CN112098645A - 一种新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒 - Google Patents
一种新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒,包括磁性颗粒‑抗FITC抗体、FITC标记新型冠状病毒重组抗原、以及碱性磷酸酶或辣根过氧化酶标记人IgA单克隆抗体。本发明试剂盒可以很好的补充核酸阴性新冠感染患者的诊断,同时对于无症状感染患者的诊断也表现出较好的价值,可实现早诊断、早治疗,尽可能缩小窗口期,对疑似病例的早期诊断具有重要的研究价值。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析检测技术领域,尤其是涉及一种新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒。
背景技术
首次感染和反复接触病毒时病毒载量高,病原体的特定蛋白如Covid-19的S蛋白和N蛋白等会刺激免疫系统引起抗体应答。
T.M.Gallagher研究发现冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)是一种I型跨膜包膜糖蛋白,由负责与病毒结合和融合的S1和S2两个结构域组合而成,S1中间片段是一个受体结合域,可以与靶细胞上的血管紧张素转化酶(ACE2)特异性结合,从病毒表面突出,可以更早地与宿主细胞接触,是中和抗体的主要诱导剂;S2结构域包含一个融合肽和两个七肽重复序列,负责病毒与靶细胞膜之间的融合。病毒S蛋白上的RBD与靶细胞上的ACE2结合后,S2通过HR1和HR2区之间的相互作用而发生构象改变,形成融合核心,并使病毒和靶细胞膜紧密接近,从而导致病毒融合进入细胞。
全长的S蛋白包含RBD和其他病毒功能域以及多个抗原中和表位,因此与单独的RBD相比,可诱导出更有效的中和抗体。而RBD实际引起中和抗体效价比全长S蛋白高得多的可能原因之一是后者含有非中和表位,可诱导增强抗体。
人体在被病毒感染后,最早出现的抗体是IgM及IgA抗体,IgA反应出现并早期生长,在第3周达到高峰,与IgM相比,IgA的抗体具有独特的抗体的动力学特征,并且比IgM反应更强,更持久。
IgM,IgA和IgG型病毒特异性抗体水平是预测人群对该疾病的免疫力以及是否与其他冠状病毒发生交叉反应的重要指标。Chintalacharuvu K.R在文章中指出IgA在人类机体中是一类比较独特的抗体,一方面由于其分子形式的异质性,具有两个IgA亚类,分别称为IgA1和IgA2。像所有Ig一样,每个子类都包含两个相同的重链(HC)和两个相同的轻链(LC)的基本分子单元。每条链在其N末端以可变区开始,然后是恒定区。每个子类中的LC都相同,但是HC在其恒定区域内有所不同,它们由不同的Cα基因编码。另外一方面IgA抗体特异性的不会参与机体的免疫应答,是介导机体粘膜免疫的主要因子,其在粘膜分泌物中能有效地阻止外界抗原附着或侵入人粘膜上皮,从而避免外来物给机体造成的损伤。
Ig A在正常人血清中的含量仅次于IgG,按其免疫功能又分为血清型和分泌型蛋白,血清型IgA占总量的85%左右,大部分血清型IgA为单体,大约10%-15%为二聚体,也发现有少量多聚体IgA的功能区的分布于与IgG相似。分泌型IgA为二聚体,其α重链之间存在相对较短的铰链,仅有10多个氨基酸残基组成。Patrícia de Sousa-Pereira和JennyM.Woof研究发现IgA铰链序列具有彼此独立弯曲的能力,但也可能增加对蛋白水解的敏感性,铰链为整个IgA的分子提供了对于活性至关重要的灵活性。鉴于分泌型IgA存在于分泌液中,如唾液、泪液、初乳、鼻和支气管分泌液、胃肠液、尿液、汗液等。IgA检测可以同时检测早期和记忆IgA应答,是当前各种抗体检测有效的补充。检测感染后迅速产生的抗体,可成为与PCR结合使用以提高检测灵敏度和准确性的工具。
总体上说,IgM、IgA、IgG三种抗体分型的检测可有效用于疾病病程发展的评估。基于以上抗体的血清学分析通过对SARS-CoV-2的免疫反应及血清转化的研究,从而确定COVID-19病程,对于流行病学研究、监测研究、疫苗试验必不可少。
当前国内外免疫层面关于新型冠状病毒诊断产品主要是总抗以及IgM、IgG抗体联合检测试剂,而新型冠状病毒特异性IgA抗体检测还未普及。因此,有必要提供一种IgA的检测方法,实现对疑似病例的早期诊断。
发明内容
有鉴于此,本发明旨在提出一种新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒,本发明针对IgA抗体作为介导局部粘膜免疫的主要因子以及特定的抗体动力学特征,通过采用磁微粒化学发光技术来检测ncovid-19感染后血清中的抗体变化,可以很好的补充核酸阴性新冠感染患者的诊断,同时对于无症状感染患者的诊断也表现出较好的价值,可实现早诊断、早治疗,尽可能缩小窗口期,对疑似病例的早期诊断具有重要的研究价值。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
