FI86585C - Kompositioner och foerfarande foer av bestaemning hbxag:s naervaro. - Google Patents

Kompositioner och foerfarande foer av bestaemning hbxag:s naervaro. Download PDF

Info

Publication number
FI86585C
FI86585C FI854395A FI854395A FI86585C FI 86585 C FI86585 C FI 86585C FI 854395 A FI854395 A FI 854395A FI 854395 A FI854395 A FI 854395A FI 86585 C FI86585 C FI 86585C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
ala
leu
polypeptide
glu
phe
Prior art date
Application number
FI854395A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI854395A (fi
FI854395A0 (fi
FI86585B (fi
Inventor
Richard A Lerner
Ann M Moriarty
Hannah Alexander
Original Assignee
Scripps Clinic Res
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scripps Clinic Res filed Critical Scripps Clinic Res
Publication of FI854395A publication Critical patent/FI854395A/fi
Publication of FI854395A0 publication Critical patent/FI854395A0/fi
Publication of FI86585B publication Critical patent/FI86585B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI86585C publication Critical patent/FI86585C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/82—Hepatitis associated antigens and antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/826—Viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/22—Viral peptide or viral protein
    • Y10S930/223—Hepatitis related

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Image Generation (AREA)
  • Transmission And Conversion Of Sensor Element Output (AREA)
  • Editing Of Facsimile Originals (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

