CN113533724A - 一种新冠状病毒covid-19检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种新冠状病毒covid-19检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新冠状病毒COVID‑19检测方法及试剂盒。通过标记的IgA检测新冠状病毒COVID‑19。本发明的检测过程方便，检测结果可靠。

Description

一种新冠状病毒COVID-19检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种新冠状病毒COVID-19检测方法及试剂盒。
背景技术
冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。人首次感染新型病毒后，机体的免疫系统会对病毒进行免疫防御，产生特异性的抗体。抗体测定试剂盒可用于流行病学调查，了解人群中有多少个体接触过相应的新型病毒，有助于国家对疫情的整体判断和控制。现阶段，新型冠状病毒COVID-19的S蛋白和N蛋白检测临床上主要以核酸检测和CT检测为准，检测速率慢，专业操作要求高。
公开号为CN112795695A的中国专利涉及一种用于检测新冠病毒的荧光PCR检测试剂盒及检测方法，其包括新冠内参、特异性引物、内参检测探针、第一检测探针和第二检测探针，新冠内参为所述特异性引物中的一对引物的靶序列，内参荧光报告基团、所述第一荧光报告基团和所述第二荧光报告基团互不相同。该试剂盒能够通过活体采集病毒后进行核酸提取从而达到新冠病毒的检测。
公开号为CN112795475A的中国专利提供了适用于非人源样品的新冠病毒检测系统及其应用，所述新冠病毒检测系统包括采样管和PCR检测试剂；所述PCR检测试剂包括非人源质控基因的特异性引物和探针、新冠病毒的特异性引物和探针、DNA聚合酶、dNTPs和PCR缓冲液。但上述检测方法只能检测到组织液中包含的裸露的病毒，对于存在于细菌或组织细胞内的病毒无法准确检测，可能出现组织液中不存在病毒，而体内仍然存在包含病毒的细菌，进而出现检测假阴性，后期患者复阳的问题。该检测方法以人源新冠病毒为内参进行定量对比，采样过程中容易出现高假阳性等检测问问题。
现基于细胞实验和动物实验发现，IgA能够与COVID-19病毒结合形成免疫复合体，并且能够协助COVID-19病毒进入无ACE2的hela细胞和A549细胞，协助COVID-19进行免疫逃逸。IgA抗体为粘膜免疫系统产生的抗体，也是对阻断病毒感染起到重要作用的抗体。研究其辅助COVID-19进入动物细胞的机理对于研究COVID-19的传播和感染路径有极大的潜在价值。新冠病毒COVID-19的IgA检测试剂盒的使用，能够为临床提供血清学的证据，可与核酸检测方法、FISH和电镜等方法联合使用，从而为新冠病毒COVID-19的诊断和各项机理研究提供更全面、准确的信息。
此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于发明人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。
发明内容
针对现有技术之不足，本发明提供一种新冠状病毒COVID-19检测方法，通过标记的IgA检测新冠状病毒COVID-19。
根据一种优选的实施方式，包括步骤：以新冠病毒COVID-19的特异性蛋白作为检测的复合物，使用磁微粒化学发光法，通过SA级联放大对新冠状病毒抗体IgA检测。
根据一种优选的实施方式，标记的IgA还包括IgA1、IgA2。
根据一种优选的实施方式，包括：定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂、发光底物和清洗浓缩液；其中，所述定标品、阴性对照品和阳性对照品包括：新型冠状病毒lgA抗体；所述抗试剂包括：异硫氰酸荧光素标记的新冠状病毒特异性蛋白；所述二抗试剂包括：碱性磷酸酶标记的抗人IgA标记抗体；所述磁微粒试剂包括：抗异硫氰酸荧光素抗体偶联磁微粒；所述发光底物包括：ALPS发光底物。
根据一种优选的实施方式，所述新型冠状病毒lgA抗体通过0.1M的Tris缓冲液溶解，并稀释至新生牛血清的缓冲液中配制得到所述定标品、阳性对照品和阴性对照品。