一种新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒,包括磁性颗粒-抗FITC抗体、FITC标记新型冠状病毒重组抗原、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体、化学发光底物、牛血清白蛋白缓冲液。
优选的,FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原为S-RBD蛋白。
优选的,所述磁性颗粒-抗FITC抗体的制备,包括以下步骤,将四氧化三铁微球用戊二醛进行活化,室温混匀4-6h后,用0.02-0.05M PBS PH=7.4的缓冲液清洗三次,并用该溶液进行悬浮,浓度为50-80mg/mL,之后,每毫升悬浮液中,加入鼠抗FITC抗体约100-180ug,于37℃混匀温育4-10h,用等体积的0.02-0.05M PBS、质量分数5%BSA pH=7.4缓冲液于37℃封闭1小时;最后,用质量分数0.5%BSA、0.02-0.05M Tris-HCl pH=8.0的缓冲液清洗三次;所四氧化三铁的微球的粒径为0.1-0.5μm。
优选的,还包括牛血清白蛋白缓冲液,其制备包括如下步骤,将2.1-2.6g BSA溶于2.1-2.8L 0.15-0.20M的PBS缓冲液中,pH值范围在7.4±0.2,搅拌至完全溶解,并加入2.1-2.5mL ProClinTM300搅拌混匀30-60min。
优选的,FITC标记新型冠状病毒重组抗原的制备,包括如下步骤:
1)将待标记重组抗原置于透析袋中,透析缓冲液为0.02-0.05M碳酸盐缓冲液,透析1-2h;
2)将FITC溶于二甲基亚砜中,配制浓度为1-2mg/ml。FITC每次使用均需新鲜配制,并要求避光。
3)将透析完成的重组抗原与FITC按照质量比为1:(0.5-1)的比例进行混合,轻摇混匀,2-8℃避光反应8-12h。
4)向上述反应混合液中加入1-5M的NH4CL,并使终浓度达到30-60mM,置于2-8℃反应2-4h,以终止反应。
5)将上述完成的标记液置于0.01-0.05M的PBS缓冲液中透析12h后,取出标记好的原料,加入等体积的甘油保存备用。
优选的,辣根过氧化酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的制备,包括如下步骤,
A、辣根过氧化物酶(HRP)活化
1)配制5-10mg/mL HRP溶液;
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液;
3)将步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比(1-2):1混匀,2-8℃避光反应30min;
4)配制浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液,与步骤3)配制的溶液以相同体积混合,常温避光反应0.5-2h,活化即完成;
B辣根过氧化酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体
1)将待标记IgA单克隆抗体置于透析袋中,透析缓冲液为0.02-0.05M碳酸盐缓冲液,透析1-2h;
2)将上述透析完成的单克隆抗体与活化的辣根过氧化酶酶按照质量比为1:(0.5-0.8)的比例充分混匀后置于0.02-0.05M碳酸盐缓冲液中透析8h,
3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液,按1-2mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合,并于2-8℃避光反应2-4h;
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析18-24h,加入等体积甘油,-20℃保存;
碱性磷酸酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的制备,包括如下步骤:
A、碱性磷酸酶(ALP)活化
1)配制5-20mg/mL ALP溶液;
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO 4溶液;
3)将上述步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比(1-2):1混合均匀,2-8℃避光反应0.5-1h;
4)配制浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液,与上述步骤3)溶液以相同体积混合,常温避光反应10-30min,活化即完成;
B、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体
1)将待标记IgA单克隆抗体置于透析袋中,透析缓冲液为0.02-0.05M碳酸盐缓冲液,透析1-2h;
2)将上述透析完成的单克隆抗体与活化的碱性磷酸酶按照质量比为1:(0.5-0.8)的比例充分混匀后置于0.02-0.05M碳酸盐缓冲液中透析8h,
