CN113325177B

CN113325177B - 一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN113325177B
Application number: CN202110624537.5A
Authority: CN
Inventors: 张振斌; 史光辉; 田鸽; 杨桂霞; 栾大伟; 刘萍
Original assignee: Biosys Chongqing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Biosys Chongqing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-04
Filing date: 2021-06-04
Publication date: 2024-03-01
Anticipated expiration: 2041-06-04
Also published as: CN113325177A

Abstract

本公开提供一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒及其应用，其中的抗原为修饰型COVID‑19Spike RBD重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1或与上述序列具有至少80％同源性的序列，所述序列包括野生型新型冠状病毒毒株和突变型新型冠状病毒毒株的检测位点。本公开的抗原为在现有的COVID‑19Spike RBD重组蛋白的基础上进行基因设计而成的修饰型COVID‑19Spike RBD重组蛋白，该重组蛋白的氨基酸序列包括野生型新型冠状病毒毒株和突变型新型冠状病毒毒株的检测位点，即同时具备检出野生型与突变型毒株的能力。

Description

一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒及其应用

技术领域

本公开涉及免疫分析检测技术领域，尤其涉及一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒及其应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的流行对全球公众健康构成了严重威胁，由SARS-CoV-2引起的疾病被世界卫生组织(WHO)正式命名为COVID-19。COVID-19在临床上表现为肺炎、发热、咳嗽、肌肉疼痛、腹泻，严重时导致死亡。WHO报告显示，截止2020年11月，COVID-19已造成世界大流行，确诊病例超9000万例，累计死亡病例超200万例。接种疫苗是预防病毒感染流行的有效手段，SARS-CoV-2与2003年爆发的严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)和2012年爆发的中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(MERS-CoV)同属于冠状病毒科的β-冠状病毒属。由于前期无疫苗、药物等有效防控手段，同时该病毒存在人群普遍易感，传播途径多，难以有效阻断等原因，目前世界各地科学家正在努力快速研发新冠疫苗，并取得可喜进展。

冠状病毒是包膜病毒，主要结构包括单股正链核酸(ssRNA),刺突蛋白(spikeprotein，S蛋白)、膜蛋白(membrane protein，M蛋白)、包膜蛋白(envelop protein，E蛋白)、核衣壳蛋白(nucelocapsid protein，N蛋白)。其中，S蛋白形成三聚体结构，负责识别并结合宿主细胞表面的受体，在病毒感染的第一步发挥重要作用。M和E蛋白在病毒装配中起重要作用，N蛋白是RNA合成所必需的。SARS-CoV的研究显示，由于SARS-CoV-2与SARS-CoV的基因组高度相似性，其表面S蛋白直接与宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)结合进入细胞引起感染，促进病毒感染繁殖及感染。疫苗的有效性就在于诱导机体产生中和抗体，与病毒结构蛋白上的中和抗原表位结合，阻断该表位与敏感细胞的细胞膜上的相应受体结合，从而阻止该病毒入侵敏感细胞，发挥疫苗的保护作用。

冠状病毒的N蛋白是与病毒RNA结合并构成核衣壳的蛋白，在病毒组装和RNA转录中起着至关重要的作用，同时也参与宿主细胞对病毒感染的反应。SARS的N蛋白可以和患者的血清发生反应，并表达SARS的N蛋白DNA疫苗亦可以诱导小鼠产生抗体反应。但因N蛋白位于病毒颗粒内部，抗体反应可能在抗病毒感染中的作用甚微。

借鉴SARS-CoV和MERS-CoV的研究经验，有效的疫苗接种后应诱导有效的B细胞应答产生抗体，尤其是中和抗体，中和抗体可阻止病毒与细胞受体的结合而阻止病毒进入细胞。此外，根据免疫途径的不同，黏膜途径接种疫苗还可以激活黏膜分泌型IgA抗体，在感染部位直接对抗病毒感染。已经证实，T细胞免疫在SARS-CoV感染的恢复中起重要作用，并且动物实验中也证实疫苗特异性记忆CD4 T细胞对SARS-CoV的感染具有保护作用。因此，有效的新冠疫苗应该同时激发中和抗体及特异性的T细胞应答。

