NO172394B

NO172394B - Antigent, syntetisk polypeptid, anvendelse derav til in vitro diagnose, vannopploeselig eller vanndisperbar antigen polymer, reseptormolekyl og diagnostisk proevesystem for bestemmelse av tilstedevaerelse av hbxag i en kroppsvaeske

Info

Publication number: NO172394B
Application number: NO85854448A
Authority: NO
Inventors: Ann M Moriarty; Hannah Alexander; Richard A Lerner
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1984-03-08
Filing date: 1985-11-07
Publication date: 1993-04-05
Also published as: DK516585A; ATE59185T1; WO1985003950A1; AU594642B2; EP0155147B1; FI86585C; DE3580927D1; FI854395A; AU4067285A; DK516585D0; NO854448L; FI86585B; FI854395A0; US4777240A; DK175364B1; IL74544A; NO172394C; CA1340732C; JPH0832721B2; EP0155147A2

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse vedrører antigent, syntetisk polypeptid, anvendelse derav til in vitro diagnose, vann-oppløselig eller vanndispergerbar, antigen polymer, reseptormolekyl og diagnostisk prøvesystem for bestemmelse av tilstedeværelse av HBxAg i en kroppsvæske.

Teknikkens stand

A. Kloning og vektorer

Innføringen av eksogen DNA i eukaryote celler er blitt

et av de mest virkningsÉulIe redskaper for molekylærbiologen. Denne fremgangsmåten krever virksom avlevering av DNA i

kjernen til mottagercellen og derpå følgende identifikasjon av celler som uttrykker den fremmede DNA.

Konstruerte vektorer som f.eks. plasmider eller bakterio-fager (fager) eller andre DNA-sekvenser som er i stand til å replikere i en vertcelle kan brukes for å konstruere celler som virker som fabrikker ved at de produserer store mengder spesifikke virusproteiner. Rekombinante plasmider vil her bli brukt som eksempler på vektorer, også kalt kloningsred-skaper. Se US patentskrift nr. 4 338 397.

Plasmider er ekstrakromosomale genetiske elementer

som finnes i en lang rekke bakteriearter. De er vanligvis dobbeltkjedede, lukkede, ringformede DNA-molekyler. Det mest utbredt brukte plasmid er pBR322, en vektor hvis nukleotid-sekvens og endonukleasespaltningsposisjoner er velkjente.

Nukleinsyreproduksjon under anvendelse av plasmid-

eller fagvektorer er blitt svært enkel. Plasmidet eller fag-

DNA spaltes med en restriksjonsendonuklease og knyttes in

vitro til en utvalgt fremmed DNA. Det resulterende rekombinante plasmid eller fag innføres så i en celle som f.eks.

E. Coli og den således produserte celle induseres slik at

den fremstiller mange kopier av den konstruerte vektor. Så

snart en tilstrekkelig mengde DNA er produsert ved hjelp av kloningsvektoren, "skjæres" den fremmede DNA ut og plasseres i en andre vektor for å produsere eller transkribere pro-

teinet eller polypeptidet som det fremmede genet koder for.

Avhengig av den anvendte DNA (intakt gen, cDNA eller bakteriegen), kan det være nødvendig å tilveiebringe eukaryote transkripsjons- og translasjonssignaler for å styre ekspresjon i rnottagerceller. Disse signaler kan tilveiebringes ved å kombinere den fremmede DNA in vitro med en ekspresjonsvektor.

Ekspresjonsvektorer inneholder sekvenser av DNA som kreves for transkripsjonen av klonede gener og transla-sjonen av deres budbringer-RNA-er .(mRNA-er) til proteiner. Slike påkrevde sekvenser eller kontrollelementer er vanligvis: (1) en promoter som signaliserer startpunktet for transkripsjon, (2) en terminator som signaliserer endepunktet for transkripsjon, (3) en operator som regulerer promoteren, (4) et ribosombindende sete for den første binding av cellenes proteinsyntesemaskineri og (5) start- og stoppkodoner som signaliserer begynnelsen og slutten på proteinsyntese.

For å kunne brukes, bør en ekspresjonsvektor ha flere ytterligere egenskaper. Den bør være forholdsvis liten og inneholde en sterk promoter. Ekspresjonsvektoren bør

én eller flere selekterbare markører for å .muliggjøre tifikasjon av transformanter. Den bør også inneholde et gjenkjenningssete for ett eller flere restriksjonsenzymer i områder av vektoren som ikke er av vesentlig betydning for ekspresjon.

Konstruksjonen av ekspresjonsvektorer er derfor et komplisert og noe uforutsigelig foretagende. Den eneste på-litelige prøve på effektiviteten til en ekspresjonsvektor er å måle initieringshyppigheten for syntesen av vedkommende mRNA. Kvantifisering av mRNA er imidlertid omstendelig og det er ofte vanskelig å oppnå nøyaktige målinger. Det er derfor blitt utviklet andre, mer praktiske måter for å påvise transformasjon.

En slik måte har vært å overvåke syntese av fremmede proteiner i transformerte celler med enzymatiske prøver. Flere markørgener er blitt utviklet for å indikere at transformasjon har inntruffet.

En annen måte som har vært brukt for å overvåke transformasjon på, omfatter bruken av immunologiske reagenser. Dersom nivået av uttrykt protein er tilstrekkelig høyt, så kan cytoplasmatisk eller overflate-immunofluorescens med et antistoff konjugert til et fluorescerende fargestoff som f.eks. fluorescein eller rhodamin, brukes til å påvise vektor-spesifikke proteinekspresjonsprodukter.

Mer vanlig er det at transformerte celler dyrkes i nærvær av radioaktivitet etter immunoutfelling. Ved denne fremgangsmåte har det vært brukt Staphyloccocus aureus protein A seleksjon av immunkomplekser [Kessler, (1975),

J. Immunol., 115:1617-1624] og "Western blotting"-fremgangsmåten [Renart et al., (1979), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76:3116:3120] for å påvise transformasjonsspesifikke mar-kører.

Analyse av genekspresjon ved å bruke apevirus 40

(SV4 0) vektorer er langt den mest utforskede eukaryote trans-formasjonsteknikk på det biologiske og immunkjemiske nivå. Genetisk og biokjemisk informasjon vedrørende organisasjonen av SV40-genomet er blitt fastslått eller bekreftet ved hjelp av nukleotidsekvensen til virusgenomet. Se oversikt i Molecular Biology of Tumor Viruses, 2. utg., del 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Utformingen av forskjellige SV4 0 vektormolekyler har vært avhengig av den nøyaktige kartlegging av genetiske signaler og bruken av restriksjonsendonukleaser for isoleringen av definerte fragmenter fra SV4 0-genomet.

SV40 ble opprinnelig utviklet som en eukaryot-trans-duserende vektor ved å bruke et lytisk system. Mulligan et al.,

(1929), Nature ( London), 277:108-114. Deretter ble transformerende (ikke-lytiske) vektorer konstruert med isolerte segmenter fra SV40-genomet. Se oversikt av Elder et al.,

(1981), Annu. Rev. Genet., 15:295:340.

