第二子群，且調整溶胞物、上清液或濾液之pH使得第一及第二子群非均相分佈。在一些實施例中，pH處理可在調整過pH的溶液中引起粒子及/或聚集物形成，且VLP之第二子群實質上係在所得粒子/聚集物中發現，且VLP之第一子群保留於調整過pH的溶液之體積中。在一些實施例中，如利用本文純化之諾羅病毒基因群II VLP所例示，與包含具有全長VP1蛋白質之VLP的第一子群相比，第二子群包含含有經截短VP1蛋白質之VLP。

在一些實施例中，純化VLP之方法進一步包括自調整過pH的溶液移除非VLP粒子/聚集物以產生純化溶液。在一些實施例中，移除包括(但不限於)以下過程中之一或多者：離心、沈澱、絮凝、沉降及過濾。在一些實施例中，分離至少包括離心以移除粒子/聚集物。

在一些實施例中，移除非VLP粒子/聚集物包括自調整過pH的溶液分離VLP之第二子群以產生純化溶液，其中該純化溶液實質上保留VLP之第一子群。換言之，粒子/聚集物包含VLP之第二子群。以此方式，可在收穫過程之早期(即在培養物澄清期間)達成VLP之不期望子群之選擇性移除。

在一些實施例中，移除/澄清係藉由一或多個過濾過程完成。適宜過濾包括(但不限於)深度過濾、膜過濾、化學過濾及/或諸如此類。在一些實施例中，至少一個過濾過程係使用一或多個深度過濾器之深度過濾。深度過濾可係指任何採用多孔過濾器/過濾介質之過濾過程。適宜深度過濾器包括(但不限於)矽藻土深度過濾器、合成深度過濾器及/或諸如此類。使用深度過濾之益處包括便於可棄材料之操作 及利用性，此消除對再使用設備所需之清除確認的需要。在一些實施例中，亦可視情況採用一或多個使用(例如)亞微米過濾器之額外過濾過程。

在一些實施例中，VLP之第一子群對殘餘污染蛋白質之比率在此步驟後增加至少約2倍。在一些實施例中，VLP之第一子群對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍及其之間之所有值。

在一些實施例中，在過濾後，自溶胞物、上清液或濾液移除至少約50%殘餘污染核酸。術語「殘餘污染核酸」可包括(但不限於)宿主細胞核酸、宿主細胞病毒之核酸、產生病毒之核酸(即用於產生VLP)及/或諸如此類。在一些實施例中，自溶胞物、上清液或濾液移除至少約55%、至少約60%、至少約61%、至少約62%、至少約63%、至少約64%、至少約65%、至少約66%、至少約67%、至少約68%、至少約69%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約100%及其之間之所有值之殘餘污染核酸。

一般而言，可藉由改變VLP濃度對任何其他組份之濃度之比率來量測(針對溶胞物、上清液或濾液)指定處理步驟後VLP之純化程度。例如，可在VLP濃度與感染物濃度之間、VLP濃度與殘餘污染蛋白質之間及/或在VLP濃度與宿主細胞過程污染物之間計算該比率。

在一些實施例中，純化VLP亦涵蓋在自調整過pH的溶液移除VLP之第二子群後，自純化溶液分離VLP之第一群體。在一些實施例中，自純化溶液分離VLP之第一群體包括任何適宜分離方法，例如離心(例如連續流動)、沈澱、相分離、正切流動過濾、緩衝液更換方法及/ 或諸如此類。在一些實施例中，自純化溶液分離VLP之第一群體包括使用一或多個層析過程。每一層析過程可獨立地選自(但不限於)羥基磷灰石層析、疏水性交互作用層析、尺寸排除層析、離子交換層析、混合模式層析及親和層析。離子交換層析可為陰離子交換層析或陽離子交換層析。

在一些實施例中，VLP之第一子群對殘餘污染蛋白質之比率在此步驟後增加至少約2倍。在一些實施例中，VLP之第一子群對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍及其之間之所有值。在一些實施例中，在此步驟後，自溶胞物、上清液或濾液移除至少約50%殘餘污染核酸。術語「殘餘污染核酸」可包括(但不限於)宿主細胞核酸、產生病毒核酸、病毒核酸、細菌核酸、真菌核酸、可與本文所述系統及方法相關或可不相關之其他有機體之核酸及/或諸如此類。在一些實施例中，自溶胞物、上清液或濾液移除至少約55%、至少約60%、至少約61%、至少約62%、至少約63%、至少約64%、至少約65%、至少約66%、至少約67%、至少約68%、至少約69%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約100%及其之間之所有值之殘餘污染核酸。

本發明者亦已發現，溶劑及/或清潔劑處理步驟用於自VLP製劑純化活病毒感染物(例如桿狀病毒)。如前文所述，溶劑及/或清潔劑可在與層析管柱接觸之前添加至VLP製劑中，及/或可在與層析管柱接觸之前添加至主體溶液中，及/或可在與VLP製劑接觸之前添加至層析管柱中。因此，儘管為簡便起見關於管柱上溶劑/清潔劑處理進行闡述，但應瞭解，該等可能性之每一者皆在本發明範圍內。在該等實 施例中，本發明方法包含產生或獲得含有VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液及使用多步層析過程純化VLP。多步層析過程之至少一個層析過程包含使溶胞物、上清液或濾液與層析材料接觸，其中VLP結合至該層析材料。至少一個層析過程亦包含用溶劑及/或清潔劑處理層析材料。至少一個層析過程進一步包含在處理後自層析材料洗脫VLP。

在一些實施例中，至少一個層析過程亦包括用溶劑及/或清潔劑處理層析材料。在一些實施例中，層析材料係層析管柱，且處理涵蓋管柱上處理或用溶劑及/或清潔劑洗滌。可採用任何適宜溶劑及/或清潔劑。在一些實施例中，溶劑係有機溶劑且包括(但不限於)一或多種以下磷酸三丁酯(TnBP)。在一些實施例中，清潔劑包括(但不限於)以下中之一或多者：Triton X-100、辛基苯酚環氧乙烷縮合物、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯及膽酸鈉及其各種組合。例示性組合物係：非離子型清潔劑(包括Triton X-100及聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯)、兩性離子型清潔劑(包括CHAPS及Zwittergent 3-12)及離子型清潔劑(包括膽酸鈉及二甲基雙十八烷基溴化銨)。

在一些實施例中，溶劑及/或清潔劑包含至少約0.01%，至少約0.1%、至少約0.2%、至少約0.3%、至少約0.4%、至少約0.5%、至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約10%清潔劑(w/v)及其之間之所有值之清潔劑(w/v)。在一些實施例中，溶劑及/或清潔劑包含至少約0.01%溶劑(w/v)，至少約0.1%、至少約0.2%、至少約0.3%、至少約0.4%、至少約0.5%、至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約10%溶劑(w/v)及其之間之所有值。在一些實施例中，溶劑及/或清潔劑另外含有常用生物緩衝液(例如乙酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸、磷酸鹽、Tris及/或諸如此類)及/或鹽(例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂及/或諸如此類)。

在一些實施例中，利用溶劑及/或清潔劑處理之持續時間係約10分鐘。在一些實施例中，利用溶劑及/或清潔劑處理之持續時間係約20分鐘，係約30分鐘，係約1小時，係約2小時，係約3小時，係約4小時，係約5小時，係約10小時，係約15小時，係約20小時，係約21小時，係約22小時，係約23小時，係約24小時及其之間之所有範圍/子範圍。

在一些實施例中，細胞溶胞物或培養上清液/濾液係使用如前文所論述之重組方法產生。在一些實施例中，VLP係在以下中之一或多者中產生：細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、植物或哺乳動物細胞。在一些實施例中，VLP係諾羅病毒基因群I VLP、諾羅病毒基因群II VLP及/或諾羅病毒基因群IV VLP。

在一些實施例中，純化VLP包括使用多步層析過程純化VLP。每一層析過程獨立地如前文所列舉經選擇。在一些實施例中，多步層析過程之第一層析過程係陽離子交換層析，且亦可採用一或多個隨後層析過程。

在一些實施例中，至少一個層析過程包括使溶胞物、上清液或濾液與層析材料接觸，其中VLP結合至該層析材料。所用層析材料端視所採用之特定層析過程而定且可包括(但不限於)陽離子交換管柱、羥基磷灰石管柱、疏水性交互作用管柱、尺寸排除管柱、陰離子交換管柱、混合模式管柱或親和管柱及諸如此類。在至少一個層析過程係陽離子交換層析時，層析材料係陽離子交換管柱或膜。

