JPS59501774A - 非ａ型、非ｂ型肝炎ウイルス、同定方法、精製、特徴付け、診断及び免疫化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

発明の名称　非ム型、非Ｂ型肝炎ウィルス、同定方法、精製、特徴付け１診断及 び免疫化 技術分野 本発明の一部は久の資金源、即ちアメリカ合衆国政府ＡＧ−０４１４５、ＡＡ− ０２６６６、ＡＭ−１，７７０２゜ＡＭ　１７６０９．ＣＡ−３２６０５，ＡＭ −０７２１８，１−ＫＯ２−ＡＡ−０００４８から得られた基金を用いて開発さ れたものである。 本発明は非Ａ型、非Ｂ型肝炎ウィルスの同定、単離。 特徴付け、精製及び用途並びにそれの診断方法及びワクチン方法な叡扱うもので ある。 背景技術 非Ａ型、非Ｂ型肝炎の名前は％ＢＢ型肝炎ＨＢＶ）或いはム型肝炎（ＨＡＹ）に 伴う如何なる公知の或−は血清学的に固定可能なウィルスによる感染の不存在下 において生ずるヒトにおける急性及び慢性のウィルス肝炎の症例に対して与えら れるものである。非ム型、非Ｂ型肝炎（以下に「ＮＡＮＢＪと称する〕の特性は 次の（Ｄｉｅｎｓｔａｇ　ｅｔ　ａｌ、）Ｉｌｃよるハリソｙ（Ｈａｒ−ｒｉｓ ｏｎ　）の「内科医学原理」３０２章（＠Ｐｒ１ｎｃ−ｉｐＩｅｓ　ｏｆ　Ｉｎ ｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ’、第９版。 ＭｃＧｒａｗ−ＨｉｌｌＢｏｏｋ　Ｃｏ−＊ｔｓｓｏｔｐｐ−１４５９−１４６ ７）、及びＷ、Ｓ−ロビンソン（Ｗ、　Ｓ　。 Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）による「非Ａ型、非Ｂ型肝炎の謎」（＠Ｔｈｅ　Ｅｎｉｇｍ ａ　ｏｆ　Ｎｏｎ−ム、Ｎｏｎ−Ｂ　Ｈｅｐ−ａｔｉｔｉｓ’、Ｔｈｅ　Ｊｏｕ ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉａｆｅｃｔ−Ｄｉｓ−、Ｖｏｌ−１４５Ｎｏ−３，ｐ９−３ ８７−３９５（１９８２））。これらの二つの文献は、本発明にお−て準用し、 以下のコメントはこれらから抜粋されたものである。 Ａ型及びＢ型肝炎の両者を同定するための血清学的感応試験は、感染病と首尾一 貫したインキュベーション期間及び伝染様式をもって肝炎の症例の同定に導因た が、しかし、Ａ型及びＢ型肝炎感染の血清学的証拠のないものであった。 この病気のチンパンジー類への伝染は、多くの症例が１以上の感染性物質により 引き起こされたものであることを明確に確立した。過去数年間において全世界中 において多くの室験室Ｖｃ′ＭＶｈてこれらの感染病に対する原因となる物質の 同定及び＋Ｆ？徴付けを行うための鋭意な努力がなされている。 ＮＡＮＢ肝炎の臨床的診断は、公知の肝炎ウィルス類及びその他の肝炎を引き起 こす公知の因子による感染を除外することにより行われている。この感染病は、 輸血或いは非経口的薬物悪用後、ヒト対ヒトの接触及びＨＢＶ感染にも伴うその 他の状況において高い頻度で生じている。風土病的及び見かげ上流行病的病気も 又明白な非経口的伝染を伴うことなく観察されている。 これらの今日迄の進歩及び鋭意な努力にも拘らず。 ＮＡＮＢ肝長の如何なる病因学的物質も抗原的超構造的或いは分子的物体として 一義的に同定されていない。 この結果は、ＮＡＮＢ肝長を有する患者の血清におけるウィルス抗原の濃度がＢ 型肝炎を有する患者’ＩＣＭげるＨＢＶ抗原のそれよりもはるかに低いものであ ること、或いはそのウィルス、その缶口質或いはその遺伝物質を同定するための 適当な試薬或いは方法は従来説明されていなかったことを示唆するものである。 この分野における今日までの最も重要な実験的進歩は、ＮＡＮＢ肝炎感染因子の チンパンジー類への伝染である。これは、病気の動物モデルにおけるＮＡＮＢ肝 炎に伴う伝染可能因子の直接の証明を与えるものである［Ａｌｔｅｒ、Ｉ’１Ｊ −ｅｔ　ａｌ、Ｌａｎｃｅｔｌ：４５９−４６３（１９７８）、Ｔａｂｏｒ、ｇ −ｅｔ　ａｌ、１ｂｉｄ　１：４６３−４６６（１９７８）、Ｈｏｌｌｉｎｇｅ ｒ、Ｆ−Ｂ、ｅｔａｌ、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　１０：６Ｏ−６８（１９ ７８）、又はＢｒａｄｌｅｙ　Ｄ、Ｗ、ｅｔ　ａｌ、Ｊ−Ｍｅｄ−Ｖｉｒｏｌ− ３：２５３−２６９（１９７９）３照。これらは全て本発明において準用てる〕 。 ＮＡＮ　Ｂ肝炎が災騙動物に伝染されたという事実にも拘らず、如何なるウィル スｉｖｈはその他の感染性因子も不発明の前ｖｃ確笑性をもって物質的ｖｃ同定 されてはいない。ＮＡＮＢ肝炎を有する患者及びチノパンツ−の血清における明 らかに独特の抗原／抗体系の検出が報告されて−るが、それらの結果はｉｉ認す ることが困難であり、これらの試験の如何なるものもＮＡＮＢ感染因子（作用因 子）を含有することが知られた血清を明確に同定したものではない（例えば、ｖ ｉｔマ１−１ｓｋｉ、Ｌ−ｅｔ　ａｌ、Ｌａｎａｔ　２２：１２６３−１２６７ （１９７９）、Ｋａｂｊｒｉ、Ｍ−ｅｔ　ａｌ、Ｌａａ（６ｔ　２：２２１−２ ２４（１９７９）、Ｔａｂｏｒ　Ｅ、、Ｊ、Ｍｅｄ。 Ｖｉｒｏｌ、４：１６１−１６９（１９７９）及びＣｈｉｒｃｕ。 Ｌ、Ｖ、ｅｔ　ａｌ、Ｊ−Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、６：１４７−１５１（１９８０ ）参照】。抗ぷに加えて、ＮＡＮＢ肝炎に感染されたヒト及びチンパンジーの血 清及び肝臓に電子顕微鏡によりウィルス様粒状鶴造が観察されて−る（例えば、 １ｌｒａｄｌｅｙ、Ｄ、Ｗ、、Ｊ−Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ−３：２５３−２６９（ １９７９）及びＢｒａｄｌｅｙ、Ｄ、Ｗ−ｅｔａｌ、Ｊ−Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、 ６：８５−２０１（１９８Ｇ）参照）。 これらの研究の全ての評価は上記ａビンソン（ｇｏ−ｂｉｏｓｏｎ、Ｊ、Ｉｔｌ ｆ−Ｄｉｉ、Ｖｏｌ、１４５（１９８２））によりにのよう和なされている＝［ これらの粒子に関するより決定的な証拠がなくして且つ数多くの研究者がこれら の発見な［Ｍすることが出来な−でいるので。 現時点＃ｃＳ−てＨＢＶ様ウィルスが実際にＮムＮＢ肝炎の原因であると結論付 けることはできな杭」。 上記全ての点（鑑みて、現在ＮＡＮＢ肝炎の原因である病因学的因子な同定し、 単離し、及び特徴付ける大きな必要性が存在することは極めて明日である。又。 この病気の迅速且つ正確な診断を助けるそのための正確且つ明確な同定及び検出 技術に対する需要も又存在する。 発明の開示 従って、本発明の目的は、ＮＡＮＢ肝炎の病因学的因子の正確且つ特異的な特徴 付けを提供することである。 本発明のもう一つの目的は、試料中におけるＮＡＮＢ肝炎の病因学的因子の同定 及び検出方法を提供することである。 更に、本発明の別の目的は、−物におけるＮＡＮＢ肝炎の診断方法を提供するこ とである。 更に又、本発明の別の目的は、ＮＡＮＢ肝炎に対するワクチン及びその様なワク チンを使用することよりなる免疫化方法を提供することである。 更に又、本発明の別の目的は、ＮＡＮＢ肝炎ウィルスの精製方法を提供すること である。 これら及び以下により容易に明らかとなる本発明のその他の目的は久のものを提 供することにより達成された： 未弱毒化或−は活性化形＠ＷＣお−て、下記の特性を有することを特徴とする弱 毒化成Ｖ’ｈは不活化影響のＤＮＡ６イルス： １）２Ｘ１０’／ルトンより大きい分子量；２）市販の抗ＨＢｓＡｇ　ＩｇＭ％ ／クローナル抗体５　Ｄ３　（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ（ＵＳム）より販売されている ラジオイムノアッセイテストキットから得られたもの。 下記参照）に対する実質的な免役反応性：３３ｉＨｉ１系統ＡＴＣＣＣＲＬ　８ ０１ｇから得られた抗−ｉｉＢｓＡｇモノクａ−ナル抗体に対する実質的な無免 疫反応性： ４）該ＤＮムウイルスの濃度増大と共に増大するポリクローナルＩｇＧ抗−ＨＢ ８Ａｇ抗体に対するａ度依存性結合能力； ５）５Ｄ３　ＩｇＭ抗体の存在下におりｈＹ、、　、免役電子顕畝鏡により観察 された際の個々の粒状形態：６）細胞系統ムＴＣＣＨＢ　８０５ｇより＃られた ＩｇＭ抗体でアフイニテイＭＩＸ、した場合に、約ｓｏ、ｏｏｏ、約２３，００ ０及び約２０．０００未満の分子量におけるＡンドよりなる、ドブクル硫酸ナト リウムポリアクリルアミドゲル上におけるポリペプチドブａフィルニ ア）該ウィルスのＤＮＡが、Ｂ型肝炎つィルＸＤＮムと部分的相同を示すこと； 及び ８）該ＤＮＡウィルスが、チンパンジーにおいて非Ａ型、非Ｂ型肝炎の特性を有 する感染性を示すこと。 本発明のもう一つの目的は、動物の試料円において非Ａ型、非Ｂ型肝炎ウィルス の存在を検出する方法にお−て、Ａ）該試料中に該ウィルスの存在なＳ認し。 及びＢ）ＭウィルスをＢ全肝炎ウィルスから区別する、ことを特徴とする方法を 提供することにより達成゛された。 本発明のもう一つの目的は、イムノアフィニティークロマドグラフィにより動物 試料からのＮＡＮＢウィルスを精製する方法に＄ｆｖｈて、免疫吸着剤抗体が該 ＮムＮＢウィルスに対して実質的に免疫反応性を有するモノクローナル抗体であ ることを待機とする方法を提供することにより達成された。 本発明は又、生きた、弱毒化された或いは不活化された形態のＮＡＮＢウィルス を利用するワクチン及びワクチン化方法を提供するものである。 −面の簡単な説明 本発明は以下の図面を参照して行われる説明により良く埋屏な得ることができる が、これらの図面は下記に説明されるものである： 第１図は、モノクローナル５Ｄ３−ＩｇＭ抗−ＨＢｓアフィニティーカラムをグ リクン−Ｈｃｌ　緩衝Ｈ（ｐＨ２，６）で溶出後のヒト血清から単離された結合 活性の代表例である。記号は矢の通りである：（・）　モノクａ−ナル５Ｄ３− ５Ｄ３ラジオイムノアツセイ（ＲＩＡ）による溶出液中での結合されたＣＰＭ　 ： （ム）アフィニティーカラムを通過し、Ｐｉ／ＮａＣ１で溶離された分画血清上 のモノクローナルアッセイにふける結合されたＣＰＭ； （０）　市販のラジオイムノアッセイキットによす分析された際のグリクン−１ （Ｃ１ｉ出液の蒔合ゾロフイＡ／（ポリクローナル抗体、ＡＵ３ＲＩＡ　ＩＩ） 、例Ｉ参照。 第２図警′ｉ％３人の患者から得られたヒト血清において５回のモノクローナル ＲＩＡにより示された結合プロフィルを示す。全てのモノクローナルｎ　Ｉ　ｈ 抗体は血清の逐欠擢釈液と反応性を有し、その様なＩｇＧ及びＩｇＭモノクロー ナル抗−ＨＢａがＨＢｓＡｇ上に存在する決定子を認識することを示している（ 患者Ｄ）（右図）。対照的に、５Ｄ３−５Ｄ３モノクローナルアツセイは、患者 Ｂ及びＣかもの血清の逐次稀釈におＶｌて高い結合値を示している（左図］。こ れらのモノクローナル杭内の説明及び特徴付けは後述する。 第３図は、患者の血清（−１１）からのアフィニティー精製物質のドブクル硫酸 ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル上のポリペプチドゾロフィルを示す：患者 人、急性肝炎：患者Ｂ、慢性活動性肝灸；患者Ｃ１血ｇ！ｉ供与者：及び患者り 、ＨＢｓＡｇ−陽性慢性急性肝炎。 ４つの全ての標本中において３個の同様な、ｊｆ　１７ペプチドが存在する（１ ，２及び３と印す）６ポリペプチド１＋１５０，００００Ｍ「を可し、ポリペプ チド２及び３は２２．０００〜２３，０００のＭｒを有する。試料り中にはＭｒ ２７．０００〜３０，０００のポリペプチドがある。 しかしながら、試料Ａ、Ｂ及びｃＶｃｓいては、試料りには見られない３個の付 加的な主たる蛋白質バンドが存在する。１つはほぼ８０．０００（５Ｄ３・重鎖 と対比して）のＭｒを有し、他の２つのもののうち第１のものは２３．０００よ りや〜大きなＭｒを有し、第２＠目のものは２０，０００未満のＭ「を有丁。５ Ｄ３抗本の１頻及び軽鎖は患者Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤからの他の如１ｐ１なる蛋白質 とも共移吻しない。 第４図は、モノクローナル抗−ＨＢｓ抗体にょるＨＢｓＡｇ決定子への結合の比 較的抑制を示て。ＩｇＧ抗−ＨＢｓ抗Ｂ２Ｃ６及び５Ｃ３は、ＨＢｓＡｇ−関連 決定子に対てる５Ｄ３の結合に対して伺等の影響を有さないのに対し、ＩｇＭ抗 −ＨＢａである３Ｄ４は５Ｄ３箱合を部分的に阻害した。 第５図は、急性肝炎Ｂ及び免役複合病を有する患者におけるＩｇＭモノクローナ ルＲＩＡ（Ｊ）とポリクローナル抗ＫＡＵＳＲＩＡ　ｎ（ム）の比紋を示す。・ １１＠Ｏｓ・・は５ＧＯＴ（血清アラニンアミノトランスフェラーゼ）。 