根据国家生物信息中心网站最新数据，显示SARS-CoV-2S蛋白已有3225个位点发生突变，其中引起氨基酸变化的突变共1930个，位于蛋白受体结合域(RBD)的氨基酸突变有253个。最近有三株新型冠状病毒突变株引起全世界广泛关注，分别是英国B.1.1.7突变株、南非B.1.351突变株和巴西P.1突变株。有研究发现，英国B.1.1.7突变株有23个特殊的突变，包含69-70缺失，145缺失及N501Y、D614G、P681H、T7161I、A570D、S982A、D1118突变；另外ORF1ab和ORF8也有多个位点发生突变，其中T1001I、A1708D、SGF3675-3677del是位于ORF1ab上的突变；Q27stop、R52I、Y73C是位于ORF8的突变。有研究发现，这种突变型毒株比原始的野生型毒株的传播性高出70％。针对目前新型冠状病毒持续突变，对于抗体的检测方法提出了新的挑战。

发明内容

有鉴于此，本公开的目的在于提出一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒及其应用，以解决背景技术中提及的问题。

基于上述目的，本公开提供了一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒，其中，所述抗原为修饰型COVID-19Spike RBD重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1或与上述序列具有至少80％同源性的序列，所述序列包括野生型新型冠状病毒毒株和突变型新型冠状病毒毒株的检测位点。

进一步，所述的试剂盒，还包括：碱性磷酸酶或辣根过氧化酶标记的修饰型COVID-19Spike RBD重组蛋白；和，偶联磁性颗粒的COVID-19ACE2受体蛋白。

进一步，所述的试剂盒还包括化学发光底物。

进一步，当试剂盒中包括辣根过氧化物酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白时，化学发光底物包括A液和B液；

A液为0.5-1.5g/L鲁米诺，0.05-0.2g/L对碘酚，缓冲液为pH 7.5-9的2-10mmol/LTris-HCl，避光保存；

B液为0.5-1g/L过氧化脲；A液和B液按体积比1:1混合。

当试剂盒中包括碱性磷酸酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白时，化学发光底物包括如下组分，0.1-0.5g/L AMPPD，0.05-0.1g/L Na₂SO₃，2-10g/L SDS(十二烷基硫酸钠)，5-10g/L Tris；0.02-0.1mL/L Tween-20和1-3mL Proclin TM 300，pH值为9.0±0.50。

进一步，所述偶联磁性颗粒的COVID-19 ACE2受体蛋白的工作浓度为0.01～0.08μg/mL。

进一步，所述碱性磷酸酶或辣根过氧化酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白的工作浓度为0.1～0.8mg/mL。

进一步，辣根过氧化酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白的制备过程包括以下步骤：

1)配制5-10mg/mL HRP溶液；

2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO₄溶液；

3)将步骤1)的HRP 100-200μL置于0.01-0.05M pH＝5.2的乙酸盐缓冲液中，2-8℃中透析2-4h；

4)取出透析过的HRP，向其中加入步骤2)中过碘酸钠NaIO₄溶液2-4μL，于室温避光反应30-60min；

5)向上述混合液中加入1-4μL甘油轻轻混匀，以除去过量的过碘酸钠；

6)将步骤5)中的混合液置于0.01-0.05M pH＝5.2乙酸盐缓冲液中，透析4-8h，除去未反应的试剂；

7)更换0.02-0.05M pH＝9.5的碳酸盐缓冲液，2-8℃反应4-8h；并加入修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白，使其浓度达到2-4mg/mL；