Hamer et al. var de første til å foreslå at SV40

kunne brukes til å klone genet som det ikke var tilgjengelig noen probe for. De foreslo at dobbeltkjedede cDNA-kopier fra en heterogen mRNA-populasjon kunne "skytes" inn i en SV40-vektor, og at virus som bar den ønskede sekvens kunne identifiseres ved å bruke et radioaktivt eller fluorescerende antistoff.

Hamer et al. rapporterte først konstruksjonen av en SV4 0 rekombinant ekspresjonsvektor som inneholdt en ekspre-sjonsmarkør, i 1979. Hamer et al., (1979), Cell, 17:725-735. Deres SV40-vektor inneholdt virus-DNA-sekvensene fra BamHI endonukleaserestriksjonssetet ved 0,14 kartenheter, og med urviserne til Haell restriksjonssetet ved 0,28 kartenheter.

I tillegg til hele det tidlige gen A og opprinnelsesstedet

for virus-DNA-replikasjon, inneholdt vektoren den virale promoter, leder, mellomliggende sekvens, 5'-delen av hoved-molekylet og de 3'-terminale sekvenser for den virale siste 195 mRNA. Den inneholdt ikke 1660 basepar (pb) av sekvenser fra siste område som koder for virusproteinet UPI, 2 og 3. Priers et al., (1978), Nature, 273:113:120 og Reddy et al.,

(1978), Science, 200:494:502.

Gensekvenser som koder for kanin-(3-globin ble ligert

inn i den ovenfor nevnte vektor som en ekspresjonsmarkør. For å bestemme hvorvidt kanin-3-globin ble syntetisert i ape-celler infisert med den rekombinante vektor, brukte Hamer et al., supra, en radioimmunologisk prøve som er i stand til å påvise så lite som 1,0 nanogram globin.

Selv om Hamer et al. var i stand til å påvise posi-

tive bevis for fi-globin-ekspresjon, ga de uttrykk for flere reservasjoner med hensyn til anvendeligheten av det rekombinante SV40-3-globin-systemet. Ettersom globin bare er lite oppløselig, kan for det første betydelige tap ha oppstått under fremstillingen av prøver for måling. Bestemmelsen av globinmengden i de infiserte cellene kan således være be-heftet med så store feil som 10 x mengden. For det annet kan prøven ikke skjelne mellom autentisk globin og andre immunologisk beslektede produkter som f.eks. "read-through" protein eller polypeptidfragmenter.

En faktor som Hamer et al. ikke ga seg i kast med,

er den store graden av homologi mellom alle eukaryote glo-biner. Denne homologi gjør det vanskelig å skjelne vektor-indusert globinekspresjon fra globin som er endogen for vertcellesystemet.

B. Hepatitt B viruspeptider og anti- polypeptid- antistoffer

Hepatitt-virusene er markert forskjellige agenser. De kan grupperes strikt i kraft av det "mål"-organ som de påvirker, leveren. Selv om en rekke virus påvirker leveren som en del av systemiske infeksjoner, er det med uttrykket "hepatitt-viruser" vanligvis ment type A (HAV), type B (HBV) og ikke-A-, ikke-B-agensene. Blant de tre typer virus er HBV langt det mest utforskede på det biologiske, immunokjemiske og kliniske plan.

HBV klassifiseres som et DNA-virus og adskiller seg

i mange henseender fra alle andre familier av DNA-virus.

HBV er sammensatt av en ytre kappe (mer solid enn en membran eller et hylster) bestående av protein, lipid og carbohydrat, og som bærer et unikt antigenkompleks, dvs. hepatitt B overflateantigenet (HBsAg). Det inneholder også et indre nukleo-kapsid med en antigenspesifisitet som er forskjellig fra overflateantigenet, dvs. hepatitt B kjerneantigen (HBcAg).

Man kjenner også til et oppløselig antigen, HBeAg, innen teknikken. Dette antigen antas å bestå av HBcAg-polypeptider som ikke er sammensatt til HBV-kjerner, og følgelig har en unik antigenspesifisitet i den ikke-sammensatte tilstand .

I typiske selvbgrensende akutte HBV-infeksjoner opptrer de følgende serologiske markører ved jevne mellomrom i serum hos en infisert vert: HBaAg, HBeAg, anti-HBC, anti HBE og anti-HBS. Tilsynekomsten av anti-HBE signaliserer det ende-lige tap av påvisbar HBsAg. Dette skjer i alle tilfeller med selvbegrensende akutt HBV-infeksjon. Etter at HBS er forsvunnet er det en forsinkelse fra noen få uker til flere måneder før anti-HBS kommer til syne.

Under kronisk HBV-infeksjon er HBsAg og anti-HBS til stede. Vertens serum kan oppvise enten den serologiske markør HBeAg eller den serologiske markør anti-HBE, dvs. pasienten kan enten være HBeAg- eller anti-HBE-positiv.

Følsomme og spesifikke radioimmunoprøver og enzym-immunprøver for flere av HBV-markørene er i utstrakt bruk. Disse svært følsomme serologiske prøver har gitt et grunnlag for å overvåke fremkomsten av virus og immunresponsmarkører under en HBV-infeksjon.

I løpet av de siste få årene har mange undersøkelser indikert at hver serologisk markør står for spesifikke virus-arrangementer som gir vertresponser under HBV-replikasjon. Profilen til de serologiske markører på forskjellige trinn under det kliniske forløp av sykdom kan således gi nyttig diagnostisk og prognostisk informasjon.

Forbindelsen mellom hepatitt B virus og human hepato-cellulær carcinom (HCC), leverkreft, er grundig undersøkt og seroepidemiologiske såvel som histopatologiske funn antyder sterkt at HBV er direkte eller indirekte involvert i etiologien til leverkreft. Et antall hepatom-cellelinjer er blitt avledet fra human HCC og påvisning av HBV-spesifikk DNA integrert i genomet til to slike cellelinjer, PLC/PRF/5

og EPH3B er rapportert. I disse cellelinjene er imidlertid bare hepatitt B overflateantigenet blitt uttrykt i vevkultur som et virusspesifikt genprodukt. Andre HBV-markører som f.eks. hepatitt B kjerneantigen, hepatitt BE antigen og en DNA-polymerase er ikke blitt påvist.

Noen DNA-tumorvirus fra dyr kan gi transformasjon gjennom virkningen av virusgener som regulerer replikasjonen og integrasjonen av virusgenomet, og celler transformert med slike virus kan bære et T-(tumor) eller neo-(nytt) antigen uttrykt ved hjelp av de transformerende gener. Nyere bevis for et antigen som er analogt med T-antigen, er oppnådd i humane hepatom-celler som inneholder integrerte HBV-gener,

ved å bruke anti-komplement-immunofluorescens-fargings-teknikken. Dette antigen er blitt betegnet HBV-forbundet nukleært antigen (HBNA). Wen et al., (1983) Infect. Immun., 39:1361-1367.

HBNA ble påvist i sera fra flere HBsAg-positive HCC-pasienter og ekspresjon av antigenet ble demonstrert i både cellekultur og tumorvev. I tillegg ble anti-HBNA-antistoffer funnet i seraene fra noen HbsAg-positive pasienter med HCC. HBNA kan utgjøre den tidligere ikke-erkjente ekspresjon av et HBV-gen.