1 86585
Koostumuksia ja menetelmiä HBxAg:n läsnäolon määrittämiseksi Tämä keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-tekniikkaan, ilmentyviin vektoreihin ja polypeptidisiin ilmentymisen merkit-simiin ja erityisemmin hepatitis B -viruksen antigeenin HBxAg-geenin kloonaamiseen, HBxAg-antigeenin sisältävään ilmentyvään vektoriin sekä koejärjestelmiin ja -menetelmiin HBxAg:n ja anti-HBxAg:n määrittämiseksi ruumiin näytteistä.
A. Kloonaaminen 1a vektorit
Solun ulkopuolisen DNA:n vieminen eukarioottisten solujen sisään on eräs tehokkaimmista molekyylibiologin työvälineistä. Tämä menetelmä edellyttää sitä, että DNA saadaan viedyksi tehokkaasti vastaanottavan solun tumaan ja että tämän jälkeen tätä vierasta DNA:ta ilmentävät solut kyetään tunnistamaan.
Keinotekoisesti valmistettuja vektoreita, kuten plasmideja tai bakteriofageja (faageja) tai jotakin muuta sellaista DNA-ketjua, joka kykenee replikoitumaan isäntäsolussa, voidaan käyttää solujen muodostamiseen, jotka solut tämän jälkeen toimivat tuotantolaitosten tavoin ja tuottavat suuria määriä kyseisiä virusperäisiä proteiineja. Ohessa yhdistelmäplasmideja käytetään esimerkkinä vektoreista, joita kutsutaan myös kloonauksen kuljettimiksi. Katso US-patenttijulkaisu 4 338 397, joka liitetään tähän julkaisuun tällä viittauksella.
Plasmidit ovat kromosomien ulkopuolisia geneettisiä elementtejä, joita on todettu olevan lukuisissa eri bakteerilajeissa. Ne 2 86585 ovat tyypillisesti kaksoisjuosteisia, sulkeutuneita rengasmaisia DNA-molekyylejä. Kaikkein eniten käytetty plasmidi on pBR322, ja tämän vektorin nukleotidien järjestys sekä endonuk-leaasien pilkkomiskohdat tunnetaan hyvin.
Nukleiinihappojen tuotanto plasmidi- tai faagivektoreita käyttäen on nykyään hyvin vaivatonta. Plasmidi- tai faagi-DNA pilkotaan restriktio-endonukleaasilla ja liitetään in vitro valittuun vieraaseen DNA-ketjuun. Tämän jälkeen tuloksena oleva yhdistelmäplasmidi tai -faagi viedään esimerkiksi E. coli-bak-teerin soluun, ja näin valmistettu solu indusoidaan, jolloin se tuottaa lukuisia kopioita tästä keinotekoisesti valmistetusta vektorista. Kun kloonaavalla vektorilla on saatu tuotetuksi riittävä määrä DNA:ta, niin tuotettu vieras DNA irroitetaan ja istutetaan toiseen vektoriin, jotta tämän vieraan geenin koodaamaa proteiinia tai polypeptidiä saataisiin tuotetuksi tai kopioiduksi.
DNA-ketjusta (kokonainen geeni, cDNA tai bakteerioeräinen geeni) riippuen saattaa olla välttämätöntä saada aikaan eukarioottisen kopioitumisen ja luennan viestit, joilla voidaan ohjata ilmentymistä vastaanottavissa soluissa. Nämä viestit voidaan saada aikaan siten, että tämä vieras DNA yhdistetään in vitro ilmentyvään vektoriin.
Ilmentyvät vektorit sisältävät DNA-ketjuja, jotka ovat välttä-mättömiä kloonattujen geenien kopioitumisessa sekä niiden la -hetti-RNA-molekyy1 ien (mRNA) luennassa proteiineiksi. Tyypil-lisesti, tällaiset välttämättömät ketjut tai säätelevät elemen-· tit ovat: (1) promoottori, joka toimii kopioitumisen alkamis- pisteen viestinä; (2) terminaattori (päättäjä), joka toimii kopioitumisen päättymispisteen viestinä; (3) operaattori, joka säätelee promoottoria; (4) ribosomin sitoutumiskohta, : : johon solun proteiinisynteesin välineistö alun perin sitoutuu; ja (5) käynnistys- ja pysäytyskodonit, jotka toimivat proteiini-..I synteesin aloituksen ja päättämisen viestinä.
3 86585
Ollakseen käyttökelpoinen, ilmentyvällä vektorilla tulisi olla lukuisia muitakin ominaisuuksia. Sen tulisi olla suhteellisen pieni ja sen tulisi sisältää vahvan promoottorin. Tämän ilmentyvän vektorin tulisi käsittää yhden tai useamman valittavissa olevan merkitsimen, jo(i)lla muuntuneet isännät voitaisiin tunnistaa. Samoin siinä tulisi olla yhden tai useamman restriktio-entsyymin tunnistuskohta, jotka sijaitsevat tämän vektorin niissä alueissa, jotka eivät ole olennaisia ilmentymiselle.
Täten ilmentyvän vektorin muodostaminen on monimutkaista ja jossakin määrin ennalta arvaamatonta. Ilmentyvän vektorin tehokkuuden ainoa luotettava koe on mitata se esiintymistiheys, jolla asianmukaisen mRNA:n synteesi käynnistyy. mRNA:n kvanti-toiminen on kuitenkin vaivalloista ja täsmällisiin mittauksiin pääsy on usein vaikeata. Tästä syystä muuntumisen ilmaisemiseksi on kehitetty muita, käytäntöön sovellettavia menetelmiä.
Eräänä tällaisena tapana on seurata vieraan proteiinin synteesiä muunnetuissa soluissa entsymaattisten kokeiden avulla. Muuntumisen osoittamiseksi on kehitetty lukuisia merkitseviä geenejä.
Eräs toinen keino muuntumisen seuraamiseksi käsittää immunologisten reagenssien käytön. Mikäli ilmentyneen proteiinin taso on riittävän korkea, niin tällöin vektorille spesifisen proteii-ni-ilmentymisen tuotteiden ilmaisemiseksi voidaan käyttää fluoresoivaan väriin, kuten fluoreseiiniin tai rodamiiniin konjugoidulla vasta-aineella toteutettavaa sytoplasmista tai pinnan immunofluoresenssia.
Tavallisemmin, immunosaostuksen jälkeen muunnettuja soluja viljellään radioaktiivisen aineen läsnäollessa. Tässä lähestymis- tavassa muuntumiselle spesifisten merkitsimien ilmaisemiseksi on käytetty Staphylococcus aureus-bakteerin proteiineista A muodostuneita immunokomplekseja /Kessler, (1975), J. Immunol. 115:1617-16247 sekä Western-täolitystoimenpidettä /Renart et ai., (1979), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:3116-31207.
4 86585
Geenin ilmentymisen analysointi Simian virus 40 (SV40)-vektoreita käyttäen on selvästi eniten tutkittu eukarioottien muun-tamistekniikka biologiassa ja immunokemiassa. SV40-viruksen perimän järjestäytymiseen liittyvä geneettinen ja biokemiallinen informaatio on selvitetty tai varmennettu tässä virusperäisessä perimässä nukleotidien järjestyksen avulla. Yleiskatsaus julkaisussa Tooze (1980), Molecular Biology of Tumor Viruses, 2. painos, Osa 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Erilaisten SV40-vektorimolekyylien muodostaminen on perustunut geneettisten viestien täsmälliseen kartoittamiseen sekä restriktio-endonukleaasien käyttöön eristettäessä tästä SV40-perimästä määrättyjä fragmentteja.
SV40 kehitettiin alunperin eukariootteihin siirrettäväksi vektoriksi, jota käytetään lyyttisessä järjestelmässä. Mulligan et ai., (1929 ), Nature (London), 277:108-114. Myöhemmin soluja muuntavia (ei-lyyttisiä) vektoreita muodostettiin SV40-perimästä eristettyjen segmenttien avulla. Yleiskatsaus julkaisussa Elder et ai., (1981), Annu. Rev. Genet. 15:295-340.
Hamer et ai. ehdottivat ensimmäisinä, että SV40-virusta voitaisiin käyttää niiden geenien kloonaamiseen, joille geeneille ei ollut saatavissa koetinta. He ehdottivat, että heterogeenisesta mRNA-populaatiosta peräisin olevat kaksijuosteiset cDNA-kopiot voitaisiin "ampua" SV40-vektoriin, ja tätä toivottua ketjua kantava virus voitaisiin tunnistaa käyttämällä radioaktiivista tai fluoresoivaa vasta-ainetta.
Hamer et ai. julkaisivat 1979, että ilmentymisen merkitsimen sisältävä, ilmentyvä SV40-yhdistelmävektori oli muodostettu. Hamer et ai., (1979), Cell, 17:725-735. Heidän muodostamansa SV40-vektori sisälsi ne virusperäiset DNA-ketjut, jotka sijaitsivat BamHI-endonukleaasin restriktiokohdasta, asemassa 0,14 ‘ · - kartan yksikköä, myötäpäivään Haell-restriktiokohtaan, asemassa 0,82 kartan yksikköä. Koko varhaisen geenin A sekä virusperäi-sen DNA:n replikaation alkamiskohdan lisäksi tämä vektori sisältää virusperäisen promoottorin, johtavan osan, väliketjun, \ 5 86585 rungon 5'-osan ja 3'-pään ketjut virusperäistä myöhäistä 195-mRNA:ta varten. Se ei sisältänyt virusperäistä proteiinia UPI 2 ja 3 koodaavista myöhäisten alueiden ketjuista 1660 emäsparia (bp). Priers et ai., (1978), Nature, 273:113-120 ja Reddy et ai., (1978), Science, 200:494-502.
Kaniinin beeta-globiinigeenin koodaavat ketjut ligatoitiin tähän edellä mainittuun vektoriin ilmentymisen merkitsimik-si. Jotta saatiin määritetyksi se, tapahtuiko tällä yhdistel-mävektorilla infektoiduissa apinasoluissa kaniinin beeta-globiinin synteesiä, edellä mainitussa Hamer:in et ai. julkaisussa käytettiin sellaista radioimmunokoetta, joka kykeni ilmaisemaan jopa niinkin pienen määrän kuin 1,0 nanogrammaa globiinia.
Vaikka Hamer et ai. kykenivätkin osoittamaan positiivista todistusaineistoa beeta-globiinin ilmentymisestä, niin kuitenkin he suhtautuivat varauksellisesti tämän SV40/beeta-globiinin sisältävän yhdistelmäjärjestelmän käyttökelpoisuuteen. Ensinnäkin, koska globiini on ainoastaan niukasti liukenevaa, niin huomattavia tappioita saattaa liittyä näytteiden käsittelemiseen mittausta varten. Täten näissä infektoiduissa soluissa olevan glo-biinin määrän määrityksessä virhe saattaa olla 10-kertainen oikeaan arvoon verrattuna. Toiseksi tässä kokeessa ei voida erottaa toisistaan todellista globiinia ja muita immunologisesti :;: globiinin kaltaisia tuotteita, kuten läpilukeutuvaa proteiinia jtai polypeptidin fragmentteja.
: Tekijä, jota Hamer et ai. eivät maininneet, on se, että kaikki eukarioottiset globiinit ovat suuressa määrin keskenään homologisia. Tästä homologisuudesta johtuen vektorin indusoimaa ilmentynyttä globiinia on vaikea erottaa siitä globiinista, joka on endogeenistä isännän solu järjestelmälle.
6 86585 B. Hepatitis B-viruksen peptidit ja anti-polypeptidien vasta- aineet _;_
Hepatitis-virukset ovat toisistaan huomattavasti poikkeavia aineita. Ne on ryhmitelty yhteen ainoastaan niiden vaikutuksen kohteena olevan "kohde-elimen", maksan, perusteella. Vaikka lukuisat virukset vaikuttavatkin maksaan systeemisten (koko organismiin vaikuttavien) infektioiden seurauksena, niin kuitenkin käsitteellä "hepatitis-virukset" tarkoitetaan tavallisesti tyypin A (HAV), tyypin B (HBV) ja non-A, non-B-aineita. Näistä kolmesta virustyypistä on tutkittu eniten HBV-tyyppiä biologisia, immunokemia11 is ia ja kliinisiä tavoitteita varten.
HBV luokitellaan DNA-virukseksi, ja se eroaa monessa suhteessa kaikista muista DNA-virusten luokista. HBV käsittää proteiinista, lipidistä ja hiilihydraatista muodostuvan ulomman päällyksen (olennaisempi kuin kalvo tai kotelo), jossa on ainutlaatuinen antigeenikompleksi; eli hepatitis B-viruksen pinnan antigeeni (HBsAg). Samoin se sisältää sisemmän nukleokapsidin, jonka antigeeninen spesifisyys poikkeaa pinnan antigeenin spesifisyydestä; eli hepatitis B-viruksen ydinantigeenin (HBeAg).
Siitä on myös tunnistettu liukoinen antigeeni HBeAg. Tämän antigeenin oletetaan käsittävän HBcAg-polypeptide jä, jotka eivät sisälly HBV-ytimiin, ja näin ollen niiden antigeeninen • spesifisyys ytimeen sisältymättömässä tilassa on ainutlaatui nen .
Tyypillisissä, itserajoittuvissa akuuteissa HBV-infektioissa infektoidun isännän seerumista voidaan todeta peräjälkeen seu-raavat serologiset merkitsimet: HBsAg, HBeAg, anti-HBC, anti- . HBE ja anti-HBS. Anti-HBE:n ilmaantuminen tarkoittaa ilmais- : : tavissa olevan HBsAgrn mahdollista katoamista. Tämä pitää paikkansa kaikissa itserajoittuvien akuuttien HBV-infektioiden tapauksessa. HBS:n katoamisen jälkeen seuraa pituudeltaan parista viikosta useaan kuukauteen oleva viiveaika ennen ant i-HBS:n ilmaantumista.
Il 7 86585
Kroonisten HBV-infektioiden aikana HBsAg:tä sekä anti-HBC:ta on läsnä. Isännän seerumissa voidaan todeta serologisina merkitsi-minä joko HBeAgrtä tai anti-HBE:tä; toisin sanoen potilas voi olla joko HBeAg-positiivinen tai anti-HBE-positiivinen.
Monien näiden HBV-merkitsimien tapauksessa käytetään laajalti herkkiä ja spesifisiä radioimmunokokeita ja entsymaattista immunokokeita. Viruksen ja immuunireaktion merkitsimien ilmaantumisen seuraaminen HBV-infektion aikana perustuu näihin erittäin herkkiin serologisiin kokeisiin.
Monet tutkimukset ovat viime vuosien aikana osoittaneet, että kukin tällainen serologinen merkitsin tarkoittaa isännän reaktioina erityisiä virusperäisiä tapahtumia HBV-reolikoitumisen aikana. Näin ollen serologisten merkitsimien profiilista sairauden kliinisen etenemisen eri vaiheissa voidaan saada käyttökelpoista diagnostista ja ennusteet!ista tietoa.
Hepatitis B-viruksen ja ihmisen hepatosellulaarisen karsinooman (HCC) eli maksasyövän välistä riippuvuutta on tutkittu runsaasti, ja seroepidemiologisten sekä histopatologisten löydösten perusteella voidaan selvästi olettaa, että HBV liittyy suoraan tai epäsuoraan maksasyövän etologiaan. Lukuisia hepatomasolujen solusukupolvia on otettu ihmisen HCC:stä, ja tässä yhteydessä on julkaisu kahden tällaisen solusukupolven, PLC/PRF/5 ja EPH3B, genomiin (perimään) liittyneen, HBV-spesifisen DNA:n toteaminen. Kuitenkin näissä solusukupolvissa ainoastaan hepatitis B:n pinnan antigeeni on ilmentynyt kudosvi1jelmässä tälle virukselle I'" spesifisenä geenituotteena. Muita HBV:n merkitsimiä, kuten hepatitis B:n ytimen antigeeniä, hepatitis BE:n antigeeniä tai DNA-polymeraasia, ei olla todettu.
Eräät eläimistä peräisin olevat DNA-tuumorivirukset voivat saa- da aikaan transformaation (muuntuminen) virusperäisten qeenien vaikutuksen avulla, jptka geenit säätelevät virusperimän repli-koitumista ja integroitumista, ja tällaisten virusten muuntamat 8 86585 solut voivat käsittää tämän muuntumisen aikaansaavien geenien ilmentämän T-antigeenin (T = tuumori) tai neoantigeenin (neo = uusi). T-antigeenille analogisesta antigeenistä on viime aikoina saatu todistusaineistoa ihmisen hepatomasoluista, jotka sisältävät integroituneita HBV-geenejä, käyttäen antikomplemen-tin immunofluoresoivaa värjäystekniikkaa. Tämä antigeeni on nimitetty HBV:hen liittyväksi tuma-antigeeniksi (HBNA). Wen et ai. , ( 1983) Infect. Immun., 39:1361-1367.
HBNA-antigeeniä todettiin monen HBsAg-positiivisen HCC-potilaan seerumeista, ja antigeenin ilmentyminen osoitettiin sekä soluviljelmästä että kasvainkudoksesta. Lisäksi anti-HBNA:n vasta-aineita todettiin joidenkin HBsAg-positiivisten HCC-potilaiden seerumeista. HBNA voi olla tuloksena HBV-geenin aikaisemmin havaitsemattomasta ilmentymisestä.
Julkaisussa Galibert et ai., Nature, 281:646-650, 1979, esitetään nukleotidien järjestys HBV-genomissa, joka on osittain kaksois juosteinen ja osittain yksijuosteinen, rengasmainen, noin 3200 emäksen pituinen DNA, joka osittainen yksi- tai kaksijuos-teisuus on ainutlaatuinen virusten piirre. Genomin pitkän juos-teen (L-juoste; täysin rengasmainen) todettiin sisältävän neljä : lukukehystä, jotka olivat riittävän suuria vastatakseen virus- peräisistä proteiineista. Nämä alueet nimettiin S-, C-, P- ja . X-alueiksi ja ne esitetään kaavamaisesti kuvassa 1.
---- Alueiden S ja C todettiin sisältävän HBsAg:n ja HBcAg:n geenit, : vastaavasti. Alueen P uskotaan koodaavan proteiinia, joka ko- konsa ja aminohappo jäännösten koostumuksensa suhteen on samankaltainen kuin DNA-polymeraasi. Edellä mainitussa Wen:in et ai. julkaisussa esitetään, että alue X on eräs HBNA:ta koodaa-van geenin todennäköisistä lähteistä.
Alueissa P ja X sijaitsevien geenien toimintojen olettamuksel-lisen tuntemuksen perusteella nähdään, että HBV:n geneettisen järjestäytymisen ja molekyylibiologian ymmärtämisessä on edel ti 9 86585 leen aukkoja. Tämän aukon syynä on ollut se, että in verojärjestelmä tämän viruksen viljelemiseksi on puuttunut.
Viime aikoihin saakka HBV:n ainoana lähteenä oli ihmispotilai-den seerumi. Viruksen kasvattamisen epäonnistuminen soluviljelmissä johtuu sen isäntäsolujen hyvin kapeasta solutyyppi-alueesta .
Eräänä lähestymistapana HBV-DNA:n ja sen geenituotteiden tuottamiseksi on ollut yhdistelmä-DNA-tekniikan käyttö. Tämän tekniikan avulla on mahdollista tuottaa suuressa mitassa sellaisia nukleiinihappoketjuja, jotka koodaavat tiettyä virusperäistä proteiinia.
Julkaisussa Tiollais et ai. (1981), Science, 213:406-411 esitetään E. coli-bakteerin transformoiminen HBsAgitä koodaavan geenin sisältämällä plasmidilla pBR322, ja siinä esitetään, että tätä eristettyä geeniä muodostui huomattavia määriä. Nämä tutkijat halusivat samoin selvittää HBsAgrn geenin sijainnin HBV-genomissa, sekä ne tekijät, jotka vaikuttavat sen ilmentymiseen proteiinina. Tätä tarkoitusta varten he muodostivat HBsAg:n geenin sisältäviä ilmentyviä vektoreita, joita käytettiin sekä bakteerisoluissa että imeväisten soluissa.
; Eräs tällainen, edellä mainitussa Tiollais: in et ai. julkaisussa muodostettu vektori sai aikaan E. coli-bakteerissa sellaisen : proteiinin biosynteesin, jossa proteiinissa oli HBsAg:n anti- geenisyyden määrääviä tekijöitä. Se muodostettiin istuttamalla : osa HBsAg:tä koodaavasta geenistä bakteeriofaagiin plac-5-lUV5 - - siten, että luonnollisen HBV:n lukukehys säilyi.
Voidakseen tutkia HBV-geenin ilmentymistä nisäkässoluissa Tiol-'· lais et ai. muodostivat sarjan HBsAqrtä ilmentäviä plasmideja : istuttamalla transfektoivia elementtejä koko HBV-genomin eri kohtiin. Näiden transfektoivien elementtien avulla koko HBV-genomi voitiin yhdistää usealla eri tavalla suuntautuneena tällä e 10 86585 vektorilla muunnettujen hiirisolujen perimään. Muodostaessaan nämä vektorit tällä tavalla tutkijoiden tavoitteena oli voida käyttää HBV:ssä luonnostaan esiintyviä geneettisiä säätelyele-menttejä.
Ainoastaan kolme edellä mainitussa julkaisussa Tiollais et ai. esitetystä kuudesta ilmentävästä vektorista sai aikaan toivotun HBsAg-proteiinin ilmentymisen. Sen tuotanto ilmaistiin siten, että sen läsnäolo kudosviljelmien nesteissä määritettiin lampaan anti-HBsAg-antiseerumia käyttäen. Muita tutkimuksen hetkellä tunnettuja virusperäisiä merkitsimiä (eli HBcAg, HBeAg ja DNA-polymeraasi) ei todettu muunnetuista soluista.
Edellä mainitun Tiollais:in et ai. tutkimuksen hetkellä X-alueen mahdollinen olemassaolo oli tunnettu kuten myös se mahdollisuus, että se saattaa koodata HBV-proteiinia. Toisin sanoen oli tunnettua, että tämä HBV-genomi kykeni mahdollisesti koodaamaan enemmän proteiineja kuin mitä aikaisemmin tähän virukseen oletettiin liittyvän.
Tätä ongelmaa kutsutaan genotyypiksi fenotyyppiä etsittäessä. Edellä mainitussa julkaisussa Wen et ai. viitattiin mm. tähän ongelmaan kun siinä esitettiin, että X-alue sisältää HBNA:ta koodaavan geenin.
: Ennen edellä mainittuja Tiollais:in et ai. ja Wen:in et ai.
tutkimuksia julkaisussa Sutcliffe et ai., (1980) Nature 287: ·" 801-805 esitettiin mm. yleinen menetelmä tämän ongelman ratkai- : semiseksi. Tässä julkaisussa syntetisoitiin kemiallisesti poly- peptidi siitä proteiinista lähtien, joka proteiini oli ennustettavissa proteiinituotteeltaan tuntemattoman, virusperäisen gee-.·. : nin nukleotidijärjestyksen perusteella. Tälle polypeptidille ... kehitettiin vasta-aineita, ja niiden annettiin reagoida kaikkien niiden proteiinien kanssa, joita proteiineja tällä viruksella infektoidut solut tuottivat. Sutcliffe et ai. totesivat aikai- li i li 86585 semmin tuntemattoman ja tunnistamattoman, virusperäisen proteiinituotteen läsnäolon käyttäen vasta-aineita tämän ennustetun proteiinin osille.
Tähän päivään mennessä kirjallisuudessa ei olla esitetty tämän tai jonkin toisen tekniikan hyväksikäyttöä, jolla HBV-genomissa olevan X-alueen proteiinituote voitaisiin yksiselitteisesti tunnistaa. Tämä voi johtua siitä, että vaikka synteettisten antigeenien valmistaminen ja niiden käyttö ennalta määrätyllä tavalla spesifisten vasta-aineiden indusoimiseksi onkin yleisesti ottaen esitetty, niin kuitenkin suuri osa tästä tekniikasta on edelleen tuntematonta.
Tähän on lukuisia syitä. Ensinnäkin geneettisten ketjujen perusteella päätellyt aminohappojäännösten järjestykset proteiinissa ovat luonteeltaan hypoteettisia, mikäli tämän nuk-leotidiketjun lukukehystä ei kyetä täsmällisesti selvittämään, sillä geneettinen koodi sisältää runsaasti liiallista informaatiota .
Toiseksi synteettinen antigeeni ei välttämättä indusoi vasta-aineita, jotka immunoreagoivat täydellisen proteiinin kanssa sen luonnollisessa ympäristössä. Kolmanneksi, isännän luonnolliset, immunogeeniä vastaan vaikuttavat vasta-aineet harvoin immunoreagoivat sen polypeptidin kanssa, joka polypeptidi vas-.1 . taa tämän immunogeenin aminohappoketjussa esiintyvää lyhyttä ‘ : lineaarista osaa.
: Tämä keksintö käsittää useita piirteitä. Sen eräs piirre koh- distuu yhdistelmä-DNA: hän, joka käsittää HBxAgrtä koodaavaan geeniin sidotun ilmentyvän vektorin. Erityisen suositeltavassa : yhdistelmä-DNA:ssa tämä ilmentyvä DNA-vektori koostuu ensimmäi sestä DNA-ketjusta, joka käsittää BamHI-endonukleaasin restrik-tiokohdasta alkavan, Simian Viruksesta 40 peräisin olevan DNA-ketjun, joka restriktiokohta sijaitsee emäsasemassa 2468, tämän ketjun jatkuessa myötäpäivään Haell-endonukleaasin restriktio- t 4 12 86 585 kohtaan, joka kuvan 2 mukaisesti on emäsasemassa 767, sekä HBxAgrn koodaavasta geenistä, joka saadaan ketjuun toisena geenin DNA-ketjuna, joka käsittää emäsasemassa 1437 sijaitsevasta Haell-endonukleaasin restriktiokohdasta alkavan hepatitis B-viruksen DNA-ketjun, jatkuen myötäpäivään BamHI-endo-nukleaasin restriktiokohtaan, joka kuvan 1 mukaisesti sijaitsee emäsasemassa 28, Tämä ensimmäinen ja toinen DNA-ketju on kytketty keskenään toimivasti edistämään HBxAg:n ilmentymistä .
Tämän keksinnön toinen piirre kohdistuu yhdistelmä-DNA:hän, joka käsittää HBxAqrtä tai HBxAgrn olennaisen osan muodostavaa . polypeptidiä koodaavan geenin. Erityisen suositeltava yhdis-telmä-DNA sisältää HBxAgrtä koodaavan geenin ja sen kuvan 1 mukainen emäsjärjestys käsittää emäsasemasta 1437 myötäpäivään asemaan 28, tai olennaisen osan tästä.
Edelleen tämän keksinnön eräänä piirteenä on plasmidi, joka koodaa vähintään yhtä sellaista yhdistelmä-DNA:ta, joka sisältää HBxAgrtä tai sen olennaisen osan muodostavaa polypeptidiä koodaavan geenin. Tämä plasmidi voi käsittää kuvan 1 mukaisen emäsjärjestyksen alkaen emäsasemasta 1437, ja jatkuen myötäpäivään asemaan 28, tai olennaisen osan tästä. Erityisen suositeltavassa sovellutuksessa plasmidin käsittämä ensimmäinen DNA--· : ketju koostuu Simian Viruksen 40 (SV40) virusperäisestä DNA- " ketjusta, joka alkaa emäsasemassa 2468 sijaitsevasta BamHI- endonukleaasin restriktiokohdasta, jatkuen myötäpäivään EcoRI-endonukleaasin restriktiokohtaan, joka kuvan 2 mukaisesti si-: jaitse emäsasemassa 1717; ja toinen DNA-ketju koostuu emäsase- massa 375 sijaitsevasta BamHI-endonukleaasin restriktiokohdasta alkavasta plasmidin pBR322 DNA-ketjust a, joka jatkuu kuvan 3 - . mukaisesti myötäpäivään EcoRI-endonukleaasin restriktiokohtaan, joka sijaitsee emäsasemassa nolla; sekä kolmas DNA-ketju, joka koostuu hepatitis B-viruksen DNA-ketjusta, alkaen emäsasemassa - ‘ : 1400 sijaitsevasta BamHI-endonukleaasin restriktiokohdasta ja :jatkuen myötäpäivään, kuvan 1 mukaisesti, BamHI-endonukleaasin ‘ . restriktiokohtaan, joka sijaitsee emäsasemassa 28. Tässä plas- « l! i3 86585 midissa ensimmäinen ja toinen DNA-ketju on ligatoitu toimivasti niiden vastaavista EcoRI-endonukleaasin restriktiokohdista; toinen ja kolmas DNA-ketju on ligatoitu toimivasti niiden vastaavista BamHI-endonukleaasin restriktiokohdista; ja ensimmäinen ja kolmas DNA-ketju on ligatoitu toimivasti niiden vastaavista BamHI-endonukleaasin restriktiokohdista, kuten kuvassa 4 esitetään .
Menetelmä HBxAg:n tai sen olennaisen polypeptidiosan tuottamiseksi muodostaa tämän keksinnön erään piirteen. Tämän piirteen mukaisesti tämän keksinnön mukaisen ilmentävän järjestelmän sisältämää isäntää kasvatetaan viljelyalustassa niin kauan, että HBxAg:tä tai sen olennaista polypeptidiosaa on saatu tuotetuksi ja että sitä on keräytynyt tähän isäntään tai sen kasvatusalustaan. Tämän jälkeen keräytynyt HBxAg tai sen olennainen poly-peptidiosa otetaan talteen.
Edelleen eräs tämän keksinnön piirre kohdistuu antigeeniseen, synteettiseen polypeptidiin. Tämä synteettinen polypeptidi sisältää noin 6-40 aminohappojäännöstä ja sen järjestys vastaa HBxAg:n antigeenisyyden määräävien elementtien aminohappojäännösten järjestystä. Erityisen suositeltava polypeptidi käsit-: tää aminohappo jäännös ten järjestyksen, joka on valittu seuraa- van kaavan mukaisten polypeptidiketjujen joukosta, kirjoitet-. tuna vasemmalta oikealle ja aminopäästa karboksipaähän: -·. (i) Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu
Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp; - (ii) Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-
Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val; ja (iii) Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala.
Ohessa tarkastellaan myös veteen liukenevaa tai veteen disper- "·. goituvaa antigeenistä polymeeriä, joka käsittää lukuisia, toi siinsa kytkeytyneitä synteettisiä, polypeptidistä muodostuneita U 86585 toistuvia yksiköitä, jotka ovat sitoutuneet toisiinsa hapettuneiden kysteiinijäännös ten avulla. Nämä toistuvat yksiköt muodostuvat edellä tarkastelluista polypeptideistä, jotka käsittävät kysteiinijäännöksen sekä amino- että karboksipäässä, tai jotka sisältävät yhden kysteiinijäännöksen jommassa kummassa päässä ja yhden kysteiinijäännöksen polypeptidin sisällä. Erityisen suositeltavia, polypeptidin muodostamia toistuvia yksiköitä, jotka käsittävät kysteiinijäännöksen sekä amino- että karboksipäässä, ovat seuraavan kaavan mukaisia, joka kaava on kirjoitettu vasemmalta oikealle ja aminopäästä karboksioäähän:
Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cys; Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Cys; ja R·*·- Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala-R^, , 12 missä seka R ja R on kysteiinijäännös, edellyttäen että ainoas-1 2 taan toinen R :stä ja R :sta on läsnä.
Ohessa tarkastellaan myös vasta-aineen liittymiskohdan sisältäviä reseptorimolekyylejä, joista mainittakoon vasta-aineet, jotka kykenevät immunoreagoimaan edellä mainittujen antigeenisten polypeptid ien kanssa. Niitä erityisen suositeltavia polypeptide jä, joiden kanssa nämä reseptorimolekyy1it immunoreagoivat, voidaan havainnollistaa edellä kuvatuilla polypeptidei11ä.
Nämä reseptorimolekyy1it immunoreagoivat myös HBxAg:n tai sen olennaisen polypeptidiosan kanssa.
Ohessa tarkastellaan myös diagnostista koejärjestelmää, jolla voidaan määrittää HBxAgin ilmaistavissa olevan määrän läsnäolo ruumiista otetusta näytteestä. Tämä järjestelmä käsittää vähintään yhden astian, jossa oleva reagenssi sisältää edellä kuvattuja reseptorimolekyylejä. Edelleen tämä järjestelmä saattaa käsittää toisessa astiassa olevan toisen reagenssin, joka on sitä antigeenistä, synteettistä polypeptidiä, jonka kanssa re- I: 15 86585 septorimolekyylit reagoivat. Tämän diagnostisen koejärjestelmän osana voi lisäksi olla laite, jolla reseptorimolekyylien ja HBxAg:n välinen immunoreaktio voidaan todeta.
Edelleen tämän keksinnön eräänä piirteenä on menetelmä HBxAgrn ilmaistavissa olevan määrän läsnäolon toteamiseksi ruumiin näytteistä. Tällöin proteiinit siitä näytteestä, josta HBxAgrn ilmaistavissa oleva määrä pyritään määrittämään, sekoitetaan edellä mainittuihin reseptorimolekyyleihin indikoivan reagens-sin läsnäollessa, jollon reseptoreiden ja HBxAgrn välinen immunoreaktio saadaan ilmaistuksi. Tämän seoksen annetaan seisoa niin pitkän ajan, että tämä indikoiva aine osoittaa immunoreak-tion tapahtuneen. Indikoivan aineen avulla saatu viesti tästä reaktiosta varmistetaan tämän jälkeen.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .
Tämän keksinnön osan muodostavissa piirustuksissar kuva 1 on kaavamainen diagrammi, jossa nähdään HBV/adw-genomin fysikaalinen rakenne ja geneettinen järjestäytyminen, katso julkaisu Tiollais et ai. (1981), Science 213:406-411, muunnoksena, joka esitetään julkaisussa Ono et ai. (1983), N.A.R., 11r1747-1757. Pitkän (L) juosteen 5’-pään esitetään liittyvän emäspareilla lyhyen (S) juosteen 5'-päähän. Tietyt restriktio-kohdat, jotka on esitetty kaarimaisilla nuolilla, ja restrik-tioendonukleaasin lyhenne vastaavat HBV/adw-genomin fysikaalista karttaa, joka on analysoitu edellä mainitussa Ono et al.rn julkaisussa. Genomia ympäröivät leveät nuolet vastaavat L-juos-teen neljää suurta, avointa aluetta. Näitä neljää mahdollisesti koodaavaa aluetta kutsutaan S-, P-, X- ja C-alueiksi. Kunkin täten nimetyn alueen jälkeen suluissa esitetty aminohappojäännösten (aa) lukumäärä vastaa kunkin alueen koodaaman hypoteettisen polypeptidin pituutta. Ne kaksi aluetta, jotka vastaavat määriteltyä S- ja C-geeniä, on esitetty täplitettyinä alueina näiden leveiden nuolien sisällä. EcoRI-endonukleaasin ainutta pilkkomiskohtaa käytetään tämän kartan alkupisteenä.
i6 8 6 585
Kuva 2 esittää kaavamaisesti SV40-DNA:n restriktiokarttaa, valmistettuna julkaisussa Reddy et ai. (1978), Science, 200:494-501 esitetyn primäärin ketjun perusteella, ja muunnettuna tavalla, joka esitetään julkaisussa Van Heuverswyn ja Fiers (1979), Eur. J. Biochem., 100:51-60.
Kuva 3 esittää kaavamaisesti plasmidin pBR322 restriktiokarttaa, joka on valmistettu julkaisussa Sutcliffe (1979), Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77 ketjulle esitetyn ensitiedon perusteella.
Kuva 4 esittää kaavamaisesti jäljempänä osassa Materiaalit ja menetelmät kuvattua menetelmää, jolla DNA-fragmentteja istutetaan tämän keksinnön mukaisiin AM6:n (aaltoviiva), plasmidin pBR322 (yhtenäinen viiva) ja SV40-viruksen (katkoviiva) käsittäviin vektoreihin, jolloin saadaan tuotetuksi kloonaava vektori SVAM191, ja sitten ilmentyvä vektori SVHBV-3, joka ilmentää HBxAgrn olennaista osaa. BamHI-, EcoRI- ja Haell-restriktio-endonukleaasien kohtien suhteelliset asemat esitetään täytettyinä ympyröinä, tyhjinä ympyröinä ja täytettyinä kolmioina, vastaavasti. Samoin kuvassa nähdään alkupiste (ori) sekä SV40-genomin varhaiset ja myöhäiset promoottorit.
: Kuva 5 esittää lineaarista osaa ilmentyvästä yhdistelmävektorista . SVHBV-3, joka sisältää SV40:n myöhäisen promoottorin geenin, aminopään 99 aminohappo jäännöksen (99aa) geenin sekä 132 karboksipään aminohappojäännöstä koodaavan HBxAg-geeniketjun olennaisen polypeptidiosan (132aa, 132 aminohappojäännöstä ;· 154:stä) geenin. Kuvassa esitetään samoin vektorin ilmentämän fuusioproteiinin VP2 HBxAg mRNA.
Kuva 6 esittää HBxAg:tä koodaavasta geenistä luettua aminohappo-- - : jäännösten järjestystä vasemmalta oikealle ja suunnassa amino- - päästä karboksipäähän. SVBHV-3-vektorin ilmentämän HBxAg:n olennainen osa esitetään nuolella, joka sijaitsee aminohappo-jäännösten asemassa 23 (Ala), joka on ilmentyneen HBxAg-poly- peptidin aminopäässä oleva jäännös. Tämän keksinnön mukaisten il n 86505 synteettisten polypeptidien, joita merkitään numeroilla 99, 100 ja 142, suhteelliset asemat HBxAg-ketjussa esitetään kolmella merkityllä, alleviivatulla aminohappojäännösten ketjulla.