在一些實施例中，至少一個層析過程亦包括在管柱上處理後自層析材料洗脫VLP。洗脫機制可端視實驗因素而定，該等實驗因素係(例如但不限於)層析過程之選擇、所用溶劑及/或清潔劑、VLP/層析基質與洗脫劑之間之相互作用等。洗脫可藉由利用如業內已知之任何適宜且常用之生物緩衝液(乙酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸、磷酸鹽、 Tris)及鹽(氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂)調整層析系統之pH及/或離子強度來實施。在一些實施例中，至少一個層析過程係陽離子交換層析，且洗脫係藉由用乙酸鹽洗滌陽離子交換管柱來實施。在另一實施例中，至少一個層析過程係羥基磷灰石層析，且洗脫係藉由用磷酸鈉洗滌羥基磷灰石管柱來實施。

在一些實施例中，與包括溶劑及/或清潔劑處理之至少一個層析過程後之溶胞物、上清液或濾液相比，VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加約2倍。術語「殘餘污染蛋白質」可包括(但不限於)宿主細胞蛋白質、來自宿主細胞病毒之蛋白質組份、產生病毒核酸、病毒核酸、細菌核酸、真菌核酸、可與產生系統相關或可不相關之其他有機體之核酸及/或諸如此類。在一些實施例中，VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍、至少75倍、至少80倍、至少85倍、至少90倍、至少95倍、至少100倍及其之間之所有值。在一些實施例中，在多步層析過程後，VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加約2倍。在一些實施例中，VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加約3倍、約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍、至少約100倍及其之間之所有值。

在一些實施例中，在包括溶劑及/或清潔劑處理之至少一個層析過程後，自溶胞物、上清液或濾液移除至少約30%殘餘污染蛋白質。在一些實施例中，自溶胞物、上清液或濾液移除至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約46%、至少約47%、至少約48%、至少約49%、至少約50%、至少約51%、至少約52%、至少約53%、至少約54%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約 92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約100%及其之間之所有值之殘餘污染蛋白質。

在一些實施例中，在包括溶劑及/或清潔劑處理之至少一個層析過程後，溶胞物、上清液或濾液中之VLP皆無損失。在一些實施例中，在包括溶劑及/或清潔劑處理之至少一個層析過程後，溶胞物、上清液或濾液中之VLP損失不超過約1%、不超過約2%、不超過約3%、不超過約4%、不超過約5%、不超過約6%、不超過約7%、不超過約8%、不超過約9%、不超過約10%、不超過約15%、不超過約20%、不超過約25%、不超過約30%、不超過約35%、不超過約40%、不超過約45%、不超過約50%、不超過約50%、不超過約55%、不超過約60%及其之間之所有值。

在一些實施例中，在包括溶劑及/或清潔劑處理之至少一個層析過程後，自溶胞物、上清液或濾液回收約100% VLP。在一些實施例中，在包括溶劑及/或清潔劑處理之至少一個層析過程後，自溶胞物、上清液或濾液回收至少約99%、至少約98%、至少約97%、至少約96%、至少約95%、至少約94%、至少約93%、至少約92%、至少約91%、至少約90%、至少約85%、至少約80%、至少約75%、至少約70%、至少約65%、至少約60%、至少約55%、至少約50%、至少約45%、至少約40%及其之間之所有值之VLP。

在一些實施例中，本文所述之本發明方法亦可清除含有活病毒且進一步含有由活病毒產生之VLP的溶液中之活病毒及/或使其不活化，其中該方法包括將含有活病毒之溶液之pH調整至小於約5之pH值以產生調整過pH的溶液。活病毒可為(但不限於)活宿主細胞病毒、產生病毒(例如，桿狀病毒)、可與產生系統相關或可不相關之污染病毒及/或諸如此類。VLP可為(但不限於)基因群I VLP及/或基因群II VLP。

在一些實施例中，調整過pH的溶液中之活病毒之含量比含有活病毒之溶液降低至少約10倍。在一些實施例中，調整過pH的溶液中之活病毒之含量係比含有活病毒之溶液降低至少約100倍、至少約10³倍、至少約10⁴倍、至少約10⁵倍、至少約10⁶倍、至少約10⁷倍、至少約10⁸倍、至少約10⁹倍、至少約10¹⁰倍及其之間之所有值。

在一些實施例中，可自調整過pH的溶液移除非VLP粒子/聚集物以產生純化溶液，隨後可藉由至少一個層析過程對其進行處理。至少一個層析過程可包括使純化溶液與層析材料接觸(其中VLP結合至層析材料)及用溶劑及/或清潔劑處理層析材料。至少一個層析過程亦可包括在處理後自層析材料洗脫VLP以產生洗脫物。在一些實施例中，與含有活病毒之溶液相比，洗脫物中之活病毒之含量減少至少約10²倍。在一些實施例中，與含有活病毒之溶液相比，洗脫物中之活病毒之含量減少至少約10³倍、至少約10⁴倍、至少約10⁵倍、至少約10⁶倍、至少約10⁷倍、至少約10⁸倍、至少約10⁹倍、至少約10¹⁰倍、至少約10¹¹倍、至少約10¹²倍、至少約10¹³倍、至少約10¹⁴倍、至少約10¹⁵倍、至少約10¹⁶倍及其之間之所有值。

在一些實施例中，本文所述之本發明方法亦可清除含有活病毒且進一步含有由活病毒產生之VLP的溶液中之活病毒及/或使其不活化，其中該方法包括使用至少一個層析過程純化含有活病毒之溶液。至少一個層析過程可包括使溶液與層析材料接觸(其中VLP結合至層析材料)及用溶劑及/或清潔劑處理層析材料。至少一個層析過程亦可包括在處理後自層析材料洗脫VLP以產生洗脫物。在一些實施例中，與含有活病毒之溶液相比，洗脫物中之活病毒之含量減少至少約10倍。在一些實施例中，與含有活病毒之溶液相比，洗脫物中之活病毒之含量減少至少約10²倍、至少約10³倍、至少約10⁴倍、至少約10⁵ 倍、至少約10⁶倍、至少約10⁷倍、至少約10⁸倍、至少約10⁹倍、至少約10¹⁰倍及其之間之所有值。

在一些實施例中，本發明進一步可操作以自含有VLP之溶胞物、上清液或濾液純化類病毒顆粒(VLP)，該純化係使用低pH處理步驟及過濾過程/步驟以移除過程污染物及/或VLP之第二子群以及至少一個包括管柱上溶劑及/或清潔劑處理之層析過程以使活病毒感染物不活化。在一些實施例中，第一子群包括具有全長VP1亞單元之諾羅病毒VLP，且第二子群包括具有經截短VP1亞單元之諾羅病毒VLP。溶胞物、上清液或濾液係藉由如前文所述之任何適宜方式產生。

調整溶胞物、上清液或濾液之pH係以類似於已經闡述之方式實施，包括pH值之條件(例如小於約5)、處理持續時間(例如約30分鐘)等。pH處理導致形成含有VLP之第二子群之粒子及/或聚集物，而VLP之第一子群保留於調整過pH的溶液之體積中。

過濾過程係以類似於已經闡述之方式實施，且可為深度過濾過程。過濾步驟可移除含有VLP之第二子群以及過程污染物(例如殘餘污染核酸)之粒子/聚集物以產生經過濾之純化溶液，其中VLP之第一子群保留於經過濾之純化溶液之體積中。

在此實施例中，pH處理及過濾步驟係在多步層析過程之前實施，且純化VLP包括使用多步層析過程自經過濾之純化溶液分離VLP之第一子群，其中多步層析過程之每一層析過程獨立地如前文所述經選擇。VLP之第一子群結合至經溶劑及/或清潔劑處理之層析材料/管柱。可採用如前文列舉之任何適宜溶劑及/或清潔劑。隨後自層析材料洗脫VLP之第一子群。

在一些實施例中，在低pH處理及至少一個層析過程後，VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加約2倍。在一些實施例中，VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加約3倍、約4倍、至少5倍、至少10倍、至少15 倍、至少20倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍及其之間之所有值。在一些實施例中，在低pH處理及多步層析過程後，VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加約2倍。在一些實施例中，VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加約3倍、約4倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍及其之間之所有值。

在一些實施例中，本發明進一步可操作以使用低pH處理步驟及深度過濾過程/步驟純化VLP以移除過程污染物及/或VLP之不期望子群，例如VLP之第二子群。pH處理步驟可如前文所述實施。

