DK175364B1

DK175364B1 - Antigent syntetisk peptid, antigen polymer samt receptormolekyle

Info

Publication number: DK175364B1
Application number: DK198505165A
Authority: DK
Inventors: Richard A Lerner; Ann M Moriarty; Hannah Alexander
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1984-03-08
Filing date: 1985-11-08
Publication date: 2004-09-13
Also published as: FI854395A; FI854395A0; US5534405A; IL74544A; CA1340732C; EP0155147A2; NZ211357A; IL74544A0; US5183734A; FI86585B; JPS61502094A; EP0155147A3; NO172394B; NO854448L; AU4067285A; JPH0832721B2; DE3580927D1; FI86585C; NO172394C; AU594642B2

Description

DK 175364 B1 I

Den foreliggende opfindelse angår et antigent syn- I

tetisk peptid som angivet i krav 1, idet et foretrukkent I

sådant peptid er angivet i krav 2. Opfindelsen angår også I

en vandopløselig eller vanddispergerbar antigen polymer som I

5 angivet i krav 3 samt et receptormolekyle som angivet i I

I krav 4. I

I A. Kloning og vektorer

I Indførelsen af eksogent DNA i eucaryotiske I

I celler er blevet et af de mest magtfulde værktøjer for I

I 10 molekylærbiologen. Denne fremgangsmåde, kræver effek- I

I tiv afgivelse af DNA*et i kærnen i modtagercellen og

I efterfølgende celleidentificering, der udtrykket det I

I fremmede DNA. I

I Manipulerede vektorer, såsom plasmider eller I

I 15 bakteriofager (fager) eller anden DNA-sekvens, som er I

I i stand til at replikere i en værtscelle kan anvendes ‘ I

I til at konstruere celler, der fungerer som fabrikker I

I der fremstiller store mængder af specifikke virale pro- I

I teiner. Rekombinante· plasmider vil her blive anvendt I

I 20 som eksempler på vektorer, også kaldet kloningsvehikler, I

I jf.. US patentskrift nr. 4.338.397. I

I Plasmider er ekstrachromosome genetiske ele- I

I menter, der findes i en række forskellige bakteriearter. I

I De er typisk dobbelstrengede, lukkede, cirkulære DNA- I

I 25 -molekyler. Det mest almindeligt anvendte plasmid er I

I pBR322, en vektor, hvis nucleotidsekvens og endonucle- I asespaltningssteder er velkendte.

I Nucleinsyreproduktion ved hjælp af plasmid- I * eller fagvektorer er blevet meget nem. Plasmid- eller I fag-DNA spaltes med en restrlktionsendonuclease og for- I enes in vitro med et valgt fremmed DNA. Det fremkomne I rekombinante plasmid eller fag indføres derpå i en cel- I le såsom E.coli, og den således producerede celle brin- I ges til at producere mange kopier af den konstruerede I vektor. Når først der er produceret en tilstrækkelig I DK 175364 B1 i mængde DNA af klonings vektoren, udskæres det produce-re- ^e fremmede DNA og anbringes i en anden vektor, så at der produceres eller transcriberes det protein eller polypeptid, som det fremmede gen koder for.

5 Afhængigt af DNA'et (intakt gen, cDNA eller

bakterielt gen) kan det være nødvendigt at tilvejebrin- I

ge eucaryotiske transcriptions- og translationssignaler for at styre ekspressionen i modtagerceller. Disse sig-

naler kan tilvejebringes ved at kombinere det fremmede I

10 DNA in vitro med en ekspressionsvektor. I

B Ekspressionsvektorer indeholder DNA-sekvenser, I

der er nødvendige for transcription af klonede gener og I

translationen af deres meddeler RNA’er (mRNA*er) til I

B proteiner. Typisk er sådanne nødvendige sekvenser el- I

15 ler styringselementer: (1) en promotor, der signalerer I

I transcriptionsstartpunktet, (2) en terminator, der sig- I

nalerer transcriptionsslutpunktet, (3) en operator, der I

regulerer promotoren, (4) et ribosombindingssted for I

I den indledende binding af cellernes proteinsyntesemaski- I

B 20 neri og (5) start- og stopcodoner, der signalerer be- I

B gyndelse og afslutning af proteinsyntese. I

B For at kunne anvendes skal en ekspressipnsvek- I

B tor besidde flere yderligere egenskaber. Den skal være I

B forholdsvis lille og indeholde en stærk promotor. Eks- I

B 25 pressionsvektoren skal bære en eller flere valgbare mar- I

B kører, der tillader identificering af transformanter. I

B Den skal også indeholde et genkendelsessted for et eller I

B flere restriktionsenzymer i sådanne regioner i vektoren, I

B der ikke er væsentlige for ekspression. I

B 30 Konstruktionen af ekspressionsvektorer er der- f I

B for et kompliceret og noget uforudsigeligt foretagende. |

B Den eneste virkelige prøve på en ekspressionsvektors ef- I

B fektivitet er at måle den hyppighed, hvormed syntesen I

B af det rigtige mRNA igangsættes. Imidlertid er mæng- I

B 35 debestemmelse af mRNA langsommelig, og det er ofte van- I

B skeligt at opnå nøjagtige målinger. Der er derfor Ble- I

DK 175364 B1 I

3 I

O I

vet udviklet andre mere praktiske midler til påvisning I

af transformation. I

Et af disse midler har været at overvåge syn- I

tese af fremmede proteiner i transformerede celler med I

5 enzymatiske prøver. Der er udviklet adskillige markør- I

gener til påvisning af, at transformation er indtruffet, I

I Et andet middel, der anvendes til at overvåge I

I transformation, indebærer anvendelse af immunologiske I

I reagenser. Hvis niveauet af udtrykt protein er tilstræk- I

I io kelig højt, kan der anvendes cytoplasmid- eller overfla- I

I defluorescens med et antistof konjugeret til et fluore- I

I scerende farvestof såsom fluorescein eller rhodamin til I

I at påvise vektor-specifikke proteinekspressionsprodukter. I

I Hyppigere dyrkes transformerede celler i nær- I

I 15 vær af radioaktivitet efter immunfældning. Ved denne I

I løsning anvendes Staphylococcus aureus-protein A-udvæl- I

I gelse af immunkomplekser [Kessler, J. Immunol. 115, 1617- I

I 1624 (1975)] og Western aftryksmetode [Renart m.fl., I

I Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3116-3120 (1979] til at I

I 20 påvise transformationsspecifikke markører. I

I Analyse af genekspression ved hjælp af Simian- I

I virus-40-(SV40)-vektorer er langt den mest udforskede eukaryotiske transformationsteknik på biologisk og im- I munkemisk niveau. Genetisk og biokemisk information I 25 vedrørende indretningen af SV40-genomet er blevet kon- I stateret eller bekræftet af nucleotidsekvensen i det vi- rale genom. Oversigt gives af Tooze i Molecular Biology of Tu- I mor Viruses, 2. udg., del 2, Cold Spring Harbor, New York I ^ (1980). Planen over forskellige SV40-vektormolekyler 30 er baseret på den nøjagtige kortlægning af genetiske sig- naler og anvendelsen af restriktionsendonucleaser til I isolering af afgrænsede fragmenter fra SV40-genomet.

I SV40 blev til at begynde med udviklet som I en eukaryotisk-transducerende vektor ved hjælp af et 35 lytisk system, Mulligan m.fl., Nature (London), 277, I 180-114 (1929). Derefter blev transformerende (ikke- I DK 175364 B1

Hq H lytiske) vektorer konstrueret med isolerede segmenter af H SV40-genomet. Oversigt af Elder m.fl., Annu. Rev. Genet.

H 15, 295-340 (1981).

H Hamer m.fl. var de første, der foreslog, at H 5 SV40 kunne anvendes til at klone gener, hvortil der ikke H fandtes nogen probe. De foreslog, at dobbeltstrengede H cDNA-kopier fra en heterogen mRNA-*population kunne "short- H gunnnes" ind i en SV40-vektor, og virus, der bar den øn- skede sekvens^ kunne identificeres ved hjælp af et radio- H 10 aktivt eller fluorescerende antistof.

H Hamer m.fl. rapporterer som de første konstruk- H tion af en SV40-rekombinant-ekspressionsvektor, der in- H deholder en ekspressionsmarkør, i 1979. Hamer m.fl., Cell H .17, 725-735 (1979). Deres SV40-vektor indeholder de H 15 virale DNA-sekvenser fra BamHI-endonuclaserestriktions- H stedet ved 0,14 kortenheder med uret til Haell-restrik- H tionsstedet ved 0,82 kortenheder. Foruden hele det tid- H lige gen A og viral-DNA-replikationsoprindelsen indehol- H der vektoren den virale promotor, fører, indskudt sekvens, H 20 kroppens 5'-del og 31-endestillede sekvenser for det vi- I rale sene 195 mRNA. Den indeholder ikke 1660 basepar (bp) i de sene regionsekvenser, der koder for det virale pro- I tein UPI, 2 og 3. Priers m.fl., Nature 273, 113-120 (1978) I og Reddy m.fl., Science 200, 494-502 (1978).

25 Kanin-B-globifi—genkodningssekvenser ligatere- res ind i den ovennævnte vektor som ekspressionsmarkør.

For at bestemme, om kanin-Ø-globin syntetiseres i abe- I celler inficeret med deres rekombinant vektor, anvender

Hamer m.fl., supra, en radiommunanalyse, der kan påvise 30 helt ned til 1,0 nanogram globin. 1 I Selv om Hamer m.fl. er i stand til at påvise positive beviser for β-globinekspression, udtrykker de flere forbehold med hensyn til anvendeligheden af SV40/ β-globin-rekombinant-systemet. For det første, efter- 35 som globin kun er ringe opløseligt, kan der opstå betyde- I lige tab under fremstillingen af prøver til måling. Så-

DK 175364 B1 I

i

ledes kan mængdebestemmelsen af globin i de inficerede I

celler være helt op til 10-foldig forkerte. For det I

andet kan analysen ikke skelne mellem autentisk globin I

og andre dermed immunologisk beslægtede produkter, så- I

5 som gennemlaesningsprotein- eller polypeptidfragmenter. I

En faktor, som Hamer m.fl. ikke beskæftiger I

sig med, er den høje grad af homologi mellem alle euka- I

ryotiske globiner. Denne homologi gør det vanskeligt I

at skelne vektor-induceret globinekspression fra glo- 10 bin, der er endogent i værtscellesystemet.

B. Hepatitis B-viruspeptider og anti-polypeptid- I

-antistoffer I

Hepatitis-viraene er udpræget anderledes mid- I

ler. De grupperes strengt sammen ved hjælp-af det "mål"- I

15 organ, de påvirker, leveren. Selv om et antal vira på- I

virker leveren som en del af systemiske infektioner, op- I

I fattes udtrykket "hepatitis vira" i reglen som type A

I (HAV) , type B (HBV) og ikke-Arikke-B-midleme. Af de I tre typer vira er HBV langt den mest udforskede på biolo- I 20 gisk immunkemisk og klinisk niveau.

I HBV er klassificeret som et DNA-virus og ad- I skiller sig i mange henseender fra alle andre familier af I DNA-vira. HBV er sammensat af et ydre dække (mere hånd- gribeligt end en membran eller omhylning) bestående af 25 protein, lipid og carbonhydrat og med et særegent anti- I genkompleks, dvs. hepatitis B-overflade-antigen (HBsAg).

I Det indeholder også et indre-nucleocapsid med en entigen I specificitet, der adskiller sig fra overfladeantigenets, I dvs. hepatitis B-kerneantigen (BHcAg).

I 30 Et opløseligt antigen HBeAg kendes også inden for dette område. Dette antigen menes at bestå af I HBcAg-polypeptider, som ikke er samlet i HBV-kerner og I følgelig har en særegen antigen specificitet i ikke-sam- I let tilstand.

35 Ved typiske selv-begrænsende akutte HBV-infek- I tioner forekommer følgende serologiske markører i række- I DK 175364 B1 H ° H følge i en inficeret værts serum: HBsAg, HBeAg, anti-HBC, abtu-HBE og anti-HBS. Forekomst af anti-HBE isgnalerer endeligt tab af påviseligt HBsAg. Dette gælder i alle tilfælde af selv-begrænset akut HBV-infektion. Efter BBS's for- 5 svinden går der fra nogle få uger til flere måneder før H anti-HBS fremkommer.

Under kronisk HBV-infektion forekommer HBsAg og anti-HBC. Værtsserummet kan vise enten HBeAg- eller anti-HBE-serologiske markører, dvs. patienten kan være 10 enten HBeAg- eller Anti-HBE-positiv.

Følsomme og specifikke radiommunanalyser og enzymimmunanalyser for adskillige af HBV-markørerne an-

vendes i vidt omfang. Disse stærkt følsomme serologiske I

prøver udgør en basis for overvågning af tilsynekomst I

H 15 af virus- og immun-reaktionsmarkører under forløbet I

af HBV-infektion. I

Η I de seneste ar har man ge undersøgelser vist, I

at hver serologisk markør tilkendegiver specifikke vira- I

le fænomener for værtsreaktioner under HBV-replikation. I

20 Serologiske markørers profil i de forskellige stadier I

under det kliniske sygdomsforløb kan således give nyt- I

tig diagnostisk og prognostisk information. I

I Forbindelsen mellem '-.hepatitis B-virus oo human I

hepatocellulær carcenom (HCC), levercancer, er blevet I

25 vidtgående undersøgt, og seroepedimiologiske samt histo- I

I patologiske fund tyder stærkt på, at HBV er direkte el- I

ler indirekte invovleret i levercancers ætiologi. Der I

er udledt en række hepatoma-ceIlelinier ud fra human HCC, I

I og påvisning af HBV-specifikt DNA integreret i genomet I

30 i to sådanne cellelinier PLC/PRF/5 og EPH3B er beskre- ' I

I vet. Imidlertid er kun hepatitis B-overfladeantigenet I

I i disse cellelinier udtrykt i vævskultur som et virus- I

I specifikt genprodukt. Andre HBV-markører, såsom hepa- I

titis B-kerneantigen, hepatitis BE-antigen og en DNA- I

35 -polymerase er ikke blevet påvist. I

I Nogle DNA-tumorvira hos dyr kan producere I

mmm^mmnmmm.·....... ^ *'*$>( -1lfc?ii»J.«gg?!PPl|

DK 175364 B1 I

I 7 I

lo I

I transformation via funktion af virale gener, som reguL I

I lerer replikationen og integrationen af det viral genom, I

I og celler transformeret af sådanne vira kan bare et T- I

I (tumor)- eller neo-(nyt)-antigen udtrykt af de transfor- I

I · 5 merende gener. Nye beviser vedrørende et antigen, der I

I er analogt med T-antigen, er opnået i humane hepatoma- I

I ’ -celler indeholdende integrerede HBV-gener ved hjælp af I

I anti-komplement-immunfluorescerende farvningsteknik. Det' I

I te antigen er blevet betegnet HBV-associeret kerne-anti- I

I 10 gen (HBNA). Wen m.fl., Infect. Immun. 39, 1361-1367 I

I (1983). I

I HBNA er påvist i sera fra adskillige HBsAg-po- I

I sitive HCC-patienter, og ekspression af antigenet påvi- I

I ses i både cellekultur og tumorvæv. Desuden er der fun- I

I 15 det anti-HBNA-antistoffer i sera fra nogle HBsAg-positi- I

I ve patienter med HCC. HBNA kan repræsentere den tidli- I

I gere ikke erkendte ekspression af et HBV-gen. I

I I 1979 rapporterer Galibert m.fl. i Nature 281, I

I 646-650, nucleotidsekvensen i HBV-genomet, et cirkulært I

I 20 DNA på ca. 3200 baser, som er delvis dobbelt- og delvis I

enkeltstrenget, et træk, der er enestående blandt vira. I

Genomets lange eller L-streng (fuldstændig cirkulær) vi- I ser sig at indeholde fire aflæsningsrammer, der er sto- I re nok til at gælde for virale proteiner. Disse regio- 25 ner betegnes S, C, P og X og vises skematisk i fig. 1 på I tegningen.

I Regionerne S og C har vist sig at indeholde I generne for hhv. HBsAg og HBcAg. Region P menes at ko- I de for et protein, der i størrelse og aminosyrerestind- 30 hold ligner en DNA-polyroerase. Region X hævdes af Wen m.fl. supra, at være en af de sandsynlige kilder for I genet, der koder for HBNA.

I Den rene forsøgsvise tildeling af funktioner for generne i regionerne P og X viser, hvor meget der I 35 stadig mangler i forståelsen af HBV's genetiske indret- I ning og molekylære biologi.' En årsag til denne manglen- I DK 175364 B1 de forståelse er; at der ikke findes et in-vitro-system til formering af virusset.

Indtil for nylig har den eneste HBV-kilde været serum fra humanpatienter. De mislykkede forsøg på at 5 dyrke virusset i cellekultur er en følge af det meget snævre værtscelle-udvalg.

En løsning på problemet med at producere HBV- -DNA og dets gen-produkter har været at anvende rekom- H binant DNA-teknologi. Denne teknologi gør en:industri- H 10 el produktion mulig af nucleinsyresekvenserne, der tøfl der for et særligt viralt protein.

Tiollais m.fl., Science 213, 406-411 (1981) H rapporterer transformation af E.coli med pBR322 indehol- H dende genet,.der koder for HBsAg,og rapporterer produk- 15 tion af signifikante mængder af det isolerede gen. Dis- H se forskere har også ønsket at undersøge HBsAg-genets lokalisering i HBV-genomet, og de faktorer, som påvirker dets ekspression til protein. For at kunne gøre dette har de konstrueret ekspressionvektorer, der indeholder 20 HBsAg-genet, til brug i både bakterielle og pattedyre- celler.

En af de ekspressionsvektorer, der er konstru- eret af Tiollais m.fl., supra, har opnået biosyntese af et protein i E.coli, som indeholder HBsAg antigene de- 25 terminanter. Det blev konstrueret^ ved at indsætte en del af det gen, der koder for HBsAg, i bakteriofagen I plac5-lUV5, så at naturligt HBV’s aflæsningsramme be- vares.

I For at undersøge HBV-genekspression i patte- 30 dyreceller har Tiollais m.fl., supra, konstrueret en ' række HbsAg-ekspressionsplasmider ved at indsætte trans- I fektionselementer på forskellige steder i hele HBV-ge- nomet. Transfektionselementerne tillod hele HBV-geno- I met at blive integreret i flere forskellige oriente- I 35 ringer ind i genomet i museceller, transformeret med I vektoren. Ved at skabe vektorer på denne måde har dis-

DK 175364 B1 I

se forskere forsøgt at anvende HBV's naturligt forekommen- I

de genetiske reguleringselementer. I

Kun tre af de seks ekspressionvektorer, som I

Tiollais m.fl., supra, anfører, producerer ekspression

5 af det ønskede HBsAg-protein. Dets produktion påvises I

ved at afprøve dets tilstedeværelse i vævskulturvæsker

ved anvendelse af fåre-anti-HBsAg-antiserum. De andre I

virale markører, der kendtes på undersøgelsestidspunk- I

tet, (dvs. HBcAg, HBeAg og. DNA-polymerase) blev ikke på-

10 vist i de transformerede celler. I

På tidspunktet for Tiollais m.fl.'s undersø- . I

gelse kendte man den mulige eksistens af region X, li- I

gesom også den mulighed, at den kan kode for et HBV-pro- I

tein. Det vil sige, at det var kendt, at HBV-genomet inde- I

15 holder evnen til at kode for flere proteiner, end man I

tidligere mente havde forbindelse roed virusset. I

Dette problem er blevet kaldt genotype i sø- I

gen efter phenotype. Det er dette problem bl.a., som I

I Wen m.fl. supra, beskæftigede sig med, når de hævdede, I

I 20 at region X indeholder genet, der koder for HBNA. I

I Før de ovennævnte studier af Tiollais m.fl. I

I og af Wen m.fl. har Sutcliffe m.fl. i Nature 287, 801- I

I 805 (1980) bla. påvist en almen teknik til løsning af I

I dette problem. De syntetiserer kemisk et polypeptid I

I 25 fra det protein, der forudsiges af nucleotidsekvensen i I

I et viralt gen, hvis proteinprodukt er ukendt. Der dyr- I

I kes antistoffer mod polypeptidetjog de reagerer mod al- I

I le proteinerne fremstillet af celler inficeret, med vi- I russet. Ved at anvende antistoffer mod dele af et for- I 30 udset protein har Sutcliffe m.fl. påvist et tidligere I ukendt og ikke erkendt viralt proteinprodukt.