Näin ollen synteettisen polypeptidin 99 aminohappojäännösten ketju vastaa asemia 100-115, laskien aminopään Met-jäännöksestä, joka esitetään kuvassa, synteettisen polypeptidin 100 ketju vastaa asemia 115-131, kuvassa esitetystä aminopään Met-jäännöksestä laskien, ja synteettisen polypeptidin 142 ketjun järjestys vastaa asemia 144-154 kuvassa esitetystä aminopäään Met-jäännöksestä laskien, eli se vastaa karboksipään yhtätoista jäännöstä.
Kuva 7 on valokuva autoradiogrammista, jossa nähdään anti-X antiseerumeiden ja kahden, ihmisestä saadun hepatomasolujen lysaatin välinen reaktiivisuus. Kahta ihmisestä peräisin olevaa hepatomasolujen sukupolvea, PLC/PRF/5 ja HepG2, kasvatettiin alustassa, joka oli Dulbecco:n muunnos Eagle:n alustasta (DMEM), ja joka sisälsi 10 % sikiöasteisen vasikan seerumia, kunnes oli saatu yhtenäinen solukerros (6. vuorokautena yhtenäisen soluker-roksen muodostaneesta viljelmästä l:5-jaos). Supernatantit poistettiin, monokerrokset sisältävät pullot laitettiin jäihin 5 minuutiksi ennen solujen ottamista talteen kaapimalla, ja kerätyt solut saatettiin solukasaumaksi sentrifugoinnilla. Soluka-saumat pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), jäähdytettiin nopeasti -70°C:ssa ja lyofilisoitiin yön yli. Tuloksena olevat solujauheet liuotettiin PBStään ja niiden lopullinen pitoisuus näytepuskurissa saatettiin arvoon 2 milligrammaa millilitrassa (mg/ml). Näytteitä keitettiin 5 minuuttia ja solujäte poistettiin sentrifugoimalla Beckman-mikrofuugissa 30 minuutin ajan. Viittäkymmentä mikrogrammaa solulysaattia inku-boitiin 15 minuuttia RIPA-puskurissa _/PBS:ää, joka sisältää 1 % Nonidet P-40:tä (polyoksietyleeni (9) oktyyli-fenyylieetteri), • " : 0,05 % natrium-deoksikolaattia ja 0,1 % SOS/, ja merkittiin tämän 125 ::: jälkeen radioaktiivisesti 3 mikroCurie:11a I:tä kloramiini T-reaktiota käyttäen McConahey et ai. (1966), Int. Arch. Allergy, '..I 29:185-189. Kustakin radioaktiivisesti merkitystä hepatomalysaa- ·; tista otettiin 1,5 x 10^ sykettä minuutissa (cpm) vastaava annos, * is 8 6 585 ja niiden annettiin reagoida 60 minuuttia RIPA-puskurissa anti-X polypeptidin 10 mikrolitran kanssa. Antigeenin ja vasta-aineen muodostamat kompleksit (immunoreaktion tuotteet) saostettiin formaliinilla kiinnitettyjen Staphylococcus aureus-bakteereiden avulla. Kasaumat pestiin kertaalleen RIPA-puskurilla ja kahdesti 500 millimolaarisella (mM) LiCl-liuoksella 100 mM Tris-puskurilla (pH 8,5) ja niiden radioaktiivisuus määritettiin. Kaikki kasaumat liuotettiin 40 millilitraan näytepuskuria /0,0625 M Tris-HCl (pH 6,8), 2 % SDS, 10 % glyserolia, 5 % 2-merkaptoetanolia ja 0,001 % bromofenolisinistä/, niitä keitettiin 3 minuuttia, sentrifugoitiin solujätteen poistamiseksi ja ne analysoitiin SDS-PAGE-menetelmällä seuraavasti.
Radioaktiivisesti merkityt solulysaatit laitettiin denaturoivan natriumdodekyylisulfaatin polyakryyliamidigeeleille (SDS-PAGE; 12,5 %) elektroforeesia varten, jossa käyte» ti in monoteImää, joka esitetään julkaisussa Laemmli, (1970), Nature, 297:680-685. Proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosaliuskoil-le, kuten julkaisussa Towbin et ai. (1979), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:4350-4354 esitetään. Nitroselluloosalla olevat täplät värjättiin amidomustalla ennen liuskojen inkubointia 4°C:n lämpötilassa yön yli BLOTTO:ssa /Johnson et ai. (1983), J. Exp. Med., 159:1751-1756/, jolloin epäspesifisten sidosten määrä väheni.
~ Nitroselluloosaliuskoja inkuboitiin 3 tunnin ajan huoneen lämpö-r’:': tilassa anti-polypeptidin vasta-aineiden 1:350-laimennoksen kanssa, : lopullisessa tilavuudessa 10 ml BLOTTO. Liuskat pestiin BL0TT0:ssa 12 5·.
ennen niiden 1 tunnin pituista inkubointia I:lla merkityn - · S. aureus-bakteerin proteiinin A kanssa (10^ cpm/10 ml). Niissä "V tapauksissa, joissa jäljempänä esitetysti esiintyy polypeptidin aiheuttamaa kilpailua, anti-polypeptidin antiseerumeita inkuboitiin 60 minuutin ajan polypeptidin lOO mikrogramman kanssa ennen radioaktiivisesti merkityn antigeenin lisäämistä. Liuskat ’.· " pestiin edellä esitetysti, huuhdottiin vedellä, kuivattiin ja autoradiografoitiin. Urien 1 ja 5 annettiin reagoida anti-polypeptidin 99 vasta-aineiden (anti-99) kanssa; uran 2 annettiin reagoida polypeptidin 99 kanssa esi-inkuboidun anti-99:n kanssa; uran 3 annettiin reagoida täysin erilaisen polypeptidin kanssa I: i9 86 585 esi-inkuboidun anti-99:n kanssa; ja uran 4 annettiin reagoida vertailuna toimivan esi-immuuniseerumin kanssa. HepG2-soluista saadut lysaatit (urat 1-4) eivät reagoineet anti-polypeptidin 99 kanssa. Vasemmassa marginaalissa esitetyt numerot tarkoittavat proteiinien liikkuvuuden suhteellisia asemia. Oikeassa marginaalissa olevat nuolet tarkoittavat niiden liikkuneiden proteiinien asemia, joiden proteiinien molekyylipainot ovat 28 000 ja 45 000 daltonia.
Kuva 8 on valokuva, joka esittää anti-X antiseerumin ja simpanssin maksakudoksen välistä reaktiivisuutta (C; urat 3 ja 4) sekä anti-X antiseerumin ja ihmisen maksakudoksen välistä reaktiivisuutta (H; urat 1 ja 2). Simpansseista ja ihmisistä saadut maksa-preparaatit jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä ja ne jauhettiin hienoksi jauheeksi huhmareessa. Solujauheet liuotettiin näytepuskuriin, ja ne analysoitiin elektroforeettisesti geeliä käyttäen ja täplät muodostettiin kuvan 7 yhteydessä esitetyllä tavalla. Nitroselluloosaliuskat kehitettiin antiseerumin 1:50-laimennoksella, kuten kuvan 7 yhteydessä esitetään, kuitenkin kahdessa suhteessa tästä poiketen: 1) BLOTTOtn asemasta kaikissa inkuboinnoissa ja pesuissa käytettiin 1 % naudan seerumin albumiinin (BSA) liuosta, ja 2) antigeeniin sitoutuneet vasta-aineet ilmaistiin piparjuuren peroksidaasiin konjugoidulla : vuohen anti-kaniini IgGrllä. Antigeenin ja vasta-aineen välisen . : immunoreaktion tuotteet tehtiin näkyviksi kastamalla liuskat seu- • · : raavaan kehitysliuokseen. Tämä kehitysliuos valmistettiin 50 millilitrasta TBS-puskuria 37°C:n lämpötilassa, johon lisättiin : _·_ 250 mikrolitraa absoluuttista etanolia, joka sisälsi 8 mg 4-kloori- i . 1-naftolia sekä 330 mikrolitraa 30-prosenttista vetyperoksidia. Polypeptidin 99 antiseerumia (anti-99) käytettiin kahdessa vasemmalla sijaitsevassa, salvatussa ja salpaamattomassa alueessa, kun taas polypeptidin 142 antiseerumia (anti-142) käytettiin kahdessa oikealla sijaitsevassa salvatussa ja salpaamattomassa alueessa. Kuvan vasemmassa reunassa olevat numerot tarkoittavat geelillä liikkuvuuksia niiden proteiinien tapauksessa, joiden proteiinien molekyylipainot ovat 66, 45, 31, 21 ja 14 kilodalto-nia, vastaavasti.
2o 86 585
Kuva 9 on valokuva Southernrin täpläanalyysistä, jossa käytettiin ihmisen ja simpanssin maksasta saatuja, restriktioentsyy-meillä pilkottuja DNA-näytteitä, jotka oli saatu X-proteiinia ilmentävistä maksakudoksista, ja jossa analyysissä sitoutumisen koettimena käytettiin hepatitis B-viruksen DNA:ta. Näistä näytteistä kuvan 8 yhteydessä esitetyllä tavalla valmistetuista solu-jauheista uutettiin DNA:t täydellisesti. Kymmenen mikrogrammaa DNA:ta laitettiin 1-prosenttisen agaroosigeelin kuhunkin koloon. Pilkkomispuskurit restriktioentsyymejä varten olivat valmistajien suositusten mukaisia. Kaikki, pilkkomiset toteutettiin 37°C:n lämpötilassa yön yli käyttäen 50 entsyymiyksikköä. (5 x DNA:n pitoisuus mikrogrammoina). Urissa 1-3 nähdään simpanssin A-243 maksasta saatu, BamHI:llä tai EcoRI:lla pilkottu tai pilkkomaton DNA, vastaavasti; urissa 4-6 nähdään simpanssin 344 maksasta saatu, BamHI:llä tai EcoRI:llä pilkottu tai pilkkomaton DNA, vastaavasti; urissa 7-10 nähdään ihmisen HBcAg-positiivisesta maksasta saatu, Hindllltlla, BamHI:llä tai EcoRI:llä pilkottu ja pilkkomaton DNA, vastaavasti; ja urissa 11-14 nähdään ihmisen HBsAq-negatiivisesta maksasta saatu DNA, joka on pilkottu HindIII:llä, BamHI:llä tai EcoRI:llä tai joka on pilkkomaton, vastaavasti.
Kuva 10 on valokuva au tor ad i oq r amm i. s t a , jossa nähdään anti-X polypeptidin antiseerumeiden ja X-ohjautuvan geeni tuot teen väli-: nen reaktiivisuus. BSC-l-solujen kasvatuksesta saadut monoker- \ rokset (2 x 10^ solua) infektoitiin SVHBV-3-kantai sei1 a yhdis- telmäviruksella (tsA23g-virionin 3a SVHBV-3-vi rionin seos) tai villityypin SV40-viruksella /Moriarty, et ai. (1981), Proc.
Natl. Acad. Sei. USA, 78:2606-26107. Näitä viljelmiä inkuboi-tiin seerumia sisältämättömässä DMEM:issä 40°C:n lämpötilassa 48-72 tunnin ajan, jonka ajan kuluessa vähintään 50% sytopaat-tisesta ilmiöstä (soluviljelmän infektoituminen viruksilla) oli tapahtunut. Supernatantit poistettiin, ja solukerrokset sisältävät pullot laitettiin jäihin 5 minuutiksi ennen solujen : ottamista talteen kaapimalla. Kerätyt solut sontrifuqoLtiin ’ · ja tuloksena olevat solukasaumat pestiin PBS:llä, jäädytettiin .. . nopeasti -70°C:ssa ja lyofilisoitiin yön yli. Tuloksena olevat 2i 86585 solujauheet liuotettiin PBSrään ja niiden lopullinen pitoisuus näytepuskurissa saatettiin arvoon 2 mg/ml. Näytteitä keitettiin 5 minuuttia, ja solujäte poistettiin sentrifugoimalla Beckman-mikrofuugissa 30 minuuttia. Viidestäkymmenestä sataan mikrogrammaa solulysaattia laitettiin denaturoiville polyakryyli-amidigeeleille (12,5%) ja analysoitiin elektroforeettisesti, kuten edellä esitetään. Proteiinit siirrettiin edellä esitetyllä tavalla elektroforeettisesti nitroselluloosaliuskoille. Nitroselluloosalla olevat täplät värjättiin amidomustalla ennen niiden inkuboimista 4°C:n lämpötilassa yön yli BLOTTOrssa, jolloin epäspesifisten sidosten määrä väheni. Nitroselluloosa-liuskoja inkuboitiin 3 tunnin ajan huoneen lämpötilassa anti-. peptidin vasta-aineiden 1:350-laimennoksen kanssa, lopullisena tilavuutena 10 ml BLOTTO. Liuskat pestiin BLOTTOrssa ennen 125 niiden inkuboimista 1 tunnin ajan I-merkityn S. aureus-bak-teerin proteiinin A (10^ cpm/10 ml) kanssa. Liuskat pestiin edellä esitetysti, huuhdottiin vedellä, kuivattiin ja autoradio-grafoitiin. Niissä tapauksissa, joissa saloautuminen polypep-tidillä oli odotettavissa, antiseerumeita esi-inkuboitiin poly-peotidiliuoksen 100 mikrogramman kanssa yön yli d°C:n lämoöti-lassa tai 2 tunnin ajan 37°C:ssa ennen niiden inkuboimista nit-rosel.luloosaliusko jen kanssa. Molekyylipainot Derustuvat alhaisten molekyy1ipainoien standardeihin (BioRad), ja ne esitetään kuvan vasemmassa marginaalissa. Urien 1 ja 3 annettiin reaqoida anti-polypeptidin 99 ja anti-polypeptidin 142 vasta-aineiden : : : kanssa, vastaavasti. Urien 2 ja 4 annettiin reagoida näiden samojen vasta-aineiden kanssa, joita vasta-aineita oli esi-in-... kuboitu polyDeptidin 99 tai polypeptidin 142 kanssa, vastaavasti.
: Urissa 5 ja 6 nähdään antipolypeptidin 99 ja 142 vasta-aineiden, • - vastaavasti, reaktiot vertailuna toimivien solulysaattien kanssa.
Oheisella keksinnöllä on lukuisia etuja ja hyviä puolia. Eräs näistä eduista on se, että ensimmäisen kerran HBxAgrn läsnäolo missä tahansa solussa saatiin ilmaistuksi.
Toisena etuna on se, että tässä keksinnössä saadaan aikaan testausmenetelmä ja -järjestelmä HBxAgrn läsnäolon toteamiseksi kroonisesti hepatitis B-viruksen infektoimassa isäntäeläimessä.
i 22 86585
Edelleen eräänä etuna on se, että tämän keksinnön soveltaminen mahdollistaa HBxAgrn toteamisen ihmisen hepatomaskasvaimesta peräisin olevista soluista, mikä vahvistaa hepatitis B-viruksen ja tämän syöpämuodon välillä oletettua yhteyttä.
Eräs keksinnön hyvistä puolista on se, että siinä saadaan aikaan menetelmä HBxAg:ta koodaavan geenin kloonaamiseksi.
Toinen tämän keksinnön hyvistä puolista on se, että siinä saadaan aikaan keino HBxAgrn olennaisen polypeptidiosan ilmentymiseksi, jota olennaista polypeptidiosaa voidaan käyttää antigeeninä sellaisessa diagnostisessa kokeessa, jolla selvitetään ihmisen seerumissa olevan HBxAgrn vasta-aineiden (anti-X vasta-aineet) läsnäolo .
Edelleen tämän keksinnön hyvänä puolena on se, että siinä valmistetaan sellainen synteettinen polypeptidi, joka aminohappojäännösten järjestykseltään vastaa HBxAgrn antigeenisyyden determinantin (määräävä elementti) sitä ketjua, jota voidaan käyttää HBxAgrn kanssa immunoreagoivien vasta-aineiden valmistamiseen sekä niiden polypeptidien, joilla on yhteinen antigeenisyyden determinantti HBxAgrn kanssa, i mmunorougo i v i en vas t a-a i riei den valmistamiseen .
' : ; Tämän keksinnön muut edut ja hyvät puolet ovat ilmeisiä alan : : : asiantuntijalle seuraavan yksityiskohtaisen kuvauksen sekä patenttivaatimusten perusteella.
: Määritelmät - - Transfektior uusien geneettisten merkitsimien aikaansaaminen sisällyttämällä eukariottisiin soluihin lisä-DNArta.
; Transformaatior uusien geneettisten merkitsimien aikaansaaminen ·. ‘ sisällyttämällä prokariottisiin soluihin lisä-DNArta.
.···. Kloonaava vektori r mikä tahansa plasmidi tai virus, johon voidaan istuttaa kloonattavaa vierasta DNArta.
23 86585
Plasmidi: autonominen, itsereplikoituva, kromosomien ulkopuo linen rengasmainen DNA.
Avoin lukukehys: DNA-ketju, joka voidaan (mahdollisesti) muuttaa luennan avulla proteiiniksi.
Avustajavirus: virus, jossa on vajavaisesta viruksesta puuttu vat toiminnot, ja jonka avulla vajavainen virus kykenee viemään infektoivan syklin päätökseen sekainfektion aikana.
Geeni (Cistroni): DNA-segmentti, joka on osallisena polypeptidi- ketjun valmistuksessa; se käsittää alueita, jotka sijaitsevat ennen koodaavaa aluetta ja sen jälkeen (johto- ja peräalueet) sekä erillisten koodaavien segmenttien (eksoni) välissä olevia väliketjuja (introni).
Ilmentyminen: prosessi, jonka rakenteellinen geeni käy läpi polypeptidin tuottaessaan. Se on transkription (kopiointi) ja translaation (luenta) yhdistelmä.
Klooni: suuri joukko keskenään identtisiä soluja tai molekyylejä, jotka ovat peräisin yhdestä ainoasta solusta tai molekyylistä.
Emäspari (bp): suhde, jonka adeniini (A) ja tyrniini (T), tai sytosiini (C) ja guaniini (G) muodostavat keskenään DNA-kaksois-kierteessä.
Ilmentyvä vektori: mikä tahansa plasmidi tai virus, johon voi- . . daan istuttaa tai jolla voidaan ilmentää vierasta DNA:ta.
Alavirta: luonnehtii niitä ketjunosia, jotka ulottuvat pitem mälle ilmentymisen suuntaan; esimerkiksi polypeptidin koodaava alue geenissä sijaitsee alavirtaan käynnistävästä kodonista.
A. Yleistarkastelua
Hepatitis B-viruksen HBV genomissa oleva alue X on mielenkiintoinen mm. siitä syystä, että viime aikojen löydökset osoittavat, että tämä alue X on mahdollisesti ilmentyvä, ja tavanomaisissa : . serologisissa HBV-analyyseissä ei olla löydetty sen proteiini-·'· tuotetta eikä tällaisen tuotteen vasta-aineita. Ohessa käytetään viime aikoina kehitettyä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa sekä synteettisten polypeptidien tekniikkaa, joiden avulla voidaan välttää tavanomaisissa menetelmissä havaitut puutteellisuudet HBxAg:n 24 86585 ilmentymistä tutkittaessa, ja joilla HBxAqrn ilmentymistä voidaan havainnollistaa soluissa, jotka ovat peräisin ihmisen hepatoma-kasvaimsesta saaduista solusukupolvista, sekä kroonisesti HBV-infektoituneista ihmisistä ja simoansseista peräisin olevissa maksasoluissa.
Tätä tavoitetta ajatellen tässä keksinnössä tarkastellaan HBxAg:n kloonaavia ja ilmentäviä vektoreita, synteettisiä polypeptidejä, jotka vastaavat HBxAgrn antiqeenisyyden determinantteja, ja näiden synteettisten polypeptidien vaikutuksesta muodostuneita vasta-aineita, jotka sitoutuvat sekä näihin polypeptideihin että HBxAgrhen tai sen olennaiseen osaan, sekä kokeisiin, joilla HBxAgrn läsnäolo voidaan todeta.
Ohessa tarkasteltuja kloonaavia vektoreita käytetään mm. HBxAgrn sisältävän geenin käyttökelpoisten määrien valmistamiseksi.
Tätä geeniä voidaan puolestaan käyttää mm. HBxAgrn ja sen poly-peptidifragmenttien sellaisten määrien valmistamiseksi, joita määriä voidaan käyttää tutkittaessa itse hepatitis B-viruksen aiheuttamaa tautia.
Tämän keksinnön mukaiset uudet synteettiset polypeotidit ovat käyttökelpoisia mm. antigeeneinä, kun valmistetaan vasta-aineita, jotka immunoreagoivat HBxAgrn sekä sen olennaisten polypeptidi-. osien kanssa, ja jotka immunoreagoivat itse näiden synteettisten * ' polypeptidien kanssa. Näin valmistettuja vasta-aineita voidaan käyttää tämän jälkeen HBxAgrn tai sen olennaisten polypeptidi-osan läsnäolon testaamiseksi infektoidun isäntäaläimen soluista tai kudosviljelmistä.
: Ilmentävää vektoria voidaan käyttää solujen transfektoimiseen sekä HBxAgrn olennaisen osan sisältävän polypeptidin ilmentymisen indusointiin. Tämän jälkeen tätä ilmentynyttä polypep- • ; tidiä voidaan käyttää antigeeninä kokeissa, joilla ruumiista saaduista näytteistä määritetään HBxAgrn vasta-aineiden läsnä- olo.
25 86585 Tämän keksinnön mukaista ilmentyvää vektoria ja vasta-aineita voidaan myös käyttää merkitsimenä transfektoiduissa soluissa, jotka sisältävät tämän ilmentyvän vektorin, ja jotka lisäksi sisältävät muun ylimääräisen ligatoidun geenin, jonka läsnäolon toteaminen saattaa olla suhteellisen vaikeata. Täten jäljempänä kuvattu ilmentyvä vektori, jota kutsutaan SVHBV-3-vektoriksi, voidaan avata ja ligatoida johonkin muuhun sellaiseen vieraaseen geeniin, jonka koodaama proteiini saattaa olla suhteellisen vaikeasti määritettävissä. Sen jälkeen, kun vektori on saatettu uudestaan rengasmaiseksi, sopivat solut on infektoitu tällä täten muodostetulla uudella vektorilla ja kun soluista on saatu maljäämällä yksisoluisia pesäkkeitä, niin ne solut, joihin tämä uusi vektori sisällytettiin, voidaan tunnistaa sen perusteella, että ne ilmentävät vektorin koodaaman osan HBxAg:stä, joka on sulautuneena vieraan geenin koodaamaan proteiiniin, käyttämällä tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita. Tällainen merkitsin saattaa olla erityisen käyttökelpoinen niissä tapauksissa, joissa tämän vektorin toivotaan ilmentyvän eukarioottisissa soluissa, eli tapauksissa, joissa bakteerisolujen vektoreissa, kuten vektorissa pBR322, läsnäolevia lääkeaineen vastustuskyvyn mer-kitsimiä ei ole läsnä.
1. Kloonaavat vektorit Tämän keksinnön mukainen, HBxAgrn geenin sisältämä yhdistelmä-DNA voidaan tuottaa esimerkiksi kloonaamalla osa HBV DNA:sta. HBV:n genomimateriaalin saamiseksi yksijuosteisen osan sisältävä Dane-partikkelin DNA muunnetaan täydellisesti kaksijuos-teiseksi DNA:ksi käyttäen viruksen endogeenista DNA-polymeraa-sia.
Täten saatu rengasmainen, kaksijuosteinen HBV käsittää kaksi BamHI-endonukleaasin restriktiokohtaa. BamHI-entsyymi1la pilkkominen tuottaa tavallisesti kolme lineaarista tuotetta, jotka luokitellaan koon mukaan. Suurin näistä on 3200 emäsparin (bp) pituinen fraqmentti, joka edustaa ainoastaan yhdestä BamHI-koh- dasta pilkottua, koko HBV-genomia. 1850 emäsDarin ja 1350 emäs-parin pituisia fragmentteja syntyy, kun HBV pilkkoutuu molemmista BamHI-kohdista.
26 86585
Julkaisussa Galibert et ai. (1979), Nature, 281:646-650, esitetty HBV:n nukleotidien järjestyksen analyysi paljastaa, että 1850 emäsparin pituinen HBV:n BamHI-fragmentti sisältää HBxAg:tä koodaavan geenin. Kaikissa näissä kolmessa fragmentissa on kuitenkin täydentävät BamHI-päät, joten ne voidaan istuttaa kloo-naavan plasmidin BamHI-kohtaan.
Plasmidissa pBR322 on yksi ainoa BamHI-restriktiokohta, joka sijaitsee tetrasykliinin vastustuskyvyn aikaansaavassa geenissä, kuten kuvaa 3 tarkastelemalla voidaan todeta. Kun plasmidin pBR322 DNA pilkotaan BamHI-entsyymi 1lä, saadaan yksi lineaarinen fragmentti, joiden päät täydentävät päitä kolmessa BamHI-entsyymillä saadussa HBV:n DNA-fragmenteissa (BamHI HBV DNA-fragmentissa).
Kun kukin näistä kolmesta BamHI HBV DNA-fragmentista ligatoidaan plasmidin pBR322, sen BamHI-kohtaan, T4 DNA-ligaasia käyttäen, jolloin plasmidit muodostuvat uudestaan ja muuttuvat renkaiksi, niin tuloksena oli kolme ainutlaatuista yhdistelmä-DNA-plasmi-dia. Nämä kloonaavat yhdistelmäplasmidit ovat rengasmaisia DNA-molekyylejä, ja niille on annettu nimiksi: AM7, joka sisältää plasmidin pBR322 DNA:n sekä plasmidin pBR322 BamHI-kohtaan istutetun, 1350 emäsparin pituisen BamHI HBV DNA-fragmentin; AM6, joka sisältää plasmidin pBR322 DNA:n sekä plasmidin BamHI-: kohtaan istutetun, koko HBV-genomin; ja AMI, joka sisältää plas midin pBR322 DNA:n sekä plasmidin pBR322 BamHI-kohtaan istute- ; V tun, 1850 emäsparin BamHI HBV DNA-fragmentin, joka käsittää HBxAg:n geenin.
.·- Kun BamHI HBV DNA-fragmentit on ligatoitu plasmidin pBR322 BamHI- kohtaan T4 DNA-ligaasilla, niin täten syntyneet yhdistelmäplas- - midit eivät enää saa aikaan tetrasykliinin vastustuskykyä. Näin ollen edellä mainituilla ligaatiotuottei11a transformoitujen Escherichia coli (E. coli)-bakteerin kannan HB101 pesäkkeiden - '/ joukosta valikoitiin ampisilliinille vastustuskykyisiä ja tetra- sykliinille herkkiä muunnoksia.
L
27 86585
Kolmelle, yhdistelmäplasmideilla AMI, AM6 ja AM7 transformoidulle, lääkeaineen perusteella valikoidulle E. coli-kannalle HB101 on annettu nimiksi ECAMl, ECAM6 ja ECAM7, vastaavasti. Näitä edellä mainittuja plasmideita valmistettiin suhteellisen suuria määriä kasvattamalla edellä mainittuja transformant-teja sopivassa ravintoalustassa, kuten LB-ravintoalustassa jäljempänä kuvattavalla tavalla.
Edellä mainituista plasmideista AMI ja AM6 voidaan irroittaa koko HBxAg-geenin emäsketjun tai osan siitä sisältävä fragmentti sopivia restriktioentsyymejä käyttämällä. Esimerkiksi kun plasmidit AMI ja AM6 pilkottiin restriktioentsyymillä BamHI, niin reaktiotuotteista voitiin eristää HBxAgrtä koodaavan geenin sisältämä, 1850 emäsparin pituinen fragmentti. Kasvattamalla näillä yhdistelmäplasmideilla muunnettuja E. coli-baktee-rin HB101 kantoja ECAM6 tai ECAMl voidaan saada suhteellisen suuria määriä HBxAg:tä koodaavaa DNA-ketjua.
Sen HBxAg:n geenin, jossa DNA-emäsjärjestys ja sijainti HBV-genomissa on määritetty, perusteella on ilmeistä, ettei siihen sisälly introneita. Tämä tarkoittaa sitä, että tämä geeni on kopioitavissa sellaisenaan, mikä johtaa fenotyypin ilmentymiseen lähetti-RNA:na eläinsoluissa sekä bakteerisoluissa.
2. Ilmentyvät vektorit HBxAg-geenin sekä asianmukaisen ilmentymisjärjestelmän vieminen eläisoluun, esimerkiksi afrikkalaisen marakatin munuaissoluun - menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Ganem et ai. (1976), 'IV J. Mol. Biol. 101:57-83, saattaa johtaa HBxAg:n synteesiin mai-' ' nitun solun sisällä. Lisäksi naiden apinan munuaissolujen, jotka sisältävät HBxAg-geenin seka asianmukaisen ilmentyvän vek-: torin, viljeleminen tekee HBxAgrn halvan massatuotannon mahdol- liseksi.
HBxAg-geenin ilmentämiseen kykenevä yhdistelmä-DNA muodostettiin edullisesti siten, että täydellinen HBxAq-qeeni tai sen fragmentti istutettiin sen lukukehystä siirtämättä Simian Virukseen \ i 28 86585 40 (SV40), alavirtaan SV40:n myöhäisen alueen promoottorista. Vektoria, joka ilmentää SV40:n myöhäisen alueen promoottoria käyttäen, tuotettiin suuria määriä seuraavalla tavalla.
SV40-DNA ja plasmidin pBR322 DNA pilkottiin kahdella restriktio-entsyymillä, BamHI:llä ja EcoRI:llä. SV40:stä ja plasmidista pBR322 peräisin olevat suuremmat fragmentit ligatoitiin T4 DNA-ligaasia käyttäen. Tämä ligaatiotuote pilkottiin BamHI-entsyy-millä, jolloin muodostui lineaarinen DNA, jossa oli BamHI-kohee-siopäät. Tämän SV40/pBR322-DNA:n ja 1850 emäsparin BamHI HBV DNA:n ligatoiminen johti rengasmaiseen yhdistelmäplasmidiin, joka nimettiin SVAM191-plasmidiksi.
Tämä yhdistelmä-DNA SVAM191 sisältää E. coli-bakteerin kokonaisen, ampisilliinin vastustuskyvyn aikaansaavan geenin. E. coli-bakteerit HB101, jotka on transformoitu plasmidilla SVAM191, ovat ampisilliinille vastustuskykyisiä ja tetrasykliinille herkkiä, joten niitä voidaan valikoida sen perusteella, miten herkkiä ne ovat näille lääkeaineille. Plasmidilla SVAM191 muunnetut E. coli-bakteerit HB101 on nimetty EC-SVAM191-bakteereiks.i , ja niitä voidaan kasvattaa sopivassa alustassa, kuten ampisil-liinia sisältävässä LB-ravintoalustassa, ja täten voidaan saada suhteellisen suuria määriä tätä plasmidia.
3. Soluvi LLeljnä
Isäntäsolujen transformointi täten saaduilla yhdistelmä-DNA-plas-mideilla AMI, AM6 ja SVAM191 voidaan toteuttaa tunnetuilla menetelmillä /Cohen et al·., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69:2110-2114 (1972)7 tai niiden muunnoksilla. Tällaisia isäntäsoluja ovat mm. mikro-organismit, kuten Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis sekä hiivat, ja mieluiten ne ovat jokin Escherichia coli-bakteerin kanta, kuten nimillä 294 (ATCC 31446) W3100 (ATCC 27325) tai RRl (ATCC 31447) tunnetut kannat. Isän-täsolusukupolvena käytetään erityisen miololLään E. roli-kantaa HB101 (ATCC 33694) .
: : Uutta, HBxAg-geenin sisältävää yhdistelmäplasmidin DNA:ta kan tavan solun kanta voidaan eristää tunnetuilla menetelmillä, kuten esimerkiksi seuraavaa tekniikkaa käyttäen.
29 86585
Ainoastaan osittain kaksi juos teinen Dane-partikkelin DNA voidaan merkitä radioaktiivisesti siten, että sen yksijuosteinen osa täydennetään ^H:ta sisältävillä dNTP-ryhmillä, käyttäen eiidogeenisen DNA-polymeraasin reaktiota. Robinson (1975),
Am. J. Med. Sei., 270:151-159. Tämän jälkeen tätä merkittyä tuotetta käytetään koettimena, jolloin positiivinen klooni voidaan erottaa aikaisemmin saatujen, lääkeaineen avulla valikoitujen transformanttien joukosta käyttämällä tunnettua, Southern:in täplähybridisaation menetelmää /Southern (1975), J. Mol. Biol., 98:5037 tai tunnettua Desäkehybridisaation menetelmää /Grunstein et ai. (1975), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72:3961-39657- Täten muunnettuja ja eristettyjä isäntäsoluja kasvatetaan tunnetussa alustassa. Tämä alusta voi olla esimerkiksi LH-ravinto-alustaa, Penassay-ravintoa lustaa tai M9-alustaa, joka sisältää glukoosia ja Casaminohappoja /Miller, Experiments in Molerular Genetics, 431-433 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1912)7.
Tämä viljeleminen toteutetaan tavallisesti 15-43°C:n lämpötilassa, mieluiten 28-40°C:ssa, 2-24 tunnin ajan, mieluiten 4-16 tun-- . nin ajan, ja tarpeen vaatiessa ilmastaen ja/tai sekoittaen.
Viljelyn jälkeen bakteerisolut otetaan talteen, solut suspen-doidaan puskuriin ja rikotaan esimerkiksi iysotsyymi1lä, jäähdyttämällä ja sulattamalla tai ultraäänikäsittelyl1ä. HBxAq:tä koodaava qeeni voidaan eristää menetelmällä, jolla tavallisesti solujen rikkomisen jälkeen sentrifuqoimalla saadusta suoernatan- tista puhdistetaan DNA:ta.
HBxAg:tä eukarioottisissa soluissa ilmentävän vektorin saamiseksi osa plasmidin SVAM191 DNA:sta, mukaan lukien kaikki plasmidista pBR322 peräisin oleva DNA, poistettiin. Tämä toteutettiin siten, että SVAM191 pilkottiin restriktioentsyymillä Haell. Kun suurempi, plasmidista SVAM191 saatu Haell-pilkkomistuote tehtiin rengasmaiseksi, niin tällöin muodostui vektori, joka kykenee ilmentämään HBxAgrtä eläinsoluissa, ja jolle annettiin nimeksi SVHBV-3.
30 8658S
Nisäkkäästä saatu isäntäsolu voidaan transfektoida vektorilla SVHBV-3 tunnettuja menetelmiä käyttäen, jolloin saadaan aikaan ilmentymisjärjestelmä. Esimerkiksi, restriktioentsyymillä Hindlll pilkottu SVHBV-3 voidaan istuttaa COS-7-soluihin (ATCC CRL 1651). /Katso, Gluzman (1981), Cell, 23:175-182; ja Siddiqui (1983), Mol. and Cell Biology, 3:143-146^ SVHBV-3 voidaan myös istuttaa naudan Papilloma-virukseen, jolloin sillä voidaan transformoida hiiren solusukupolvia.
SVHBV-3-vektoria käytetään mieluiten yhdessä SV40tsÄ23g-avustaja-viruksen kanssa, jolloin sillä voidaan transfektoida afrikkalaisen marakatin munuaisesta saatua solusukupolvea BSC-1 (ATCC CCL 26). Näin muunnettuina nämä BSC-l-solut tuottivat oolypeptidiä, joka sisälsi HBxAgrn antigeenisyyden determinantteja.
Tulisi käsittää, että kloonaavan tai ilmentävän siirtovälineen valittuun restriktiokohtaan istutetun geenifragmentin nukleotidi-järjestys saattaa sisältää nukleotidejä, jotka eivät kuulu osana toivotun proteiinin todelliseen geeniin tai se saattaa käsittää ainoastaan jonkin fragmentin tästä geenistä. Täten geneettisessä koodissa olevan informaation tunnetusta ylenpalttisuudesta johtuen tämä istutettu geeni ei ole välttämättä identtinen ohessa kuvatun HBxAg-geenin kanssa, vaan riittää, että se koodaa HBxAg:tä. Lisäksi HBxAgrtä koodaava DNA-ketju voi käsittää ylimääräisiä emäksiä joko 3'- tai 5'-päässä tai tämän HBxAgrtä koodaavan ketjun molemmissa päissä, kunhan vain lukukehys pysyy muuttumattomana. Toisin sanoen istutetusta DNA-ketjusta riippumatta tässä keksinnössä edellytetään ainoastaan, että transformoitu tai trans-fektoitu isäntä tuottaa joko HBxAgrtä koodaavaa DNArta, HBxAg-proteiinia tai polypeptidiä, joka sisältää olennaisen osan HBxAg-proteiinista, vastaavasti.
4. Polypeptidit, antigeenit ja vasta-aineet
Kuten jäljempänä esitetään, HBxAgrn ilmentyminen voidaan todeta sellaisten synteettisten polypeptidien indusoimia vasta-aineita käyttämällä, joissa synteettisissä polypeptideissä aminohappo-jäännösten järjestys vastaa aminohappojäännösten järjestystä 3i 86585 HBxAgrn antigeenisyyden determinantissa. Tämän keksinnön mukaiset polypeptidit käsittävät tyypillisesti noin 6-40 aminohappo jäännöstä . Nämä polypeptidit käsittävät mieluiten noin 10-20 aminohappojäännöstä.
Seuraavassa ja kuvassa 6 esitettyjen, nimillä 99, 100 ja 142 tunnettujen synteettisten polypeptidien aminohappojäännösten järjestys määritettiin edellä mainitussa Galibert:in et ai. julkaisussa esitetyn HBV:n nukleotidi järjestyksen perusteella.
Polypeptidi 99: Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-
Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cys,
Polypeptidi 100: Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-
Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val, ja Polypeptidi 142: Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-
Phe-Phe-Thr-Ser-Ala, jossa kukin aminohappojäännösten ketjuista esitetään vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karboksipäähän.
