TW202330924A - 新型冠狀病毒mRNA疫苗及其製備方法與用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供了一種新型冠狀病毒mRNA疫苗及其製備方法與用途。本發明提供一種能編碼目標多肽的mRNA分子,其中,所述的目標多肽包括SARS-CoV-2刺突蛋白S中NTD-RBD天然結構域,所述NTD-RBD天然結構域包括NTD片段與RBD片段,NTD片段與RBD片段之間以來源於S蛋白的天然胺基酸序列作為連接子連接。本發明提供了編碼SARS-CoV-2中刺突蛋白的NTD-RBD天然結構域的mRNA,實現了對新型冠狀病毒突變株的免疫效果,適用性廣。
Description
本發明是關於一種mRNA疫苗及其製備方法與用途,具體是一種針對新型冠狀病毒(包括原始株和/或突變株)的mRNA疫苗、其製備方法與相關用途。
mRNA疫苗技術可以作為快速靈活的技術平臺,有效應對各種新興病毒的威脅。因此mRNA疫苗被認為是對抗新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)最有潛力的一種疫苗。隨著化學修飾mRNA和奈米脂質載體技術的發展和成熟,mRNA在多種病毒疫苗研發中的優勢愈發凸顯。
由於免疫反應的特異性,標靶抗原表位序列(包括B細胞表位和T細胞表位)直接決定了免疫反應的種類。鑒於B細胞免疫和T細胞免疫都在SARS-CoV-2病毒的清除中不可或缺,盡可能去選擇合適的免疫原性片段,是新型冠狀病毒疫苗設計的關鍵一步。在設計針對SARS-CoV-2突變株的標靶抗原時,需要考慮到有些抗原表位會誘導出非中和抗體,這類抗體不能產生有效的保護作用,反而有機率引起藥物不良事件(Adverse Drug Event,ADE)的效應,加重病毒的感染程度。因此在這種情況下,全長S蛋白能否繼續作為疫苗抗原值得深入研究探討。經過研究COVID-19病人體內的血清發現S蛋白的N端區域(N-terminal domain,NTD)片段和受體結合區域(receptor-binding domain,RBD)片段含有多個B細胞和T細胞有效表位,並能夠引發強烈的保護性抗病毒免疫,這也進一步證實了設計新型冠狀病毒疫苗時進行抗原表位分析的重要性。
WO2021159040A9公開了一種編碼包含新型冠狀病毒S蛋白NTD和RBD區域的mRNA疫苗,在胺基酸序列設計中,使用了甘胺酸-絲胺酸連接子(glycine-serine linker)對NTD和RBD區域進行連接。
另一方面,現已發現新型冠狀病毒新型變異株,並且世界範圍內的流行毒株發生了明顯變化,其不同程度的免疫逃逸對現有新型冠狀病毒疫苗和後續疫苗研發工作帶來了挑戰。
本發明的一個目的在於提供一種針對新型冠狀病毒的mRNA疫苗。
本發明的另一個目的在於提供針對新型冠狀病毒的mRNA疫苗的製備方法。
本發明的另一個目的在於提供針對新型冠狀病毒的mRNA疫苗的DNA模板。
本發明的另一個目的在於提供針對新型冠狀病毒的mRNA疫苗的用途。
一方面,本發明提供了一種能編碼目標多肽的mRNA分子,其中,所述的目標多肽包括SARS-CoV-2刺突蛋白S中N端區域(N-terminal domain,NTD)-受體結合區域(receptor-binding domain,RBD)天然結構域(後續簡稱:NTD-RBD天然結構域),所述NTD-RBD天然結構域包括NTD片段與RBD片段,NTD片段與RBD片段之間以來源於S蛋白的天然胺基酸序列作為連接子連接。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,還編碼NTD-RBD天然結構域N端的信號肽。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子編碼的胺基酸序列從N端到C端依次包括信號肽、NTD片段、連接子、RBD片段。
在本發明的一些具體實施方案中,所述信號肽包括但不限於:如SEQ ID NO: 1第1-12位胺基酸組成的序列(MFVFLVLLPLVS)。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,所編碼的NTD-RBD天然結構域中,所述的連接子的胺基酸序列為SEQ ID NO: 50。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,所編碼的NTD-RBD天然結構域中,NTD片段的胺基酸序列選自:
(a)SEQ ID NO: 49的第1至第289位組成的胺基酸序列;
(b)由(a)的胺基酸序列經過替換、增加和/或缺失一個或幾個胺基酸且具有與(a)相同功能的衍生序列。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,所編碼的NTD-RBD天然結構域中,RBD片段的胺基酸序列選自:
(c)SEQ ID NO: 49的第304至第526位組成的胺基酸序列;
(d)由(c)的胺基酸序列經過替換、增加和/或缺失一個或幾個胺基酸且具有與(a)相同功能的衍生序列。
本發明中,所述的「相同功能」是指同樣具有免疫原性。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,所編碼的NTD-RBD天然結構域的胺基酸序列為:
SEQ ID NO: 44至SEQ ID NO: 49中任一序列所示胺基酸序列;或
與SEQ ID NO: 44至SEQ ID NO: 49中任一序列同一性在92.78%以上的衍生的胺基酸序列。