根据一种优选的实施方式，所述新生牛血清缓冲液包括以下体积比的组分：新生牛血清99.45-99.89％、四环素0.01％-0.05％和硫酸新霉素0.1-0.5％。
根据一种优选的实施方式，所述异硫氰酸荧光素标记的新冠状病毒特异性蛋白、所述碱性磷酸酶标记的抗人IgA标记抗体分别与Tris盐酸缓冲液混合制得所述抗试剂和所述二抗试剂。
根据一种优选的实施方式，所述ALPS发光底物按照1:4的体积比经缓冲液稀释制得所述发光底物。
一种前述试剂盒的制备方法，包括：
1)分别配制定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂、发光底物、和清洗浓缩液；
2)将定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂、发光底物、清洗浓缩液独立地置于包装容器内，得到新型冠状病毒IgA检测试剂盒。
如前所述的制备方法制备得到的新冠病毒检测试剂盒在检测新冠病毒中的应用。
一种新冠状病毒COVID-19检测方法，使用前述的检测试剂盒进行新冠状病毒COVID-19检测。
本发明的有益之处在于：
(1)使用方便，用户能够根据试剂盒内的现有试剂对病毒进行可靠检测，并且检测质量可靠，检测结果不受溶液和标准对照的影响，检测结果可靠。
(2)提供一种新的病毒检测方法，并且能够加快检测速度。
附图说明
图1是SARS-CoV-2和IgA在心脏中共定位结果图；
图2是SARS-CoV-2、IgA和细菌在病人心脏共定位的结果图；
图3是SARS-CoV-2和IgA在病人脾共定位的结果图；
图4是SARS-CoV-2、IgA和细菌在病人肺部共定位的结果图；
图5是IgA、新冠病毒假病毒和细菌共培养后的检测结果图；
图6是SARS-CoV-2感染大鼠后在大鼠小肠内的FISH+IF结果图；
图7是SARS-CoV-2感染小鼠后在小鼠肺内的FISH+IF结果图；
图8是SARS-CoV-2感染大鼠后在大鼠肺内的FISH+IF结果图；
图9是SARS-CoV-2感染大鼠后在大鼠小肠内细菌和病毒的FISH+IF结果图；
图10是IgA和病毒与A549和Hela细胞内的复合物检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图1-10进行详细说明。
实施例1 IgA免疫复合体的发现
在进行新冠肺炎的临床诊断治疗时，发现一例患者为细菌感染症状，但通过血培培养不出细菌，但细菌通用引物探针FISH和抗SARS-CoV-2Spike蛋白免疫荧光共定位，发现细菌和病毒在心、肺、肾脏和脾共定位，特别是心脏，由此产生了细菌可能是L-form细菌，而病毒可能通过侵染L-form细菌进而由携带病毒的L-form细菌再侵染人体实现传播的猜想。并且，COVID-19治愈病人复阳案例也在不断增加，理论上治愈后患者体内不应该有病毒，在不接触COVID-19患者或新冠病毒环境，复阳意味着SARS-CoV-2依然存在患者体内。在患者治愈后免疫力增强可以杀灭病毒情况下，病毒要逃避宿主免疫，除了感染宿主免疫细胞外，感染没有抗原性的L-form细菌(细胞壁多糖是细菌的主要抗原，无壁后，细菌失去抗原性，可以逃避宿主的免疫监视)是最好的选择。而环境中细菌及L-form细菌无处不在，呼吸、接触和进食病毒和细菌污染的食物都可以导致动物及人类感染。
SARS-CoV-2导致人心、肝、脾、肺、肾、胃肠道、甚至于胎盘等脏器全身性感染，最终导致人死亡。在正常健康情况下，人的肺和胃肠道有共生细菌，但胃肠道共生菌量要比肺大得多，外源性病毒感染的细菌更容易导致胃肠道的L-form细菌感染，再经IgA包裹突破宿主粘膜免疫屏障，经循环系统到达各个脏器，导致全身性感染。IgA是机体黏膜防御系统中的主要成分，广泛分布于乳汁、唾液以及胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道黏膜分泌液中。一直以来，认为与SARS-CoV-2有关的免疫球蛋白主要为IgG和IgM，但由于在新冠患者的心、肺、肾脏和脾均定位出病毒的存在，而消化道和呼吸道均属于黏膜免疫，因此怀疑IgA参与SARS-CoV-2感染的过程。
COVID-19临床样本肺细菌和新冠病毒共感染，验证IgA与SARS-CoV-2和细菌共定位，实验流程如下：
(一)采集COVID-19确诊患者的组织样品，进行样品处理，处理方法如下：
1、脱蜡：
1)二甲苯脱蜡3次，每次5min；
2)100％酒精两次，每次2min；