8)加入NaBH₄使其终浓度为5-10mM，2-8℃孵育6-18h；

9)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。

进一步，碱性磷酸酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白的制备过程包括以下步骤：

1)配制5-20mg/mL ALP溶液；

2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO₄溶液；

3)将步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比(1-3):1混合均匀，2-8℃避光反应0.5-1h；

4)配制浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤3)溶液以相同体积混合，常温避光反应18-24h，活化即完成；

5)将待标记的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白置于透析袋中，透析缓冲液为0.02-0.05M碳酸盐缓冲液，透析1-2h；

6)将上述透析完成的COVID-19 Spike RBD重组蛋白与活化的碱性磷酸酶按照质量比为1:(0.5-0.8)的比例充分混匀后置于0.02-0.05M碳酸盐缓冲液中透析8h；

7)配制浓度为5-10mg/mL的NaBH₄水溶液，按1-2mgALP加80-100μL配制好的NaBH₄水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应2-4h；

8)将上述步骤7)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析18-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。

进一步，偶联磁性颗粒的COVID-19ACE2受体蛋白的制备方法包括以下步骤：

1)配制0.1-0.5M HEPES溶液使其PH值在7.5-9.5之间；

2)配制1-3M(NH₄)₂SO₄溶液，使其PH值在7.5-9.5之间；

3)取10-20mg Tosyl磁珠于2mL离心管中，置于磁力架上，待磁分离彻底后去除上清液；

4)加1-2mL纯水于2mL离心管中，颠倒混匀后，置于磁架上，磁分离彻底后去除上清液；

5)向离心管中加入1mL配制好的0.1-0.5M HEPES溶液，重悬磁珠；

6)向重悬后的磁珠中加入100μg-200μg COVID-19 ACE2受体蛋白，混匀；

7)向6)混合液中加入适量1-3M(NH₄)₂SO₄溶液，使(NH₄)₂SO₄溶液工作浓度为0.5-1M，置于旋转混匀仪上反应16-24h；

8)反应完成后加入10-20μL 10％BSA溶液进行封闭，在旋转混匀仪上反应16-24h；

9)反应完成后将离心管置于磁力架上进行磁分离，去除上清液；

10)加入1-2mL磁珠稀释液，重悬磁珠，颠倒混匀后，置于磁架上，磁分离后去除上清液；

11)重复步骤10)两次；

12)向离心管中加1-2mL磁珠稀释液重悬磁珠，4℃保存备用。

基于同一发明构思，本公开还提供所述的试剂盒在新型冠状病毒检测试剂中的应用。

从上面所述可以看出，本公开提供的一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒及其应用，其中的抗原为在现有的COVID-19 Spike RBD重组蛋白的基础上进行基因设计而成的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白，该重组蛋白的氨基酸序列包括野生型新型冠状病毒毒株和突变型新型冠状病毒毒株的检测位点，即同时具备检出野生型与突变型毒株的能力；

另外，其中的试剂盒采用酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白、磁性颗粒偶联COVID-19 ACE2受体蛋白的试剂组合方式，区别于传统的链霉亲和素体系，减少试剂组分，使用便捷，为样本的快速检出提供方便；该试剂盒采用磁性颗粒偶联的COVID-19ACE2受体蛋白与人血清中新型冠状病毒中和抗体竞争结合COVID-19 Spike RBD重组蛋白的原理，并通过化学发光法定量检测中和抗体的浓度，原理可靠，检测结果稳定性及准确度较高。

附图说明

为了更清楚地说明本公开或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为对现有的COVID-19 Spike RBD重组蛋白进行基因修饰过程的前后对照图；

图2为本公开实施例中疫苗免疫后15d内样本中中和抗体的变化情况曲线图。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。