3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液,按1-2mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合,并于2-8℃避光反应2-4h;
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析18-24h,加入等体积甘油,-20℃保存。
优选的,还包括化学发光底物,配制如下:
当试剂盒中包括辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体时,化学发光底物包括A液和B液;
A液为0.5-1.5g/L鲁米诺,0.05-0.2g/L对碘酚,缓冲液为PH 7.5-9的2-10mmol/L、Tris-HCl,避光保存;
B液为0.5-1g/L过氧化脲,用工艺用水配制;A液和B液在使用前5min按体积比1:1混合;
当试剂盒中包括碱性磷酸酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体时,化学发光底物包括如下组分,0.1-0.5g/L AMPPD,0.05-0.1g/L Na2SO3,2-10g/L SDS(十二烷基硫酸钠),5-10g/LTris;0.02-0.1mL/L Tween-20和1-3mL Proclin TM 300,pH值为9.0±0.50。优选的,磁性颗粒-抗FITC抗体、FITC标记新型冠状病毒重组抗原、以及辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的工作浓度分别为1-2mg/mL、1-4μg/mL、2-8μg/mL。
本发明还提供如上所述的试剂盒在制备新型冠状病毒IgA检测试剂中的应用。
本发明采用间接法原理检测人血清中的新型冠状病毒IgA抗体。将磁性颗粒-抗FITC抗体、FITC标记新型冠状病毒抗原(合成多肽或重组抗原)和样本加入到反应管中,若样本中含有新型冠状病毒IgA抗体,则与以上试剂中的合成多肽或重组抗原形成复合物,同时结合到磁性颗粒上,洗掉游离成分。将碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶鼠抗人IgA单克隆抗体加入反应管中,碱性磷酸酶标记或辣根过氧化物酶的鼠抗人IgA单克隆抗体作为二抗,与样本中的IgA抗体结合,并形成碱性磷酸酶标记抗体或辣根过氧化物酶的-IgA抗体-重组抗原-磁性颗粒复合物,洗掉游离成分。加入化学发光底物液,碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶催化底物液发光,测定各样本管的发光值(RLU)。样本的发光值与其中的新型冠状病毒IgA抗体浓度呈正相关,从而检测人血清中的新型冠状病毒IgA抗体。
相对于现有技术,本发明所述的一种新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒,具有以下优势:
附图说明
图1为实施例一的ROC曲线分析图;
图2为实施例二的ROC曲线分析图。
具体实施方式
除有定义外,以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
一种新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒,包括磁性颗粒-抗FITC抗体、FITC标记新型冠状病毒重组抗原、辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体、化学发光底物、牛血清白蛋白缓冲液。FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原为S-RBD蛋白。
所述磁性颗粒-抗FITC抗体的制备,包括以下步骤,将四氧化三铁微球用戊二醛进行活化,室温混匀6h后,用0.05M PBS PH=7.4的缓冲液清洗三次,并用该溶液进行悬浮,浓度为50mg/mL,之后,每毫升悬浮中,加入鼠抗FITC抗体100ug,于37℃混匀温育4h,用等体积的0.05M PBS质量分数为5%BSA PH=7.4缓冲液于37℃封闭1小时;最后,用0.5%BSA0.02M Tris-HCl PH=8.0的缓冲液清洗三次;所四氧化三铁的微球的粒径为0.2μm。
新冠状病毒稀释液制备:将2.1g BSA溶于2.1L 0.05M的PBS缓冲液中,pH值范围在7.5,搅拌至完全溶解,并加入2.1mL ProClinTM300搅拌混匀30min。
FITC标记新型冠状病毒重组抗原的制备,包括如下步骤:
1)将待标记重组抗原置于透析袋中,透析缓冲液为0.02M碳酸盐缓冲液,透析1h。
2)将FITC溶于二甲基亚砜中,配制浓度为1mg/ml。FITC每次使用均需新鲜配制,并要求避光。
3)将透析完成的重组抗原与FITC按照质量比为1:0.5的比例进行混合,轻摇混匀,4℃避光反应12h。
4)向上述反应混合液中加入5M的NH4CL,并使终浓度达到50mM,置于4℃反应2h,以终止反应。
5)将上述完成的标记液置于0.01-0.05M的PBS缓冲液中透析12h后,取出标记好的原料,加入等体积的甘油保存备用。