3)移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:
1)每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2)37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
3)SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4)梯度酒精脱水(-20℃预冷)。
3、变性：
1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；
2)78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；
3)78℃孵育8min；
4)即移入-20℃预冷70％酒精的染色缸内2min，再依次移入80％、90％和100％的-20℃预冷酒精内，每缸2min；
5)空气干燥。
4、杂交：
1)准备探针；
2)取一个较大的湿盒，交叉放置切片；
3)滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；
4)盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
4.1、杂交后的水洗：
5)镊子小心去除盖玻片；
6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
7)2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；
8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
9)从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。
10)每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；
11)去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。
4.2、扩增：
12)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
13)每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
14)去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；
15)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
16)每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
17)1×PBS室温下洗3次，每次2min。
5、细胞核染色：
1)张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；
2)尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
如图1-图4，在确诊COVID-19的临床诊断患者的组织采样进行IgA和抗SARS-CoV-2Spike蛋白免疫荧光的图片中显示，IgA和SARS-CoV-2共定位于患者心、肺、脾中。
(二)细胞模型证实IgA包裹的新冠病毒假病毒可以侵入细菌体内。如图5所示，IgA、新冠病毒假病毒和细菌共培养。左：实验组，IgA包裹的病毒可以侵入细菌胞质内；右：对照组，细菌培养基中加IgA，无病毒颗粒IgA未检测到侵入细菌胞质。
(三)病毒感染或黏附细菌感染hACE2小鼠和肥胖小鼠、自发性高血压大鼠SHR和II糖尿病ZDF大鼠，标准新冠假病毒溶液以鼻或胃的灌注方式进行大鼠病毒感染，具体方法如下：
1).SARS-CoV-2假病毒的制备
SARS-CoV-2假病毒是通过用聚醚酰亚胺(PEI)将293T细胞与psPAX2、pLenti-GFP和编码SARS-CoV-2 S的质粒共转染而产生的。转染后40，64小时收集上清液，以800×g离心5分钟以除去细胞碎片，通过0.45微米过滤器，并使用灭菌的SW28转子以22，000转/分钟在4℃超速离心2小时。通过转导293T-ACE2细胞并用荧光激活细胞分选术(FACS)计数EGFP阳性细胞来测定病毒的滴度。