Huomattakoon, että polypeptidit, jotka aminohappojäännösten järjestykseltään vastaavat polypeptidien 99 ja 100 ketjuja, paitsi että polypeptidien 99 ja 100 karboksi- ja aminopäässä olevat kysteiinijäännökset puuttuvat, vastaavasti, ovat myös käyttökelpoisia oheisessa keksinnössä ja niitä pidetään tämän keksinnön osana. Näitä polypeptidejiä, joita kutsutaan poly-peptideiksi 99b ja LOOb, voidaan käyttää immunogeeneina, mikäli ne on sidottu kantajaan amino- tai karboksioään jäännöksestään, :: ja niitä voidaan myös käyttää tutkittaessa immunoreaktioiden salpautumista, kuten kuvien 7, 8 ja 10 yhteydessä esitetään ja kuten jäljempänä kuvataan.
Seuraavat kaavat esittävät aminohappojäännösten järjestystä polypeptideissä 99b ja 100b, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karboksioäähän: ' . Polypeptidi 99b: Leu-Ser-Ala-Met-Ser- .. . Thr-Thr-Aso-Leu-G.lu-Ala-Tyr-Phe-hys-Asp, 32 86585
Polypeptidi 100b: Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-
Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val.
a. X-proteiini transfektoiduissa soluissa
Kaniinit, jotka immunoitiin keyhole limpet-entanan hemosyaniini (KLH)-kantajaan konjuqaatiksi kytketyllä polypeotidillä 99, 100 tai 142, tuottivat vasta-aineita (anti-99, anti-100 ja anti-142, vastaavasti), jotka immunoreagoivat SVHBV-3-vektorilla transfek-toiduissa BSC-l-soluissa ilmentyneen HBxAg-oolyoeotidin kanssa, mikä osoitti ensimmäisen kerran HBxAg-polypeotidin ilmentymisen näissä tai joissakin muissa soluissa. Nämä anti-polyoeptidin vasta-aineet eivät immunoreagoineet minkään muun transfektoimat-tomista BSC-l-soluista löydetyn polypeptidin kanssa; eli soluista, jotka olivat infektoituneet villityvpin (wt) SV40-viruksella.
Lisäksi HBxAg-polypeptidiä ilmentävien anti-polypeptidin vasta-aineiden immunoreaktiivisuus estyi tai salpautui, mikäli näitä vasta-aineita esi-inkuboitiin niitä täydentävän (vastaavan) polypeptidin kanssa; eli sen polypeptidisen immunoqeenin kanssa, joka sai niiden muodostumisen aikaan. Tämä saloautuminen osoittaa, että nämä vasta-aineet tunnistivat spesifisesti HBxAgrksi oletetun polypeptidin antigeenisyyden determinantin, ja että nämä synteettiset polypeotidit vastasivat aminohappojäännösten M ; järjestykseltään järjestystä oletetun HBxAg-proteiinin antigee-; : : nisvyden determinantissa. Tulokset saloautumisesta saatiin käyt- tämällä Western:in täplitvstekniikkaa (Materiaalit ja menetel- mät), minkä jälkeen sidottujen vasta-aineiden sijainti selvi-125 : .·. tettiin I:llä merkittyä Staohylococcus aureus-bakteerin pro-- - teiinia A käyttäen, jonka jälkeen kokeen kehittäminen tapahtui autoradiografisesti.
’' Nämä tulokset esitetään kuvassa 10 polypeotidien 99 ja 142 anti-seerumeiden tapauksessa. Kuvassa 10 ura 1 esittää anti-99:n j'-·; ja SVHBV-3-vektori 11 a infektoiduista soluista saadun lysaatin .···. välistä immunoreaktiota, kun taas ura 2 esittää tämän immuno-reaktion salpautumista, kun antiseerumia esi-inkuboidaan polypeptidin 99 kanssa. Samalla tavalla ura 3 esittää anti-142 ja solulysaatista saadun proteiinin välistä immunoreaktiota, ja li 33 8 6 5 8 5 tämä immunoreaktio saloautui, kun tätä antiseerumia esi-inku-boitiin oolypeotidin 142 kanssa. Urista 5 ja 6 nähdään, ettei immunoreaktiota esiintynyt vertailusolujen lysaattien kanssa.
Tämä nolyoeptidi-ilmentymisen tuote SVHBV-3:lla transfektoi-duissa soluissa, jonka tuotteen antiseerumin tunnistivat spesifisesti polypeptideiksi 99 ja 142, kuten kuvassa 10 esitetään, molekyylipaino on noin 24 000 daltonia. Kuten jäljempänä esitetään, ihmisen hepatomakasvaimesta peräisin olevan solusuku-polven PLC/PRF/5 lysaatista on tunnistettu polypeptidi, jonka molekyylipaino on noin 28 000 daltonia. Oletetaan, että tämä molekyylipainojen välinen ero näiden kahden solusukupolven il-mentämissä polypeptideissä (proteiineissa) johtuu siitä, että ilmentyneet polyoeptidit ovat tuloksena X-proteiinin ja muiden proteiinien tai polypeotidien välisestä yhteensulautumisesta (fuusiosta).
Näin ollen, kuten edellä jo huomautettiin, SVHBV-3:sta puuttuu täydellisen, X-proteiinia koodaavan genomin osa. Kuvasta 6 nähdään, että SVHBV-3:n sisältämästä X-geenin osasta puuttuu kodonit tämän oletetun X-proteiinin ensimmäisille kahdellekym-menellekahde.lle aminohappo jäännökselle, metioniinin käynnistvs-kodoni ATG mukaanlukien.
; Täten arveltiin, että SVHBV-3:lla transfektoitujen solujen il- mentämä polypeptidi on mahdollisesti fuusiotuote, joka on syntynyt vektorissa läsnäolevien SV40-rakenteellisen proteiinin VP2-ketjujen kanssa. Tämän fuusioproteiinin (Dolypeotidin) koon arveltiin olevan 24 500 daltonia. Molekyylipainoltaan ‘ ' noin 24 000 daltonia olevan ilmentyneen polypeptidin löytyminen on näiden olettamusten mukaista. 28 000 daltonin fuusio-proteiinia (polypeptidiä) tarkastellaan jäljempänä.
• b. Hepatomasoluissa ilmentynyt X-proteiini HBxAg:n ilmentyminen .uskotaan samoin olevan HBV-tautien jois-- sakin tiloissa esiintyvä toiminta. Esimerkiksi polypeptidin 99 vasta-aineet (anti-S9) tunnistivat spesifisesti 28 000 dal-
J
34 86585 tönin proteiinin, joka oli ilmentynyt ihmisen hepatomakasvai-mesta peräisin olevassa solusukupolvessa PLC/PRF/5 (ATCC CRL 8024). Tavallinen kaniinin seerumi ei tunnistanut tätä proteiinia ja anti-99:n tunnistaminen saloautui, kun sitä esi-inkuboitiin polypeptidin 99 kanssa. Tämän solusukuoolven tiedetään sisältävän integroituneen HBV DNA:n. Chakrabortv et ai., (1980), Nature, 286:531-533; Edman et ai. (1980), Nature, 286:535-538; sekä Marion et ai., (1980), Virol, 33:795-806.
HBsAg on todettu tästä hepatomasolujen sukupolvesta,/McNab et ai., (1976), Cancer, 34:509-515; sekä Aden et ai., (1979), Nature, 282:615-6167, kun taas kaikki standardikokeet HBcAg:n ja HBeAg:n ilmaisemiseksi ovat olleet negatiivisia. Nimellä HepG2 (ATCC CCL 23) tunnettu solusukupolvi on myös ihmisen hepatomasolujen sukupolvi, mutta se ei sisällä integroituneita HBV DNA-ketjuja. Katso edellä mainittu Aden:in et ai. julkaisu.
Nämä tulokset saatiin siten, että PLC/PRF/5-solun proteiinit merkittiin radioaktiivisesti, mitä seurasivat toistuvat immuno-saostukset anti-99:ää ja Staphylococcus aureus-bakteerin proteiinia A käyttäen, ja sitten talteen otetun saostuman elektroforeesi. Tämän jälkeen tämä 28 000 daltonin proteiini tunnistettiin autoradiografisesti. Tätä toimenpidettä tarkastellaan f samoin osassa Materiaalit ja menetelmät.
; Kuvassa 7 esitetään tulokset samankaltaisesta tutkimuksesta, jossa käytettiin sekä PLC/PRF/5- että HepG2-soluista saatuja : lysaatteja. Kuvasta 7 nähdään, että 28 000 daltonin suuruinen - X-spes.ifinen proteiini todettiin PLC/PRF/5-soluista (ura 5).
Immunoreaktiivisuus katosi, kun vasta-ainetta esi-inkuboi-tiin polypeptidin 99 kanssa (ura 6), mutta ei jonkin asiaan liittymättömän polypeptidin kanssa (ura 7). Vertailuna toiminut esi-immuuniseerumi (= seerumi ennen immunointia) ei immuno-reagoinut (ura 8). X-spesifistä reaktiivisuutta ei todettu .· vertailuna tomineissa HepG2-lysaateissa (urat 1-4). Nämä tulok set osoittavat, että X-geenituote ilmentyy ihmisen hepatomasolu- i li 35 86585 jen sukupolvessa, joka sisältää integroituneita HBV DNA-ket-juja.
c. X-proteiinin ilmentyminen maksasoluissa
Lisäksi neljää ihmisestä tai simpanssista Deräisin olevaa maksa-näytettä, joihin joko liittyi HBV-infektio tai joista se puuttui^ tutkittiin Western:in täplityskokeella X:n sukulaispro-teiinien läsnäolon selvittämiseksi, anti-X-polypeptidin vasta-aineita käyttäen. Tämän tutkimuksen tulokset esitetään taulukossa 8. Yksi ihmisestä peräisin oleva näyte (H) oli saatu kroonisesti HBV-infektoidusta hepatomamaksasta ja toinen akuutin vaiheen HBV-infektiosta (H). Infektoitumattomasta simpanssista (C) ja kroonisesti HBV:llä infektoidusta simpanssista (C) saatiin maksasolujen lysaattia, joiden annettiin reaqoida anti-X-polvpeptidin vasta-aineen kanssa.
Anti-99-vasta-aineet reagoivat sekä 45 000 että 28 000 (vasemman marginaalin nuoli, oikean marginaalin o28) daltonin suuruisen proteiinin kanssa. Molemmat reaktiivisuudet saloautuivat, kun näitä vasta-aineita esi-inkuboitiin Dolypeotidin 99 kanssa. Kun anti-142-vasta-aineiden annettiin reaqoida näiden samojen solulysaattien kanssa, niin spesifiset vyöhykkeet todettiin : kohdissa 40 000 (p40), 28 000 (p28) ja 17 000 (ol7). Näihin proteiineihin kohdistuvia reaktiivisuuksia pidetään spesifisinä, koska ne menetetään, kun anti-142-vasta-aineita esi-inkuboidaan polypeptidin 142 kanssa.
Vertailunäy tteessä, joka oli inf ektoitumattoman simpanssin maksa *- (ura 3 kaikissa liuskoissa), todettiin noin 45 000 daltonin suu ruinen proteiini (d45) ja siihen liittyvät anti-99-vasta-aineet sekä proteiinit o40 ja ol7 niihin liittyvine anti-142-vasta-aineineen. Proteiini p28 ilmentyi ainoastaan HBV:n infektoi-: missä kudoksissa (ura 5). Immunoreaktiivisyys menetettiin, -- kun vasta-ainetta esi-inkuboitiin polyoeotidin 99 kanssa (ura ; 6), mutta ei asiaan liittymättömällä oolypeptidillä (ura 7).
36 86585
Vertailuna toimiva esi-immuuniseerumi ei reagoinut (ura 8). Vertailuna toimivista HepG2-lysaateista ei todettu X-spesi-fistä reaktiivisuutta (urat 1-4). Näiden tulosten oerusteella on selvää, että X-geenituotetta ilmentyy ihmisen hepatoma-solujen sukupolvessa, joka sisältää integroituneita HBV DNA-ket juja.
45 000 daltonin suuruisen proteiinin läsnäolo todettiin myös suhteellisen pienenä määränä PLC/PRF/5-soluista Deräisin olevissa lysaateissa, kuten kuvassa 7 esitetään. Anti-99-vasta-aineiden ja 45 000 daltonin suuruisen proteiinin välinen immu-noreaktio salpautui myös, kun näitä vasta-aineita esi-inkuboi-tiin immunoivan polypeptidin 99 kanssa. Tämä nähdään kuvan 7 urassa 6.
Ihmisen tavallisista maksasoluista saatujen uutteiden (HBV-seronegatiivisia) todettiin ilmentävän ainoastaan 45 000 daltonin suuruista proteiinia Western:in täolityskokeessa anti-99:ää käyttäen. Lisäksi HBs:n, HBc:n ja HBe:n vaikutuksesta muodostuneita, kaupallisesti saatavia vasta-aineita (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) käyttäen toteutetuilla vertailukokeilla ei kyetty tunnistamaan tämän keksinnön mukaisilla vasta-aineilla paikallistettuja Droteiineja. Tämän oerus-teella voidaan jälleen odottaa, että 45 000 daltonin suuruisessa proteiinissa olevat antigeenisvyden determinantit ovat HBxAgrn kanssa homologiset, mutta että anti-99:n tunnistama 28 000 daltonin suuruinen proteiini on spesifinen HBV-taudin : aiheuttamalle tilalle, ja että se eroaa HBsAgistä, HBeAgrstä sekä HBcAg:stä.
d. X-geeni maksasoluissa p28:n ilmentyminen PLC/PRF/5-soluissa oli peräisin isännän DNArhan integroituneesta HBV DNArsta. Oli mielenkiintoista - -' määrittää, oliko tämä ainoa taoa, jolla X-proteiini voi il- mentyä.
Tästä syystä ne simpanssista ja ihmisen maksasta saadut DNA:t, joissa todettiin X-oroteiinia, varustettiin HBV DNA-koetti- 37 86585 mella (kuva 9). Näistä maksakudoksista eristettiin täydellisesti kuvassa 8 esitetty DNA, ja siitä analysoitiin HBV-DNA-ketjujen läsnäolo. 28 000 daltonin suuruisen proteiinin sisältävästä simpanssin näytteestä saadusta DNA:sta muodostui homologisia vyöhykkeitä, kun se pilkottiin BamHIrllä, EcoRI:llä tai kun se jätettiin pilkkomatta (kuva 9, urat 1, 2 ja 3, vastaavasti). BamHI pilkkoo rengasmaisen HBV DNA:n kahdeksi fragmentiksi /suuruudeltaan 1859 ja 1350 emäsparia (bo|/, 5,8 kilo-emäksen (kb) kohdalla oleva vyöhyke (ura 1) edustaa aenomin kokoa suurempaa integroitunutta ketjua. Koska tämän molekyyli-oainoltaan suuren DNA-vyöhykkeen alapuolella ei esiinny muita vyöhykkeitä (ura 3), niin tästä päätellään, että tässä DNArssa on läsnä ainoastaan HBV:n integroituneita ketjuja.
Lisäksi HBcAg-positiivisesta ihmisen maksasta valmistettiin DNA-preparaatti, joka varustettiin HBV-koettimella. Pilkkominen restriktioentsyymeillä Hindlll, BamHI tai RcoRT tai pilkkomaton DNA (kuva 9, urat 7-10, vastaavasti) paljasti homologisten ketjujen läsnäolon, jotka ketjut olivat genomin kokoon verrattuna yhtä suuria tai pienempiä, mikä osoitti sen, että nämä ihmisestä peräisin olevat DNA-näytteet eivät sisältäneet integroituneita ketjuja. Simpanssista ja ihmisestä peräisin I;; olevat maksakudokset, joista puuttui 28 000 daltonin suuruinen : proteiini, olivat myös negatiivisia HBV DNA-ketjujen suhteen : (kuva 9, urat 4-6 ja 11-14, vastaavasti). Kuvassa 9 esitet- tujen tulosten perusteella on selvää, että X-proteiini ilmen-: tyy HBV-infektoiduissa kudoksissa HBV-genomin tilasta huoli matta, jolloin päästään eroon siitä X-proteiinin ilmentymisen edellytyksestä, että HBV DNA on integroituneena.
- e. Yhteenveto tuloksista ' Edellä kuvatut tulokset osoittavat, että HBV-inf ektoiduissa ihmisen ja simpanssin maksakudoksissa esiintyy aikaisemmin .···. tunnistamatonta, viruksen koodaamaa proteiinia. Tätä 28 000 daltonin proteiinia (p28) koodaa HBV-qenomi riippumatta siitä, onko se vapaana, ekstrakromosomaalisessa (kromosomien ulkopuolella olevassa) muodossa, vai onko se integroituneena solun DNA:han.
38 86585 Tämä 28 000 daltonin oroteiini (p28) ei ole pelkästään X-alueen tuote, vaan se sisältää myös muita HBV-ketjuja. X-oroteiinin ennustettu koko, perustuen edellä mainitussa Galibert:in et ai. julkaisussa esitettyyn ketjuun, on noin 17 000 daltoniä (kuva 6). Kuitenkin sen X-proteiinin , jonka an t i-X-Deot id i n vasta-aineet tunnistivat PLC/PRF/5-soluissa, sekä simpanssin ja ihmisen HBV-infektoiduissa kudoksissa, molekyylipaino on 28 000 daltonia. Tämä koossa havaittu ero ei johdu X-qeenin sulautumisesta solun ketjuihin, sillä integroituneen HBV DNA:n puuttuminen p28:aa ilmentävissä ihmisen kudoksissa (kuva , urat 7-10) osoittaa, että X-proteiinin (p28) luenta tapahtuu yksinomaan HBV-qenomista.
X-proteiinin suurentunut koko on selitettävissä, mikäli proteiini on joko fuusio HBsAg-X tai X-HBcAq. Tällaisen fuusion todennäköisyys voidaan päätellä siitä, että nämä HBV-qeenit ovat lähellä toisiaan qenomissa.
Pyrkimys määrittää tällaisen fuusion olemassaolo RNA-taso 11 a epäonnistui, mikä johtui siitä, että PLC/PRF/5-soluista, joiden todettiin sisältävän X-ketjuja, saaduissa kopioissa todettiin joko pinnan tai ytimen ketjuja sekä X:ää (tuloksia ei ole : esitetty). Samankaltaisia tuloksia on esitetty julkaisussa
Gough (1983), J. Mol. Biol., 165:683-699. X-ydin-fuusion todistusaineistoa saadaan Heoadnavirus-perheen toisen jäsenen DNA-ketjusta, eli ankan hepatitis B-viruksesta (DHBV), missä --- molemmista geeneistä saadaan luennalla yksi proteiini /Mandart, : et ai. (1984), J. Virol., 49:782-7927, katso myös julkaisu .·.* Feitelson et ai. (1982 ), J. Virol., 43:687-696.
Se tosiseikka, että H3V:n X-alue ilmentyy, on varmaa. Kuitenkin tämän geeni tuot teen toiminta on edelleen tuntematonta. Proteiinimolekyyli, jonka on ehdotettu olevan X-alueesta luennalla muodostuva tuote, on löydetty IIRV-qenomi i n liittyen, tai täsmällisemmin, se on kova Ien11isesti sitoutunut L-juosteen ;·: 5'-loveen ("nick") Gerlich et ai. (1980), Cell, 21: 801-809. Se : ehdotus, että X-proleiini edusti DNA: ta sitovaa proteiinia, li kumoutui, kun PLC/PRF/5-solujen tai HBV-infektoidun kudoksen käsittely DNAasilla ei poistanut tai muuttanut o28:n aktiivi suutta (tuloksia ei ole esitetty).
39 86585 Tällä hetkellä HBV-infektion biologiaa tai HBV-infektion ja myöhemmin käynnistyvän hepatosellulaarisen karsinooman välistä riippuvuutta tunnetaan hyvin vähän. Tästä syystä HBV-infektion tai HBV-ketjujen läsnäolon lisämerkitsimet ovat erittäin tärkeitä. Tällä hetkellä tutkitaan anti-X-vasta-aineiden ja X-proteiinin olemassaolon mahdollisuutta ihmisseerumeissa.
Ohessa ja patenttivaatimuksissa polypeptidiketjujen yhteydessä, erilaisissa kieliopillisissa muodoissaan käytetyllä käsitteellä "vastata" tarkoitetaan kuvattua polypeptidiketjua, jonka joko amino- ja/tai karboksipäähän on joko lisätty tai niistä puuttuu korkeintaan kolme aminohappojäännöstä, ja joka sisältää ainoastaan konservatiivisia substituoitumisia tietyissä aminohappo jäännöksissä, jotka sijaitsevat tässä polypeptidiketjussa.
Edellä käytetyllä käsitteellä "konservatiivinen substituoitumi-nen" tarkoitetaan sitä, että jokin aminohappojäännös on korvautunut jollakin toisella, biologisesti samankaltaisella jäännöksellä. Esimerkkeinä konservatiivisista substituoitumisista mainittakoon hydrofobisen jäännöksen, kuten Ile, Vai, Leu tai Met, korvautuminen toisella hydrofobisella jäännöksellä, tai jonkin polaarisen jäännöksen korvautuminen toisella polaarisella jäännöksellä, esimerkiksi jäännösten Arg ja Lys, Glu ja Asp tai Gin ja Asn väliset substituoitumiset, sekä muut vastaavat.
Joissakin tapauksissa ionisen jäännöksen korvautuminen vastak-kaisesti varautuneella ionisella jäännöksellä, kuten esimerkiksi : Asp Lys-jäännöksellä, katsotaan konservatiiviseksi, sillä näiden ionisten ryhmien ajatellaan ainoastaan toimivan 1 iukenemisapuna. Kuitenkin yleisesti ottaen, koska ohessa tarkasteltavat korvautumiset tapahtuvat suhteellisen lyhyissä synteettisissä ooly-peptidin muodostamissa antigeeneissä, verrattaessa niitä koko : proteiiniin, niin ionisen jäännöksen korvautumista toisella ionisella, vastakkaisesti varautuneella jäännöksellä pidetään 40 86585 ohessa "radikaalina korvautumisena", kuten myöskin ionittomien ja ionisten jäännösten välisiä korvautumisia tai suurikokoisten jäännösten, kuten Phe, Tyr tai Trp, ja oienempien jäännösten, kuten Gly, Ile ja Vai, välisiä korvautumisia.
Ohessa käsitteitä "ioniton" ja "ioninen" jäännös käytetään niiden tavanomaisessa merkityksessä tarkoittamaan niitä aminohappojäännöksiä, joilla tavallisesti ei ole varausta tai joilla tavallisesti on varaus, vastaavasti, fysioloqisissa pH-olosuhteissa. Esimerkkejä ionittomista jäännöksistä ovat Thr ja Gin, kun taas esimerkkejä ionisista jäännöksistä ovat Arg ja Asp.
Käsitettä "antigeeni" käytetään perinteisesti tarkoittamaan vasta-aineen sitomaa kokonaisuutta, ja sillä tarkoitetaan kokonaisuutta, joka indusoi tämän vasta-aineen tuotannon. Nykyisessä käytännössä antigeenin merkitys on rajoittunut vasta-aineen sitomaan kokonaisuuteen, kun taas käsitettä "immunogeeni" käytetään siitä kokonaisuudesta, joka indusoi vasta-aineiden tuotannon.
Joissakin tapauksissa antigeeni ja immunogeeni ovat sama kokonaisuus, kuten esimerkiksi silloin, kun synteettistä polypepti-diä käytetään vasta-aineiden tuotannon indusoimiseen, näiden vasta-aineiden sitoutuessa tähän polyoeptidiin. Nämä samat poly-peptidit (99, 100 tai 142) indusoivat kuitenkin myös sellaisia vasta-aineita, jotka sitoutuvat koko proteiiniin, kuten HBxAg:hen, missä tapauksessa tämä polypeptidi on sekä immunogeeni ! että antigeeni, kun taas HBxAg on antigeeni. Mikäli ohessa - tarkasteltu kokonaisuus on sekä immunogeeninen että antigeeninen, niin sitä kutsutaan tavallisesti antigeeniksi.
5. Koejärjestelmät ja -menetelmät
Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että SVHBV-3:ta voidaan käyttää ilmentyvänä vektorina. Siinä on lukukehykseen, HBxAg-geenistä alavirtaan istutettujen vieraiden DNA-ketjujen ilmentymistä säätelevät elementit.
I; 41 86585
Samoin nämä tulokset osoittavat, että synteettisiä polypepti-deitä 99, 100 ja 142 sekä niiden antipeptidisiä vasta-aineita voidaan käyttää osana siinä koejärjestelmässä ja -menetelmässä, joilla pyritään ilmaisemaan HBxAg:n läsnäolo testattavasta ruumiin näytteestä, kuten esimerkiksi HBxAg:tä oletettavasti kantavasta isäntäeläimestä saaduista hepatomasoluista tai maksasoluista, sekä ilmaisemaan onnistunut transfektoituminen SVHBV-3:lla ja seuraamaan ilmentymistä, kun SVHBV-3:ta käytetään ilmentyvänä vektorina.
Tällainen järjestelmä käsittää vähintään ensimmäisen reagenssin, joka sisältää reseptorimolekyylejä, joissa on vasta-aineen kytkeytymiskohta, kuten esimerkiksi vasta-aineita, olennaisesti kokonaisia vasta-aineita tai hyvin tunnettuja vasta-aineen Fab-ja F(ab’)^-osia, ja jotka kykenevät immunoreagoimaan tämän keksinnön mukaisen synteettisen polypeptidin kanssa; toisin sanoen, jotka on saatu muodostumaan tämän keksinnön mukaisilla synteettisillä oolypeptidei1lä. Tämä järjestelmä käsittää myös indikaattorin, kuten fluoresoivan värin, esimerkiksi fluoreseiiniä tai rodamiinia, radioaktiivisen alkuaineen, esimerkiksi jodi-125 tai hiili-14, tai entsyymiin kytkeytyneen vasta-aineen, joka on saatu muodostumaan ensimmäisen reagenssin reseptoreiden avulla (esim. peroksidaasiin kytkeytynyt vuohen anti-kaniini-IgG), joka * indikaattori ilmaisee ensimmäisessä reagenssissa olevien resepto reiden ja spesifisesti ilmentyvän HBxAgm välisen immunoreakt ion. Alunperin tämä indikaattori voi olla sitoutunut ensimmäiseen reagenssiin tai se voi olla vapaana. Tällaisen HBxAg-testin :Y- reagenssijärjestelmän tyypillisiä sovellutuksia ovat mm. entsyy miin kytketyn immunosorbentin kokeet (ELISA), radioimmunoko-keet ja immunofluoresenssikokeet (IF).
Diagnostisia, kokeita, joilla voidaan määrittää HBxAg:n läsnäolo ruumiin näytteestä käyttäen tämän keksinnön mukaisia polypepti-: dejä sekä niiden anti-polypeptidisiä vasta-aineita, on jo kuvat tu laajasti. Tällaisen diagnostisen kokeen kaupallisena suo--- . ritusmuotona tarkastellaan erästä diagnostista koejärjestelmää.
X
42 86585
Eräs tällainen järjestelmä käsittää vähintään yhden säiliön, joka sisältää anti-polypeptidin reseptoria, kuten esim. anti-99:ää tai anti-142:ta ensimmäisenä reaqenssina. Järjestelmään kuuluen toisena reaqenssina voidaan toimittaa toisessa säiliössä tietty määrä polypeptidiä, joka sai aikaan tämän anti-polypepti-disen vasta-aineen muodostumisen, esimerkiksi polypeptidiä 99 tai polypeptidiä 142. Tämä diagnostinen koejärjestelmä saattaa myös käsittää muita säiliöitä, jotka sisältävät edellä mainittuja indikaattoreita, yhtä tai useampaa puskuria, ja muita vastaavia, kuten hyvin tunnetaan.
Menetelmää HBxAg:n ilmaistavissa olevan määrän läsnäolon toteamiseksi on myös kuvattu laajasti aikaisemmin. Lyhyesti, tässä menetelmässä testattaessa ruumiin näytteestä saadut proteiinit, kuten hepatoma- tai maksasolujen proteiinit sekoitetaan vasta-aineen kytkeytymiskohdan sisältäviin reseptoreihin, jotka kykenevät immunoreagoimaan tämän keksinnön mukaisen synteettisen poly-peptidin sekä HBxAg:n kanssa, joka kytkeytymiskohta voi olla anti- 99 tai anti-142, tai niiden Fab- tai F(ab')-osa, indikaattorin 125 läsnäollessa, kuten esimerkiksi I:llä merkityn Staphylococcus aureus-bakteerin (S. aureus) proteiinin A läsnäollessa, tai entsy-maattisen merkkiaineen, kuten johonkin edellä mainittuun reseptoriin kytkeytyneen piparjuuren peroksidaasin läsnäollessa, jolloin HBxAg:n ja reseptoreiden välinen immunoreaktio voidaan todeta.
: Tätä seosta seisotetaan niin kauan, että indikaattori ehtii vies- tittämään tämän immunoreaktion tapahtumisen, ja tällaisen viestin läsnäolo varmennetaan autoradiogrammin avulla. Ruumiin näyte tai siitä saadut proteiinit adsorboidaan tai kiinnitetään mielui-'! ' ten jollakin muuli a tavalla (sidotaan) kiinteään matriisiin, kuten nitroselluloosalevylle tai lasilevylle, ennen niiden sekoittamista reseptoreihin.
: Mikäli tämä indikaattori on erillinen molekyyli, kuten S.
aureus-bakteerin radioaktiivisesti merkitty proteiini A, niin tällöin sidottu ruumiin näyte ja reseptorimolekyylit sekoitetaan ensin, ilman indikaattoria, ja tätä seosta seisotetaan niin kauan, että sitoutunut immunoreaktion tuote ehtii muodostua.
l! 43 86585 Tämän jälkeen tämä sitoutunut immunoreaktion tuote huuhdotaan. Sitten nämä erilliset indikaattorimolekyylit sekoitetaan sidottuun immunoreaktion tuotteeseen, ja tätä seosta seisotetaan niin kauan, että toinen sitoutunut reaktiotuote ehtii muodostua. Tämän jälkeen tämä toinen sitoutunut reaktiotuote huuhdotaan ja indikaattorista saadun viestin läsnäolo määritetään.
Mikäli tämä indikaattori on osa tämän keksinnön mukaisista reseptoreista, niin näitä merkittyjä reseptoreita sekoitetaan testattavaan sidottuun ruumiin näytteeseen, ja tätä seosta seisotetaan niin kauan, että immunoreaktion tuote ehtii muodostua. Sitten tämä sidottu immunoreaktion tuote huuhdotaan ja indikaattorista saatavan viestin läsnäolo määritetään.
Edellä mainittua toista reagenssia, kuten polypeptidejä 99 tai 142, voidaan käyttää vertailureagenssina tutkittaessa immunoreaktion salpautumista, jolloin voidaan varmistaa se, että muodostunut immunositoutuminen on spesifistä eikä epäspesifistä. Tällaisia salpautumistutkimuksia havainnollistetaan kuvissa 7, 8 ja 10.
Mikäli SVHBV-3:ia käytetään ilmentyvänä vektorina, niin vierasta DNArta istutetaan alavirtaan HBxAg-geenistä, mieluiten sen ai- • ' noaan BamHI-restriktiokohtaan, ja tätä uutta, näin tuotettua '· vektoria käytetään solujen transfektoimiseen. Oletetaan, että HBxAgrn ilmentyminen transfektoidussa solussa osoittaa SVHBV-3:een istutetun vieraan DNA:n ilmentymisen. Edellä kuvatulla HBxAg:n ilmentymisen kokeella ilmaistu HBxAgrn ilmentyminen osoittaa -. SVHBV-3:een istutetun vieraan DNA:n ilmentymisen.
Täten transfektointiyritvksen jälkeen muodostuneiden solupesäk-' keiden tutkimista edellä mainitun koejärjestelmän avulla voidaan · käyttää hyväksi valikoitaessa niitä pesäkkeitä joissa trans-fektointi onnistui. Esimerkiksi solut niistä pesäkkeistä, jotka olivat tuloksena pyrittäessä istuttamaan tämä vektori eukariootti-siin soluihin, otetaan talteen, rikotaan ja soluproteiinit uutetaan. Tämän jälkeen nämä uutetut soluproteiinit erotetaan 44 86585 elektroforeettisesti SDS-polyakrYyliamidiqeelillä, ja erotetut proteiinit täplitetään nitroselluloosalle. Nämä Läpi i. te ty t proteiinit saatetaan kosketuksiin edellä kuvatun koejärjestelmän reseotoreiden ja merkkiaineen ylimäärän kansaa, kuten esimerkiksi
1?G
synteettisen polypeptidin 99 tai polypeptidin 142 ' l:Llä merkit tyjen vasta-aineiden kanssa, jonka jälkeen immunoreagoimattomat vasta-aineet (reseptorit) huuhdotaan pois, jolloin voidaan valmistaa autoradiogrammi, joka osoittaa tämän vieraan geenin koodaamaan polypeptidiin sulautuneen, ilmentyneen HBxAq-osan läsnäolon.
Nämä edellä kuvatut koemenetelmät ja -järjestelmät ovat erityisen käyttökelpoisia X-proteiinin tai sen olennaisen osan tunnistamiseen, kun niitä on läsnä ruumiin näytteessä, erityisesti kudosnäytteessä, kuten maksasta otetun näytepalan soluissa. Alla kuvattava diagnostinen testi ja menetelmä ovat erityisen käyttökelpoisia X-proteiinin vasta-aineiden määrittämiseen, joita X-proteiineja voi olla läsnä ruumiin näytteessä, kuten koko veressä, seerumissa tai olasmassa. Esimerkkinä tällaisesta diagnostisesta menetelmästä käytetään Western'in täoläanalyysiä. Tätä menetelmää soveltava kaupallinen suoritusmuoto on kuitenkin ELISA:na (entsyy-: m.iin kytketyn immunosorbentin koe) tunnettu diagnostinen järjes telmä.
; Tällöin antigeeninä käytetään mieluiten SVHBV-3-vektori11 a transfektoiduissa soluissa ilmentyvää tuotetta, esimerkiksi — BSC-l-soluissa ilmentynyttä, suurin piirtein 24000 daltonin suuruista proteiinia, kuten kuvan 10 yhteydessä esitetään, vaikka antigeeninä voidaan myöskin käyttää tämän keksinnön mukaista, suositeltavaa polypeptidiä, kuten polypeotidiä 99 tai polypeptidiä 142. Täten antigeeninä voidaan käyttää jäljempänä esitetysti af finitee11ikromatogra fialLa olennaisesti puhtaassa muodossa saatavaa HBxAg-molekyy1iä itseään, HBxAg-molekyy1 in olennaista osaa, joka esimerkiksi ilmentyy SVHBV-3-vektori11 a transfektoiduissa BSC-l-soluissa (24000 daltonin polypeptidi) tai polypeptidiä, joka aminohappo jäännösten järjestyksensä suhteen vastaa järjestystä HBxAgrn antigeenisyyden determinantissa .
li 45 86585 Tämä antigeeni on mieluiten sidottu (adsorboitu) tai muuten kiinnitetty kiinteään matriisiin, kuten ristisidoksia sisältävään dekstraaniin, jota on saatavana tavaramerkkinä SEPHADEX yhtiöstä Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, New Jersey), agaroosiin, lasihelmiin, polyvinyylikloridiin, polystyreeniin, ristisidoksia sisältävään akryyliamidiin , ni trosel Luloosaan tai mikrot ii t ter i. -levyn koloihin, jotka toimivat kiinteänä kantajana.
Tähän antigeeniin, joka on mieluiten sidottu kiinteän kantajan osana toimivaan kiinteään matriisiin, sekoitetaan testattavaa, nestemäistä ruumiin näytettä, jolloin muodostuu kiinteän faasin ja nestefaasin välinen seos. Tätä seosta seisotetaan niin kauan, että ruumiin näytteessä läsnäolevat anti-X-proteiinin (anti-HBxAg) vasta-aineet ehtivät immunoreaqoida antiaeenin kanssa.
Tämän immunoreakt Lori tapahtuminen määritetään tämän jälkeen indikaattorin avulla, jolloin anti-X-proteiinin vasta-aineiden läsnäolo testatussa ruumiin näytteessä saadaan osoitetuksi.
Esimerkiksi eräässä tutkimuksessa SVHBV-3-vektorilla transfektoi-tujen BSC-l-solujen lysaatit valmistettiin, ja erotettiin elektroforeettisesti, sekä siirrettiin ja sidottiin kiinteänä matriisina toimiville nitroselluloosalevyille, olennaisesti kuvan 10 yhteydessä kuvatulla tavalla, jolloin muodostuu kiinteä faasi. Tämän jälkeen kuudesta potilaasta, jotka sairastavat eri hepatitis-tauteja, saatujen seeruminäytteiden 1:50-laimennokset sekoitettiin .erillään näihin nitroselluloosaan sidottuihin, transfektoiduista BSC-l-soluista saatuihin proteiineihin, jolloin muodostui kiinteiden faasien ja nestefaasien väliset seokset. Näitä seoksia seisotettiin niin kauan (2 tuntia), että seerumeissa läsnäolevat anti-X-vasta-aineet ehtivät immunoreagoida sidotun antigeenin kanssa.
Sen jälkeen, kun näytteet oli huuhdottu kiinteän ja nestemäisen faasin erottamiseksi, edellä esitetyistä vaiheista saatuihin kiinteisiin faaseihin sekoitettiin toisistaan erillään nestemäistä liuosta, joka sisältää indikaattorina toimivaa, piparjuuren peroksidaasiin konjugoitujen, vuohen anti-ihminen- tai anti-kaniini-vasta-aineiden 1:200 laimennosta, jolloin muodostuivat: 46 86585 toiset, kiinteän ja nestemäisen faasin väliset seokset. Näitä erillisiä, toiseksi muodostettuja, kiinteän ja nestemäisen faasin välisiä seoksia säilytettiin niin kauan (1 tunti), että nämä vasta-aineet ehtivät reagoida matriisiin sidotun antigeenin kanssa immunoreagoineiden, ihmisen anti-X-vasta-aineiden kanssa. Kaniinin anti-polypeptidisiä vasta-aineita käytettiin vertailuna vuohen anti-kaniinin vasta-aineiden kanssa. Tuloksena olevat, kiinteän ja nestemäisen faasin väliset seokset erotettiin jälleen toisistaan huuhtomalla. Tämän jälkeen tuloksena olevat kiinteät faasit kehitettiin 4-kloori-l-naftolia sisältäviä liuoksia käyttäen, kuten kuvan 8 yhteydessä esitetään.