深度過濾過程可包括使調整過pH的溶液與一或多個深度過濾器接觸以產生經過濾之純化溶液。一或多個深度過濾器可基於任何產生因素(例如處理容量、粒子載荷或負荷、產物回收率、最終濁度、過濾量及/或諸如此類)適宜地選擇用於純化系統。在一些實施例中，深度過濾器中之至少一者係矽藻土深度過濾器。在一些實施例中，若干深度過濾器係矽藻土深度過濾器，其各自具有獨立地選自約50升/m²、約100升/m²、約200升/m²、約300升/m²、約400升/m²、約500升/m²、約600升/m²、約700升/m²、約800升/m²、約900升/m²、約1000升/m²及其之間之所有值之過濾量。在一些實施例中，使用具有選自約150升/m²、約200升/m²、約250升/m²、約300升/m²、約350升/m²、約400升/m²及其之間之所有值之過濾量的單一深度過濾器。可使用之例示性深度過濾器係Millistak+HC莢過濾器。

在一些實施例中，與細胞溶胞物或培養上清液/濾液相比，藉由深度過濾過程自調整過pH的溶液移除至少約50%殘餘污染核酸。在一些實施例中，與細胞溶胞物或培養上清液/濾液相比，藉由深度過濾過程自調整過pH的溶液移除至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少 約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約100%及其之間之所有值之殘餘污染核酸。

在一些實施例中，與細胞溶胞物或培養上清液/濾液相比，藉由深度過濾過程自調整過pH的溶液回收約100% VLP。在一些實施例中，與細胞溶胞物或培養上清液/濾液相比，藉由深度過濾過程自調整過pH的溶液回收至少約99%、至少約98%、至少約97%、至少約96%、至少約95%、至少約94%、至少約93%、至少約92%、至少約91%、至少約90%、至少約85%、至少約80%、至少約75%、至少約70%、至少約65%、至少約60%、至少約55%、至少約50%、至少約45%、至少約40%及其之間之所有值之VLP。

在一些實施例中，所回收VLP係VLP之第一群體。在一些實施例中，可使用一或多個層析過程以自如前文所述之經深度過濾之純化溶液分離VLP之第一子群。

在一些實施例中，本發明之態樣進一步可操作用於提供諾羅病毒VLP之純化群體之溶液，其含有相對於VLP不超過80%之殘餘污染蛋白質，如藉由尺寸排除層析及ELISA所量測。諾羅病毒VLP之純化群體之溶液可自前文所述細胞溶胞物、培養上清液或濾液或自前文所述之任何其他溶液(例如調整過pH的溶液、深度過濾溶液等)產生。在一些實施例中，諾羅病毒VLP之純化群體之溶液係藉由純化含有諾羅病毒VLP之溶胞物、上清液或濾液之溶液獲得。在一些實施例中，諾羅病毒VLP之純化群體之溶液係藉由以下過程中之一或多者產生：pH處理、離心、沈澱、絮凝、沉降、過濾及層析。在一些實施例中，諾羅病毒VLP之純化群體之溶液係自如前文所述之任何處理/未處理之溶液(例如藉由pH處理及過濾步驟，之後多步層析過程)產生。

在一些實施例中，相對於細胞溶胞物或培養上清液/濾液之溶液，諾羅病毒VLP之純化群體之溶液不含殘餘污染核酸。在一些實施 例中，相對於細胞溶胞物或培養上清液/濾液之溶液，諾羅病毒VLP之純化群體之溶液含有不超過約1%、不超過約2%、不超過約3%、不超過約4%、不超過約5%、不超過約10%、不超過約15%、不超過約20%、不超過約25%、不超過約30%、不超過約35%、不超過約40%、不超過約45%、不超過約50%、不超過約55%、不超過約60%、不超過約65%、不超過約70%、不超過約75%、不超過約80%及其之間之所有值之殘餘污染核酸。

在一些實施例中，溶液含有約100%來自初始溶胞物、上清液或濾液之諾羅病毒VLP。在一些實施例中，溶液含有約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、約50%、約45%、約40%及其之間之所有值之來自初始溶胞物、上清液或濾液之諾羅病毒VLP。

在一些實施例中，與初始溶胞物、上清液或濾液相比，諾羅病毒VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約50倍。在一些實施例中，與初始溶胞物、上清液或濾液相比，諾羅病毒VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約45倍、至少約40倍、至少約35倍、至少約30倍、至少約25倍、至少約15倍、至少約10倍、至少約5倍、至少約4倍、至少約3倍、至少約2倍及其之間之所有值。

在一些實施例中，諾羅病毒VLP之純化群體之溶液可用於商業過程，例如用於臨床及大規模製造疫苗。在一些實施例中，與臨床及大規模製程相關之過程體積可低至20升。例如，在一些實施例中，可自包括諾羅病毒VLP之溶液製備疫苗。

在一些實施例中，本發明之態樣進一步可操作用於提供具有VLP之純化群體之溶液，其中該溶液含有至少約50%具有全長VP1亞單元之VLP。在一些實施例中，具有VLP之純化群體之溶液含有至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約 80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%及其之間之所有值之具有全長VP1亞單元之VLP。換言之，具有VLP之純化群體之溶液可實質上不含具有經截短VP1亞單元之VLP。在一些實施例中，具有VLP之純化群體之溶液含有至多約5%、至多約10%、至多約15%、至多約20%、至多約25%、至多約30%、至多約35%、至多約40%、至多約45%、至多約50%及其之間之所有值之具有經截短VP1亞單元之VLP。

在一些實施例中，具有VLP之純化群體之溶液可自含有至少約5%具有經截短VP1亞單元之VLP的未純化溶液產生。在一些實施例中，未純化溶液可含有至少約6%、至少約7%、至少8%、至少約9%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%及其之間之所有值之具有經截短VP1亞單元之VLP。

未純化溶液可為任何處理/未處理溶液，其包括細胞溶胞物溶液、培養上清液、濾液、調整過pH的溶液及/或諸如此類。在一些實施例中，具有VLP之純化群體之溶液係如前文所述自未純化溶液藉由pH處理步驟及自pH處理移除經截短VP1亞單元產生。移除可藉由離心、沈澱、絮凝、沉降、過濾及/或諸如此類中之一或多者實施。在一些實施例中，具有全長VP1亞單元之VLP之純化群體可藉由將一或多個層析過程施加至VLP之純化群體之溶液來產生。

有利地，藉由該等實施例中之任一者產生之純化VLP實質上不含活病毒感染物。不含感染物可指不存在能夠感染之活性劑，例如活宿主細胞病毒本身。換言之，純化VLP可含有不活化且不能感染之試劑。舉例而言，即使含有經處理之桿狀病毒以使桿狀病毒不再能感染的試樣仍含有不活化之桿狀病毒，但該試樣不含感染物。此外，試樣不需絕對不含能夠感染之活性劑，相反，若適用，試樣僅需足夠不含 活性劑以使試樣可作為人類或動物疫苗用於其預期目的(即，若適用，其滿足規定人類或動物疫苗內之感染物之可接受含量的任何美國聯邦法規(United States federal regulations))。

本發明方法尤其可用作放大VLP產生用於臨床及商業製造之方法。納入低pH處理及/或管柱上溶劑及/或清潔劑處理步驟之純化方法產生至少約50-250mg純化VLP/L起始培養物、至少約200-400mg純化VLP/L、至少約350-500mg純化VLP/L、至少約400-750mg純化VLP/L、至少約700-850mg純化VLP/L、至少約800-1000mg純化VLP/L及其之間之所有範圍及子範圍。所產生VLP實質上不含過程污染物及異常VLP結構。在此情況下，「實質上不含」意指如由熟習此項技術者所瞭解，儘管可意欲移除所有過程污染物及異常VLP結構，但與本文所述程序相關之實際態樣可不自最終組合物完全消除污染物及異常VLP結構，但可用於其預期目的。

本發明之實施例進一步可操作以涵蓋包含藉由上文提及之方法純化之VLP之第一子群的疫苗。通常，該等疫苗製備為液體溶液或懸浮液形式之注射劑；亦可製備適於在注射之前溶解或懸浮於液體中之固體形式。該等製劑亦可經乳化或以乾粉形式產生。通常使活性免疫原性成份與醫藥上可接受且與活性成份相容之賦形劑混合。適宜賦形劑係(例如)水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇或諸如此類及其組合。