2).非抗生素诱导细胞壁缺陷型细菌的产生并与SARS-CoV-2假病毒共培养
a.以1:100的比例吸取过夜菌液(250μl)加入25ml LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养2-3h至OD600达到0.5左右(OD600范围0.4-0.6)。
b.将25mL菌液移至预冷的50mL聚丙烯离心管中，在冰上放置30min，使培养物冷却到0℃。
c.于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞。
d.倒出培养液，将管倒置1min(于滤纸/吸水纸上)，使最后残留的痕量培养液流尽。
e.每50mL菌液用10mL预冷的0.1mol/L的CaCl2，重悬每份沉淀，放置于冰浴上30min。
f.于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞。
g.倒出培养液，将管倒置1min(于滤纸/吸水纸上)，使最后残留的痕量培养液流尽。
h.每50mL初始培养物用2mL用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2(含15％甘油)重悬每份细胞沉淀。
i.在冰上将细胞分装成小份，100μl/份，防御-70℃冻存。
g.如果当天要用，最好将制好的感受态细胞在4℃放置4h后再用，效果较好。制备好的感受态细胞在4℃放置24-48h内使用，不影响效果。
以上步骤类似于感受态细胞的制备但有不同。
j.以上制备的细菌用高糖或高盐溶液培养48h。
k.高盐或高糖液态培养基细菌与病毒共培养。
3).病毒感染或黏附细菌感染hACE2小鼠和肥胖小鼠、自发性高血压大鼠SHR和II糖尿病ZDF大鼠
SARS-CoV-2假病毒与细胞壁缺陷型细菌共培养48h后梯度离心，去除大部分未感染或黏附的假病毒。这一步实验难度比较大，优化实验条件获得最大量病毒感染或黏附的细菌。
4).SARS-CoV-2假病毒感染或黏附细菌经鼻和灌胃感染hACE2转基因小鼠和肥胖小鼠、高血压和糖尿病大鼠
A.每只hACE2转基因小鼠和肥胖小鼠107copies/5mL SARS-CoV-2假病毒用10μl移液器枪尖经鼻感染小鼠；
B.每只自发性高血压大鼠SHR和II糖尿病ZDF大鼠108copies/5mL SARS-CoV-2假病毒用10μl移液器枪尖经鼻感染大鼠；
C.每只hACE2转基因小鼠和肥胖小鼠107copies/5mL SARS-CoV-2假病毒用5cm灌胃针灌胃感染小鼠；
D.每只自发性高血压大鼠SHR和II糖尿病ZDF大鼠108copies/5mL SARS-CoV-2假病毒用5cm灌胃针灌胃感染大鼠。
先保定动物,即用右手将大鼠尾巴提起，置于鼠笼或粗糙的平面上，当大鼠向前挣扎时，用左手的拇指和食指捏住大鼠两耳后颈背皮肤，翻转大鼠置于掌心，拉直后肢，以小指压住大鼠尾巴即可。在保定大鼠过程中，不要用力过大，勿握其颈部，以免窒息死亡。以灌胃器轻轻压其头部，使口腔与食道成一条直线，再将灌胃针沿上腭壁轻轻进入食道，当灌胃针进入约5cm左右时即达胃内。如果灌胃针的位置插入正确，大鼠可自行吞服药，灌胃针插入位置不正确，大鼠会强烈挣扎，必须拔出重插，否则可能将药物灌入气管，造成大鼠死亡。注完药液后轻轻抽出灌胃针。
灌注后3～5天，进行大鼠组织切片观察。
如图6-9所示，在大鼠的小肠和肺中和小鼠的肺中均同时存在IgA和SARS-CoV-2病毒。新冠病毒假病毒感染大鼠小肠有大量的病毒颗粒，肠道细菌已经突破肠道粘膜屏障易位，经肠道新冠病毒是可能到达宿主各个脏器故而确认被SARS-CoV-2感染的大鼠和小鼠的IgA能够与SARS-CoV-2病毒和肠道细菌形成免疫复合体。
(四)对IgA、IgA-SARS-CoV-2病毒复合体对于人体细胞的作用进行进一步探索，方法如下：
实验组1：使用IgA-SARS-CoV-2病毒复合体侵染A549细胞：
1、0.25％胰酶新鲜解冻；
2、预冷的D-Hanks清洗容器；
3、加入约1-2mL的胰酶,晃动瓶子,使液体浸润容器底部；
4、超净台上放置约1-2分钟；
5、镜下观察见细胞变圆或细胞间隙变大,即可加入含血清的培养基(1640+10％的小牛血清+200u/mL庆大霉素)终止消化；