需要说明的是，除非另外定义，本公开实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。

针对背景技术中提及的问题，申请人为应对新型冠状病毒突变株的检测，首先在现有的对野生型新型冠状病毒毒株有检出作用的原料中进行了大量筛选，并选出现有的COVID-19 Spike RBD重组蛋白为对野生型新型冠状病毒毒株检出准确度最高，由此，确定COVID-19 Spike RBD重组蛋白为基础原料，并针对突变型新型冠状病毒毒株的变化，对该基础原料进行了修饰，继而形成了修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白，该修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白均可检出野生型与突变型毒株感染。

另外，现有的针对新型冠状病毒中和抗体检测的方法更多的偏重于定性检测，如酶联免疫吸附实验(ELISA)、假病毒中和抗体检测(PBNA)等，定性检测的方法对于处于临界值的样本的定性趋于模糊，会产生一定概率的假阳性与假阴性结果。当前市面上仍缺乏灵敏度高，特异性好，且可用于定量检测的试剂盒。本试剂盒通过将ACE2受体蛋白与磁性颗粒偶联，S蛋白与碱性磷酸酶或辣根过氧化酶偶联，根据病毒入侵细胞的过程，若样本中含有新型冠状病毒中和抗体，则与磁性颗粒偶联的COVID-19ACE2受体蛋白竞争结合修饰型COVID-19 Spike RBD。鉴于目前中和抗体定性检测试剂盒中无法准确评估中和抗体在体内的真实水平，本试剂盒通过对市面上多种中和抗体标准品进行筛选，并筛选出线性较好的中和抗体标准品，绘制标准曲线并计算血清中中和抗体的水平，以及注射疫苗后中和抗体的量化情况，为康复后患者以及疫苗注射后人群血液内中和抗体的变化水平提供了有效监测标准。

本公开中所用到的试剂COVID-19ACE2受体蛋白、COVID-19 Spike RBD重组蛋白、中和抗体标准品均购自于天津梅迪赛斯生物科技有限公司；本公开中所用到的仪器为Axceed 260磁微粒全自动化学发光免疫分析仪(津械注准20182400046)。

以下通过具体实施例对本公开的技术方案进行说明。

本公开提供了一种新型冠状病毒抗原，所述抗原为修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白，根据报道出的突变序列，进行相应的修饰。其氨基酸序列为SEQ ID NO:1或与上述序列具有至少80％同源性的序列，所述序列包括野生型新型冠状病毒毒株和突变型新型冠状病毒毒株的检测位点。

进一步可选地，所述上述序列具有至少80％同源性的序列为至少具有90％同源性，更进一步可选地为至少具有95％、96％、97％、98％、99％的同源性。

另外，该序列主要是在现有的COVID-19 Spike RBD重组蛋白(即人工合成的SARS-CoV-2S蛋白RBD)的基础上对H69del、V70del、Y144del、N501Y、A570D、D614G、P681H等特定位点进行修饰，如图1所示，以涵盖野生型新型冠状病毒毒株的检测位点和突变型新型冠状病毒毒株的多个突变位点，继而对野生型新型冠状病毒毒株和突变型新型冠状病毒毒株均具有检出作用。

基于同一发明构思，本公开还提供了一种应用如上述抗原的试剂盒，包括：碱性磷酸酶或辣根过氧化酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白；和，偶联磁性颗粒的COVID-19 ACE2受体蛋白。

该试剂盒采用酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白、磁性颗粒偶联COVID-19 ACE2受体蛋白的试剂组合方式，区别于传统的链霉亲和素体系(酶标记的抗原或抗体、生物素标记的抗原或抗体、以及链酶亲和素磁珠)，减少试剂组分，使用便捷，为样本的快速检出提供方便；该试剂盒采用磁性颗粒偶联的COVID-19 ACE2受体蛋白与人血清中新型冠状病毒中和抗体竞争结合COVID-19 Spike RBD重组蛋白的原理，原理可靠，检测结果稳定性及准确度较高；且该试剂盒可通过化学发光法定量检测中和抗体的浓度，为定量检测人血清中新冠病毒中和抗体的浓度奠定基础。