I Indtil nu har anvendelsen af denne eller I enhver anden teknik, der utvetydigt identificerer HBV- I genom-Regions X's protein-produkt, ikke været omtalt.

I 35 Dette kan skyldes, at selv om den almene idé med at I fremstille syntetiske antigener og anvende dem til at I DK 175364 B1 H fremkalde antistoffer af forudbestemt specificitet har været beskrevet, er der stadig et stort område inden for denne teknologi, der fortsat ikke kan forudsiges.

Grundene hertil er flere. For det første H 5 er proteinaminosyrerestsekvenser, der afledes ud fra H en genetisk sekvens af hypotetisk natur, medmindre nu-' H c leotidsekvensaf læsnings rammen er nøje fastslået på H grund af den genetiske kodes omfang.

H For det andet fremkalder et syntetisk antigen H 10 ikke nødvendigvis antistoffer, som immunreagerer med det intakte protein i dets native miljø. For det H tredie immunreagerer en værts naturlige antistoffer mod H et immunogen sjældet med et polypeptid, som svarer til H en kort lineær del af immunogenets aminosyresekvens.

H 15 Et rekombinant DNA omfatter en ekspressionsvektor H bundet til genet, der koder for HBxAg. I et særlig foretruk- ket rekombinant DNA omfatter DNA-ekspressionsvektoren en H første DNA-sekvens omfattende den Simian virus-40-virale

DnA-sekvens fra BamHI-endonuclease-restriktionsstedet ved 20 basestilling 2468 i urets retning til Haell-endonucleasere- H striktionsstedet ved basestilling 767 ifølge tegningens fig. 2, og genet, der koder for HBxAg, tilvejebringes af en anden gen-DNA-sekvens, der omfatter hepatitis B-virus-DNA- sekvensen fra Haell-endonucleaserestriktionsstedet i base- 25 stilling 1437 i urets retning til BamHI-endonuclasere- striktionsstedet i basestilling 28 ifølge tegningens I fig. 1. Den første og den anden DNA-sekvens er opera- tivt forbundet for at fremme ekspression af HBxAg.

Et andet aspekt udgøres af et rekombinant DNA, som 30 omfatter et gen, der koder for HBxAg eller for et polypeptid, I der udgør en væsentlig del af HbxAg. Et særlig foretrukket rekombinant DNA indeholder genet, der koder for HbXag og I har den basesekvens, der vises i fig. 1, som dækkende base- I stillingerne i urets retning til 28 eller en væsentlig del I 35 deraf.

I Et plasmid, der koder for mindst ét rekombinant DNA, 11 DK 175364 B1 der omfatter et gen, der koder for HBxAg eller for et poly-peptid, der udgår en væsentlig del deraf, udgør endnu et aspekt. Dette plasmid kan omfatte den basesekvens, der er vist i fig. 1 dækkende basestillingerne 1437 i urets retning 5 til 28 eller en væsentlig del deraf. Ved en særlig foretrukket udførelsesfona omfatter plasmidet en første I DNA-sekvens omfattende den Simian-virus-40-(SV40)-vi- I rale DNA-sekvens fra BamHI-endonucleaserestriktionsste- I det i basestilling 2468 i urets retning til EcoRI-endo- I 10 nucleaserestriktionsstedet i basestilling 1717 ifølge I fig. 2; en anden DNA-sekvens omfattende plasmid-pBR- I 322-DNA-sekvensen fra BamHI-endonucleasestillingen i I basestilling 375 i urets retning til“EcoRI-endonucle-

I aserestriktionsstedet i basestilling 0 ifølge fig. 3; I

I 15 og en tredje DNA-sekvens omfattende hepatitis B-virus- I

I -DNA-sekvensen fra BamHI-endonucleaserestriktionsste- I

I det i basestilling 1400 i urets retning til BamHI-endo- I

I nucleaserestriktionsstedet i basestilling 28 ifølge fig. I

I 1. I dette plasmid er første og anden DNA-sekvens ope- I

I 20 rativt ligateret ved deres respektive EcoRX-endonuclea- I

serestriktionssteder; anden og trejde-DNA-sekvens er I

operativt ligateret ved deres respektive BamHI-endonu- I

cleaserestriktionssteder, og første og tredje DNA-se- I

I kvenser er operativt ligateret i deres respektive BamHI- I

I 25 -endonucleaserestriktionssteder ifølge fig. 4. I

I En fremgangsmåde til fremstilling af HBxAg I

I eller en væsentlig polypeptiddel af HbxAg udgør et an- I

I det aspekt. Ifølge dette dyrkes en vært indeholdende et her I

B omhandlet ekspressionssystem i et dyrkningsnæringsmedium, I

I 30 indtil der er produceret HBxAg eller en væsentlig polypeptid- I

del deraf og akkumuleret i værten eller dyrkningsvæsken.

B Det akkumulerede HBxAg eller en væsentlig polypeptiddel deraf udvindes herefter.

Opfindelsen angår som nævnt et antigent syntetisk B 35 polypeptid. Dette syntetiske polypeptid indeholder fra 6 til 40 aminosyrerester og svarer i sekvens til sekvensen af DK 175364 B1 en antigen determinant i HBxAg. Et særligt foretrukket po- H lypeptid omfatter en aminosyrerestsekvens udvalgt blandt H de polypeptidsekvenser, der er gengivet ved formlerne H skrevet fra venstre til højre og i retning fra aminoen- H 5 destillingen til carboxyendestillingen: (i) Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu- H ~Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp; (ii) Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-

Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val og 10 (iii) Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-

Ser-Ala.

En vandopløselig eller vanddispergerbar anti- H gen polymer indeholdende en flerhed af forenede synteti- H ske polypeptidgentagelsesenheder bundet sammen af oxide- 15 rede cysteinrester er også omfattet af opfindelsen, jf. xrav 3.

H Gentagelsesenhederne omfatter de ovenfor omtalte polypep- H tider, som indeholder cysteinrester i både amino- og H carboxyendestillingen eller indeholder en cysteinrest i H den ene endestilling og en cysteinrest inden for poly- 20 peptidkæden. Særlig foretrukne polypeptidgentagelsesen- heder, herunder amino- og carboxyendestillingscystein- resterne,er gengivet ved en formel skrevet fra venstre til højre og i retning fra aminoendestilling til carb- oxyendestilling valgt blandt I 25 Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-

Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cys;

Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly- I Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Cys og I R^-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr- I 30 Ser-Ala-R2, m 12 hvor R og R hver er en cysteinrest, forudsat at kun I 12 et af symbolerne R og R forekommer.

Receptormolekyler, som omfatter et antistof- 35 kombineringssted, såsom antistoffer der kan immunrea- I gere med et af de ovenfor omtalte antigene polypeptider, |pv -~-~y · % i :gj

DK 175364 B1 I

13 I

I udgør ligeledes en del af opfindelsen. De særligt fore- I

I trukne polypeptider, hvormed disse receptormolekyler im- I

I munreagerer, er belyst af de ovenfor beskrevne polypep- I

I tider. Disse receptormolekyler immunreagerer også med I

I 5 HBxAg eller med en væsentlig polypeptiddel deraf. I

I Et diagnostisk analysesystem til bestemmelse I

I af tilstedeværelsen af en påviselig mængde HBxAg i en I

I kropsvæske skal ligeledes beskrives. Dette system I

I omfatter mindst én beholder, som indeholder et reagens, I

I 10 der omfatter de ovenfor beskrevne receptormolekyler. I

I Dette system kan yderligere omfatte et andet reagens i I

I en anden beholder, hvilket andet reagens er det antigene I

I syntetiske polypeptid, hvormed receptormolekylerne immun- I

I reagerer. Et middel til signalering af immunreaktionen I

I 15 mellem receptormolekylerne og HBxAg kan udgøre en yder- I

I ligere del af dét diagnostiske analysesystem. I

I Der skal også beskrives en fremgangsmåde I

I til afprøvning af tilstedeværelsen af en påviselig mæng- I

I de HBxAg i en kropsprøve. Her blandes proteiner fra en I

I 20 kropsprøve, der skal analyseres for tilstedeværelsen I

I af en påviselig mængde HBxAg, med de ovennævnte recep- I

I tormolekyler under tilstedeværelse af en indikator, I

I der signalere en immunreaktion mellem receptorerne og HBxAg. Blandingen opretholdes i tilstrækkelig lang I 25 tid til,at indikatoren kan signalere, at der er ind- I truffet en immunreaktion, hvorefter dette signal kon- I stateres.

I Opfindelsen vil i det følgende blive gennem- gåst i forbindelse med tegningen, på hvilken I 30 fig. 1 er et skematisk diagram, der viser I den fysiske struktur og genetiske arrangement i HBV/ I adwfgenom fra Tiollais m.fl., Science 213, 406-411 (1981) I modificeret af Ono m.fl., N.A.R. 11, 1747-1757 (1983).

I Det rapporteres, at 5'-enden af den lange (L)-streng er I 35 baseparret med 5'-enden af den korte (S)-streng. Visse I restriktionssteder, der er vist med pile forbundet med I DK 175364 B1 buer, og forkortelsen for restriktionsendonuclasen sva- rer til det fysiske kort over HBV/adw-genomet analyse- ret af 0N0 ni.fl., supra. De brede pile, der omgiver ge- nomet, svarer til de fire store åbne regioner i L-stren- 5 gen. Disse fire potentielle kodningsregioner er beteg- net S, P, X og C. Antallet af aminosyrerester i paren- teser (aa) efter hver af de fire betegnede regioner sva- rer til længden af det hypotetiske polypeptid, der ko- des for af hver region. De to regioner svarende til de 10 definerede gener S og C er vist med stiplede områder i H de brede pile. Det særegne EcoRI-endonucleasestéd an- H vendes som kortets oprindelsespunkt, fig. 2 viser skematisk et SV40-DNA-restrik- tionskort fremstillet ud fra den primære sekvens offent- 15 liggjort af Reddy m.fl., Science 200, 494-501 (1978) modificeret af Van Heuverswyn og Fiers, Eur. J. Biochem.

I 100, 51-60 (1979), fig. 3 viser skematisk et kort over plasmid H pBR322 fremstillet ud fra primære sekvensdata hos Sut- 20 cliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative I Biology 43, 77 (1979), H fig. 4 viser skematisk den fremgangsmåde, der er beskrevet i afsnittet "Materialer og fremgangs- H måder" nedenfor, og som anvendes til at indsætte DNA- I 25 -fragmenter i vektorer ifølge opfindelsen fremstillet ud fra I AM6 (bølgelinier), pBR322 (helt optrukne linier) og SV40 (stiplede linier) til fremstilling af kloningsvektoren H SVAM191, og derpå ekspressionsvektoren SVHBV-3, som ud- I trykker en væsentlig del af HBxAg. De relative posltio-

30 ner for restriktionsendonuclasestederne for BamHI, EcoRI

I og Haell er vist ved hhv. lukkéde cirkler, åbne cirkler I og lukkede trekanter. SV40-genomets oprindelse (ori) I og tidlig og sen promotor er også vist, fig. 5 viser en lineær del af den rekombinan- I 35 te SVHBV-3-ekspressionsvektor, der indeholder generne for den sene SV40-promotor, de aminoendestillede 99 ami- DK 175364 B1 15 nosyrerester (99aa) og en væsentlig polypeptiddel (132aa, 132 af 154 aminosyrerester) i HBxAg-gensekvensen, der koder for de 132 carboxyendestillede aminosyrerester. i Også mRNA'et for VP2 HBxAg-fusionsproteinet udtrykt af 5 vektoren er vist, fig. 6 viser den translaterede aminosyrerestsekvens vist fra venstre til højre og i regningen fra aminoendestilling til carboxyendestilling i genet, der koder for HBxAg. Den væsentlige del af HBxAg udtrykt 10 af SVBHV-3 er vist ved pilen i aminosyrereststillingen 23 (Ala), som er den aminoendestillede rest i det udtrykte HBxAg-polypeptid. De relative stillinger i syntetiske polypeptider betegnet 99, 100 og 142 ifølge opfindelsen i HBxAg-sekvensen er vist ved de tre mærkede 15 understregede aminosyrerestsekvenser. Aminosyrerest-sekvensen i syntetisk polypeptid 99 svarer derfor til stillingerne 100-115 fra den aminoendestillede Met-rest i figuren, sekvensen af syntetisk polypeptid 100 svarer til stillingerne 115-131 fra den aminoendestillede Met-20 -rest i figuren, og sekvensen i syntetisk polypeptid 142 svarer til sekvensen i stillingerne 144-154 fra figurens aminoendestillede Met-rest, dvs. de 11 carboxyendes tillede rester, fig. 7 er et fotografi af et autoradiogram, 25 der viser anti-X-antiseras reaktivitet med to human-hepatomcellelysater. To human heptaom-cellelinier, PLC/PRF/5 og HepG2 dyrkes i Dulbecco's modifikation af Eagle's medium (DMEM) med 10% kalvefosterserum til sub-sammenløbning (dag 6 i en 1:5 andél fra en sammenløbet 30 kultur). Væskeoverfaserne fjernes, kolberne, der indeholder monolagene, anbringes på is -5 minutter, før cellerne opsamles ved skrabning, og de opsamlede celler pel-leteres ved centrifugering. Cellepellet'erne vaskes med phosphatpufret saltvandsopløsning (PBS), lynfryses 35 ved -70°C og lyophiliseres natten over. De' fremkomne cellepulvere opløses i PBS og bringes på en endelig I DK 175364 B1

I 16 I

I koncentration på 2 mg/ml i prøvepuffer. Prøverne ko- I

ges i 5 minutter, og cellerester fjernes ved centri- I

I fugering i en iBeckman mikrofuge i 30 minutter. 50yUg I

I cellelysat inkuberes i 15 minutter i RIPA-puffer (PBS I

I 5 indeholdende 1% "Nonidet P-40" [polyoxyethylen (9) oc- I

I tylphenylether), 0,05% natriumdeoxycholat og 0,1% SDS] I

I 125 I

og radiomærkes med 3 mikroCurie I ved hjælp af chlor- I

I amin-T-reaktion, McConahey m.fl., Int. Arch. Allergy 29, I

I 185-189 (1966). 1,5 x 10^ tællinger pr. minut (cpm) af I

I 10 hver af de radiomærkede hepatomalysater omsættes med 10 I

I ^,ug anti-X-polypeptid i 60 minutter i RIPA. Antigen/an- I

I tis tof-komplekserne (immunreaktionsprodukter) fældes I

I med formalinfikseret Staphylococcus aureus. Pelletter- I

I ne vaskes en gang med RIPA og to gange med 500 mmolær I

I 15 LiCl, 100 mmolær Tris (pH 8,5) og analyseres for radio- I

aktivitet. Alle pelletterne opløses i 40^ug pøvepuffer I

I [0,0625 molær Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% glycerol, I

I 5% 2-mercaptoethanol og 0,001% bromphenolblåt], koges I

I i 3 minutter, centrifugeres for at fjerne cellerester I

I 20 og underkastes SDS-PAGE på følgende måde: I

De radiomærkede cellelysater fyldes på denatu- I

I rerende natriumdodecylsulfat/polyacrylamidgeler (12,5%) I

I (SDS-PAGE) og underkastes elektroforese ifølge Laeiranli's I

I metode, Nature 297, 680-685 (1970).. Proteinerne over- I

I 25 føres elektroforetisk til nitrocelluloseark som beskre- I

I vet af Towbin m.fl., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, I

I 43.50-4354 (1979) . Nitrocelluloseaftryk farves i ami- I

I dosort før inkubation ved 4°C natten over i BLOTTO I

I [Johnson m.fl, J. Exp. Med. 159, 1751-1756 (1983)] til I

I 30 reduktion af ikke-specifik binding. Nitrocellulose- I

I strimler inkuberes i 3 timer ved stuetemperatur med en I

I 1:350 fortynding af anti-polypeptidantistoffer i et I

I slutvolumen på 10 ml BLOTTO. Strimlerne vaskes i BLOTTO I

I 125 I

før en times inkubation med med I mærket S.aureus-pro- I

I 35 tein A (10^ cpm pr. 10 ml). Når der nedenfor er angi- I

I vet konkurrerence af et polypeptid, inkuberes anti-po- I

DK 175364 B1 I

17 I

lypeiptid-antiseraene med lOO^ug polypeptid i 60 minut- I

ter før tilsætning af det radiomærkede antigen. Strim- I

lerne vaskes som ovenfor, skylles med vand, tørres og I

autoradiograferes. Banerne 1 og 5 omsættes med anti- I

5 -polypeptiel-99-antistoffer (anti-99), bane 2 omsættes med I

anti-99 præinkuberet med polypeptid 99, bane 3 omsæt- I

tes med anti-99-præinkuberet med et ikke-relateret po- I

lypeptid, og bane 4 omsættes med eft præimmun serumkon- I

trol. Lysater fra HepG2-celler (baner 1-4) reagerer I

10 ikke med anti-polypeptid 99. Tallene i venstre margen I

viser relative proteinmigreringsstillinger. Pilene I

i højre margin viser migreringsstillingerne for prote- I

I iner med molekylevægte på 28.00,0 og 45.000 dalton, I

I fig. 8 er et fotografi, der viser anti-X-an- I

I 15 tiserums reaktivitet med chimpanse-(C, bane 3 og 4) og I

I menneske-(H, bane 1 og 2) levervæv. Leversn'it taget I

I fra chimpanser og mennesker lynfryses i flydende nitro- I

I gen og formales til et fint pulver med morter og støder. I

I Cellepulverne opløses i prøvepuffer og underkastes gel- I

I 20 elektroforese og aftrykkes som beskrevet for fig. 7. I

I Der fremkaldes nitrocellulosestrimler med en 1:50 for- I tynding af antiserum som beskrevet for fig. 7 med to I undtagelser: 1) Der anvendes 1% okseserumalbumin-(BSA)- I opløsning i stedet for BLOTTO ved alle inkubationer og I 25 vask, og 2) de antigenbundne antistoffer påvises med med I peberrodsperoxidase konjugeret gede-anti-kanin-IgG.