Tästä tutkimuksesta saadut tulokset osoittavat, että potilaista, joissa oli diagnostoitu hepatosellulaarinen karsinooma, saatu seerumi sisälsi transfektoiduissa BSC-1 soluissa SVHBV-3-vekto-rin ilmentämään polypeptidiin sitoutuvia vasta-aineita. Täten nämä vasta-aineet ovat anti-X-vasta-aineita, ja niiden läsnäolo osoittaa sen, että X-geenituote on autenttinen antigeeni HBV-infektion jossakin vaiheessa.
Mikäli edellä kuvatussa Western'in täplityskokeessa käytettyä, suurin piirtein 24000 daltonin suuruista polyoeotidistä ilmenty-mistuotetta käytetään antigeeninä ELISA-määrityksessä, kuten jäl-' jempänä esitetään, tai jossakin muussa samankaltaisessa kokeessa, niin tämä polypeptidi mieluiten puhdistetaan ja eristetään ennen -- - tällaista käyttöä. Tämä puhdistaminen ja eristäminen voidaan ! toteuttaa hyvin tunnettuja tekniikoita käyttäen.
: Esimerkiksi anti-99- tai anti-142-vasta-aineet tai niissä olevat vasta-aineen kytkemiskohdat, voidaan valmistaa ohessa kuvatulla tavalla ja ne voidaan yhdistää kiinteään matriisiin, kuten agaroo-: siin tai ristisidoksia sisältäviin agaroosin johdannaisiin, joita on saatavana tavaramerkkeinä SEPHAROSE 6B, CL6B, 4B ja CL4B, yhtiöstä Pharmacia Fine Chemicals, tai joita on saatavana tavaramerkkeinä Βίο-Gel A-0,5M, A-1,5M ja A-50M yhtiöstä BioRad " Laboratories, Richmond, CA. Käyttökelpoisia kiinteitä matrii- :·: se ja ovat myös edellä kuvatut, ristisidoksia sisältävä dekstraani, I, 47 86585 jota on saatavana tavaramerkkinä SF.PHADEX, seka pol yakryy 1 i ami di a olevat helmet, joita on saatavana tavaramerkkeinä Bio-GeL P-2, P-30, P-100 ja P-300, samoin yhtiöstä BioRad Laboratories.
Agaroosin johdannaista olevan matriisin käyttöä tarkastellaan havainnollisuuden vuoksi seuraavassa.
Kytkemistä varten tämä agaroosimatriisi aktivoidaan tyypillisesti syanogeenibromidilla. Tämän jälkeen aktivoitu matriisi pestään ja toivotut vasta-aineen (reseptorin) molekyylit kytketään siihen, tätä aktivoitua matriisia kuivaamatta. Sitten matriisiin sidottu vasta-aine pestään ja se on valmista käytettäväksi. Matriisissa olevien reaktiivisten, mutta reagoimatta jääneiden ryhmien voidaan toivottaessa antaa reagoida amiinin, kuten etanoliamiinin tai Trisrin kanssa, vaikkakin nämä reaktiiviset ryhmät hajoavat nopeasti.
Affiiniteettisorbenltia voidaan käyttää irtonaisena, esimerkiksi dekantterissa tai pullossa, tai se on voitu ahtaa kolonniin.
Ennen käyttöä affiniteettisorbentti pestään mieluiten puskurissa tai muussa vesiliuoksessa, jota käytettiin solu.lysaattien puhdistamiseen, ja joka sisältää noin 24000 daltonin polypeptidiä, jotta vältytään epäspesifisesti sitoutuvilta proteiineilta tai vasta-aineilta, jotka ovat kytkeytyneet kantajaan eoästabii-listi .
Tässä määrityksessä käytetään vesiseosta, joka sisältää SVHBV-3-vektoreilla transfektoitujen solujen lysaatin, ja siihen sekoitetaan tätä affiniteettisorbenttia. Tämä seos muodostaa palautuvan, kytkeytyneen vasta-aineen (reseptori) ja suurin piirtein 24000 daltonin suuruisen polypeptidin (antigeeni) välisen komplek-sin (reseptoriliqandi).
Tämän jälkeen tämä kytkeytynyt, reseptorin ja ligandin välinen kompleksi erotetaan jäljellä olevasta, kompleksiin osallistu- ____: mattomasta vesiseoksesta, jolloin polypeptidinen antigeeni saa- -- - daan puhdistetussa muodossaan affiniteettisorbenttiin kytkeytyneenä. Mikäli sekoittaminen suoritetaan dekantterissa tai pullossa, 48 86585 niin tämä erottaminen voidaan toteuttaa suodattamalla ja pesemällä. Mikäli sorbentti on kolonnissa, erottaminen voidaan toteuttaa eluoimalla tämä kompleksiin osallistumaton vesiseos, jonka jälkeen sorbentti mieluiten jälleen pestään.
Mikäli tämä puhdistettu polyDeotidinen antiaeeni halutaan saada irtoamaan affiniteettisorbentista, niin tämä voidaan tyypillisesti saavuttaa lukuisilla toimenpiteillä. Kaikissa näissä toimenpiteissä tämä palautuva, kytkeytynyt, reseptorin ja ligan-din välinen kompleksi hajotetaan komponenteikseen, eli matriisiin kytkeytyneeksi reseptoriksi ja polypeptidisen antigeenin muodostamaksi ligandiksi, jonka jälkeen tämä polypeptidisen antigeenin muodostama ligandi erotetaan kytkeytyneestä reseptorista, jolloin saadaan aikaan puhdistettua, polypeptidisen antigeenin muodostaman liqandin liuosta, joka ei sisällä affiniteet-tisorbenttia. Tätä liuosta voidaan käyttää sellaisenaan tai se voidaan tiivistää tai kuivata ennen sen käyttämistä toivotulla tavalla. Joissakin tapauksissa saattaa olla toivottavaa poistaa suolat tästä liuoksesta ennen sen käyttöä, kuten tunnettua on.
Tämän palautuvan kompleksin hajoittaminen voidaan toteuttaa monilla eri tavoilla. Tyypillisesti tähän tarkoitukseen käytetään 0,2-molaarista glysiini-hydrokloridin liuosta, jonka pH . : : on noin 2,5. Vaihtoehtoisesti tämä sitoutunut, polypeptidisen antigeenin muodostama ligandi voidaan irrottaa kilpailumekanismin avulla kytkeytyneestä reseptorista, käyttäen tämän oalau-·; tuvan kompleksin seosta yhdessä näiden vasta-aineiden muodos-‘ .·. tamisen aikaansaaneen, immunoqeenisen oolyoeotidin ylimäärän kanssa, käyttäen esimerkiksi oolvoeptidiä 99, mikäli anti-99-vasta-aineita on kytkeytyneenä matriisiin. Tällainen kilpailu estää polypeptidisen antiaeenin mahdollisen denaturoitumisen.
- Komponenteikseen hajotetun polypeptidisen antigeenin erotta-‘ minen affiniteettisorbentista voidaan toteuttaa edellä esite-: tysti.
ii « 86585
Af f ir.iteettisorbenttien valmistaminen ja niiden käyttö on laajalti tunnettua. Kuitenkaan tällaisia materiaaleja ja sovellutuksia, joihin liittyy tämän keksinnön mukaisten vasta-aine-ja antigeenimolekyylien käyttöä, ei tätä ennen ole ollut saatavilla. Yksityiskohtainen kuvaus affiniteettisorbenteista, menetelmistä niiden valmistamiseksi, sekä käytöstä, jossa antigeeni on kytketty matriisiin, on löydettävissä julkaisusta Antibody as a Tool, Marchalonis ja Warr, toimittajat, John Wiley & Sons, New York, sivut 64-67 sekä 76-96 (1982).
Esimerkkinä mainitussa, edellä kuvattua menetelmää soveltavassa ELISA-määrityksessä käytetään kiinteätä kantajaa, joka muodostuu polystyreenistä tai polyvinyylikloridistä valmistetun, kaksitoista tai yhdeksänkymmentäkuusi koloa käsittävän mikrotiit-terilevyn koloista muodostuvaan kiinteään matriisiin adsorboidusta tai muulla tavalla kiinnitetystä., edellä kuvatusta antigeenistä, jolloin muodostuu kiinteä kantaja. Mikrotiitterile-vyn koloissa olevat epäspesifisen sitoutumisen kohdat salvataan tämän jälkeen tyypillisesti proteiinilla, esimerkiksi naudan seerumin albumiinilla (BSA). Sitoutumaton antigeeni sekä BSA poistetaan mikrotiitterilevyn koloista esimerkiksi huuhtomalla.
Tämän jälkeen nestemäistä ruumiin näytettä, kuten ihmisen seerumia, verta tai plasmaa sekoitetaan tähän edellä kuvattuun, kiinteään kantajaan sidottuun antigeeniin, jolloin muodostuu kiinteän ja nestemäisen faasin seos. Tätä kiinteän ja nestemäisen faasin välistä seosta seisotetaan niin kauan, että ruumiin näytteessä olevat anti-X-proteiini-vasta-aineet ehtivät immunoreagoida antigeenin kanssa, eli noin 30 minuutista noin ;Y- 2 tuntiin. Tämän jälkeen kiinteä ja nestemäinen faasi taval lisesti erotetaan.
Tämän jälkeen tähän kiinteään faasiin sekoitetaan nestemäistä liuosta, joka käsittää toista, merkkiaineella merkittyä, indikaattorin sisältävää .vasta-ainetta, vasta-aineen kytkeytymis-kohdan tai ensin mainitun vasta-aineen kanssa reagoivaa, S.
5o 86 585 aureus-bakteerin proteiinia A, jolloin muodostuu toinen kiinteän ja nestemäisen faasin välinen seos. Esimerkkinä tällaisesta toisesta vasta-aineesta mainittakoon oeroksidaasilla merkitty, vuohen anti-ihminen-vasta-aine, missä tapauksessa ensin mainitut vasta-aineet ovat peräisin ihmisen ruumiin näytteestä. Lisäksi käyttökelpoisia entsymaattisia merkkiaineita ovat al-kaalinen fosfataasi, beeta-D-galaktosidaasi ja glukoosi-oksi-daasi.
Tätä seosta, joka muodostuu kiinteästä faasista (kiinteään matriisiin sidotun antigeenin ja vasta-aineen välisen immunoreak-tion tuote) ja tästä toisesta, merkkiaineella merkityn vasta-aineen liuoksesta, seisotetaan niin kauan (inkuboidaan esim. noin yhden tunnin ajan), että sitoutuneen, ensiksi mainitun vasta-aineen ja indikaattorin välille ehtii muodostua reaktiotuote, esimerkiksi näiden kahden vasta-aineen välisenä immunoreaktiona. Tämän jälkeen kiinteä ja nestemäinen faasi erotetaan.
Edellä kuvattu toinen vasta-aine voi myös olla spesifinen ainoastaan yhdelle immunoglobuliinien luokalle (esim. IgG, IgM, IgE,
IgA tai IgD), ja immunoreagoida ainoastaan tämän luokan kanssa. Näiden vasta-aineiden avulla voidaan tunnistaa ruumiin näytteessä läsnäolevan anti-X-proteiini-vasta-aineen immunoglobuliini-luokka. Lisäksi tämä toinen vasta-aine tai vasta-aineen kytkey-tymiskohta voi olla spesifinen ainoastaan toiselle kahdesta ' ; immunoglobuliinin kevyen ketjun tyypistä (eli kappa tai lambda) ja immunoreagoida ainoastaan sen kanssa. Näiden vasta-aineiden : avulla voidaan tunnistaa ruumiin näytteessä läsnäolevan immunoglo- buliinimolekyylin isotyyppi, ja ne ovat hyvin tunnettuja.
Tämän jälkeen kiinteään faasiin sekoitetaan liuos, joka sisäl-tää entsymaattisen merkkiaineen substraattia, kuten esimerkiksi peroksidaasin tapauksessa vetyperoksidia, sekä väriä muodostavan väriaineen esiastetta, kuten o-fenyleenidiamiinia tai 4---- kloori-l-naf tolia, tai alkaalisen fosfataasin tapuksessa p-nit- ro f enyyl if osf aatt ia . Riittävän pituisen ajan (esimerkiksi 60 minuutin) kuluttua optinen tiheys voidaan määrittää ennalta si 86585 määrätyllä aallonpituudella (esim. 490 tai 405 nanometriä, vastaavasti), ja sitä verrataan vertailunaytteen optiseen tiheyteen, jolloin saadaan selville, oliko ruumiin näytteissä läsnä anti-X-proteiini-vasta-aineita.
Tämän keksinnön eräs suoritusmuoto käsittää diagnostisen järjestelmän käyttövalmiiden reagenssipakkausten (kitti) muodossa, johon kittiin kuuluu kiinteänä matriisina toimiva, esimerkiksi polystyreenistä valmistettu, kaksitoista koloa käsittävä mikro-titterilevy, sekä tähän kiintään matriisiin adsorboitu (sidottu) tai muulla tavalla kiinnitetty, tämän keksinnön mukainen, edellä kuvattu antigeeni, jolloin muodostuu kiinteä kantaja. Tämä järjestelmä käsittää myös mieluiten erillään pakattuja anti-ihminen Ig-vasta-aineita, joihin on kytketty indikaattori, kuten perok-sidaasilla merkittyjä, vuohen anti-ihminen Ig-vasta-aineita, ja se saattaa myös käsittää tämän kytkeytyneen indikaattorin substraattia, kuten vetyperoksidia ja väriä muodostavan väriaineen esiastetta, kuten esimerkiksi o-fenyleenidiamiinia, samoin erillisissä pakkauksissaan. Tyypillisesti tällainen kitti ei sisällä vetyperoksidia sen suhteellisesta epastabiilisuudesta johtuen, ja tavallisesti kitin lopullinen käyttäjä huolehtii sen saamisesta, vaikkakin vetyperoksidia sisältävä säiliö voi myös olla tällaisen diagnostisen järjestelmän osana. Tätä järjestelmää soveltavassa kokeessa käyttökelpoisia puskurisuoloja on samoin voitu sisällyttää yhdessä tai useammassa erillisessä pakkauksessaan, kuivana tai nestemäisenä. Myös tämän keksinnön mukaista, suositeltavinta polypeptidiä, kuten esimerkiksi polypeptidiä 99, voidaan sisällyttää tähän kittiin erillisenä pakkauksenaan, ..· ja sitä voidaan käyttää vertailuna kilpailevan sitoutumisen tut kimuksissa. Tällä diagnostisella järjestelmällä voidaan toteut- : taa anti-X-proteiini-vasta-aineiden läsnäolon testaaminen ruu- mi in näytteestä, esimerkiksi seerumista edellä kuvattua menetel-mää käyttäen.
6. Polymeerien valmistaminen ·:·-· Tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä voidaan kytkeä yhteen, jolloin muodostuu veteen liukeneva tai veteen dispergoituva antigeeninen polymeeri, joka käsittää lukuisia polypeptidin 52 86585 muodostamia toistuvia yksiköitä. Tämän polymeerin etuna on parantunut immunologinen reagointikyky. Mikäli tämän polymeerin muodostamiseen käytetään erilaisia polypeptidejä, niin tällaiset polymeerit kykenevät lisäksi indusoimaan vasta-aineita, jotka immunoreagoivat HBxAqrn lukuisten antigeenisyyden determinanttien kanssa.
Polymeeri voidaan valmistaa syntetisoimalla nämä polypeptidit siten, että ne sisältävät kaksi kysteiinijäännöstä, kuten jäljempänä esitetään. Nämä kaksi kysteiinijäännöstä voivat olla läsnä polypeptidiketjun toisessa päässä ja ketjun sisällä tai sekä amino- että karboksipäässä. Kaksi kysteiinijäännöstä sisältävää polypeptidiä kutsutaan ohessa yleisesti "diCys"-poly-peptidiksi, kun taas molemmissa päissään kysteiinijäännöksen sisältävää polypeptidiä kutsutaan ohessa "diCys-päätteiseksi" polypeptidiksi. Tällaisen polypeptidiketjun sisällä olevat kysteiinijäännökset tai polypeptidiketjun päissä olevat kysteiini jäännökset voivat olla läsnä siinä HBxAg-ketjussa, jota tämä polypeptidi vastaa, esimerkiksi polypeptidissä 142 keskellä oleva kysteiini /seitsemäs jäännös karboksipäässä olevasta alaniinista (Ala)_7, polypeptidin 99 karboksipäässä oleva kysteiini (Cys) tai päissä olevat kysteiinijäännökset voidaan li-: sätä tämän polymeerin valmistamista varten.
.1. Esimerkkeinä käyttökelpoisista diCys-polypeptideistä mainitta- * - koon seuraavan kaavan mukaiset polypeptidit, joka kaava on kirjoitettu vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä kar-: boksipäähän:
Polypeptidi 99a: Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cys,
Polypeptidi 100a: Cys-beu-Phe-Lys-Asp-Trp-
Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Cys, ja Polypeptidi 142a: R^-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys- : Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala-R^ .... 1 2 missä seka R että R ovat kysteiini jäännöksiä, kuitenkin sillä 1 2 ; edellytyksellä, että ainoastaan toinen jäännöksistä R ja R on läsnä.
I: 53 86585
Kuten kuvassa 6 esitetään, kukin polypeptideistä 99, 100 ja 142 sisältää sellaisen kysteiinijäännöksen, joka on läsnä luennan läpikäyneen X-genomin aminohappojäännösten ketjussa. Tämän perusteella voidaan päätellä, että polypeptidit, joilla on polypeptidien 99 ja 100 mukainen aminohappojäännösten ketjut, ketjujen päissä olevia kysteiinijäännöksiä lukuun ottamatta, ovat myös ohessa käyttökelpoisia immunoreaktion salpau-tumista tutkittaessa, kun käytetään kantajaan kytkentää jollakin muulla tavalla kuin MBS-reaktiolla, jota tarkastellaan myöhemmin.
Mikäli yksi tai kaksi kysteiinijäännöstä lisätään ketjun päihin polymeerin valmistamista varten, jolloin muu aminohappo-jäännösten kelju vastaa HDxAq:n antiqoenisyydcn determinanttia, niin tämän polymeerisen toistuvan yksikön katsotaan edelleen vastaavan HBxAg:n antigeenisyyden determinanttia.
Tyypillisessä, laboratoriossa tapahtuvassa valmistuksessa 10 milligrammaa tätä diCys-polypeptidiä (joka sisältää kysteiini-jäännökset hapettumattornassa muodossa) liuotetaan 250 milli-litraan 0,1 molaarista ammoniumkarbonaattipuskuria, jonka pH on noin 8. Sitten tämä liuotettu diCys-päätteinen polypeptidi ‘ hapetetaan ilman avulla sekoittamalla varovaisesti tätä tulok- sena olevaa liuosta noin 18 tunnin pituisen ajan, tai niin : kauan, ettei Sllman:in kokeella todeta vapaata merkaptaania.
/Katso Ellman (1959), Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77^7 --- ; Täten valmistettu polymeeri sisältää lukuisia tämän keksinnön mukaisia polypeptide ja toistuvina yksikköinään. Nämä polypeo-tidiset toistuvat yksiköt ovat sitoutuneet toisiinsa hapettuneilla kystei ini jäännöksillä.
Tällainen .lukuisia tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä sisältävä polymeeri voidaan esittää seuraavalla kaavalla, joka on kirjoitettu vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä kar-boksipäähän: 54 86585 (A) , (B).
a b missä A ja B ovat erilaisia, polypeptidistä muodostuneita toistuvia yksiköitä, kuten esimerkiksi polypeptidejä 99, 100 tai 142. Alaindeksinä olevat kirjaimet a ja b ovat kokonaislukuja, joiden kummankin keskimääräinen arvo on nollasta noin 2000:een, sillä edellytyksellä, että lukujen a ja b keskimääräisten arvojen summa on vähintään kaksi, jolloin tässä polymeerissä on läsnä vähintään kaksi polypeptidin muodostamaa toistuvaa yksikköä.
Alaindeksinä olevien kirjaimien a ja b keskimääräisten arvojen summa on tyypillisesti alle noin 2000, jolloin tuloksena olevan polymeerin keskimääräinen molekyylipaino on noin 5 000 000 dal-tonia. Suositeltavimmissa sovellutuksissa tämän polymeerin keskimääräinen molekyylipaino on noin 50 000 - 1 000 000 daltonia.
Edellä esitetyn kaavan on tarkoitus olla yleinen esitys tämän polymeerin toistuvista yksiköistä sekä kunkin läsnäolevan toistuvan yksikön keskimäärisestä lukumäärästä. Tämän keksinnön mukaiset polymeerit, jotka sisältävät kaksi erilaista toistuvaa yksikköä, ovat tyypillisesti satunnaisia kopolymeerejä. Täten edellä esitetyssä kaavassa ei ole tarkoitus esittää sitä jär-- jestystä, jossa polypeptidiset toistuvat yksiköt ovat läsnä : polymeerissä, kuten esimerkiksi kappalekopolymeerissä.
Edellä kuvatut, tämän keksinnön mukaiset, veteen liukenevat { tai veteen dispergoituvat polymeerit ovat sekä immunogeenisiä ... että antigeenisiä, joten ohessa niitä kuvataan käsitteellä antigeeninen, kuten edellä esitetään. Kun tällaisia antigeenisiä polymeerejä dispergoidaan fysiologisesti siedettävään laimen-timeen ja annetaan kaniineille immunoivana, 400 mikrogrammaa polymeeriä kaniinia kohden sisältävänä injektointina, niin nämä ; antigeeniset polymeerit kykenevät indusoimaan vasta-aineiden : tuotannon Uuden Seelannin punaisissa kaniineissa, jotka vasta- aineet immunoreagoivat HBxAqrn kanssa. Immunologiassa tunnetaan lukuisia esimerkkejä tällaisista fysiologisesti siedettävistä laimentimista, ja niitä tarkastellaan yksityiskohtaisemmin seuraavassa.
* ti 55 86 585 7. Polypeptidien kytkeminen proteiinikantajiin
Ohessa käytettävät synteettiset polypeptidit kytkettiin keyhole-limpet-etanan hemosyaniiniin (KLH) käyttäen seuraavaa, hyvin tunnettua menetelmää. Tämä KLH-kantaja aktivoitiin ensin m-maleimidobentsoyyli-N-hydroksisukkinimidiesterillä, jonka jälkeen se kytkettiin polypeptidiin tämän polypeptidin aminopäässä olevasta kysteiinijäännöksestä (polypeptidi lOO), polypeptidin karboksipäässä olevasta kysteiinijäännöksestä (polypeptidi 99) tai käyttämällä polypeptidin 142 keskellä sijaitsevaa kysteiiniä Michael'in additioreaktion avulla kuvattu julkaisussa Liu et ai., (1979), Biochem., 80, 690.
Tämän keksinnön mukainen polypeptidi voidaan myös kytkeä kantajaan jollakin toisella tavalla, ja se voidaan kytkeä muihinkin kantajiin kuin KLH:iin. Esimerkiksi polypeptidi, esimerkiksi polypeptidi 99b, voidaan kytkeä tetanustoksoidia olevaan kantajaan vapaiden aminoryhmien avulla, käyttäen O,04-prosenttis-ta glutaraldehydiliuosta, kuten hyvin tunnetaan. Katso esimerkiksi julkaisu Klipstein et ai. (1983), J. Infect. Disc., 147:318.
Tämän synteettisen polypeptidin amino- tai karboksipäissä tai sen keskellä sijaitsevassa osassa olevien kysteiinijäännösten on todettu olevan erityisen käyttökelpoisia muodostettaessa j konjugaatteja disulfidisidosten avulla, sekä Michaeliin addi- tioreaktion tuotteita, mutta konjugaattien valmistamiseen j -·; voidaan myös käyttää muita, alalla hyvin tunnettuja menetelmiä.
Esimerkkinä muista sitomis- (kytkemis-) toimenpiteistä, joilla : voidaan muodostaa amidiliitoksia kantajan ja polypeptidin vä- ’"V lille, mainittakoon dialdehydien, kuten glutaraldehydin käyt tö (tarkasteltu edellä) tai muiden vastaavien käyttö, tai karbodi-imiditekniikan käyttö, kuten esimerkiksi vesiliuokoisen karbodi-imidin, esimerkiksi l-etyyli-3-( 3-dimetyyliaminopro-pyy1i)karbodi-imidin käyttö.
Käyttökelpoiset kantajat ovat alalla hyvin tunnettuja, ja taval-- lisesti ne ovat itsekin proteiineja. Esimerkkeinä tällaisista t 56 86 585 kantajista mainittakoon keyhole limpet-hemosyaniini (KLH), edestiini, tyroglobuliini, albumiinit, kuten naudan seerumin albumiini tai ihmisen seerumin albumiini (BSA tai HSA, vastaavasti), punaiset verisolut, kuten lampaan erytrosyytit (SRBC), tetanustoksoidi, koleratoksoidi sekä polyaminohapot, kuten poly(D-lysiini:D-glutaamihappo), sekä muut vastaavat.
Kuten myös alalla hyvin tunnetaan, usein on edullista sitoa tämä synteettinen polypeptidi kantajaansa välittävän, kytkevän ryhmän avulla. Kuten edellä mainittiin, glutaraldehydi on eräs tällainen kytkevä ryhmä.
Kuitenkin mikäli käytetään kysteiiniä, niin tämä välittävä kytkevä ryhmä on mieluiten m-maleimidobentsoyyli-N-hydroksisukkin-imidin esteri (MBS), kuten myöskin edellä mainitaan. MBS lisätään tyypillisesti ensin kantajaan esteri-amidi-vaihtoreaktiol-la. Tämän jälkeen voi seurata edellä mainittu Michael*in reaktio, tai MBS:n lisääminen voi tapahtua suojatun merkaptoryhmän Michael'in additioreaktiolla, kuten esimerkiksi tiolietikkahapon (CH^COSH) additioreaktiolla maleimido-kaksoissidoksen poikki. Suojaavan asyyliryhmän irrottamisen jälkeen disulf idisidos muodostuu suojauksestaan vapautetun kytkevän ryhmän merkaptaanin ja synteettisessä polypeptidissä olevan, lisätyn kysteiinijäännöksen merkaptaanin välille.
' Kantajan valinta riippuu pikemminkin antigeenin lopullisesta käyttötarkoituksesta, kuin antigeenin determinanttiosasta, ja se perustuu valintakriteereihin, jotka eivät erityisesti liity tähän keksintöön. Esimerkiksi mikäli rokotetta käytetään eläi-·:: missä anti-polypeptidisten vasta-aineiden valmistamiseksi, joilla vasta-aineilla pyritään selvittämään HBxAgrn läsnäolo, niin tällöin tulisi valita sellainen kantaja, joka ei saa aikaan epäedul- : lista reaktiota tässä kyseisessä eläimessä. Mikäli tällaista siirrostetta, esimerkiksi rokotetta HBxAg:tä vastaan, on tarkoitus käyttää ihmisessä, niin tällöin on pääasiallisesti kiinnitettävä huomiota siihen, ettei kantajalla ja/tai tuloksena olevalla antigeenillä ole immunokemiallisiä tai muita sivu- : 57 86585 reaktioita, ja että se on turvallinen sekä tehokas - eli huomiota on kiinnitettävä niihin samoihin seikkoihin, jotka pätevät kaikkiin ihmisessä käytettäviin rokotteisiin.
8. Immunointitoimenpiteet
Immunointeihin käytetyt rokotteet sisältävät tehokkaan määrän polypeptidiä, joko erillisistä polypeptideistä muodostuvana polymeerinä, jossa polypeptidit on sidottu toisiinsa hapettuneiden kysteiinijäännösten avulla, tai konjugaattina, joka muodostuu kantajaan kytketystä polypeptidistä. Polypeptidin tehokas määrä rokotteessa riippuu mm, rokotettavasta eläinlajista, eläimen ruumiin painosta, sekä rokotteen valitusta antotihey-destä, kuten hyvin tunnetaan. Tyypillisesti rokotteet valmistetaan kuivasta, kiinteästä polypeptidin konjugaatista tai poly-peptidien muodostamasta polymeeristä suspendoimalla tätä ooly-peptidin konjugaattia tai polypeptidistä polymeeriä veteen, suolaliuokseen tai apuaineeseen.
Tyypillisesti näissä rokotteissa polypeptidin pitoisuus on noin 20-500 milligrammaa rokoteannosta kohden. Polypeptidin mainitut määrät tarkoittavat polypeptidin painoa ilman kantajan painoa, mikäli kantajaa käytetään.
Nämä rokotteet sisältävät myös fysiologisesti siedettyä (hyväksyttävää) laimenninta, kuten vettä, fosfaatilla puskuroitua : suolaliuosta, tai suolaliuosta, ja edelleen laimentimen osana on tyypillisesti apuaine. Apuaineet, kuten Freundrin täydellinen apuaine (CFA), Freund:in epätäydellinen apuaine (IFA) ja : aluma ovat alalla tunnettuja materiaaleja, ja niitä on kauoal- - . lisesti saatavana useista eri lähteistä.
Rokotteen varastoliuoksia valmistetaan CFA:ta, TFA:ta tai alu-• maa käyttäen seuraavasti: sellainen määrä synteettisen Doly- peptid.in konjugaattia tai polymeeristä polypeptidiä, jolla mää-rällä rokoteannokseen saadaan toivottu määrä polypeptidiä, liuotetaan fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen (PBS), oH-arvossa 7,2. Tämän jälkeen tähän polypeptidin liuokseen sekoitetaan yhtä suuri tilavuus CFA:ta, IFA:ta tai alumaa, jolloin saadaan aikaan polypeptidia, vettä ja apuainetta sisältävä rokote, jos sa veden ja öljyn välinen suhde on noin 1:1. Tämän jäLkeen tämä seos homogenoidaan, jolloin saadaan rokotteen varastoiiuos.
58 86585
Kaniineihin, joita käytetään ohessa anti-oolvoeDtidisten vasta-aineiden muodostamiseen, injektoitiin ihon alaisesti täydelliseen Freundrin apuaineeseen (CFA) emulqoitua, 200 mikrogrammaa polypeptidin konjugaattia (polypeptidi olus kantaja) sisältävää rokotetta; rokotetta, joka sisältää 200 mikroqrammaa polyoeoti-din konjugaattia ja epätäydellistä Freund:in apuainetta (.IFA); sekä rokotetta, joka sisältää 200 mikrogrammaa polypeptidin konjugaattia ja 4 milligramaa alumaa, injektoitiin vatsaontelon sisäisesti 0., 14. ja 21. vuorokautena, vastaavasti, immu-nointiaikataulun mukaisesti. Kukin rokotus (immunointi) käsitti rokotteen neljä injektointia. Hiiret voidaan immunoida samalla tavalla käyttäen suurin piirtein yhtä kymmenesosaa edellä mainitusta annolsesta rokotetta kohden.
Tyypillisesti näistä eläimistä otetaan verta talteen 4 ja 15 viikon kuluttua ensimmäisestä injektoinnista. Vertailuna toimivaa, immunointia edeltävää seerumia saatiin kustakin eläimestä ottamalla verta juuri ennen ensimmäistä immunointia.
Vertailuna toimivan rokotteen varas to liuoksia voidaan myös val-‘ mistaa käyttämällä keyhole limpet etanan hemosyaniinia (KLH), : KLH:ta IFAtssa (epätäydellisessä Freund:in apuaineessa), KLH:ta alunaan absorboituna, KLH: ta alunaan absorboituna olus pertus-: ; sis , edestiini, tyroq lobu 1 i ini , tetanustoksoidi , tetanus tokso idi IFArssa, koleratoksoidi sekä koleratoksoidi IFAtssa.
Kun antigeeniä tai rokotetta injektoitiin tai annettiin muulla tavalla isäntäeläimelle, tämän eläimen immuunijärjestelmä reagoi tuottamalla suuria määriä tätä antigeeniä vastaan vaikuttavia vasta-aineita. Koska valmistetun antigeenin, eli kantajaan kytketystä synteettisestä polymeeristä tai polymeeristä muodostuneen antigeenin spesifinen antiqeenisyyden determinantti vas-taa mielenkiinnon kohteena olevan luonnollisen antigeenin deter- 59 86 585 minanttia, niin isäntäeläin ei ainoastaan tuota tämän synteettisen polypeptidisen antigeenin vasta-aineita, vaan myös tämän synteettisen, polypeptideistä muodostuneen antigeenin vastaaman proteiinin tai polypeptidin vasta-aineita, siis HBxAgrn vasta-aineita.
9. Tallennukset
Seuraavassa luetellut aineet on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection maaliskuun 8. päivänä 1984, ja niillä on jäljempänä kunkin kohdalla mainittu tunnusnumero. Kaikki mainitut solusukupolvet, vektorit ja muut vastaavat, joiden yhteyteen on kirjoitettu lyhenne "ATCC", ja sen jälkeen numeroita ja/tai numeroita ja kirjaimia, viittaavat materiaaleihin, jotka on tallennettu edellä mainittuun kantakokoelmaan American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852.
Materiaalit ATCC-tunnusnumero
Viruksen SVHBV-3 ja avustaja- viruksen tsA239 seos VR 2084
Vektori DNA
SVHBV-3 40102 AM6 40101 SVAM191 40103 E-coli .:. EC-AM6 39630 EC-AMI 396 2 9 I/ EC-SVAM191 39631 Tämän keksinnön keksijöiden toimesta kantakokoelmaan ATCC tallennettujen, edellä mainittujen materiaalien ohella myös muiden henkilöiden valmistamia materiaaleja, joita käytetään ohessa, on tallennettu kantakokoelmaan ATCC. Luettelo näistä materiaaleista on seuraavassa: 60 86585
Materiaalit ATCC-tunnusnumero E. coli W3110 27325 294 31446 RR1 31447 HB101 33694
Nisäkässolut
HepG2 CCL 23 BSC-1 CCL 26 COS-7 CRL 1651 PLC/PRF/5 CRL 8024
Vektori pBR3 2 2 37017 B. Materiaalit ja menetelmät 1. HBV DNA:n eristäminen ja käsittely HBV DNA:n alue X eristettiin Dane-partikkeleista, alatyyooi adw, jotka olivat neräisin HBsAq-positiivisen ihmisluovutta jän plasmasta (National Institute of Health, no. 737139), menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Robinson, Am. J. Med. Sei., (1975) 270:151-159. Lyhyesti, 1,0 ml olasmaa laimennettiin 3,0 millilitraksi TN-puskurilla, joka sisälsi 0,001 molaarista (M) ’ Tris-HCl:ia (pH 7,4) ja 0,5 M HCl:ia. Laimennettua plasmaa sent- ' rifugoitiin nopeudella 10 000 x q kymmenen minuuttia suurikokoi sen jätemateriaalin poistamiseksi, jonka jälkeen se kerrostettiin 30-prosenttisen (w/v) sakkaroosin 2,5 millilitran (ml) Däälle, joka sakkaroosi sisälsi TN-puskuria, 0,001 M EDTA:ta /0,1 pro-; senttiä 2-merkaptoetanolia ja 1 mi 1 ligramma/mi 11 ilitra (mg/ml) naudan seerumin albumiinia (BSA), joita oli tätä ennen sentri-: fugoitu nopeudella 10 000 x g 10 minuutin ajan saostuneen BSA:n --- poistamiseksi?· Sen jälkeen, kun näytettä oli sentrifuqoitu 4 tuntia nopeudella 50 000 rpm 4°C:n lämpötilassa Spinco SW-65 roottorissa (Beckman Instruments, Inc.), supernatantti poistettiin varovaisesti ja kasauma suspendoitiin uudestaan 50 mikro-litraan TN-puskuria, joka sisälsi 1% Nonidet P-40:tä (polyoksi-etyleeni (9) oktyyli-fenyyli-eetteri ; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) sekä 0,1% 2-merkaptoetanolia.
I.
6i 86585
Edellä eristetty yksijuosteinen osa HBV DNA:sta tehtiin kaksi-juosteiseksi lisäämällä tähän 50 mikrolitraan uudestaan suspen-doitua HBV RNArta 25 mikrolitraa mix E:tä /0,2 M Tris-HCl (pH 7,4), 0,08 M MgCl£, 0,24 NH4Cl, 1,0 millimolaarinen (mM) kunkin dATP, dTTP, dGTP ja dCTP suhteen7, jonka jälkeen tätä inkuboi-tiin 37°C:n lämpötilassa 3 tuntia. Robinson (1975), Am. J. Med. Sei., 270:151-159.
Genomissa koettimena käytettävää, radioaktiivisesti merkittyä HBV DNA:ta valmistettiin edellä mainittua ketjun täyttötoimen-pidettä käyttäen siten, että 0,25 mikrolitraa sekä dCTP:stä että dGTP:stä korvattiin 3HdCTP:llä ja 3HdGTP:llä (molemmissa 21 Curieta/mM), vastaavasti.
2. HBxAqsn kloonaaminen HBxAq:tä koodaavan DNA-ketjun sisältävä osa HBV-genomista kloonattiin käyttäen E. coli-bakteeriin vietyä plasmidia oBR322. Edellä eristetty kaksijuosteinen, merkitsemätön HBV DNA pilkottiin restriktio-endonukleaasilla BamHI /50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl, 1 mM ditiotreitoli§7. Tätä reaktio-seosta käsiteltiin elektroforeettisesti 0,6-prosenttisen agaroo-sigeelin vaakasuorilla levyillä 100 ampeeria käyttäen, 2 tunnin ajan (Tris-asetaatti, 0,002 M EDTA).
1-prosenttisella etidiumbromidilla suoritettu värjäys Daljasti :: kolme HBV DNA-fragmenttia, mikä osoittaa kahden BamHI-restrik- ' tiokohdan läsnäolon genomissa. 3200 emäsoarin (bp) pituinen : fragmentti edusti koko HBV-genomia lineaarisessa muodossa, mikä oli tuloksena ketjun katkeamisesta ainoastaan yhdestä BamHI-kohdasta. 1850 emäsparin ja 1350 emäsparin fragmentit edusti-- - - vat kahteen fragmenttiin katkennutta genomia, mikä oli tulok sena täydellisestä BamHI-pilkkoutumisesta.