此外，若需要，疫苗可包含輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝液或增強疫苗效力之佐劑。在一些實施例中，疫苗組合物包含一或多種佐劑與純化之VLP之組合。大多數佐劑含有經設計以保護抗原免於快速分解代謝之物質(例如氫氧化鋁或礦物油)及免疫反應刺激劑(例如百日咳博德特氏桿菌(Bordatella pertussis)或結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)衍生之蛋白質)。可自商品購得之適宜佐劑為：例如弗氏不完全佐劑(Freund's Incomplete Adjuvant)及完全佐劑 (Pifco Laboratories,Detroit,Mich.)；Merck佐劑65(Merck and Company公司，Rahway,N.J.)；鋁鹽，例如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁；鈣、鐵或鋅之鹽；醯基化酪胺酸醯基化糖之不溶性懸浮液；經過陽離子或陰離子衍化之多糖；聚磷腈；生物可降解微球體；及Quil A。

適宜佐劑亦包括(但不限於)類鐸(toll-like)受體(TLR)激動劑，特定言之4型類鐸受體(TLR-4)激動劑(例如，單磷醯脂質A(MPL)、合成脂質A、脂質A模擬物或類似物)、鋁鹽、細胞因子、皂苷、胞壁醯二肽(MDP)衍生物、CpG寡糖、革蘭氏陰性細菌之脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳液、病毒體、螺旋狀物、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆(poloxamer)顆粒、微粒、脂質體、水包油乳液、MF59及角鯊烯。在一些實施例中，佐劑不為細菌衍生之外毒素。較佳佐劑包括刺激Th1型反應之佐劑，例如3DMPL或QS21。

單磷醯脂質A(MPL)(即沙門氏菌(Salmonella)之脂質A之非毒性衍生物)係已研發為疫苗佐劑之有效TLR-4激動劑(Evans等人，2003)。在臨床前鼠類研究中，已顯示鼻內MPL可增強分泌以及全身體液反應(Baldridge等人，2000；Yang等人，2002)。其亦已證明在超過120,000名患者之臨床研究中為安全且有效之疫苗佐劑(Baldrick等人，2002；Baldridge等人，2004)。MPL經由TLR-4受體刺激誘導先天性免疫性，且因此能夠誘發針對寬範圍之感染病原體(包括革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌、病毒及寄生蟲)之非特異性免疫反應(Baldridge等人，2004；Persing等人，2002)。疫苗調配物中納入MPL應可快速誘導先天性反應、自病毒攻擊誘發非特異性免疫反應，同時增強由疫苗之抗原性組份產生之特異性反應。

在一些實施例中，本發明提供包含單磷醯脂質A(MPL)或3去-O-醯基化單磷醯脂質A(3D-MPL)作為適應性及先天性免疫性之增強劑 的疫苗。化學3D-MPL係3去-O-醯基化單磷醯脂質A與4、5或6條醯基化鏈之混合物。較佳形式之3去-O-醯基化單磷醯脂質A揭示於歐洲專利0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)中，其以引用方式併入本文中。在另一實施例中，本發明提供包含合成脂質A、脂質A模擬物或類似物(例如BioMira之PET脂質A)或經設計以起類TLR-4激動劑作用之合成衍生物的疫苗組合物。

在某些實施例中，疫苗組合物包含兩種佐劑。佐劑之組合可選自彼等上文所述者。在一個特定實施例中，兩種佐劑係MPL及氫氧化鋁(例如，明礬)。在另一特定實施例中，兩種佐劑係MPL及油。

術語「有效佐劑量」或「佐劑之有效量」應由彼等熟習此項技術者充分瞭解，且包括一或多種佐劑能夠刺激對所投與抗原之免疫反應的量，即增加所投與抗原組合物之免疫反應的量，如在鼻洗滌物中之IgA含量、血清IgG或IgM含量或B及T細胞增殖方面所量測。與無任何佐劑之相同抗原組合物相比，免疫球蛋白含量之適宜有效增加包括增加5%以上、較佳25%以上且具體而言50%以上。

在一個實施例中，本發明提供調配用於非經腸投與之疫苗組合物，其中該組合物包括純化VLP與氫氧化鋁及緩衝液之組合。緩衝液可選自由以下組成之群：L-組胺酸、咪唑、琥珀酸、tris、檸檬酸、雙-tris、pipes、mes、hepes、甘胺酸醯胺及三(羥甲基)甲基甘胺酸。在一個實施例中，緩衝液係L-組胺酸或咪唑。較佳地，緩衝液係以約15mM至約50mM、更佳約18mM至約40mM或最佳約20mM至約25mM之濃度存在。在一些實施例中，抗原性或疫苗組合物之pH係約6.0至約7.0、或約6.2至約6.8、或約6.5。疫苗組合物可為水性調配物。

在一些實施例中，除VLP、氫氧化鋁及緩衝液外，疫苗組合物進一步包含至少一種佐劑。舉例而言，佐劑可為類鐸受體激動劑，例如MPL、鞭毛蛋白、CpG寡核苷酸、合成脂質A或脂質A模擬物或類似 物。在一些實施例中，佐劑係MPL。

在一個實施例中，本發明疫苗可調配為含有一或多種純化VLP抗原作為免疫原、佐劑(例如MPL)、生物聚合物(例如殼聚糖，以促進與黏膜表面之黏著)及增積劑(例如甘露醇及蔗糖)的乾粉。使用諾羅病毒作為無包膜病毒之非限制性實例，諾羅病毒疫苗可調配物為10mg含有一或多種諾羅病毒基因群抗原(例如，Norwalk病毒、Houston病毒、Snow Mountain病毒)、MPL佐劑、殼聚糖黏膜黏著劑及甘露醇及蔗糖(或其他糖，例如右旋糖、乳糖、海藻糖及甘油)作為增積劑且用以提供適當流動特性的乾粉。調配物可包含約7.0mg(25至90% w/w範圍)殼聚糖、約1.5mg甘露醇(0至50% w/w範圍)、約1.5mg蔗糖(0至50% w/w範圍)、約25μg MPL(0.1至5% w/w範圍)及約100μg諾羅病毒抗原(0.05至5% w/w範圍)。

以上述諾羅病毒疫苗調配物繼續，諾羅病毒抗原可以約0.01%(w/w)至約80%(w/w)之濃度存於疫苗中。在一些實施例中，諾羅病毒抗原可以約5μg、約15μg及約50μg/10mg乾粉調配物(0.025、0.075及0.25% w/w)之劑量調配用於投與至兩個鼻孔中或以約10μg、約30μg及約100μg(0.1、0.3及1.0% w/w)之劑量調配用於投與至一個鼻孔中。在每一投與期間，調配物可在一個或兩個鼻孔中給予。在首次投與後1至12週可加強投與以改良免疫反應。疫苗及抗原性調配物中之諾羅病毒抗原之含量可在1μg至100mg範圍內，較佳在1μg至500μg範圍內，更佳在5μg至200μg範圍內，最通常在10μg至100μg範圍內。以每一劑量投與之總諾羅病毒抗原可為約10μg、約30μg或約100μg，在投與至兩個鼻孔時在總共20mg乾粉中，或在投與至一個鼻孔時在總共10mg乾粉中。乾粉特性應使得小於10%顆粒之直徑小於10μm。平均粒徑之直徑在10μm至500μm範圍內。

在一些實施例中，疫苗組合物係凍乾粉末且重構成水性調配 物。因此，本發明涵蓋製造純化諾羅病毒組合物之方法，該等方法包含(a)製備包含諾羅病毒抗原、蔗糖及殼聚糖之預凍乾溶液，其中蔗糖對殼聚糖之比率係約0：1至約10：1；(b)冷凍溶液；及(c)將冷凍溶液凍乾30-72小時，其中最終凍乾產物含有一定百分比之呈聚集形式之該諾羅病毒抗原。凍乾可在環境溫度、降低溫度下發生，或在不同溫度下在循環中進行。僅出於闡釋目的，凍乾可經一系列步驟發生，例如如下循環：於-69℃下開始，經3小時逐漸調整至-24℃，隨後保持此溫度18小時，隨後經1小時逐漸調整至-16℃，隨後保持此溫度6小時，隨後經3小時逐漸調整至+34℃，且最後保持此溫度9小時。在一個實施例中，預凍乾溶液進一步包含增積劑。在另一實施例中，該增積劑係甘露醇。

可藉由以下指南測定適於產生期望百分比之聚集之蔗糖與殼聚糖之比率。端視預凍乾溶液濃度而定，含有約2：1至約10：1範圍內之蔗糖對殼聚糖之質量比的預凍乾混合物在凍乾後將產生約50%至100%範圍內之完整病毒抗原(即0%至50%聚集抗原)。0：1之蔗糖對殼聚糖之質量比將產生小於30%完整諾羅病毒抗原(即大於70%之聚集抗原)。省略蔗糖及殼聚糖二者及僅使用增積劑(例如甘露醇)將產生小於10%之完整抗原(即端視預凍乾溶液濃度而定，大於90%聚集抗原)。使用該等指南，熟習此項技術者可調整預凍乾混合物中之蔗糖對殼聚糖質量比及濃度，以獲得產生最佳免疫反應所需之期望量之聚集。