Ｓ／Ｎは実験試料中における結合されたＣＰＭ／対照例対照例会されたＣＰＭと して定義される信号対ノイズ比（例３参照）である。 第６図は、チンパンジーにおける非Ａ型、非Ｂ型肝炎の臨床及びウィルス学的経 過を示すものである。ＡＬＴの上昇が血液内における抗原及びＨＢＶ関連ＤＮＡ 配列の出現に先立って辰われる（この図及び７〜１０図については例４を挙照ン ； 第７図は、非Ａ型、非Ｂ型肝炎を胃する二匹のチンノぞンジーからの２５０μを 血清における分子ハイブリッド形成分析によるＢ型肝灸ウィルス−ＤＮＡ関連配 列の検出を示す。′は組換えクローン化ＨＢＶ−ＤＮＡプローブを用いた陽性の 結果な示す。スポラ）１．２及び３はＨＢＶ−ＤＮＡＫ対して＋’ｚＢ性であツ タが、ＩｇＭ抗−ＨＢｓラジオイムノアッセイによる抗原に対しては陽性であっ た（第９図及び第１０図参照）。スポット４．５及び６は、４７日目、５８日目 及び６４日月において血清中の抗原及びＨＢＶ−ＤＮＡ関連配列の両者に対して 陽性であった（第６図〕。スポット８及び９は又第２の動＄において１９０９０ 日月２０４０４日月いて抗原及びＩ（ＢＹ−関連配列に対して陽性であった（第 ８図〕。スポット７及び１０は陰性の対照列である。 第８図は、チンパンジーにおける非Ａ型、非Ｂ型肝炎の臨床同ウィルス学的経過 を示１゜感染にも拘らず、血清中におけるウィルス抗原及びＨＩ３ｖ−ＤＮＡ関 連配列の存在により示される如＜ＡＬＴ値は正常に留まった。 第９図はチンパンジーにおける非Ａ型、非Ｂ型肝炎の臨床的及びウィルス学的経 過を示す。第６図と同様に、ＡＬＴの上昇が、モノクローナルＩｇＭ抗−ＨＢｓ ラジオイムノアッセイにより検出される抗原の出現にほぼ４５日前に先立って表 われる。ＨＢＶ−ＤＮＡ関連配列はこのｖＪ？１ＪＶｃは検出されなかった。 第１０区は、チンパンジーにおける非Ａ型、非Ｂ型肝炎の臨床的及びウィルス学 的経過な示す。モノクローナルＩｇＭ抗−ＨＢｓラソオイムノアッセイにより測 定された３１固の明確な抗原血症（ａｎｔｉｇｅａｅｍｉａ）のピークの出現に 注意丁べきである。 発明を実施するための最良の嘘様 本発明は、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の原因因子の同定及び′特徴付けのための高度に 特異的且つ正確な試、験の発見に基づいてＶ）る。本発明者等は、ＮＡＮＢ肝炎 ウィルスを特徴付け、これをＡ型肝炎ウィルス（ＨＶＡ）ＡｔびＢ型肝灸ウィル ス（ＨＶＢ）と区別するために各種分析技術を利用した。これらの技術１ｃは物 理的−化学的特性、免役学的特性、遺伝的％機付は及び感染性特徴付けなどがよ まれる。 ＮＡＮＢ肝炎ウィルスの発見は、肝炎の臨床的鑓候は有するが、多価Ｉ　ｇ　Ｇ 抗体を用いた従来のイムノアッセイ技術の如何なるものによっても血清学的同定 の行われなかったヒトの血液内におＶ）でその存在を検出することにより行われ た。次いで、ＮＡＮＢウィルスを容易に特徴付は及び検出し、これをＢ型肝炎ウ ィルスから区別することのできる各種異ったモノクローナル抗体に対して鳴性或 Ｖｈは陰性の結合を示すことによる一連のモノクローナル抗体スクリーニング試 験を行った。 以下の説明において、−！ニックローナル及び多価抗体について数多くのものが 用いられる。これらの抗体の性質、起源及び種類を以下に示す： １）５Ｄ３：これはセント：Ｉ−＃　（Ｃｅ　ｎ　ｔ　ｃ　ｏ　ｒ　−２４４Ｇ ｒｅａｔ　Ｖａｌｌｅｙ　Ｐａｒｋｗａｙ、Ｍａｌｖｅｒ−（１，ＰＡ　ＵＳＡ 　１９３５５）Ｉｃより販売されているＨＢＳＡｇ検出用［ＲＩＡテストキット （ＵＳ　１ｉｃＮｏ＋８８９）Ｊに存在てるポリスチレンビーズ話合ＩｇＭ抗体 として市販されている、ＨＢＳＡｇに対するモノクローナルＩｇＭ杭内を表わ丁 。この抗体については米Ｌｉ１％計第４．２７１．１４５号明４４（Ｗａｎｄｓ 等］並びにウオンズ等（Ｗａｎｄｓ　ｅｔ　ａｌ、）のｐｒｏｃ−１１（ａｔ、 ムｃａｄ−３ｃｉ、、ＵＳＡ　Ｖｏｌ−７８：１２１４−１２１８．１９８１年 ２月を参考文献として挙げる。これらの両文献は本発明において準用する。 ２）３Ｄ４：これはＡＴＣＣＫ寄託蕾号ＨＢ−８１７０で寄託されている細胞系 統３Ｄ４から得られたＨＢＳＡｇに対して特異性を有する（即ち抗−ＨＢＳＡｇ ）モノクローナルＩｇＭ抗体を表わ丁。 で寄託されている細胞系統ＩＦ８より得られたモノク１：Ｉ−ナルＩｇＭ抗−Ｈ ＢｓＡｇ杭内を表ゎ丁。この抗体は前記ワンス等の米国特許第４．２７１．１４ ５号明細書及びワンス等のＰＮＡＳ　Ｖｏｌ−７８，１９８１年２月の論文に説 明されている。 ４）５Ｃ１１：、：れはＡＴＣＣＫ寄託番号ＨＢ−８１７１で寄託されている細 胞系統５Ｃ１１かも得られたモノクローナルＩｇＧ１抗−ＨＢ５Ａｇ抗内を表ゎ 丁。 ５）ＡＵＳＲＩＡ　Ｉｆ二これＧエボリクローナルＩｇＧ杭内を含有する市販さ れているＨＢｓＡｇ試験キット（４ｂｂｏｔｔ）からの抗体を表ゎ丁。 これら及びその他の抗体は又、次のＰＣＴ特計小計出願載されている：出願番号 ＰＣＴ／ＵＳ　８１１０１２７０゜１９８０年９月１９日出＃（Ｗａｎｄｓ、Ｚ ｕｒａｗｓｋｉ及びＳｃｈｏｅｍａｋｅｒ　［モノクローナル高アフィニティー ＩｇＭ杭内を用いたイムノアッセイ（Ｉｍｍｕ　ｎ　ｏ　ａ　−５ｓａｙ　Ｕｔ ｉｌｉｚｉｎｇ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＨｉｇｈＡｆｆｉｎｉｔｙ　ＩｇＭ　 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）Ｊ　１９８２年４月１日公−（番号Ｗ０　８２１０１０ ７２）。 又、ＨＢＶ−ＤＮＡ配列による組換えプラスミドをき有する細菌培養液ｐＡＯＩ 　ＨＢＶもＡＴＣＣ番号３１８７３で寄託されて−る。 ＮＡＮＢウィルスは、ＮＡＮＢ肝炎に感染しているヒトソの他のａ物宿主、例え ばチンパンジー、マーモセット、及びその他のＮＡＮＯウィルスに適当な宿主の いずれかからも単離することができる。ＮＡＮＢウィルスの存在は、従来技術に おいては同定可能な肝炎ウィルス（ＨＡＹ、ＨＢＶｌＥｐｓｔｅｉａ−Ｂａｒｒ ウィルス、すイトメガロウイルス、その他）及びその他の病因因子（例、胛前性 薬品及び化学物質］を排除することにより複雑なものとなっていた。上記の他の ウィルスを排除すること罠より宿主中におけるＮＡＮＢ感染因子の存在を示唆す ることは尚可能であるが、それを確立することはできない。しかしながら、本発 明による高度に特異的なＮＡＮＢウィルスの試験法の出現により、これらを下記 の如く利用するのが好ましい。 好ましくは、抗原組成物の省製及び引き続く特徴付けのためにモノクローナル５ Ｄ３ＩｇＭ抗−ＨＢ８を用いるアフィニティークロマトグラフィーを利用するこ とができる。過当な材料は、５Ｄ３を５ｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ■にカップリング させることにより得られる。適当な宿主からの血清を固相支持体上のモノクロー ナル抗体と接触させて置き、この材料を室温において数時間インキエペートさせ る。これらの支持体を欠いで十分に適当な生理学的緩衝液（例、ＰＢＳ−リン酸 緩衝塩水）を用いて生理学的９Ｈにおいて洗浄する。次いでカラム画分を酸性緩 衝液（例ｐＨ２−３）を用いて採集することができる。各画分のｐＨを生理学的 ｐＨに調整し、結合活性を適当な抗体な用いて決定する。次いで最も高い結合活 性を示すピーク画分を集めてＮＡ５ ＮＢウィルスを果めることができる。ウィルスは又。 任意の細胞＠養液（例、該ウィルス酸いはウィルスＤＮＡでＷ＆染されｒＳＩｆ ｄＩ園、酵母及びその他の真核細胞）或いはこれを産生する発＃液の上澄液から 単離丁番ごともできる。 Ｎ　Ａ　Ｎ　Ｂウィルスは少なくとも４つの異った特性により特徴付は及び同定 を行うことが出光、それらの各々を以下に示す。 物理的−化学的１！ＩＬＮＡＮＢウイルス粒子ハ。 ５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ■クロマドグ之フイーによる決定によりほぼ２ＸｌＯ ’の分子量を有する。このウィルスは免役電子顕徴税により明確な粒子の外観？ ：Ｖｉする。 このウィルスを上記５Ｄ３−　ＩｇＭアフィニティークロマトグラフィーにより 血清から単点すると突出した針状粒子が２２０．０００ＸＩＣ観察され、それら の表面上の５Ｄ３抗−Ｈａｓの存在を示唆する。アフィニティー精製物質をドブ ノル硫酸す）　ＩＪウム／１０％ポリアクリルアミドゲルＶＣ適用し、ＨＢｓＡ ｇウィルスと対比すると、全ての標本において約ｓｏ、ｏｏｏの分子量及び２２ ．０００〜２３，０００の分子量において同様なポリペプチドが存在てることが 見られる。しかしながら。 更に、ＮＡＮＢウィルスは、ＨＢＳＡｇ［は見られない三つの付加的な主たる缶 口質バンドを示し、一つははｍｓｏ、ｏｏｏのＭｒを有し、その他の二つのうち ｉｌのものは２３．０００より僅かに大きい分子量を有し、第２のものは２０， ０００未満の分子量を有てる（第３図参照）。 免役学的特性　ＮＡＮＢウィルスは、ＩＪ　ｍ　すＨＢ　ｓＡｇ−プｄエピトー プに対して特異性、即ち免疫反応性、ヲ有てるある呼のモノクローナル抗体と反 応するが、他のその廊な抗−ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体とは反応しない。し １１えは、ＮＡＮＢは全てのか匣において抗体５Ｄ３と或いは抗体３Ｄ４（これ らの両者は共にモノクローナルＩｇＭ抗−ＨＢｓＡｇ仇本であるンと父差反応す る。使方、ＮＡＮＢシエ抗体ＩＦ８（又、ＨＢｓＡｇに対して特異性を有てるモ ノクローナルＩｇＭである）とは、或いはモノクローナル５Ｃ１１（ＩｇＧ１抗 体）とは又差反嘔しない。これは、ＮＡＮＯウィルスをこｒらのモノクローナル 抗体と反応するＢ型肝炎ウィルスと明確に区別するのに役立つ。ＮＡＮＢの’ｋ 　ｉ面抗−ＨＢｓ抗体（市販されているＡＵＳＲＩＡ　ＩＩ）との免疫反応性は 濃度依存性である。約１ｎｇ〜ｌｏ００ｇの讃Ｉｆにおいて多価ＩｇＧ抗体はＮ ＡＮＢウイルスン恢出或いｔ工錆合しない。ＮＡＮＢをこれらよりも約１００倍 以上にｄ帰すると、多価ＩｇＧによる結合及び侵出が観祭される。しかしながら 、場合によって多価尻−Ｈａｓ抗Ｋ　６−１アフイニテイークロマトグラフイー による冨イヒ後においても、上記の如＜ｉｏｏ＠夢酪の後にもＮＡＮＢ肝炎血漬 を検出せず、或いはく合しない。 これらの高イ靜度におけるＮＡＮＢの５Ｄ３抗−Ｈａｓによろ前インキュベーシ ョンは１通常の多価抗−ＨＢｓによる７辺合を阻害てる。 遺伝旧時性 ＮＡＮＢウィルス（ｒ）　Ｄ　Ｎ　Ａ配列は部分的ＫＨＢＶ−ＤＮＡに相同して いるが、しかし、同一ではない。従って、それはｌｉ裂ＨＢＶ−ＤＮＡプローブ とのハイブリッド形成により検出することが可能である。下記参照。 感染的特性　上記物坤釣−化学的、形留学的、免疫学的及び遺伝的′寺性を有す るＮＡＮＢウィルス）工、感染性を百する。ウィルス肝灸の感染性の研究はチン ノンジー及びヒトにおいて陽性である。この感染の特注は、通常ＨＢ　Ｖ　ＦＪ ｉいはＨＡＹに対して見られるものとは異ってＶする。感染性物質の接種から血 液中のウィルス或いはウィルス蛋白質の出現までと定義されるインキュペーノヨ ン期間は従来認識されているものより長い。アラニンアミノトランスフェラーゼ （ＡＬＴ）上昇が抗原血症の出現に先立ち数週間前に表われる。抗原血症はＡＬ Ｔ上昇の不存在下においても起こり得、これはヒトにおＶ）て見られる現象であ る。慢性のウィルスキャリヤー状態がヒト及びテンＡンジーにおいて生じ得る。 抗原血症及び／又はウィルス血症の期間は数週間乃至数ヶ月絖くようであり１通 常回仮と共に消滅する。抗原血症は、ＡＬＴ水準が正常である場合、病気の消散 期においてなお検出可能であり、これはヒトにおけるＨＢＶｇ染と同様である。 感染の途中において抗原血症の幾つかの徴候が生じ得る。予め存在する抗−ＨＢ ｓは動物において保護的ではなく、ＮＡＮＢウィルスは抗原組成においてＨＢＶ とは十分に異ること？確認した（第６図及び第８〜１０図参照）。 勿論、上記特性は単に一つの可能性としての組合せであるにてぎな一〇明らかに 、これらの特性のより多くが研究され、発見されるにつれてこのウィルスヲ９’ ｌＪえはＢ型肝炎とは全く又差反応しなｌＡ１以上のものを含む追加的モノクロ ーナル抗体或いはＤＮＡプローブにより符漱付げることが可能となる。この司ｎ ｔ注は。 しかしながら、ウィルス白木に関する限りにおいて如何なる追加の或いは新規な 同定試験の如何に拘らずウィルスそれ自身は含む本願にＲいては十分に意図され ているものである。 このＮＡＮＢウィルスの特性を使用して動物試料例えば血液−ｌ峙に破輸血血液 −１血清、尿、乳１組織試料、糞便、などにおいてＮＡＮＢウィルスの存在を検 出するための高感度及び高渭度の試験を開発てることが司Ｈしである。