根據本發明的一些具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,所編碼的NTD-RBD天然結構域的胺基酸序列為SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 44中的一種。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,所編碼的胺基酸序列為SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 1。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,其蛋白質編碼區序列包括如SEQ ID NO: 25的第37-1623位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 26的第37-1623位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 27的第37-1623位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 28的第37-1614位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 29的第37-1614位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 30的第37-1614位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 31的第37-1617位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 32的第37-1617位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 33的第37-1617位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 34的第37-1623位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 35的第37-1623位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 36的第37-1623位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 37的第37-1623位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 38的第37-1623位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 39的第37-1623位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 40的第37-1614位核苷酸組成的序列、SEQ ID NO: 41的第37-1614位核苷酸組成的序列或SEQ ID NO: 42的第37-1614位核苷酸組成的序列。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,其蛋白質編碼區序列如SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 42所示。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,經過1-甲基假尿苷修飾。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,還包括5’-UTR序列和/或3’-UTR序列。
具體地,5’-UTR序列可包含或不包含Kozak序列。在本發明的一些優選實施方案中,所述5'-UTR具有SEQ ID NO: 51所示序列。
在本發明的一些優選實施方案中,3’-UTR序列具有SEQ ID NO: 52所示序列。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,還經過3'加尾修飾和/或至少一個5'加帽修飾。
具體地,3'加尾修飾例如包含多聚腺苷酸尾(Poly-A Tail),所述聚A尾可以是中間插入或不插入連接子的多聚腺苷酸。
具體地,至少一個5'加帽修飾的帽結構可選自Cap0、Cap1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鳥苷、2'氟-鳥苷、7-脫氮-鳥苷、8-氧代-鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷或2-疊氮基-鳥苷。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,其是經分離的mRNA。
根據本發明的具體實施方案,本發明提供的mRNA分子,是經純化的。所述的純化包括但不限於經過層析、氯化鋰或乙醇沉澱、離心柱、氯萃取、乙醇沉澱或凝膠純化。
另一方面,本發明還提供了一種DNA分子,其編碼本發明前述任意一種mRNA分子。
另一方面,本發明還提供了一種重組質體,其含有本發明前述的DNA分子。
另一方面,本發明還提供了一種脂質奈米顆粒,其負載有本發明前述任意一種mRNA分子。
另一方面,本發明還提供了一種藥物組合物,其包含:本發明前述任意一種mRNA分子,以及藥學上可接受的賦形劑。所述的賦形劑可選自溶劑、水溶劑、非水溶劑、分散介質(disperse medium)、稀釋劑、分散劑、懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、脂質、類脂質(lipidoid)脂質體、脂質奈米顆粒、核-殼奈米顆粒、聚合物、脂複合物(lipoplexe)肽、蛋白、細胞、透明質酸酶、及它們的混合物。
另一方面,本發明還提供了本發明所述的mRNA分子、所述的DNA分子、所述的重組質體、所述的脂質奈米顆粒或所述的藥物組合物在製備新型冠狀病毒mRNA疫苗中的用途。