疫苗可以與劑量調配物相容之方式且以如治療有效且具免疫原性之該量投與。此外，已知獲得疫苗之佐劑效應之各種方法且其可與本文所揭示VLP結合使用。

可利用多種宿主-表現載體系統來表現VLP多肽。該等宿主-表現系統代表媒劑，藉由其可產生VLP多肽以產生VLP。

在哺乳動物宿主細胞中，可利用多個基於病毒之表現系統。另 外，可選擇調節插入序列表現之宿主細胞，或以特定期望方式改質並處理基因產物。蛋白質產物之該等改質對於VLP之產生或VLP多肽或額外多肽(例如佐劑或額外抗原)之功能可係重要的。對於蛋白質及基因產品之轉譯後處理及改質，不同宿主細胞具有獨特且特異性機制。適當細胞系或宿主系統可經選擇以確保所表現外來蛋白質之正確改質及處理。為此，可使用對初級轉錄物之適宜處理、基因產物之糖基化及磷酸化具有細胞機制之真核宿主細胞。

本發明之某些態樣包括與VLP製劑相關之額外抗原，且可為能夠誘發免疫反應之任何物質。在一些實施例中，抗原可為任何過敏原。過敏原包括(但不限於)細胞、細胞提取物、蛋白質、多肽、肽、多糖、多糖結合物、多糖及其他分子之肽及非肽模擬物、小分子、脂質、糖脂及碳水化合物。

藉由參考以下非限制性實例可更好地理解本發明。除非上下文另外明確說明，否則如本說明書中所用單數形式「一」(「a」、「an」)及「該」包括複數指示。若上述方法及/或方案指示以特定次序發生之某些事件及/或流動圖案，則可對某些事件及/或流動圖案之次序進行改質。例如，可針對疫苗製程期間產生之任何過程中間體(包括但不限於主體產生培養物、澄清產生培養物、層析洗脫部分、層析流出物/洗滌部分、超濾/透析過濾滯留物部分及/或過程部分濾液)實施藉由低pH處理之VLP處理。

另外，若可能，可在平行過程中同時實施某些事件，以及依序實施。

實例 Sf9培養物

於27℃及環境空氣飽和下在燒瓶中實施Sf9昆蟲細胞之常規培育。經多個傳代培養Sf9細胞用於桿狀病毒擴增及VLP產生。使用自 動細胞計數器(T4 Cellometer,Nexcelom Bioscience)實施Sf9培養物之常規計數。

重組桿狀病毒

藉由使用Cellfectin根據製造商之說明書將轉移載體及線性桿狀病毒DNA共轉染至黏著性Sf9昆蟲細胞中、之後進行噬菌斑純化及額外輪之桿狀病毒擴增來產生重組桿狀病毒。隨後收穫重組桿狀病毒作為藉由低速離心收穫之上清液部分。將所得重組桿狀病毒調整至最終10% DMSO(v/v)，分成等份試樣並於-80℃下儲存。如上文所概述實施冷凍桿狀病毒之擴增以產生VLP。

VLP產生

使用可棄式Wave生物反應器實施諾羅病毒VLP之產生。對於生物反應器產生，將Sf-900 II不含血清之培養基無菌轉移至Wave生物反應器並培育培養物。在達成適當細胞密度後，向生物反應器培養物中無菌添加重組桿狀病毒並在上文概述之條件下培育表現培養物。基於活細胞密度，通常在感染後4-6天收穫生物反應器培養物。

除諾羅病毒VLP外，產生培養物亦可藉由用含有沙波病毒VP1亞單元之重組桿狀病毒感染而產生。或者，產生培養物可藉由用含有諾羅病毒VP1亞單元之重組桿狀病毒感染而產生，該亞單元經改造以在表面暴露之環區域中含有外來胺基酸及/或抗原(嵌合諾羅病毒VLP)。

生物反應器收穫

對於收穫，藉由添加HCl將生物反應器培養物調整至pH-3.0且隨後於環境溫度下在攪拌下培育2h。隨後藉由添加咪唑將培養物調整至pH-5.0(Norwalk)或pH-6.0(共有)且隨後藉由低速離心進行澄清。藉由過濾離心後上清液實施生物反應器之最終澄清。在下一單元操作之前，將所得收穫材料(條件培養基)於環境室溫下儲存24h或於4℃下儲存1週。

對於含有沙波病毒或嵌合諾羅病毒VLP之主體產生培養物的收穫，將實施研究，從而評價於pH-2.5下處理30min至48h範圍內之時段後污染物移除及VLP回收率。顯示結構上完整之VLP之最有利之回收率及過程污染物之移除的條件將用於放大處理。適於此目的之經改造VLP(包括嵌合變體)之列表通常可參見於2011年1月21日提出申請且標題為「Targeted Heterologous Antigen Presentation on Calicivirus Virus-Like Particles」之PCT申請案第PCT/US2011/022094號及於2009年8月10日提出申請且標題為「Virus-Like Particles Comprising Composite Capsid Amino Acid Sequences for Enhanced Cross Reactivity」之美國發明申請案第13/023,363號，其揭示內容之全文以引用方式併入。

陽離子交換捕獲層析

使用Sartobind S膠囊實施諾羅病毒VLP之陽離子(CE)捕獲層析。對於純化，用乙酸鹽(pH-5.0)平衡膠囊並裝載條件培養基(總共1.5gVLP)。隨後用乙酸鹽(pH-5.0)洗滌膠囊直至280nm(A₂₈₀)處之流出物吸收<200mAU為止。接下來將膠囊用乙酸鹽(pH-5.0)、1% Triton X-100、0.2%磷酸三丁酯飽和並洗滌。在此管柱上溶劑/清潔劑處理後，將膠囊用乙酸鹽(pH-5.0)以100mL/min洗滌直至A₂₈₀<50mAU。利用乙酸鹽(pH-5.0)及NaCl實施諾羅病毒VLP之洗脫。將VLP洗脫部分收集至可棄式瓶或生物過程袋中。

如上文所述藉由陽離子交換層析純化共有VLP，只是對於所有過程緩衝液，使用檸檬酸鹽(pH-6.0)替代乙酸鹽(pH-5.0)。

羥基磷灰石(HA)捕獲層析

使用250mL床體積CHT陶瓷羥基磷灰石管柱(BioRad)實施Norwalk VLP之羥基磷灰石(HA)捕獲層析。對於純化，用MES(pH-6.0)平衡膠囊並裝載條件培養基(總共250mg VLP)。隨後用MES (pH-6.0)洗滌膠囊直至280nm(A₂₈₀)處之流出物吸收<200mAU為止。接下來將膠囊用MES(pH-6.0)、1% Triton X-100、0.2%磷酸三丁酯飽和並洗滌。在此管柱上溶劑/清潔劑處理後，將膠囊用MES(pH-6.0)以70mL/min洗滌直至A₂₈₀<50mAU。藉由用100mM磷酸鈉(pH-6.8)洗滌及利用400mM磷酸鉀(pH-6.8)洗脫實施諾羅病毒VLP之洗脫。將VLP洗脫部分收集至可棄式瓶或生物過程袋中。

對於利用管柱上溶劑/清潔劑處理之沙波病毒或嵌合諾羅病毒VLP之層析，將實施研究，從而評價容許與層析基質(其包括(但不限於)陽離子交換管柱、羥基磷灰石管柱、疏水性交互作用管柱、尺寸排除管柱、陰離子交換管柱、混合模式管柱或親和管柱)有效結合並自其洗脫的緩衝液條件(pH及離子強度)。對於顯示結構上完整之VLP之最有利之回收率及過程污染物之移除的條件，將以類似於上文所概述方式之方式實施VLP處理(包括溶劑/清潔劑處理)。

VLP表徵

在純化後，藉由一組分析方法分析諾羅病毒VLP之純度。使用NuPAGE梯度凝膠實施SDS-PAGE分析。將所得PAGE凝膠用Imperial蛋白質染色劑染色或用銀染色。在捕獲層析步驟期間針對產生培養物之低pH-處理及管柱上溶劑/清潔劑處理藉由標準噬菌斑分析評定桿狀病毒不活化。

藉由使用尺寸排除層析(SEC)及透射式電子顯微術(EM)分析純化產物來實施Norwalk VLP結構完整性之分析。對於SEC，將純化Norwalk VLP稀釋並在Superose 6管柱上分析。對於EM分析，將VLP稀釋於L-組胺酸(pH-6.5)、氯化鈉中，點至銅網狀柵上並用2%乙酸雙氧鈾染色。