Näiden kolmen edellä eristetyn BamHI HBV DNA-restriktiofragmen-tin kopioita saatiin plasmidin pBR322 (ATCC 37017) kloonaamalla : V /Sutcliffe (1978), P. Natl. Acad. Sei., USA, 75:3 73 7-3 793.7- HBV DNA:n BamHI-fragmenttien istuttamiseksi plasmidiin pBR322 i 62 86585 tämä plasmidi tehtiin lineaariseksi pilkkomalla se BamHI-restriktioentsyymillä /50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl^, 1 mM ditiotreitolia7, jolloin saatiin HBV-frag-menttien päitä täydentävät päät. Nämä kolme HBV DNA-fragment-tia ja plasmidin pBR322 fragmentti sekoitettiin keskenään, jonka jälkeen DNA-ligaatio suoritettiin T4 DNA-ligaasilla /66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 66 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolia ja 0,4 mM ATP: ta_/ . Edellä mainitussa reaktiossa saatu ligaatioreak-tion tuote on rengasmaista DNArta, joka on saatu lineaariseksi tehdystä plasmidista pBR322 ja HBV-fragmenteista niiden toisiaan täydentävät päät yhteen liittämällä.
Nämä rengasmaiset yhdistelmäplasmidit istutettiin E. coli-baktee-rin kantaan HB101 (ATCC 33694; saatu Dr. Dean Hunter'ilta, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD), käyttäen menetelmää, joka on esitetty julkaisussa Cohen et ai. (1972), Proc.
Natl. Acad. Sei. USA,69:2110-2114. Lyhyesti E. coli-bakteerin HB101 viljelmää inkuboitiin 0,03 M CaCl„-liuoksessa nollan C:n y · * · lämpötilassa 20 minuuttia. Noin 5 x 10 bakteerisolua lisättiin 0,3 mi.llilitraan samaa liuosta, johon oli lisätty 100 nano-grammaa (ng) yhdistelmäplasmideita. Tätä transformaatioreaktion seosta inkuboitiin 0°C:n lämDÖtilassa 60 minuuttia.
- - Plasmidi pBR322 sisältää ampisilliinin ja tetrasykliinin vastus-tuskyvyn aikaansaavat geenit. Lääkeaineille herkät, tällä plas-midilla transformoidut bakteerisolut ovat vastustuskykyisiä ampi-: silliinille ja tetrasykliinille. Koska plasmidin pBR322 DNArssa on ainoastaan yksi sellainen BamHI-pilkkomiskohta, joka si-: jaitsee tetrasykliinin vastustuskyvyn aikaansaavassa geenissä, : : niin HBV-fragmenttien istuttaminen tähän BamHI-kohtaan hajottaa tämän geenin. Täten plasmidista oBR322 sekä sen BamHI-kohtaan istutetusta HBV DNA-fragmentista saadulla plasmidilla (kloonaava vektori) muunnettu (transformoitu), lääkeaineelle herkkä E. coli-bakteerin kanta HB101 on vastustuskykyinen ampisilliinille ja herkkä tetrasykliinille.
)
II
63 86585
Transformoidut E. coli-bakteerit, toisin sanoen plasmidista amoi-silliinin vastustuskyvyn aikaansaavan geenin sisältävät bakteerit valittiin maljaamalla tämän transformointireaktio seos LB-ravinto-agaria olevalle alustalle /kasvualusta, joka sisältää litraa kohden: 10 g Bactoagaria, 10 g Bactotryptonia, 5 g Bacto-hiivauutetta (kaikki yhtiöstä Difco Labs, Detroit, MI) ja 5 g NaCl:ia/, joka sisältää ampisilliinia pitoisuutena 50 mikro-grammaa/ml. Maljattuja E. coli bakteereita inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 2 vuorokautta.
Niiden pesäkkeiden joukosta, joissa todettiin ampisilliinin vastuskykyä edellä esitetyn transformointitoimenoiteen jälkeen, valittiin tetrasykliinille herkkiä pesäkkeitä maljaamalla näitä ensin mainittuja pesäkkeitä edellä mainitulle LB-ravintoa.lustalle, joka ampisilliinin sijasta sisälsi tetrasykliiniä pitoisuutena 50 mikrogrammaa/ml. Myös näitä maljattuja pesäkkeitä inkuboitiin 37°C:n lämpötilassa 2 vuorokautta. Täten saatiin E. coli-bakteerin HBlOl kantoja, jotka sisälsivät plasmidin pBR322 sekä tetrasykliinin vastustuskyvyn aikaansaavassa geenissä olevaan BamHI-pilkkomiskohtaan istutettuja HBV DNA-fraqmentteja.
3. Plasmidi-DNA:n uuttaminen
Edellä eristettyjä, yhdiste.lmä-DNA: ta sisältäviä E. coli-HB101-• : : soluja kasvatettiin ampisilliinia pitoisuutena 20 mikrogrammaa/ ml sisältävässä LB-ravintoalustassa, johon logaritmisen kasvu-vaiheen aikana lisättiin kloramfenikolia pitoisuudeksi 170 mik-rogrammaa/ml. Tätä kasvattamista jatkettiin useiden tuntien ajan plasmidi-DNA:n määrän lisääntymiseksi.
Tämän jälkeen solut hajotettiin sekoittamalla 500 millilitraan soluja 5 ml 25-prosenttista sakkaroosia 50 mM Tris-HCl-liuok-sessa (pH 8,0). Sen jälkeen, kun seosta oli inkuboitu 10 minuuttia 0°C:n lämpötilassa, siihen sekoitettiin 1 ml 1-prosent-;--·· tista lysotsyymiä 0,25 M Tris-HCl-liuoksessa (pH 7,5). Kun seosta oli inkuboitu 10 minuuttia 0°C:n lämpötilassa, siihen sekoitettiin varovaisesti 2 ml 0,25 M EDTA:ta (pH 8,0). Kun tätä seosta oli inkuboitu 10 minuuttia 0°C:n lämpötilassa, sii- 64 86585 hen sekoitettiin 8 ml 1-prosenttista Triton X-100-liiiosta /ooly-oksietyleeni (9) oktyyli fenyylieetteri? 0,15 M Tr.is-HCl-liuok-sessa (dH 8,0) 0,2 M EDTA (dH 8,0), ja inkuboitiin jälleen 10 minuuttia 0°C:n lämpötilassa.
Tuloksena oleva lysaatti sentrifugoitiin nopeudella 30 000 mm Spinco SW-65-roottorissa (Beckman Instruments) denaturoituneen proteiinin ja solujätteiden poistamiseksi. DNA saostettiin tästä kirkastetusta lysaatista sekoittamalla siihen 1/10-tilavuut-ta 2,5 M natriumasetaattia ja 2,5 tilavuutta 99-prosenttista etanolia, ja seosta inkuboitiin -20°C:n lämpötilassa 30 minuuttia. Saostettu DNA saatettiin kasaumaksi sentrifugoimalla nopeudella 10 000 x g 30 minuutin ajan.
Proteiinien poistaminen toteutettiin kahdesti käyttämällä 1 millilitraa fenolia, joka oli kyllästetty 0,01 M Tris-HCl:llä (pH 7,6), 0,1 M NaCl:11a ja 0,0012 M EDTA:lla. Landers et ai., (1977), J. Virol., 23:368-376. Edellä esitetystä toimenpiteestä otettiin talteen vesikerros ja DNA saostettiin siitä lisäämällä siihen 1/10-tilavuutta 2 M natriumasetaattia ja 2,5 tilavuutta 99-orosenttista etanolia, ja seosta inkuboitiin -20°C:n lämpötilassa 20 minuuttia. Sentrifuqoinni11 a, joka kesti 10 minuuttia ja joka suoritettiin nopeudella 10 000 x q, saatiin : täydellisesti kaksijuosteisen, HBxAgrtä koodaavan geenin sisäl- tämän DNA:n kasauma.
I 4. Plasmidi-DNA:n analyysi ;·; HBV DNA:n läsnäolo klooneissa varmistettiin Southern:in siirto-ja hybridisointitekniikkaa käyttäen Southern (1975), Mol. Biol., 98:503. 10 mg kustakin edellä esitetyllä tavalla eristetystä kloonista saatua plasmidi-DNA:ta pilkottiin BamHI-entsyymillä (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl^, 1 mM ditio-treitolia). Tätä reaktioseosta käsiteltiin elektroforeettisesti 0,6-prosenttisen aqaroos iqeel in vaasuorilla liuskoilla, 100 ampeerilla 2 tunnin ajan (0,0 M Tris-asetaatti, 0,002 M 5DTA).
65 86585
Geelissä oleva DNA denaturoitiin upottamalla geeli useaan 1,5 M NaCl:n ja 0,5 M NaOH:n annokseen tunnin ajaksi, huoneen lämpötilassa, jatkuvasti sekoittaen tai ravistellen. Joissakin tapauksissa geelissä oleva DNA hydrolysoitiin hapolla toteutetulla depurinointireaktiolla ennen alkaalista denaturointia uoottamal-la geeli kahdesti 15 minuutin ajaksi 0,25 M HClriin huoneen lämpötilassa. Denaturoinnin jälkeen geeli neutraloitiin upottamalla se useisiin tilavuuksiin liuosta, joka käsitti 1 M Tris-HCl:ia (pH 8,0) ja 1,5 M NaCl, 1 tunnin ajaksi huoneen lämpötilassa koko ajan ravistellen.
Geelissä oleva DNA siirrettiin nitroselluloosan päälle olennaisesti menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Maniatis et ai.
(1982), J. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor. Lyhyesti, nitroselluloosa (luettelonumero BA85, yhtiöstä Schleicher & Schuel, Ohio) laitettiin geelin päälle ja nitroselluloosan päälle laitetaan useita kerroksia Whatman 3MM-oaperia. Tämä kerrostuma laitettiin tämän jälkeen, geelipuoli alaspäin, Whatman 3MM-langa1le, jonka päät oli upotettu puskuriin, joka sisälsi 0,9 M NaCl:ia ja 0,09 M natriumsitraattia. Tällöin puskurin kapi 1laari1iike siirtää DNA:n geelistä nitroselluloosalle.
DNA kiinnitettiin nitroselluloosaan kuumentamalla sitä 80°C:n lämpötilassa 2 tuntia vakuumissa.
Edellä valmistettu, nitroselluloosalla oleva plasmidi-DNA -- - (Southern'in suodatin) varustettiin koettimella HBV DNA:n ; läsnäolon selvittämiseksi, käyttäen edellä mainittua Maniatis'in ;-·· et ai. toimenpidettä.
Lyhyesti, nämä .Southern'in suodattimet esihybridisoitiin upottamalla ne esihybridisaationesteeseen, 0,9 M NaCl, 0,09 M natriumsitraattia, 0,5% SDS (natriumdodekyylisulfaatti), 100 mq/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta ja 5X Denhardt'in liuosta (joka sisältää litraa kohden 1 q Ficollria, l g polyvinvyli-; pyrrolidonia ja l g BSA:n fraktiota V) 4 tunniksi 68°C:n lämpö- tilassa.
* 66 86585
Hybridisointi suoritettiin 1 ämpösauma.ttavassa muovipussissa, jossa oli juuri sen verran hybridisaationestettä, että Southern'in 2 suodattimet pysyivat märkinä (50 mikrolitraa/cm suodatinta). Hybridisointiliuos käsitti 0,9 M NaCl, 0,09 M natriumsitraatti, 0,01 M EDTA, 5X Denhardt'in liuosta, 0,5% SDS, 100 mikrogrammaa/ml 7 denaturoidun lohen sperman DNArta sekä 5 x 10 corn edellä valmistettua, radioaktiivisesti merkittyä HBV DNA:ta. Southern'in suodatinta inkuboitiin tässä hybridisointi1iuoksessa 12 tuntia 68°C:n lämpötilassa.
Sen jälkeen, kun suodatinta oli pesty 2 tunnin ajan (0,3 M NaCl, 0,03 M natriumsitraatti), tällä suodattimena valotettiin röntqen-sädefilmi (XPR-1, Kodak), jolloin saatiin autoradiografinen kuva.
Kolme yhdistelmäplasmidia eristettiin edellä mainittua toimenpidettä käyttäen, ja niille annettiin nimiksi AM6, AM7 ja AMI.
AM6 sisälsi plasmidin pBR322 DNA:n sekä koko HBV-qenomin. AM7 sisälsi olasmidin OBR322 DNA:n sekä 1350 emäsparin suuruisen fragmentin HBV-DNA:sta. AMI sisälsi olasmidin oBR322 DNA:n sekä 1850 emäsparin suuruisen fragmentin HBV DNA:sta, joka fragmentti sisälsi HBxAq:tä koodaavan geenin.
5. SV40/HBxAg-ilmentyvän vektorin DNA:n sisältävän reolikoitu- van olasmidin muodostaminen__ : Dean Hamer'ilta, mainittu edellä, saatu vajavainen SV40-virus ' : - pilkottiin BamHI- ja EcoRI-endonukleaasei11a puskurissa, joka
: sisälsi 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^ ja ImM
• f- ditiotreitolia. Plasmidin pBR322 DNA Dilkottiin edellä esite- : .·. tysti kahdesti, jolloin muodostui täten pilkotun SV40 DNA:n päitä täydentävät päät. Kummastakin pilkkomiskäsittelystä saadut katkotut tuotteet erotettiin ja puhdistettiin kesiumkloridin tiheysgradientin sentr ifugoinni1la . Tanaka et ai. (1975), J.
- ’ Bact., 121:354-362. Täten eristetyt SV40:sta saatu 4492 emäs- parin fragmentti ja pBR322:sta saatu 3987 emäsparin fragmentti alistettiin DNA-1iqaatioon T4 DNA-liqaasia käyttäen puskurissa, joka sisälsi 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MqC^, 10 mM ditiotreitolia ja 0,4 mM ATPrtä, jolloin muodostui plasmidi pBRSV ’ (kuva 4).
I: ___ J . I . Γ-τ »J.V1—^ YT'i . ' '.<»»·. · · Τ' ' - · · ~- ·' 67 86585
Edellä esitetyssä reaktiossa saatu ligaatioreaktion tuote on rengasmaista DNA:ta, joka on saatu lineaariseksi tehdyn plas-midin pBR322 3987 emäsparin fragmentista ja SV40-viruksen 4492 emäsparin fragmentista liittämällä yhteen niiden toisiaan täydentävät EcoRI- ja BamHI-päät. Tämän jälkeen tämä rengasmainen plasmidi tehtiin lineaariseksi katkaisemalla se BamHI-restrik-tiokohdasta, joka oli muodostunut ligaation aikana, muodostaen kuhunkin oäähän BamHI-koheesioDäät.
HBxAg:tä koodaavan geenin sisältämä 1850 emäsparin HBV DNA-fraq-mentti eristettiin pilkkomalla edellä eristetty olasmidi ΛΜ6 BamHI-entsyymiilä puskurissa, joka sisälsi 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^ sekä 1 mM ditiotreitoi ia. Reak-tioseosta käsiteltiin elektroforeettisesti 100 amoeerilla 2 tunnin ajan 0,8-prosenttista agaroosia käyttäen, ja 1850 emäsparin vyöhyke leikattiin irti ja sitä lämpökäsiteltiin 68°C:n lämpötilassa 15 minuutin ajan. Siihen lisättiin L/10-tilavuutta 3 M natriumasetaattia ja tuloksena oleva liuos käsiteltiin edellä kuvatulla, proteiinit poistavalla toimenpiteellä.
Täten eristetyssä, HBxAq:n geenin sisältävässä HBV DNA-fragmen-tissa oli täydentävät BamHI-päät. Sitten tämä DNA-fragmentti λ: : ligatoitiin edellä valmistettuun pBRSV-plasmidiin T4 DNA-ligaa- ·' siä käyttäen puskurissa, joka sisälsi 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), mM MgClj* 10 mM ditiotreitolia ja 0,4 mM ATP.
: Edellä esitetyn ligaatioreaktion tuote oli rengasmaista plas- midi-DNA:ta, jolle annettiin nimeksi SVAM191.. Se sisälsi myötäpäivään tarkastellen, 4492 emäsparin SV40 DNA-fragmentin al-. . käen emäsasemansa 2468 BamHT-kohdasta ja päättyen emäsasemansa 1717 EcoRI-kohtaan, 3987 emäsparin PBR322 DNA-fraqmentin alkaen emäsasemansa 0 EcoRI-kohdasta ja päättyen emäsasemansa 375 BamHI-: * kohtaan, sekä 1850 emäsparin HBV DNA-fraqmentin alkaen emäsasemansa 1400 BamHI-kohdasta ja päättyen emäsasemansa 28 BamHJ-koh-taan. Plasmidi SVAM191 esitetään kaavamaisesti kuvassa 4.
68 86585 SVAM191 istutettiin E.coli-bakteerin HB101 edellä kuvattua trans-formointitoimenpidettä käyttäen. Koska nämä transformoidut E. coli-bakteerit olivat samoin ampisilliinille vastustuskykyisiä sekä tetrasykliini 1le herkkiä, niin niihin sovellettiin samaa, edellä kloonaavan E. coli-vektorin yhteydessä esitettyä eristämistoimenpidettä. Samoin niihin sovellettiin edellä kuvattuja toimenpiteitä DNA:n tuottamiseksi, eristämiseksi, puhdistamiseksi sekä analysoimiseksi, jolloin saatiin plasmidin SVAM191 olennaisesti ouhdasta DNA:ta milligrammojen suuruisia määriä.
6. Ilmentyvän vektorin SV40/HBxAq muodostaminen
Vektori, joka kykenee indusoimaan HBxAg:n tuotannon eukariootti-sissa soluissa, valmistettiin irroittamalla osa plasmidin SVAM191 DNArsta. Tämä saatiin aikaan pilkkomalla plasmidin SVAM191 DNA Haell-endonukleaasilla puskurissa, joka sisälsi 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^ sekä 1 mM dit iotrei toi ia, jolloin SVAM191 pilkkoutuu Haell-kohdistaan, jotka sijaitsevat SV40 DNA-alueen emäsasemassa 767 sekä HBV DNA-al.ueen emäsasemassa 1437.
Edellä esitetystä reaktiosta saadut kaksi DNA-fraqmenttia erotettiin elektroforeettisesti agaroosigeeliä käyttäen, edellä kuvattua toimenpidettä soveltaen. Täten eristetty suurempi, ainoastaan SV40:n ja HBV DNA:n sisältävä fragmentti tehtiin rengasmaiseksi ligatoimalla sen toisiaan täydentävät Haell-päät T4 DNA-ligaasia ja edellä kuvattua toimenpidettä käyttäen.
- Edellä muodostetulle rengasmaiselle DNA:n ilmentyvälle vekto-rille annettiin nimeksi SVHBV-3 (kuvat 4 ja 5). Se sisältää : ilmentymistä säätelevät elementit viruksesta SV40 sekä HBxAgrtä :: koodaavan geenin HBV:stä.
7. Eukariottisten isäntäsolujen transfektoiminen vektorilla SVHBV-3_
Vektorilla SVHBV-3 transfektoimisoen valittiin afrikkalaisen marakatin munuaisesta saatu, SV40-viruksen isäntänä mahdolli-sesti toimiva solusukupolvi BSC-1 (ATCC CCL 26; saatu henki- ____ löltä Dr. G.B. Thornton, Johnson & Johnson Biotechnology Center, i 69 86585 7
Inc., La Jolla, California). Noin 10 solusta muodostuvia yhtenäisiä monokerroksia saatiin viljelemällä soluja 37°C:n lämpötilassa Eagle'n alustassa, joka sisälsi olennaisia ravintoaineita mahdollisimman niukasti (minimal essential medium; EMEM), ja jota oli täydennetty 10-prosenttisesti sikiöasteisen vasikan seerumilla, 100 yksiköllä penisilliiniä/ml, 100 mikro-grammalla streptomysiiniä/ml sekä 3 mM L-glutamiinia. Nämä monokerrokset infektoitiin vektorin SVHBV-3 DNA:11a DEAE-deks-traanin läsnäollessa, kuten julkaisussa Ganem et ai. (1976), J. Mol. Biol., 101:57-83 kuvataan.
Yksi pullo infektoitiin 1,6 mikrogrammalla tätä vhdisteimä-SVHBV-3 vektoria käyttäen avustajana 0,05 mikrogrammaa SV40 tsA239:n DNA:ta· Vertailuihin lisättiin ainoastaan samansuuruiset määrät avustajavektorin DNA:ta. Näitä viljelmiä inku-boitiin 40°C:n lämpötilassa 12 vuorokautta, jonka jälkeen solut rikottiin jäädyttämistä ja sulattamista käyttäen, ja niitä säilytettiin -70°C:n lämpötilassa.
Edellä saaduista jäädytetyistä solujauheista uutettiin solupro-teiinit lisäämällä ensin 2 mg solujauhetta 1 millilitraan pro-. . teiineja uuttavaa puskuria [2% SDS, 10¾ glyserolia, 0,08 M Tris-HC1 (pH 6,8), 2 mM fenyy1i-metyy1i-sulfonyy1ifluoridia, 0,1 M ' ditiotreitolia, 0,001% bromifenolisinistä?· Tämän jälkeen tätä liuosta keitettiin 5 minuutin ajan, sentrifugoitiin 15 000 rom:n nopeudella 10 minuuttia ja supernatantit otettiin talteen.
Tämän jälkeen 100 mikrogrammaa näytteen proteiinia sisältävä määrä supernatanttia alistettiin SDS-polyakryyl.iamidigeel il lä toteutettuun elektroforeesiin seuraavassa kuvattua Western'in täplitvstoimenoidettä käyttäen.
8. Polypeptidien synteesit Tämän keksinnön mukaiset polypeptidit syntetisoitiin kemiallisesti käyttäen kiinteän faasin menetelmiä, joita on kuvattu -·. julteisuissa Merrifield et ai. (1963), J. Am. Chem. Soc.
85:2149; Merrifield et ai. (1970), A. Rev. Biochem., 39:841- 866 sekä Houghten et ai. (1980), Int. J. Peptide Prot. Res., 16:311-320. Ohessa käytetyt suhteellisen lyhyet polypeotidit vastaavat HBxAgrn antigeenisyyden determinantteja.
7o 86585
Kuvassa 6 nähdään HBxAg:n 154 aminohappojäännöksen ketju.
Samoin kuvassa 6 nähdään ohessa kuvattujen, suosi teltavimpien synteettisten polypeptidien (99, 100 ja 142) aminohappojäännösten järjestykset. Kaikkien synteettisten polypeptidien koostumus varmennettiin aminohaopoanalyysi1lä.
Yleisesti ottaen immunogeeni tai synteettinen oolyoeotidi valmistetaan vaiheilla, joissa saadaan aikaan lukuisia, HBxAq:n antigeenisyyden determinanttialueen aminohappojäännöksiä vastaavia, sopivasti suojattuja aminohappoja, ja joissa nämä aminohapot syntetisoidaan sellaiseksi polyoeptidiksi, joka aminohappojäännösten järjestykseltään vastaa polypeptidistä aminohanoojäännösten järjestystä tässä antigeenisyyden determinantissa. Tätä tuotettua synteettistä oolyoeptidiä voidaan käyttää rokotteen valmistamiseen, tavallisesti kytkemällä se kantajaan kon]uqaatin muodostamiseksi, jonka jälkeen tehokas määrä tätä konjuqaattia dispergoidaan johonkin fysiologisesti siedettävään laimentimeen.
Nämä polypeptidit syntetoidaan mieluiten edellä mainittujr»n kiinteän faasin menetelmien mukaisesti kysteiinihartsia käy t-- täen. Katso edellä mainittu julkaisu Merrifield et ai. J. Am.
! Chem. Soc.. Tässä menetelmässä alfa-aminoryhmä kussakin .lisät-tävässä aminohapossa suojataan tyypillisesti tertiaärisellä - butoksikarbonyyliryhmällä (t-BOC) ennen tämän aminohapon lisää-mistä kasvavaan polypept idike t juun . Sitten tämä suojaava t-BOC-ryhmä poistetaan ennen seuraavan aminohapon lisäämistä tähän kasvavaan oolyoeot idiket juun . Yksittäisten aminohappojen sivu-ketjut suojataan seuraavasti: Arq-tosvyli; Ser-, Thr-, Glu- ja Asp-O-bentsyyli; Tyr-O-bromobentsyylioksi-karbamyyli; Trp-N-formyyli; kysteiinin tapauksessa s-metoksibentsyyli; lysiinin tapauksessa 2-klooribentsoksikarbonvyli; sekä histidiinin tapauksessa dinitro fenyy1i. Aspergiinia käytettäessä tämän suo-• : jatun aminohapon kanssa lisätään yhtä suuri moolimäärä N-hydroksi- bentstriatsolia ja liuottimena kytkeytymisessä käytetään dimetyyli-formamidia (DMF).
7i 86585
Trp-jäännöksissä olevat N-formyyliryhmät poistetaan sen jälkeen, kun polypeptidi on irroitettu tukihartsista, käsittelemällä niitä 1,O-molaarisella ammoniumbikarbonaatilla, polypeptidin pitoisuuden ollessa 1,0 milligrammaa/millilitra, 16 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Yamashiro et ai. (1973), J. Org. Chem., 38: 2594-2597. Kytkeytymisen tehokkuutta kussakin vaiheessa voidaan seurata ninhydriinillä tai pikriinihapolla, ja se on mieluiten suurempi kuin 99% kaikissa tapauksissa. Katso julkaisut Gisin (1972), Anal. Chem. Acta, 58:248-249; sekä Kaiser (1980), Anal. Biochem., 34:595-598.
Toivotun polypeptidin valmistamisen jälkeen osaa tuloksena ole-. vasta suojatusta polypeptidistä (noin 1 gramma) käsitellään kahdella millilitralla anisolia, ja noin 20 millilitraa vedetöntä vetyfluoridia tiivistetään reaktioastiaan hiilihappojään lämpötilassa. Tuloksena olevaa seosta sekoitetaan noin 4°C:n lämpötilassa noin yhden tunnin ajan, jolloin suojaavat ryhmät irtoavat ja polypeptidi lohkeaa irti hartsista. Sen jälkeen, kun vety-fluoridi on haihdutettu 4°C:n lämpötilassa ^-virran avulla, jäännöstä uutetaan kolmasti vedettömällä dietvylieetterillä anisolin poistamiseksi, ja jäännös kuivataan vakuumissa.
Tätä vakuumissa kuivattua materiaalia uutetaan 5-prosenttisella etikkahapon vesiliuoksella (3 kertaa 50 millilitraa) vapaan polypeptidin erottamiseksi hartsista. Uutteen sisältävä liuos lyo-filisoidaan, jolloin saadaan monomeerista hapettumatonta polypeptidi ä.
: : Lyhyesti, kunkin polypeptidin tapauksessa yleistoimenpiteessä 4 milligramman KLH:ta, joka on sekoitettu 0,25 millilitraan 10 millimolaarista natriumfosfaattipuskuria (pH 7,2), annetaan reagoida MBS:n 7 milligramman kanssa; joka MBS on liuotettu DMF:iin, ja tuloksena olevaa seosta sekoitetaan 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. MBS-liuos lisätään pisaroittain, jolloin voidaan taata se, ettei DMF:n paikallinen pitoisuus ole liian korkea, sillä KLH on liukenematonta noin 30-prosenttisissa tai suurem-missä DMF-pitoisuuksissa. Reaktiotuote KLH-MB tuote johdetaan i 72 86585
Sephadex G-25-geelistä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) valmistetun kromatografiakolonnin läpi, joka oli tasapainotettu 50 mM natriumfosfaattipuskurilla (oH 6,0), jolloin vapaa MBS saatiin poistetuksi. Kolonnin eluaatista saaduista, 280 nanometrin allonoituudella seurattavista, tuotteen sisältävistä fraktioista talteen otetun KLH:n saanto on tyypillisesti noin 80%.
Sitten näin valmistetun KLH-MB:n annetaan reagoida polypeptidin kanssa, josta polypeptidistä 5 milligrammaa on liuotettu 1 milli-litraan puskuria. Tuloksena olevan reaktioseoksen pH astetaan arvoon 7-7,5, ja tätä reaktioseosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 3 tunnin ajan, jolloin saadaan polypeptidistä ja kantajasta muodostuva konjugaatti.
9. Western'in täplitysmenetelmä
Anti-polypeptidisiä vasta-aineita (anti-99, anti-100 ja anti-142) tarkasteltiin Western'in täplitysmenetelmällä, jolloin saatiin todetuksi niiden oletettu spesifisyys HBxAgrlle sekä HBxAg:n olennaisen polypeptidiosan ilmentyminen transfektoiduissa soluissa. HBxAg:n sisältävät soluproteiinit erotettiin elektro-foreettisesti 12,5-prosenttista SDS-polyakryyliamidigeeliä käyttäen. Katso julkaisut Laemmli (1970), Nature, 277:680-685; sekä . . Towbin et ai. (1979), Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 76:4350-4354.
' Proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosalle : .· (Schleicher & Schuel, luettelonumero BA85), edellä mainitussa Towbin'in et ai. julkaisussa esitetyllä tavalla, käyttäen säh-: : : köistä täolityslaitetta (E.C. Apoaratus Corp. of Jacksonville,
: ; ; Florida) sekä puskuria, joka sisälsi 25 mM Tris-emästä, 192 mM
glysiiniä, 20% metanolia ja 0,1% SDS:ää (pH 8,3). Siirtämisen jälkeen nitroselluloosa suojattiin BLOTTO:lla /Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer, Johnson et ai., (1983), J. Exp. Med., 159:1751-1756; 5% (w/v) rasvatonta maitojauhetta; 0,01% vaahdonestoainetta anti-foam A (Sigma, luettelonumero A5758) sekä 0,0001% mertiolaatti (Sigma, luettelonumero 5125) PBS:ssä, pH-arvossa 7,27 epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi.
9 73 86585 Täplien annettiin reagoida antipeptidisen vasta-aineen 100 mikrolitran kanssa 10 millilitrassa BLOTTO:a 3 tunnin ajan, jonka jälkeen niitä pestiin 3 kertaa yhden tunnin ajan 50 milli-litralla uutta BLOTTO:a.
Vektorille spesifiseen proteiiniin sitoutuneet anti-polypepti- diset vasta-aineet ilmaistiin siten, että täplien annettiin rea- 125 . · goida I-merkityn, Staphylococcus aureus-bakteerin proteiinin A 20 mikrolitran kanssa 10 millilitrassa BLOTTOra 1 tunnin ajan. Tämän jälkeen täpliä pestiin 50 millilitrassa uutta BLOTTOra 15 minuuttia 4 kertaa, ja sitten virtaavassa vedessä 20 minuuttia.
125 10. Bepatomasolujen uutteiden_I-merkitsemmen
Ihmisen hepatomakasvaimesta oeräisin olevan solusukupolven PLC/PRF/5, jonka tiedetään sisältävän HBV:n integroituneita ketjuja /Alexander et ai. (1976), African Med. J., 50:21-24; ATCC CRL 80247, monokerrokset lyofilisoitiin . Solujauhe liuotettiin fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen (PBS), jolloin proteiinin pitoisuudeksi saatiin 1 mq/ml . Nooeudella 10 000 x g tapahtuneen sentrifugoinnin jälkeen, jolloin solujäte saatiin poistetuksi, 50 mikrolitraa edellä saatua liuosta sekoitettiin 75 mikrolitraan RIPA-liuosta /0,15 M NaCl, 10 mM nat-riumfosfaattia (pH 7,5), 1¾ Nonidet P-40, 0,5¾ natriumdeoksi-kolaattia, 0,1% SDS:ia7 sekä 20 mikrolitraan 0,2 M natriumfos- faattia (pH 7,5). Yhdessä kokeessa täten liukoiseksi saatettu 125 ... ..
soluproteiini merkittiin 5 milliCuriella I:ta käyttäen kloramiini-T:n reaktiota. Kuvassa 7 esitetyssä tutkimuksessa 12 5·· solulysaatit merkittiin 3 mikroCuriella I:tä samaa reaktiota käyttäen.
. . Edellä saatu reaktioseos johdettiin PBSrllä pestyn Sephadex G-25-kolonnin (Pharmacia Fine Chemicals, Piscatawav, NJ) läpi. Saatua, radioaktiivisen tuotteen sisältävää fraktiota (9 x 10 cpm/ml) esi-inkuboi t i i n kaniinin normaalin seerumin kanssa epäspesifisen sitoutumisen poistamiseksi. Lyhyesti, 20 mikrolitraa piikin tuottavaa fraktiota sekoitettiin 1,0 millilitraan % f 74 86585 RIPA-liuosta, 20 mikrolitraan Trasylolia (Sigma-yhtiön tavaramerkillä suojattu proteiini, helmikuussa 1984 ilmestyneessä luettelossa sivulla 163) sekä 100 mikrolitraan NRS:.iä. Sen jälkeen, kun seoksia oli inkuboitu 1 tunnin ajan 0°C:n lämpötilassa, niihin sekoitettiin 500 mikrolitraan Staphylococcus aureus-bakteerin formaliinilla kiinnitettyjä soluja (Staph A; Calbiochem, La Jolla, CA), ja tätä seosta inkuboitiin 0°C:n lämpötilassa 30 minuutin ajan. Staph A-saostuma poistettiin sentrifugoimalla nopeudella 10 000 x g 10 minuutin ajan, ja supernatantti otettiin talteen.
11. Immunosaostukset (IP)
Kaniinin anti-polypeptidisen, polypeptidiä 99 vastaan vaikuttavan antiseerumin (anti-99) annettiin reagoida edellä saatujen, radioaktiivisella jodilla merkittyjen soluproteiinien kanssa. Lyhyesti, 10 mikrolitraa anti-99:ia sekoitettiin 2 x 10^ cpm vastaavaan määrään merkkiainetta sisältävää uutetta ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 0°C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen siihen lisättiin 40 mikrolitraa Staph A-soluja ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 0°c:n lämpötilassa. Staph A-snosfuma poistettiin sentrifugoimalla nopeudella 10 000 x g 10 minuutin ajan, ja saatu kasauma otettiin talteen. Kasauma suspendoitiin uudestaan 1 millilitraan RIPA-liuosta ja sentrifuqoitiin, kuten edellä. Tuloksena oleva kasauma suspendoitiin uudestaan 1,0 millilitraan LiCl-liuosta (100 mM Tris-HCl, 500 mM LiCl) ja sentrifugoitiin uudestaan. Käsittely LiCl-liuoksella toistet-V tiin ja kasauma otettiin talteen.
Edellä saatu kasauma suspendoitiin uudestaan 50 mikrolitraan näytepuskuria ja sitä keitettiin 3 minuuttia. Tätä seosta sent-rifugoitiin 1 minuutin ajan nopeudella 10 000 x g ja supernatantti otettiin talteen, sekä käsiteltiin elektroforeettisesti 12,5-prosenttista SDS-polyakryyliamidigeeliä käyttäen. Edellä saaduilla geeleillä valotettiin XRP-l-röntgensädefilmi, jolloin saatiin autoradiografi.
75 86585 12. Simpanssin ja ihmisen maksasta saatujen solu-uutteiden valmistaminen ja testaaminen_
Kahdesta kroonisesti HBV-infektoidusta simpanssista sekä ihmisestä saadut maksanäytteet, sekä tavallisesta ihmisestä ja simpanssista (HBV sero-negatiivisia) saadut maksanäytteet jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä ja jauhettiin jauheeksi.
Nämä jauheet sekoitettiin näytepuskuriin /0,0625 M Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% glyserolia, 5% 2-merkaptoetanolia ja 0,001% bromifenolisinist§7 ja keitettiin viisi minuuttia.
Seosta sentrifugoitiin nopeudella 10 000 x g 30 minuutin ajan solujätteen poistamiseksi. Tämän jälkeen näytteet analysoitiin Western'in täplitystestillä edellä kuvatusti, käyttäen 75 mikrogrammaa proteiinia geeliuraa kohden.
13. Anti-HBxAg:n vasta-aineiden tunnistaminen ihmisen seerumista_____ SVHBV-3:lla transfektoitujen BSC-l-solujen uutteet, 20 mikro-grammaa uraa kohden, alistettiin SDS-PAGE-määritykseen 12-pro-senttisia akryyliamidigeelejä käyttäen, ja erotetut proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosalevyille, edellä kuvatusti. Tuloksena oleville nitroselluloosalevyille sekoitettiin 1:50-laimennoksena seerumia, joka oli saatu kuudesta sellaisesta ihmisestä, joille oli diagnostoitu HBVrstä johtuvia • - infektioita, jotka sisältävät oireellisen kantajan, sekä poti-' laasta, jolla oli hepatosellulaarinen karsinooma. Vertailule-vyille laitettiin tämän keksinnön mukaisia kaniinin anti-poly-: · peptidisiä vasta-aineita.
Nitroselluloosasta, proteiinista ja seerumista muodostuneita : : seoksia pidettiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Sitten levyt huuhdottiin ja niille sekoitettiin 1:200-laimennoksina pipar--*- · juuren peroksidaasiin kytkettyjä vuohen anti-ihmisen tai anti-kaniinin vasta-aineita, kulloinkin tilanteen mukaisesti. Näitä seoksia seisotettiin 1 tunnin pituisen ajan, jolloin sitoutuneet : anti-X-vasta-aineet reagoivat asianmukaisten anti-vasta-aineiden kanssa. Levyt pestiin ja kehitettiin 4-kloori-l-naftolilla, —: kuten edellä kuvataan. Hepatosellulaarista karsinoomaa sairas- 76 86585 tavasta potilaasta saatu seerumi oli voimakkaasti immunoreak-tiivinen SVHBV-3:lla transfektoitujen soliijen ilmentämän, suurin piirtein 24 000 daltonin suuruisen polvpeptidin kanssa.
14. Solusukupolvet ja kudosnäytteet PLC/PRF/5- ja HepG2-solut saatiin tutkijalta Dr. D. Milich, Department of Basic & Clinical Research, Scripps Clinic and Research Foundation (Scripps), La Jolla, CA. Simpanssin maksakudoksen näytteet saatiin tutkijoilta Drs. R. Purcell ja P. Kaplan, the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda MD, sekä Ortho Diagnostics, Inc., Raritan NJ, vastaavasti. Ihmisen maksakudoksen näytteet saatiin tutkijoilta Drs. F. Chisari, J. Dienstag ja A. Yu, Scriops Department of Medicine, Harvard University, Boston MA, sekä Depar-ment of Pediatrics, University of California-San Diego, La Jolla, CA., vastaavasti.
Edellä esitetyn on tarkoitus havainnollistaa, mutta ei rajoittaa tätä keksintöä. Siitä voidaan käyttää lukuisia muunnoksia ja variaatioita kuitenkaan tämän keksinnön uusien sovellutusten hengestä ja tavoitteista poikkeamatta.
\ i