6、添加IgA-SARS-CoV-2于37℃下进行共培养；
7、镜下观察。
实验组2：使用IgA-SARS-CoV-2病毒复合体侵染Hela细胞：
1.取待传代的细胞，打开versene，用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。(加versene主要是为了将旧培养基洗去)。在离心管中间部分将液体加入。
2.打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入，加入IgA-SARS-CoV-2。
3.将细胞放入37℃孵箱。放孵箱2min,收胰酶，打开PBS。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
4.取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后(细胞变圆，但不漂起)，用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800rpm离心5min；
5.吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中；
6.细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀；
7.擦计数板，用枪吸10μl的液体，计数。不要把枪伸到离心管内；
8.吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37℃孵育，收超净台；
通过FISH-IF实验进行IgA和IgA复合体的镜下观察，如图10所示，观察得到IgA能够作为媒介以与病毒形成复合体的方式进入A549和Hela细胞内部。
实施例2试剂盒制备
配置缓冲溶液
实施例中所用各试剂材料均可商购获得，所用各仪器设备也是所属领域的现有仪器设备，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
本发明中所述的各种缓冲液的配方如下：
Tris盐酸pH8.0缓冲液：
试剂名称 生产商 浓度 1L缓冲液用量
Tris Sigma 0.1M 12.12mL
氯化钠 Sigma 0.9％ 5.82mL
4M盐酸 Sigma pH7.5 约20mL
新生牛血清缓冲液：
试剂名称 生产商 浓度 1L缓冲液用量
新生牛血清 Sigma 100％ 1000mL
四环素 Sigma 0.01％ 10mg
硫酸新霉素 Sigma 0.01％ 10mg
抗试剂Tris盐酸缓冲液：
试剂名称 生产商 浓度 1L缓冲液用量
Tris Sigma 0.1M 12.12mL
氯化钠 Sigma 0.9％ 5.82mL
绵羊血清 广州蕊特 10％ 100mL
新生牛血清 广州蕊特 10％ 100mL
磁微粒Tris盐酸缓冲液
试剂名称 生产商 浓度 1L缓冲液用量
Tris Sigma 0.1M 12.12mL
氯化钠 Sigma 0.9％ 5.82mL
甲基纤维醚 Sigma 5％ 50g
发光底物缓冲液
Figure BDA0003207003780000111
定标品、阴性对照品、阳性对照品的定性为
试剂名称 阴阳性
定标品 -
阴性对照品 阴
阳性对照品 阳
浓缩清洗液的配制，按以下配方配制。
试剂名称 生产商 浓度 1L缓冲液用量
Tris Sigma 0.1M 12.12mL
氯化钠 Sigma 0.9％ 5.82mL
Tween-20 Sigma 5％ 50mL
曲拉通-100 Sigma 5％ 50mL
上述定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂、发光底物、浓缩清洗浓缩液各试剂组分配制好后，独立地置于一个包装容器内，以组成本实施例的新型冠状病毒IgA检测试剂盒(磁微粒分离化学发光法)套组。
实施例3制备定标品、阴性对照品和阳性对照品
所述定标品、阴性对照品、阳性对照品是按照以下方法配制得到的：采用含蛋白的缓冲液溶解重组新冠状病毒IgA抗体，并用含新生牛血清的缓冲液稀释成不同浓度点，通过定标得到定标品、阴性对照品、阳性对照品。
实施例4制备抗试剂