結果

生物反應器產生-為研發產生VLP之可放大方法，使用業內通 常已知之技術使Sf9培養物在Wave生物反應器中生長以用重組桿狀病毒感染。

生物反應器收穫-在產生諾羅病毒VLP後，生物反應器培養物含有高含量活桿狀病毒(約10⁷-10⁸pfu/mL)，其在VLP製造期間必須不活化且經清除。實施研究以測定產生培養物之低pH-處理是否係收穫期間之可行步驟。如表1中所示，在研究中達成高桿狀病毒(AcNPV)不活化程度(對於Norwalk VLP過程>5log₁₀且對於共有VLP過程>4log₁₀)，其中於室溫下將產生培養物於pH<3.5下培育1h。表1亦顯示達成高逆轉錄病毒(A-MLuV)不活化程度(對於Norwalk VLP過程>7log₁₀且對於共有VLP過程>6log₁₀)。相比之下，藉由SDS-PAGE及尺寸排除層析之產生培養物之分析顯示在低pH處理產生培養物後，Norwalk及共有VLP二者保持可溶且結構上完整。在產生期間，通常在諾羅病毒VP1亞單元中觀察到N末端蛋白水解解離。除清除大量Sf9宿主細胞蛋白質外，顯示藉由主體培養物之低pH處理而選擇性移除含有經截短VP1之VLP(圖1A及1B)。

基於上述發現，已藉由低pH-處理及藉由低速離心之初步澄清研發收穫策略。為進一步保護下游捕獲步驟，使所得低速上清液/濾液部分穿過PES膠囊過濾器且隨後進入含有膠囊過濾器之無菌生物過程袋中。此收穫策略提供諾羅病毒VLP之有效回收，該等諾羅病毒VLP在所述儲存條件下在所得條件培養基中穩定且產生相對純VLP部分用 於下游處理。

下游處理-對於下游處理，重點放在充分適於放大cGMP製造之正交純化方法上。以下程序經設計以處理來自起始條件培養基之VLP。

陽離子交換層析-基於膜之層析已因大直徑(約1μm)膜孔中之有效質量轉移而用於純化大型巨分子複合物。與習用基於珠粒之層析基質相比有效結合諾羅病毒VLP之Sartobind S陽離子交換膜已用於自條件培養基捕獲及純化VLP(圖2A)。為在諾羅病毒VLP下游處理期間促進桿狀病毒之不活化，已在捕獲步驟中納入使用含有1% Triton X-100、磷酸三丁酯之平衡緩衝液之管柱上溶劑/清潔劑處理步驟。在洗滌膠囊以移除溶劑/清潔劑緩衝液後，用含有氯化鈉之平衡緩衝液之分級梯度洗脫諾羅病毒VLP。目前處理方案指定在Sartobind S 10”膠囊上裝載最大1.5g之條件培養基中之諾羅病毒VLP。如表2中所示，達成高桿狀病毒(AcNPV)不活化程度(對於Norwalk VLP過程>4log₁₀，且對於共有VLP過程>4log₁₀)。表2亦顯示達成高逆轉錄病毒(A-MLuV)不活化程度(對於Norwalk VLP過程>7log₁₀，且對於共有VLP過程>6log₁₀)。進一步觀察到，在採用低pH處理及管柱上溶劑/清潔劑處理時，表1及2中所列舉純化值之數值加和係包膜病毒之不活化之精確量度。

類似於陽離子交換層析，亦已顯示利用管柱上溶劑/清潔劑處理 之羥基磷灰石捕獲層析可有效處理諾羅病毒VLP(圖2B)。

純化諾羅病毒VLP之表徵-為評價使用多步層析過程之產生及下游處理後之VLP之組裝狀態，藉由尺寸排除層析(SEC)及透射式電子顯微術(EM)分析純化VLP。在所述條件下藉由SEC分析時，Norwalk及共有VLP顯示約7.2-7.6分鐘之滯留時間與具有幾百萬道爾頓(Dalton)之分子量之純化產物一致(圖3A)。由於拆卸VP1衣殼蛋白以約15分鐘之滯留時間洗脫，故該等結果證實大部分衣殼蛋自質納入組裝VLP中。藉由透射之純化材料之分析指示Norwalk及共有VLP之主要為約35-40nm之均勻顆粒，與VP1衣殼單體之T3二十面體組裝一致(圖3B)。

藉由溶劑/清潔劑處理進行之病毒不活化/清除.

將模型病毒摻入共有VLP條件培養基中並藉由在具有及不具有管柱上溶劑/清潔劑處理之陽離子交換層析進行處理。如表3中所示，觀察到僅藉由CE步驟模型病毒之減少極小，而包括管柱上溶劑/清潔劑處理可提供高清除率/不活化程度。

¹ 雙嗜性鼠類白血病病毒。

² 桿狀病毒。

藉由低pH及溶劑/清潔劑處理進行之病毒不活化/清除.

在Sf9昆蟲細胞中產生諾羅病毒VLP後，在藉由習用方法(低速離心及過濾)收穫後，生物反應器產生培養物含有高含量活桿狀病毒(約10⁸pfu/mL)。表4顯示，僅低pH處理不能以在產生培養物中發現之程 度使桿狀病毒完全不活化。相比之下，藉由低pH及溶劑/清潔劑處理之組合使桿狀病毒不活化之程度在產生培養物中超過約10pfu/mL。

藉由低pH處理之VP1蛋白水解片段之移除

在桿狀病毒表現系統中產生期間，共有VP1亞單元可經歷蛋白水解解離，從而對表現材料之特定部分引起N末端截短產生。此蛋白水解片段組裝至VLP中並在下游處理期間與包括全長VP1亞單元之VLP共純化。在研發研究期間，發現主體生物反應器產生培養物之低pH處理會選擇性移除含有N末端截短產物之VLP群體，其為下游處理提供更均質材料。

在下游處理後，藉由銀染色SDS-PAGE及光密度測定法之共有VLP藥物物質之分析顯示，自收穫時未經pH處理之生物反應器培養物純化之VLP的VP1 N末端截短產物之含量較大(表5)。相比之下，自pH處理之生物反應器培養物純化的VLP僅由全長VP1亞單元構成。

¹ 針對5個個別共有VLP組顯示之結果。

藉由管柱上溶劑/清潔劑處理之宿主細胞蛋白質清除

在收穫生物反應器產生培養物後，藉由利用管柱上溶劑/清潔劑 處理之陽離子交換(CE)層析處理Norwalk及共有VLP。評價生物反應器收穫材料(CE裝載)及陽離子交換洗脫部分(CE洗脫)之VLP及Sf9宿主細胞蛋白質(HCP)含量。對於該等研究，藉由尺寸排除層析測定VLP含量並使用市售ELISA套組(Cygnus Technologies，目錄號：F020)測定HCP含量。表6顯示過程部分之HCP含量之多個VLP組中平均化之數據，且顯示藉由CE步驟HCP明顯減少，如藉由上述分析所測定。

藉由低pH處理及深度過濾之Norwalk及共有VLP生物反應器產生培養物之收穫

對於Norwalk及共有VLP之當前製造，藉由低pH處理並藉由離心/過濾進行澄清來收穫生物反應器產生培養物。當前收穫程序之低pH處理步驟用於使病毒不活化及移除過程污染物，而離心用於產生培養物之初步澄清。儘管離心係已確立且可放大之生物反應器澄清方法(參見圖4A)，但替代使用深度過濾進行初步澄清(參見圖4B)提供多個優勢，包括便於可棄材料之操作及利用性，此消除對清除確認的需要。

為進一步表徵並改良生物反應器產生培養物之收穫，實施研發研究以：1)評價桿狀病毒及宿主細胞核酸過程污染物之清除；及2) 評價使用矽藻土深度過濾器進行初步澄清。上文概述之研究匯總於圖4A-4B中，且如下實施：在振動燒瓶或攪拌罐式生物反應器中產生Norwalk及共有VLP產生培養物。

藉由以下方式收穫產生培養物：低速離心及0.2μm過濾；低pH處理，之後低速離心及0.2μm過濾；低pH處理，之後深度過濾及0.2μm過濾。

藉由qPCR評價過程部分之核酸含量且藉由尺寸排除層析評價VLP回收率。

對於表7中所示之研究，收穫時低pH處理步驟可顯著清除Norwalk(減少至1/12.7至1/47.4)及共有(減少至1/2.9至1/3.0)VLP產生培養物之核酸污染物。另外，使用深度過濾器替代離心進行初步澄清會增加Norwalk(減少至1/65.0至1/110.9)及共有(減少至1/30.7至1/51.9)VLP產生培養物之核酸污染物的總體清除率。