浓缩洗涤液制备:具体包括58g/L磷酸氢二钠,5.92g/L磷酸二氢钠,180g/L NaCl,10mL/L Tween-20和质量浓度2%Proclin300。
试剂0制备:将磁性颗粒-抗FITC抗体按照1/200的体积比稀释比例,用新型冠状病毒稀释液进行稀释,并混匀。工作浓度为2mg/mL;
试剂1制备:将FITC标记新型冠状病毒重组抗原按照0.2μg/mL的使用浓度,用新型冠状病毒稀释液进行稀释,并搅拌均匀。
试剂2制备:将辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体按照0.1μg/mL的使用浓度,用新型冠状病毒稀释液进行稀释,并搅拌均匀。
IgA抗体阴性对照:将上述新型冠状病毒稀释液作为新冠状病毒IgA抗体阴性对照。
IgA抗体阳性对照:将抗新型冠状病毒IgA抗体阳性混合人血清按1/2000体积比稀释,作为新冠状病毒IgA抗体阳性对照。
实施例一
辣根过氧化酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的制备,包括如下步骤:
A:辣根过氧化物酶(HRP)活化
1)配制10mg/mL HRP溶液;
2)配制12.8mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液;
3)将步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比2:1混匀,4℃避光反应30min;
4)配制浓度为20μL/mL的乙二醇水溶液,与步骤3)配制的溶液以相同体积混合,常温避光反应30min,活化即完成,放-20℃保存(保存时间不超过3个月);
B、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体
1)将待标记IgA单克隆抗体置于透析袋中,透析缓冲液为0.02M碳酸盐缓冲液,透析1h。
2)将上述透析完成的单克隆抗体与活化的辣根过氧化酶按照质量比为1:0.8的比例充分混匀后置于0.02M碳酸盐缓冲液中透析8h,
3)配制浓度为2mg/mL的NaBH4水溶液,按1mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合,并于4℃避光反应2h;
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h,加入等体积甘油,-20℃保存。
化学发光底物包括A液和B液,配制步骤如下:
A液为0.7g/L鲁米诺,0.08g/L对碘酚,缓冲液为pH 8.6的5mmol/L Tris-HCl,避光保存;
B液为0.675g/L过氧化脲,用工艺用水配制;A液和B液在使用前5min按体积比1:1混合。
当试剂盒中包括辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体时,试剂盒的使用方法:
1、将新型冠状病毒IgA抗体阴阳性对照和辣根过氧化酶化学发光底物A液和B液在室温(18~25℃)下平衡30分钟。
2、配液:用纯化水将浓缩洗涤液10倍稀释(1L浓缩洗涤液加9L纯化水)。若浓缩洗涤液有结晶,可将浓缩洗涤液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。
分析过程
1、样本处理:取1mL生理盐水加入25μL样本,用漩涡混匀仪混匀5秒,静止15分钟后开始实验。
2、根据实验需要设置阴性、阳性对照各2管及处理后样本若干,启动仪器测试流程:分别加入35μL新型冠状病毒IgA抗体试剂0、50uL新型冠状病毒IgA抗体试剂1、75μL处理后样本或阴性对照/阳性对照、75μL新型冠状病毒IgA抗体试剂2两步法反应时间35分钟;完成第二次清洗后每管加入化学发光底物A液和B液各100μL,避光检测,反应5秒读数。
试剂盒的结果判定
样本S/CO=样本发光值/cut-off。
阴性判断:样品发光值<临界值(cut-off),样本S/CO<1.0,检测结果判为阴性。
阳性判断:样品发光值≥临界值(cut-off),样本S/CO≥1.0,检测结果判为阳性。
1、试剂盒的性能评估测定:
1.1试剂盒灵敏度的评估
选取三批血清样本进行倍比稀释,1:2、1:4、1:8、1:16,将检测结果中阳性检出率为90%~95%的最大稀释倍数作为试剂盒的最低检出限。
试验结果
1.2试剂盒样本试验结果
试验方法:选取20例正常人样本,进行检测
试验结果:20例正常样本检测结果均为阴性
3、IgA检测与IgG检测的样本符合率
试验方法:对于同一份样本分别进行IgG与IgA的检测,以检测两种不同抗体检出效果的符合率,根据上述试剂盒结果的判定标准进行结果判读;试验结果:
试验结论:通过对同一份样本进行IgA和IgG的同时检测,结果表明两种抗体的样本检出符合率一致。
根据检验结果使用SPSS软件进行ROC曲线分析,具体结果如下表所示,ROC曲线分析图如图1所示。
曲线下的面积
检验结果变量:VAR00001
a.在非参数假设下
b.零假设:实面积=0.5
样本S/CO≥1,检测结果判为阳性;样本S/CO<1,检测结果判为阴性。其中S/CO值为检测样本的发光值/cutoff值。通过ROC曲线确定试剂盒在不同cutoff值的情况下,试剂盒灵敏度及特异性的表现,筛选出最优的cutoff值。
ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.963,表明本发明所述试剂盒在临床诊断中的准确性较高
实施例2
碱性磷酸酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的制备,包括如下步骤:
1)将待标记IgA单克隆抗体置于透析袋中,透析缓冲液为0.02M碳酸盐缓冲液,透析1h。
2)将上述透析完成的单克隆抗体与活化的碱性磷酸酶按照质量比为1:0.8的比例充分混匀后置于0.02M碳酸盐缓冲液中透析8h,
3)配制浓度为2mg/mL的NaBH4水溶液,按1mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合,并于4℃避光反应2h;
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h,加入等体积甘油,-20℃保存。
化学发光底物配制如下:
1)量取900mL的纯化水;
2)向步骤1)的纯化水中分别添加0.2gAMPPD,0.05g Na2SO3,2gSDS(十二烷基硫酸钠),6gTris,搅拌至完全溶解;
3)向步骤2)的溶液中分别添加0.02mLTween-20和3mL ProclinTM300,定容至1L;
4)调节pH至9.2,储存于2~8℃。
当试剂盒中包括碱性磷酸酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体时,试剂盒的使用方法:
1、将新型冠状病毒IgA抗体阴阳性对照和碱性磷酸酶化学发光底物液在室温(18~25℃)下平衡30分钟。
2、配液:用纯化水将浓缩洗涤液10倍稀释(1L浓缩洗涤液加9L纯化水)。若浓缩洗涤液有结晶,可将浓缩洗涤液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。
分析过程
1、样本处理:取1mL生理盐水加入25μL样本,用漩涡混匀仪混匀5秒,静止15分钟后开始实验。
2、根据实验需要设置阴性、阳性对照各2管及处理后样本若干,启动仪器测试流程:分别加入35μL新型冠状病毒IgA抗体试剂0、50uL新型冠状病毒IgA抗体试剂1、75μL处理后样本或阴性对照/阳性对照、75μL新型冠状病毒IgA抗体试剂2两步法反应时间35分钟;完成第二次清洗后每管加入碱性磷酸酶化学发光底物液200μL,避光检测,反应5秒读数。
试剂盒的结果判定
样本S/CO=样本发光值/cut-off。
阴性判断:样品发光值<临界值(cut-off),样本S/CO<1.0,检测结果判为阴性。
阳性判断:样品发光值≥临界值(cut-off),样本S/CO≥1.0,检测结果判为阳性。
试剂盒的性能评估测定:
1、试剂盒灵敏度的评估
1.1试验方法:选取三批血清样本进行倍比稀释,1:2、1:4、1:8、1:16,将检测结果中阳性检出率为90%~95%的最大稀释倍数作为试剂盒的最低检出限。
1.2试验结果
最低检出限的确定
2、试剂盒样本试验结果
试验方法:选取20例正常人样本,进行检测
试验结果:20例正常样本检测结果均为阴性
3、IgA检测与IgG检测的样本符合率
试验方法:对于同一份样本分别进行IgG与IgA的检测,以检测两种不同抗体检出效果的符合率,根据上述试剂盒结果的判定标准进行结果判读;试验结果:
试验结论:通过对同一份样本进行IgA和IgG的同时检测,结果表明两种抗体的样本检出符合率一致。
根据检验结果使用SPSS软件进行ROC曲线分析,具体结果如下表所示,ROC曲线分析图如图2所示。
曲线下的面积
检验结果变量:IgA磁微粒化学发光
a.在非参数假设下
b.零假设:实面积=0.5
样本S/CO≥1,检测结果判为阳性;样本S/CO<1,检测结果判为阴性。其中S/CO值为检测样本的发光值/cutoff值。通过ROC曲线确定试剂盒在不同cutoff值的情况下,试剂盒灵敏度及特异性的表现,筛选出最优的cutoff值。
ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.978,表明本发明所述试剂盒在临床诊断中的准确性较高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒,其特征在于:包括磁性颗粒-抗FITC抗体、FITC标记新型冠状病毒重组抗原、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体、化学发光底物、牛血清白蛋白缓冲液。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒,其特征在于:FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原为S-RBD蛋白。