特に有用 であるのは、動物血清、特にヒト血清及びヒト血液から得られた生成物、例えば 赤血球、皿漿、血小板′Ｕ！ｋａ″ａ、凝固因子虐縮物などニオケるＮＡＮＢ肝 炎の診断のためのＮＡＮＢウィルスの検出である。又、ＮＡＮＢ肝炎感染の受血 者への伝染の可能性を検肴てるための血液供給者からの血液試料中のＮＡＮＢの 検出が’１ｅｊＫ有用である。 哨製されたＮＡＮＢウィルスの利用可能性はイムノアッセイ方法の一発を可能に てる。現在当分野に利用可能である複数のイムノアッセイ方法の如何なるものに おいても燗白な抗体を使用てることができる。（例えば、Ｔ−Ｃｈａｒｄ　”Ａ ｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔ。 Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅ’ｄ　’ｆｅ−ｃｈ ｎｉｑｕｅｓ″、Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ　１９７８、或いはＳｃｌ＋ｕｕ ｒｓ、Ａ−Ｈ−Ｗ−Ｍ−ｅｔ　ａｌ、＠ｇｎｚｙｍｅＩｎｍｕｎｏａｓｓａｙ” 、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ−Ａｃｔａ　１３１：１−４０　（１９７７）、参照。こ れらの両文献は本発明において進用てろ。）　ｌ＋！Ｉえば、試料中におけるウ ィルスの存在は、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、或いはラテック ス波果イムノアッセイにより検出することができる。利用される技術は、競合反 応、「プンドイツテ」（前進、後退或いを工同時）、二重抗体、或いはｔ４素カ スケードなどがあり、これらは全て当業者には公知である。ある技術については 、公知の方法ニヨリ、検出可能に標識化したＮＡＮＢウィルス、例えば放射線ラ ペｙ（Ｉ　１２５．Ｃ１４，Ｈ３，Ｐ””ｆｘと）。 酵素（アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼなど〕、螢光プローブなどで 標１鎗化したＮＡＮＢを調製することが有用である。抗体は、溶液であっても或 いは例えば管の内部、重合体或いはガラスピーズ上、プラスチック片上などに固 定化してもよ＾。 検出は又、検出可能ＶＣ標、Ｖｌ化されたプローブを用いるハイブリッド形成分 析によって行うこともできる。 ある特別のウィルスの遺伝清報ｉＥＬ／’はコード（暗号）はりポヌクレオチド （ａＮＡ＞ｆｆいはデオキクリポヌクレオチド（ＤＮＡ）の重合体より構成され る核酸を含む。 互に＠補的であるヌクレオチド分子は、溶液中において「水素−結合」により相 互作用して安定な塩基対を形成でることが知られている。即ち、アデニンはチミ ジンを認識し、グアニンはシトシンを認識する。二本の一本鎖の相補的ＤＮＡ分 子が、相補的ヌクレオチドが互に認識し得る条件下にふいて溶液中に存在すると 、これらの分子は相互作用して安定な二本＠構造を形成する。この二本鎖は一本 ＠　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｔ：ｊ、完全に劣化させるある種のヌクレアーゼによる攻撃に 対して耐性を有する。従って、大きな精度なもって二本鎖形成の程度を確認する ことが可能である。溶液中で反応するポリヌクレオチド類における塩基配列のこ の相互作用は「再アニーリング」或いは「分子ハイブリッド形成」と称され、偽 の相互作用が起こらない特異的且つ惑受注条件下に行うことができる。 実質的に安定且つ認識可能なハイブリッドを形成するためには、はぼ５０〜１０ ０のヌクレオチドの最少の相補的配列長さ或いはよりしばしば１００　Ｎ２００ 個のヌクレオチドが必要とされる。その様なハイブリッドを形成する能力は、ハ イブリッド形成反応の笑験条件（イオン強度、極性、ｐＨ及び）−イブリッド形 成溶液の温度）、相補的核酸分子及びインキュベーションの時間の長さに依存す るように思われる。反応におけるもう一つの変数は、試験試料中のＤＮＡの物理 状叩。 即ちそれが溶液状轢にあるか或いはニトロセルロース濾紙などの固体支持体マト リックスに固定されているかどうかである。後者の場合において、検出クローブ と固体支持本表面に固定されているＤＮＡの試験試料間のハイブリッド形成の速 度は、はぼ３０％遅くなる。 しかしながら、後者の方法′Ｌ工、ハイブリッド配列の検出に対して、当業者に より容易に得られるμｇＤＮＡ当り２〜４Ｘ１０８）％異活性の〔３２ｐ〕放射 性標識ＤＮＡプローブな用いて極めて感度が高く、０−０−１ｐ１３ （１０ｇｍ）の特異的ＤＮＡ配列未満をき有するニトロセルロース７１ルター上 の２〜５ｍｍ直径の円形スポットを検出することができる。 上記各種要因に応じて、ハイブリッド形成反応は。 完全な鋭いは完全に近い相補的ＤＮＡ配列における対応が必要とされる極めて厳 格な条件下にお＾て、或いは部分的な対応が必要とされるより厳格でた一条件下 に行うことができる。ハイブリッド形成の厳格性に対する条件が連相されるにつ れて、増々小さな配列相同の俵酸分子がハイブリッドを形成するようになる。こ れは勿論反応の特異性を減少し、誤った陽性の結果の機会を上昇させる。従って 、好ましい実施態様におムては、高度に厳格なハイブリッド形成条件が使用され 、その結果ＨＢＶ−ＤＮＡと共通したＥＶａは殆んど同一のほぼ１００〜２００ 以上のヌクレオチドの配列領域の分子ノみがニトロセルロースフィルター上に安 定且つ検出可能なハイブリッドを形成てる。これは、ハイブリッド形成法を用い て、ＮＡＮＢ−ＤＮＡに密接に関連し、はぼ同−或いは同一のＤＮＡ分子或いは 遺伝情報を含む任意の細胞１組織１組織抽出物、血清、血漿１体液。 分泌物、性液、胸乳、ワクチンなどにおけるＤＮＡ分子を同定することを可能に する。 本発明に開示される如＜、ＮＡＮＢ肝炎ウィルスは。 ＨＢＶ　−ＤＮＡに密接に関連でる配列を含有し、精製され適当に標識化された ＨＢＶ−ＤＮＡプローブとのノ飄イブリッド形成により検出することができる。 ＨＢＶ−ＤＮＡに密接に関連していないＤＮＡｗｉ、いはＲＮＡ分子はこの方法 によっては同定或いは検出されない。これらの方法、考慮及び条件並びにハイブ リッド形成技術における多くの変化及びハイブリッドの検出％単離及び同定手段 は当業＠に公知である。ｍ換えＨＢＶ−ＤＮＡプローブ、プローブの標識化、ハ イブリッド形成条件に関てる詳細は矢の文献に記載されている：チャクラポーテ イ等（Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ）、＜よるＮａｔｕｒｅ、Ｖａｌｕ ｍｅ　２８６．Ｎｏ−５７７２，ｐ−５３１−５３３（１９８０年７月３１日） 、クヨーノ々ル等（Ｓｈｏｕｖａｌ　ｅｔ　ａｌ）によるＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｓＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ（ＰＮＡＳる ）Ｕ−８，Ａ−Ｖｏｌｕｍｅ　７７、Ｎｏ、１Ｏ−ｐ−６１４７−６１５１（１ ９８０年１０月）、クヤフリツツ及びキュー（Ｓｈａｆｒｉｔｚ　ａｎｄ　Ｋｅ ｗ）Ｋよる［ｅｐａｔｏｌ−ｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ　ｔ、Ｎｏ−１，１）ｌ）− １−８（１９８１年１〜ｂ ］）−Ａ−ｅｔ　ａｌ）によるＮｅｗ　Ｅｏｇｌ−Ｊ、Ｍｅｄ−。 ３０５：１０６７−１０７３（１９８１年）及び同時係属中の米山時計出願第２ ４９．３６９号明細書（１９８１年３月３１日出願、発明の名称「８型ウイルス 肝炎の診断試験」）、これらの文献は全て本発明におＶｌて進用てる。 使用される技術の如何に拘らず、試料中におけるウィルスの検出は、全体で２段 階の試験によって行われ、それはウィルスの存在をｄ　痣する（役立つのみなら ずそれと密接に関連したＨＢＶからの区別を行う。 例えば、咲出試験はＮＡＮＢウィルスが反応性を有する５Ｄ３或いは３Ｄ４など の抗体との免疫反応性の試験を行う第１の工程の後、ＮＡＮＢウィルスが交差反 応性を有さないが、ＨＢＶが有する５ｃｔｘ或ＶｈはＩＦ８などの抗体とのイム ノアッセイの第２工程よりなるものである。 もう一つの２段階試液法は５Ｃ１１或いはｌＦ８などの抗体（交差反応性を示さ ない）を用いる第１のイムノアッセイ工程とその後に行われるＨＢＶ−ＤＮＡ１ いはＮＡＮＯ−ＤＮＡ　（下記３魚］の検出可能に標識化すしたプローブ（例え ば、Ｐ或いはビオチンａ識プローブ）を用いたＤＮＡハイブリッド形成よりなる も・のである。 史に又、別の試辞法は第１の工程が５Ｄ３或いは３Ｄ４モノクローナルＩｇＭを 用ｖ−ｈたイムノアッセイであり、その後チンパンジーにおける感染移注の研究 を行う２段哨方云よりなるものである。 或いは又、第１の工程が５Ｄ３を用いたイムノアッセイであり、稟２の工程がＮ ＡＮＢ甲に存在するが、しかし、ＨＢＳＡｇには存在しない異った缶口質を探索 するドデシル瞳藪ナトリウム上のポリアクリルアミドゲルである２段階分析を使 用することができる。 又、七σ）他の５１　＝性として、２段階より多くの工程ｒｅ　利用丁７）方法 、例えば５Ｄ３．３Ｄ４．５Ｃ１１，ＩＦ８を用いたスクリーニング、ＤＮＡプ ローブを用いたハイブリッド形成の試験及び感染考性よりなる方法などの可能性 も明らかに存在てる。しかしながら、２段階試験（任益の順序において）は、試 料がＨＢＶでＷ＃染さｈている可能性に対して区別するために行われる最小のも のである。 多価ＩｇＧ抗−ＨＢ５Ａｇとの又岩反心住のないことは、又ＮＡＮＢウィルスの 存在を不１−ものであり、上記試験の組合せに追加することができる。それはし かしながら、抗原のａ１縮などの積極的な同定がその存在を確認するために依然 必要とされるので決定的な証拠でシエない。 本発明は又、ＮＡＮＢ肝炎の診断ｖｃｎ用なキットの製造に−する。例えば、そ の根なキットは、その中に１以上の容器手段を受け入れるようＩｃ１１！１１窒 化されたキャリヤーよりなり、該ＮＡＮ　Ｂウィルス九対する免役反応性を頁て るモノクローナルＩｇＭ抗体を含有てる第１の容器、及びＨＢｓＡｇｌＣ対して は免役反応性を有するが、しかし、該ＮＡＮＢウィルスに対しては免役反応性を 有さないモノクローナル抗不ン含む第２の容器をきむものである。 このキットは又、検出可能に標識化されたＨＢＶ−ＤＮＡプローブをき有てる纂 ３の容器手段、及び／又はＨＢｓＡｇに対しては免役反応性をＨてるが、しかし 、ＮＡＮＢウィルスに対しては免役反応性を有しないもう一つのモノクローナル 抗体ｆｔよ有する追加の容器手段を有でることができる。 検ｇ５Ｔ能に仲硫化されたＨＢＶ−ＤＮＡは又キット内のもう一つの容器内にも 存在し得る。 初めＩＣ付製されたクローン化ＨＢＶ−ＤＮＡによるハイブリッド形成技術を利 用して、ＨＢＶ−ＤＮＡＫ部分的な配列相同を有するＮＡＮＢ肝炎ウィルスのＤ ＮＡをクローン化することが可能である。これは、極めて厳格なハイブリッド形 成条件下においてもＨＢＶ−ＤＮＡプローブがヒト及びチンパンジー血清の両者 においてＮＡＮＢウィルスを検出する能力を有するという発見に基づくものであ る。本発明において説明されるモノクローナル抗体アフィニティーカラムによる ウィルスの槓＃により、ウィルスのＤＮＡが、ＢＲ３２２のようなセーブラスミ ド或いはバクテリオファージ人などのバクテリオファージ内において抽出及びク ローン化することができる。 一連の制限エンドヌクレアーゼを用いて二本鎖ＤＮＡ内における′時定のへキサ ヌクレオチド配列の認識によりこのＤＮＡを公知の特別の５′及び３′末端を有 する特定のセグメントに切断てる。これらのＤＮＡフラグメントを次いで四−の 制限酵素で処理したプラスミド或いはバクテリオファーソに導入して、キメラ組 換えＤＮＡ分子を生成する。これらの粗製えＤＮＡ分子をＥ−ｃｏｌｉ中に尋人 し、増幅し、多板に生産する。 ＨＢＶ−ＤＮＡ［＋！ＶｉｉｆＧＬ、たＮＡＮＢウィルスＤＮＡ配列なき有てる 組遺え体は標博的スクリーニング法を用＾た分子ハイブリッド形成により同定さ れる。久いでその様なりローンの大きな評を使用して、僅かにのみＨＢＶ　−Ｄ ＮＡＫ関連したＮＡＮＢウィルス配列を有する付加円なりローンを見出て。この 手法により、ＮＡＮＢ肝炎ウィルスの全分子補遺を再含成てることができる。こ のｍ報及びこれらのクローンを用いて、ＮＡＮＢ肝炎ウィルスに対して特異的な 新しい組供えＤＮＡクローンを調製することが可能となる。 実質的に細胞成分及びその他のウィルス及び非ウィルス成分のない精製された単 離ＮＡＮＢウィルスの利用可能性はＮＡＮＢワクチンの調製を可能にする。この ワクチンは当分野の多くの公知の方法により調製することができる。