Claims (7)

1. Diagnostiskt testsystem för bestämning av närvaron av HBxAg i kroppsprov, kännetecknat av att det innefattar a) ätminstone en behällare med ett första reagens, vilket första reagens innefattar receptormolekyler, vilka receptor-molekyler kan immunoreagera med HBxAg samt med en antigenisk syntetisk polypeptid, vilken polypeptid innefattar en amino-syragruppsekvens utvald ur gruppen av polypeptidsekvenser representerade av formlerna skrivna frän vänster tili höger och i riktningen för aminoterminus tili karboxiterminus (i) Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp; (ii) Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Gly-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val; och (iii) Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala, och vilken polypeptid innehäller under cirka 40 aminosyra-rester; och b) en indikator för immunoreaktionen.
1. Diagnostinen koejärjestelmä HBxAg:n läsnäolon määrittämiseksi ruumiin näytteestä, tunnettu siitä, että se käsittää a) vähintään yhdessä säiliössä olevan ensimmäisen reagens-sin, tämän ensimmäisen reagenssin käsittäessä reseptorimo-lekyylejä, jotka kykenevät immunoreagoimaan HBxAgtn kanssa sekä antigeenisen synteettisen polypeptidin kanssa, joka polypeptidi sisältää aminohappotähdesekvenssin, joka on valittu polypeptidien muodostamasta ryhmästä, joita edustavat kaavat, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa ami-nopäästä karboksipäähän, (i) Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp; (ii) Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Gly-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val; sekä (iii) Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala, ja joka polypeptidi sisältää alle noin 40 aminohappotähdettä; ja b) immunoreaktion indikaattorin.
2. Diagnostiskt testsystem enligt patentkravet 1, kännetecknat av att nämnda polypeptid är en vattenlöslig eller i vatten dispergerbar antigenpolymer innehällande ett flertal 81 36585 sairananbundna syntetiska äterkommande peptidenheter samman-bundna genom oxiderade cysteingrupper, vilka äterkoiranande enheter representeras av en formel skriven frän vänster till höger och i riktningen frän aminoteirminus till karboxiterminus utvald ur gruppen bestäende av Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cys} Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Cys; och R^Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala-R2, väri R1 och R2 betecknar en cysteingrupp och förutsatt att 1 2 endast en av R och R finns närvarande.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen diagnostinen koejärjestelmä, tunnettu siitä, että mainittu polypeptidi on veteen liukeneva tai veteen dispergoituva antigeeninen polymeeri, joka käsittää lukuisia toisiinsa liittyneitä, synteettisestä polypeptidistä muodostuvia toistuvia yksiköitä, jotka ovat sitoutuneet toisiinsa hapettuneilla kysteiinijäännöksillä, ja toistuvat yksiköt ovat seuraavan kaavan mukaisia, joka kaava on kirjoitettu vasemmalta oikealle ja suunnassa amino-päästä karboksipäähän, seuraavasta joukosta valiten: Cys-Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp-Cys; Cys-Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Glu-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val-Cys; sekä R^Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala-R2, jossa sekä R että R ovat kysteiinijäännös, kuitenkin edellyttäen, että ainoastaan toinen jäännöksistä R1 ja R2 on läsnä . 78 8 6 585
3. Diagnostiskt testsystem för bestämning av närvaron av HBxAg i kroppsprov, kännetecknat av att det innefattar a) ätminstone en behällare med ett första reagens, vilket första reagens innefattar receptormolekyler, vilka receptor-molekyler kan immunoreagera med HBxAg samt med en antigenisk syntetisk polypeptid, vilken polypeptid innefattar en amino-syragruppsekvens utvald ur gruppen av polypeptidsekvenser representerade av formlerna skrivna frän vänster tili höger och i riktningen för aminoterminus tili karboxiterminus (i) Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp; (ii) Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Gly-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val; och (iii) Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala, och vilken polypeptid innehäller under cirka 40 aminosyra-rester; och b) en indikator för immunoreaktionen, och att det dessutom innefattar ett andra reagens i en andra behällare, vilket andra reagens utgöres av den antigena syntetiska polypeptiden vanned nämnda receptor immunoreagerar.
3. Diagnostinen koejärjestelmä HBxAg:n läsnäolon määrittämiseksi ruumiin näytteestä, tunnettu siitä, että se käsittää a) vähintään yhdessä säiliössä olevan ensimmäisen reagens-sin, tämän ensimmäisen reagenssin käsittäessä reseptorimo-lekyylejä, jotka kykenevät immunoreagoimaan HBxAg:n kanssa sekä antigeenisen synteettisen polypeptidin kanssa, joka polypeptidi sisältää aminohappotähdesekvenssin, joka on valittu polypeptidien muodostamasta ryhmästä, joita edustavat kaavat, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa ami-nopäästä karboksipäähän, (i) Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp; (ii) Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Gly-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val; sekä (iii) Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala, ja joka polypeptidi sisältää alle noin 40 aminohappotähdettä; ja b) immunoreaktion indikaattorin, ja että se lisäksi käsittää toisessa säiliössä olevan toisen reagenssin, tämän toisen reagenssin ollessa mainittua antigeenistä synteettistä polypeptidiä, jonka kanssa mainittu reseptori immunoreagoi.
4. Förfarande för att bestämma närvaron av en detekterbar mängd av HBxAg eller ett polypeptidparti därav, som innehäl-
82 B 6 5 85 ler HBxAg:s antigeniska determinant och dess väsentliga ho-mologer, kännetecknat av att man blandar fast-matris-bundna proteiner frän ett kroppsprov som skall testas med receptor-molekyler som kan immunoreagera med en antigenisk syntetisk polypeptid, vilken polypeptid innefattar en aminosyragrupp-sekvens utvald ur gruppen av polypeptidsekvenser represente-rade av formlerna skrivna frän vänster till höger och i riktningen för aminoterminus till karboxiterminus (i) Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp; (ii) Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Gly-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val; och (iii) Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala, och vilken polypeptid innehäller under cirka 40 aminosyra-rester; upprätthäller blandningen under en tidsperiod som är till-räcklig för att indikeringsanordningen skall signalera att en immunoreaktion har uppträtt; och bestämmer uppträdandet av nämnda signal.
4. Menetelmä HBxAg:n tai sen peptidiosan, joka sisältää HBxAg:n antigeenisyyden determinantin ja sen olennaiset homologit, ilmaistavan määrän läsnäolon määrittämiseksi, tunnettu siitä, että testattavasta ruumiin näytteestä saatuja, kiinteään matriisiin sidottuja proteiineja sekoitetaan re-septorimolekyyleihin, jotka pystyvät immunoreagoimaan antigeenisen synteettisen polypeptidin kanssa, joka polypeptidi sisältää aminohappotähdesekvenssin, joka on valittu polypeptidien muodostamasta ryhmästä, joita edustavat kaavat, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä karboksipäähän, 1 Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp; 79 86585 (ii) Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Gly-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val; sekä (iii) Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala, ja joka polypeptidi sisältää alle noin 40 aminohappotähdettä, seisotetaan mainittua seosta riittävä ajanjakso, jotta indikaattori antaa signaalin, että immunoreaktio on tapahtunut; ja mainitun signaalin läsnäolo todetaan.
5. Förfarande enligt patentkravet 4, kännetecknat av att kroppsprovet och receptorn blandas i fränvaro av nämnda in-dikeringsmedel och blandningen upprätthälles under en tidsperiod som är tillräcklig för att en bunden immunoreaktions-produkt skall bildas och indikeringsmedlet blandas med im-munoreaktionsprodukten efter det att produkten har sköljts.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ruumiin näyte ja reseptori sekoitetaan mainitun indikaattorin puuttuessa, ja tätä seosta seisotetaan niin kauan, että sitoutunut immunoreaktion tuote ehtii muodostua, ja mainittu indikaattori sekoitetaan tähän immunoreaktion tuotteeseen mainitun tuotteen huuhtomisen jälkeen .
6. Förfarande för bestämning av närvaron av anti-HBxAg-antikroppar i ett kroppsprov, kännetecknat av att det inne-fattar stegen: a) tillhandahällande av en antigen fixerad vid en fast matris under bildning av en fast bärare, vilken antigen är utvald ur gruppen bestäende av HBxAg i en form väsentligen ren av andra aktiviteter, ett polypeptidparti av HBxAg, som innehäller HBxAg:s antigeniska determinant och dess väsentliga homologer och en peptid innehällande en aminosyragrupp- 83 86585 sekvens utvald ur gruppen av polypeptidsekvenser represente-rade av formlerna skrivna frän vänster till höger och i riktningen för aminoterminus till karboxiterminus (i) Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Aep; (ii) Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Gly-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val; och (ii i) Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala, och vilken polypeptid innehäller under cirka 40 aminosyra- rester; b) blandning av nämnda fasta bärare med flytande kropps-prov som skall testas under bildning av fasta och flytande faser; c) upprätthällande av blandningen under en tidsperiod som är tillräcklig för att anti-HBxAg-antikroppar närvarande i kroppsprovet skall immunoreagera med antigenerna pä den fasta bäraren; och d) bestämning av närvaron av nämnda immunoreaktion med ett indikeringsmede1.
6. Menetelmä anti-HBxAg-vasta-aineiden läsnäolon toteamiseksi ruumiin näytteestä, tunnettu siitä, että a) käytetään kiinteään matriisiin kiinnitettyä antigeeniä kiinteän kantajan muodostamiseksi, tämän antigeenin ollessa valittu ryhmästä, joka käsittää HBxAg:n muista aktiivisuuksista pääasiallisesti puhdistetussa muodossa, HBxAg:n poly-peptidiosan, joka sisältää HBxAg:n antigeenisyyden determinantin ja sen olennaiset homologit sekä polypeptidin, joka sisältää aminohappotähdesekvenssin, joka on valittu polypep-tidien muodostamasta ryhmästä, joita edustavat kaavat, kirjoitettuna vasemmalta oikealle ja suunnassa aminopäästä kar-boksipäähän, (i) Leu-Ser-Ala-Met-Ser-Thr-Thr-Asp-Leu-Glu-Ala-Tyr-Phe-Lys-Asp; (ii) Leu-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu-Gly-Gly-Glu-Ile-Arg-Leu-Lys-Val; sekä (iii) Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr-Ser-Ala, ja joka polypeptidi sisältää alle noin 40 aminohappotähdettä, 80 86585 b) mainittu kiinteä kantaja sekoitetaan testattavaan nestemäiseen ruumiin näytteeseen, jolloin muodostuu kiinteä ja nestemäinen faasi; c) mainittua seosta seisotetaan niin kauan, että ruumiin näytteessä läsnäolevat anti-HBxAg-vasta-aineet ehtivät im-munoreagoida mainitussa kiinteässä kantajassa olevien antigeenien kanssa; ja d) mainitun immunoreaktion läsnäolo ilmaistaan indikaattorin avulla.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu antigeeni on polypeptidi, jonka molekyyli-paino on suurin piirtein 24 000 daltonia ja joka saadaan ilmentymään, kun soluja transfektoidaan kantakokoelman ATCC vektorilla, jonka tunnusnumero on 40102.
7. Förfarande enligt patentkravet 6, kännetecknat av att antigenen utgöres av polypeptiden med en molekylvikt av ca 24 000 dalton som uttryckes genom transfektion av celler med vektorn med ATCC-tillgänglighetsnumret 40102.
FI854395A 1984-03-08 1985-11-07 Kompositioner och foerfarande foer av bestaemning hbxag:s naervaro. FI86585C (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US58757084A 1984-03-08 1984-03-08
US58757084 1984-03-08
US64814284 1984-09-07
US06/648,142 US4777240A (en) 1984-03-08 1984-09-07 SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker
US8500359 1985-03-06
PCT/US1985/000359 WO1985003950A1 (en) 1984-03-08 1985-03-06 A sv40 expression vector containing hbxag as an expression marker