另一方面,本發明還提供了一種新型冠狀病毒mRNA疫苗,其包含本發明所述的mRNA分子。在本發明的一些具體實施方案中,所述的疫苗為脂質奈米顆粒劑型。
根據本發明的具體實施方案,本發明所述的新型冠狀病毒mRNA疫苗,其中,脂質奈米顆粒的粒徑為50 nm~200 nm,優選為50 nm~150 nm。
根據本發明的具體實施方案,本發明所述的新型冠狀病毒mRNA疫苗,其中,所述的脂質奈米顆粒包括mRNA和脂質,其中,所述脂質包括:
a)正電荷脂質和/或可離子化脂質中的一種或多種;
b)中性輔助脂質;
c)膽固醇;以及
d)PEG修飾的脂質。
根據本發明的具體實施方案,本發明所述的新型冠狀病毒mRNA疫苗,其中,所述的正電荷脂質和/或可離子化脂質與mRNA的氮磷莫耳比為5:1 ~ 20:1。
根據本發明的具體實施方案,本發明所述的新型冠狀病毒mRNA疫苗,所述的脂質奈米顆粒中,以脂質的總莫耳量為100%計,各脂質成分的莫耳比為:
正電荷脂質或可離子化脂質:46% ~ 50%;
中性輔助脂質:5% ~ 10%;
膽固醇:38.5% ~ 48%;
PEG修飾的脂質:0 ~ 3%。
根據本發明的具體實施方案,本發明所述的新型冠狀病毒mRNA疫苗,所述的脂質奈米顆粒中,所述的可離子化脂質包括但不限於:4-(N,N-二甲基胺基)丁酸(二亞油基)甲酯((Dlin-MC3-DMA)、SM-102、((4-羥基丁基)氮雜二烷基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)中的一種或多種,所述的正電荷脂質包括但不限於:DOTMA、DOTAP中的一種或多種;所述的中性輔助脂質包括但不限於:DSPC、DOPE、DSPE中的一種或多種;所述的PEG修飾的脂質包括但不限於:甲氧基聚乙二醇雙十四烷基乙醯胺(ALC-0159)、DMG-PEG中的一種或多種。
根據本發明的具體實施方案,本發明所述的新型冠狀病毒mRNA疫苗,為冷凍乾燥劑型或冷凍劑型。
另一方面,本發明還提供了一種新型冠狀病毒mRNA疫苗的製備方法,其包括製備所述mRNA分子的過程。具體地,包括以下步驟:
合成編碼NTD-RBD天然結構域肽段的DNA片段,並複製到質體作為模板,轉錄製備得到目標mRNA分子。
優選地,所述目標mRNA分子為本發明前述的任意一項mRNA分子。
在本發明的一些具體實施方案,本發明提供了製備所述mRNA分子的方法,其中,合成編碼NTD-RBD天然結構域肽段的DNA片段的過程可自行合成或委託合成。將所述DNA片段複製到質體作為模板進行,可按照如下反應製備目標mRNA分子:
a)三步法:體外轉錄得到未加帽未加尾的mRNA,在RNA聚合酶和ATP的條件下,在mRNA尾部加上polyA結構(polyA結構中間可插入連接子或不插入連接子),在加帽酶催化下,以給未加帽的mRNA的5'端加上帽子結構,得到加帽加尾的mRNA分子;
b)兩步法:體外轉錄得到加尾未加帽的mRNA;在加帽酶催化下,以給未加帽的mRNA的5'端加上帽子結構,得到加帽加尾的mRNA分子;
c)一步法:進行體外轉錄和加帽,得到加帽加尾的mRNA分子。
在本發明的一些具體實施方案,製備所述mRNA分子的方法還包括mRNA的純化過程:將所述的mRNA進行氯化鋰/乙醇沉澱、離心用空管柱、氯萃取/乙醇沉澱或凝膠純化,以獲得純化後的mRNA。
根據本發明的具體實施方案,本發明的新型冠狀病毒mRNA疫苗的製備方法,還包括:
將所製備的mRNA分子溶解在檸檬酸緩衝液組成的水相中,採用微流控或衝擊式射流的方法與溶解在乙醇相中的脂質成分混合,製備負載有mRNA的脂質奈米顆粒。其中,所述的脂質成分如前所述可包括可電離的陽離子磷脂(ionizable lipids),中性輔助磷脂,膽固醇,聚乙二醇修飾的磷脂(PEGylated lipid)等。
根據本發明的具體實施方案,本發明的新型冠狀病毒mRNA疫苗的製備方法,還包括將所製備的脂質奈米顆粒製成冷凍製劑或冷凍乾燥製劑的過程。
根據本發明的具體實施方案,本發明的新型冠狀病毒mRNA疫苗的製備方法,將脂質奈米顆粒製成冷凍乾燥製劑的過程包括:
a)配製含有脂質奈米顆粒和冷凍乾燥保護劑的緩衝液;
b)降溫進行預凍;
c)在真空條件下升溫進行乾燥,使體系含水量在3%以下,製備得到脂質奈米顆粒的乾燥製劑。
根據本發明的一些具體實施方案,本發明的新型冠狀病毒mRNA疫苗的製備方法中,所述的冷凍乾燥保護劑包括但不限於以下保護劑1至保護劑3中的一種或多種:
保護劑1:蔗糖;
保護劑2:蔗糖和非離子表面活性劑;
保護劑3:蔗糖和海藻糖。
根據本發明的具體實施方案,本發明的新型冠狀病毒mRNA疫苗的製備方法中,所配製的含有脂質奈米顆粒和冷凍乾燥保護劑的緩衝液中,蔗糖的品質體積濃度為10%~20%(即,10~20g/100mL),優選為12~18%;海藻糖的品質體積濃度為0%~20%,優選為0%~5%,更優選為0.5%~3%;非離子表面活性劑的品質體積濃度為0%~2%。在本發明的一些具體實施方案中,所述非離子表面活性劑包括但不限於泊洛沙姆,例如可以是Pluronic F-68。泊洛沙姆在所配製的含有脂質奈米顆粒和冷凍乾燥保護劑的緩衝液中的品質體積濃度優選為0%~1%。
本發明中,SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 21分別為新型冠狀病毒原始株、Alpha株、Beta株、Gamma株、Delta株和Omicron株的NTD-RBD抗原的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4分別為新型冠狀病毒原始株的人源、小鼠、大鼠密碼子優化的DNA片段序列;SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27為其對應的mRNA編碼區序列。
SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8分別為新型冠狀病毒Alpha株的人源、小鼠、大鼠密碼子優化的DNA片段序列;SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30為其對應的mRNA編碼區序列。
SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12分別為新型冠狀病毒Beta株的人源、小鼠、大鼠密碼子優化的DNA片段序列;SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33為其對應的mRNA編碼區序列。
SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16分別為新型冠狀病毒Gamma株的人源、小鼠、大鼠密碼子優化的DNA片段設計;SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36為其對應的mRNA編碼區序列。
SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20分別為新型冠狀病毒Delta株的人源、小鼠、大鼠密碼子優化的DNA片段設計;SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39為其對應的mRNA編碼區序列。
SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24分別為新型冠狀病毒Omicron株的人源、小鼠、大鼠密碼子優化的DNA片段設計;SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42為其對應的mRNA編碼區序列。
SEQ ID NO: 43為新型冠狀病毒Delta株RBD抗原的mRNA序列。
SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49分別為原始株、Alpha株、Beta株、Gamma株、Delta株和Omicron株的NTD-RBD天然結構域的胺基酸序列。
SEQ ID NO: 50是NTD-RBD天然結構域中連接子的胺基酸序列。
本發明中,除特別注明以及結合上下文能明確確定外,所描述的新型冠狀病毒包括原始株和/或突變株。
在本發明的一些具體實施方案中,本發明先通過對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)進行抗原表位分析,確定以NTD-RBD為抗原靶點,LNP為遞送載體,免疫方式為肌肉注射的mRNA疫苗劑型,同時通過UTR和密碼子優化、體外轉錄方法合成編碼病毒抗原片段的mRNA,最終實現人源細胞高效表現,並且對目前流行的主要突變株均具有保護作用;整個mRNA疫苗生產週期短、技術操作簡單、生產成本低,保存時間久,不需要冷鏈,便於運輸。傳統疫苗對很多新型病毒引起的公共衛生事件無法做到快速回應,而mRNA疫苗適用性更廣,序列可以靈活設計,以應對不同的病原體,針對快速編譯的急性傳染病疫苗快速研發有及其重要的作用。
本發明設計的以NTD-RBD為抗原的mRNA疫苗,能在相同接種量的條件下,引起更強的中和抗體效應。
為了對本發明的技術特徵、目的和有益效果有更加清楚的理解,現對本發明的技術方案進行以下詳細說明,但不能理解為對本發明的可實施範圍的限定。
通過下面的實施例可以對本發明進行進一步的描述,然而,本發明的範圍並不限於下述實施例。所屬技術領域的通常知識者能夠理解,在不背離本發明的精神和範圍的前提下,可以對本發明進行各種變化和修飾。本發明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現本發明目的所使用的許多材料和操作方法是所屬技術領域公知的,但是本發明仍然在此作盡可能詳細描述。未詳細註明的方法操作,按照所屬技術領域現有技術的常規操作或商廠說明書建議的操作進行。
實施例1:mRNA疫苗及其製備方法
本實施例提供了mRNA疫苗,其製備方法主要按照以下操作進行。
1、根據待合成的mRNA合成對應的DNA片段,並將所述DNA片段複製至表現質體獲得重組質體,將所述重組質體轉入宿主細胞獲得重組細胞,從擴增後的重組細胞中提取質體。
對構建好的質體進行酶切線性化,酶切反應系統如下(以酶切2μg的重組質體為例):
10 × 消化緩衝液 I(Digestion Buffer I):2μl
BspQI (10 U/μl)(購買自諾唯贊):1μl
質體DNA(Plasmid DNA):2μg
無核酸酶水(RNase-free Water):補水至20μl。
將上述酶切體系置於50℃反應1h。待反應結束後,取酶切反應前後體系各1μl進行DNA瓊脂糖凝膠電泳(1.5%瓊脂糖凝膠,5V/min,40min)。根據電泳結果比較顯示,重組質體是否酶切完全。
合格標準:電泳檢測出現單一條帶;與酶切前的超螺旋質體比較,條帶位於超螺旋質體上方;大小符合預期要求。
測定結果:條帶單一;大小符合預期且條帶位於超螺旋質體上方。
2、DNA模板超濾(ultrafiltration)
利用Millipore 30Kd超濾管濃縮上述獲得的DNA模板。
3、DNA模板FPLC純化
將上述超濾得到的DNA濃縮液,加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇混合液(苯酚/氯仿/異戊醇體積比=25/24/1),充分震盪後,12000g離心15min。
去掉沉澱,轉移上清液至新的離心管中,加入上清液體積的1/10 3M NaAc(pH5.2),混勻,然後加入2倍體積的無水乙醇,混勻,於-20℃靜置30min。
4℃,12000g離心10min,棄上清液。
用70%乙醇洗滌沉澱,12000g離心5min,取上清液,於無塵無菌操作檯中乾燥5min。
用適當的無核酸酶水溶解純化後的DNA模板。