即ち、ワク チンは全生存ウィルスから、或いは酵素或いは溶媒を用Ｖ１て分裂して得られる カブ７ドなどの先便学的に活性であるが、しかし、非病原的なその下部成分から Ｘ友することがでざる。化学旧に弱毒化さｈた生きた或いは死んだウィルスワク チン類、例えばプロピオラクトン、稀ホルマリン（即ち、１％未満の）、エチレ ンアミン、ハロゲン化炭化水素などで処理されたものも使用てることができる。 これらの試礪は物質の免役原注を保持すると共にウィルスのＦ４原性を減少させ る。 もう一つのウィルスの閉力を弱める技術は、無毒性或いは低速成長菌株、或いは 宿主内において持続的複製の１Ｌカを有さない突然変異体を開発させろことであ る。これは、一般的に当分野において「遺伝的弱毒化」として知られており、遺 伝子操作成いは逐久継代により行うことができる。例えば、生きた弱毒化ウィル スの製造は、ｆ１１諭したウィルスなＭ鐵細胞を含有する＠養液に適用させて、 その様な＠養液内で例えは１０〜２００の継代により弱毒化させ、その後肢ウィ ルスを増殖させ、ワクチンを４！！造するというようにして実施される。もう一 つの生ワクチンを製造でる方法は。 クローンを選別して培養てる方法である。感染細胞が生ワクチンの製造に使用さ れる場合には、ウィルスな細胞から放出するのが有利である。ワクチンの製造技 術は一般的に次のような文献に詳細に記されている：”Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　Ｄ ｉｓｅａｓｅ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｔｈｅ−ｉｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎ ｄ　Ｕｓｅ’、Ａ１１ａｎ、Ｗ−Ｈ，、Ｊ、Ｅ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ及び９−Ｔ ｏｌｈ；Ｆｏｏｄａｎｄ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏ ｎ。 Ｒｏｍｅ　１９７８゜ ワクチン類は生であるか☆毒化されているかいずれの場合においても、それらの 多くの異った形特において公知の方法で薬理学的に許容可能なワクチンキャリヤ ー、例えば生体許容可能な油などを用いて懸濁液として調製される。それには、 安定剤を添加てるのが有利であり、乾燥調剤が凍結乾燥により調製されている場 合には特に有利である。水酸化アルミニウムなどの７ジユバントも又み加てるこ とができる。安定剤としてはソルビトール、マン；トール、デンプン、テキスト ラン或いはグルコースなどの炭水化物、アルブミンｒｆｔすはカゼインなどの缶 口質、ウシ血清或いはスキムミルクなどの蛋白ｌＪＩき有剤、及びアルカリ注金 属ホスフェートなどの緩ＷＩｇなどが挙げられる。その様な組成物中には単位投 与被当り１−１００μｇのウィルスが通常存在″ｆる。 ワクチン＆！動物、％にヒトにＮＡＮＢ肝炎の発達を防止するために投与てるこ とができる。ワクチン（ｌ−１００μｇの抗原）は筋肉内に投与した後２回目、 ３回目および５！にそれ以上の追加抗原刺戟を二重の２ケ月間の間隔で行うこと ができる。又、ワクチンは皮下或いは静脈内に投与することがｏＴ廂であり、又 投与経路、投江量及び第１回の完投化と第２回目め免疫追加抗原の間の時間は使 用されたウィルス抗原の免疫原性及び特注に応じて異る。 以上−役円に本発明を説明したが、以下に本発明の埋屏を容易にするために、具 体ｔ１に則して説明するがこれらは例示の目面で挙げられるものであり、特に断 りのない限り本発明乞限足するものではない。 例　ｌ Ｂ型肝炎表面抗原に対するモノクローナルＩｇＭラジオイムノアッセイ：多価抗 体と非反応性の血清中のＮＡＮＤ−結合活性 材料及び方法 患者　患者Ａは急性肝炎（ＡＨ）　を有する２６７の男であった。研究の際には 、面渭グルタミン酸−オギザク酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ；アスノぞラ ギン酸アミノトランスフェラーゼ）は２ｘ６ｘｉ際単位（ＩＵ）／ｍｌ（正常値 ＜５０）　テ；Ｊ＞ｒ）、　ヒＩＪ　ｙヒ：ｙ％１９．２ｍｇ／１００ｍ１　（ 正常値＜１−０）であり、アルカリ性ホスファターゼは１１９１Ｕ／ｌ　（正常 値〈４５）であった。彼の病気の消散には２ケ月かかった。患者Ｂは、慢性活動 性肝炎（ＣＡＨ）を有てる６５才の男であった。彼は十二指腸潰瘍による胃腸出 血のための多数の輸血後２ケ月後にＡＨを発生した。肝臓の生検は小範囲の壊死 を伴う急性ウィルス肝炎と一致でる組織学的模様を示した。この患者は快方に向 い５ＧＯＴ、ビリルビン、アルカリ性ホスファターゼ値は数週間後に正常値に戻 った。しかしながら、２ケ月後に彼は再び黄だんとなり病気の症候を示し、肝臓 の生検は壊死後肝硬変を伴うＣＡＲを示した。最後の４年曲、彼の病気は活動的 であり、５ＧＯＴ値は４５〜２２１　ｔＵ／ｍ　１であり、アルカリ性ホスフェ ート水準はおだやかに増大した。患者Ｃは４２才の女性の血液供給者であつち彼 女の身体検量及び５ＧＱＴ、ビリルビン及びアルカリ性ホスファターゼは正常で あった。患者りは肝１誠の生検により証明されたＨＢＳＡｇ　−陽性ＣＡＲを有 する５８才の男性であった。患者ＥはＡＨ＆有する３６７の男であった。その５ ＧＯＴは６５０１Ｕ／ｍｌであり。 ビリルビンは２．４ｍｇ／ｌｏｏｍｌであり、アルカリ注水ス７アターゼは研究 の時点において１２１１Ｕ／ｌであった。 患者Ｅは彼の病気の急性期間内においてＡ塑成いはＢ型肝炎の何等の血清学的マ ーカーを有さなかった［ＨＢＳＡｇ、Ｂ型肝炎核抗原に対する抗体（抗−ＨＢＣ ）、抗−ＨＢｓ、及びＡ型肝炎抗原に対するＩｇＭ抗体（抗−ＨＡＣＫ対して陰 性、ムｂｂｏｔｔ　ＲＩＡＫより試験〕。患者Ａは抗−ＨＢＣ及び抗−ＨＢｓに 対しては陽性であったが、しかしＨＢＳＡｇ及びＩｇＭ抗−ＨＡに対しては陰性 であった。患者Ｂは又、ＡＨの間はＨＢｓＡｇ抗−ＨＢ５及びＩｇＭ抗−ＨＡに 対しては陰性であった。しかしながら、ＣＡＢの発生後後は抗−ＨＢｃ及び抗− ＨＢｓＶＣ対しては陽性となったがしかし。 ＨＢｓＡｇＫ対しては陽性とはならず、これらの抗体に対しては活動的肝臓病の 状況における最後の４年間はこれらの抗体に対して血清＠注であった。彼は仇− ＨＡＩｇＭＫ対しては陰性であった。患者ＣはＡ塑成いはＢ型肝炎に対しては何 等の血清学的マーカーを有さなかった。患者りはＦＩＢｓＡｇ及び抗−ＨＢ　ｃ ＶＣ対してのみ陽性であった。 患者ム、Ｂ、Ｃ及びＥは彼らの血清により５Ｄ３−５０３モノクローナルサンド イツチＲＩｋＶＣおいて示された高い結合活性のためにより詳細な研究のために 選ばれたものである。患者Ｂの血清はＡＨ及びＣＡＨの際にＲＩＡにおいて陽性 が高く、彼はコード下のアッセイにより首尾一貫して１町定さ名た。患者Ｃは特 別の興味のあるものであった：彼女の血液はＢ型又はＡ型肝炎のｒｆｎ漬字同学 的マーカーに急性肝炎を伝染したものと考えられた。ＩＯ単位の血液が受面＠に ＠血されたが、コード下において彼女の血清が研究に利用可能な８つの単位の中 でモノクローナルアッセイにおいて反応性であった唯一のものであった。患者り は彼の血清がモノクローナルＲＩＡ及び市販のＲＩ　Ａ　（ＡＵＳＲＩＡ　ｎ、 Ａｂｂｏｔｔ製）　（７）　両者ノＶ、ずれを用ｔｎ−ｃもアフィニティー＆製 ＠滑から５Ｄ３−５Ｄ３モノク、ローナルＲｒＡにおいて検出される高い結合活 性を単離てるために幼児が行われた。モノクローナル５Ｄ３ＩｇＭ抗−ＨＢｓの アフィニティーカラム（エクアノーゲンブロマイド活注化５ｅｐｈａｒｏｓｅ　 ６Ｂ＠（７）ｍｌ　当９２〜４ｍｇ（７）ＩｇＭをカップリングさせて調製した 。各患者からの血清（２０〜５０ｍｌＪｙｇカラム上ＩＣ置き、箪温で数時間イ ンキュベートさせた。久いでカラムを十分にり７酸ａ備化塩水（Ｐｉ／ＮａＣ１ ）（ｐＨ７−２）で洗浄した。引′ｖｃきｌ〜２ｍｌの画分をグリシンＭＣＩ緩 衝液（ｐＴｌ　２．６　）で浴出させて果めた。各画分のｐＨをＯ−ＬＭ　Ｎａ ＯＨで７．４に調製し、話合活性をモノクローナル及びＡＵＳＲＩＡ　ＩＩ　Ｒ ＩＡにより浴出液についてめた。最高結合に性を示すピーク面分をプールし、Ｍ ｉｃｒｏ−ＰｒｏＤｉＣｏｎ装ｆｉｊ（Ｂｉｏ−Ｍｏｌ−ｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎ ａｍｉｃｓ、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、０Ｒ）Ｋよ（ニ）　りほぼ１００倍０縮し、 以下に不丁研究に史に供した。 免役電子町微椀法　急性錠いは少性肝長を有するｉ者からの血清式′＃＋（３〜 ５ｍ１）及び５Ｄ３−アフイニ２イー積裂物質及び正常な患者及び肝戚病対照ｌ （ハロタン肝炎、アルコール性肝炎、或いは初期胆汁肝硬変を有する通常のモノ クローナルＲｒＡ［おいては非反応性の個人）からの血清な５ｅｐｈａｒｏｓｅ 、４Ｂクロマトグラフイで８＃されｅｌｏＯμｇの５Ｄ’３１ｇＭで４０Ｃにお いて１２時間インキュベートさ讐た。このインキュベート混合物を１２．０００ Ｘｇにお偽て１時間遠心分離し、上澄液を傾潟分離し、沈澱物を３ｏμｔ（７） ＰＨ／ＮａＣＩＣＰＫ再忍濁さ−ｖｅ。、七〇ｆｆ＋　Ｒ（５〜１０μｔ）を２ ％のリンタングステン戚カリウム（ｐＨ７，２）でネガティブに染色されたコロ ジオン／炭２−破復標不ｙリッドに＠加し、ＪＥＯＬ　１００Ｂ’ｉＩｌ子顕微 幌で＆ｒ食した。その他の対照ト」シエ、血清と、受動面ば４果反応により１： ５００，０００の抗−ＨＢｓ力価を有する１００μＬの血清でインキュベートさ れた５Ｄ３アフイニテイー精製物質よりなるものであった。後者の血清は多数輸 血血友病者から得られたものであった。 抗原的特徴付け　ｆｉＫ　５　Ｄ　３結合物質の抗原組成物を規定するためにモ ノクローナルＩｇＧ及びＩｇＭ抗−ＨＢｓ抗体を用いる一連のＲＩＡを行った。 要するに、５Ｄ３　ＩｇＭ抗−ＨＢｓを固相支″ｍ体にカップリングさせた後、 血Ｗ！試料の述べ稀釈液或いは５Ｄ３ＩｇＭアフィニティー梢製吻質及び１２５ ニー標識ＩＣ７及び５Ｃ３（ＩｇＧｌ及びＩｇＧ２ａ％ツクローナル抗−ＨＢｓ ）、２Ｆ１１．ＩＦ８及び５Ｄ３（ＩｇＭモノクローナル抗−ＨＢｓ）の重加を 行った。反応混合物を４５°Ｃで４時間インキ゛ユベート後、固相支務体を蒸貿 水で洗浄した。結合された放射能（ｃｐｍ）をｐａｃｋａｒｄガンマカウンター で測定した。ＲＩＡにおいて使用されたモノクローナル杭木は、’ＨＢＳＡｇｉ 合研究において競合的阻害の不存在により示された様に、異った決定子を認識で ることが示された［Ｗａｎｄｓ、Ｊｒ−等Ｌａｎｃｅｔ　１：１９８２年５月、 本発明において逆用丁−帆＼ （二１．９　ろ〕。モノクローナルＲＩＡにおいて試料により示された結合活性 は又、通常の抗−ＨＢｓ試薬（ＡＵＳＲＩＡ　Ｕ）で観察されたものと対比され た。琺終円に５Ｄ３アフイニテイ−Ｍ製物質を上記の如くほぼｉｏｏ倍に濃縮し 、ＡＵＳＲＩＡ　ＩＩアッセイにより再試験を行った。これらの条件下ＶＣおい て、ＮＡＮＢ抗原は反応性となった。 ポリペプチド類の分析　患者からアフィニティークロマトグラフイーにより調製 された結合物質（２０〜２５ｐｔ）をＮａＤｏｄＳＯ４／１０％イリアクリルア ミドゲルニかけｃ（Ｍｏｒｉａｒｔｙ等％同文献７８　：　２６０６（１９８１ ３）。５ｅｐｈａｒｏｓｅ’　４Ｂｎラム精ｄ５Ｄ３１ｇＭ抗−ＨＢｓが対照例 として使用された。従って、患者Ａ、Ｂ及びＣ及びＨＢｓＡｇ−陽性、也者から 得られたアフィニティー精膜１ｆｆｌｘのゲル上のポリペグチドプロフィルをＣ ＡＨ（患者Ｄ）と対比した。 分子債決定　５Ｄ３−結合物質の近似分子量を決定するために実験を行った。、 叡者Ｂ及びＣかもの血清試料（１０〜１５ｍ１）を３ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂカ ラＡよＫおき、Ｐ　Ｈ／　Ｎ　ａ　Ｃｌで浴出した。分子糺マーカーは＃色デキ ストラン、ＩｇＭ、ＩｇＧ及びミオグロビンであった。両分のアリコー）Ｙ５Ｄ ３−５Ｄ３モノクローナルＲＩ　ＡＣＰにおいて試験を行い、結合活性を分子斌 マーカーの溶出プロフィルと対比しゼ。最も高−結合活性を示ｆ−分ゼブールし 、き縮し、上記の如く５Ｄ３で免疫沈降させ、゛成子頻做硯で検量した。 甜果 巣１図に’Ｌ　５Ｄ３−５Ｄ３　％ツクローナルＲＩＡｌｃより測定された５Ｄ ３１ｇＭ抗−Ｊ’ｌＢＳアフィニティーカラムから溶出された各種１面分の典型 的結合プロフィルを示すものである。結合活性はグリシンＭＣＩ緩衝液による溶 出後に回収され、表ＩＫ見られる如く、ピーク面分での話合した放射ｊじの−は 未分画血清において得られたそれよりも高かった。 通常の多価抗−ＨＢｓ試薬を用いた場合には何等の結合活性も観察されなかった 。更に１分別血清シエカラムを通過後及びＰ・／ＮａＣ１で浴出後モノクローナ ル凰 ＲＩＡによる測定により結合活性（１，欠けていた（第１図］。 