试验组1：异硫氰酸荧光素与新冠状病毒S蛋白和N蛋白的偶联：异硫氰酸荧光素用0.1M抗试剂Tris缓冲液配制浓度为2.5mg/mL，使用分光光度计在495nm处读取吸光值，异硫氰酸荧光素的吸光值应该在0.9～1.1范围内。将需要连接的蛋白，按所需要的量转移到棕色玻璃瓶。计算所需要的异硫氰酸荧光素的体积，取上述异硫氰酸荧光素计算体积加入蛋白溶液中，室温下搅拌1.5小时，异硫氰酸荧光素与新冠状病毒S蛋白和N蛋白偶联物的纯化，使用pH＝9的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，pH＝8-9的碳酸氢盐缓冲液进行洗脱，分部收集洗脱液，紫外监测，记录仪记录纯化图谱。确认含有连接物的试管，注意、避光防护，将得到的异硫氰酸荧光素标记的新冠状病毒S蛋白和N蛋白按照一定比例加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中制得抗试剂；所述表面活性剂选自Tween 20在蛋白缓冲液中的浓度为0.01％。
试验组2：异硫氰酸荧光素与新冠状病毒S蛋白和N蛋白的偶联：异硫氰酸荧光素用缓冲液配制浓度为1.0mg/mL，使用分光光度计在495nm处读取吸光值，异硫氰酸荧光素的吸光值应该在一定的范围内。将需要连接的蛋白，按所需要的量转移到棕色玻璃瓶。计算所需要的异硫氰酸荧光素的体积，取上述异硫氰酸荧光素计算体积加入蛋白溶液中，室温下搅拌1小时，异硫氰酸荧光素与新冠状病毒S蛋白和N蛋白偶联物的纯化，使用pH＝8的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，pH＝8-9的碳酸氢盐缓冲液进行洗脱，分部收集洗脱液，紫外监测，记录仪记录纯化图谱。确认含有连接物的试管，注意、避光防护，将得到的异硫氰酸荧光素标记的新冠状病毒S蛋白和N蛋白按照一定比例加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中制得抗试剂；所述表面活性剂选自Bronidox在蛋白缓冲液中的浓度为0.5％。
试验组3：异硫氰酸荧光素与新冠状病毒S蛋白和N蛋白的偶联：异硫氰酸荧光素用缓冲液配制浓度为5.0mg/mL，使用分光光度计在495nm处读取吸光值，异硫氰酸荧光素的吸光值应该在一定的范围内。将需要连接的蛋白，按所需要的量转移到棕色玻璃瓶。计算所需要的异硫氰酸荧光素的体积，取上述异硫氰酸荧光素计算体积加入蛋白溶液中，室温下搅拌2小时，异硫氰酸荧光素与新冠状病毒S蛋白和N蛋白偶联物的纯化，使用pH＝8-9的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，pH＝8-9的碳酸氢盐缓冲液进行洗脱，分部收集洗脱液，紫外监测，记录仪记录纯化图谱。确认含有连接物的试管，注意、避光防护，将得到的异硫氰酸荧光素标记的新冠状病毒S蛋白和N蛋白按照一定比例加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中制得抗试剂；所述表面活性剂选自TritonX-100在蛋白缓冲液中的浓度为0.1％。
实施例5制备二抗试剂
试验组1:碱性磷酸酶与抗人IgA抗体的偶联：碱性磷酸酶用缓冲液配制浓度为1.0mg/mL，使用分光光度计在280nm处读取吸光值，碱性磷酸酶的吸光值应该在0.9～1.1范围内。将需要连接的抗体，按1:2摩尔比转移到棕色玻璃瓶。计算所需要的碱性磷酸酶的体积，取上述碱性磷酸酶计算体积加入抗体溶液中。室温下搅拌4小时。碱性磷酸酶与抗人IgA抗体偶联物的纯化，使用pH＝8的碳酸氢盐缓冲液进行平衡，pH＝8.5的碳酸氢盐缓冲液进行洗脱，分部收集洗脱液，紫外监测，记录仪记录纯化图谱。确认含有连接物的试管，注意、避光防护，将得到的碱性磷酸酶标记的抗人IgA标记抗体按照1：1加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中制得抗试剂；所述表面活性剂选自Tween20，浓度为0.01％。
试验组2：碱性磷酸酶与抗人IgA抗体的偶联：碱性磷酸酶用缓冲液配制浓度为5.0mg/mL，使用分光光度计在280nm处读取吸光值，碱性磷酸酶的吸光值应该在一定的范围内。将需要连接的抗体，按摩尔比1:10的比例转移到棕色玻璃瓶。计算所需要的碱性磷酸酶的体积，取上述碱性磷酸酶计算体积加入抗体溶液中。室温下搅拌5小时。碱性磷酸酶与抗人IgA抗体偶联物的纯化，使用pH＝9的碳酸氢盐缓冲液进行平衡。pH＝8.5的碳酸氢盐缓冲液进行洗脱，分部收集洗脱液，紫外监测，记录仪记录纯化图谱。确认含有连接物的试管，注意、避光防护，将得到的碱性磷酸酶标记的抗人IgA标记抗体按照一定比例加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中制得抗试剂；所述表面活性剂选自TritonX-100，浓度为0.5％。