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI854395A FI854395A (fi) 1985-11-07
FI854395A0 FI854395A0 (fi) 1985-11-07
FI86585B FI86585B (fi) 1992-05-29
FI86585C true FI86585C (fi) 1992-09-10

Family

ID=27080076

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI854395A FI86585C (fi) 1984-03-08 1985-11-07 Kompositioner och foerfarande foer av bestaemning hbxag:s naervaro.

Country Status (13)

Country Link
US (3) US4777240A (fi)
EP (1) EP0155147B1 (fi)
JP (1) JPH0832721B2 (fi)
AT (1) ATE59185T1 (fi)
AU (1) AU594642B2 (fi)
CA (1) CA1340732C (fi)
DE (1) DE3580927D1 (fi)
DK (1) DK175364B1 (fi)
FI (1) FI86585C (fi)
IL (1) IL74544A (fi)
NO (1) NO172394C (fi)
NZ (1) NZ211357A (fi)
WO (1) WO1985003950A1 (fi)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4942125A (en) * 1984-09-07 1990-07-17 Scripps Clinic And Research Foundation SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker
US4777240A (en) * 1984-03-08 1988-10-11 Scripps Clinic And Research Foundation SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker
AU599348B2 (en) * 1985-12-18 1990-07-19 Microgenesys, Inc. Method for producing selected polypeptides in virally infected insect cells and polypeptides isolated therefrom
US4816564A (en) * 1986-01-31 1989-03-28 Merck & Co., Inc. Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast
WO1988010300A1 (en) * 1987-06-22 1988-12-29 Medico Labs Ag Heterologous viral peptide particle immunogens
AU2913889A (en) * 1987-11-16 1989-06-14 Fox Chase Cancer Center Determination of anti-pol as an early marker of viral hepatitis infection
JPH0260589A (ja) * 1988-08-26 1990-03-01 Natl Sci Council バクテリオファージｍ１３の遺伝子□ｄ２プロモーターを使用した大腸菌中での外来タンパクの高レベル産生
US5650275A (en) * 1990-06-11 1997-07-22 Nexstar Pharmacueticals Inc Target detection method using spectroscopically detectable nucleic acid ligands
EP0491077A1 (en) * 1990-12-19 1992-06-24 Medeva Holdings B.V. A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
US6297048B1 (en) * 1992-02-04 2001-10-02 Chiron Corporation Hepatitis therapeutics
US5378605A (en) * 1993-06-08 1995-01-03 Thomas Jefferson University Method of detecting hepatitis B variants having deletions within the X region of the virus genome
US5872206A (en) * 1994-10-06 1999-02-16 The General Hospital Corporation Compositions and methods for interfering wtih hepatitis B virus infection
JP2002509157A (ja) * 1998-01-19 2002-03-26 モガン バイオテクノロジー リサーチ インスティチュート Ｂ型肝炎ウイルスのｘプロテインに由来するペプチド抗原を含むリポソーム
AU2480799A (en) * 1998-01-29 1999-08-16 Thomas Jefferson University Molecular markers for diagnosing hepatocellular carcinoma
US6638903B2 (en) 2002-01-15 2003-10-28 Milliken & Company Non-staining red colorants and liquid fabric softener formulations comprising such non-staining colorants
US6593289B1 (en) 2002-01-15 2003-07-15 Milliken & Co. Liquid fabric softener formulations comprising hemicyanine red colorants
EP1774625B1 (en) 2004-07-13 2014-06-25 Panduit Corporation Communications connector with flexible printed circuit board
ATE537586T1 (de) 2005-07-15 2011-12-15 Panduit Corp Kommunikationsverbinder mit einer vorrichtung zur kompensation von uebersprechen
WO2007110098A1 (en) * 2006-03-29 2007-10-04 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale HBx PEPTIDES, CAPABLE OF ELICITING A PROMISCUOUS IMMUNODOMINANT CD4+ RESPONSE DIRECTED AGAINST HBV
NZ586074A (en) * 2010-06-10 2013-07-26 Auckland Uniservices Ltd LCLRP peptides, constructs and uses thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) * 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
US4415491A (en) * 1980-01-14 1983-11-15 The Regents Of The University Of California Synthetic vaccine peptide epitomes of hepatitis B surface antigen
US4338397A (en) 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
FI83662C (fi) * 1980-07-17 1991-08-12 Scripps Clinic Res Diagnostik antikropp och foerfarande foer dess framstaellning.
ZW18282A1 (en) * 1981-08-31 1983-03-23 Genentech Inc Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture
US4442205A (en) * 1981-09-22 1984-04-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Simian virus recombinant that directs the synthesis of hepatitis B surface antigen
US4459359A (en) * 1981-11-19 1984-07-10 New York Blood Center, Inc. Sensitive immunoassays of antigens or antibodies sequestered within immune complexes
JPS5936698A (ja) * 1982-08-20 1984-02-28 Science & Tech Agency Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞
US4777240A (en) * 1984-03-08 1988-10-11 Scripps Clinic And Research Foundation SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker
US4942125A (en) * 1984-09-07 1990-07-17 Scripps Clinic And Research Foundation SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen

Also Published As

Publication number Publication date
FI854395A (fi) 1985-11-07
FI854395A0 (fi) 1985-11-07
US5534405A (en) 1996-07-09
IL74544A (en) 1994-11-11
CA1340732C (en) 1999-09-14
EP0155147A2 (en) 1985-09-18
NZ211357A (en) 1988-08-30
IL74544A0 (en) 1985-06-30
US5183734A (en) 1993-02-02
FI86585B (fi) 1992-05-29
DK175364B1 (da) 2004-09-13
JPS61502094A (ja) 1986-09-25
EP0155147A3 (en) 1985-11-06
NO172394B (no) 1993-04-05
NO854448L (no) 1986-01-06
AU4067285A (en) 1985-09-24
JPH0832721B2 (ja) 1996-03-29
DE3580927D1 (de) 1991-01-31
NO172394C (no) 1993-07-14
AU594642B2 (en) 1990-03-15
DK516585D0 (da) 1985-11-08
EP0155147B1 (en) 1990-12-19
WO1985003950A1 (en) 1985-09-12
DK516585A (da) 1985-11-08
US4777240A (en) 1988-10-11
ATE59185T1 (de) 1991-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI86585C (fi) Kompositioner och foerfarande foer av bestaemning hbxag:s naervaro.
Moriarty et al. Antibodies to peptides detect new hepatitis B antigen: serological correlation with hepatocellular carcinoma
Neurath et al. Hepatitis B virus contains pre-S gene-encoded domains
Gerin et al. Chemically synthesized peptides of hepatitis B surface antigen duplicate the d/y specificities and induce subtype-specific antibodies in chimpanzees.
CA2162132C (en) Hepatitis b virus mutants, reagents and methods for detection
JPS62502704A (ja) 立体配座−独立並びに立体配座依存決定基を有するタンパク抗原
US7393933B1 (en) Hepatitis B monoclonal antibodies
AU628156B2 (en) Monoclonal antibodies to pres2 and pres1 polypeptides of the hepatitis b viral envelope
JP2002506419A (ja) Ａ型肝炎ウイルスポリタンパク質の抗原反応性領域
US4803156A (en) Peptide-beta-lactamase conjugates for enzyme-linked immunoassays
Steward et al. Immunity to hepatitis B: analysis of antibody and cellular responses in recipients of a plasma-derived vaccine using synthetic peptides mimicking S and pre-S regions.
US4942125A (en) SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker
Fiordalisi et al. Analysis of the hepatitis B virus genome and immune response in HBsAg, anti-HBs positive chronic hepatitis
JPH0940694A (ja) 肝炎ｇｂウイルスの合成ペプチド及びその使用
EP0082789B1 (en) Immunological composition and method for hepatitis b virus
NO177310B (no) Antigent polypeptid fra HBxAg, antistoff som reagerer med polypeptidet, diagnostisk analysesystem for bestemmelse av tilstedeværelsen av HBxAg i en kroppspröve, samt anvendelse av polypeptidet til in vitro diagnose
FI95726B (fi) Diagnostiset menetelmät ja määrityssarjat, joissa käytetään yhdistelmä-DNA-tekniikalla muodostettua hepatitis B -viruksen pinta-antigeenia
Ijaz Production and use of monoclonal antibodies against a conserved epitope of hepatitis B surface antigen
Persing Identification and characterization of the presurface proteins of hepatitis B virus
Clayton Investigations into the surface antigens of Hepatitis B Virus

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Owner name: SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION

MA Patent expired