本例において５Ｄ３−貼合物質の抗［的特徴のいくつかが決定された。（又、下 記参照）。一つの研究においては、第２図に示される如く、５回のモノクローナ ルＲＸ人が使用された。第２図の右図は、モノクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗− ＨＢｇ抗体（５Ｄ３．２Ｆ１１．ＩＦ８、ＩＣ７及び５Ｃ３）を用いたＲＩＡに おいて試験された血清の逐次稀ＸＲＫ対する結合プｃｘフィルの半対数プロット である。全てのイムノアッセイはＨＢｓＡｇ−晴性ＣＡＨを有する患＠Ｖｃお＾ て高い反応性を示した。これに対して、４［ｉ？Ｉのその他のモノクローナルＲ ＩＡが使用された際に有意なに合活性の不存在により示されて−る如くＣ第２固 在図３．５Ｄ３−イにおけるこれらの血清の反応性がを異的抗原−杭棒相互作用 の結果であり、阜に血清のネズミのモノクローナルＩｇＧ及びＩｇＭ抗−ＨＢｓ への非特異的結合によるものではないことを示している。 ５Ｄ３−結合物置の付加的抗原特性も又表１に示されている。結合活性の夏合は ５Ｄ３−５Ｄ３アツセイに：％ｆｌ／Ｉて患者Ａ、Ｂ及びＣからの血清試料がア フィニティーＳ製され、叉ＩＣ＃縮されるにつれて増大して−る。 全ての４つの試料が約１００倍（＠置）に濃縮された場合に、それらが多価抗− Ｈ８ｓ試％（ＡＵＳＲＩＡ　Ｉｔ）について強いＩ性のに果を示してすることは 輿体深い。 しかしながら、この詔合活性は、これらの試料ｔ５Ｄ３モノクローナル抗−ＨＢ ＳｔＣより予めインキュベートすることにより遮断された。これに対して患者り からのアフィニティー′：Ｉ＃製ＨＢＳＡｇの５Ｄ３ＩｇＭ抗−ＨＢＳＫよる前 インキュベージ！ｙｉｃはＡ［ｌ５ＲＩＡ　ＩＩにおいて知られたＨＢＳＡｇ結 合活性の５０％の連断が寂察されたＫｆぎなかった。 ４人の患者から得られたアフィニティー精製（至）責σ）ＮａＤｏｄ８ｏ４／ポ リアクリルアミドゲル上のポリペプチドプロフィルを第３図に示で如く比軟した 。比猷を患＠　Ａ　ｓ　Ｂｓ　０間及び患＠Ｄから得られ＊ＨＢｓＡｇＫおい

【 行ったところ、蛋日質バンドにおいて、ある顕著な類似性が見られた。主たるｓ ｏ、ｏｏｏダルトンの蛋日質は、全試料について共通であった＃；ＨＢｓＡｇボ ＩＪペプチドは患者Ａ、Ｂ、Ｃからのその他のｓｏ、ｏｏ。 ダルトンの缶口質よりも僅かに先方に移動していた。 ２２．０００〜２３．０００ダルトンの」囲におけろ２つｆ）その他のポリペプ チドは全ての４つの単農物におげろ共通成分であるように思われた。より重要な ことにを工。 Ａ、Ｂ及びＣの試料においてをエポリペプチドブロフイルは同一であり、又、Ｈ ＢＳＡｇのポリペプチドに対して何等かの類似性が存在したものの、群としては 明確な差が存在した。 最後に、５ｅｐｈａｒｏａｅ　４Ｂ■りＯｆｆトゲラフイーにより決定されＴ− 患者Ｂ及びＣＫおける結合性物質の分子量）工はぼ２Ｘ１０’であった。　′＃ 例に、七ツクローナルＲＩＡにおいてのみ検出された結合物債の性′ＪｉＬを直 遥に対比でるように試みられた研究を示でものであり、通常のアッセイ（ＡＵＳ ＲＩＡＩＩ）にふいて検出されたものではない。若し、モノクローナルＲＩＡな 用いて測定された結合活性がＨＢｓＡｇＫ向−であったならば、モノクローナル ＲＩＡのＨＢｓＡｇＫ対する公知ノＷ＆度（１００±３０９ｇ／ｍｌ）に照らし て通常のアッセイも陽性の髪果をもたらしたことが予想されたであろう。本研究 の目標）工。 ＨＢＳＡｇと、Ａ］１ｌｔ５ｊｓ〜工ＣＡＨを有τろ通常のＲＩＡによってはＨ ＢＳＡｇＫついて血清中にお−て陰性の患者から、およびその血液が受面＠Ｖｃ ＡＭを伝染させることを含む血液供与者から得られた５Ｄ３アフイニテイー積Ｒ 物質との関連性を評イーするものであった。 疑うべくもなく、モノクローナル５Ｄ３抗−ＨＢｓは本研究及び従来のｌｌｉ察 （Ｗａｎｄｓ　ｅｔ　ａｌ、ＰＮＡＳ−７８：１２１４−１２１８　（１９８１ ）３により示された如く。 ＨＢｓＡｇ上の決定子を認識した。ＨＢＳＡｇは５Ｄ３ＩｇＭアフィニティーカ ラムにより血清から単層された。この単離物の免疫反応性は５Ｄ３モノクローナ ル及びＡＵＳＲＩＡ　ＩＩアッセイのいず九においても測定された高い結合活性 により確認された。更に、アフィニティー精製ＨＢｓＡｇ＊５Ｄ３　ＩｇＭ抗− ＨＢｓで前イン＝？ユヘ−）し、免疫沈降１１Ｊを電子顕微鏡で検量したところ 、典型的な２２−〜２５−ａｍの粒子が観察された。 粒子の果り及びそれらの「突出した」或いは「けは立った」外観は１表面上の抗 体の存在に一致するものである。事笑、この観察は、５Ｄ３モノクローナル抗− Ｉ（ＢＳとＩＩＢＢＡｇ上の特異性決定子との相互作用の継代釣証拠を与えるも のである。アフィニティー猜製ＨＢＳＡｇＩｆｉ物のＮａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ ４／ポリアクリルアミドゲル上の？リペプデドプロフィルは主たる５０．０００ 〆ルトンのポリペプチド及び２個のより小さな蛋白質（２３，０００及び２７． ０００ダルトン）を示す従来の報告と一致でるものであった。最後に、ＨＢＳＡ ｇ＄雌物価抗−ＨＢｓ（ＡＵＳＲＩＡ　Ｉ［）を用いるＲＩＡにおげろ高い結合 活性により確立された。 ＨＢＳＡｇと患者人、Ｂ、Ｃ及びＥから阜治された５Ｄ３免没反応性物質（ＮＡ ＮＢ）の間には幾つかの類似性が観察され−ｒ−ｏ先ず、５Ｄ３−　ＩｇＭ抗− ＨＢｓアフィニティーカラム及びモノクローナルＲＩＡにより測定された溶出液 中に結合されてＶ）ろ放射症を用いて回収された結合活性は血清甲において―」 定されたそれよりも数倍高かった。更に、溶出液のｆＩｌ縮後、モノクローナル ＲＩＡＫおける再試験は一層高い結合°値をもたらした。第２ｔＣ，アフィニテ ィー精製物質の免疫沈降により、χ子顕５１Ｌｉにより別々の粒子であることが 判明した。しかしながら、高−力価抗−ＨＢ　ｓｆｉ加後ＫＧ工単会物中に【工 粒子は見られなかった。ＮＡＮＢ校子の外視及び寸法はｔ（ＢｓＡｇに類似して ｖ−ｉ７’：が同一で％；なかった。電子顕微鏡グリッド上の粒子密度は５Ｄ３ −　ＨＢＳＡｇ免反沈降物につめて観察されたものよりも一般面により小さいも のであった。５　Ｄ　３−ＨＢｓＡｇ免疫沈降物と同様に、粒子の集合物が観察 され、これは恐らくその表面における５Ｄ３抗体の存在な表わ丁ものであると思 われる。最後に第３図に示す如く、ＮａＤＯｄＳＯ４／ポリアクリルアミドゲル 電気泳′＠により、ＨＢ３Ａｇについて既述の如く同一の分子ｔａ囲（３個のポ リペゾチド類があることが判明した。 ５Ｄ３　ＩｇＭ抗−ＨＢ５１？ｉ合物質（ぎＡＮＢ）は。 ＨＢｓＡｇとある種の特性を分ち合うものであるが明確な相違が認められた。こ れらの相違に５Ｄ３免役反応性物質を他のモノクローナルＩｇＧ及びＩｇＭ抗− ＨＢｓ抗本並びに通常の試薬を用めて検量した際に最も明日であった。４つのそ の他のＩｇＭ及びＩｇＧ抗−Ｈａｓ抗体は、固相ＲＩＡにおいて試験した際に。 ５Ｄ３結合物質とは反応性を示さなかった。これに対して、全ての４つの抗体は 同−ＲＩＡにふいてＨＢＳＡｇと極めて高い反応性を示した。これに関して、５ Ｄ３が固相支持−とカップリングされ、他の１２５Ｘ−標識化モノクローナルＩ ｇ＆及びＩｇＧ仇−ＨＢｓが指示ゾローゾとしての役割を呆したことは注目に値 ′ｆ７）。 、○ 従って５Ｄ３結合物＠　＋Ｘ、固相叉狩体に話合したが。 しかし、ＲＩＡＫよっては検出されなかったようであワ、それらのエビトー１は 不存在であるか、−他のモノクローナル抗−ＨＢｓでは同定されるに十分な８Ｋ ＫＲいて利用可能でなかった。 ５Ｄ３−アフィニティー精製嶺質の抗原％性についての追加調肴を浴出液の旋層 （はぼ１００倍１１後に行つ７：、各濃泪鏝にこれらの率騎吻は丁べてＡＵＳＲ ＩＡ　Ｉｆ中において反応性ン有した。より重要なことに、５Ｄ３抗−ＨＢ５ｌ Ｉｃよる前インキュペークヨンを工通常の抗−ＨＢｓによる結合をａ＃しπＧ１ つの可能性のある解釈は、常法により調装された抗−１（１３ｓ試薬は少量の５ Ｄ３　ＩｇＭ抗−ＨＢ　Ｓ　ｉＣｆｊｊ似した抗体、或Ｌ／１は向−エピトープ に対して成金するＩｇＧクラスの抗体をき有することである。しかしながら、こ れらの単凝物（表１月工市販のＲＩＡＫふいて通常の抗−ＨＢｓとの高い結合値 を有し、このことはＨＢｓＡｇ上の決定子及びＮＡＮＢ　５Ｄ３結合物質の−ｎ 等かの抗原釣交差反応性を水製するものである。これに対して。 ５Ｄ３のＨＢｓＡｚによる前インキュベークヨンの纜果。 ＡＵＳＲＩム■により再試験した際に結合活性がほぼ５０％減少した。この結果 はその他の未占有決定子が市販の多価抗−ＨＢｓによる結合に利用可能であ−る ので予想されなかったことでをＸなかった。従ってこれらの知見蚤工、５Ｄ３　 ＩｇＭ抗−ＨＢｓｌｒＺＨＢｓＡｇ上ＫＮＶｈて高度に表現されたエピトープに 向けられたものであるが、しかしＮＡＮＢウィルスと共通するエピドーグをも認 識するものであることビ示唆するものである。 本例について選択された患＠％工、その血清が５Ｄ３−５Ｄ３モノクローナルア ツセイにより陽性の反応を与えたが、しかし、市販のＲＩＡでは与えなかったよ り大きな許の一部であったことを強調丁べきである。 寵者の選択は主としてそれらのモノクローナルＲＩＡＫおける血清の極めて高い 結合活性に基づＡているものである。従って、現時点においてより低い結合活性 を有するその他の血清から得られる単離物が上記と同一特性をもたら丁か否か九 ついては明確でシエない。しかしながら、５Ｄ３−　ＩｇＭ物質［ＮＡＮＢ］が 急性及び慢性炎症性肝・４病を有千る思考から、及び史に−（正常な）１固人か ら得られた血清よりアフィニティー精製され通常の抗−ＨＢ５試薬により分析さ れた場合には限られたＨＢｓＡｇとの父差反応注を示すことは明日である。更に この物質はＲＩＡにおいて４つの他のＩｇＭ及びＩｇＧモノクローナル抗−ＨＢ ｓによっては認識ぼ２Ｘ１０’の分子量を有し、免疫寛子顕微説により個々の粒 子としての外観を有するものである。 カーペンタリア（Ｃａｒｐｅｎｔａｒｉａ）’ｐｉ（ｒ）タイー民居住区である モーニントｙ（Ｍｏｒｎｉｎｇｔｏｎ）島とない。これらの被検者及びクィーン ズランドの厚生料をヘパリン化管に入れｒｍ漿を遠心外′＃により分ｎしプリド ーマの生育及びクローニングは従来説明されたもの□と同一゛である（Ｗａｎｄ ｓｖ％Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏ−ＨＢＳＡｇ上の決定子に、対する特異性、ＥＢ ｓ、Ａｇ、（プブタイグａｄｗ及びａｙｗ）で破りされた亦皿球を演果する能力 、抗体クラス及びすプクラス及びｆ（ＢＳＡｇ−関連エピトープに対する親和性 について特徴付け°られ亀この研究のためには、、ＨＢＳ、Ａ、ｇのあらゆる公 印のすブタイブを認識し、又Ｈ，Ｂ５Ａｇ決足子疋対七てｉめて高い親和性定式 を有し、ｉ［ＮＡＮＢ抗原活注を認識するので２つのＩｇＭ及び２つのｘｇＧモ ノクローナル抗−ＨＢｓ抗体を選択した。即ち、モノクローナル抗告々有でる。 七ツクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗−１’ｌＢｇラジオイムノアッセイ（試瑣燥 作） 従来の研究（Ｊ−８ｈｏｒｅｙ４．ｌＨｅｐａｔｏｌｏｇｙｌ：５４６　（１９ ８１）（Ａｂｓｔ−））は、５Ｄ３　ＩｇＭモノ抗−ＨＢｓ抗体の甲で最も高い ：ｆＭ、相性足相性有数ろことを確立した。５Ｄ３抗−ＨＢＳは固相支付体にカ ップリングされ、その他のＩｇＭ及びＩｇＧ抗体ハヨウ素−１２５により４−１ ＯμＣｉ／μｇの′Ｐｆ異活性に放射１標識された。ヨウ素化前に抗体はＩｇＧ については腹水からブドウ球菌−蛋白’Ｊ−Ａアフィニティークロマトグラフィ ーにより、ＩｇＭについては「５ｅｐｈ−ａｒ、ｏｓＣ−４ＢＪクロマトグラフ ィーにより積喪し亀モノクローナルラジオイムノアッセイにつ−てはほぼｓｏ　 ｎｇの５Ｄ３７［ａビーズを１００Ｊｔの血漬及び１００μｔ（１５０，ＯＯ’ ＯＣ９ｍ）　放射線ｍ處％／／Ｈ−す＃抗−ＨＢ５で１６時闇インキエペートし た。面相叉持本を３回蒸留水で洗浄し、ビーズに粘合した放射症？Ｐａｃｋａｒ ｄガンマウェルカウンターでｒＡ１１定した。 全ての血清試＠は、固相支持体上の抗体及び放射−標識指示抗体が同一である５ Ｄ３−５Ｄ３　ｒ同時サンドイッチ」ラジオイムノアッセイにより評価した。こ の感度が高いものである。−匹高一結合活性がＩｆ１１清甲に示されると、放射 線標識３Ｄ４．２Ｃ６，奴いを工５Ｃ３抗−Ｈａｓが指示プローブである３つの その他の七ツクローナルラジオイムノアッセイが行われた。従って。 そり）他の高−アフィニティ一モノクローナル抗体により検出でることのできる ５Ｄ３−免役反応性物質における追加的抗原決定子が存在下るか否かを決定でる ことがｆ５］ｋであった。