¹ 藉由離心/0.2μm過濾(無pH處理)澄清之收穫部分。

² pH處理及離心/0.2μm過濾後之收穫部分。

³ pH處理及Millistak+DQHC深度過濾/0.2μm過濾後之收穫部分。

如表8中所示，在使用多種深度過濾器之收穫研究中觀察到155-390L/m²範圍內之容量及73-101%之VLP回收率。所觀察有利之過濾量及VLP回收率使得該方法適於使用放大製造。

N/A-不可獲得。

Claims (96)

1. 一種用於純化類病毒顆粒(VLP)之方法，該方法包含：產生或獲得含有該等VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液；將該溶胞物、上清液或濾液之pH調整至小於約5之pH值以產生調整過pH的溶液；及自該調整過pH的溶液移除非VLP粒子/聚集物以產生包含該等VLP之純化溶液。
2. 如請求項1之方法，其中該等VLP至少包含該等VLP之第一子群及第二子群。
3. 如請求項2之方法，其中該移除該等非VLP粒子/聚集物包含自該調整過pH的溶液移除VLP之該第二子群，其中該純化溶液實質上保留VLP之該第一子群。
4. 如請求項3之方法，其進一步包含在自該調整過pH的溶液移除VLP之該第二子群以產生該純化溶液後，自該純化溶液移除VLP之該第一群體。
5. 如請求項4之方法，其中該細胞溶胞物或培養上清液/濾液之該等VLP係諾羅病毒(norovirus)VLP，其中該第一子群包含具有全長VP1亞單元之諾羅病毒VLP，且其中該第二子群包含具有經截短VP1亞單元之諾羅病毒VLP。
6. 如請求項4之方法，其中VLP之該第一子群對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約2倍。
7. 如請求項3之方法，其中VLP之該第一子群對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約2倍。
8. 如請求項1之方法，其中該調整該pH係以約30分鐘至約48小時之間之持續時間進行。
9. 如請求項1之方法，其中該等VLP包含酸穩定之VLP。
10. 如請求項1之方法，其中該溶胞物、上清液或濾液之調整過之pH小於約3。
11. 如請求項1之方法，其中該溶胞物、上清液或濾液之調整過之pH小於約4。
12. 如請求項1之方法，其中該移除係經由以下一或多種過程進行：離心、沈澱、絮凝、沉降及過濾。
13. 如請求項12之方法，其中該移除包括藉由深度過濾及之後的額外過濾產生該純化溶液，來澄清該調整過pH的溶液。
14. 如請求項1之方法，其中該純化結果，自該溶胞物、上清液或濾液移除至少約65%殘餘污染核酸。
15. 如請求項1之方法，其中該純化結果，自該溶胞物、上清液或濾液移除至少約98%殘餘污染核酸。
16. 如請求項1之方法，其進一步包含使用一或多個層析過程，自該純化溶液分離VLP之第一子群，每一層析過程獨立地選自：羥基磷灰石層析、疏水性交互作用層析、尺寸排除層析、離子交換層析、混合模式層析及親和層析。
17. 一種用於純化類病毒顆粒(VLP)之方法，該方法包含：產生或獲得含有VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液；及使用多步層析過程純化該等VLP，其中該多步層析過程之至少一個層析過程包含：使該溶胞物、上清液或濾液與層析材料接觸，其中該等VLP結合至該層析材料；用溶劑及/或清潔劑處理該層析材料；及在該處理後，自該層析材料洗脫該等VLP。
18. 如請求項17之方法，其中該溶劑及/或清潔劑包含以下一或多 者：TnBP、辛基苯酚、環氧乙烷縮合物、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯，以及膽酸鈉、Triton X-100及磷酸三丁酯。
19. 如請求項17之方法，其中該等VLP係以下一或多者：諾羅病毒基因群I VLP、諾羅病毒基因群II VLP、諾羅病毒基因群IV VLP、嵌合諾羅病毒VLP及沙波病毒(sapovirus)VLP。
20. 如請求項17之方法，其中與該溶胞物、上清液或濾液相比，該等VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約10倍。
21. 如請求項17之方法，其中與該溶胞物、上清液或濾液相比，該等VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約90倍。
22. 如請求項17之方法，其中該純化結果，自該溶胞物、上清液或濾液移除至少約50%殘餘污染蛋白質。
23. 如請求項17之方法，其中該純化結果，自該溶胞物、上清液或濾液移除至多約99%殘餘污染蛋白質。
24. 如請求項17之方法，其中在該純化期間損失不超過約50%之該等VLP。
25. 如請求項17之方法，其中該純化結果，回收至少約65%之該等VLP。
26. 如請求項17之方法，其中每一層析過程獨立地選自：羥基磷灰石層析、疏水性交互作用層析、尺寸排除層析、離子交換層析、混合模式層析、基於膜之層析及親和層析。
27. 如請求項26之方法，其中該多步層析過程之第一層析過程係離子交換層析，其中該離子交換層析係選自陰離子交換層析及陽離子交換層析。
28. 如請求項27之方法，其中該處理步驟係在該離子交換層析過程之離子交換管柱上進行。
29. 如請求項27之方法，其進一步包含一或多個額外層析過程。
30. 如請求項17之方法，其中該多步層析過程之第一層析過程係選自離子交換層析、羥基磷灰石層析及疏水性交互作用層析。
31. 如請求項17之方法，其中該溶胞物、上清液或濾液係使用重組方法產生。
32. 如請求項31之方法，其中該等VLP係在細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、植物或哺乳動物細胞中產生。
33. 一種純化類病毒顆粒(VLP)之方法，該方法包含：產生或獲得含有VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液，該等VLP至少包含該等VLP之第一子群及第二子群；將該溶胞物、上清液或濾液之pH調整至小於約5之pH以產生調整過pH的溶液；使用過濾過程，自該調整過pH的溶液移除VLP之該第二子群，以產生經過濾之純化溶液，其中該經過濾之純化溶液實質上保留VLP之該第一子群；及使用多步層析過程自該經過濾之純化溶液分離VLP之該第一子群。
34. 如請求項33之方法，其中該多步層析過程之至少一個層析過程包含：使該經過濾之純化溶液與層析材料接觸，其中VLP之該第一子群結合至該層析材料；用溶劑及/或清潔劑處理該層析材料；及自該層析材料洗脫VLP之該第一子群。
35. 如請求項34之方法，其中與該溶胞物、上清液或濾液相比，VLP之該第一子群對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約2倍。
36. 如請求項33之方法，其中每一層析過程獨立地選自：羥基磷灰石層析、疏水性交互作用層析、尺寸排除層析、離子交換層 析、混合模式層析及親和層析。
37. 如請求項33之方法，其中該等VLP係以下一或多者：諾羅病毒基因群I VLP、諾羅病毒基因群II VLP、諾羅病毒基因群IV VLP、嵌合諾羅病毒VLP及沙波病毒VLP。
38. 如請求項37之方法，其中該等VLP係諾羅病毒基因群I VLP，其中該第一子群包含具有全長VP1亞單元之諾羅病毒VLP，且其中該第二子群包含具有經截短VP1亞單元之諾羅病毒VLP。
39. 如請求項33之方法，其中該溶胞物、上清液或濾液係使用重組方法產生。
40. 如請求項33之方法，其中該等VLP係在細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、植物或哺乳動物細胞中產生。
41. 如請求項33之方法，其中該溶胞物、上清液或濾液之調整過之pH小於約3。
42. 如請求項33之方法，其中該溶胞物、上清液或濾液之調整過之pH小於約4。
43. 如請求項33之方法，其中該pH之調整係以約30分鐘至約48小時之間之持續時間進行。
44. 如請求項33之方法，其中該過濾過程包括深度過濾過程。
45. 如請求項33之方法，其在過濾後進一步包含以下一或多種過程：離心、沈澱、絮凝、沉降及額外過濾。
46. 一種疫苗，其包含藉由如請求項33之方法製備之VLP之該第一子群。