I 1979 rapporterte Galibert et al., Nature, 281:646:650 nukleotidsekvensen til HBV-genomet, et ringformet DNA-

molekyl med ca. 3200 baser som er dels dobbelt- og dels enkelt-kjedet, et trekk som er unikt blant virus. Den lange kjeden, eller L-kjeden, (fullstendig ringformet) til genomet ble funnet å inneholde fire avlesningsrammer som er store nok til å svare for virusproteiner. Disse områder ble kalt S, C,

P og X, og er skjematisk vist i fig. 1.

Det er funnet at områdene S og C inneholder genene for henholdsvis HBsAg og HBeAg. Område P antas å kode for et protein som tilsvarer en DNA-polymerase i størrelse og inn-hold av aminosyrerester. Område X ble postulert av Wen et al., supra, å være en av de sannsynlige kilder for genet som koder for HBNA.

Den bare foreløpige fastsettelse av funksjoner for genene i områdene P og X demonstrerer det tomrommet som fortsatt eksisterer når det gjelder forståelsen av den genetiske organisasjon og molekylære biologi hos HBV. En grunn for dette tomrom har vært fraværet av et in vitro system for formering av viruset.

Inntil nylig var den eneste kilde for HBV pasienters serum. De feilslåtte forsøk på å dyrke viruset i cellekultur er et resultat av dets svært snevre vertcelleområde.

En måte å gripe problemet med å produsere HBV-DNA og dets genprodukter an på, har vært å bruke rekombinant DNA-teknikk. Denne teknikk muliggjør storskalaproduksjon av nukleinsyresekvensene som koder for et bestemt virusprotein.

Tiollais et al., (1981), Science, 213:406-411 rapporterte transformasjon av E. coli med pBr322 som inneholdt genet som koder for HBsAg, og rapporterte produksjon av betydelige mengder fra det isolerte genet. Disse forskerne ønsket også å undersøke HBsAg-genets lokalisering innenfor HBV-genomet, og faktorene som påvirket dets ekspresjon til protein. For å gjøre dette konstruerte de ekspresjonsvektorer som inneholdt HbsAg-genet for bruk både i bakterie- og pattedyrceller.

En av ekspresjonsvektorene konstruert av Tiollais et al., supra, ga biosyntese av et protein i E. coli som inneholdt HbsAg antigene determinanter. Den ble bygd opp ved å innføre

en del av genet som koder for HBsAg i bakteriofag plac5-lUV5 for å bevare avlesningsrammen til naturlig HBV.

For å undersøke ekspresjon av HBV-gen i pattedyrceller konstruerte Tiollais et al., supra, en serie HbsAg-ekspre-sjonsplasmider ved å innføye transfeksjonselementer på forskjellige steder i det hele HBV-genom. Transfeksjonselementene lot det hele HBV-genom bli integrert i flere forskjellige orienteringer i genomet fra museceller transformert med vektoren. Ved å lage vektorene på denne måte forsøkte disse forskerne

å bruke HBVs naturlig forekommende genetiske kontrollele-

menter.

Bare tre av de seks ekspresjonsvektorer rapportert av Tiollais et al., supra, ga ekspresjon av det ønskede HBsAg-protein. Produksjon av dette ble påvist ved å teste med hensyn på dets tilstedeværelse i vevdyrkningsvæsker ved å bruke anti-HbsAg-antiserum fra sau. De øvrige virusmarkører som var kjent på tidspunktet for undersøkelsen (dvs. HBsAg, HBeAg og DNA-polymerase), ble ikke påvist i de transformerte celler.

På tidspunktet for den ovenfor nevnte undersøkelse utført av Tiollais et al. var den mulige eksistens av område X kjent, det samme var muligheten for at den kunne kode for et HBV-protein. Dvs. at det var kjent at HBV-genomet hadde kapasitet til å kode for flere proteiner enn det som tidligere var blitt forbundet med viruset.

Dette problem er blitt kalt genotype på leting etter fenotype. Det er blant annet dette problem som Wen et al., supra, beskjeftiget seg med når de postulerte at område X inneholder genet som koder for HBNA.

Før de ovenfor nevnte undersøkelser utført av Tiollais et al. og Wen et al., demonstrerte Sutcliffe et al., (1980) Nature, 287:801-805, blant annet en generell teknikk for å løse dette problem. De syntetiserte kjemisk et polypeptid omfattet av proteinet som var forutsagt av nukleotidsekvensen til et virusgen med et proteinprodukt som var ukjent. Det ble frembragt antistoffer mot polypeptidet og disse ble omsatt med alle proteinene laget av celler infisert med viruset.

Ved å bruke antistoffer mot deler av et forutsagt protein, påviste Sutcliffe et al. et tidligere ukjent og ikke gjenkjent virusproteinprodukt.

Hittil har bruken av denne eller en annen teknikk for utvetydig å identifisere proteinproduktet til HBV-genom-område X ikke vært rapportert. Dette kan skyldes at mens det generelle konsept for å fremstille syntetiske antigener og bruke dem til å indusere antistoffer med på forhånd bestemt spesifisitet har vært beskrevet, gjenstår det et stort område innenfor denne teknikken som fortsetter med å unndra seg for-utsigbarhet.

Grunnene for dette er flere. For det første er rekke-følgene av aminosyrerester i proteiner utledet fra en genetisk sekvens av en hypotetisk natur med mindre nukleotid-sekvensens avlesningsramme er sikkert fastslått, noe som skyldes den overflødighet som er innebygget i den genetiske kode.

For det andre induserer et syntetisk antigen ikke nød-vendigvis antistoffer som reagerer immunologisk med det intakte protein i dets naturlige miljø. For det tredje reagerer en verts naturlige antistoffer mot et immunogen sjeldent immunologisk med et polypeptid som svarer til en kort, rettkjedet del av immunogenets aminosyresekvens.

Kort oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører flere aspekter.

Et aspekt er et antigent, syntetisk polypeptid. Det syntetiske polypeptid er kjennetegnet ved at det inneholder opptil 40 aminosyrerester som i aminosyrerestrekkefølge svarer til en antigen determinant i HBxAg, hvor polypeptidet omfatter en aminosyrerestsekvens valgt fra gruppen av polypeptidsekvenser representert ved formlene skrevet fra venstre mot høyre og i retning fra aminoende til carboxylende:

En vannoppløselig eller vanndispergerbar, antigen polymer er også omfattet av oppfinnelsen. Polymeren er kjennetegnet ved at den inneholder et stort antall sammen-føyde, syntetiske, repeterende polypeptidenheter bundet sammen ved hjelp av oxyderte cysteinrester, hvor de repeterende enheter er representert ved en formel skrevet fra venstre mot høyre i retning fra aminoende til carboxylende som er valgt fra gruppen bestående av:

hvor hver av R<1> og R<2> er en cysteinrest, med den betingelse at bare én av R<1> og R<2> er til stede.