在一些实施例中，试剂盒中辣根过氧化酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白的制备过程如下：

1)配制10mg/mL HRP溶液；

2)配制10mg/mL过碘酸钠NaIO₄溶液；

3)将步骤1)的HRP 100μL置于乙酸盐(pH＝5.2 0.02M)缓冲液中，4℃中透析2h；

4)取出透析过的HRP，向其中加入步骤2)中过碘酸钠NaIO₄溶液2μL，于室温避光反应30min；

5)向上述混合液中加入1μL甘油轻轻混匀，以除去过量的过碘酸钠；

6)将步骤5)中的混合液置于乙酸盐(pH＝5.2 0.02M)缓冲液，透析4h，除去未反应的试剂；

7)更换0.02M pH＝9.5的碳酸盐缓冲液，4℃反应6h；并加入修饰型COVID-19Spike RBD重组蛋白，使其浓度达到4mg/mL；

8)加入NaBH₄使其终浓度为5mM，4℃孵育12h；

9)完成的标记液用0.01M PBS于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。

在一些实施例中，试剂盒中碱性磷酸酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白的制备过程如下：

1)配制10mg/mL ALP溶液；

2)配制10mg/mL过碘酸钠NaIO₄溶液；

3)将上述步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比(1-3)：1混合均匀，4℃避光反应1h；

4)配制浓度为20μL/mL的乙二醇水溶液，与上述步骤3)溶液以相同体积混合，常温避光反应24h，活化即完成。

5)将待标记COVID-19 Spike RBD重组蛋白置于透析袋中，透析缓冲液为0.02M碳酸盐缓冲液，透析1-2h；

6)将上述透析完成的COVID-19 Spike RBD重组蛋白与活化的碱性磷酸酶按照质量比为1:0.8的比例充分混匀后置于0.02M碳酸盐缓冲液中透析8h，

7)配制浓度为10mg/mL的NaBH₄水溶液，按1mgALP加80μL配制好的NaBH₄水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应2h；