I Antigen/antistof-immunreaktionsprodukterne gøres syn- I lige ved at dyppe strimlerne i følgende fremkalderop- I * løsning, der fremstilles ud fra 50 ml TBS-puffer ved I 30 37°C, hvortil der er tilsat 250^uliter absolut ethanol I indeholdende 8 mg 4-chlor-l-naphthol og 330^,uliter 30% I hydrogenperoxid. Antiserum mod polypeptid 99 (anti-99) I anvendes til de to paneler på venstre hånd, blokeret I eller ikke blokeret. Tallene på venstre side i figuren I 35 viser gelmigreringsstillingerne for proteiner med mole- I kyleVægte på hhv. 66, 45, 31, 21 og 14 kilodalton,

I DK 175364 B1 I

I i

I fig. 9 er et fotografi af en Southern-aftryks- I

analyse af human og chimpanse- med restriktionsenzym- I

-spaltet lever-DNA’er fra levervæv, der udviser X-pro- I

H tein, ved hjælp af hepatitis-B-virus-(HBV)-DNA) som I

I 5 bindingssonde. Totalt EiNA ekstraheres fra de cellepul- · I

H vere, der fremstilles ud fra prøverne beskrevet i fig. I

8. lOyUg DNA fyldes i hver fordybning i en 1% agarose- I

I gel. Restriktionsenzymfordøjelsespuffere er som anført I

af producenten (BRL, hvem, hvor). Alle fordøjelser ud- I

10 føres natten over ved 37°C med 50 enheder enzym (5 x I

I DNA-koncentration i mikrogram). Banerne 1-3 viser chimp- I

I -A-243-lever-DNA fordøjet med hhv. BamHI, EcoRI eller I

ikke-spaltet, banerne 4-6 viser, chimp-344-lever-DNA I

I spaltet med hhv, BamHI, EcoRI eller uspaltet, banerne I

15 7-10 viser human-HBcAg-positivt lever-^DNA skåret med I

I hhv. Hindlll, BamHI, EcoRI eller uden fordøjelse, og I

banerne 11-14 viser human-HBsAg-negativ lever-DNA for- I

I døjet med hhv. Hindlll, BamHI, EcoRI eller ufordøjet, og I

fig. 10 er et fotografi af et autoradiogram, I

20 der viser anti-X-polypeptid-antiseras reaktivitet med I

I et X-rettet genprodukt. Sammenløbende monolag af BSC-1- I

I -celler (2 x 10^ celler) inficeres med det rekombinant I

SVHBV-3-stamvirus (en blanding af tsA23g og SVHBV-3— I

I virioner) eller vildtype SV40 [Moriarty m.fl., Proc. I

I 25 Natl. Acad. Sci USA 78, 2606-2610 (1981)). Kulturerne I

inkuberes i serumfri DMEM ved 40°c i 48-72 timer, på I

I hvilket tidspunkt der er sket ca. 50% cytopatisk virk- I

I ning. Væskeoverfaserne fjernes, og kolberne, der in- I

I deholder monolagene, anbringes på is i 5 minutter, før I

H I

30 cellerne opsamles ved skrabning. De opsamlede celler I

centrifugeres, og de fremkomne cellepellets vaskes med I

PBS, lynfryses ved -70°C og lyophiliseres natten over. I

De fremkomne cellepulvere opløses i PBS og bringes på I

en slutkoncentration på 2 mg/ml i prøvepuffer. Prø- I

I 35 verne koges i 5 minutter, og cellerester fjernes ved I

I centrifugering i eh Beckman mikrofuge i 30 minutter. I

DK 175364 B1 I

19 I

50-100 mikrogram cellelysat fyldes på denaturerende po- I

lyacrylamidgeler (12,5%) og underkastes elektroforese som I

tidligere beskrevet. Proteinerne overføres elektrofo- I

retisk til nitrocelluloseark som tidligere beskrevet. I

5 Nitrocelluloseaftrykkene farves i amidosort før inku- I

I bation natten over ved 4°C i BLOTTO til reduktion af I

I ikke-specifik binding. Nitrocellulosestrimler inkube- I

I res i 3 timer ved stuetemperatur med en 1:350-fortyn- I

I ding af anti-peptid-antistoffer i et slutvolumen på I

I 10 10 ml BLOTTO. Strimlerne vaskes i BLOTTO før en times I

I 125 I

I inkubation med med·; I mærket S. aureus-protein A

I (10^ cpm pr. 10 ml). Strimlerne vaskes som ovenfor, I

I skylles med vand, tørres og autoradiograferes. I de I

I tilfælde, hvor der udføres blokering med polypeptid, I

I 15 præinkuberes antiseraene med 100 mikrogram polypeptid- I

I opløsning natten over ved 4°C eller i 2 timer ved 37°C I

I før inkubation med nitrocellulosestrimlerne. Molekyle- I

I vægt baseres på lav-molekylevægt-standarder (BioRad) I

I og ses i venstre margin på figuren. Banerne 1 og 3 I

I 20 omsættes med anti-polypeptid hfiv. 99 og 142. Banerne I

I 2 og 4 omsættes med de samme antistoffer præinkuberet I

I med polypeptid 99 eller med polypeptid 142. Banerne I

I 5 og 6 viser omsætning af hhv. antipolypeptid 99 og I

I 142-antistoffer med kontrolcellelysater. I

I 25 Den foreliggende opfindelse har mange for- I

I dele, hvoraf en er, at man for første gang har påvist I

I tilstedeværelse af HBxAg i en hvilken som helst celle.

En anden fordel er, at opfindelsen mulig- I gør en analysemetode og et system til påvisning af I 30 tilstedeværelsen af HBxAg i et kronisk hepatitis-B-in- I ficeret værtsdyr.

I Endvidere er det en fordel, at anvendelse af I opfindelsen gør det muligt at påvise HBxAg i celler, I der er afledt ud fra human hepatomer, hvorved det for- I 3 5 modede led mellem hepatitis B-virus og denne form for I cancer forstærkes.

I DK 175364 B1

I 20 I

Desuden tilvejebringer opfindelsen et mid- I

del til kloning af genet, der koder for BHxAg, hvilket I

er en fordel. I

Endvidere rummer opfindelsen den fordel, at I

5 den tilvejebringer et middel til at udtrykke en væsent- I

lig polypeptiddel i HBxAg, som kan anvendes som et an- I

tigen i en diagnostisk prøve for tilstedeværelse af an- I

H tistoffer mod HBxAg (anti-X-antistoffer), som forekom- I

mer i serum fra mennesker. I

H 10 Endelige indebærer opfindelsen den fordel, at I

der kan fremstilles et syntetisk polypeptid, hvis ami- I

nosyrerestsekvens svarer til sekvensen i en antigende- I

terminant i HBxAg, som kan anvendes til at fremstille I

antistoffer, som immunreagerer med HBxAg samt med poly- I

I 15 peptider, som deler en antigen determinant med HBxAg. I

I Definitioner I

I Transfektion: er erhvervelse af nye genetiske I

H markører ved inkorporering af tilsat DNA i eucaryotiske I

celler. I

20 Trans formation: er erhvervelse af nye geneti- I

I ske markører ved inkoroporering af tilføjet DNA i pro- I

caryotiske celler. I

Kloningsvektor; er ethvert plasmid eller vi- I

rus, hvorid et fremmed DNA kan indsættes for at blive I

I 25 klonet. I

I Plasmid: er et autonomt selv-replikerende ek- I

I strachromosomt cirkulært DNA. I

I Aben aflasningsramme: er en DNA-sekvens, som I

(potentielt) kan translateres til protein. I

I 30 Hjælpervirus: er et virus, der tilvejebringer I

I funktioner, der mangler i et defekt virus, og sætter I

I sidstnævnte i stand til af slutte den infektiøsecyk- I

I lus under en blandet infektion. I

I Gen (cistron): er det DNA-segment, som er in- I

I 33 volveret i at producere en polypeptidkæde; det omfat- I

ter regioner forud for eller efter kodningsregionen I

DK 175364 B1 I

21 I

(fører og efterløber) samt mellemliggende sekvenser (in- I

troner) mellem individuelle kodningssegmenter (eksoner). I

Ekspression: den proces, som et strukturelt I

gen gennemgår for at fremstille et polypeptid. Det er I

5 en kombination af transcription og translation. I

Klon: beskriver et stort antal identiske cel- I

ler eller molekyler med en enkelt ophavscelle eller -mo- I

lekyle. I

I Basepar (bp): er parnerskabet mellem adenin (A) I

I 10 og thymin (T) eller mellem cytosin (C) og guanin (G) i I

I en DNA-dobbeltskrue. I

I Ekspressionsvektor: er ethvert plasmid eller I

I virus, hvori et fremmed DNA kan,indsættes eller udtryk- I

I kes. I

I 15 Neastrøms (længere fremme): identificerer I

I sekvenser, der strækker sig længere frem i retning af eks- I

I pression; f.eks. ligger polypeptidkodningsregionen "ned- I

I strøms" (længere fremme) for initieringskodonet. I

I Region X i hepatitis B-virus-HBV-genomet har I

I 20 interesse, bl.a. fordi nyt bevismateriale tyder på mu- I

I ligheden fory at det bliver udtrykt, og traditionel HBV- I

I serologi ikke har fundet dets proteinprodukt eller an- I tistoffer mod et sådant produkt. De ny-udviklede rekom- I binant DNA- og syntetisk polypeptidteknologier anvendes ..

I 25 her for at fjerne nogle af de fejltagelser, der forekom- I mer hos traditionelle metodikker med hensyn til ekspres- I sion af HBxAg og for at belyse ekspressionen af HBxAg i I celler fra af human hepatom afledte cellelinier og i le- I · verceller fra chimpanser og mennesker med en kronisk I 30 HBV- infektion .- I Hertil benytter den foreliggende opfindelse klo- I nings- og ekspressionsvektorer for HBxAg, syntetiske I polypeptider, der svarer til antigene determinanter i I HBxAg og til antistoffer fremstillet mod disse synteti- I 35 ske polypeptider, der bindes til polypeptiderne samt I til HBxAg eller til en væsentlig del deraf, samt ana-

I DK 175364 B1 I

I 22 I

lyser for tilstedeværelse af HBxAg. I

De her omtalte kloningsvektorer anvendes bl. I

I a. til fremstilling af nyttige kvantiteter af et gen, I

I der indeholder HBxAg. Dette gen kan igen bl.a. anven- I

I 5 des til at fremstille mængder af HBxAg og polypeptidfrag- I

menter deraf, som kan anvendes til at studere selve I

I sygdommen heptaitis B. I

De nye syntetiske polypeptider ifølge opfin- I

I delsen kan bl.a. anvendes som antigener ved fremstil- I

10 ling af antistoffer, som immunreagerer med HBxAg og væ- I

sentlige polypeptiddele deraf samt immunreagerer med I

I selve de syntetiske polypeptider. De således fremstil- I

lede antistoffer kan herefter anvendes til at analysere I

I for tilstedeværelse af HBxAg eller en væsentlig polypep- I

I 15 tiddel deraf i celler fra et inficeret værtsdyr eller I

I i vævskultur. I

I Ekspressionsvektoren kan anvendes til at trans- I

I ficere celler og fremkalde ekspression af et polypeptid, I

som omfatter en væsentlig del af HBxAg. Det udtrykte I

I 20 polypeptid kan så anvendes som antigen ved en analyse I

I til bestemmelse af tilstedeværelse af antistoffer mod I

I HBxAg i en kropsprøve. I

I Ekspressionsvektoren og antistofferne ifølge I

opfindelsen kan også anvendes som markør for fransfice- I

I 25 rede celler, som indeholder ekspressionsvektoren og I

I yderligere omfatter endnu et ligateret gen, hvis til- I

stedeværelse kan være relativt vanskelig at fastslå, I

I Således kan fekspressionsvektoren, kaldet I

I SVHBV-3, der beskrives nedenfor, åbnes og ligate- I

I 30 res til endnu et andet fremmed gen, der koder for et I

I protein, hvis tilstedeværelse det kan være forholdsvis I

I vanskeligt at bestemme. Efter recirkularisering, infektion I

I af passende celler med den således dannede nye vektor og I

I udstrygning i enkeltcellekolonier, kan de celler, der I

I 35 inkorporerer den nye vektor, identificeres ved hjælp I

I af deres ekspression af den med vektor kodede del af I

- ' · -wsassu..... s.. ·; -TOCTf~:..............·"*-· JiiM^giiaiiiifc^-ifriiwjifeUJiai DK 175364 B1 23 HBxAg sammensmeltet med det protein, der kodes for af I det fremmede gen, ved hjælp af antistofferne ifølge op- I findelsen. En sådan markør kan især være nyttig, når I man ønsker, at vektoren skal udtrykkes i eucaryotiske I 5 celler, dvs., når der ikke forekommer medieinresisten- I te markører i bakteriecellevektorer, såsom pBR322.

I (1) Kloningsvektorer I Det rekombinante DNA, som indeholder HBxAg-genet, I kan f.eks. fremstilles ved at klone en del a HBV-DNA'et.

I 10 For at få HBV-genomt materiale omdannes Dane-partikel-DNA

I indeholdende en enkeltstrenget del, til et fuldstændig, dob- I beltstrenget DNA ved hjælp af den virus-endogene DNA-polyme- I rase.

I Det cirkulære, dobbeltstrengede HBV, der så- I 15 ledes opnås, indeholder to BamHI-endonucleaserestrik- I tionssteder. Spaltning med BamHI giver typisk tre li- I neære produkter, der klassificeres efter størrelse.

I Den største er et fragment på 3200 basepar (bp), der I repræsenterer hele HBV-genomet kun spaltet i ét BamHI- I 20 -sted. Fragmenter, der indeholder 1850 og 1350 bp, fås, I når HBV spaltes i begge BamHI-steder.

I Analyse af HBV-nucleotidsekvensen,foretaget I af Galibert m.fl.. Nature 281, 646-650 (1979), afslø- I rer, at det 1850 bp store HamHI-fragment omfatter ge- I 25 net, der koder for HBxAg. Imidlertid har alle tre frag- I menterhave BamHI-komplementære endestillinger og kan I derfor indsættes i et kloningsplasmidS' BamHI-sted.

I Plasmid pBR322 har et eneete BainHI-restrik- I tionssted, som er lokaliseret inden for dets gen, der I 30 giver tetraeyelinresistens, som det ses ved undersøgel- I se af fig. 3. Spaltning af pBR322-DNA med BamHI gi- I ver et enkelt lineært fragment med endestillinger, der I er komplementære med hvert af de tre BamHI-HBV-DNA- I -fragmenter.

I 35 Når hvert af de tre BamHI-HBV-DNA-fragmenter I ligateres ind i pBR322 ved dets BaroHI-sted med T4-DNA- I DK 175364 B1

I 24 I

I -ligase, så at plasmiderne dannes igen og cirkularise- I

I res, giver det tre særegne rekombinante plasmid-DNA'er. I

I De rekombinante kloningsplasmider er cirkulære DMA'er I

I og betegnes AM7, der indeholder pBR322-DNA med det I

I 5 1350 bp store BamHI-HBV-DNA-fragment indsat i pBR322’s I

I BamHI-sted, AM6, der indeholder pBR322-DNA med hele HBV- I

-»genomet indsat i pBR322's BamHI-sted, og AMI indehol- I

I dende pBR322-DNA med det 1850 bp store BamHI-HBV-DNA- I

I -fragment omfattende HBxAg-genet indsat i pBR322's BamHI- I

I 10 -sted. I

I Når BamHI-HBV-DNA-fragmenterne ligateres i I

I pBR322's BamHI-sted med T4-DNA-ligase, har de rekom- I

I binante plasmider, der således dannes, ikke mere evnen I

I til at give tetracyclinresistens. Ampicillin-resisten- I

I 15 te og tetracyclinfølsomme transformanter udvælges her- I

I ved blandt kolonier af Escherichia coli (E.coli) stamme I

I HB101 transformeret med de ovenfor nævnte ligaterings- I

I produkter. I

I Tre medicinudvalgte stammer af E.coli HB101 I

I 20 transformeret med rekombinante plasmider AMI, AM6 og I

I AM7 betegnes hhv. ECAM1, ECAM6 og ECAM7. De ovennævnte I

I plasmider fremstilles i forholdsvis store mængder ved I

I at dyrke de ovennævnte transformanter i et passende me- I

I dium, såsom LB-næringsvæske, som beskrevet nedenfor. I

I 25 Ud fra de ovennævnte plasmider AMI og AM6 I

I kan der udskæres et genfragment indeholdende hele eller I

en del af HBxAg-genbasesekvensen ved hjælp af passende I

I restriktionsenzymer. Når således plasmider AMI og AM6 I

fordøjes med restriktionsenzymet BamHI, isoleres fra I

30 reaktionsprodukterne et 1850 bp stort DNA-fragment, der I

I omfatter det gen, der koder for HBxAg. Ved at dyrke med I

rekombinant plasmid transformerede E.coli HBlOl-stammer I

ECAM6 eller ECAM1 kan der fås en forholdsvis stor mæng- I

I de af DNA-sekvensen, der koder for HBxAg. I

35 Ud fra HBxAg-genet, hvis DNA-basesekvens og I

I placering på HBV-genomet er bestemt, fremgår det, at der I

25 DK 175364 B1 ikke forekommer introner deri. Dette betyder, at genet kan transcriberes, da det skal føre til phenotypisk ekspression som meddeler-RNA i dyreceller samt i bakterieceller.

5 (2) Ekspressionsvektorer

Indførelse af HBxAg-genet med et passende ekspressionssystem i en dyrecelle., f.eks. en nyreceller fra en afrikansk grøn abe, ved hjælp af Ganem m.fl.'s metode [J. Mol. Biol. 101, 57-83 (1976)], kan føre til 10 HBxAg-syntese i cellen. Desuden gør dyrkning af disse abenyreceller, der indeholder HBxAg-genet med en passende ekspressionsvektor, en billig masseproduktion af HBxAg mulig.

Der konstrueres med fordel et recombinant DNA, der kan 15 udtrykke HBxAg-genet, ved, uden at ændre dets aflæsningsramme, at indsætte det komplette HBxAg-gen eller et fragment deraf i Simian-virus 40 (SV40) længere fremme fra SV40-senregionpromotoren. En vektor til ekspression, der benytter SV40-senregionpromotoren, 20 fremstilles i store mængder på følgende måde.

SV40-DNA- og pBR322-DNA underkastes BamHI-og EcoRI-dobbelt-restriktionsenzymfordøjelse. De store SV40- og pBR322-fragmenter ligateres ved hjælp af T4-DNA-ligase. Ligateringsproduktet underkastes 25 BamHI-fordøjelse til dannelse af et lineært DNA med

BamHI-klæbrige ender. Ligatering af dette SV40/pBR322--HBV-DNA resulterer i et cirkulært rekombinant plasmid kaldet SVAM191.

Det rekombinante DNA SVAM191 indeholder et 30 intakt E.coli- arapicillinresistent -gen. E.coliHBlOl transformeret med SVAM191 er ampicillinresistent og te-tracyclinfølsomt og kan således udvælges på basis af medicinfølsomhed. E.coli HB101 transformeret med SVAM 191 betegnes EC-SVAM191 og kan dyrkes i et passende me-35 dium, såsom LB-næringsvæske indeholdende ampicillin, og en forholdsvis stor mængde af dette plasmid kan herved I DK 175364 B1 I 26

opnås. I

I (3) Cellekultur I

Transformeringen af en værtscelle med de så- I

ledes opnåede rekombinante DNA-plasmider AMI, AM6 og I

B 5 SVAM191 kan foretages ved hjælp af kendte metoder [Cohen I

I m.fl., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114 (1972)] I

I eller en modifikation deraf. Værtscellerne omfatter I

B blandt andet sådanne mikroorganismer som Escherichia I

I coli (E.coli), Bacillus subtilis og gærsorter, og heraf I

B 10 foretrækkes én Escherichia coli-stamme såsom stammerne I

^ betegnet 294 (ATCC 31446), W3110 (ATCC 27325) eller RRl I

B (ATCC 31447). E.coli stamme HB101 (ATCC 33694) er en I

særlig foretrukket værtscellelinie. I

Isolering af en cellestamme, der bærer det I

I 15 HBxAg-gen-indeholdende nye rekombinante plasmid-DNA, I

B kan foretages ved hjælp af velkendte metoder, herunder I

f.eks. følgende metode. I

B Dane-partikel-DNA, som er kun delvis dobbelt- I

B strenget, kan mærkes radioaktivt ved at udfylde den I

I 20 enkeltestrengede del med ^H-holdige dNTP'er ved hjælp af I

B endogen DNA-polymerasereaktion. [Robinson, Am. J. Med. I

B Sci. 270, 151-159 (1975)]. Herefter kan en positiv klon I

B ved hjælp af det mærkede produkt som sonde udtages blandt I

B de allerede opnåede, medicinudvalgte transformanter ved I

B 25 hjælp af den kendte Southern aftrykshybridiseringsmetode I

I [Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 (1975)3, eller ved den I

B kendte kolonihybridiseringsmetode [Grunstein m.fl., Proc. I

I Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961-3965 (1975)]. I

B Værtsceller, der er transformeret og isoleret I

B 30 på denne måde, dyrkes i et kendt medium. Mediet kan I

B f.eks. være LB-næringsvæske, Penassay-næringsvæske eller I

B M9-medium indeholdende glucose og Casamincsyrer [Miller, I

B Experiments in Molecular Genetics, 431-433 (Cold Spring I

B Harbor Laboratory, New York, 1972)]. I

B 35 Dyrkning udføres i reglen ved 15-43°C, for- I

B trinsvis ved 28-40 C, i 2-24 timer, fortrinsvis 4-16 ti- I

27 DK 175364 B1 mer, om nødvendigt med luftning οσ/eller omrøring.

Efter dyrkningen opsamles bakteriecellerne, der suspenderes i en puffer og lyses som f.eks. med lysozym, frysning/optøning eller ved ultralydbehandling.

5 Genet, der koder for HBxAg, kan isoleres ved hjælp af en metode, der er alment kendt til DNA-rensning ud fra centrifugeringsvæskeoverfasen opnået efter cellelyse.

For at få en vektor, der udtrykker HBxAg i eukaryotiske celler, fjernes en del af SVAMl91-DNA'et, 10 herunder alt DNA'et af pBR322-oprindeIse. Dette sker ved at underkaste SVAM191 Haell-restriktionsenzymfor-døjelse. Når det største af Haell SVAM191-fordøjelses-produkterne cirkulariseres, dannes en vektor, der kan udtrykke KBxAg i en dyrecelle, kaldet SVHBV-3.