Reseptormolekyler er også omfattet av oppfinnelsen. Reseptormolekylene er kjennetegnet ved at de omfatter et antistoffbindende sete som er i stand til å reagere immunologisk med et antigent, syntetisk polypeptid som inneholder opptil 40 aminosyrerester valgt fra gruppen bestående av polypeptidsekvenser representert ved formlene skrevet fra venstre mot høyre og i retning fra aminoende til carboxylende:

Et diagnostisk prøvesystem for bestemmelse av tilstedeværelse av HBxAg i en kroppsprøve er også omfattet av oppfinnelsen. Dette system er kjennetegnet ved at det omfatter minst én beholder med et første reagens, idet det første reagens omfatter reseptormolekyler som omfatter et antistoff bindende sete som er i stand til å reagere immunologisk med HBxAg og med et antigent, syntetisk polypeptid ifølge krav 1. Dette system kan videre omfatte et andre reagens i en andre beholder, idet dette andre reagenset er det antigene, syntetiske polypeptidet som reseptormolekylene immunreagerer med.

Anvendelse av et antigent, syntetisk polypeptid ifølge krav 1 til in vitro diagnose utgjør et ytter-

ligere aspekt ifølge oppfinnelsen. Her blandes proteiner fra en kroppsprøve som skal undersøkes med hensyn på tilstedeværelsen av en påvisbar mengde HBxAg, med de ovenfor angitte reseptormolekyler i nærvær av et indikasjonsmiddel for signalisering av en immunreaksjon mellom reseptorene og HBxAg. Sammenblandingen får pågå i en tilstrekkelig lang tid til at indikasjonsmidlet kan få signalisert at en immunreaksjon har inntrådt. Tilstedeværelsen av dette signalet kon-stateres så.

Kort beskrivelse av tegningene

Figurene som utgjør en del av beskrivelsen av foreliggende oppfinnelse: Fig. 1 er et skjematisk diagram som viser den fysiske struktur og genetiske organisasjon av HBV/adw-genomet fra Tiollais et al. (1981), Science, 213:406-411 modifisert av Ono et al. (1983), N. A. R., 11:1747-1757. 5'-enden av den lange (L) kjeden er rapportert å være baseparet med 5'-enden av den korte (S) kjeden. Visse restriksjonsseter angitt ved hjelp av piler knyttet til buer og forkortelsen for restriksjonsendonukleasen svarer til det fysiske kartet over HBV/adw-genomet analysert av Ono et al., supra. De brede pilene som omgir genomet svarer til de fire store, åpne områdene i L-kjeden. Disse fire potensielt kodende områder er betegnet S, P, X og C. Antallet aminosyrerester i parenteser (aa) som følger etter hver av de fire angitte områder, svarer til lengden av det hypotetiske polypeptidet som kodes for av hvert område. De to områdene som svarer til de definerte gener S og C, er angitt ved hjelp av prikkede områder innenfor de brede pilene. Det enkle EcoRI endonukleasespaltings-

stedet er brukt som startpunkt i kartet.

Fig. 2 illustrerer skjematisk et SV40 DNA-restrik-sjonskart fremstilt ut fra den primære sekvensen publisert av Reddy et al.., (1978), Science, 200:494-501 og modifisert av Van Heuverswyn and Fiers (1979), Eur. J. Biochem.,

100:51-60. Fig. 3 illustrerer skjematisk et plasmid pBR322 re-striksjonskart fremstilt ut fra primærsekvensdata ifølge Sutcliffe (1979) , Cold Spring Harbor Symposium on Quanti-tative Biology 43, 77.

Fig. 4 illustrerer skjematisk fremgangsmåten beskrevet

i avsnittet vedrørende materialer og metoder nedenunder som ble brukt for å innføye DNA-fragmenter i vektorer ifølge oppfinnelsen fremstilt fra AM6 (bølgelinjer), pBR322 (hel-trukne linjer) og SV40 (prikkede linjer) for å fremstille kloningsvektoren SVAM191 og deretter ekspresjonsvektoren SVHBV-3 som uttrykker en vesentlig del av HBxAg. Relative posisjoner for restriksjonsendonukleaseseter for BamHI ,

EcoRI og Haell er illustrert ved hjelp av henholdsvis lukkede ringer, åpne ringer og lukkede trekanter. Begynnelsespunktet (ori) og den første og den siste promoteren i SV40-genomet er også angitt.

Fig. 5 avbilder en rettkjedet del av den rekombinante SVHBV-3 ekspresjonsvektor som inneholder genene for den siste SV40-promoteren, de 99 aminosyrerestene i aminoenden (99aa)

og en vesentlig polypeptiddel (132aa, 132 av 154 aminosyrerester) av HBxAg-gensekvensen som koder for de 132 aminosyrerestene i carboxylenden. mRNA-raolekylet for VP2 HBxAg-fusjonsproteinet uttrykt ved hjelp av vektoren .er også avbildet.

Fig. 6 illustrerer den translaterte aminosyrerestsekvens vist fra venstre mot høyre og i retningen fra.aminoende til carboxylende i genet som koder for HBxAg. Den vesentlige del av HBxAg uttrykt ved hjelp av SVBHV-3 er illustrert ved hjelp av pilen ved aminosyrerestposisjon 23 (Ala), som er amino-enderesten i det uttrykte HBxAg-polypeptidet. De relative posisjoner til de syntetiske polypeptider betegnet 99, 100

og 142 ifølge foreliggende oppfinnelse i HbxAg-sekvensen er illustrert ved hjelp av de tre merkede, understrekede aminosyrer estsekvensene. Aminosyrerestsekvensen til syntetisk

polypeptid 99 svarer derfor til posisjonene fra 100 til 115 fra MET-resten i aminoenden vist i figuren, sekvensen til syntetisk polypeptid 100 svarer til posisjonene fra 115 til 131 fra Met-resten i aminoenden i figuren, og sekvensen til syntetisk polypeptid 142 svarer i sekvens til posisjonene fra 144 til 154 fra Met-resten i aminoenden i figuren, dvs.

de elleve carboxylenderestene.

Fig. 7 er et fotografi av et autoradiogram som viser reaktiviteten til anti-X-antisera med to cellelysater av human-hepatom. To cellelinjer av human-hepatom, PLC/PRF/5

og HepG2 ble dyrket i "Dulbecco's Modification of Eagle<1>s Medium" (DMEM) med 10% serum fra kalvefoster til nesten sammenflyting (dag 6 av en 1:5 andel fra en sammenflytende kultur). Supernatanter ble fjernet, flaskene som inneholdt monolagene ble plassert på is i 5 minutter før cellene ble samlet inn ved avskraping, og de innsamlede celler ble pellettert ved hjelp av sentrifugering. Cellepellets ble vasket med fosfatbufret saltoppløsning (PBS), hurtigfrosset ved -7 0°C og frysetørket over natten. De resulterende cellepulvere ble oppløst i PBS og bragt til en sluttkonsentra-

sjon på 2 mg pr. ml (mg/ml) i prøvebuffer. Prøvene ble kokt i 5 minutter og cellerester ble fjernet ved sentrifugering i en Beckman mikrosentrifuge i 30 minutter. 50 ug cellelysat ble inkubert i 15 minutter i RIPA-buffer [PBS, inneholdende 1% Nonidet P-40 (polyoxyethylen-(9)-octylfenylether, 0,05% natriumdeoxycholat og 0,1% SDS] og radioaktivt merket med

125 3 microCurie I ved hjelp av kloramin-T-reaksjonen til McConahey et al. (1966), Int. Arch. Allergy, 29:185-189.