8)将上述步骤7)完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。

在一些实施例中，试剂盒中偶联磁性颗粒的COVID-19 ACE2受体蛋白的制备过程如下：

1)配制0.1M HEPES溶液使其PH值在7.5；

2)配制3M(NH₄)₂SO₄溶液，使其PH值在7.5；

3)取10mg Tosyl磁珠于2mL离心管中，置于磁力架上，待磁分离彻底后去除上清液；

4)加1mL纯水于2mL离心管中，颠倒混匀后，置于磁架上，磁分离彻底后去除上清液；

5)向离心管中加入1mL配制好的0.1M HEPES溶液，重悬磁珠；

6)向重悬后的磁珠中加入100μgCOVID-19 ACE2受体蛋白，混匀；

7)向6)混合液中加入适量3M(NH₄)₂SO₄溶液，使(NH₄)₂SO₄溶液工作浓度为1M，置于旋转混匀仪上反应18h；

8)反应完成后加入10μL 10％BSA溶液进行封闭，在旋转混匀仪上反应18h；

10)加入1mL磁珠稀释液，重悬磁珠，颠倒混匀后，置于磁架上，磁分离后去除上清液。

11)重复步骤10)两次；

12)向离心管中加1mL磁珠稀释液重悬磁珠，4℃保存备用。

在一些实施例中，试剂盒中还配制有化学发光底物，该化学发光底物的制备过程如下：

当试剂盒中包括辣根过氧化酶标记COVID-19 Spike RBD重组蛋白时，化学发光底物配制如下：

A液为0.7g/L鲁米诺，0.08g/L对碘酚，缓冲液为pH 8.6的5mmol/L Tris-HCl，避光保存；

B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min按体积比1:1混合

当试剂盒中包括碱性磷酸酶标记COVID-19 Spike RBD重组蛋白时，化学发光底物配制如下：

1)量取900mL的纯化水；

2)向步骤1)的纯化水中分别添加0.2gAMPPD，0.05g Na₂SO₃，2gSDS(十二烷基硫酸钠)，6gTris，搅拌至完全溶解；

3)向步骤2)的溶液中分别添加0.02mLTween-20和3mL ProclinTM300，定容至1L；

4)调节pH至9.2，储存于2～8℃环境中保存备用。

在一些实施例中，试剂盒中还配制有辅助试剂，该辅助试剂包括磁珠稀释液、试剂稀释液和浓缩洗涤液，其中，

浓缩洗涤液制备过程如下：具体包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/L Tween-20和质量浓度2％Proclin300。

磁珠稀释液主要用于偶联磁性颗粒的COVID-19ACE2受体蛋白试剂(简称：试剂0)的配制，该配制过程如下：将偶联磁性颗粒的COVID-19 ACE2受体蛋白按照1/80的体积比稀释，用磁珠稀释液进行稀释，并混匀。

试剂稀释液主要用于碱性磷酸酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD蛋白试剂(简称：试剂1)的配制，该配制过程如下：将碱性磷酸酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD蛋白按照1/2000的体积比稀释，用试剂稀释液进行稀释，并混匀。

在一些实施例中，当试剂盒中包括碱性磷酸酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白时，试剂盒操作过程及结果判定如下；

1)试剂准备

将新型冠状病毒中和抗体校准品和化学发光底物于室温(18～25℃)下平衡30分钟。

配液：用纯化水将浓缩洗涤液/清洗液20倍稀释(1L浓缩洗涤液/清洗液加19L纯化水)。若浓缩洗涤液/清洗液有结晶，可将其置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。

2)加样过程

根据实验需求，设置校准品6管及处理后的若干样本，启动仪器检测流程：分别加入35μL试剂1(浓度为0.05μg/mL)、50μL血液样本或校准品、35μL试剂0(0.2mg/mL)。一步法反应时间共计25分钟，完成第二次清洗后每管各加入化学发光底物A液和B液各100μL，避光检测，反应5秒读数。

3)试剂盒的结果判定

当检测样本浓度＜1.0AU/mL，检测结果判为阴性，并用“-”表示；

当检测样本浓度在1.0～2.0AU/mL之间，判断为不确定，建议3-5天后复查并综合判断；

当检测样本浓度≥2.0AU/mL，检测结果判为阳性；其中，当样本浓度为2～12AU/mL时为阳性，并用“+”表示；当样本浓度为12～30AU/mL时为强阳性，并用“++”表示；

当检测样本浓度为0～30AU/mL时，检测结果按实测浓度报告；

当检测样本浓度＞30AU/mL时，报告为＞30AU/mL。

在一些实施例中，本公开的试剂盒的性能分析如下(需要说明的是进行性能分析的试剂盒为包括碱性磷酸酶标记的修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白的试剂盒)：

1、稳定性分析

1.1设计要求：试剂盒37±1℃放置7天，外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密性检测结果均应符合设计要求。

1.2试验方法：将试剂盒在37℃存放7天后取出，检测企业参考品。

1.3稳定性检测结果如下表所示：

注：本说明书中涉及的第一批、第二批和第三批均指代三个不同批次的试剂盒。

2、精密性分析如下：

选用合适的强阳、弱阳、阴性三种样本，应符合以下要求

阴性样本：待测物浓度低于最低检测限或为零浓度，阴性检出率应为100％(n≥20)；

弱阳性样本：待测物浓度略高于试剂盒的最低检出限，阳性检出率为100％(n≥20)；

强阳性样本：待测物浓度呈中度到强阳性，阳性检出率为100％且CV≤8％(n≥20)。

试验方法：

检测企业精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。

精密性参考品检测结果如下表所示：

企业阴性参考品检测结果：

企业阴性参考品为25份新型冠状病毒中和抗体阴性血清灭活样本，其中包含甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体等阳性干扰样本。