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒,其特征在于:所述磁性颗粒-抗FITC抗体的制备,包括以下步骤,将四氧化三铁微球用戊二醛进行活化,室温混匀4-6h后,用0.02-0.05M PBS PH=7.4的缓冲液清洗三次,并用该溶液进行悬浮,浓度为50-80mg/mL,之后,每毫升悬浮液中,加入鼠抗FITC抗体约100-180ug,于37℃混匀温育4-10h,用等体积的0.02-0.05M PBS、质量分数5%BSA pH=7.4缓冲液于37℃封闭1小时;最后,用质量分数0.5%BSA、0.02-0.05M Tris-HCl pH=8.0的缓冲液清洗三次;所四氧化三铁的微球的粒径为0.1-0.5μm。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒,其特征在于:还包括牛血清白蛋白缓冲液,其制备包括如下步骤,将2.1-2.6g BSA溶于2.1-2.8L0.15-0.20M的PBS缓冲液中,pH值范围在7.4±0.2,搅拌至完全溶解,并加入2.1-2.5mLProClinTM300搅拌混匀30-60min。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒,其特征在于:FITC标记新型冠状病毒重组抗原的制备,包括如下步骤:
1)将待标记重组抗原置于透析袋中,透析缓冲液为0.02-0.05M碳酸盐缓冲液,透析1-2h;
2)将FITC溶于二甲基亚砜中,配制浓度为1-2mg/ml;
3)将透析完成的重组抗原与FITC按照质量比为1:(0.5-1)的比例进行混合,轻摇混匀,2-8℃避光反应8-12h;
4)向上述反应混合液中加入1-5M的NH4CL,并使终浓度达到30-60mM,置于2-8℃反应2-4h,以终止反应;
5)将上述完成的标记液置于0.01-0.05M的PBS缓冲液中透析12h后,取出标记好的原料,加入等体积的甘油保存备用。
6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒,其特征在于:
辣根过氧化酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的制备,包括如下步骤,
A、辣根过氧化物酶(HRP)活化
1)配制5-10mg/mL HRP溶液;
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液;
3)将步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比(1-2):1混匀,2-8℃避光反应30min;
4)配制浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液,与步骤3)配制的溶液以相同体积混合,常温避光反应0.5-2h,活化即完成;
B辣根过氧化酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体
1)将待标记IgA单克隆抗体置于透析袋中,透析缓冲液为0.02-0.05M碳酸盐缓冲液,透析1-2h;
2)将上述透析完成的单克隆抗体与活化的辣根过氧化酶酶按照质量比为1:(0.5-0.8)的比例充分混匀后置于0.02-0.05M碳酸盐缓冲液中透析8h,
3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液,按1-2mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合,并于2-8℃避光反应2-4h;
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析18-24h,加入等体积甘油,-20℃保存;
碱性磷酸酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的制备,包括如下步骤:
A、碱性磷酸酶(ALP)活化
1)配制5-20mg/mL ALP溶液;
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO 4溶液;
3)将上述步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比(1-2):1混合均匀,2-8℃避光反应0.5-1h;
4)配制浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液,与上述步骤3)溶液以相同体积混合,常温避光反应10-30min,活化即完成;
B、碱性磷酸酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体
1)将待标记IgA单克隆抗体置于透析袋中,透析缓冲液为0.02-0.05M碳酸盐缓冲液,透析1-2h;
2)将上述透析完成的单克隆抗体与活化的碱性磷酸酶按照质量比为1:(0.5-0.8)的比例充分混匀后置于0.02-0.05M碳酸盐缓冲液中透析8h,
3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液,按1-2mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合,并于2-8℃避光反应2-4h;