1,5 x 10 g tellinger pr. minutt (tpm) av hver av de radioaktivt merkede hepatom-lysater ble omsatt med 10 ul anti-X-polypeptid i 60 minutter i RIPA. Antigen-antistoff-kompleksene (immunreaksjonsprodukter) ble utfelt med formalinfiksert Staphyloccocus aureus. Pelletene ble vasket en gang med RIPA og to ganger med 500 millimolar (mM) LiCl, 100 nM Tris (pH = 8,5), og ble analysert med hensyn på radioaktivitet. Alle pelletene ble oppløst i 40 pl prøvebuffer (0,0635 M Tris-HC1 (pH 6,8), 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-merkaptoethanol og 0,001% bromfenolblått, kokt i 3 minutter, sentrifugert ved

å fjerne cellerester og underkastet SDS-PAGE på følgende måte.

De radioaktivt merkede cellelysater ble fylt på de-naturerende natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-geler (12,5%)

(SDS-PAGE) og underkastet elektroforese ved å følge fremgangsmåtene til Laemmli, (1970), Nature, 297:680-685. Proteinene ble overført til nitrocelluloseark ved hjelp av elektroforese som beskrevet av Towbin et al. (1979), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76:4350-4354. Nitrocelluloseflekkene ble farget i amidsvart før inkubasjon ved 4°C over natten i BLOTTO [Johnson et al. (1983), J. Exp. Med., 159:1751-1756] for reduksjon av ikke-spesifikk binding. Nitrocellulosestrimler ble inkubert i 3 timer ved værelsetemperatur med en 1:350 fortynning av anti-polypeptid-antistoffer i et sluttvolum på 10 ml BLOTTO. Strimlene ble vasket i BLOTTO før

125

en 1 times inkubasjon med I-merket S. aureus protein A (10 cpm pr. 10 ml). Der hvor konkurranse med et polypeptid er angitt nedenunder ble anti-polypeptid-antisera inkubert med 100 fig polypeptid i 60 minutter før tilsetningen av det radioaktivt merkede antigen. Strimlene ble vasket som ovenfor, skylt med vann, tørket og autoradiografert. Feltene 1

og 5 ble omsatt med anti-polypeptid 99 antistoffer (anti-99), felt 2 ble omsatt med anti-99 preinkubert med polypeptid 99, felt 3 ble omsatt med anti-99 preinkubert med et ikke-beslektet polypeptid og felt 4 ble omsatt med en preimmun-serum-kontroll. Lysater fra HepG2-celler (felter 1-4) reagerte ikke med anti-polypeptid 99. Tallene i den venstre marg angir relative proteinmigreringsposisjoner. Piler i den høyre marg angir migreringsposisjonene til proteiner med molekylvekter på 28.000 og 45.000 dalton.

Fig.8 er et foto som viser reaktiviteten av anti-X-antiserum med levervev fra sjimpanser (C: felter 3 og 4) og fra menneske (H: felter 1 og 2). Leverutsnitt fra sjimpanser og mennesker ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og ble oppmalt til et fint pulver med en morter og støter. Cellepulvere ble oppløseliggjort i prøvebuffer og ble underkastet gelelektroforese og blottet som beskrevet for fig. 7. Nitrocellulosestrimler ble fremkalt med en 1:50 fortynning av antiserum som beskrevet i fig. 7, med to unntak: (1) 1% oppløs-ning av bovinserumalbumin (BSA) ble brukt i stedet for BLOTTO ved alle inkubasjoner og vaskinger, og(2) de antigenbundne antistoffer ble påvist med pepperrotperoxidase-konjugert geit-anti-kanin-IgG. Antigen-antistoff-immunreaksjonspro-duktene ble visualisert ved å dyppe strimlene i den følgende fremkallingsoppløsning. Fremkallingsoppløsningen ble fremstilt fra 50 ml TBS-buffer ved 37°C hvortil det ble tilsatt 250 Vil absolutt ethanol som inneholdt 8 mg 4-klor-l-nafthol og 330 ul 30% hydrogenperoxyd. Antiserum mot polypeptid 99 (anti-99) ble brukt i de to feltene til venstre, blokkert

og ikke-blokkert, mens antiserum mot polypeptid 142 (anti-142) ble brukt i de to feltene til høyre, blokkert og ikke-blokkert. Tallene på den venstre side av figuren illustrerer gelmigre-ringsposisjoner for proteiner med molekylvekter på henholdsvis 66, 45, 31, 21 og 14 kilodalton.

Fig. 9 er et fotografi av en"Southern blot"-analyse

av restriksjonsenzymspaltede lever-DNA-molekyler fra levervev hos menneske og sjimpanse som oppviste X-protein, ved å bruke hepatitt B virus (HBV) DNA som bindingsprobe. Total DNA ble ekstrahert fra cellepulvrene fremstilt fra prøvene beskrevet i fig. 8. 10 pg DNA ble fylt i hver brønn med en 1% agarosegel. Buffere for restriksjonsenzymnedbrytning var i henhold til produsenten (BRL). Alle spaltinger ble utført over natten ved 37°C med 50 enheter enzym (5 x DNA konsentrasjon i microgram). Feltene.1 - 3 viser sjimpanse A-243 lever-DNA spaltet med BamHI, EcoRI eller uspaltet, feltene 4-6 viser sjimpanse 344 lever-DNA spaltet med henholdsvis BamHI, EcoRI eller uspaltet, feltene 7-10 viser human og HBcAg-positiv lever-DNA kuttet med henholdsvis Hindlll, BamHI,

EcoRI eller uten spalting, og feltene 11 - 14 viser human HbsAg-negativ lever-DNA spaltet med henholdsvis Hindlll, BamHI, EcoRI eller uspaltet.

Fig. 10 er et fotografi av et autoradiogram som viser reaktiviteten til anti-X-polypeptid-antisera med et X-styrt genprodukt. Sammenflytende monolag av BSC-l-celler (2 x IO<7 >celler) ble infisert med det rekombinante SVHBV-3-viruset (en blanding av tsA23g og SVHBV-3- virioner eller vill-type SV40 [Moriarty et al. (1981), P roe. Nati. Acad. Sei. USA,

78:2606-2610]. Kulturene ble inkubert i serumfritt DMEM ved 40°C i 48 til 72 timer, på hvilket tidspunkt omtrent 50% cytopatisk effekt hadde oppstått. Supernatanter ble fjernet og kolbene som inneholdt monolagene ble plassert på is i 5 minutter før cellene ble samlet sammen ved avskraping.