用NanoDrop檢測純化後模板的濃度,以及260/280、260/230的比值。取樣進行DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(1.5%瓊脂糖,5V/min,40min)。
合格標準:260/280介於1.8至2.1之間,260/230在1.6至2.2之間。
測定結果:濃度為500ng/μl,260/280=1.90,260/230= 1.7。
4、FPLC純化後模板超濾
Millipore 30Kd超濾管濃縮FPLC純化後的DNA模板,用無核酸酶水洗脫溶解。用NanoDrop檢測超濾後模板的濃度,以及260/280、260/230的比值。最終用無核酸酶水稀釋至150ng/μl。
測定結果:濃度為150ng/μl,260/280=1.95,260/230=1.85。
5、mRNA的體外合成
在恒溫反應器中,進行mRNA的體外合成。
按照如下合成體系進行(反應試劑按照先後順序添加):
反應體積,1600μl(置於2ml無核酸酶管中,為單個管的反應體積,一次同時反應多管):無核酸酶水440μl、7.5mM的ATP 160μl、7.5mM的N1-甲基-假尿苷160μl、7.5mM的CTP 160μl、7.5mM的GTP 160μl、7.5mM的M7G(2’OMeA)pG 160μl、150ng/μl的DNA模板 40μl、10×緩衝液160μl和Enzyme Mix 160μl。
所述RNA體外合成的條件為37℃,10h。
經過體外轉錄和加帽,得到目標mRNA分子。
本發明各具體實驗例中,目標mRNA分子除編碼序列外,還包括5’UTR(AGGGAGAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCGCCACC,SEQ ID NO: 51)和3’UTR(GCUGCCUUCUGCGGGGCUUGCCUUCUGGCCAUGCCCUUCUUCUCUCCCUUGCACCUGUACCUCUUGGUCUUUGAAUAAAGCCUGAGUAGGAAG,SEQ ID NO: 52),5’CAP為m7G+-5'-ppp-5'-Am2'-3'-p-(cap1),3’加多聚腺苷酸尾(SEQ ID NO: 53)。
6、DNase I消化去除DNA模板
向mRNA體外合成後的每個管中各加入120μl DNase I。
上下顛倒10次混勻,1000rpm離心10s。
重新置於恆溫反應器中,37℃,1h。
反應結束後,將反應液合併到50ml無核酸酶管中,檢測DNA片段的殘留。三次測量結果為0.013ng/100μg mRNA,0.016ng/100μg mRNA,0.017ng/100μg mRNA。
7、mRNA沉澱回收
向上一步驟中的每個50ml無核酸酶管中,加入等體積的醋酸銨溶液。
上下顛倒10次混勻。
置於-20℃ 2h,沉澱。
17000g,4℃離心,30min。
去掉上清液,用70%乙醇洗滌沉澱。
17000g,4℃離心,10min。
去掉70%乙醇,於無塵無菌操作檯中蒸乾,每管加入無核酸酶水20ml。
靜置10min後,用微量吸管輕吹吸混勻。
用NanoDrop檢測回收後的mRNA濃度為5μg/μl,A260/A280為1.90、A260/A230為2.0。
取1μl,稀釋10倍,進行RNA ScreenTape assay以及瓊脂糖凝膠電泳檢測其片段完整性。
檢測結果為:條帶符合大小,片段完整。
8、LiCl沉澱純化mRNA
將上一步驟中回收的mRNA按照其1.5倍體積加入無核酸酶水,混勻。
加入原mRNA 1.5倍體積的-20
○C預冷的LiCl溶液,混勻。
然後於-20℃靜置2h。
16000g離心20min。
棄上清液,用70%乙醇洗滌沉澱,16000g離心15min。
取上清液,於無塵無菌操作檯中乾燥5min。
用適當的無核酸酶水溶解純化後的mRNA。
純化後的mRNA用0.1M檸檬酸稀釋至2μg/μl。
9、LNP製備
配製水相:將mRNA按照2 μg/ul的終濃度稀釋於檸檬酸緩衝液。
按照表1配製乙醇相溶液。
表1
組份 | 配製1mL所需組份/μL | 配製0.5mL所需組份/μL |
ALC-0315 | 559.7 | 279.8 |
ALC-0159 | 117.2 | 58.6 |
DSPC | 260.5 | 130.2 |
Cholesterol | 62.7 | 31.3 |
準備好PBS作為LNP稀釋液;
注射泵儀器操作步驟:
(1) 將A相(mRNA緩衝液)裝入5mL注射器,B相(脂質化合物溶於無水乙醇)裝入5mL注射器,安裝於注射泵,夾緊;
(2) 將晶片連接到注射器,設定注射泵流速;
(3) 點擊注射泵的開始按鍵,將料液注入晶片;
(4) 觀察晶片出口的產品顏色,棄去前5滴乳白色液滴(約為100ul)後,開始收集到60 mL PBS中;
(5) 收集完成的產品,輕柔地上下顛倒混勻,保存於4℃;
(6) 取0.3mL作為包覆率檢測樣品;
(7) 裂解:取步驟(6)的0.1mL,加入2μL 10% Triton X-100,混勻,室溫反應10min;
(8) 包覆率檢測:分別取64μL步驟(6)和步驟(7)的樣品稀釋5倍,作為裂解前後的LNP RNA樣品;測定RNA濃度;用裂解前後濃度差值除以裂解後濃度,得出包覆率;
(9) 於瑪律文公司的Zetasizer nano儀器上使用標準檢測方法進行粒徑與PDI檢測、Zeta電位分析,上樣體積為600μl,樣品池為DTS1070,檢測溫度為25℃。
本實施例所製備得到的負載mRNA的LNP的粒徑、PDI和包覆率的檢測結果如圖1、圖2所示。圖1、圖2中,橫坐標編號分別對應各mRNA的序列編號,即,圖中25對應的樣品為SEQ ID NO: 25的mRNA樣品,圖中26對應的樣品為SEQ ID NO: 26的mRNA樣品,圖中27對應的樣品為SEQ ID NO: 27的mRNA樣品,以此類推,圖中42對應的樣品為SEQ ID NO: 42的mRNA樣品。
10. LNP凍乾