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析18-24h,加入等体积甘油,-20℃保存。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒,其特征在于:还包括化学发光底物,配制如下:
当试剂盒中包括辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体时,化学发光底物包括A液和B液;
A液为0.5-1.5g/L鲁米诺,0.05-0.2g/L对碘酚,缓冲液为PH 7.5-9的2-10mmol/L、Tris-HCl,避光保存;
B液为0.5-1g/L过氧化脲,用工艺用水配制;A液和B液在使用前5min按体积比1:1混合;
当试剂盒中包括碱性磷酸酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体时,化学发光底物包括如下组分,0.1-0.5g/L AMPPD,0.05-0.1g/L Na2SO3,2-10g/L SDS(十二烷基硫酸钠),5-10g/LTris;0.02-0.1mL/L Tween-20和1-3mL Proclin TM 300,pH值为9.0±0.50。
8.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA抗体磁微粒化学发光法检测试剂盒,其特征在于:磁性颗粒-抗FITC抗体、FITC标记新型冠状病毒重组抗原、以及碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的工作浓度分别为1-2mg/mL、1-4μg/mL、2-8μg/mL。
9.如权利要求1-8任一项所述的试剂盒在制备新型冠状病毒IgA检测试剂中的应用。
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113009154A (zh) * | 2021-02-25 | 2021-06-22 | 山东莱博生物科技有限公司 | 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用 |
CN113072625A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-07-06 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 多肽、新型冠状病毒抗体的检测试纸和检测试剂盒 |
CN113125756A (zh) * | 2020-07-15 | 2021-07-16 | 南京岚煜生物科技有限公司 | 抗体标准品赋值和抗原中和当量确定的方法 |
CN113325177A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-08-31 | 博奥赛斯(重庆)生物科技有限公司 | 一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒及其应用 |
CN113533724A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-10-22 | 北京浩鼎瑞生物科技有限公司 | 一种新冠状病毒covid-19检测方法及试剂盒 |
CN114705868A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-07-05 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒及其制备方法 |
CN115184344A (zh) * | 2022-01-30 | 2022-10-14 | 北京市疾病预防控制中心 | 一种适用于新型生物样本口腔液的新型冠状病毒IgG抗体检测方法及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20200209226A1 (en) * | 2017-01-20 | 2020-07-02 | Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co. | Labeled complex, preparation method thereof, kit containing the same, application of kit and detection system comprising kit |
CN111413496A (zh) * | 2020-05-18 | 2020-07-14 | 博奥赛斯(天津)生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体化学发光法检测试剂盒 |
CN111551743A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-08-18 | 北京贝尔生物工程股份有限公司 | 一种快速准确检测新型冠状病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法 |