原住民からの全ての血清試料は又、市販のラジオイム ノアッセイ（各々［Ａｕ５ｒｉａ　ｎＪ。 「Ａｕ５ａｂＪ　、及び「ｃｏｒａｂＪ　；Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏ ｒｉｅｓイリノイ州、化７カビ）によりＨＢＳＡｇ。 抗−ＨＢＳ及びＢ型肝炎核抗＃−（抗−ＨＢＣ）について試験を行った。 ＨＢｓ−Ａｇ−関連決定子の分析 ４１−のモノクローナル抗−Ｂｕｇ抗体が同一の、苫接に関連した。或いは別々 のＨ８３１ｇ上の抗原決定子を語源するか否かを決定するために読合−阻害研究 を行った。これらの検討のためにＨＢｓＡｇ　（ｖブタイブ精表未標シ５Ｄ３． ３Ｄ４．２Ｃ６或いは５Ｃ３抗−）Ｉｎｓで１６４ｆ’ｊ＋インキエペートした 。藁μ度の未＃は５０３は放射・ぷ標＠５Ｄ３のＨＢＳＡｇ上のその決定子に対 する結合ｆｔ児全に＠害てることが予想される。若し。 別の０例えば２Ｃ６のようなモノクローナル抗−Ｈａｓが放射１ｆ！！椋識５Ｄ ３でインキュベートされ、ＨＢａＡｇへの５Ｄ３結合の阻害がなＶｓ％合には、 ５Ｄ３及び２Ｃ６は異った決定子に結合でると結論付けろことができよう。この 諸論を支持する証拠を９ＡＫ与えるために１例えば２Ｃ６を放射讐係１し、各撞 湯度の未参繊５Ｄ３でインキュベートさせる逆災珈を行った。高−反の他の未僚 誠抗体の存在下において、標識抗圧の結合の何等の阻害もなＶｈ場合には、これ らの２つの抗体はＢ型肝炎つィルス関連蛋白質上の別個の決定子に回けられたも のに違いなめ。 結　果 ｒｇｃ抗−ａａｓｖｒ、体２Ｃ６及び５Ｃ３は５Ｄ３１７）ＨＢｓＡｇ−関係決 定子に対しては何等の影響も及ぼさなかったのに対しく駆４図】、３Ｄ４．即ち ＩｇＭ抗−ＨＢｓは部分釣［５Ｄ３結合を阻害した。追加実験は５Ｃ３，２Ｃ６ 及び５Ｄ３がＨＢｓＡｇ上の別々の決定子′ｔｔ認識することを確蜜した。５Ｄ ３及び３Ｄ４工ビドーグ曲にはＰｌ等かの抗原父差反応性が見られたが、しかし ３Ｄ４結合は２つのＩｇＧ抗−ＨＢｓ抗体（５０３及び２０６）によって影簀を 受けなかった。この研究にだいて使用された４つのモノクローナルラジオイムノ アッセイにＨＢＳＡｇ上において３つの別々のエピトープ及び１つの部分釣又差 反応性エピトープを検出てる。 この研究の人口のほぼ５０％が、）ｆＢｓＡｇ、抗−ＨＢｓ及び抗−１（Ｂｃ、 或Ｉ／１は抗原及び杭木の血清中［おける存在に示される如＜、ＨＢＶ［曝され たもので、もったＣ表２）。 表２　モーニントン島住民におけるＢ型肝灸（ｎ＝９６）　２３（２４，９）　 ７（７−３）　２７（２８−１）　５（５−２）　？（７−３）成人女子 （ローフ３３　１３（１７−８）　７（９−６３１５（２０−５）　５（６−８ ３１０（１３−７３子供男子 （ロー５７）　５（８−７）　１（１，７）　１５（２６−３）　２（３−５） 　５（８−８）子供女子 （ｎ＝５０）　４（８−０）　１（２−０）　６（１２−０）　１（２−０）　 ６（１２−０）総　１ （ｎ＝３１６）　５１（１６−１）　２２（６−９８）　７３（広う−０３１４ （４−４）　３１（９−８）本年令及び性についてのデータが利用可能な２７６ ／３１６の仮検者についての分析 十　全人口３１６人であった １４人が市販のラジオイムノアッセイ（ＡＵＳＲＩＡ■）によつＨＢＳＡｇ［対 して吻性であった。これらの全ては５Ｄ３−５Ｄ３同時プンドイツチモノクロー ナルラジオイムノアツセイによってはその他σ）１７名の市販＋７）ＲＩ　Ａ　 （ＡＵＳＲＩＡ　ＩＩ）により陰性であったもｆ）と同様に極めて高い陽性であ った。女性の破検者よりも、全ての年令におＶ）て男性の故瑛者においてＢ型肝 扱ウィルスマーカーが高い強度で得られた。 表３　モノクローナル−杭木、姑合にょ７）　ＨＢＶｌ　（Ｌ６　８．３　Ｌｌ 　（Ｌ７　６−４２　０−４　１１−０　１−０　０−５　４−３３　＋＋　０ −７　４−１　０−５　４−ｉ　０−６４　１、Ｉ　Ｌｌ　８−ＯＬ２　６．４ ５　＋＋　ＯＪ　１３−０　０−６　０−３　１７−０６　＋−ｔＬｌ　４−０ 　肌０　０−５　１−３７　Ｌ９　２３−ＯＬＩ　Ｌｌ　３−５ｓ　＋＋　１− ３　７−１　０−６　０−７　２−８９　−　＋　（Ｌ７　Ｌ４　Ｌ４　０４　 ＬＯＩＯＯ−９９−７０−３０−９６−３ １１＋−０−８３４０−６（Ｌ５　Ｌ１１２　ＬＩ　ＩＬＯＯＪ　（Ｌ９　Ｌ９ １３　＋＋　Ｌ３　１５．０　（Ｌ６　０−６　２−４１４　ｆＬ４　３−９　 ０−３　０．３　１−＋ｉ１５　＋−０−４１１−ＯＬ４　（Ｌ４　１１１６　 −　＋　０．８　５．５　０−４　（Ｌ５　ＬＯ１７＋＋　１．７　ＣＯ（Ｌ８ 　Ｌ４　Ｌ７対照例十 本　８／Ｎは実験試料中における平均結合ｃｐｍｔｔ陰性対照例の平ｊｅｌｃｐ ｍで除して計算された信号／ノイズを表わす。Ｓ／Ｎ＞１０の場合は結果が陽性 と考えられる。 ＋　陽性の被検者数（％）。 ＋　ＡＵＳＲＩＡ　Ｉｆラジオイムノアッセイにより陽性であるオーストシリア の原住民試料。全試料はモノクローナル抗−ＨＢｓ　ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体と反 応性であった。 ＢＤ＝血液供給者。 表２に示された１４名ＨＢ８Ａｇ−陽性被検者に加えて５Ｄ３−５Ｄ３モノクロ ーナルラジオイムノアツセイは１７名のその他の被検者におりても相当な結合活 性を示した。これらの試料の更にモノクローナル−抗体分析の結果を表３に示す 。幾つかのパターンが観察された。例えば、試料ｌにおＶｌては、５Ｄ３−５Ｄ ３．５Ｄ３−３Ｄ４及び５Ｄ３−５Ｃ３ラジオイムノアツセイにおいては陽性の 結果が得られたが、しかし、市販のラジオイムノアッセイ（ＡＵＳＲＩＡ　Ｍ） 或いは５Ｄ３−２Ｃ６ラジオイムノアツセイでは得られなかった。他の被検者か らの試料１例えば２．５及び８は５Ｄ３−５Ｄ３及び５Ｄ３−３Ｄ４アツセイに よってのみＨＢｓＡｇ　−陽性であった。これらの場合の各々におｉて５Ｄ３は 固相支持体とカップリングされ、その他の１２５！−標識モノクローナルＩｇＭ 及びＩｇＧ抗−ＨＢｓは指示プローブとしての役割を果たした。 ５Ｄ３−反応性ｖｌＪ質は１面相支持体に結合したが、しかし、他のモノクロー ナル抗−ＨＢｓ抗体を用Ｖｓた幾つかのラジオイムノアッセイにより検出された かつに、のはそれらの抗体が認識するＨＢＳＡｇウィルス決定子が不存在或Ｌ／ Ｉは十分な濃度で利用可能でなかったためによるものと思われる。競合−阻害研 究は５０３及び３Ｄ４決定子間の十部分的抗原性父差反応性な示したので、１７ の５Ｄ３−＠性試料中の＋２（７ｔ％］において３Ｄ４抗体による結合活性があ ったことは驚くに足りない。全モノクローナルラジオイムノアッセイに対する陽 性率９！、低い血液供給者人口においては無視できるものであった（表３）。こ の知見は、モノクローナルラジオイムノアッセイのＨＢｓｉＡｇ−関連決定子に 対する特異性の証拠を更に与えるものである。 考察 モーニントン島の原住民社会の５０％を超えるものがＨＢＶＫ曝されていること が判明した。ＨＢＶによる極めて高割合の感染名は、家族集団内の密接な接触の 量、貧しい社会経済条件及び極めて高い性病の発生のためにモーニントン島のよ うな閉鎖原住民社会においては予想されることである。 本例により高−アフィニティーＩｇＭ及びＩｇＧモノクローナル抗体のノ爵異性 が確認された。これらの抗体はＨＢｓＡｇに対して調製されたものであり、各々 は公知のＨＢｓＡｇｔプタイグと特異的に反応することが示された。競合−阻害 実験はこれらの杭木がＨＢｓＡｇ上の別個の決定子を認識することを示している 。通常の多価抗−ＨＢｓ抗血清（ムＵＳＲＩＡ　ｎ）と反応した全テの血清試＃ ＋は又４つのモノクローナル抗−ＨＢｓＩｇＧ及びＩｇＭ抗体と強く反応し、Ｈ ＢＶ曝繕の低いことが知られているコーカナス人の対照レリかも得られた血清試 料はモノクローナル杭木との反応の喫反が低かった。血清中のＨＢｓＡｇに対す る杭木結せの倦釈曲線は着しく類似しており、これは、これらのウィルス決定子 がＨＢＳＡｇ上に高Ｖ−頻度において存在し、それらが月−に人口内に分布して いることを示した。 その血清が５Ｄ３−５Ｄ３モノクローナルラジオイムノアツセイにおいては反応 性を示したが、しかし通常の多唾抗−ＨＢｓ抗血清において試験された場合には 陰性であった１７人の対照者は本発明に特に関連性を有するものである。５Ｄ３ −５Ｄ３ラジオイムノアツセイは、ＨＢｓＡｇ−関連決定子に対して血清ｍ１当 ９１００１）ｇの感度を有するものであり、これは市販のラジオイムノアッセイ のそれよりも数倍大きい感度を表わすものである。従って、これらの陽性の活果 の幾つかは、このアッセイのより大きな感度に基づいて説明することが出来るも のであるが、その他の陽性の結果はこの機構によっては説明することが不可能で ある。 異ったＨＢＳＡｇ決定子を認識する抗体を用９るその他のモノクローナルラジオ イムノアッセイは実質的な数の５０３−＠性試料において高い結合活性を示した 。 との概念を更に支持するものである。例１においては５Ｄ３−５Ｄ３モノクロー ナルラジオイムノアツセイにおいて高い結合活性を示したが、しかし、ＡＵＳＲ ＩＡ■におｉては陰性であった血清試料が検討され、この結合物質の特性の幾つ かは上記の如＜ｔ＃徴機付られ亀通常のＨＢＶマーカーを有さない高割合のモー ニントン島住民において、高−アフィニティ一モノクローナル抗体によってのみ 認識された抗原決定子の発見は。 この社会においてＨＢＶＫ抗原的に関連するが、従来検出されなかったウィルス ジＵちＮＡＮＢウィルスが存在することを示して−る。これは次の例により証明 される（下記参照）。 血清試料及びＲＩＡ　血清試料及びＲＩＡはし＋４１及び例２のものである。 七ツクローナルＲＩＡにおいてのみ反応性を有した幾人かの個人は、血清中に抗 −ＨＢ５及び抗−１’ｌＢｅ抗体を有したので１種々の抗原・抗体比において形 成されたＨＢｓＡｇ−抗−ＨＢｓ免疫複合体におけるＨＢｓＡｇ関連決定子に対 するモノクローナルＲＩＡの感度を確認するために追塀の実験を行った。これら の検討において、ＨＢＳＡｇの慢性保持者を数人選別し、それらの血清について 逐次４沢を行った（ＨＢｓＡｇ−陽性血清を用いてン。各試Ｍにおいて結合活性 をモノクローナルＲＩＡＩＣより測足し、多価抗−ＨＢｓ抗体（ＡＵＳＲＩＡ　 Ｉｆ　）ｉＣより得られたものと対比した。 ＨＢＳＡｇ−陽性血清の稀釈液（２００μｔ）を次いで多数輸血血友病患者（受 動血液凝集反応による抗−ＨＢｓ力ｒｉ　ｉ〜２−２Ｘ１０６）からの血清（２ ５μｔ）で２０゜Ｃにおいて１２時間インキュベートした。このインキュベーク ヨンｉＲＩ　ＡＹ行った。ＨＢｓＡｇ上Ｃ対してはモノクローナル抗−ＨＢｓ及 びＡＵＳＲＩＡ　ＩＩ、及び抗−ＨＢｓレベルに対してはＡＵＳＡＢであった。 ＨＢＶ　ＤＮＡ　ハイブリッド形成研究　分子ハイブリッド形成研究のために、 ヒト血清のｌＯμｔアリコートをニトロセルロースＰ紙にかけ０．５ＭＮａＯＨ によりこのＦ紙に変性及び固定した。この物質ケＰ紙上において０．５Ｍ　Ｔｒ ｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７−４−１，５ＭＮａＣ１により中和し、０−３Ｍ　ＮａＣ １１０−０３Ｍクエン酸ナトリウム中においてプロテイナーゼＫ（２００μｇ／ μｔ）により消化し、風乾し、真空中８０°Ｃで２時間焼成した。結合ＤＮＡを 油ハイブリッド形成し、ＨＢＶ　［３２ｐ］　ＤＮＡを用いてノ１イゾリツド形 成した。 これらの試験について、組換えクローン化ＨＢＶ　ＤＮＡ（ＩＩ［３，２５０塩 基対］を、プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＥＣ０ＲＩを用いて消化するこ とによりプラスミド、ＡＯＩ　ＨＢＶ　ＤＮＡから再検製した後、精製ＨＢＶ　 ＤＮＡバンドをアガロースゲル亀気泳勧及び電気浴出を行ツタ。ＨＢＶ　ＤＮＡ ＋！［３２９′３　ｄＧＴＰ及び［３２ｐ〕ｄＡＴＰにより、ニック−トランス レーションによりＤＮＡのμｇ当り２−４ＸＩＯＣρｍの特異活性に標識化され た。ハイブリッド形成は、変性仔牛チムｘＤＮＡ　（１５０〜２００μｔ）及び 熱変性ＨＢＶ［３２］　ＤＮＡ（ｌＸ１０’ｃｐｍ／ｍｌ）を６５％き有する０ ７５Ｍ　ＮａＣｌ１０−０７５Ｍクエン酸ナトリウム１０．０２％ポリビニルピ ロリドｙ１０−０２％ｐｉｃｏｌ１１０　、０２％ウノ血清アルブミン中におい て２４〜３６時間行った。ハイブリッド形成後未反応浴液を廃棄し、ニトロセル ロースフィルタを洗浄、乾燥し、オートラジオグラフを行った。比較実験のため の試験試料は、精＠ＨＢＶ　ＤＮＡ、即ち、ＰＬＣ／ＰＲＦ１５細胞系統から抽 出されたＤＮＡであって、かつ、ゲノーム当量当り。 或いは血清Ｄａｎｅ粒子から単離されたＤＮＡ当り５〜６個のＨＢＶ　ＤＮＡの 複製をき有するものであった。 結果 第５図は、関節炎１発疹及び関節痛によって特徴付けられる急性Ｂ型肝炎及びＨ ＢｓＡｇ−抗−ＨＢｓ免疫複合病を有する患者についての一連の研究な示すもの である。