I 15 En pattedyrecellevært kan transficeres med I SVHBV-3 ved kendte metoder, så at der tilvejebringes I et ekspressionssystem. Således kan SVHBV-3, når det I spaltes med restriktionsenzymet Hindlll, indsættes i I C0S-7-celler (ATCC CRL 1651). [Jfr. Gluzman, Cell 23, I 20 175-182 (1981) og Siddiqui, Mol. and Cell Biology 3, I 143-146 (1983)]. SVHBV-3 kan også indsættes i okse- I papilloma-virus og derved anvendes til at transfice- I re musecellelinier.

I Mere foretrukket er det at anvendes SVHBV-3 I 25 sammen med Sv40tsA22£-hjælpervirus til at transficere I nyrecellelinie af grøn afrikansk abe BSC-1 (ATCC CC1 26).

I Når BSC-l-celleme transf iceres således, produceres et I polypeptid indeholdende HBxAg-antigene determinanter.

I Det skal bemærkes, at nucleotidsekvensen eller I 30 genfragmentet, der er indsat i det udvalgte restriktions- I sted i klonings- eller ekspressionsvehiklen, kan omfat- I te nucleotider, er ikke udgør nogen del af det faktiske I gen til det ønskede protein, eller kan omfatte blot et I fragment af det gen. På grund af de kendte overskud i I 35 den genetiske kode, behøver det indsatte gen således I ikke at være identisk med HBxAg-genet, der beskrives I DK 175364 B1 I 28

H her, men behøver blot at kode for HBxAg. Desuden kan I

H en DNA-sekvens, som koder for HBxAg, omfatte yderligere I

baser i 3'- og/eller 5'-enden på den sekvens, der koder I

for HBxAg, når blot aflæsningsrammen er uændret. Sagt I

5 på en anden måde, ligegyldig hvilken DNA-sekvens, der I

indsættes, kræver den foreliggende opfindelse kun, at

den tranformerede eller transficerede vært producerer I

enten et DNA,· der koder for HBxAg, proteinet HBxAg el- I

ler et polypeptid, som omfatter en væsentlig del af I

H 10 HBxAg-proteinet. I

H (4) Polypeptider, antigener og antistoffer I

H Som beskrevet nedenfor kan ekspressionen af I

HBxAg påvises ved hjælp af antistoffer, fremkaldt af I

I syntetiske polypeptider, hvis aminosyrerestsekvens sva- I

I 15 rer til aminosyrerestsekvensen i en antigen determi- I

I nant i HBxAg. Polypeptiderne ifølge opfindelsen inde- I

holder i reglen ca. 6 til ca. 40 aminosyrerester, for- I

I trinsvis ca. 10 til ca. 20 aminosyrerester. I

Aminosyrerestsekvensen i syntetiske polypep- I

20 tider betegnes 99, og 100 og 142, der ses nedenfor og I

i fig. 6, bestemmes ud fra HBV-nucleotidsekvensen ud- I

I givet af Galibert m.fl., supra. I

Polypeptid 99: Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr- I

I Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cys, I

I 25 Polypeptid· 100: Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp- I

I Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val, og I

I Polypeptid 142: Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn- I

Phe-Phe-Thr-Ser-Ala. I

hvor hver af aminosyrerestsekvenserne er vist I

30 i retning fra venstre til højre og i retning fra amino- I

I endestilling til carboxyendestilling. I

I Det skal bemærkes, at polypeptider, der i amino- I

I syrerestsekvens svarer til sekvenserne i polypepti- I

I der 99 og 100, undtagen med hensyn til manglende carboxy- I

I 35 og amino-endestillede cvsteinrester i hhv. polypeptiderne I

I 99 og 100, også kan anvendes her og betragtes som en del I

DK 175364 B1 I

29 I

af opfindelsen. Sådanne polypeptider, der er betegnet I

polypeptider 99b og 100b, er anvendelige som immunogener, I

når de er bundet til en bærer ved hjælp af deres amino- I

eller carboxyendestillede rester, og kan også anvendes I

5 til immunreaktionsblokerende undersøgelser i lighed I

med dem, der er vist delvis i fig. 7, 8 og 10, og vil I

blive omtalt nedenfor. I

Aminosyrerestsekvenserne i polypeptiderne I

99b og 100 b vises i formlerne nedenfor fra venstre til I

10 højre og i retning fra aminoendestilling til carboxyen- I

destilling: I

polypeptid..· 99b: Leu-Ser-Ala-Met-Ser- I

Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp, I

Polypeptid'..· 100b: Leu-Phe-Ly s-Asp-Tr p- I

15 Glu-Glu-Leu-Gly-Glii-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val. I

(a) X-protein i transflcerede celler I

Kaniner immuniseret med polypeptider 99, 100 I

eller 142 forbundet med en nøglehulsklæbehæmocyanin-(KLH)- I

bærer som konjugat producerer antistoffer (hhv, anti-99, I

20 anti-100 og anti-142), som immunreagerer med HBxAg-poly- I

I peptidet udtrykt i BSC-l-celler transficeret med SVHBV-3, I

I hvorved det for første gang viser ekspression af et I

I HBxAg-polypeptid i disse eller nogen som helst celler. I

I Disse anti-polypeptid-antistoffer immunreagerer ikke med I

I 25 noget polypeptid, der findes i ikke-transficerede BSC-1- I

I -celler, dvs. celler inficeret med vild-type-(wt)-SV40. I

I Desuden hæmmes eller blokeres antipolypeptid- I -antistoffernes immunreaktivitet, som udtrykker HBxAg- I polypeptid/ved præinkubation af antistofferne med deres I 30 komplementære (tilsvarende) polypeptid, dvs. polypeptid- immunogenet, hvorimod de er produceret. Denne bloke- I ring viser, at antistofferne specifikt genkender en an- I tigen determinant i det polypeptid, der forudsiges at I være HBxAg, og at de syntetiske polypeptider i aminosy- I 35 rerestsekvens svarer til antigendeterminanter i det for- I udsagte HBxAg-protein. Disse blokeringsresultater fås DK 175364 B1 I 30 ved hjælp af Western-aftryksteknik (materialer og meto- der) efterfulgt af lokalisering af bundne antistoffer i 2 ς med med I-mærket Staphylococcus aureus-protein A ef- terfulgt af autoradiografisk fremkaldelse af prøven.

5 Disse resultater er vist i fig. 10 for anti- sera mod polypeptider 99 og 142. Bane 1 i fig. 10 vi- ser anti-99's immunreaktion med det med SVHBV-3 infice- rede cellelysat, medens bane 2 viser blokering af denne immunreaktion ved hjælp af præinkubation af antiserum- 10 met med polypeptid 99. På lignende måde immunreagerer anti-142 med et cellelysatprotein i bane 3, og denne im- munreaktion blokeres ved hjælp af præinkubation af det antiserum med polypeptid 142. Banerne 5 og 6 viser, at der ikke finder nogen immunreaktion sted med lysater

15 fra kontrolceller. I

Polypeptidekspressionsproduktet af med I

SVHBV-3-transficerede celler, der identificeres speci-

fikt ved hjælp af antisera mod polypeptider 99 og 142, I

som vist i fig. 10, har en molekylevægt på ca. 24.000 I

20 dalton. Som omtalt nedenfor er et polypeptid med en I

molekylevægt på ca. 28.000 dalton, blevet identifice- I

ret i lysater fra den humane ud fra hepatom afledte cel- I

lelinie PLC/PRF/5. Man mener, at forskellen i molekyle- I

vægt i polypeptiderne (proteiner) udtrykt af de to cel- I

H 25 lelinier stammer fra, at polypeptiderne, der udtrykkes, I

stammer fra fusion af X-proteinet med andre proteiner I

I eller polypeptider. I

Som således allerede bemærket, mangler SVHBV-3 I

en del af det komplette X-kodende genom. Fig. 6 viser, I

30 at den del af X-genet, der er med i SVHBV-3, udelukker I

kodoner for de første 22 aminosyrerester i det formodede I

X-protein, herunder methionin-initieringskodonet ATG. I

Det kan derfor forudses, at polypeptidet, der I

udtrykkes af celler transficeret af SVHBV-3, vil være I

35 et fusionsprodukt, hvor de SV40-strukturelt-protein VP2- I

sekvenser forekommer i vektoren. Den forudsete størrel- I

31 DK 175364 B1 se af fusionsproteinet (polypeptidet) forudsiges at være 24.500 dalton. Fundet af et udtrykt polypeptid med en molekylevægt på ca. 24.000 dalton svarer derfor til denne forudsigelse. Fusionsproteinet på 28.000 dalton (po-5 lypeptid) omtales nedenfor.

(b) X-protein udtrykt i hepatomceller

Ekspression af BHxAg menes også at være en funktion i visse HBV-sygdomsstadier. Således genkender antistoffer mod polypeptid 99 (anti-99) specifikt et 10 protein på 28.000 dalton udtrykt i den af human-heptatom afledte cellelinie PLC/PRF/5 (ATCC CRL 8024) . Normalt kaninserum genkender ikke dette protein, og anti-99-gen-kendelse blokeres af præinkubatipn med polypeptid 99.

Denne cellelinier vides at indeholde integreret HBV-DNA.

15 [Chakraborty m.fl., Nature 286, 531-533 (1980), Edman m.fl., Nature 286, 535-538 (1980), og Marion m.fl., Virol.

33, 795-806 (1980)]. HBsAg er blevet påvist i denne he-patomcellelinie · [McNab m.fl., Cancer 34, 509,515 (1976), og Aden m.fl., Nature 282, 615-616 (1979)], medens alle 20 standardprøver for HBcAg og HBeAg har været negative.

Cellelinien kaldet HepG2 (ATCC CCL 23) er også en human-heptatomcellelinie, men indeholder ikke integrerede HBV-DNA-sekvénser (Aden ml.fl., supra).

Disse resultater fås ved at radiomærke PLC/PRF/5-25 celleproteiner efterfulgt af gentagene immunfældninger ved hjælp af anti-99 og Staphylococcus aureus-protein A og derpå elektroforese af det udvundne bundfald. Proteinet på 28.000 dalton identificeres derpå ved hjælp af autoradiografi. Denne metode omtales også i afsnit-30 tet om materialer og metoder.

Resultater af en lignende undersøgelse ved hjælp af lysater fra både PLC/PRF/5- og HepG2-celler ses i fig. 7, der viser, at et X-specifikt protein på 28.000 dalton påvises i PLC/PRV/5-celler (bane 5). Immunreak-35 tiviteten går tabt, når antistof præinkuberes med polypeptid 99 (bane 6), men ikke med et ikke-relateret poly-

I DK 175364 B1 I

i 32 I

I peptid (bane 7) . Præimmun-serumkontrollen immunreage- I

I rer ikke (bane 8). Ingen X-specifik reaktivitet påvises I

I i kontrol-HepG2-lysaterne (banerne 1-4). Disse resul- I

I tater fastslår, at et X-genprodukt vil udtrykkes i en I

I 5 human-heptatom-cellelinie, der indeholder integrerede I

I HBV-CNA-sekvenser. I

I (c) Xrprotein-ekspression i leverceller. I

I Desuden undersøges fire leverprøver fra menne- I

I ske og chimpanse, enten med eller uden en historie med I

I 10 HBV-infektion, med en Western-aftryksprøve for tilstede- I

I værelse af et X-relateret protein ved hjælp af ariti-X- I

I -polypeptidantistoffer. Resultaterne af denne undersø- I

I gelse ses i fig. 8. En humanprøve (H) er fra en kronisk I

I HBV-inficeret hepatomlever, og den anden fra en HBV-in- I

I 15 fektion i akut fase (H). En ikke-inficeret chimpanse (C) I

og en med kronisk HBV inficeret (C) anvendes begge til I

I at opnå levercellelysater, der omsættes med anti-X-poly- I

I peptidantistoffer. I

I Anti-99-antistoffer reagerer mod protein på bå- I

I 20 de 45.000 og 28.000 dalton (pil i venstre margin, højre I

I margin p28). Begge reaktiviteter blokeres, når disse I

I antistoffer præinkuberes med polypeptid 99. Når anti-142- I

I -antistoffer reagerer mod disse samme cellelysater, påvi- I

I ses specifikke bånd ved 40.000 (p40), 28.000 (p28) og I

I 25 17.000 (pl7). Reaktiviteterne mod disse proteiner an- I

ses som specifikke, fordi de fjernes, når anti-142 an- I

I tistoffer præinkuberes med polypeptid 142. I

I Kontrolprøven, en ikke-inficeret chimpansele- I

I ver (bane 3 i alle paneler), udviser det ca. 45.000 dal- I

I 30 ton tunge protein (p45) med anti-99-antistoffer og bå- I

I de p40 og pl7 med anti-142-antistoffer. Protein p28 fl

I udtrykkes kun i med HBV-inficerede væv (baner celler I

I bane 5). Immunreaktiviteten går tabt, når antistof præ- I

I inkuberes med polypeptid 99 (bane 6), men ikke med et ik- I

I 35 ke-relateret polypeptid (bane 7). Præimmun-serumkontrol- I

I len immunreagerer ikke (bane 8). Ingen X-specifik reak- I

WwWV. ι^ί.^^,τφφττί-ιφ»^··_;_’ ^W—»«!τίΙ.»fa-_ miTOM^aiK^-liHBI·!· DK 175364 B1 33 tivitet påvises i HepG2-kontrollysåterne (banerne 1-4).

Disse resultater fastslår, at et X-genprodukt udtrykkes i en human-hepåtomcellelinie, der indeholder integrerede HBV-DNA-sekvenser.

5 Der iagttages også tilstedeværelse af et pro tein på 45.000 dalton i forholdsvis lille mængde i ly-saterne fra PLC/PRF/5-celler, vist i fig. 7. Immunreak-I tionen mellem anti-99-antistoffer og proteinet på 45.000 dalton blokeres også af præinkubation af antistofferne 10 med det immuniserende polypeptid 99. Dette ses i bane 6 i fig. 7.

Ekstrakter af normale humanlevercellér (HBV seronegativ) viser sig kun at udtrykke proteinet på 45.000 dalton ved Western-aftryksanalyse med anti-99.

15 Desuden identificerer kontrolprøver, der foretages med på markedet værende antistoffer produceret mod HBs, HBc og HBe (Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) ikke noget protein lokaliseret med antistofferne ifølge opfindelsen. Dette tyder igen på, at proteinet på 20 45.000 dalton har antigene determinanter, der er homo loge med HBxAg, men at proteinet på 28.000 dalton, der genkendes af anti-99, er specifikt for en HBV-sygdoms-tilstand og afviger fra HBsAg, HBeAg og HBcAg.

(d) X-gén i leverceller 25 p28's ekspression i PLC/PRF/5-celler integre res fra HBV-DNA til værts-DNA'et. Man er interesseret i at fastslå, om dette er den eneste måde, hvorpå X?-pro-teinet kan udtrykkes.

Derfor sonderes sådanne chimpanse- og human-30 lever-DNA'er, der udviser X-protein, med HBV-DNA (fig. 9).

Totalt DNA isoleres fra levervævene, der er repræsenteret i fig. 8, og analyseres.for tilstedeværelse af HBV--DNA-sekvenser. DNA'et fra chimpanse-præparatet med protein på 28.000 dalton afslører homologe bånd, når det 35 spaltes med BamHI, EcoRI eller når det er ufordøjet (fig. 9 hhv. bane 1, 2 og 3). BamHI-spalter cirkulært

I DK 175364 B1 I

I 34 I

I HBV-DNA i to fragmenter [1850 og 1350 basepar (bp)], hvor I

I båndet ved 5,8 kilobaser (Kb) (bane 1) repræsenterer I

I en integreret sekvens, der er større end genomstørrelse. I

I Eftersom der ikke ses nogen bånd under DNA-båndet med I

I 5 høj molekylevægt (bane 3) , slutter man, at der kun fore- I

I kommer integrerede sekvenser af HBV i dette DNA. I

I Desuden fremstilles DNA ud fra en HBcAg-posi- - I

I tiv humanlever og sonderes med HBV-DNA. Restriktionsen- I

I zymspaltning med Hindlll, BamHI, EcorI eller ufordøjet I

I 10 DNA (fig. 9 hhv. bane 7-10) , afslører homologe sekvenser I

I der enten er lig med eller mindre end genomstørrelse, I

I hvorved ethvert tegn på, at disse human-DNA-prøver I

I indeholder integrerede sekvenser, elimineres. Chimp-

I og human-levervæv, der mangler proteinet på 28.000 dal- I

I 15 ton, er også negative med hensyn til HBV-DNA-sekvenser I

I (fig. 9, hhv, bane 4-6 og 11-14). De data, der er vist I

I i fig. 9 bekræfter, at X-protein udtrykkes i med HBV- I inficeret væv uanset HBV-genomets tilstand og elimine-

I rer derfor forudsætningen om HBV-DNA-integrering for I

I 20 Xtekspression. I

I (e) Summering af resultater I

I De ovenfor beskrevne resultater viser forekomst I

I af et tidligere uidentificeret viraltkodet protein i I

I med HBV inficerede human- og chimpanselevervæv. Dette I

I 25 protein på 28.000 dalton (p28) kodes af HBV-genomet, I

I hvadenten det forekommer frit i en ekstrachromosom form I

I eller findes integreret i det cellulære DNA. I

I Proteinet på 28.000 dalton (p28) er ikke ude- I

I lukkende et produkt af X-regionen, men indeholder yder-

I 30 ligere HBV-sekvenser. Den forudsagte størrelse af I

I X-proteinet, baseret på den sekvens, der er rapporte-

I ret af Galibert m.fl., supra, er på ca. 17.000 dalton I

I (fig. 6). Imidlertid er molekylevægten af det X-pro- I

I tein, der påvisesmed anti-X-peptidantistoffer i PLC/ I

I 35 PRF/5-celler samt i chimpanse- og human-HBV-inficerede I

I væv, 28.000 dalton. Uoverensstemmelsen i størrelse I

35 DK 175364 B1 skyldes ikke en fusion af X-genet med cellulære sekvenser, eftersom manglen på integreret HBV-DNA i humanvæv, der udtrykker p28 (fig. 9, bane 7-10) viser, at Χ-proteinet (p28) udelukkende translateres fra HBV-ge-5 nomet.

Den forøgende størrelse af X-proteinet kan forklares, hvis proteinet er enten en HBsAg/x- eller en X-HBcAg-fusion. Sandsynligheden for en sådan fusion antydes af disse HBV-geners nærhed ved hinanden på ge-10 nomet.

Et forsøg på at bestemme forekomsten af en sådan fusion på RNA-niveauet mislykkedes på grund af, at de opnåede transcripter i PLC/PRF/5-cellerne, som viste sig at indeholder X-sekvenser, også udviser enten 15 overflade-(s) eller kerne-(c)-sekvenser samt X (data er ikke vist). Lignende resultater rapporteres af Gough, J. Mol. Biol. 165, 683-699 (1983). Beviset for en X-kernefusion kommer fra DNA-sekvensen i et andet medlem i Hepadnavirus-familien, ande-hepatitis B-virus 20 (DHBV), hvor begge gener translateres som et enkelt protein [Mandart m.fl., J. Virol. 49, 782-792 (1984)3 og fra et arbejde af Feitelson m.fl., J. Virol. 43, 687-696 (1982).

Den kendsgerning, at X-regionen i HBV ud-25 trykkes, er blevet konstateret. Imidlertid er dette genprodukts funktion stadig ukendt. Et proteinmolekyle, som man har foreslået at være translationsproduktet af X-regionen, findes associeret med HBV-genomet, eller mere specifikt, er covalent bundet til 5’-nick 30 i L-strengen, Gehrlich m.fl., Cell 21, 801-809 (1980).

Tanken om,X-protein som et DNA-bindingsprotein blev forkastet, da DNA-ase-behandling af PLC/PRF/5-celler eller med HBV-inficeret væv ikke fjernede eller ændrede p28-aktivitet (data ikke vist).