De oppsamlede celler ble sentrifugert, og de resulterende cellepellets ble vasket med PBS, hurtigfrosset ved -70°C og frysetørket over natten. De resulterende cellepulvere ble oppløst i PBS og bragt til en sluttkonsentrasjon på 2 mg/ml i prøvebuffer. Prøvene ble kokt i 5 minutter og cellerester ble fjernet ved sentrifugering i en Beckman mikrosentrifuge i 30 minutter. 50 - 100 \ig cellelysat ble fylt på denatu-rerende polyacrylamidgeler (12,5%) og underkaset elektroforese som beskrevet tidligere. Proteinene ble elektroforetisk overført til nitrocelluloseark som beskrevet tidligere. Nitrocelluloseflekkene ble farget i amidosvart før inkubasjon ved 4°C over natten i BLOTTO for reduksjon av ikke-spesifikk binding. Nitrocellulosestrimler ble inkubert i 3 timer ved værelsetemperatur ved en 1:350 fortynning av anti-peptid-antistoffer i et sluttvolum på 10 ml BLOTTO. Strimlene ble

125

vasket i BLOTTO før en 1 times inkubasjon med L-merket S. aureus protein A (10 g cpm pr. 10 ml). Strimlene ble vasket som ovenfor, og skylt med vann, tørket og autoradiografert. 1 tilfeller hvor blokkering med polypeptid ble utført, ble antiseraene forinkubert med 100 ug polypeptidoppløsning over natten ved 4°C eller 2 timer ved 37°C før inkubasjon med nitrocellulosestrimlene. Molekylvekter var basert på lave molekylvektstandarder (BioRad), og er vist i venstre marg på figuren. Feltene 1 og 3 ble omsatt med henholdsvis anti-polypeptid 99 og anti-polypeptid 142 antistoffer. Feltene 2 og 4 ble omsatt med de samme antistoffene forinkubert med henholdsvis polypeptid 99 eller med polypeptid 142. Feltene

5 og 6 viser omsetningen av henholdsvis antipolypeptid 99

og 142 antistoffer med kontroll-cellelysater.

Foreliggende oppfinnelse har flere goder og fordeler. En av disse godene er at for første gang er tilstedeværelsen av HBxAg i en celle påvist.

Et annet gode er at oppfinnelsen gir en prøvemetode og

-system for påvisning av tilstedeværelsen av HBxAg i et kronisk

hepatitt B-infisert vertsdyr.

Nok et annet gode er at bruken av oppfinnelsen har muliggjort påvisningen av HBxAg i celler avledet fra human-hepatom, og derved styrket antagelsen av en forbindelse mellom hepatitt B virus og denne form for kreft.

En av fordelene ved oppfinnelsen er at den tilveiebringer midler for kloning av genet som koder for HBxAg.

En annen fordel ved oppfinnelsen er at den tilveiebringer midler for ekspresjon av en vesentlig polypeptiddel av HBxAg som kan brukes som et antigen i en diagnostisk prøve på tilstedeværelsen av antistoffer mot HBxAg (anti-X-antistoffer)

som er tilstede i serumet hos mennesket.

Nok en annen fordel ved oppfinnelsen er fremstillingen av et syntetisk polypeptid med aminosyrerestsekvens som svarer til sekvensen i en antigen determinant av HBxAg som kan brukes til å fremstille antistoffer som immunreagerer med HBxAg.såvel som med polypeptider som har en antigen determinant til felles med HBxAg.

Ytterligere goder og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil bli åpenbaret for fagfolk innen teknikken ut fra den detaljerte beskrivelse og kravene nedenunder.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Definisjoner

Transfeksjon; er ervervelsen av nye genetiske markører ved inkorporering av tilsatt DNA i eukaryote celler.

Transformasjon: er ervervelsen av nye genetiske mar-kører ved inkorporering av tilsatt DNA i prokaryote celler.

Kloningsvektor: er ethvert plasmid eller virus hvori det kan føyes inn en fremmed DNA som skal klones.

Plasmid: er en autonomt selvreplikerende, ekstrakromosomal ringformet DNA.

Åpen avlesningsramme: er en DNA-sekvens som er (potensielt) translaterbar til protein.

Hjelpe- virus:er et virus som tilveiebringer funksjoner som er fraværende i et defekt virus, og som gjør det mulig for det sistnevnte å fullføre infeksjonssyklusen under en blandet infeksjon.

Gen (Cistron): er DNA-segmentet som er involvert i produksjon av en polypeptidkjede, det omfatter områder som kommer foran og følger etter det kodende område (leder og tilhenger) såvel som mellomliggende sekvenser (introner) mellom individuelt kodende segmenter (exoner).

Ekspresjon: prosessen som et strukturelt gen gjennomgår for å produsere et polypeptid. Det er en kombinasjon av trans-skripsjon og translasjon.

Klon: betegner et stort antall identiske celler eller molekyler med en enkel opphavscelle eller et enkelt opphavs-molekyl.

Basepar (bp): er et makkerskap mellom adenin (A) og thymin (T), eller mellom cytosin (C) og guanin (G) i en DNA dobbelhelix.

Ekspresj onsvektor: er ethvert plasmid eller virus hvori det kan føyes.inn eller uttrykkes en fremmed DNA.

Nedstrøms: identifiserer sekvenser som følger senere ut i ekspresjonsretningen, f.eks. er det polypeptidkodende område for et gen nedstrøms for startkodonet.

A. Generell omtale

Område X i hepatitt B virus HBV-genomet er av interesse blant annet fordi nyere bevis indikerte muligheten for at det ble uttrykt, og tradisjonell HBV-serologi hadde ikke funnet dets proteinprodukt eller antistoffer mot et slikt produkt. Nylig utviklede teknikker med rekombinant DNA og syntetisk polypeptid er her brukt for å overvinne noen av de uheldige utfall man støtte på ved tradisjonelle metoder når det gjelder ekspresjonen av HBxAg, og for å illustrere ekspresjonen av HBxAg i celler fra humane hepatom-avledede cellelinjer og i leverceller fra sjimpanser og mennesker med en kronisk HBV-infeksjon.

For det formål vedrører foreliggende oppfinnelse antigene, syntetiske polypeptider som svarer til antigene determinanter i HBxAg, vannoppløselige eller vanndisperger-bare, antigene polymerer, reseptormolekyler, så vel som et diagnostisk prøvesystem for bestemmelse av tilstedeværelse av HBxAg i en kroppsprøve, samt anvendelse av et slikt antigent, syntetisk polypeptid til in vitro diagnose.

Kloningsvektorene som her er omtalt, brukes blant annet for fremstilling av nyttige mengder av et HBxAg-holdig gen. Dette genet kan igjen blant annet brukes til å fremstille mengder av HBxAg- og polypeptidfragmenter derav som kan brukes ved undersøkelse av selve hepatitt B sykdommen.

De nye syntetiske polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er blant annet nyttige som antigener ved fremstilling av antistoffer som immunreagerer med HBxAg og vesentlige polypeptiddeler derav, såvel som immunreagerer med de syntetiske polypeptidene selv. De således fremstilte antistoffer kan deretter benyttes til å analysere med hensyn på tilstedeværelse av HBxAg eller en vesentlig polypeptiddel derav i cellene fra en infisert dyrevert eller i vevkultur.

Ekspresjonsvektoren kan brukes til å transfisere celler og indusere ekspresjon av et polypeptid som omfatter en vesentlig del av HBxAg. Det uttrykte polypeptid kan så benyttes som et antigen i en prøve for å bestemme tilstedeværelsen av antistoffer mot HBxAg i en kroppsprøve.