この図においてＨＢＳＡｇＫ対する信号／ノイズ比（特異的結合活性の 目安）は多価抗−ＨＢｓ（ＡＵＳＲＩＡ　ｎ　）を用いた場合よりもモノクロー ナル抗−ＨＢｓ（ＩｇＭ）な用いた方が高い。より重要なことに、多価ＡＴＪＳ ＲＩＡ　ＩＩ　ＲＩＡが陰性になラフｊ後１３週間の闇（■３　ｗｋ　）ＨＢＳ ＡｇＫ対するモノクローナルＲＩＡは陽性であった。この期間において、抗−Ｈ Ｂｓは血清中に存在したが、これは、モノクローナルＲＩＡが抗−ＨＢｓ過剰に おいて形成されたＨＢＳＡｇ−抗−ＨＢｓ免疫複合体におけるＨＢＳＡｇ−関連 決定子？検出し、又その様な決定子は多励抗−ＨＢｓ抗血清により検出可能でな いことを示唆する。 この可能性を史に探索するために、ＨＢｓＡｇ−抗−ＨＢｓ免疫複合体が高力価 多価抗ＨＢＳ抗体の添加により慢性ＨＢＳＡｇ保持者からの血清を用Ｖ１て１ｎ ｖｉｔｒｏで形成された２つの追加研冗を行った。多価抗−ＨＢｓをＨＢｓＡｇ 保持者からの血清に蚕卵したところ、モノクローナルＲＩＡ（抗ＨＢｓ　ＩｇＭ ）はＡＵＳＲＩＡ　ＩＩ　ＲＩＡよりも１０倍大ぎい侑釈嘉までも陽性であった 。ＩｇＭモノクローナル抗−ＨＢ　ｓ　ｔ７）代りにＨＢｓＡｇ上の別個の決定 子を認識するＩｇＧモノクローナル抗−ＨＢ５　５Ｃ３及び５Ｃ１１を用いて研 究を行ったところ、（同様の結果が得られた。これらの知見は、モノクローナル 抗−ＨＢｓ　ＲＩＡは％ＨＢＳＡｇが最早多価抗−ＨＢ５抗体により検出不町罷 となった場９ 合にも免役複合体中に特異的ウィルスエピトープを認識し得ることを示す。 ＨＢＶ　ＤＮＡ−関連配列がモノクローナル抗−ＨＢ５抗体によってのみＲＩＡ によるＨＢｓＡｇ上Ｃ対して＠性である血清試料中に存在するか否かを決定する ためＫ。 血清（１０μｔアリコート）をニトロセルロ−ス戸砥にスポットとして適用し％ 変性した。ＤＮＡ物質は組換え一クローン化及び再Ｍｊａｌ（Ｂｙ　［ｐ］　Ｄ ＮＡで固定化、ハイブリッド形成し、洗浄し、オートラジオグラフを行った。全 ての実験は２人の研究者が鼎立にオートラジオグラフを解釈するコード下に行わ れた。 ＡＵＳＲＩＡ　ＩＩによるＥＩＢｓＡｇに対して陽性或いは陰性のいずれかであ る一連の対照試料はハイブリッド形成によるＨＢｖ　ＤＮＡに対してもそれぞれ 対応して＠性成いは陰性であった。臨床夾験室かもの数百個のランダムの或いは 未選別の標本においてはＡＵＳＲＩＡ　ＩＩＲＩＡが陰性であった場合にＨＢＶ 　ＤＮＡハイブリッド形成試験が陽性であった例は全くなかった。 ニー標識モノクローナル抗−ＨＢ５　ＩｇＭ（５Ｄ３）を用いたＲＩＡによって はＨＢＳＡｇに対して２５ 陽性であるが、しかし、　■−標標識多価−−ＨＢｓＡＵＳＲＩＡ　ＩＩ　）に よるＲＩＡによっては陰性である選別試料群におＡ″ＣＨＶＢ　［ｐ］ＤＮＡハ イブリッド形成を行った。７個の試料中３個は分子ハイブリッド形成によりＨＢ Ｖ　ＤＮＡに対して陽性であった。臨床実ｗ室からのランダムの試料と異り、５ Ｄ３抗−ＨＢ５　ＲＩＡ（１１０ち、ＮＡＮＢつ４　Ａ／　Ｘ蛋臼質）テ検出さ れたＨＢｓＡｇ−関連抗原活性を含有するこれらの試料の幾つかは又、＊製ＨＢ Ｖ−ＤＮＡとの分子ハイブリッド形成により検出されるｌ１ＢＶ−ＤＮＡ−関連 配列（即ち、ＮＡＮＢウィルスＤＮＡ　）も含有した。 ＡＵＳＲＩＡ　Ｉ［によるＨＢＳＡｇに対しては陰性であるが、しかし、モノク ローナル抗−ＨＢｓＡｇに対しては陽性の血清が又ＨＢＶ−関連ＤＮＡ配列に対 しても１−性である確率をめるために先にモノクローナルＲＩＡＫよりＩ＃徴付 けられた３６個の選ばれた試料及び追加の試料をコード下においてＨＢＶ　［３ ２ρ：ｌ　ＤＮＡによりハイブリッド形成した（表４）。 表４は臨床清報と共に各種のＲＩＡを含むその他の試験からのデータン掲げてい る。ＨＢａＡｇに対してモノクローナル抗−ＨＢｓ１用いて＠性であるが、しか し、多価抗−ＨＢｓを用いては陰性である異った個人からの試料である３６試料 中の合計１３個（３６％］は組換え−クローン化及び再精製ＨＢＶ　ＤＮＡを用 いたハイブリッド形成によってはＨＢＶ　ＤＮＡ配列に対して陽性であった。こ れらの個人のうち急性又は慢性肝炎ン有する３人の患者、４人の血液供給者（そ のうち２人はそれらの血液の受血者に肝炎を伝染させると思われた）、及び６人 のＨＢＶ感染が風土病であるモー二ントン島から孤立した人口のオーストラリア 原住民であった（　Ｍ　３参照）。 考察 本例においては、モノクローナルＲＩＡは抗−Ｈａｇ過剰の存在において形成さ れたＨＢＳＡｇ−抗−ＨＢ５免疫複合体におけるウィルスエピトープに結合する 能力を有する。この現象に対する可能性のある説明は＝１３ｉ％アフィニティー モノクローナル抗−Ｅ［ＢＳはそれらの決定子に対して自然発生抗−ＨＢｇより も一層有効ｌＣ朔合し得る。或いはｉ）これらの抗体は多価抗−ＨＢ５過剰の存 在下において未占有決定子に接近し得る。即ち、多価抗−ＨＢ５は、５Ｄ３，５ Ｃ３及び５Ｃ１ｌモノクローナル抗体の免役学的特性については僅かに少量の抗 体を含有し、仮に免疫原性がＨＢｌｉＡｇ関速決定子に向けられたものであって も、これらのモノクローナル抗体との免疫学的反応性の領域は、多価抗血清に存 在するそれケ越えるものである。 その様な現象はモノクローナルＲＩＡによる免疫汲合・体におけるＨＢＳＡｇの 検出なり能くするものであるが、これに対して通常の抗−ＨＢｓ抗体は抗−ＨＢ 、Ｓｉ％１の条件下において何等の結合活性も示さない。 その様な活性は過−！Ａ１抗−ＨＢｓの存在下にょるＨＢｓＡｇの検出を説明し 得るものであるがＣ表４、症例１及び９〜１３）、抗−ＨＢｓ陰性でもあるＡＵ ＳＲＩＡＩＩＩＣよるＨＢｓＡｇに対して陰性である患者において観察される陽 性結合活性に関しては更に考察が必要であるＣ表４症例２〜８）。これらの結果 の幾つかは。 本例及び前記例にお＾て示されたＨＢｓＡｇ−関連決定子に対するモノクローナ ルイムノアッセイの増大した感度により説明することができる。更に、ある患者 におけるｆＩＢｓＡｇは抗−ＨＢｓ等洒或いは過剰の条件下に循環する免疫複合 体に存在する可能性があり、又ここで示されたようにモノクローナルＲＩＡによ ってのみ検出可能なもので牟る。 モノクローナルＲＩＡによってはＨＢＳＡｇに対して陽性であるが、しかし多価 ＲＩ　Ａ　（ＡＵＳＲＩＡ　ｎ　）　Ｋよっては陰性である血清試料の３６％に 存在するＨＢＶ　ＤＮＡ反応配列において、これらの結果は、ＨＢＶ　ＤＮＡＫ 関連或関連類似のＤＮＡ配列はそれらの試料中に存在することを示している。こ れらの選ばれた症例の他にＡＵＳＲＩＡ　ｎ　ＲＩＡにょるＨＢｓＡｇに対して 陰性のヒト血清とのハイブリッド形成はこれまでに検出されていない。従って、 不知見は生物学的に偽陽性の結果を表わすものではない。 免疫活性物質及びハイブリッド形成可能なりＮＡ配列の両者の存在は、これらの 試料中の相当な割合におけるＮＡＮ　Ｂウィルスの存在に対する確証円なａｉＥ 拠を与える。血清中におけるＨＢＶマーカーが市販のＲＩＡにより検出されなか った状況下における両方の試験について陽性の結果が見出された（症例２−７％ 表４）。 該検者の血清が市販のＡｂｂｏｔｔ千ットによリットｓＡｇ。 抗ＨＢｓ及び抗ＨＢｃに対して陰性であった状況下においてヒト肝戴匍胞瘤組誠 において一陣化ＨＢＶ−ＤＮＡが報告されていることに注意すべきである［Ｃ− Ｂｒｅｃｈｏｔ、等Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、ｌ、　４９９　（抜粋９Ｂ）。１９ ８１年及びＣ−Ｂｒｅｃｈｏｔ等Ｈｅｐａｔｏ−１ｏｇｙ　２．補遺２７Ｓ−３ ４３，１９８２年、これらは本発明において準用する〕。 ＲＩＡ％ＨＢＶ−ＤＮＡハイブリッド形成化及び抗体特異性は上記列１〜３にお いて説明した通りである。 感染性幼児 二匹のテンノぞンジーに、輸皿により「非−Ａ型、非−Ｂ型」肝炎を伝染すると 診断された個人から得られた１ｍｌの血清を接種した。もう１つのチンパンジー は先に「非−Ａ型、非−Ｂ型」肝炎ケ受面者に伝染することが示され７：４０ｍ １ｄ固因子＃−物、が注射された。最後のチンパンジーは「非−Ａ型、非−Ｂ型 」肝炎作用因子が潜伏する疑いのあるもう１人の個人からの１ｍｌン接橿した。 逐次研究ケ行＾、血清中の免役反応性を逐次４つのモノクローナル抗−ＨＢｓで 測定し、ＲＩＡを測定し、ＨＢｖ−関連ＤＮＡ配列の存在を分子ハイブリッド形 成分析により測定し、ＨＢＳＡｇＹＡＵＳＲＩＡ　ＩＩ　ＲＩＡＫ、Ｃす、かつ Ｂ型肝炎核抗原（抗−ＨＢｃ）及び抗−ＨＢｓに対する抗体により（各々Ｃ０Ｒ ＡＢ及びＡＵＳＡＢ　；　Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ−ｉｅｓ社、イリ ノイ州、北ノヵゴ）及び選ばれた試料についてはＡ型肝炎ウィルスに対するＩｇ Ｍ抗体（ＨＡＶＡＢ　；　Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）ＩＣよ り測定した。 結果 第６図は、凝固因子濃匈物により接種されたチンパンジーにおける観察結果を示 す。この動物は、以前にＨＢＶ感染から回復しており、接種時及び研死期間の間 抗−ＨＢｓに対してＱ性であっＬｏこのチンパンジーは従って現在認識され、定 義されているようなＨＢＶＷ＆染に対して免疫であった。肝臓損傷の第１の証拠 は、４０日目にＡＬＴ水準の７０ＩＵ／Ｌ（ｍｌ（３８ＩＵ／Ｌ　）の上昇を伴 うことで明らかになった。ＡＬＴ上昇はほぼ３５日間継絖した。免役反応性抗原 は４　Ｑ　ｍ　ｌの凝固因子濃ａ物の接種後のしばらくして低い力価で表われ、 その後循環血液から消失した０６４日目に血清中に５０ＣＰＭのベースラインか ら４０１ＯＣＰＭへのＩｇＭ抗−ＨＢｓ結合活性の顕著な上昇があった（Ｓ／Ｎ は約８０．ｎｔ＜２−１）。抗原血症は引続き血液中に５６日間存在したが、力 価は肝炎の消散と共に低下した。ＡＬＴ水準は７８日目までに正常値に達したが 、抗原は血液中に依然史１ｃ４２日間検出可能であったことは注目に値する。最 も重要なことは、ＡＬＴ水準の上昇が抗原血症及び／又（エウイルス血症の発生 にほぼ３０日間先立って表われたことであり、この様に６４日間のインキュベー クヨン期間のより詳細な説明を与える（例えば第１ＡＬＴ上昇後２４日）。 次いで血液中の抗原の発現とＨＢＶ−関連ＤＮＡ１為イブリッド形成可能配列の 存在との間の相関関係が作られた。対照として、ＨＢＶ−関連核酸配列は分子ハ イブリッド形成分析によってインキュベークヨン期間には検出されなかった。こ れに対して、抗原力価における上昇とＨＢＶ−ＤＮＡプローゾにハイブリッド形 成した核酸物質の存在との間には顕著な相関関係があり。 ヴイリオンが循環血液中に放出されたことを示唆した７ （ａｌ！’、７図）。その他のＨＢＶ−関連エビトープについては５０３或いは ５Ｃ１ｌ決定子は１工Ａにより血清中には検出されなかった。この観察はＮＡＮ ＢウィルスがＨＢ”■とは抗原的に区別されるものであることを゛示す。最後に 、多価抗−］１ｌＩＢＳ！ｆｒ、体（ＡＵＳＲＩＡ、ＩＩ　）’＆用いるＲＩＡ は感染の最中に未反応性であり、抗−ＨＢｃ及び抗−ＨＡ抗体は検出不可能であ った。 第８図は、「非−Ａ型、非−Ｂ型」作用因子を保有する１ｍｌの血清を接種され た既存の抗−ＨＢを有する第２のチンパンジーの臨床的及びウィルス学的経過を 示すものである。第６図とは対照的に観察期間内においてＡＬＴレベルの上昇は 見られない。インキュペーノヨン時間はほぼ１９０日と判断された。しかしなが ら、ＩｇＭモノクローナルＲＩＡのピーク結合活性により反映された抗原血症の 水準は実に印象的なことであった（Ｓ／Ｎユ１７５）。抗原血症の期間シエ長引 き（約６５日）、抗原木遣は２６０日目までに検出されなくなった。第６図に示 された第１のチンパンジーと同様に％ＨＢＶ−関連ＤＮＡ配列はインキュベー７ ヨ゛ン期間中未検出であったが、モノクローナルＩｇＭＲＩＡ結合活性のピーク においてはＨＢＶ−ＤＮＡハイブリッド形成により存在した。更に、他のＩ’Ｉ ＢＭ関連エピトープはモノクローナルＲＩＡ並び［ＨＢＩｍＡｇ（ＡＵＳＲＩＡ 　Ｉｔ〕、抗−Ｈｌｌｃ及び抗−ＨＡ抗体によって決定されたように不存在であ った。 第９図及び第１θ図は、「非−Ａ型、非−Ｂ型」肝炎の伝染する疑いがもたれた もう１人の１−人から得られた各１ｒｎｔの血清を接種された最後の２匹のチン パンジーの臨床的及びウィルス学的経過？示すものである。第９図において、Ａ ＬＴ上昇において示される肝臓障害の証拠は５０日目に明らかとなり、再発パタ ーンをもって１４０日間継続した。抗原血症は９２日目に表われた。しかしなが ら、抗原力ｆｉｌ［＋は１３０日目迄には低下し、１８０８０日目未検出水弟に 到達した。 モノクローナＡ／ＲＩムによるピーク結合活性の大きさは、先の研究において観 察されたものよりも小さかったＣ８／Ｎユ１０）。