35 For øjeblikket vides kun lidt angående HBV- infektions biologi eller samspillet mellem HBV-infek-

I DK 175364 B1 I

I 36 I

I tion og den efterfølgende begyndelse af hepatocellulært I

I carcinom. Med henblik herpå er en hvilken som helst I

I yderligere markør for HBV-infektion eller for tilstede- I

I værelse af HBV-sekvenser af største vigtighed. Human I

I 5 sera undersøges for øjeblikket for forekomsten af anti- I

I -X-antistoffer og X-protein. I

I Udtrykket "svarer" og dets forskellige gramma- I

I tikalske former, anvendes her og i kravene i relation I

I til polypeptidsekvenser med betydningen den beskrevne

I 10 polypeptidsekvens plus eller minus op til tre amino- I

I syrerester i den ene eller begge endestillingerne (amino I

I og carboxy) og kun indeholdende konservative substitue- I

I ringer i særlige aminosyrerester langs polypeptidse- I

I kvensen. I

I 15 Udtrykket "konservativ substituering", som I

I anvendes ovenfor, betegner, at én aminosyrerest er ble- I

I vet erstattet af en anden, biologisk lignende rest. I

I Eksempler på konservative substitueringer omfatter sub- I

I stituering af én hydrofob rest såsom Ile, Val, Leu el- I

I 20 ler Met med en anden, eller substituering af en polær I

I rest med en anden, såsom mellem Arg og Lys, mellem I

I Glu og Asp eller mellem Gin og Asn og lignende. I

I I nogle tilfælde er erstatning af en ionisk I

I rest med en modsat ladet ionisk rest, såsom Asp med I

I 25 Lys, blevet kaldt konservativ inden for dette område,

I fordi disse ioniske grupper menes kun af yde opløse- I

I lighedsassistance. I reglen anses imidlertid erstat- I

I ning af en ionisk rest med en anden ionisk rest med I

I modsat ladning, eftersom de her omtalte erstatnin- I

I 30 ger sker på forholdsvis korte syntetiske polypeptid- I

I antigener sammenlignet med et helt protein, herved som en I

I "radikal erstatning" ligesom erstatninger mellem ikke- I -ioniske og ioniske rester og mellem omfattende rester I såsom Phe, Tyr eller Trp og mindre omfattende rester

I 35 såsom Gly, Ile og Val. I

I Udtrykkene "ikke-ioniske" og "ioniske" rester I

37 DK 175364 B1 anvendes her i deres sædvanlige betydning for at betegne aminosyrerester, som i reglen hhv. ingen ladriing har eller i reglen har en ladning ved fysiologiske pH--værdier. Eksempler på ikke-ioniske rester er Thr og 5 Gin, medens eksempler på ioniske rester er Arg og Asp.

Ordet "antigen" har været anvendt tidligere til at betegne en enhed, som bindes med et antistof, og betegner også en enhed, som fremkalder produktion af antistoffet. Mere nutidig anvendelse begrænser betyd-10 ningen af antigen til en enhed bundet af et antistof, medens ordet "immunogen" anvendes for den helhed, der fremkalder antistofproduktion.

I nogle tilfælde er antigen og immunogen samme helhed, som når et syntetisk polypeptid anvendes til 15 at fremkalde produktion af antistoffer, som bindes til polypeptidet. Imidlertid fremkalder de samme polypep-tider (99, 100 og 142) også antistoffer, der bindes til et helt protein, såsom HBxAg, i hvilket tilfælde po-lypeptidet er både immunogen og antigen, medens HBxAg 20 er et antigen. Når en helhed, der omtales her, er både immunogen og antigen, vil den i reglen blive kaldt et antigen.

(5) Analysesysterner og -metoder

Ovennævnte resultater viser, at SVHBV-3 kan 25 anvendes som ekspressionsvektor. Det tilvejebringer ekspressionsreguleringselementer for fremmede DNA-se-kvenser, der er indsat i aflæsningsramme længere fremme fra HBxAg-genet.

Resultaterne viser også, at syntetiske poly-30 peptider 99, 100 og 142 og antipeptid-antistoffer herimod kan anvendes som del af et analysesystem og en metode til påvisning af forekomst af HBxAg i en kropsprøve, der skal analyseres, såsom hepatomceller eller leverceller fra en dyrevært, der mistænkes for at have 35 HBxAg, til påvisning af heldig transfektion med SVHBV-3

og til at overvåge ekspression, når SVHBV-3 anvendes I

DK 175364 B1 I

som ekspressionsvektor. I

Et sådant system omfatter mindst et første I

reagens indeholdende receptormolekyler, der omfatter I

et antistof-kombineringssted, såsom antistoffer, hoved- I

5 sagelig hele antistoffer eller de velkendt Fab- eller I

f(ab')2~antistofdele, og kan immunreagere med et synte- I

tisk polypeptid ifølge opfindelsen, dvs. produceret mod I

de syntetiske polypeptider ifølge opfindelsen. En in- H

dikator, såsom et fluorescerende farvestof som fluore- I

10 scein eller rhodamin, et radioaktivt grundstof såsom I

iod-125 eller carbon-14, eller et enzymbundet antistof I

produceret mod det første reagens’ receptorer (f.eks. I

peroxidase-bundet gede-anti-kanin IgG), der skal sig- I

nalere immunreaktion mellem det første reagens' recep-

15 torer og det ekspressionsspecifikke HBxAg, tilvejebringes I

også. Indikatoren kan være indledningsvis bundet el- I

ler fri fra det første reagens. Typiske anvendelsesom- I

råder for et sådant HBxAg-analysereagenssystem omfatter I

enzymbundne immunsorbensanalyser (ELISA), radioimmunana- I

20 lyser og immunfluorescerende analyser (IF). I

Diganostiske prøver til bestemmelse af fore- I

kornst af HBxAg i en kropsprøve ved hjælp af polypepti- I

derne ifølge opfindelsen og disses anti-polypeptidan- I

tistoffer er allerede omtalt i store trask. Ved en kom- I

25 merciel udførelsesform for en sådan diagnostisk analyse I

tilvejebringes et diagnostisk analysesystem. I

Et sådant system indeholder f.eks. mindst én I

beholder med en anti-polypeptidreceptor, såsom anti-99 I

eller anti-142 som første reagens. En anden beholder I

30 med en mængde polypeptid, mod hvilket anti-polypeptid- I

antistoffet blev produceret, f.eks. polypeptid 99 el- I

ler polypeptid 142, kan også tilvejebringes som andet reagens I

Yderligere beholdere med de ovenfor beskrevne indika- I

torer, en eller- flere puffere og lignende, som det er H

35 velkendt, kan oqså findes i diagnoseanalysesystemet. I

39 DK 175364 B1

En fremgangsmåde til afprøvning af tilstedeværelse af en påviselig mængde HBxAg er også blevet omtalt i store træk. I korte træk omfatter metoden, at proteiner fra en kropsprøve, der skal undersøges, såsom 5 hepatoma- eller leverceller, blandes med receptorer, der omfatter et antistof-kombineringssted, der kan im-munreagere med et syntetisk polypeptid ifølge opfindelsen og med HBxAg, såsom anti-99 eller anti-142, eller en Fab- eller F(ab’)-del deraf, i nærvær af en indika-10 tor, såsom med 125^ mærket Staphylococcus aureus (S, aureus)-protein A eller et enzymmærkestof, såsom peber-rodsperoxidase bundet til en af de ovennævnte receptorer, til signalering af en immunreaktion mellem HBxAg og receptorerne. Blandingen opretholdes i tilstrække-15 lig lang tid til, at indikatoren kan signalere, at der er indtruffet en immunreaktion, og signalets tilstedeværelse er blevet konstateret, f.eks. ved et autoradiogram. Kropsprøven eller proteiner derfra adsorberes fortrinsvis eller fikseres på anden måde (bindes) på 20 en fast matrice, såsom et ark nitrocellulose eller et objektglas, før de blandes med receptorerne.

Når indikatoren er et separat molekyle, såsom radiomærket S.aureus-protein A, blandes den bundne krops-prøve og receptormolekylerne først uden indikator, og 25 blandingen opretholdes i tilstrækkelig tid til, at der dannes et bundet immunreaktionsprodukt. Det bundne immunreaktionsprodukt skylles derpå. Den separate molekyleindikator blandes derpå med det bundne immunreaktionsprodukt, og denne blandingen opretholdes i til-30 strækkelig tid til, at der kan dannes et bundet, andet reaktionsprodukt, og tilstedeværelsen af et signal fra indikatoren konstateres.

Det ovenfor omtalte andet reagens, f.eks, po-lypeptiderne 99 og 142, kan anvendes som kontrolreagens 35 ved en immunreaktionsblokeringsundersøgelse, for at konstatere, om specifik, fremfor ikke-specifik immun-

I DK 175364 B1 I

I 40 I

I binding har forekommet. Sådanne blokeringsundersøgel- I

I ' ser er vist i fig. 7, 8 og 10. I

I Når SVHBV-3 anvendes som ekspressionsvektor, I

I j indsættes fremmed DNA længere fremme fra HBxAg-genet, I

I 5 fortrinsvis i dets særegne BamHI-restriktionssted, og den I

I således fremstillede nye vektor anvendes til at trans- I

I ficere celler. HBxAg's ekspression i en transficeret I

I celle er et sandsynlighedsbevis for ekspression af det I

I fremmed DNA, der er indsat i SVHBV-3. HBxAg's ekspres- I

I 10 sion påvist ved hjælp af det ovenfor beskrevne HBxAg- I

I -analysesystem viser ekspressionen af fremmed DNA ind- I

I sat i SVHBV-3. I

I Således kan undersøgelse af cellekolonier pro- I

I duceret efter forsøgt transfektion ved hjælp af oven- I

I 15 stående analysesystem anvendes til at udvælge de kolo- I

I nier, hvori transfektionen er lykkedes. Således høstes I

I celler fra kolonier, der fremkommer ud fra forsøgt ind- I

I førelse af vektoren i eucaryotiske celler, lyses, og I

I celleproteinerne ekstraheres, hvorefter de adskilles I

I 20 på en SDS-polyacrylamidgel ved elektroforese, og de I

fraskilte proteiner aftrykkes på nitrocellulose. Når I

I de aftrykkede proteiner bringes i kontakt med et over- I

I skud af receptor og mærkestof i det ovenfor beskrevne I

125 I

analysesystem, såsom med -I mærkede antistoffer mod I

I 25 syntetisk polypeptid 99 eller 142, efterfulgt af skyl- I

I ning for at fjerne ikke-immunomsatte antistoffer (recep- I

I torer), kan dernæst anvendes til fremstilling af et au- I

I toradiografi, der viser tilstedeværelse af den udtrykte I

I HBxAg-del, som er sammensmeltet med det polypeptid, der I

I 30 kodes for af det fremmede gen. I

De ovenfor beskrevne analysemtoder og -syste- I

I mer er særlig anvendelige til identificering af X-pro- I

I teinet eller en væsentlig del deraf, som kan forekomme I

i en kropsprøve, især en vævsprøve, såsom i celler fra I

I 35 en leverbiopsi. Den nedenfor beskrevne diagnostiske I

analyse og fremgangsmåde er særlig anvendelig til be- I

41 DK 175364 B1 stemmelse af tilstedeværelse af antistoffer mod det X--protein, der kan forekomme i. en kropsprøve, såsom helblod, serum eller plasma. En Western-aftryksanalyse vil blive benyttet som eksempel på en sådan diagnostisk frem-5 gangsmåde. Imidlertid benyttes der ved en kommerciel udførelsesform et ELISA-(enzymbundet immunsborbensana-lyse)-diagnosesystem.

Her anvendes fortrinsvis et ekspressionsprodukt fra med SVHBV-3-vektor transficerede celler, såsom 10 protein på ca. 24.000 dalton (polypeptid) udtrykt i BSC-l-celler, der er omtalt i forbindelse med fig. 10, som antigen, men der kan også anvendes et foretrukket polypeptid ifølge opfindelsen såsom polypeptid 99 eller 142 som antigen. Således anvendes HBxAg-molekylet selv, 15 der anvendes i hovedsagelig renset form opnået ved af-finitetschromatografi som omtalt nedenfor, en væsentlig del af HBxAg-molekylet som udtrykt ved med SVHBV-3-trans-ficerede BSC-l-celler (polypeptidet på 24.000 dalton) eller et polypeptid, der i aminosyrerestsekvens svarer til 20 en antigen determinant i HBxAg, som antigenet.

Antigenet bindes fortrinsvis på (adsorberes til) eller på anden måde fikseres på en fast matrice såsom tværbundet dekstran, der fås under varemærket "Sephadex''^ fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscatawy, New Jersey), 25 agarose, glasperler, polyvinylchlorid, polystyren, tværbundet acrylamid, nitrocellulose eller fordybningerne i en mikrotiterplade, der udgør en fast understøtning.

Antigenet, der fortrinsvis er bundet til en fast matrice som del af en fast understøtning, blandes 30 med en flydende kropsprøve, der skal analyseres, så at der dannes en blanding af fast/flydende fase. Blandingen opretholdes i tilstrækkelig tid,til at anti-X-prote-in-(anti-HBxAg)-antistoffer, der forekommer i kropsprøven, kan immunreagere med antigenet. At der er ind-35 truffet immunreaktion,bestemmes f.eks. med en indikator, der signalere tilstedeværelse af anti-S-protein-antistof-

I DK 175364 B1 I

I 42 I

I fer i den analyserede kropsprøve. I

I Ved en undersøgelse fremstilles f.eks. SVHBV-3- I

vektor-transficerede BSC-l-cellelysater, adskilles elek- I

I troforetisk og overføres og bindes til nitrocelluloseark I

5 som fast matrice på en måde, der i det væsentlige ligner I

I den, der er omtalt i forbindelse med fig. 10, til dan- I

I nelse af en fast fase. Sera fortyndet 1:50 fra seks pa- I

tienter med forskellige leversygdomme, blandes hver for I

I sig med de på nitrocellulose bundne, transficerede BSC-1- I

I 10 -celleproteiner, så at der dannes blandinger af fast/fly- I

I dende fase. Disse blandinger opretholdes i et tidsrum I

I (2 timer), der er tilstrækkeligt til, at anti-X-antistof- I

I fer, der forekommer i seraene, kan immunreagere med det I

bundne antigen. I

I 15 Efter skylning for at adskille den faste og I

I den flydende fase, blandes de faste faser, der fremkom- I

I mer fra de ovennævnte trin, separat med flydende opløs- I

I ninger, der indeholde 1:200-fortyndinger af gede-anti- I

I -human- eller anti-kanin-antistoffer konjugeret til pe- I

I 20 berrodsperoxidase som indikator, så at der dannes I

I andre fast/flydende faseblandinger. De separate, andre I

I fast/flydende faseblandinger opreholdes i et tidsrum (1 I

time), der er tilstrækkeligt til, at de mærkede anti- I

stoffer kan reagere med human-anti-X-antistoffer, som I

I 25 har immunreageret med det matricebundne antigen. Der I

I anvendes kanin-anti-polypeptid-antistoffer som kontrol- I

I ler for gede-anti-kanin-antistofferne. De fremkomne I

I faste/flydende-faseblandinger adskilles igen og skylles. I

I De fremkomne faste faser fremkaldes derpå ved hjælp af I

I 30 opløsninger indeholdende 4-chlor-l-naphthol som beskrevet I

I for fig. δ I

I Resultaterne af denne undersøgelse viser, at I

I serum fra en patient, der diagnosticeres som havende I

I et heptacellulært carcinom, indeholder antistoffer, I

I 35 som bindes til polypeptidet, der udtrykkes af SVHBV-3- I

I vektoren i de transficerede BSC-l-celler. Sådanne anti- I

43 DK 175364 B1 stoffer er således anti-X-antistoffer, og deres tilstedeværelse fastslår X-genproduktet som et autentisk antigen på et vist stadium af HBV-infektion.

Når polyeptidekspressionsproduktet på ca.

5 24.000 Dalton, der anvendes ved den ovenfor beskrevne

Western-aftryksanalyse, anvendes som antigen i en ELISA, som omtalt nedenfor, eller ved en anden lignende analy— se, renses dette polypeptid fortrinsvis og isoleres før en sådan anvendelse. Denne rensning og isolering kan 10 opnås ved hjælp af kendte metoder.

Således kan anti-99-^ eller anti-142-antistof-fer eller antistof-kombinerende steder derfor fremstilles som beskrevet her og bindes til en fast matrice, såsom agarose- og tværbundne agarosederivater, der forhand-15 les under varmeærkerne "Sepharose 6B, CL6B, 4B og CL4B" af Pharmacia Fine Chemicals eller sådanne, der forhand- (5) les under varemærkerne "Bio-Gel A-0,5M, A-1,5M og A-50M"^ af Bio-Rad Laboratories i Richmond CA. Det ovenfor beskrevne tværbundne dekstran, der forhandles under vare- 6) 20 mærket "Sephadex1 , og polyacrylamidperler, der forhandles under varemærkerne Bio-Gel P-2, P-30, P-100 og P-300"® også af Bio-Rad-Laboratories, er også anvendelige som faste matricer. Anvendelse af en matrice, der består af et agarosederivat, omtales illustrerende nedenfor.

25 Agarosematricen aktiveres i reglen til bin ding ved hjælp af cyanogenbromid. Den aktiverede matrice vaskes derpå og bindes med de ønskede antistof-(receptor)-molekyler uden tørring af den aktiverede ma? trice. Det matrice-bundne antistof vaskes derpå og 30 er parat til brug. Uomsatte reaktive grupper på matricen kan omsættes med et amin, såsom ethanolamin eller Tris, om ønsket, selv om sådanne reaktive grupper hurtigt henfaldet.

Affinitetsorbenten kan anvendes i sin løse 35 tilstand, f.eks. i et bæger eller en kolbe, eller den kan fyldes på en kolonne. Før brug foretrækkes det, I DK 175364 B1

I 44 I

at affinitetssorbenten vaskes i pufferen eller det I

I andet vandige medium, der anvendes til rensning af cel- I

I lelysater indeholdende polypeptider på ca. 24.000 dalton, I

I for at eliminere ikke-specifikt bundne proteiner eller I

5 sådanne antistoffer, som er bundet ustabilt til under- I

I støtningen. I

En vandig sammensætning indeholdende med I

SVHBV-3-vektor transficeret cellelysat tilvejebringes I

I og blandes derpå med affinitetssorbenten. Denne bian- I

10 ding danner et reversibelt bundet antistof/antigen-(re- I

ceptor/ligand)-kompleks mellem det bundne antistof (re- I

I ceptor) og polypeptidet på ca. 24.000 dalton (antigen). I

Det bundne receptor/ligand-kompleks adskilles I

derpå fra resten af den ikke-kompleksbundne vandige sam- I

15 mensætning, så at peiypeptidantigenet derved fås i ren- I

I set form bundet til affinitetssorbenten. Når blandin- I

I gen finder sted i et bæger eller en kolbe, kan denne I

I adskillelse foretages ved filtrering og vask. Når sor- I

I benten er i en kolonne, kan adskillelsen finde sted ved I

I 20 eluering af det ikke-kompleksbundne vandige medium, igen, I

I fortrinsvis, efterfulgt af et vasketrin. I

I Når man ønsker det rensede polypeptidantigen I

I fri fra affinitetsorbenten, kan dette i reglen ske ved I

I en række forskellige metoder. Ved en hvilken som helst I

I 25 af disse metoder dissocieres det reversibelt bundne re- I

I ceptor/ligand-kompleks i dets komponentdele bestående I

I af matricebundet receptor og polypeptidantigenligand, I

efterfulgt af adskillelse af denne polypeptidantigen- I

I ligand fra den bundne receptor, så at der fås en opløs- I

30 ning af den rensede polypeptidantigenligand uden affi- I

nitetssorbenten. Opløsningen kan bruges som den er, el-. I

ler den kan koncentreres eller tørres før brug efter øn- I

ske. I nogle tilfælde kan det være ønskeligt af afsalte I

opløsningen før brug, som bekendt. I

35 Dissocieringen af det reversible kompleks kan I

ske på en række måder. I reglen anvendes en 0,2 molær I

I.*,!·.· IU JJIBJ Him **r·:’- -^,1. ,ί·ηυ m g=^sa i DK 175364 B1 45 glycinhydrochloridopløsning ved en pH-værdi på ca. 2,5.

Alternativt kan den bundne polypeptidantigenligand konkurreres bort fra den bundne receptor ved, at det reversible kompleks blandes med et overskud af det immuno-5 gene polypeptid, der anvendes til at producere antistofferne, f.eks. polypeptid 99, hvor anti-99-antistoffer er bundet til matricen. Ved en sådan konkurrence undgås eventuel denaturering af polypeptidantigenet. Adskillelse af det dissocierede polypeptidantigen fra af-10 finitetssorbenten kan ske som nævnt ovenfor.