47. 一種用於純化類病毒顆粒(VLP)之方法，該方法包含：產生或獲得含有該等VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液；將該溶胞物、上清液或濾液之pH調整至小於約5之pH值以產生調整過pH的溶液；及 自該調整過pH的溶液移除非VLP粒子/聚集物，該移除包括藉由深度過濾過程澄清該調整過pH的溶液以產生經純化之深度過濾溶液。
48. 如請求項47之方法，其中該深度過濾過程包含使該調整過pH的溶液與一或多個深度過濾器接觸。
49. 如請求項47之方法，其中至少一個深度過濾器係矽藻土深度過濾器。
50. 如請求項48之方法，其中該一或多個深度過濾器係複數個矽藻土深度過濾器，其各自具有獨立地選自約50升/m²至約1000升/m²之範圍之過濾量。
51. 如請求項47之方法，其中該一或多個深度過濾器係單一深度過濾器，其各自具有選自約150升/m²至約400升/m²之範圍之過濾量。
52. 如請求項47之方法，其中與該溶胞物、上清液或濾液相比，自該調整過pH的溶液移除至少約99%殘餘污染核酸。
53. 如請求項47之方法，其中與該溶胞物、上清液或濾液相比，自該調整過pH的溶液移除至少約95%殘餘污染核酸。
54. 如請求項47之方法，其中與該溶胞物、上清液或濾液相比，自該調整過pH的溶液回收至少約75%之該等VLP。
55. 如請求項47之方法，其中與該溶胞物、上清液或濾液相比，自該調整過pH的溶液回收約100%之該等VLP。
56. 如請求項47之方法，其中該等VLP至少包含該等VLP之第一子群及第二子群，且其中該澄清法自該調整過pH的溶液分離VLP之該第二子群，以產生該經深度過濾之純化溶液，且其中該經深度過濾之純化溶液實質上保留VLP之該第一子群。
57. 如請求項56之方法，該分離法進一步包含使用一或多個層析過 程自該經深度過濾之純化溶液分離VLP之該第一子群，每一層析過程獨立地選自：羥基磷灰石層析、疏水性交互作用層析、尺寸排除層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、混合模式層析及親和層析。
58. 如請求項55之方法，其中該等VLP係以下一或多者：諾羅病毒基因群I VLP、諾羅病毒基因群II VLP、諾羅病毒基因群IV VLP、嵌合諾羅病毒VLP及沙波病毒VLP。
59. 如請求項58之方法，其中該等VLP係諾羅病毒基因群I VLP，其中該第一子群包含具有全長VP1亞單元之諾羅病毒VLP，且其中該第二子群包含具有經截短VP1亞單元之諾羅病毒VLP。
60. 如請求項47之方法，其中該細胞溶胞物或該培養上清液/濾液係使用重組方法產生。
61. 如請求項47之方法，其中該等VLP係在細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、植物或哺乳動物細胞中產生。
62. 一種溶液，其包含諾羅病毒VLP之純化群體，其中如藉由尺寸排除層析及ELISA所量測，該溶液含有相對於VLP不超過約80%之殘餘污染蛋白質。
63. 一種疫苗，其包含自如請求項62之溶液製備之諾羅病毒VLP。
64. 如請求項62之溶液，其係自含有該等諾羅病毒VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液中純化。
65. 如請求項64之溶液，其含有相對於該溶胞物、上清液或濾液不超過約35%之殘餘污染核酸。
66. 如請求項64之溶液，其中自該溶胞物、上清液或濾液回收至少約50%之該等諾羅病毒VLP。
67. 如請求項64之溶液，其中與該溶胞物、上清液或濾液相比，該等諾羅病毒VLP對殘餘污染蛋白質之比率增加至少約10倍。
68. 如請求項62之溶液，其中該溶液適用於商業過程中，該商業過程具有至少20升之處理容量。
69. 如請求項62之溶液，其係藉由以下一或多種過程產生：pH處理、離心、沈澱、絮凝、沉降、過濾及層析。
70. 如請求項69之溶液，其係藉由以下方式產生：產生或獲得含有該等諾羅病毒VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液，該等諾羅病毒VLP至少包含該等諾羅病毒VLP之第一子群及第二子群；將該溶胞物、上清液或濾液之pH調整至小於約5之pH，產生調整過pH的溶液；使用過濾過程自該調整過pH的溶液移除該諾羅病毒VLP之第二子群，以產生經過濾之純化溶液，其中該經過濾之純化溶液實質上保留諾羅病毒VLP之該第一子群；及使用多步層析過程自該經過濾之純化溶液分離諾羅病毒VLP之該第一子群。
71. 如請求項70之溶液，其中該等諾羅病毒VLP係諾羅病毒基因群I VLP，其中該第一子群包含具有全長VP1亞單元之諾羅病毒基因群I VLP，且其中該第二子群包含具有經截短VP1亞單元之諾羅病毒基因群I VLP。
72. 如請求項70之溶液，其中該等諾羅病毒VLP係諾羅病毒基因群II VLP，其中該第一子群包含具有全長VP1亞單元之諾羅病毒基因群II VLP，且其中該第二子群包含具有經截短VP1亞單元之諾羅病毒基因群II VLP。
73. 一種包含VLP之純化群體之溶液，其中該溶液含有至少50%具有全長VP1亞單元之VLP。
74. 如請求項73之溶液，其含有至多約100%具有該全長VP1亞單元 之VLP。
75. 如請求項73之溶液，其中該溶液實質上不含具有經截短VP1亞單元之VLP。
76. 如請求項73之溶液，其係自含有至少10%具有經截短VP1亞單元之VLP的未純化溶液產生。
77. 如請求項76之溶液，其中該未純化溶液包括含有該等VLP之細胞溶胞物、培養上清液或濾液。
78. 如請求項76之溶液，其中該溶液係藉由以下方式自該未純化溶液產生：將該未純化溶液之pH調整至小於約5之pH值以產生調整過pH的溶液；及自該調整過pH的溶液移除具有經截短VP1亞單元之VLP以產生該溶液作為純化溶液，其中該調整過pH的溶液實質上保留具有該全長VP1亞單元之該等VLP。
79. 如請求項78之溶液，其中該移除係經由以下一或多種過程進行：離心、沈澱、絮凝、沉降及過濾。
80. 一種具有全長VP1亞單元之VLP的純化群體，其係由如請求項73之溶液經過一或多個層析過程所產生。
81. 一種清除溶液中之活病毒及/或使其不活化的方法，該溶液含有該活病毒且進一步含有由該活病毒產生之VLP，該方法包含將含有該活病毒之該溶液之pH調整至小於約5之pH值以產生調整過pH的溶液。
82. 如請求項81之方法，其中該調整過pH的溶液中之活病毒含量減少至少約10⁴倍。
83. 如請求項81之方法，其中該調整過pH的溶液中之該活病毒含量減少至少約10⁵倍。
84. 如請求項81之方法，其中該等VLP係選自基因群I VLP及基因群II VLP。
85. 如請求項81之方法，其中該活病毒包括桿狀病毒。
86. 如請求項81之方法，其進一步包含：自該調整過pH的溶液移除非VLP粒子/聚集物以產生純化溶液；及使用至少一個層析過程純化該純化溶液，其中該至少一個層析過程包含：使該調整過pH的溶液與層析材料接觸，其中該等VLP結合至該層析材料；用溶劑及/或清潔劑處理該層析材料；及在該處理後，自該層析材料洗脫該等VLP以產生洗脫物，其中與含有該活病毒之該溶液相比，該洗脫物中之該活病毒含量減少至少約10²。
87. 如請求項86之方法，其中與含有該活病毒之該溶液相比，該洗脫物中之該活病毒含量減少至少約10³倍。
88. 如請求項86之方法，其中該等VLP係選自基因群I VLP及基因群II VLP。
89. 如請求項86之方法，其中該活病毒包括桿狀病毒。
90. 一種純化之VLP組合物，其係自如請求項86之洗脫物產生。
91. 一種疫苗，其係自如請求項86之洗脫物產生。
92. 一種清除溶液中之活病毒及/或使其不活化的方法，該溶液含有該活病毒且進一步含有由該活病毒產生之VLP，該方法包含使用至少一個層析過程純化含有該活病毒之該溶液，其中該至少一個層析過程包含：使含有該活病毒之該溶液與層析材料接觸，其中該等VLP結合 至該層析材料；用溶劑及/或清潔劑處理該層析材料；及在該處理後，自該層析材料洗脫該等VLP以產生洗脫物。
93. 如請求項92之方法，其中與含有該活病毒之該溶液相比，該洗脫物中之該活病毒含量減少至少約10⁵倍。
94. 如請求項92之方法，其中與含有該活病毒之該溶液相比，該洗脫物中之該活病毒含量減少至少約10⁷倍。
95. 如請求項92之方法，其中該等VLP係選自基因群I VLP及基因群II VLP。
96. 如請求項92之方法，其中該活病毒包括桿狀病毒。