试验组3：碱性磷酸酶与抗人IgA抗体的偶联：碱性磷酸酶用缓冲液配制浓度为2.5mg/mL，使用分光光度计在280nm处读取吸光值，碱性磷酸酶的吸光值应该在一定的范围内。将需要连接的抗体，按摩尔比1:5的比例转移到棕色玻璃瓶。计算所需要的碱性磷酸酶的体积，取上述碱性磷酸酶计算体积加入抗体溶液中。室温下搅拌4.5小时。碱性磷酸酶与抗人IgA抗体偶联物的纯化，使用pH＝8.5的碳酸氢盐缓冲液进行平衡。pH＝8.5的碳酸氢盐缓冲液进行洗脱，分部收集洗脱液，紫外监测，记录仪记录纯化图谱。确认含有连接物的试管，注意、避光防护，将得到的碱性磷酸酶标记的抗人IgA标记抗体按照一定比例加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中制得抗试剂；所述表面活性剂选自Bronidox，浓度为0.1
实施例6制备磁微粒试剂
试验组1：将磁珠浓缩液充分混匀。在充分混匀后取出相应体积的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中。将反应容器置于磁场15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清。加入羧基磁珠体积5倍的磷酸缓冲液，混匀20min。再置于磁场中待磁珠全部沉降15min后吸去上清。重复清洗步骤3遍充分清洗羧基磁珠。最后将羧基磁珠溶液定容到10mg/mL。持续混匀。连接反应：按照磁珠：抗体总量＝100:1的质量比，在磁珠中加入处理后的抗体，保持混匀状态下2℃反应18小时。使用磷酸缓冲液清洗3遍。定容至10mg/mL。2℃保存待用，制得磁微粒试剂。
试验组2：将磁珠浓缩液充分混匀。在充分混匀后取出相应体积的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中。将反应容器置于磁场15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清。加入羧基磁珠体积5倍的磷酸缓冲液，混匀30min。再置于磁场中待磁珠全部沉降15min后吸去上清。重复清洗步骤3遍充分清洗羧基磁珠。最后将羧基磁珠溶液定容到50mg/mL。持续混匀。连接反应：按照磁珠：抗体总量＝100:1的质量比，在磁珠中加入处理后的抗体，保持混匀状态下8℃反应18小时。使用磷酸缓冲液清洗3遍。定容至10mg/mL。8℃保存待用，制得磁微粒试剂。
试验组3：将磁珠浓缩液充分混匀。在充分混匀后取出相应体积的羧基磁珠浓缩液至反应瓶中。将反应容器置于磁场15min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清。加入羧基磁珠2体积5倍的磷酸缓冲液，混匀25min。再置于磁场中待磁珠全部沉降15min后吸去上清。重复清洗步骤3遍充分清洗羧基磁珠。最后将羧基磁珠溶液定容到25mg/mL。持续混匀。连接反应：按照磁珠：抗体总量＝100:1的质量比，在磁珠中加入处理后的抗体，保持混匀状态下4℃反应18小时。使用磷酸缓冲液清洗3遍。定容至10mg/mL。4℃保存待用，制得磁微粒试剂。
实施例7制备发光底物
试验组1按1:4的比例将ALPS发光底物稀释至含有下列组分的缓冲液中：Tris0.1M，亚硫酸钠0.1％，SDS 1％，光泽精0.3％，牛血清白蛋白0.15％，pH9.5。
试验组2按1:10的比例将ALPS发光底物稀释至含有下列组分的缓冲液中：Tris0.1-1M，亚硫酸钠0.1％，SDS 1％，光泽精0.3％，牛血清白蛋白0.15％，pH9.5。
试验组3按1:6的比例将ALPS发光底物稀释至含有下列组分的缓冲液中：Tris0.1-1M，亚硫酸钠0.1％，SDS 1％，光泽精0.3％，牛血清白蛋白0.15％，pH9.5。
实施例8制备检测试剂盒
分别取实施例1、实施例2-5试验组3制备得到的物质配制定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂、发光底物、清洗浓缩液；将定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂、清洗浓缩液、发光底物独立地置于包装容器内，得到新型冠状病毒IgA检测试剂盒(磁微粒分离化学发光法)。