Fremstillingen af affinitetssorbenter og deres anvendelse er i store træk kendt. Imidlertid har sådanne materialer og anvendelsesområder, der inkorporerer antistoffet og antigenmolekylerne ifølge opfindel-15 sen, ikke før været til rådighed. En detaljeret beskrivelse af affinitetssorbenter, fremgangsmåder til deres fremstilling og anvendelse, hvor antigenet er bundet til matricen, kan findes i Antibody as a Tool, Marchalo-nis og Warr udg., John Wiley & Sons, New York, side 64-20 67 og 76-96 (1982).

Eksempelvis anvendes der ELISA, ved hvilken den ovennævnte fremgangsmåde benyttes, en fast understøtning, der består af det ovenfor beskrevne antigen ifølge opfindelsen adsorberet på eller på anden måde 25 fikseret på en fast matrice, der består af fordybningerne i en mikrotiterplade med 12 eller 96 fordybninger fremstillet af polystyren eller polyvinylchlorid, så at der dannes en fast understøtning. Ikke-specifikke bindingssteder på mikrotiterfordybningsvæggene blokeres 30 derefter typisk med et protein, såsom okseserumalbumin (BSA). Eventuelt ubundet antigen og BSA fjernes fra mi-krotiterfordybningen, f.eks. ved skylning.

En kropsprøvealikvot, såsom human serum, blod eller plasma, blandes med den ovenfor beskrevne anti-35 genbundne faste understøtning, så at der dannes en blanding indeholdende fast og flydende fase. Bian-

I DK 175364 B1 I

I 46 I

I dingen af fast/flydende fase opretholdes i tilstrække- I

I lig tid til, at anti-X-protein-antistoffer i kropsprøven I

I immunreagerer med antigenet, f.eks. ca. 30 minutter til I

I ca. 2 timer. Derefter adskilles i reglen den faste og I

I 5 flydende fase. I

I Derpå blandes en flydende opløsning af et I

I andet mærket antistof indeholdende indikator, antistof- I

I kombinerende sted eller S.aureus-protein A, som reage- I

I rer med det førstenævnte antistof, med den faste fase, I

I 10 så at der dannes en anden blanding af fast/flydende fase. I

I Et eksempel på et andet antistof er et med peroxidase

I mærket gede-antihumån-Ig-antistof, hvor de førstenævnte I

I antistoffer er fra en human kropsprøve. Andre anvende- I

I lige enzymmærkestoffer omfatter alkalisk phosphase, &-D- I

I 15 -galactosidase og glucose-oxidase. I

I Blandingen, der er dannet af den faste fase I

I (det faste matricebundne antigen/antistof-immunreaktions- I

I produkt) og den anden mærkede antistofopløsning opret- I

I holdes (inkuberes) i et tidsrum (f.eks. ca. 1 time), der

I 20 er tilstrækkeligt til at danne et reaktionsprodukt mel- I

I lem det bundne førstnævnte antistof og indikatoren, så- I

I som en anden immunreaktion mellem de to antistoffer.

I Derefter adskilles fast og flydende fase. I

I Det andet ovenfor beskrevne antistof kan også I

I 25 være specifikt for og immunreagere roed kun en af immun- I

I globulinklasserne (f.eks. IgG, IgM, IgE, IgA eller IgD). I

I Sådanne antistoffer tilvejebringer evne til at identi- I

I ficere immunglobulinklassen af det anti-X-proteinanti- I

I stof, der forekommer i kropsprøven. Desuden kan det I

I 30 andet antistof eller antistofkombineringssted være spe- I

I cifikt for og immunreagere med kun den ene af de to ty- I per lette immunglobulinkæder (f.eks. kappa eller lambda).

I Disse antistoffer tilvejebringer evnen til at identifi- I

I cere isotypen af det immunglobulinmolekyle, der fore- I

I 35 kommer i kropsprøven, og er velkendt. I

........=:· _:-MU—II ""-*1 DK 175364 B1 47

En opløsning indeholdende et substrat for enzymmærkningen, såsom hydrogenperoxid for peroxidase og en farvedannende farvestofsprecursor, såsom O-phenylen-diamin eller 4-chlor-l-naphthol eller p-nitrophenyl-5 phosphat til alkalisk phosphatase, blandes derefter med den faste fase. Den optiske densitet ved en forudvalgt bølgelængde (f.eks. hhv. 490 eller 405 nanometer) kan derpå bestemmes efter, at der er gået tilstrækkelig tid (f.eks. 60 minutter), og sammenlignes med den optiske 10 densitet i en kontrol til bestemmelse af, om der forekommer anti-X-protein-antistoffer i kropsprøven.

En anden udførelsesform omfatter et diagnosesystem i sætform, som indbefatter en fast understøtning, der er en fast matrice, såsom en mikrotiterstrimmel af polystyren 15 med 12 fordybninger og et antigen som beskrevet ovenfor ifølge opfindelsen absorberet (bundet) eller på anden måde fikseret på den faste matrice, så at der dannes en fast understøtning. Dette system omfatter fortrinsvis også separat emballerede anti-hum-Ig-antistoffer med en bundet indikator, 20 såsom med peroxidase mærket gede-anti-human-Ig-antistoffer, og kan også omfatte et substrat for den bundne indikator, såsom hydrogenperoxid og en farvedannende farvestofsprecursor, såsom o-phenylendiamin, i andre separate pakninger. Hydrogenperoxid er i reglen ikke med 25 i sættet, på grund af dets forholdsvis store ustabilitet, og leveres i reglen af den endelige forbruger, men én beholder med hydrogenperoxid kan også udgøre en del i diagnosesystemet. Puffersalte, der kan anvendes ved en analyse ifølge dette system, kan også indgå i en 30 eller flere separate pakninger i tør eller flydende form.

Et foretrukket polypeptid ifølge opfindelsen, såsom poly-peptid 99, kan også indgå i en separat pakning til brug ved undersøgelser af konkurrerende binding som kontrol.

En analyse for tilstedeværelse af anti-X-protein-ansti-35 stoffer i en kropsprøve, såsom serum, kan udføres med dette diagnosesystem ved hjælp af den ovenfor beskrev-

I DK 175364 B1 I

I 48 I

I ne fremgangsmåde. I

I (6) Fremstilling af polymere I

I Polypeptiderne ifølge opfindelsen kan være bun- I

I det sammen til dannelse af en vandopløselig· eller vand- I

I 5 dispergerbar antigen polymer, der omfatter en flerhed I

I af polypeptidgentagelsesenhederne. En sådan polymer I

I har den fordel, at den giver forøget immunologisk reak- I

I tion. Når der anvendes forskellige polypeptider til op- I

I fyldning af polymeren, har sådanne polymere den yderli- I

I 10 gere evne, at de fremkalder antistoffer, som immunreage- I

I rer med en flerhed af antigene determinanter for HBxAg. I

I En polymer kan fremstilles ved at syntetisere I

I polypeptiderne, som omtalt nedenfor, så at de indehol- I

I der to cysteinrester. De to cysteinrester kan forekom- I

I 15 me i den ene endestilling og i polypeptidkæden, eller i I

I både amino- og carboxyendestillingen. Et polypeptid, I

I der indeholder to cysteiner, omtales i reglen her som I

I et "diCys"-polypeptid, medens et polypeptid, der inde- I

I holder to endestillede cysteinrester, her omtales som I

I 20 et "diCys-endestillet" polypeptid. Sådanne cysteinre- I

I ster i polypeptidkæden eller i polypeptidkædens ende- I

I stillinger kan forekomme i HBxAg-sekvensen, hvortil po- I

I lypeptidet svarer, f.eks. det centrale cystein i poly- I

I peptid 142 (den 7. rest fra det carboxy-endestillede I

I 25 alanin [Ala]), det carboxy-endestillede cystein (Cys) i I

I polypeptid 99, eller de endestillede cysteinrester kan I

I tilføjes med henblik på fremstilling af polymeren. I

I Eksempler på anvendelige diCys-polypeptider I

I er de, der er gengivet ved formlerne nedenfor, skrevet I

I 30 fra venstre til højre og i retning fra amineendestilling I

I til carboxyendestilling: I

I Polypeptid. 99a; Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser- I

I Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cys, I

I Polypeptid· 100a: Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp- I

I 35 Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile'-Arg-Leu-Lys-Val-Cys, og I

49 DK 175364 B1

Polypeptid 142a: R^Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala-R2, 1 2 hvor R og R hver er en cysteinrest, forudsat at kun 1 2 et af symbolerne R og R er til stede.

5 Som det ses i fig. 6 indeholder hvert af po- lypeptiderne 99, 100 og 142 en cysteinrest, som forekommer i aminosyrerestsekvensen i det translaterede X-genom.

Det skal gentages, at polypeptider med polypeptider 99's og 100's aminosyrerestsekvenser med undtagelse af de 10 endestillede cysteinrester, også kan anvendes her til immunreaktionsblokeringsundersøgelser, og når der anvendes kobling til en bærer ved hjælp af anden reaktion end MBS, som vil blive omtalt nedenfor.

Når der tilføjes en eller to endestillede cy-15 steinrester med henblik på polymerfremstilling, og den øvrige aminosyrerestsekvens svarer til en antigen determinant i HBxAg, anåes polypeptid-gentagelsesenheden stadig som svarende til en antigen determinant i HBxAg.

Ved en typisk laboratoriefremstilling opløses 20 10 mg af diCys-polypeptidet (indeholdende cysteinrester i ikke-oxideret form) i 250 ml 0,1 molær ammoniumbicar-bonatpuffer med en pH-værdi på ca. 8. Det opløste diCys-endestillede polypeptid luftoxideres derpå ved mild omrøring af den fremkomne opløsning i et tidsrum på ca.

25 18 timer, eller indtil der ikke mere kan påvises fri mercaptan ved Ellman-prøven [jvr. Ellman, Arch. Biochem.

Biophys. 82, 70-77 (1959)].

Den således fremstillede polymer indeholder flere polypeptider ifølge opfindelsen som gentagelses-30 enheder. Disse polypeptidgentagelsesenheder er bundet sammen af oxiderede cysteinrester.

En sådan polymer, der indeholder en flerhed af polypeptiderne ifølge opfindelsen, kan gengives ved formlen, skrevet fra venstre til højre og i retning fra 35 aminoendestilling til carboxyendestilling

I DK 175364 B1 I

I 50 I

I (A)a' (B)b I

I hvor A og B er forskellige polypeptidgentagelsesenheder, I

I såsom polypeptiderne 99, 100 og 142. Indeks- I

I 5 bogstaverne a og b er hele tal, der hver har en gennem- I

I snitsværdi på 0 til ca. 2000 forudsat, at summen af gen- I

I nemsnitsværdierne og a og b er mindst 2, så at der er I

I mindst to polypeptidgentagelsesenheder i polymeren. I

I Summen af gennemsnitsværdierne af de lavere I

I 10 skrevne bogstaver a og b er i reglen ikke mere end ca. I

I 2000, så at den fremkomne polymer har en gennemsnitlig I

I molekylevært på ca. 5.000.000 dalton. Fortrinsvis lig- I

I ger polymerens gennemsnitlige molekylevægt på ca. 50*000 I

I til ca. 1.000.000 dalton. I

I 15 Ovennævnte formel skal være en generaliseret I

I gengivelse af gentagelsesenhederne i polymeren og af I

I det gennemsnitlige antal af hver gentagelsesenhed,·, der I

I forekommer. Polymerene ifølge opfindelsen, som indehol- I

I der to forskellige gentagelsesenheder, er i reglen ran- I

I 20 copolymere. Den ovenfor anførte formel skal såle- I

I des ikke repræsentere den rækkefølge, hvori polypeptid- I

I gentagelsesenheder forekommer i polymeren, f.eks. som i I

I en blok-copolymer. I

I De ovenfor beskrevne vandopløselige eller vand- I

I 25 dispergerbare polymere ifølge opfindelsen er både immuno- I

I gene og antigene og beskrives derfor her som antigene, I

I som omtalt tidligere. Sådanne antigene polymere kan, I

I når de dispergeres i et fysiologisk tolerabelt fortyn- I

I dingsmiddel og indføres som immuniserende injektion i I

I 3 0 en mængde på 400^,ug polymer pr. kanin, fremkalde produk- I

I tion af antistoffer i New Zealand Eed-kaniner, som im- I

I munreagerer med HBxAg. Eksempler på fysiologisk tole- I

I rerbare fortyndingsmidler er kendt inden for immunolo- I

I gien og omtales mere detaljeret nedenfor. I

I 35 I

IBWPW1 *g-- - _;_ί1*\Η# ΤΓΡ 1 ^ί·-- - **»> ’" /**&:-.T&J'-* ,·-Γ_· .'»· -· - DK 175364 B1 51 (7) Kobling af polypeptider til proteinbærere

De syntetiske polypeptider, der benyttes her, kobles til nøglehulsklæbende hæmocyanin (KLH) ved hjælp af følgende kendte metode. KLH-bæreren aktiveres først 5 med m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester og kobles derpå til polypeptidet via en cysteinrest, der forekommer i polypeptidets amino-endestilling (polypeptid 100), carboxyendestillingen (polypeptid 99) eller ved hjælp af det centrale cystein i polypeptid 142, ved 10 en Michael- additionsreaktion som beskrevet af Lui m. fl., Biochem. 80, 690 (1979).

Et polypeptid ifølge opfindelsen kan også kobles til en bærer på forskellige måder og kan kobles til andre bærere end KLH. Således kan et polypeptid, f.eks.

15 polypeptid 99b, kobles til en tetanustoxoid bærer via frie aminogrupper ved hjælp af en 0,04% glutaraldehyd-opløsning, som det er velkendt, jfr. f.eks. Klipstein m.fl., J. Infect. Disc. 147, 318.

Cysteinrester, der forekommer i amino- eller 20 carboxyendestillingen eller i den centrale del af det syntetiske polypeptid, har vist sig at være særlig anvendelige til dannelse af konjugater via disulfidbin-dinger og Michael- addtionsreaktionsprodukter, men der kan også anvendes andre fremgangsmåder, der er 25 velkendt inden for fremstilling af konjugater. Eksempelvis omfatter yderligere bindings-("linking")-metoder anvendelsen af dialdehyder, såsom glutaraldehyd (nævnt ovenfor) og lignende eller anvendelse af carbo-diimidteknologi, som ved anvendelsen af et vandopløse-30 ligt carbodiimid, f.eks. l-ethyl-3-(3-dimethylaminopro-pyl)carbodiimid, til dannelse af amidled mellem bæreren og polypeptid.

Anvendelige bærere er velkendt på området og er i reglen selv proteiner. Eksempler på sådanne bærere 35 er nøglehulsklæberhæmocyanin (KLH), edestin, thyroglobu-

I DK 175364 B1 I

I 52 . I

I lin, albuminer, såsom okseserumalbumin eller humanserum- I

I albumin (hhv. BSA eller HSA), røde blodlegemer, såsom få- I

I reeryhthrocyter (SRBC), tetanustoxoid, choleratoxoid samt I

I polyaminosyrer, såsom poly(D-lysin:D-gltuaminsyre) og I 5 lignende.

I Det er også kendt, at det ofte er gavnligt at

I binde det syntetiske polypeptid til dets bærer ved hjælp I

I af en forbindende mellemgruppe. Som omtalt før er glu- I

I taraldehyd en sådan forbindende gruppe. I

I 10 Når der imidlertid anvendes cystein, er mellem- I

I forbindelsesgruppen fortrinsvis m-maleimidobenzoyl-N-hy- I

I droxysuccinimidester (MBS), som også omtalt før. MBS I

I tilsættes i reglen først til bæreren ved hjælp af en e- I

I ster/amid-udvekslingsreaktion. Derefter følger den o- I

I 15 vennævnte Michael-reaktion, eller MBS-additionen kan I

I efterfølges af en Michael-addition af en blokeret mer-

I captogruppe, såsom thioleddikesyre (CH^COSH) tværs ον- I

I er maleimido-dobbeltbindingen. Efter spaltning af acyl- I

I blokeringsgruppen, dannes der en disul- I 20 fidbinding mellem de afblokerende forbindelsesmercaptan-

I gruppe og mercaptanen i den tilføjede cysteinrest i det I

I syntetiske polypeptid.

I Valg af bærer afhænger mere af den endelige I

I tilsigtede anvendelse af antigenet end af antigenets de- I

I 25 terminantdel og er baseret på kriterier, der ikke er I

I særlig involveret i den foreliggende opfindelse. Hvis I

I f.eks. et podestof skal anvendes i dyr, som til produk- I

I tion af anti-polypeptidantistoffer, der skal anvendes I

I til analyse for tilstedeværelse af HBxAg, bør der vælges I

I 3 0 en bærer, der ikke fremkalder uheldig reaktion i det sær- I

I lige dyr. Hvis et podestof, såsom en vaccine mod HBxAg, I

I skal anvendes til mennesker, indebærer de overvejende I

I hensyn manglen på immunkemisk eller andre bidereåktioner I

I i bæreren og/eller det fremkomne antigen, sikkerhed og I

I 35 effektivitet - de samme betragtninger, der gælder en I

53 DK 175364 B1 hvilken som helst vaccine, der er beregnet til brug i mennesker og dyr.

(8) Immuniseringsmetoder s J De podestoffer, der anvendes til iromuniserin- 5 ger, indeholder en effektiv mængde polypeptid som en polymer af individuelle polypeptider bundet sammen via oxiderede cysteinrester eller som konjugat af polypep-tid bundet til en bærer. Den effektive mængde polypeptid pr. inokulering afhænger bl.a. af den dyreart, 10 der skal inokuleres, dyrets legemsvægt og det valgte inokuleringsskema, som det er velkendt. Podestoffer fremstilles i reglen ud fra den tørrede faste polypeptid-konnugat eller polypeptidpolymer ved at suspendere poly-peptid-konjugatet eller polypeptidpolymeren i vand, 15 saltvandsopløsning eller adjuvans.

Disse podestoffer indeholder i reglen polypep-tidkoncentrationer på ca. 20 mikrogram til ca. 500 mg pr. inokulering. De anførte mængder polypeptid referer til vægten af polypeptid uden vægten af en bærer, når en 20 sådan anvendes.

Podestoffer indeholder også et fysiologisk to-lererbart (acceptabelt) fortyndingsmiddel, såsom vand, phosphatpufret saltvandsopløsning eller saltvandsopløsning og omfatter i reglen et adjuvans som en del af for-25 tyndingsmidlet. Adjuvanser, såsom komplet Freund's adjuvans (CFA), ukomplet Freund's adjuvans (IFA) og alun er velkkendte materialer på området og kan fås i handelen flere steder.

Podestofstamopløsninger fremstilles med CFA, 30 IFA eller alun på følgende måde: En mængde af det syntetiske polypeptid-konjugat eller polymerpolypeptid, der er stor nok til at give den ønskede mængde polypeptid pr. inokulering, opløses i phosphatpufret saltvandsopløsning (PBS) ved en pH-værdi på 7,2. Lige store vo-35 luminer CFA, IFA eller alun blandes derpå med polypeptid-

I DK 175364 B1 I

li 54 I

I 1 ° i

I opløsningen, så at der fås et podestof indeholdende poly- I

I peptid, vand og adjuvans, hvori vand/olie-forholdet er I

I ca. 1:1. Derefter homogeniseres blandingen, så at der I

I fås en podestofstamopløsning. I

I 5 Kaniner, der bruges her til at producere anti- I

I polypeptid-antistoffer, injiceres subcutant med et po- I

I destof omfattende 200 mikrogram af et polypeptid-konju- I

I gat (polypeptid + bærer) emulgeret i komplet Freund's I

I adjuvans (CFA); 200 mikrogram polypeptidkonjugat i ukom- I

I 10 plet Freund's adjuvans (IFA) og 200 mikrogram polypep- I

I tid-konjugat med 4 mg alun injiceres intraperitonealt på I

I hhv. dag 0, 14 og 21 i immuniseringsskemaet. Hver inoku- I

I lering (immunisering) består af fire injektioner pode- I

I stof. Mus kan immuniseres på lignende måde ved hjælp I

I 15 af ca. 1/10 af den ovennævnte dosis per injektion. I

I Dyrene tappes i reglen for blod 4 og 15 uger I

I efter den første injektion. Kontrol-præ-immunserum fås I

I fra hvert dyr ved blodtapning lige før den indledende I

I immunisering. I

I 20 Der kan også fremstilles kontrolpodestofsstam- I

I opløsninger med nøglehulsklæberhæmocyanin (KLH), KLH i I

I IFA (ukomplet Freund's adjuvans), KLH-alun absorberet, I

I KLH-alun absorberet-pertussis, edestin, thyroglobulin, I

I tetanustoxoid, tetanustoxoid i IFA, choleratoxoid og cho- I

I 25 leratoxoid i IFA. I

I Efter injektion eller anden indførelse af anti- I

I genet eller podestoffet i værtsdyret, reagerer dyrets I

immunsystem ved at producere store mængder antistof mod I

I antigenet. Eftersom den specifikke antigene determi- I

I 30 nant i det fremstillede antigen, dvs. det antigen, der I

I dannes af det syntetiske polypeptid bundet til bæreren I

eller polymeren, svarer til determinanten i det pågæl- I

I dende naturlige antigen, producerer værtsdyret antistof- I

I fer ikke blot mod det syntetiske polypeptidantigen, men I

I 35 også mod proteinet eller polypeptidet, hvortil det syn- I

I tetiske polypeptidantigen svarer, dvs. mod HBxAg. I

O

55 DK 175364 B1 (9) Deponeringer

De materialer/ der er opregnedet nedenfor, er deponeret i American Type Culture Collection den 8. marts 1984 og har deponteringsnumrene anført for hvert.