抗−Ｈａｓが接種時或いは肝 炎感染及び回復の際に存在しなかったことが注目されるべきである。第６図に示 されたチンパンジーと同様にＡＬＴ水準に訃ける上昇が血液中の抗原の出現に約 ５０日間先立つ。ＨＢＶ−関連ＤＮＡノ為イブイブリッド形成可能配列検出不可 能であり、その他のＨＢＶ−関連エピトーゾ、ＨＢｓＡｇ、抗−ＨＢｃ及び抗− ＨＡ抗体も見られなかった。 第１Ｏ図は同一血清な接種された第２のチン、ｅンジーを示す、、第９図に見ら れたパターンと対照的に、ＡＬＴ上昇は存在しなかった。これは第８図において 見られたノセターンと同様であった。３個の明確な抗原血症の突出部（スノぞイ ク）が見られ、最も高い値は１６４日目１Ｃ発生していた。ＨＢＶ−関連ＤＮＡ 配列は抗原血症のどんな期間中にも検出可能ではなかつ亀このチンパンジーは又 ＨＢＳＡｇ、その他のＨＢＶ関連エピトープ、抗−ＨＢｃ、抗−ＨＢｓ（感染前 、甲。 及び後）及び抗−ＨＡ抗抗体対して陰性であった。。 本例においては、例１〜３の技術により同定された作用因子がチンパンジーにお けるウィルス肝炎の感染研究により感染性を有するものであることが示される。 この様に、ヒトにおける知見（例３、表４参照）を非Ａ型、非Ｂ型肝炎の容認さ れＴ−実験動物モデルにおムて再現することが可能であった。本例における主た る観察事項は次のものが挙げられる： １）４匹の動物に注射された３種の異なった接種物は感染性である：２）感染性 物質の接種から血液中のウィルス酸＾はウィルス蛋白質の出現までの時間と定義 されているインキュベークヨン期間は従来認識されたものよりも艮ｈ；　３　） 　Ａ　Ｌ　Ｔ上昇が抗原血症の出現よりも数週間前に表われる：４〕抗原血症は ＡＬＴ上昇の不存在下において生じ得る。ヒトにおいて見られたモｆ）と同一の 現象；５）モノクローナルＩｇＭ抗−ＨＢ　ＲＩＡにより測定された血液中の抗 原の存在は、ＨＢＶ−関連ＤＮＡ様配列の分子量ハイブリッド形成分析による出 現とよく相関関係がある；６）抗原血症及び／又はウィルス血症の期間は数週間 〜数ケ月継続して通常回復と共に消失する；７）抗原血症はＡＬＴ水準が正常で ある場合病気の消失期においてもなお検出可能であり、これはヒトにおけるＨＢ Ｖ感染と同様である；８）感染の経道中に数段階の抗原血症が生じ得る；９）既 存の抗−ＨＢ５は保護的（防御的］ではなく従ってＮＡＮＢウィルスはＨＢＶと は抗原組成において十分に異るものである。この考えを支持するもσ）として５ 異ったＨＢｓＡｇ関連エピトーゾ？！−認識する多動抗−ＨＢｓ抗＃（ＡＵＳＲ ＩＡ　ｎ　）及びその他の七ツクローナル抗−ＨＢ５は未反応性であると一つ知 見がある。これらを合せ、及び前記具体例より、多くの状況において、ＮＡＮＢ 肝炎作用因子はＢ型ウィルス肝炎に関連してはいるかもしれないが、ｉｌｉれた 或Ｖｓは明確な変種（変異型）であると−５強い証拠が与えられている。 以上１本発明を十分に説明したが、不発明或いはその如何なる実施態様の趣旨或 いは範囲に影響を及ぼすことなくその方法、試験方法、組成物、操作及び過程の 広範囲且つ同等の範囲において本発明を実施され得ることは当業者に：明らかで あろう。 浄書（内容に変更なし） ｉＬ芳 ＦＩＧ、３ ５Ｄ３　△　［）　Ｄ　Ｂ　Ｃ ｆ）７０−フルＩ几−Ｈａｓ（ｍｇ／ｍｌＩ＋０　２０　３０　４０　５０　６ ０　ｔｏｏ　１１０　１２０ａ手又 ＦＩＧ、６ 日平叉 ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、８ ０１５０　１６５　１８０　１９５　２１０　２２５　２４０　２５５　２６０ 日子文 ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、　１０ ・　臼Ｉ久 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８３１０１４１２ ２、発明の名称 非Ａ型、非Ｂ型肝炎ウィルス、同定方法、精製、特徴付け、診断及び免疫化 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ザ　ゼネラル　ホスピタル　コーポレーション昭　和　５９年　７　月　１２日 （発送日　昭和５９年７月１７日） ６、補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の国際調査報告 ｌ崗能ｎｏｎａｌ　Ａｏａｌｌｃｓ［＋＋ｎ　Ｉｌａ、　ｐｃＴ／υＳ＋１１３ １０１４１．２Ｉｎｔｅｒｎｍｅ＋＋＊ｌ　Ａ＋ｌｐＨｃｍｏ＋＋　Ｎ。、に” ／ＩＥ８３１０１４１２’Ｔ／ＵＳ８３１０１４１２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．未弱褐化或いは活性形聾において、下記の・特注を胃することを背気とする 弱毒化或いは不活化形標のＤＮＡウィルス： Ａ）２ＸｌＯダルトンより太き＾分子瓜；Ｂ）ＩｇＭ抗−ＨＢｓモノクローナル 抗体ｓＤ３に対する実質的な免疫反応性； Ｃ）則胞糸仇ＡＴＣＣＣＲＬ　８０１８から得られた抗−ＨＢｓＡｇモノクロー ナル抗本に刈する央負釣な無免役反応性； Ｄ）該ＤＮＡウィルスの濃度増大と共に増大するポリクローナルＩｇＧ抗−ＨＢ ｓＡｇ抗体に対する（一度依存性免役反応性； Ｅ）５Ｄ３　ＩｇＭ侃体の存在下におＶｌて、兎投電子冊ｆｉＩ！林により覗祭 さねた際の個々の粒状形沙：Ｆ）厩ウィルスのＤＮＡがＢ型肝央ウィルスからの Ｄ　Ｎ　Ａと部分的相同を示すこと；及びＧ）該ＤＮＡウィルスが、チンパンジ ーにおいて非Ａ型、非Ｂ型肝炎の特性を仔する感染性を示すこと。 ２、　更に次の特性を有する請求の軸囲第１項６ピ砥σンＤＮＡウィルス： Ｈ）−剖胞系玩Ａ、ＴＣＣＨＢ−８１７０から欅られた抗−ＨＢｓＡｇモノクロ ーナル抗体に対する実値Ｂ９な２ 免役反応性。 ３、その活性化或いは未羽毒化形傅において、史に次の特注を有する請求の範囲 第１項記載のＤＮＡウィルス： Ｉ）ａｔｌｌ砲系統ＡＴＣＣＨＢ−８１１７から得られた抗−ＨＢ５Ａｇモノク ローナル抗体に対する実質的な無免役反応性。 ４、その活性化或いは禾弱壽化形帖におＶｌて、史に次の特性を有する請求の範 囲第１珀記、或のＤＮＡウィルス： Ｊ）５Ｄ３　ＩｇＭＫ体でイムノアフィニティー栢製をした場合に、約５０，０ ００％約２３．０００及び約２０，０００未満σ）分子檜におけるバンドよりな る、ドブクル硫寂ナトリウムポリアクリルアミドゲル上におけるポリペプチドプ ロフィル。 ５、ある試料から、非Ａ型−非Ｂ型肝炎の原因であるＤＮＡウィルス或いはそれ に由来するウィルス缶口′Ｍを偕侠する方法であって、 該ウィルス酸Ｖ）は蛋白メと共に不糾化匿のその他のウィルス酸Ｉ／１は非ウィ ルス成分をよんでなる該試料を該ＤＮＡウィルス或いはウィルス蛋白質と実質的 に免疫反応性を有するが、しかし該その他の成分とは実質的に免疫反応性を有さ ないモノクローナル抗体と接触させ、 該ＤＮＡウィルス或いはウィルス蛋白質を該モノクローナル抗体に選択的に結合 させ、及び該ＤＮＡウィルス或いはウィルス缶口質を該モノクローナル抗体から 除去することを特徴とする方法。 ６、該モノクローナル抗体が、ＩｇＭモノクローナル抗捧である請求の範囲第５ 項記載の方法。 ７、　該抗体が５Ｄ３６．いは細胞系仇ＡＴＣＣＨＢ−８１７０から得られたも の或いはそれらの組合せである請求の範囲第５項記載の方法。 ８、該モノクローナル抗体が不浴性固相上に固定化されている請求の範囲第５項 、第６項、又は第７項記載の方法。 ９、該試料が動物血清である請求の範囲第５項、第６項、又は第７項記載の方法 。 １０、該動物がヒト或いはチンパンジーである請求の範囲第９項記載の方法。 １１、該試料が該ウィルスを産生する微生物の発酵培誉液である請求の範囲第５ 項、第６項、又は第７項記載の方法。 １２、ＮＡＮＢ肝炎産生ウィルスを試料中に構出する方法であって。 Ａ）該試料中に該ウィルスの存在を確認する工程。 及び Ｂ）該ウィルスをＢ型肝炎ウィルスから区刈する工程、 を含んでなることを特徴とする方法。 １３６　該工程Ａ）がイムノアッセイにより行われる請求の範囲第３項記載の方 法。 １４、該イムノアッセイが該ＮＡＮＢウィルスに対する免疫反応性を有するモノ クローナルＩｇＭ抗体を用いて行われる請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、該ＩｇＭ抗体が５Ｄ３、或ｖｓ　ＩｔＺ　ａ胞系統ＡＴＣＣＨＢ　−８１ ７０から得られるものである請求の範囲第１４珀記載の方法。 １６、該ＩｇＭ抗体が５Ｄ３である請求の範囲第１５項記載の方法。 １７、　該イムノアッセイ法がすンドイッチイムノアッセイである請求の範囲第 １４項記載の方法。 １８、該ブンドイッチイムノアッセイが、第１の固相結合ＩｇＭモノクローナル 抗体及び第２の検出可能に標識化されたＩｇＭモノクローナル抗体を利用する請 求の範囲第１７項記載の方法。 １９、該モノクローナル抗体が共に５０３である請求の範囲第１８項記載の方法 。 ２０、該工ＨＡ）がＤＮＡハイブリッド形成である請求の範囲第１２項記載の方 法。 ２１、該ハイブリッド形成工程が、該ＮＡＮＢウィルスからのＤＮＡと検出可能 に標識化されたＨＢＶ或いはＮＡＮＢウィルスＤＮＡ−由来プローブとの間にお いて行われる請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、該検出可能に標識化されたＨＢＶ或いはＮＡＮＢグローブか　ＰＫより標 識化されている請求の範囲第２１項記載の方法。 ｎ、該工程Ｂ）がイムノアッセイにより行われる請求の範囲第１２項記載の方法 。 ス、該イムノアッセイが、ＨＢＳＡｇに対して免疫反応性を有するが、しかし、 ＮＡＮＯウィルスに対しては免役反応性を有さないモノクローナル抗体を用いて 行われる請求の範囲第２３項記点の方法。 部、＃モノクローナル抗体がａＩａ系統ムＴＣＣＣＲＬ８０１８から得られたＩ ｇＭ抗本である請求のＱ口笛２４項記載の方法。 が、該モノクローナル抗体がａ砲系玩ＡＴＣＣＨＢ−８１７１から得られたＩｇ Ｇ抗体である請求の範囲第２４項記載の方法。 ２７、該工８Ｂ）がＮＡＮＢウイルスボリペグチド類のボリアクリルアεドゲル ／８ＤＳ電気泳勧により行われる請求の範囲第１２項記載の方法。 部、該工程Ｂ）がチンＩぞンジーにおける該ＮＡＮＢウィルスの感染特性に従っ て行われる請求の範囲第１２項記載の方法。 器、該工程Ａ）が、共に５０３である第１の固相結合ＩｇＭモノクローナル抗体 及び第２の検出可能に標識化すれｒｓ　Ｉ　ｇ　Ｍモノクローナル抗＃−を用い ろアンドイツチイムノアツセイよりなり、該工程Ｂ）が、ＡＴＣＣＣＲＬ　８０ １８及びＡＴＣＣ）ＩＢ−８１７１よ６ りなる群から選ばれたａ＠糸系統ら得られたモノクローナル抗体を用ｉるイムノ アッセイよりなる瑣末のａ作画１２項記載の方法。 ３０、該試料が動物から得られた血清或いは血液である請求の範囲第１２項記載 の方法。 ３１、該動物がヒトである請求の範囲第３０珀記載の方法。 ３２、該試料が仮櫓血ヒト血液である請求の範囲第３１項記載の方法。 ３３、その中Ｋ１以上の容器手段を受け入れるように画室化されたキャリヤーよ りなる、試料中のＮＡＮＢ肝炎−産生ウィルスの検出に仔甲なキットであって。 該ＮＡＮＢウィルスに対する免疫反応性乞有するモノクローナルＩｇＭ抗本を＠ 有する第１　ｆ）容器、及びＨＢｓＡｇに対しては免役反応性を有するが、しか し、該ＮＡＮＢウィルスに対してを工免役反応性を有さないモノクローナル抗体 を富む第２の容器をよむことを特徴とするキット。 ３４、更に、検出可能に標識化されたＨＢｖ或いはＮＡＮＯ−ＤＮＡプローブを 含む第３の容器をきむＪ青水の尭口笛３３項記載のキット。 ３５、更に、ＩＩＩＩｌｓＡｇｌＣ対しては免疫反応性を有するが。 しかし、該ＮＡＮＢウィルスに対しては免疫反応性を有さな〃も５１つのモノク ローナル抗体を含有する容器手段をよむ請求の範囲第３３項又は第３４項記載の キット。 ３６．該第１０）容器手段中の該モノクローナル抗体が５Ｄ３．或いｊＸＡＴｃ ｃ　ＨＢ−８１７０，Ｃり選ばれた細胞系統から得られるものである請求の範囲 第３３項記載のキット。 ３７、該第２の容器手城中の該モノクローナル抗体がＡＴＣＣＣＲＬ　８０１８ 及びＡＴＣＣＨＢ−８１７１よりなる群から選ばれる細砲系仇かも得られる請求 の範囲第３３項記載のキット。 Ｘ、ａ−ｊａ−７”カＰ−標識化ＨＢ　Ｖ　ｉＬ／１％Ｘ　ＮＡＮＢ−ＤＮＡ７ ’ｃｌ−プである請求の範囲第３４項記載のキット。 ３９、免授原性的に活注盆の請求の範囲第１項記載のウィルスと免投原性的に不 活性なキャリヤーとよりなることを′件徴とするワクチン組成物。 栃、該ウィルスが不活化されている請求の範囲第３９項記載の組成物。 ４Ｌ　ａウィルスか弱毒化されている請求の範囲第３９項記載の組成物。 ４２、該ウィルスが生きている請求の範囲第３９項記載の組成物。