LNP溶液加入的凍乾保護劑,放入冷凍乾燥機,品質體積分數(w/v %)為蔗糖15%、海藻糖2%。(新芝 Scientz-10N)冷凍乾燥機預凍4小時後,開啟真空抽真空48小時,隨後樣品轉移到冷凍乾燥機上層,二次乾燥16小時。在冷阱中乾燥時樣品溫度探頭顯示-30℃左右,在上層乾燥時樣品溫度探頭顯示為4℃左右。乾燥結束後收集產物(即LNP凍乾粉),使用與凍乾前等體積的超純水復溶,加入超純水後凍乾粉迅速溶解,整個過程不超過20 s,用RiboGreenTM測定奈米顆粒包覆率,歐美克NS-90Z奈米細微性及電位分析儀測定奈米顆粒粒徑及zeta電位。製備得到本實施例的mRNA凍乾疫苗,所製備得到的凍乾疫苗的成品圖如圖3A所示,及復溶(reconstituted)後外觀如圖3B所示。分別將37#(對應SEQ ID NO: 37的mRNA樣品) 2μg mRNA-LNP溶液、凍乾復溶溶液和GFP mRNA-LNP反應培養的293T細胞,24小時後取細胞沉澱,裂解該細胞,穫得可溶性蛋白,進行西方墨點法(Western blot),檢測蛋白表現效率,以及將37# (對應SEQ ID NO: 37的mRNA樣品)100μg mRNA-LNP粉末在注射接種前用200μl注射用水復溶,在第1天和第14天兩次注射接種6週齡balb/c小鼠,在第35天取小鼠血清後檢測血清中抗S蛋白特異性抗體的效價,結果如圖4和圖5所示,其中,從對照組(0.9%的氯化鈉)、疫苗未凍乾組(mRNA-WT)和疫苗凍乾組(Lyo-mRNA-WT)的比較可知,凍乾技術基本不影響mRNA脂質顆粒的生物學活性。
實施例2
本實施例中,分別將25#~42# (即分別對應SEQ ID NO: 25~ SEQ ID NO: 42的mRNA樣本)100μg mRNA-LNP粉末在注射接種前用200μl注射用水復溶,在第1天和第14天兩次注射接種6週齡balb/c小鼠,在第35天取小鼠血清,檢測血清中抗S蛋白特異性抗體的效價。具體按照以下操作進行:
1、塗覆:將S1蛋白(義翹神州,40591-MM43)用塗覆液(coating buffer)稀釋成200ng/ml的溶液,加入到微孔盤中,每孔加入的體積為100μl,每個稀釋度重複3個孔,蓋上封盤膜,4℃塗覆過夜。
2、洗盤:塗覆好的96孔盤,倒出塗覆液,倒扣於吸水紙上,用力扣盤,直到孔中無殘留為止。配製洗脫液,用去離子水稀釋50x的洗脫緩衝液(Washing buffer),加入到洗盤機的進液瓶中,設置程式,每孔洗盤體積設為300μl,重複洗4次。
3、阻斷:洗好的盤,倒扣清空裡面的溶液,按每孔250μl的體積加入阻斷液(Blocking buffer),隨後封上封盤膜,於室溫阻斷2h。
4、洗盤:完成阻斷的微孔盤按照步驟2完成洗盤。
5、血清反應:用稀釋緩衝液(dilution buffer)將小鼠血清稀釋成40x,400x,4000x,40000x,400000x,4000000x,40000000x,按照每孔100μl的體積加入洗好的96孔盤中,隨後封上封盤膜室溫下反應1.5h。
6、洗盤:按照步驟2完成洗盤,其中洗盤次數增加為6次。
7、 加入二級抗體:用稀釋緩衝液稀釋二級抗體:HRP標記山羊抗小鼠IgG,稀釋倍數為10000x,稀釋好的抗體按照每孔100μl的體積加入微孔盤中,封上封盤膜,室溫下避光反應1h。
8、洗盤:按照步驟2完成洗盤,此步驟務必洗乾淨盤,倒扣清空溶液。
9、顯色:加入TMB緩衝液100μl,避光顯色20-30分鐘,此時陽性樣品顯藍色。
10、終止:加入反應終止液(Stop buffer) 100μl,10分鐘內在微孔盤上讀值,吸收波長為450nm。
根據標準品孔的光吸收值繪製標準曲線,線性回歸的相關係數應大於0.0995。根據樣品吸光度的大小計算樣品中S蛋白特異性抗體的殘留含量。
特異性抗體效價測試結果參見圖6所示。結果顯示,編碼NTD-RBD的mRNA候選疫苗免疫效果具有良好的免疫原性,誘導產生了針對S蛋白的特異性抗體,對照組注射生理鹽水的小鼠不能產生針對S蛋白的特異性抗體。
實施例3
本實施例中,通過實驗考察了編碼RBD的mRNA疫苗(43#,即對應SEQ ID NO: 43的樣本)和編碼NTD-RBD疫苗(37#,即對應SEQ ID NO: 37的樣本)的中和抗體效價。具體按照以下操作進行:
接種疫苗,分別在0天、14天時,對6~8週齡的雌性小鼠接種5μg新型冠狀病毒mRNA疫苗(溶解於PBS,200μl,肌肉注射);28天時取小鼠外週血。
準備Vero E6細胞(24孔盤),血清經熱滅活,連續3倍梯度稀釋。100μl血清與100μl病毒儲存液(100 PFU)等體積混勻,同時100μl DMEM(含2% FBS)與100μl病毒液等體積混勻,作為陰性對照。37℃反應1h。
將上述血清-病毒混合液(共200μl)轉移至24孔盤Vero E6細胞,吸附1h。期間可輕柔混勻3-4次。移除上一步的吸附液,更換甲基纖維素培養基,培養3天。多聚甲醛固定、結晶紫染色,進行空斑計數。以陰性對照組為基準,計算血清中和百分比。以JMP分析軟體Probit方法進行擬合曲線,計算PRNT
50值。
實驗結果如圖7所示,NTD-RBD誘導的中和抗體效價高於RBD,因此NTD-RBD的免疫原性優於RBD。
實施例4
本實施例中,通過實驗考察了NTD-RBD mRNA疫苗對2019-nCoV假病毒的交叉免疫保護。具體按照以下操作進行:
接種疫苗,分別在0天、14天時,對6~8週齡的雌性小鼠接種5μg新型冠狀病毒mRNA疫苗(溶解於PBS,200μl,肌肉注射);28天時取小鼠外週血,採用微量中和實驗對熱滅活血清進行測定,以檢測抗體中和新型冠狀假病毒侵染表現ACE2單層細胞的水準高低;於96孔盤上稀釋4孔,在第3天和第4天時檢測細胞的病毒性病變作用(cpe),通過Reed Muench公式計算出完全抑制cpe的血清在50%終點法中測定的血清稀釋度;採用非參數雙尾t檢測(Mann-Whiteny)進行統計分析。