企业阳性参考品检测结果：

企业阳性参考品为10份不同反应强度的新型冠状病毒中和抗体阳性血清灭活样本。

试验结果表明：表明三批试剂盒在37±1℃存放7天后，外观、阴、阳性参考品符合率、最低检出限、精密性均符合企业参考品要求。

3、灵敏度与特异性

为确定试剂盒的灵敏度，随机选取未感染新型冠状病毒(SARS-CoV-2)普通人群血液标本38例，检测其血液内中和抗体水平，检测结果如下：

试验结果表明：在普通标本中未检出阳性标本，即未出现假阳性现象。

为确定试剂盒的特异性，随机选取免疫后样本或感染新型冠状病毒(SARS-CoV-2)康复患者血液样本，检测其血液内中和抗体水平。检测结果如下表所示：

试验结果表明：阳性样本均可检出，未出现试剂盒漏检现象。

在一些实施例中，为确定试剂盒对于突变株的检出能力，本公开现将覆盖有突变位点试剂(即修饰型COVID-19 Spike RBD重组蛋白)与不含突变位点的试剂(即COVID-19Spike RBD重组蛋白)同时检测感染突变株血液样本，检测结果如下表所示：

以上实验结果表明：覆盖突变位点的试剂对于突变株检测能力提高。

在一些实施例中，为了进一步评价试剂盒对于新型冠状病毒灭活疫苗注射后在体内的量化情况，选取了注射疫苗后的普通人群并进行血液样本采集，以检测注射疫苗后体内中和抗体的变化情况，并选取了疫苗注射后不同时间点采集血液样本，分别为疫苗注射第二针3d后，5d后，14d，检测结果如下表：

/>

为更好的表现疫苗注射后的变化趋势，随机选定样本，监测其在完成疫苗免疫后15d内中和抗体的变化情况，结果如图2所示。

以上实验结果表明：人体注射疫苗后，体内抗体水平可呈现较好的良性增长。

本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本公开实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

序列表

<110> 博奥赛斯(重庆)生物科技有限公司

<120> 一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒及其应用

<130> FI210588

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1270

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro

65 70 75 80

Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser

85 90 95

Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val

115 120 125

Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr His Lys

130 135 140

Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala

145 150 155 160

Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu

165 170 175

Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys

180 185 190

Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn

195 200 205

Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val

210 215 220

Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala

225 230 235 240

Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr

245 250 255

Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe

260 265 270

Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys

275 280 285

Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr

290 295 300

Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr

305 310 315 320

Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly

325 330 335

Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg

340 345 350

Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser

355 360 365

Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu

370 375 380

Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg

385 390 395 400

Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala

405 410 415

Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala

420 425 430

Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr

435 440 445

Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp

450 455 460

Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val

465 470 475 480

Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro

485 490 495

Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe

500 505 510

Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr

515 520 525

Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr

530 535 540

Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln

545 550 555 560

Gln Phe Gly Arg Asp Ile Asp Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro

565 570 575

Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val

580 585 590

Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu

595 600 605

Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp

610 615 620

Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe

625 630 635 640

Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser

645 650 655

Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln

660 665 670

Thr Gln Thr Asn Ser His Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser

675 680 685

Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr

690 695 700

Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr

705 710 715 720

Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr

725 730 735

Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln

740 745 750

Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala

755 760 765

Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln

770 775 780

Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser

785 790 795 800

Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu

805 810 815

Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys

820 825 830

Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys

835 840 845

Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp

850 855 860

Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr

865 870 875 880

Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala

885 890 895

Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val

900 905 910

Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile

915 920 925

Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys

930 935 940

Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val

945 950 955 960

Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp

965 970 975

Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg

980 985 990

Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln

995 1000 1005

Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr

1010 1015 1020

Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys

1025 1030 1035 1040

Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly

1045 1050 1055

Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe

1060 1065 1070

Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg

1075 1080 1085

Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg

1090 1095 1100

Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser

1105 1110 1115 1120

Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp

1125 1130 1135

Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr

1140 1145 1150

Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly

1155 1160 1165

Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn

1170 1175 1180

Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1185 1190 1195 1200

Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly

1205 1210 1215

Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys

1220 1225 1230

Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly

1235 1240 1245

Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly

1250 1255 1260

Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270

Claims

1.一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒，其中，所述抗原为修饰型COVID-19Spike RBD重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述序列包括野生型新型冠状病毒毒株和突变型新型冠状病毒毒株的检测位点；所述试剂盒包括偶联磁性颗粒的COVID-19ACE2受体蛋白。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，还包括：碱性磷酸酶或辣根过氧化酶标记的修饰型COVID-19Spike RBD重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，还包括化学发光底物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，当试剂盒中包括辣根过氧化物酶标记的修饰型COVID-19Spike RBD重组蛋白时，化学发光底物包括A液和B液；

B液为0.5-1g/L过氧化脲；A液和B液按体积比1:1混合；

当试剂盒中包括碱性磷酸酶标记的修饰型COVID-19Spike RBD重组蛋白时，化学发光底物包括如下组分，0.1-0.5g/L AMPPD，0.05-0.1g/LNa₂SO₃，2-10g/L SDS(十二烷基硫酸钠)，5-10g/L Tris；0.02-0.1mL/L Tween-20和1-3mL Proclin TM 300，pH值为9.0±0.50。

5.根据权利要求2-4任一所述的试剂盒，所述偶联磁性颗粒的COVID-19ACE2受体蛋白的工作浓度为0.01～0.08μg/mL。

6.根据权利要求2-4任一所述的试剂盒，所述碱性磷酸酶或辣根过氧化酶标记的修饰型COVID-19Spike RBD重组蛋白的工作浓度为0.1～0.8mg/mL。

7.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，辣根过氧化酶标记的修饰型COVID-19SpikeRBD重组蛋白的制备过程包括以下步骤：

1)配制5-10mg/mL HRP溶液；

2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO₄溶液；

7)更换0.02-0.05M pH＝9.5的碳酸盐缓冲液，2-8℃反应4-8h；并加入修饰型COVID-19Spike RBD重组蛋白，使其浓度达到2-4mg/mL；

8)加入NaBH₄使其终浓度为5-10mM，2-8℃孵育6-18h；

8.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，碱性磷酸酶标记的修饰型COVID-19Spike RBD重组蛋白的制备过程包括以下步骤：

1)配制5-20mg/mL ALP溶液；

2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO₄溶液；

5)将待标记的修饰型COVID-19Spike RBD重组蛋白置于透析袋中，透析缓冲液为0.02-0.05M碳酸盐缓冲液，透析1-2h；

6)将上述透析完成的COVID-19Spike RBD重组蛋白与活化的碱性磷酸酶按照质量比为1:(0.5-0.8)的比例充分混匀后置于0.02-0.05M碳酸盐缓冲液中透析8h；

9.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，偶联磁性颗粒的COVID-19ACE2受体蛋白的制备方法包括以下步骤：

1)配制0.1-0.5M HEPES溶液使其PH值在7.5-9.5之间；

2)配制1-3M(NH₄)₂SO₄溶液，使其PH值在7.5-9.5之间；

5)向离心管中加入1mL配制好的0.1-0.5M HEPES溶液，重悬磁珠；

6)向重悬后的磁珠中加入100μg-200μg COVID-19ACE2受体蛋白，混匀；

11)重复步骤10)两次；

12)向离心管中加1-2mL磁珠稀释液重悬磁珠，4℃保存备用。

10.根据权利要求1-9任一所述的试剂盒在新型冠状病毒检测试剂中的应用。