Ekspresjonsvektoren og antistoffene nevnt oven-

for; kan også brukes som en markør for transfiserte celler som inneholder ekspresjonsvektoren og videre omfatter et ytterligere ligert gen hvis tilstedeværelse kan være forholdsvis vanskelig å bekrefte. Således kan ekspresjonsvektoren betegnet SVHBV-3 beskrevet nedenunder, åpnes og ligeres til nok et annet, fremmed gen som koder for et protein som det kan være forholdsvis vanskelig å analysere med hensyn på. Etter ny ringslutning, infeksjon av egnede celler med den således dannede, nye vektor, og utplating i encellede kolonier, kan de cellene som inkorporerte den nye vektoren identifiseres ved sin ekspresjon av den vektorkodede del av HBxAg sammen-smeltet med proteinet kodet for av det fremmede gen ved å bruke antistoffene som er nevnt ovenfor. En slik markør kan være spesielt nyttig når vektoren ønskes å uttrykkes i eukaryote celler, dvs. når legemiddelresistente markører som er tilstede i bakteriecellevektorer som f.eks. pBR322, ikke er tilstede.

1. Kloningsvektorer

Den rekombinante DNA som er nevnt ovenfor og

som inneholder HBxAg-genet, kan fremstilles f.eks. ved å

klone en del av HBV-DNA. For å oppnå HBV-genommateriale, om-dannes Dane-partikkel-DNA som inneholder en enkjedet del

til en fullstendig dobbeltkjedet DNA ved å bruke virusets endogene DNA-polymerase.

Det således erholdte, ringformede dobbeltkjedede HBV inneholder to BamHI-endonukleaserestriksj onsseter. Spalting med BamHI gir vanligvis tre rettkjedede produkter klassifi-sert etter størrelse. Det største er et 3200 basepar (bp) fragment som representerer hele HBV-genomet spaltet i bare ett BamHI-sete. Fragmenter som inneholder 1850 bp og 1350 bp produserer når HBV spaltes i begge BamHI-setene.

Analyse av HBV-nukleotidsekvensen ifølge Galibert et al. (1979), Nature, 281:646-650, avslører at 1850 bp HBV BamHI-fragmentet omfatter genet som koder for HBxAg. Alle tre fragmenter har imidlertid BamHI-komplementære ender og kan derfor være innføyet i BamHI-setet i et klonende plasmid.

Plasmidet pBR322 har et enkelt BamHI-restriksjonssete som befinner seg i det genet som gir tetracyklinresistens,

noe som kan sees ved gransking av fig. 3. Spaltning av pBR322-DNA med BamHI gir et enkelt rettkjedet fragment med ender som er komplementære for hvert av de tre BamHI-HBV-DNA-fragmenter.

Ligering av hvert av de tre BamHI-HBV-DNA-fragmenter

i pBR322 i dets BamHI-sete med T4-DNA-ligase for å omdanne og gjøre plasmidene ringformede, resulterte i tre unike rekombinante plasmid-DNA-molekyler. De rekombinante klonings-plasmider er ringformede DNA-molekyler, og er betegnet: AM7 som inneholder pBR322-DNA med 1350 bp BamHI-HBV-DNA-fragmentet føyet inn i pBR322's BamHI-sete, AM6 som inneholder pBR322-DNA med hele HBV-genomet føyet inn i pBR322's BamHI-setet, og AMI som inneholder pBR322-DNA med 1850 bp BamHI-HBV-DNA-fragmentet inkludert HBxAg-genet føyet inn i pBR322's BamHI-sete.

Når BamHI-HBV-DNA-fragmentene er ligert inn i pBR322 BamHI-setet med T4-DNA-ligase, har de således genererte rekombinante plasmider ikke lengre mulighet for å overdra tetracyklinresistens. Ampicillinresistente og tetracyklin-sensitive transformanter ble derved valgt ut fra kolonier av Escherichia coli ( E. coli) :stamme HB101 transformert med de ovenfor nevnte ligeringsprodukter.

Tre legemiddelutvalgte stammer av E. coli HB101 transformert med rekombinante plasmider AMI, AM6 og AM7 betegnes henholdsvis ECAM1, ECAM6 og ECAM7. De ovenfor nevnte plasmider ble fremstilt i forholdsvis store mengder ved å dyrke de ovenfor nevnte transformanter i et passende medium som f.eks. LB næringsvæske, som beskrevet nedenunder.

Et genfragment som inneholder hele eller en del av grunnsekvensen til HBxAg-genet, kan fjernes fra de ovenfor nevnte plasmider AMI og AM6 ved å bruke passende restriksjonsenzymer. Når f.eks. plasmidene AMI og AM6 ble spaltet med restriksjonsenzymet BamHI, ble et 1850 bp DNA-fragment som inneholdt genet som koder for HBxAg, isolert fra reaksjons-produktene. Ved å dyrke de rekombinante plasmid-transformerte E. coli HB101 stammer ECAM6 eller ECAM1 kan det fåes en forholdsvis stor mengde av DNA-sekvensen som koder for HBxAg.

Ut fra HBxAg-genet som DNA-grunnsekvensen og stedet

på HBV-genomet er bestemt for, er det åpenbart at det ikke kan foreligge noen introner. Dette betyr at genet kan trans-kriberes slik det er for å føre til fenotypeekspresjon som en budbringer-RNA i dyreceller såvel som i bakterieceller.

2. Ekspresjonsvektorer

Innføring av HBxAg-genet med et passende ekspresjons-system i en dyrecelle, f.eks. en nyrecelle fra afrikansk grønnape ved hjelp av fremgangsmåten til Ganem et al. (1976),

J. Mol. Biol., 101:57-83 kan føre til HBxAg-syntese i cellen. Videre muliggjør dyrkning av de apenyreceller som inneholder HBxAg-genet med en passende ekspresjonsvektor, masseproduksjon av HBxAg til lav kostnad.

Fortrinnsvis ble det konstruert en rekombinant DNA

som er i stand til å uttrykke HBxAg-genet ved å innføye, uten å bytte ut dens avlesningsramme, det fullstendige HBxAg-

genet, eller et fragment derav, i apevirus 40 (SV40) nedstrøms for SV40 sluttområdepromoteren. En vektor for ekspresjon under anvendelse av SV4 0 sluttområdepromoteren ble produsert i store mengder på følgende måte.

SV40-DNA og pBR322-DNA ble underkastet BamHI- og EcoRI-dobbelrestriksjonsenzymspaltning. De store SV40- og pBR322-fragmenter ble ligert ved å bruke T4-DNA-ligase. Ligeringsproduk-tet ble underkastet BamHI-spalting under dannelse av en rettkjedet DNA med BamHI-kohesive ender. Ligering av denne SV4 0/ pBR322-DNA med BamHI-HBV-DNA-molekylet med 1850 bp resulterte

i et ringformet rekombinant plasmid betegnet SVAM191.

Det rekombinante DNA AVAM191 inneholder et intakt

E. coli ampicillinresistent gen. E. coli HB101 transformert

med SVAM191 er ampicillinresistent og tetracyklinsensitivt,

og kan således selekteres for på grunnlag av legemiddel-sensitivitet. E. coli HB101 transformert med SVAM191 betegnes EC-SVAM191 og kan dyrkes i et passende medium, som f.eks. LB næringsvæske inneholdende ampicillin, og en forholdsvis stor mengde av plasmidet kan derved fåes.