CN111610327A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-09-01 | 北京贝尔生物工程股份有限公司 | 一种新型冠状病毒检测试剂盒及其制备方法 |
-
2020
- 2020-09-11 CN CN202010957773.4A patent/CN112098645A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20200209226A1 (en) * | 2017-01-20 | 2020-07-02 | Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co. | Labeled complex, preparation method thereof, kit containing the same, application of kit and detection system comprising kit |
CN111610327A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-09-01 | 北京贝尔生物工程股份有限公司 | 一种新型冠状病毒检测试剂盒及其制备方法 |
CN111551743A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-08-18 | 北京贝尔生物工程股份有限公司 | 一种快速准确检测新型冠状病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法 |
CN111413496A (zh) * | 2020-05-18 | 2020-07-14 | 博奥赛斯(天津)生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒IgM/IgG抗体化学发光法检测试剂盒 |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113125756A (zh) * | 2020-07-15 | 2021-07-16 | 南京岚煜生物科技有限公司 | 抗体标准品赋值和抗原中和当量确定的方法 |
CN113125756B (zh) * | 2020-07-15 | 2022-10-25 | 南京岚煜生物科技有限公司 | 抗体标准品赋值和抗原中和当量确定的方法 |
CN113009154A (zh) * | 2021-02-25 | 2021-06-22 | 山东莱博生物科技有限公司 | 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用 |
CN113009154B (zh) * | 2021-02-25 | 2024-01-30 | 山东莱博生物科技有限公司 | 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用 |
CN113072625A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-07-06 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 多肽、新型冠状病毒抗体的检测试纸和检测试剂盒 |
CN113072625B (zh) * | 2021-03-26 | 2022-06-10 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 多肽、新型冠状病毒抗体的检测试纸和检测试剂盒 |
CN113325177A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-08-31 | 博奥赛斯(重庆)生物科技有限公司 | 一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒及其应用 |
CN113325177B (zh) * | 2021-06-04 | 2024-03-01 | 博奥赛斯(重庆)生物科技有限公司 | 一种包含新型冠状病毒突变抗原的中和抗体检测试剂盒及其应用 |
CN113533724A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-10-22 | 北京浩鼎瑞生物科技有限公司 | 一种新冠状病毒covid-19检测方法及试剂盒 |
CN115184344A (zh) * | 2022-01-30 | 2022-10-14 | 北京市疾病预防控制中心 | 一种适用于新型生物样本口腔液的新型冠状病毒IgG抗体检测方法及其应用 |
CN114705868A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-07-05 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒及其制备方法 |
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