5 Alle betegnelserne for cellelinievektorer og lignende, der omfatter bogstaverne ATCC efterfulgt af tal og/eller bogstaver og numre refererer til materialer, der er deponeret i American Type Culture Co-lection, 12301 Park-lawn Drive, Rockville, MD 20852.

10 ATCC

Materiale Deponeringsnummer

Blanding af virus SVHBV-3 VR 2084

og SV40 tsA229_hjælpervirus Vektor-DNA

15 SVHBV-3 40102 AM6 40101 SVAM191 40103 E.coli 20 EC-AM6 39630 EC-AM1 39623 EC-SVAM191 39631

Foruden ovennævnte materialer, der er depo-25 neret hos ATCC, er også materialer fremstillet af andre end opfinderne og anvendt her blevet deponeret hos ATCC.

Nedenfor følger en liste over disse materialer.

ATTC

Materiale Deponeringsnummer 30 _ , .

E. coli W3110 27325 294 31446 RR1 31447 HB101 33694 35

I DK 175364 B1 I

I 56 I

I O ATCC I

Pattedyreceller_Depone ringsnurmner I

I HepG2 CCL 23 I

I BSC-1 CCL 26 I

I COS-7" - .... CRL 1651 I

I 5 PLC/PRF/5 CRL 8024 I

I Vektor I

I pBR322 37017 I

I 10 I

I B. Materialer og metoder I

I (1) HBV-DNA-isolering og rensning I

I Region XBHV-DNA isoleres ud fra Dane-partikler I

I subtype adw, fra plasma fra en HBsAg-positiv human donor I

I 15 (National Institutes of Health nr. 737139) ved hjælp af I

I Robinson's metode, Am. J. Med. Sci. 270, 151-159 (1975) I

I I korte træk fortyndes 1,0 ml plasmid til 3,0 ml med TN- I

I -puffer, der indeholder 0,001 molær (M) Tris-HCl (pH I

I 7,4) og 0,5 molær HC1. Den fortyndede plasma centrifu- I

I 20 geres ved 10..000 G i 10 minutter for at fjerne store I

I rester og lægges derpå i et lag over 2,6 ml 30% (væ/vo) I

I saccharose indeholdende TN, 0,001 MEDTA [0,1% 2-mercapto- I

I ethanol og 1 mg/ml okseserumalbumin (BSA) , som i forve- I

I jen er centrifugeret ved 10.000 G i 10 minutter for at I

I 25 fjerne udfældet BSA]. Efter centrifugering i 4 timer B

I ved 50.000 omdr./min., 4°C i en "Spinco SW-65” centrifu- I

I ge (Beckman Instruments, Inc.) fjernes væskeoverfasen fl

I forsigtigt, og pellet'en suspenderes igen i 50 mikroli- B

I ter TN-puffer indeholdende 1% "Nonidet P-40" (polyoxy- I

I 30 ethylen (9) octylphenylether, Sigma Chemical Co., St. fl I Louis, MO) og 0,1 % 2-mercaptoethanol. fl I Den enkeltstregenede del af HBV-DNA'et, der fl I er isoleret som ovenfor, gøres dobbeltstrenget ved at fl I tilsætte 25 mikroliter "Blanding E" [0,2 molær Tris- fl

I 35 -Hel (pH 7,4), 0,08 molær MgC^, 0,24 NH4C1, 1,0 mmolær I

I af hver af daTP, dTTP og dCTP] til de 50 mikroliter at- fl

I ter suspenderet HBV-DNA, efterfulgt af inkubering ved B

I 37°C i 3 timer [Robinson, Am. J. Med. Sci. 270, 151- B

I 159 (1975)]. I

DK 175364 B1 57

O

Radioaktivt mærket HBV-DNA, der skal anvendes som genomsonde, fremstilles ved at anvende ovennævnte udfyldningsmetode ved at anvende 0,25 mikroliter af hver af 3H4CTP og 3HdGTP (begge 21 Curie pr. mmol) i 5 stedet for hhv. dCTP og dGTP.

(2) HBxAg-kloninq

En del af HBV-genomet, der indeholder den DNA--sekvens, der koder for HBxAg, klones ved hjælp af plas-midet pBR322 indført i E.coli, Dobbeltstrenget umærket 10 HBV-DNA isoleret som ovenfor fordøjes med restriktions-endonucleasen BamHI [50 mmolær NaCl, 10 mmolær Tris-HCl (pH 7,5), 10 mmolær MgCl, 1 mmolær dithiothreitol]. Reaktionsblandingen elektroforeseres i en 0,6% agarose vandret pladegel ved 100 amp. i 2 timer (0,04 Tris-ace-15 tat, 0,002 molær EDTA) .

Farvning med 1% ethidiumbromid afslører tre HBV-DNA-fragmenter, der viser tilstedeværelse af to BamHi-restriktionssteder i genomet. Et fragment på 3200 basepar (bp) repræsenterer hele HBV-genomet i lineær form 20 som følge af, at det kun er skåret i et af BamHI-steder-ne. Fragmenterne på 1850 bp og 1350 bp repræsenterer genomet skåret i to fragmenter som følge af fuldstændig BamHI-fordøjelse.

Kopier af de tre BamHI HBV-DNA-restriktions-25 fragmenter, der er isoleret ovenfor, fås ved kloning i plasmidet pBR322 (ATCC 37017) [Sutcliffe, P. Natl. Acad.

Sci. USA 75, 3737-3791 (1978)]. For at indsætte HBV-DNA-BamHI-fragmenterne i pBR322 lineariseres plasmidet ved fordøjelse med BamHI [50 mmolær NaCl, 10 mmolær Tris-HCl 30 (pH 7,5) , 10 mmolær MgC^, 1 mmolær dithiothreitol] til dannelse af endestillinger, der er komplementære med dem på HBV-fragmenterne. De tre HBV-DNA-fragmenter og pBR322-fragmentet blandes og underkastes DNA-ligatering med T4-DNA-ligase [66 molær Tris-HCl (pH 7,6), 66 mmolær 35 MgC^, 10 mmolær dithiothreitol og 0,4 mmolær ATP]. Ligateringsreaktionsproduktet, der fås ved ovennævnte reak-

I DK 175364 B1 I

I 58 I

I ° I

I tion er et cirkulært DNA afledt ud fra det linearisere- I

I de pBR322 og HBV-fragmenter ved at forene deres komple- I

I mentære endestillinger. I

I De cirkulære rekombinante plasmider indføres I

I 5 i E.coli stamme HB101 (ATCC 33694, leveret af dr. Dean I

I hunter ved National Cancer Institute, NIH, Bethesda, I

I MD), efterfulgt af Cohen m.fl.'s metode, Proc. Natl. I

I Acad. Sci. USA 69, 2110-2114. I korte træk inkuberes I

I en E.coli HBlOl-kultur i en opløsning af 0,03 molær I

I 10 CaC^ ved 0°C i 20 minutter. Der tilsættes 5 x 10^ I

I bakterieceller til 0,3 ml af samme opløsning, hvortil I

I der er tilsat 100 ng rekombinante plasmider. Denne I

I transformationsreaktionsblanding inkuberes ved 0°C i I

I 60 minutter. I

I 15 Plasmidet pBR322 indeholder ampicillin- og ^ I

I tetracyclinresistens-gener. Medicihfølsomme bakterie-

I celler transformeret med dette plasmid udviser ampicil- I

I lin- og tetracyclinresistens. Eftersom pBR322-DNA kun I

I har ét BamHI-spaltningssted, som findes på tetracyclin- I

I on m I resitensgenet, afbryder indsættelse af HBV-fragmenter i

I BamHI-stedet dette gen. Medicinfølsom E.coli HB101 I

I transformeret med et plasmid, der er afledt ud fra I

I pBR322 med et indsat HBV-DNA-fragment i BamHI-stedet I

I (kloningsvektor), udviser derfor ampicillinresistens og I

I 25 I tetracyclinfølsomhed.

I Transformeret E.coli, dvs., sådanne, der inde- I

I holder det plasmid-ampicillinresistensgivende gen, udvæl- I ges ved udstrygning af transformationsreaktionsblandin-

I gen på et LB-næringsvæskeagarmedium [et vækstmedium, I

I 3Q I

I der pr. liter indeholder 10 g "Bactoagar", 10 g "Bacto-

I trypton", 5 g "Bacto" gærekstrakt (alle fra Difco Labs, I

I Detrois MI) og 5 g NaCl] indeholdende 50 mikrogram pr.

I ml ampicillin. De udstrøgne E.coli inkuberes ved 37°C I

I i to dage. I

I 35 I

I Blandt de kolonier, der udviser ampicillinre-

I sistens efter transformation ved ovenstående metode, ud- H

DK 175364 B1 59

O

vælges tetracyclin-følsomme kolonier ved at udstryge kolonierne på en LB-næringswæske, nævnt ovenfor, indeholdende 50 mikrogram pr. ml tetracyclin i stedet for ampicillin. Disse udtrøgne kolonier inkuberes også ved 5 37°C i to dage. E.coli HB101-stammer, der indeholder pBR322 med HBV-DNA-fragmenter indsat i BamHI-spaltnings-stedet i tetracyclinresistensgenet, opnås på denne måde.

(3) Plasmid-DNA-ekstraktion E.coli HBlOl-celler, der indeholder det re-10 kombinante DNA, der er isoleret som ovenfor, dyrkes i LB-næringsvæskemedium indeholdende 20 mikrogram/ml ampicillin med tilsætning af chloramphenicol til en koncentration på 170 mikrogram/ml i den logaritmiske vækstfase.

Dyrkningen forsættes i flere timer til formering af 15 plasmid-DNA'et.

Cellerne lyses derpå ved at blande 5 ml 25% saccharose i 50 mmolær Tris-HCl-(pH 8,0)-opløsning med 500 ml celler. Efter inkubation i 10 minutter ved 0°C i-blandes 8 ml 1% "Triton X-100" [polyoxyethylen (9) oc-20 tylphenylether] i 0,15 molær Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 molær EDTA (pH 8,0), og inkuberes atter i 10 minutter ved 0°C.

Det fremkomne lysat centrifugeres ved 30.000 omdr./min. i en "Spinco SW-65" centrifuge (Beckman In-25 struments) for at fjerne denatureret protein og celle- i rester. DNA fældes ud fra det klarede lysat ved at iblande 1/10 volumen 2,5 natriumacetat og 2,5 volumendele 99% ethanol og inkubere ved -20°C i 30 minutter.

DNA-bundfaldet pelletteres ved centrifugering ved 10.000 30 G i 30 minutter.

Afproteinisering udføres to gange med 1 ml phenol mættet med 0,01 molær Tris-HCl (pH 7,6), U,I molær NaCl og 0,0012 EDTA. Landers m.fl., J. Virol. 23, 368-376 (1977). Od'fra det vandige lag fra ovennævnte 35 procedure fældes DNA1et ved at tilsætte 1/10 volumen 2 molær natriumacetat og 2,5 volumen 99% ethanol og inku-

60 I

DK 175364 B1 I

beres ved -20°C i 20 minutter. Centrifugering i 10 mi- H

nutter ved 10.000 G giver en pellet af fuldstændig dob- I

beltstrenget DNA; der omfatter genet, der koder for H

HBxAg. I

5 (4) Plasmid-DNA-analyse I

Tilstedeværelsen af KBV- DNA i klonerne bekræf- I

tes ved hjælp af Southern-overførsels- og hybridise- I

ringsteknik. Southern, Mol..Biol.98 503 (1975). 10 I

mg plasmid-DNA fra hver klon, der er isoleret som oven- I

10 for, fordøjet med BamHI (50 mmolær NaCl, 10 mmolær Tris- I

-HC1 (pH 7,5), 10 mmolær MgC^/ 1 mmolær dithiothreitol) . I

Reaktionsblandingen elektroforeseres i en 0,6% agarose H

vandret pladegel ved 100 amp. i 2 timer (0,04 mol Tris- H

acetat, 0,002 mol EDTA). I

15 DNA'et i gelen denatureres ved at udbløde ge - I

len i flere voluminer 1,5 molær NaCl og 0,5 molær NaOH

i en time ved stuetemperatur under konstant omrøring

eller rystning. I nogle tilfælde hydrolyseres DNA'et I

i gelen ved syrerensning før alkalidenaturering ved at I

20 udbløde gelen to gange i 15 minutter i 0,25 molær HC1 I

ved stuetemperatur. Efter denaturering neutraliseres I

gelen ved udblødning i flere voluminer af en opløsning

af 1 molær Tris-HCl (pH 8,0) og 1,5 molær NaCl i en ti- I

me ved stuetemperatur under konstant rystning. I

25 DNA'et i gelen overføres på nitrocellulose, I

hovedsagelig som beskrevet hos Maniatis m.fl., J. Mole- I

cular Cloning, Cold Spring Harbor (1982). I korte træk I

anbringes nitrocellulose (katalog nr. BA85, Schleicher I

& Schuel, Ohio) oven på gelen, og der anbringes flere I

30 lag Whatman 3MM-papir over nitrocellulosen. Denne I

sandwich anbringes derpå med gelsiden nedad på et B

"Whatman 3MM" trækpapir, hvis ender neddyppes i en puf- H

fer, der indeholder 0,9 molær NaCl og 0,09 molær natri- I

umcitrat. Pufferens kapillære bevægelse overfører så- H

35 ledes DNA'et fra gelen til nitrocellulosen. DNA'et I

fikseres på nitrocellulosen ved bagning ved 80°C i 2 I

DK 175364 B1 61

O

timer under vakuum.

Plasmid-DNA'et på nitrocellulosen fremstillet som ovenfor (Southernfiltre) sonderes for tilstedeværelse af HBV-DNA-fragmenter ved hjælp af Maniatis m.fl.'s 5 metode, supra.

I korte træk præhybridiseres Southern-filtre ved udblødning i præhybridiseringsvæske med 0,9 molær NaCl, 0,09 molær natriumcitrat, 0,5% SDS (natriumdode-cylsulfat), 100 mg/ml denatureret laksesperm-DNA og 5 x 10 Denhardt's opløsning (indeholdende pr. liter 1 g "Fi-coll", 1 g polyvinylpyrrolidon og 1 g BSA fraktion V i 4 timer ved 68°C.

Hybridiseringen udføres i en varmeforseglelig plastpose med netop nok hybridiseringsopløsning til at 2 15 holde Southernfilteret vådt (50 mikroliter/cm filter). Hybridiseringsopløsning indeholder 0,9 molær NaCl, 0,09 molær natriumcitrat, 0,01 molær EDTA, 5 x Denhardt's opløsning, 0,5% SDS, 100 mikrogram/ml denatureret lakse- 7 sperm-DNA og 5 x 10 cmp af det ovennævnte radioaktivt 20 mærkede HBV-DNA. Southernfilteret inkuberes i hybridi-seringsopløsningen i 12 timer ved 68°C.

Efter vask af filteret i 2 timer (0,3 molær NaCl, 0,03 molær natriumcitrat), eksponeres røntgenfilm ("XP-1", Kodak) for filteret, så at der fås et auto-25 radiografisk'billede.

Der isoleres tre rekombinante plasmider ved hjælp af ovenstående metode og de betegnes AM6, AM7 og AMI. Am6 indeholder pBR322-DNA og hele HBV-genomet.

AM7 indeholder pBR322-DNA og et HBV-DNA-fragment på 30 1350 bp. AMI indeholder pBR322 DNA og et HBV-DNA-frag ment på 1850 bp omfattende det gen, der koder for HBxAg.

(5) Konstruktion af et replikationsplasmid indeholdende SV40/HBxAq-ekspressionsvektor-DNA 35 Defekte SV40-virus, der fås ud fra Dean Hamer, supra, underkastes BamHI- og EcoRI-spaltning i en puf-

I DK 175364 B1 I

I 62 I

I ° I

I fer, der indeholder 50 mmolær NaCl, 10 mmolær Tris-HCl I

I (pH 7,5), 10 mmolær MgCl2 og 1 mmolær dithiothreitol. I

I Plasmid pBR322-DNA underkastes den tidligere omtalte I

I dobbelte fordøjelse, så at der dannes endestillinger, I

I 5 der er komplementære til det således spaltede SV40-DNA. I

Spaltningsprodukterne fra hver af disse fordøjelser I

I fraskilles og renses ved cæsiumchlorid-densitetsgra- I

I dient-centrifugering. Tanaka m.fl,, J. Bact. 121, 354- I

I 362 (1975). SV40-Fragmentet på 4492 bp og pBR322-frag- I

I 10 mentet på 3987 bp, der således isoleres, underkastes I

DNA-ligatering med T4-DNA-ligase i en puffer, der inde- I

I holder 66 mmolær Tris-HCl (pH- 7,6), 6,6 mmolær MgCl2, I

I 10 mmolær dithiothreitol og 0,4 mmolær ATP til dannel- I

I se af pBRSV (fig. 4). I

I 15 Ligateringsreaktionsproduktet, der fås ved I

ovennævnte reaktion, er et cirkulært DNA afledt ud fra I

I det lineariserede pBR322-fragment på 3987 bp og SV40-frag- I

I ment på 4492 bp ved at forene deres komplementære EcoRI- I

I og BamHI-ende s til linger. Dette cirkulære plasmid line^. I

20 ariseres derpå ved spaltning i BamHI-restriktionsstedet I

I dannet under ligatering, ved dannelse af BamHI-klæbende I

endestillinger i hver ende. I

I Et HBV-DNA-fragment på 1850 bp, der omfatter I

I det gen, der koder for HBxAg, isoleres ved at underkaste I

25 plasmid AM6, der isoleres ovenfor, for fordøjelse med I

I BamHI i en puffer, der indeholder 50 mmolær NaCl, 10 I

I mmolær Tris-HCl (pH 7,5), 10 mmolær MgCl2 og 1 mmolær I

I dithiothreitol. Reaktionsblandingen underkastes deref- I

I ter elektroforese ved 100 amp. i 2 timer med 0,8% aga- I

I 30 rose, og båndet på 1850 bp udskæres og smeltes ved 68°C I

I i 15 minutter. 1/10 volumen 3 molær natriumacetat til- I

I sættes, og den fremkomne opløsning underkastes en de- I

I proteiniseringsproces, som beskrevet ovenfor. I

HBV-DNA-fragmentet, der indeholder HBxAg-ge- I

35 net, og som således isoleres, har BamHI-komplementære I

I endestillinger. Dette DNA-fragment ligateres derpå til I

DK 175364 B1 63

O

det ovenfor fremstillede pBR-SV ved hjælp af T4-DNA-liga-se i en puffer indeholdende 66 mmolær Tris-HCl (pH 7,6), mmolær MgC^, 10 mmolær dithiothreitol og 0,4 mmolær ATP.