實驗結果如圖8所示(圖中各圖案的數位編號分別為對應相同SEQ ID NO編號的樣本),本發明所構建的mRNA疫苗對新型冠狀病毒突變株均有不同程度的交叉保護效果。
實施例5:NTD-RBD新型冠狀疫苗誘導強烈的細胞免疫
本實施例中,考察了NTD-RBD新型冠狀疫苗誘導細胞免疫的作用。具體按照以下操作進行:
一、塗覆96孔盤
用70%乙醇浸潤96孔盤中的PVDF膜30秒。
加入捕獲抗體(capture antibody)(PBS稀釋),4℃過夜。
倒空盤中的塗覆液,輕輕在紙上拍乾,用PBS洗滌,禁用洗盤機。
加入100ul 2%的脫脂奶粉(或者BSA)室溫反應2小時,阻斷盤中空白位點。
PBS洗滌1次。
二、細胞刺激和細胞因子捕獲
接種疫苗,分別在0天、14天時,對6~8週齡的雌性小鼠接種5μg新型冠狀病毒mRNA疫苗RH109(40#)(溶解於PBS,200μl,肌肉注射);28天時取小鼠外週血,從新鮮血液中用Ficoll分離PBMC並進行計數後,將細胞用培養液稀釋後加入96孔盤中。通常所用細胞數量為1-2×10
5/孔。
將96孔盤在37℃二氧化碳反應箱中反應過夜。禁止移動或晃動該96孔盤。
培養盤(即上述96孔盤)中加入S蛋白pepmix刺激物反應8小時;
用含0.1% Tween 20的PBS反應10分鐘,去除細胞和未結合的細胞因子。然後用含0.1% Tween 20 的PBS洗滌3次。
三、加入檢測抗體檢測
加入標記的檢測抗體(用含1%BSA的PBS稀釋),室溫反應1-2小時。
加入受質顯色,在加入受質之前用蒸餾水洗滌該96孔盤膜的兩側,以防止部分溶液漏出後產生的背景。監測斑點的形成,適時終止反應。
用蒸餾水洗滌以終止反應。
四、結果分析
將96孔盤乾燥。(將板子放在4℃避光過夜,可使斑點邊緣銳化,更易分辨)
使用微量盤分光光譜儀進行結果分析,結果如圖9A所示,ELISPot實驗所示,多肽刺激後,疫苗組小鼠能夠產生大量的IFN-γ斑點,達到3000個斑點(spots)/100萬細胞,而生理鹽水組幾乎沒有斑點產生,說明RH109激發了強細胞免疫反應。
用流式細胞術胞內染色實驗對CD4和CD8細胞進行進一步分析,結果如圖9B和圖9C所示,發現IL2
+/TNF-α
+/IFN-γ
+的CD4
+細胞,以及TNF-α
+/ IFN-γ
+的CD8
+細胞明顯升高,說明RH109疫苗啟動了強Th1型和CD8殺傷性T細胞免疫反應。
實施例6
接種疫苗,分別在0天、21天時,對6~8週齡的雌性小鼠接種5μg或10ug新型冠狀病毒mRNA疫苗(37#)(溶解於PBS,200μl,肌肉注射);ivD為攻毒期,ivD0為攻毒當天,以新型冠狀病毒(Delta株)滴鼻來感染hACE2轉基因小鼠,感染劑量初步為10
5PFU。D42為攻毒時間。攻毒後ivD3和ivD5,分批將動物安樂死,動物安樂死後取肺(右肺)等組織器官,提取RNA,用Q-PCR法測定病毒載量或檢測活病毒效價。期間每天兩次觀察,每週稱量一次體重。SARS-CoV-2 Delta中和抗體、體重變化、生存曲線、肺部病毒載量以及腦部病毒載量分別如圖10A至圖10E所示。由圖10D可知,接種疫苗後的小鼠在進行真病毒攻毒實驗後,肺部病毒載量顯著低於佐劑對照組。由圖10B和圖10C可知,佐劑對照組小鼠於攻毒後第7天均達到安樂死標準。與佐劑對照組相比,疫苗低劑量組和疫苗高劑量組的小鼠全部存活,表明疫苗對SARS-CoV-2病毒Delta毒株感染小鼠有顯著的保護作用。
實施例7
接種疫苗,分別在0天、21天時,對6~8週齡的雌性小鼠接種兩劑科興滅活疫苗,實驗組於42天時接種5μg新型冠狀病毒mRNA疫苗RH109(溶解於PBS,200μl,肌肉注射);對照組則於42天時接種第三劑科興滅活疫苗;實驗組與對照組皆於56天時取小鼠外週血,採用微量中和實驗對熱滅活血清進行測定,以檢測抗體中和新型冠狀假病毒感染表現hACE2單層細胞的水準高低;於96孔盤上稀釋4孔,在第3天和第4天時檢測細胞的病毒性病變作用(cpe),通過Reed Muench公式計算出完全抑制cpe的血清在50%終點法中測定的血清稀釋度;採用非參數雙尾t檢測(Mann-Whiteny)進行統計分析。如圖11B所示,實驗組於RH109免疫後的血清對Omicron、Delta和原始病毒株均產生了高中和抗體水準,幾何平均效價分別是7970、9091、13998,其中針對Omicron比第二針後提高了39倍數;同時,相比於對照組用科興滅活苗作為第三針加強,實驗組對Omicron、Detla和原始病毒株的中和抗體水準分別是對照組的35、6.2、3.4倍,說明RH109非常適合作為滅活苗基礎上的加強針使用。另,本發明還比較了本發明的不同mRNA不同劑量誘導表現蛋白實驗,分別將SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55的mRNA-LNP溶液以2μg、4μg反應培養的293T細胞,24小時後取細胞沉澱,裂解細胞,平行檢測得到的目的蛋白條帶進行灰度分析24h胞內蛋白相對表現量。結果參見圖12(圖中編號28-1對應SEQ ID NO: 40、編號30-1對應SEQ ID NO: 54、編號30-3對應SEQ ID NO: 55)。本發明的mRNA具有良好的蛋白表現效率。
應當指出的是,以上所述僅為本發明的優選實施例而已,並不用於限制本發明,對於所屬技術領域之通常知識者來說,本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內,所作的任何修改、等同替換、改進等,均應包含在本發明的保護範圍之內。
無
圖1顯示本發明一具體實施例中所製備得到的mRNA-LNP的粒徑和PDI測試結果。
圖2顯示本發明一具體實施例中所製備得到的mRNA-LNP的包覆率測試結果。
圖3A顯示本發明一具體實施例中所製備得到的mRNA凍乾疫苗外觀;以及圖3B顯示該mRNA凍乾疫苗復溶後的外觀。
圖4顯示本發明一具體實施例中所製備得到的mRNA凍乾疫苗體外活性效果。