实施例9检测
1)样本稀释：加15μL未知样本和135μL样本稀释液(含1％BSA的Tris缓冲液，pH8.0)至对应反应管底部混匀，取15μL上一步稀释好的样本和135μL样本稀释液至另一对应反应管底部混匀；
2)加样：分别加15μL新型冠状病毒IgA定标品、阴性对照品、阳性对照品、100倍稀释的未知样本至对应反应管底部；
3)温育反应：加30μL抗试剂至每一试管中，混匀，置37℃反应条件下，反应15分钟；
4)温育反应：加30μL磁微粒试剂至每一试管中，混匀，置37℃反应条件下，反应5分钟；
5)清洗：将反应管置于磁场进行静置，排出上清液；加300μL清洗浓缩液至每一反应管中，混匀；重复3次；
6)温育反应：加100μL二抗试剂至每一反应管中，混匀，置37℃反应条件下，反应15分钟；
7)清洗：将反应管置于磁场进行静置，排出上清液；加300μL清洗浓缩液至每一反应管中，混匀；重复3次；
8)加底物：加200μL发光底物溶液至每一试管中，混匀；
9)测值：用化学发光仪检测发光强度(RLU)。
化学发光测定仪检测反应的发光强度，与计算的Cutoff值相比较，确定样本中相应抗体存在与否。
需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种新冠状病毒COVID-19检测方法，其特征在于，通过标记的IgA检测新冠状病毒COVID-19。
2.一种新冠状病毒COVID-19检测方法，其特征在于，包括，以COVID-19的特异性蛋白作为检测化合物，使用磁微粒化学发光法，通过SA级放大对COVID-19标记的与带标记并与COVID-19结合的IgA进行检测。
3.如权利要求1所述的新冠状病毒COVID-19检测方法，其特征在于，标记的IgA还包括IgA1、IgA2。
4.一种新冠状病毒COVID-19检测试剂盒，其特征在于，包括：定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂、发光底物和清洗浓缩液；
其中，所述定标品、阴性对照品和阳性对照品包括：新型冠状病毒lgA抗体；所述抗试剂包括：异硫氰酸荧光素标记的新冠状病毒COVID-19的特异性蛋白；所述二抗试剂包括：碱性磷酸酶标记的抗人IgA标记抗体；所述磁微粒试剂包括：抗异硫氰酸荧光素抗体偶联磁微粒；所述发光底物包括：ALPS发光底物。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒COVID-19的lgA抗体通过0.1M的Tris缓冲液溶解，并稀释至新生牛血清的缓冲液中配制得到所述定标品、阳性对照品和阴性对照品。
6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述新生牛血清缓冲液包括以下体积比的组分：新生牛血清99.45-99.89％、四环素0.01％-0.05％和硫酸新霉素0.1-0.5％。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述异硫氰酸荧光素标记的新冠状病毒COVID-19的特异性蛋白、所述碱性磷酸酶标记的抗人IgA标记抗体分别与Tris盐酸缓冲液混合制得所述抗试剂和所述二抗试剂。
8.如权利要求4-7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
1)分别配制定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂、发光底物、和清洗浓缩液；
2)将定标品、阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、二抗试剂、磁微粒试剂、发光底物、清洗浓缩液独立地置于包装容器内，得到新型冠状病毒IgA检测试剂盒。
9.根据权利要求8所述的制备方法制备得到的新冠病毒检测试剂盒在检测新冠病毒中的应用。
10.一种新冠状病毒COVID-19检测方法，其特征在于，使用权利要求4-7所述的检测试剂盒进行新冠状病毒COVID-19检测。
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