5 Produktet af ovenstående ligateringsreaktion er et cirkulær plasmid-DNA betegnet SVAM191. Det indeholder i urets retning et SV40-DNA-fragment på 4492 bp fra dets BamHI-sted i basestilling 2468 til dets EcoRI--sted i basestilling 1717, et pBR322-DNA-fragment på 3987 10 bp fra dets EcoRI-sted i basestilling 0 til BamHl-stedet i basestilling 375 og et HBV-DNA-fragment på 1850 på fra BamHl-stedet i basestilling -1400 til BamHI-sted i basestilling 28. Plasmid SVAM191 vises skematisk i fig. 4. SVAM191 indføres i E.coli HB101 ved hjælp af 15 den ovenfor beskrevne transformationsmetode. Eftersom disse transformerede E.coli også er ampicillinresistente og tetracyclinfølsomme, underkastes de samme isoleringsmetode, som beskrevet tidligere for E.coli-kloninsvekto-ren. Metoderne til fremstilling isolering, rensning og 20 analyse, der tidligere er beskrevet, anvendes til at opnå mængder i mg af hovedsagelig rent SVAM191-DNA.

(6) Konstruktion af SV40/HbxAg-ekspressionsvektor En vektor, der kan fremkalde produktion af HBxAg i eukaryotiske celler, fremstilles ved at udskære 25 en del af SVAM191-DNA. Dette sker ved at fordøje SVAM191--DNA med Haell-endonucleose 1 i en puffer indeholdende 10 mmolær Tris-HCl (pH 7,5), 10 mmolær MgC^ og 1 nunolær dithiothreitol til at spalte SVAM191 i Haell-stederne i basestilling 767 i SV40-DNA-regionen og basestilling 30 1437 i HBV-DNA-regionen.

De to DNA-fragmenter, der fås ved ovennævnte reaktion, adskilles ved elektroforetisk agarose-gelme-tode som beskrevet ovenfor. Det således isolerede største fragment, der kun indeholder SV40 og HBV-DNA, slut-35 tes til en cirkel ved at underkaste dets Haell-komple-mentære endestillinger ligateringsprocessen med T4-DNA,

I DK 175364 B1 I

I 64 I

I ° I

I der tidligere er beskrevet. I

I Denne ovenfor dannede cirkulære DNA-ekspres- I

I sionsvektor betegnes SVHBV-3 (fig. 4 og 5). Den inde- I

I holder ekspressionsstyringselementer fra SV4 0 oq et I

I 5 gen, der koder for HBxAg, fra HBV. I

I (7) Transfektion af eukaryotiske værtsceller I

I med SVHBV-3 I

I BSC-l-nyreceller fra afrikansk grøn abe (ATCC I

I CC1 26, fået hos dr. G.B. Thornton, Johnson & Johnson I

I 10 Biotechnology Center, Inc., La Jolla, Californien), en I

I tilladeliq vært til SV40, vælges til transfektion med H

I SVHBV-3. Sammenløbende monolag på ca. 10^ celler fås I

I ved dyrkning ved 37°C i Eagle's minimalt essentielt me- I

I dium (EMEM) suppleret med 10% kalvefosterserum, 100 en- I

I 15 her penicillin/ml, 100 mikrogram/ml streptomycin og 3 I

I mmolær L-glutamin. Monolagene inficeres med vektor SVHBV-3- I

I DNA i nærvær af DEAE-dekstran som beskrevet af Ganem m. I

I fl., J. Mol. Biol. 101, 57-83 (1976). I

I Én kolbe inficeres med 1,6 mikrogram af det I

I 20 rekombinante SVHBV-3 sammen med 0,05 mikrogram SV40- I

I tsA22g“DNA som hjælper. Kontroller får ækvivalente mæng- I

I der af vektorhjælper-DNA'er alene. Kulturerne inkube-

I res ved 40°C i 12 dage og lyses derpå ved frysning/tøning I

I og opbevares ved -70°C. I

I 25 Cellelulære proteiner ekstraheres fra de I

I frosne/optøede cellepulvere, der fås ved først at til- I

I sætte 2 mg cellepulver til 1 ml porteinekstraktionspuf- I

I fer [2% SDS, 10% glycerol, 0,08 molær Tris-HCl (pH 6,8), I

I 2 mmolær Phenylmethylsulphonylfluorid, 0,1 molær dithio- I

I 30 threitol, 0,001% bromphenolblåt]. Opløsningen koges der- I

I på i 5 minutter, centrifugeres ved 15.000 omdr./min i I

I 10 minutter, og derpå opsamles væskeoverfaserne derfra. H

I En tilstrækkelig stor mængde væskeoverfase I

I til, at der fås 100 mikrogram prøveprotein, underkastes H

I 35 derpå SDS-polyacrylamidgel-elektroforese ved Western- I

I aftryksmetoden, der beskrives nedenfor. I

DK 175364 B1 65

O

(8) Polypeptidsynteser

Polypeptiderne ifølge opfindelsen syntetiseres kemisk ved fastfase-metoder som beskrevet af Merrifield m.fl., J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963), Merrifield m.

5 fl., A. Rev. Biochem. 39, 841-866 (1970), og Houghten m.fl., Int. J. Peptide Prog. Res. 16, 311-320 (1980).

De forholdsvis korte polypeptider, der anvendes her, svarer til antigene determinanter i HBxAg.

Fig. 6 viser sekvensen af de 154 aminosyrer-10 ster i HBxAg. Aminosyrerestsekvenser i de foretrukne syntetiske polypeptider, der findes beskrevet her, (99, 100 og 142) ses også i fig. 6. Sammensætningen af begge syntetiske polypeptider bekræftes af aminosyreanalyse.

Almindeligvis fremstilles et immunogent eller 15 syntetisk polypeptid ved, at der tilvejebringes en flerhed af passende beskyttede aminosyrer, som svarer til aminosyreresterne i et antigent determinantdomæne i HBxAg, og at disse aminosyrer syntetiseres til et polypeptid, som har en aminosyresekvens, der svarer til po-20 lypeptidaminosyrerestsekvensen i den antigene determinant. Det fremstillede syntetiske polypeptid kan anvendes til at fremstille et podestof, i reglen ved at forbinde det med en bærer, så at der dannes et konjugat, og derefter dispergere en effektiv mængde af konjugatet i 25 et fysiologisk tolerabelt fortyndingsmiddel.

Polypeptiderne syntetiseres fortrinsvis ifølge de ovenfor omtalte fastfase-metoder ved hjælp af en cy-steinharpiks, jfr. Merrifield m.fl., J. Am. Chem. Soc. supra. Ved hjælp af den metode beskyttes a-aminogruppen 30 i hvert tilføjet aminosyre i reglen med en tert.butoxy-carbonyl-(t-BOC)-gruppe før tilføjelse af den næste aminosyre til den voksende polypeptidkæde. Sidekæderne på individuelle aminosyrer beskyttes på følgende måde:

Arg- med tosyl, Ser-, Thr-, Glu- og Asp- med 0-benzyl, Tyr-35 med O-brombenzyloxycarbamoyl, Trp- med N-formyl, og S-methoxy-benzyl til cystein, 2-chlorbenzoxycarbonyl til lysin og dinitro-

I DK 175364 B1 I

I 66 I

I 0 I

I phenyl til histidin. Når der anvendes asperigin, tilsættes den I

I lige så stor molær mængde N-hydroxy-benztriazol sammen I

I med den beskyttede aminosyre, og der anvendes dimethyl- I

I formamid (DMF) som koblingsopløsningsmiddel. N-Formyl- I

I 5 gruppen på Trp-resterne fjernes efter fraspaltning af po- I

I lypeptidet fra harpiksunderstøtningen ved behandling med I

1,0 molær ammoniumbicarbonat ved en polypeptidkoncentra- I

I tion på 1,0 mg/ml i 16 timer ved stuetemperatur. Yama- I

I shiro m.fl., J. Org. Chem. 38, 2594-2597 (1973). Effek- I

I 10 tiviteten af kobling i hvert trin kan overvåges med nin- I

I hydrin eller picrinsyre og er fortrinsvis større end 99% I

I i alle tilfælde,·jfr. Gisin, Anal. Chem. Acta 58, 248-249 I

I (1972), og Kaiser, Anal. Biochem. 34, 595-598 (1980). I

Efter fremstilling af et ønsket polypeptid be- I

I 15 handles en del af det fremkomne beskyttede polypeptid I

(ca. 1 g) med to ml anisol, og ca. 20 ml vandfrit hy- I

I drogenfluorid kondenseres ind i reaktionsbeholderen ved I

tøristemperatur. Den fremkomne blanding omrøres ved I

I ca. 4°C i ca. 1 time for at fraspalte de beskyttende I

20 grupper og for at fjerne polypeptidet fra harpiksen. I

I Efter afdampning af hydrogenfluoridet ved en temperatur I

I på 4°C med en strøm af ekstraheres remanensen med I

I vandfri diethylether tre gange for at fjerne anisolen, I

I og remanensen tørres i vakuum. I

I 25 Det vakuumtørrede materiale ekstraheres med I

I 5% vandig eddikesyre (3 gange 50 ml) for at adskille I

I det frie polypeptid fra harpiksen. Den ekstråktholdige I

I opløsning lyophiliseres, så at der fås et monomert uoxi- I

I deret polypeptid. I

I 30 I korte træk er en generaliseret metode til hvert I

I polypeptid, at 4 mg KLH i 0,25 ml 10 xnmolær natrium- I

I phosphatpuffer (pH 7,2) omsættes med 0,7 mg MBS opløst I

I i DNF, og den fremkomne blanding omrøres i 30 minutter I

I ved stuetemperatur. MBS-opløsningen tildryppes, for at I

I 35 sikre, at den lokale DMF-koncentration ikke er for høj, I

I eftersom KLH er uopløselig ved DMF-koncentrationer på ca. I

_1 " ;ι. wggf , ^iV_' »"▼'-··· · - Λ'^9 DK 175364 B1 67

O

30% eller derover. Reaktionsproduktet, KLG-MB, ledes gennem en chromatografisk kolonne, fremstillet med "Se-phadex G-25" (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.) bragt i ligevægt med 50 mmolær natriumphosphatpuffer 5 (pH 6,0) for at fjerne frit MBS. KLH-udvinding fra spidsfrak-tioner af kolonneeluatet, overvåget ved 280 nanometer, er i reglen på ca. 80%.

Det således fremstillede KLH-MB omsættes derpå med 5 mg polypeptid opløst i 1 ml puffer. Den frem-to komne reaktionssammensætnings pH-værdi justeres til 7-7,5, og reaktionssammensætningen omrøres ved stuetemperatur i 3 timer, hvorved fås et polypeptid/bærer-konjugat.

(9) Westernaftryk

Anti-polypeptid-antistofferne (anti-99, anti-15 -100 og anti-142) undersøges ved hjælp af Western af tryksteknik for at bekræfte deres forudsagte specificitet for HBxg og for at bekræfte ekspressionen af den væsentlige polypeptiddel i HBxg i fransficerede celler.

De cellulære proteiner, der omfatter HBxAg, adskilles 20 ved 12,5% SDS-polyacrylamid-gel-elektroforese, jfr.

Laemmli, Nature, 277, 680-685 (1970), og Towbin m.fl.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979).

Proteiner overføres elektroforetisk til nitrocellulose (Schleicher & Schuel, katalog nr. BA85) 25 som beskrevet af Towbin m.fl., supra, ved hjælp af et elektroaftryksapparat (E.C. Apparatus Corp., Jacksonville, Florida) med en puffer bestående af 25 mmolær Tris-base, 192 mmolær glycin, 20% methanol og 0,1% SDS (pH 8,3). Efter overførslen blokeres nitrolcellu-30 losen ved BLOTTO ["Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer", Johnson m.fl., J. Exp. Med. 159, 1751-1756 (1983)], 5% (væ/vo) 35 _ ______

I DK 175364 B1 I

I 6b I

° I

fedtfritørmælk, 0,01% antiskumningsmiddel A (Sigma, katelog nr. I

I A5758), og 0,0001% merthiolat {Sigma, katalog nr. 5125) I

I i PBS ved pH 7,2] for at reducere ikke-specifik binding. I

I Aftrykkene omsættes med 100 mikroliter antipeptid-anti- I

5 stof i 10 ml BLOTTO i 3 timer og vaskes derpå 3 gange I

I il time med 50 ml frisk BLOTTO. I

I Anti-polypeptid-antistoffer bundet til vektor- I

-specifikt protein påvises ved at omsætte aftrykkene med I

m 125 I

20 mikroliter med I mærket Staphylococcus aureus pro- I

I 10 tein A i 10 ml BLOTTO i 1 time. Aftrykkene vaskes derpå I

I i 50 ml frisk BLOTTO i 15 minutter 4 gange og derpå un- I

der en kontinuerlig strøm af vand i 20 minutter. I

I 125 I

(10) Mærkning af hepatomcelleekstrakter med I. I

I Monolag af ud fra human hepåtom afledt celle- I

I 15 linie PLC/PRF/5, der vides at indeholde integrerede se- I

I kvenser HBV [Alexander m.fl., African Med. J. 50, 21-24 I

I (1976), ATCC CRL 8024] lyophiliseres. Cellepulveret op- I

I løses i phosphatpufret saltvandsopløsning (PBS), så at I

I der fås en proteinkoncentration på 1 mg/ml. Efter een- I

I 20 trifugering ved 10.000 G for at fjerne cellerester bian- I

des 50 mikroliter af ovennævnte opløsning med 75 mikro- I

I liter RIPA [0,15 molær NaCl, 10 mmolær natriumphosphat I

I (pH 7,5), 1% "Nonidet P-40", 0,5% natriumdeoxycholat, I

I 0,1% SDS] og 20 mikroliter 0,2 molær natriumphosphat I

I 25 (pH 7,5) . Ved en undersøgelse mærkes det således oplø- I

m 125 I

seliggjorte celleprotein med 5 milliCurie I ved hjælp

I af chloramin-T-reaktionen. Ved den undersøgelser, der I

I er vist i fig. 7, mærkes cellelysaterne med 3 mikroCurie I

125 I

I ved hjælp af samme reaktion. I

I 30 Den ovennævnte reaktionsblanding ledes gennem I

I "Sephadex G-25”-kolonnen (Pharmacia Fine Chemicals, Pi- I

I scataway, NJ, vasket med PBS. Den radiomærkede spids- I

Hg I

I fraktion (9 x 10 cpm/ml) der fås, præinkuberes med nor- I

I mal kaninserum for at fjerne ikke-specifik binding. I I

35 korte træk blandes 20 mikroliter af en spidsfraktion med I

I 1,0 ml RIPA, 20 ml "Trasylol"® (protinin, Sigma, febru- I

: “---- ' '‘•^ »?·?! π > nWitew>l»!t;:y-'W)!lW«l DK 175364 B1 69 o ar, 1984, katalog side 163) og 100 mikroliter NRS. Efter inkubation i 1 time ved 0°C iblandes 500 mikroliter formalin-fikserede Staphylococcus aureus-celier ("Staph A", Calbiochem, La Jolla, Californien), og blandingen 5 inkuberes ved 0°C i 30 minutter. "Staph A"-bundfaldet fjernes ved centrifugering ved 10,000 G i 10 minutter, og væskeoverfasen udvindes.

(11) Immunfældninger (IP)

Kanin-anti-polypeptid-antiserum mod polypep-10 tid 99 (anti-99) omsættes med de ovenfor opnåede med radioiod mærkede celleproteiner. I korte træk blandes lo mikroliter anti-99 med 2 x 10^ cpm mærket ekstrakt og inkuberes i en time ved 0°C. Derpå iblandes 40 mikroliter "Staph A" og inkuberes i 30 minutter ved 0°C.

15 "Staph A"-bundfaldet fjernes ved centrifugering ved 10.000 G i 10 minutter, og pellet'en udvindes og resus-pendes i 1 ml RIPA og centrifugeres som ovenfor. Den fremkomne pellet resuspenderes i 1,0 ml LiCl-opløsning (100 mmolær Tris-HCl, 500 mmolær LiCl) og centrifugeres 20 igen. Behandlingen med LiCl-opløsningen gentages, og pellet'en udvindes.

Den ovenfor opnåede pellet resuspenderes i 50 mikroliter prøvepuffer og koges i 3 minutter. Blandingen centrifugeres ved 10.000 G i 1 minut, og væske-25 overfasen udvindes og underkastes 12,5% SDS-polyacryl-amidgel-elektroforese. De ovennævnte geler eksponeres for "XRP-l"-røntgenfilm, så at der fås et autoradiografi.

(12) Fremstilling af analyse af chimpanse- og human- levercelleekstrakter 30 Leverprøver fra to HBV-kronisk inficerede chim panser og et menneske og fra normale chimpanse- og human-levere (HBV-sero-negative) lynfryses i flydende nitrogen og formales til et pulver. Pulverne blandes med prøvepuffer [0,0625 molær Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 35 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol og 0,001% bromphenol- blåt] og koges i 5 minutter. Blandingen centrifugeres ved

I DK 175364 B1 I

1 70 I

I I

I 10,000 G i 30 minutter for at fjerne cellerester. Prø- I

verne underkastes derpå Western-aftryksanalyse som tid- I

I ligere beskrevet ved hjælp af 75 mikrogram protein pr. I

I gelbane. I

I 5 (13) Identificering af anti-HBxAq-antistoffer i I

I humansera I

I 20 mikrogram pr. bane med SVHBV-3 transfice- I

I rede BSC-l-celleektrakter underkastes SDS-PAGE på 12% I

I acrylamidgeler, og de fraskilte proteiner overføres I

I 10 elektroforetisk til nitrocelluloseark som tidligere I

I beskrevet. Det fremkomne nitrocelluloseark blandes I

I med 1:50 fortyndinger serum fra seks mennesker, som har I

I fået konstateret HBV-relaterede infektioner, herunder en I

symptomatisk bærer og en patient med et hepatacellulært I

I 15 carcinom. Kontrolark blandes med kanin-anti-polypep- I

I tid-antistoffer ifølge opfindelsen. I

I Nitrocellulose-protein-serumblandingerne op- I

I retholdes i 2 timer ved stuetemperatur. Arkene skyl- I

les derpå og blandes med en 1:200 fortynding af gede- I

I 20 -anti-human- eller -anti-kanin-antistoffer bundet til I

I peberrodsperoxidase, som det passer. Denne blanding I

I opretholdes i et tidsrum på en time for at bundne anti- I

I -X-antistoffer kan reagere med de passende anti-anti- I

I stoffer. Arkene vaskes og fremkaldes derpå med 4- I

I 25 -chlor-1-naphthol som tidligere beskrevet. Serummet I

I fra den patient med heptacellulært carcinom udviser I

I stærkt immunreaktivitet med polypeptidet på ca. 24.000 I

I dalton, der udtrykkes af med SVHBV-3 transficerede cel- I

I ler. I

I 30 (14) Cellelinier og vævsprøver I

PLC/PRF/5- og HepG2-celler leveres af Dr. D. I

Milich, Department of Basic & Clinical Research, Scripps I

Clinic and Research Foundation (Scripps), La Jolla, Ca- I

lifornien. Chimpanselever-vævsprøver leveres af dr. R. I

35 Purcell og R. Kaplan fra National Institute og Allergy I

and Infectious Diseases, Bethesda MD, og Ortho Diagno- I

71 DK 175364 B1

O

sties, Inc., Raritan, NJ. Humanlevervævsprøver leveres af dr. P. hisari, J. Dienstag og A. Yu i Scripps Department of Medicine, Harvard University, Boston MA, og Department of Pediatrics, University of California-San 5 Diego, La Jolla, Californien.

10 15 20 25 30 35

Claims

72 I I Patentkrav. I

1. Antigent syntetisk peptid, kendetegnet ved, at det indeholder fra 6 til 40 aminosyre- I I rester svarende i aminosyrerestsekvens til en antigen determinant i HBxAg. I I 5 I

2. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det omfatter en aminosyrerestse- I kvens valgt blandt polypeptidsekvenser gengivet ved formlerne, skrevet fra venstre I I mod højre og i retning fra aminoterminal til carboxyterminal: I I (i) Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp, I I 10 (ii) Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-lle-Arg-Leu-Lys-Val og I I (iii) Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala. I

3. Vandopløselig eller vanddispergerbar antigen polymer, kendetegnet ved, at den I I indeholder et antal forenede syntetiske polypeptider ifølge krav 1 som gentagne enhe- I 15 der, hvor polypeptiderne yderligere omfatter N- og C-terminale cysteinrester, og de I I gentagne enheder er bundet sammen med oxiderede cysteinrester. I

4. Receptormolekyle, kendetegnet ved, at det omfatter et antistofkombinationssted, I I der kan immunreagere med et antigent syntetisk peptid ifølge krav 1. I I 20 I