圖5顯示本發明一具體實施例中所製備得到的mRNA凍乾疫苗體內活性效果。
圖6顯示本發明的mRNA疫苗的特異性抗體稀釋終點的效價測試結果。
圖7顯示RBD和NTD-RBD抗原的免疫原性對比。
圖8顯示本發明的NTD-RBD mRNA疫苗對不同病毒株的交叉保護效果。
圖9A顯示本發明的NTD-RBD疫苗誘導強烈的細胞免疫的照片;圖9B和圖9C則分別顯示不同細胞免疫反應的直條圖。
圖10A顯示本發明的NTD-RBD疫苗的疫苗低劑量組和疫苗高劑量組中的hACE2小鼠的體內攻毒實驗結果;圖10B顯示各組ACE2小鼠於感染後的每日體重變化;圖10C顯示佐劑對照組的hACE2小鼠於感染後的存活率;圖10D顯示佐劑對照組、疫苗低劑量組和疫苗高劑量組的hACE2小鼠的肺部病毒載量;以及圖10E顯示佐劑對照組、疫苗低劑量組和疫苗高劑量組的hACE2小鼠的腦部病毒載量。
圖11A顯示第三劑採用科興滅活疫苗(Coronavac)作為加強針的實驗結果;圖11B顯示第三劑採用本發明的NTD-RBD疫苗作為加強針的實驗結果。
圖12為本發明一些具體實施例中的mRNA誘導表現的蛋白相對表現量實驗結果。
無
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Claims (25)
- 一種mRNA分子,其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 17所示。
- 如請求項1所述之mRNA分子,其核苷酸的編碼區序列如SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38或SEQ ID NO: 39所示。
- 如請求項1所述之mRNA分子,其中,該mRNA分子經過1-甲基假尿苷修飾。
- 如請求項1所述之mRNA分子,其中,該mRNA分子還包括5’-UTR序列和/或3’-UTR序列。
- 如請求項4所述之mRNA分子,其中,該5’-UTR序列包含或不包含Kozak序列。
- 如請求項4所述之mRNA分子,其中,該5'-UTR具有SEQ ID NO: 51所示序列。
- 如請求項4所述之mRNA分子,其中,該3’-UTR序列具有SEQ ID NO: 52所示序列。
- 如請求項1或4所述之mRNA分子,其中,該mRNA分子還經過3'加尾修飾和/或至少一個5'加帽修飾。
- 如請求項8所述之mRNA分子,其中,該3'加尾修飾包含多聚腺苷酸尾,該多聚腺苷酸尾為中間插入或不插入連接子的多聚腺苷酸; 至少一個5'加帽修飾的帽結構選自Cap0、Cap1、ARCA、肌苷、N1-甲基-鳥苷、2 '氟-鳥苷、7-脫氮-鳥苷、8-氧代-鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷或2-疊氮基-鳥苷。
- 如請求項1所述之mRNA分子,其是經分離的mRNA分子。
- 如請求項10所述之mRNA分子,該mRNA分子是經純化的。
- 一種DNA分子,其編碼如請求項1至11中任一項所述的mRNA分子。
- 一種重組質體,其含有如請求項12所述的DNA分子。
- 一種脂質奈米顆粒,其負載有如請求項1至11中任一項所述的mRNA分子。
- 一種藥物組合物,其包含:如請求項1至11中任一項所述的mRNA分子,以及藥學上可接受的賦形劑。
- 一種如請求項1至11中任一項所述的mRNA分子、如請求項12所述的DNA分子、如請求項13所述的重組質體、如請求項14所述的脂質奈米顆粒或如請求項15所述的藥物組合物在製備新型冠狀病毒mRNA疫苗中的用途。
- 一種新型冠狀病毒mRNA疫苗,其包含如請求項1至11中任一項所述的mRNA分子,該新型冠狀病毒mRNA疫苗為脂質奈米顆粒劑型。
- 如請求項17所述之新型冠狀病毒mRNA疫苗,其中,該脂質奈米顆粒包括mRNA和脂質,其中,該脂質包括: a)正電荷脂質和/或可離子化脂質中的一種或多種; b)中性輔助脂質; c)膽固醇;以及 d)PEG修飾的脂質。
- 如請求項18所述之新型冠狀病毒mRNA疫苗,其中,該正電荷脂質和/或可離子化脂質與該mRNA分子的氮磷莫耳比為5:1 ~ 20:1。
- 如請求項18所述之新型冠狀病毒mRNA疫苗,其中,該可離子化脂質包括:4-(N,N-二甲基胺基)丁酸(二亞油基)甲酯、SM-102、((4-羥基丁基)氮雜二烷基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)中的一種或多種,該正電荷脂質包括:DOTMA、DOTAP中的一種或多種;該中性輔助脂質包括:DSPC、DOPE、DSPE中的一種或多種;該PEG修飾的脂質包括:甲氧基聚乙二醇雙十四烷基乙醯胺、DMG-PEG中的一種或多種。
- 如請求項17至20中任一項所述之新型冠狀病毒mRNA疫苗,其疫苗劑型為冷凍乾燥劑型或冷凍劑型。
- 一種新型冠狀病毒mRNA疫苗的製備方法,其包括以下步驟: 合成編碼NTD-RBD天然結構域肽段的DNA片段,並複製到質體作為模板,轉錄製備得到目標mRNA分子; 其中,所述目標mRNA分子為如請求項1至11中任一項所述的mRNA分子。
- 如請求項22所述之製備方法,該方法還包括: 將所製備的目標mRNA分子溶解在檸檬酸緩衝液組成的水相中,採用衝擊式射流或微流控方法與溶解在乙醇相中的脂質成分混合,製備負載有該目標mRNA分子的脂質奈米顆粒。
- 如請求項23所述之製備方法,該方法還包括將所製備的負載有該目標mRNA分子的脂質奈米顆粒製成冷凍製劑或冷凍乾燥製劑的步驟。
- 如請求項24所述之製備方法,其中,將該負載有該目標mRNA分子的脂質奈米顆粒製成該冷凍乾燥製劑的步驟包括: a)配製含有該負載有該目標mRNA分子的脂質奈米顆粒和冷凍乾燥保護劑的緩衝液; b)降溫進行預凍; c)在真空條件下升溫進行乾燥,使體系含水量在3%以下,製備得到該冷凍乾燥製劑。
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