3. Celledyrking

Transformasjonen av en vertcelle med de således erholdte rekombinante DNA-plasmider AMI, AM6 og SVAM191 kan gjennomføres ved hjelp av kjente metoder [Cohen et al.,

Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69:2110-2114 (1972)] eller en modifikasjon derav. Vertcellene omfatter blant andre slike mikroorganismer som Escherichia coli ( E. coli), Bacillus subtilis og gjær, og er fortrinnsvis en stamme av Escherichia coli som f.eks. stammene betegnet 294 (ATCC 31446), W3110 (ATCC 27325 eller RR1 (ATCC 31447). E. coli stamme HB101

(ATCC 33694) er en spesielt foretrukket vertcellelinje.

Isolering av en cellestamme som bærer den HBxAg-gen-holdige, nye rekombinante plasmid-DNA, kan utføres ved hjelp av kjente metoder som f.eks. omfatter den følgende teknikk.

Danepartikkel-DNA som bare er delvis dobbeltkjedet,

kan merkes radioaktivt ved å fylle opp den érikjedede delen med <3>H-holdige dNTPs-er under anvendelse av den endogene DNA-polymerasereaksjon. Robinson (1975), Am. J. Med. Sei., 270: 151-159. Ved å bruke det merkede produkt som en probe kan en positiv klon deretter plukkes ut blant de allerede erholdte, legemiddelselektive transformanter ved hjelp av den kjente "Southern Blot" hybridiseringsmetode [Southern (1975), J. Mol. Biol., 98:503] eller ved hjelp av den kjente kolonihybridi-seringsmetode [Grunstein et al. (1975), Proe. Nati. Acad. Sei.

USA, 72:3961-3965]•

Vertceller transformert og isolert på denne måte dyrkes i et kjent medium. Mediet kan f.eks. være LB næringsvæske, Penassay næringsvæske eller M9 medium inneholdende glucose

og casaminosyrer [Miller, Experiments in Molecular Genetics,

431-433 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972)].

Dyrkningen utføres generelt ved 15 - 43°C, fortrinnsvis ved 28 - 40°C, i 2 til 24 timer, fortrinnsvis i 4 - 16 timer, om nødvendig med lufting og/eller risting.

Etter dyrkingen samles bakteriecellene, cellene sus-penderes i en buffer og lyseres, f.eks. ved lysozym, frysing og tining eller ultralydbehandling. Genet som koder for HBxAg kan isoleres ved hjelp av en fremgangsmåte som er generelt kjent for DNA-rensing fra sentrifugeringssupernatanten erholdt etter cellelyse.

For å fremstille en vektor for ekspresjon av HBxAg i eukaryote celler, ble en del av SVAM191-DNA, inkludert hele DNA av pBR322-opprinnelse, fjernet. Dette ble utført ved å underkaste SVAM191 for Haell-restriksjonsenzymspalting. Når det store av HaeII-SVAMl91-spaltingsproduktene ble gjort ringformet, ble det dannet en vektor betegnet SVHBV-3 som er i stand til å uttrykke HBxAg i dyreceller.

En pattedyrcellevert kan transfiseres med SVHBV-3 ved hjelp av kjente metoder for å tilveiebringe et ekspresjons-system. F.eks. kan SVHBV-3, når den spaltes med restriksjonsenzymet Hindlll, føyes inn i C0S-7-celler (ATCC CRL 1651).

[Se Gluzman (1981), Cell,23:175-182 og Siddiqui (1983), Mol. and Cell Biology, 3:143-146.] SVBHV-3 kan også føyes inn i bovint papillomavirus og derved brukes til å transfisere murine cellelinjer.

Mer foretrukket brukes SVHBV-3 sammen med SV40tsA„OQ

2. j y hjelpevirus til å transfisere nyrecellelinjen BSC-1 (ATCC CCL 26) fra afrikansk grønnape. Når de ble transfisert på denne måte, produserte BSC-1- celler et polypeptid som inneholder HBxAg antigene determinanter.

Det burde forståes at nukleotidsekvensen eller gen-fragmentet føyet inn ved det utvalgte restriksjonssete i klonings- eller ekspresjonsredskaper, kan omfatte nukleotider som ikke er en del av det aktuelle gen for det ønskede protein, eller kan omfatte bare en del av det genet. På grunn av de kjente overflødigheter i den genetiske kode behøver således det innføyde gen ikke være identisk med HBxAg-genet som her er beskrevet, men behøver bare å kode for HBxAg. I tillegg kan en DNA-sekvens som koder for HBxAg omfatte ytterligere baser i én av eller begge 3<1-> eller 5'-endene av sekvensen som koder for HBxAg, så lenge som avlesningsrammen er uendret. Sagt på en annen måte, uansett hvilken DNA-sekvens som føyes inn, krever foreliggende oppfinnelse bare at den transformerte eller transfiserte verten produserer henholdsvis enten en DNA som koder for HBxAg, proteinet HBxAg eller et polypeptid som omfatter en vesentlig del av HBxAg-proteinet.

4. Polypeptider, antigener og antistoffer

Som beskrevet nedenunder kan ekspresjonen av HBxAg påvises ved å bruke antistoffer indusert ved hjelp av syntetiske polypeptider med aminosyrerestsekvens som svarer til aminosyrerestsekvensen til en antigen determinant i HBxAg. Polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder

som nevnt opptil 40 aminosyrerester. Mer foretrukket er det at polypeptidene inneholder fra 10 til 20 aminosyrerester.

Aminosyrerekkefølgen i syntetiske polypeptider betegnet 99, 100 og 142 vist nedenunder og i fig. 6, ble bestemt ut fra HBV-nukleotidsekvensen publisert av Galibert et al., supra.

hvor hver av aminosyrerestsekvensene er. vist i retningen fra venstre mot høyre og i retningen fra aminoende til carboxylende .

Det skal bemerkes at polypeptider som i aminosyrerestsekvens svarer til sekvensene til polypeptidene 99 og 100, bortsett fra fraværet av carboxyl- og aminoendecystein-rester i henholdsvis polypeptid 99 og 100, også er nyttige her og betraktes som en del av foreliggende oppfinnelse. Slike polypeptider betegnet polypeptidene 99b og 100b er nyttige som immunogener når de er bundet til en bærer gjennom sine araino- eller carboxylenderester, og kan også brukes i blok-keringsundersøkelser med immunreaksjon svarende til de som er vist i deler av figurene 7, 8 og 10 og omtalt nedenunder.

Aminosyrerestsekvensene til polypeptider 99b og 100 b er vist i formlene nedenunder fra venstre mot høyre og i retningen fra aminoende til carboxylende:

a. X- protein i transfiserte celler

Kaniner immunisert med polypeptidene 99, 100 eller

142 bundet til en "keyhole limpet" hemocyanin (KLH) bærer som et konjugat, produserte antistoffer (henholdsvis anti-

99, anti-100 og anti-142) som immunreagerte med HBxAg-polypeptidet uttrykt i BSC-l-celler transfisert med SVHBV-3,

og demonstrerte derved for første gang ekspresjonen av et HBxAg-polypeptid i de cellene eller i celler overhodet. Disse anti-polypeptid-antistoffene immunreagerte ikke med noe polypeptid som finnes i ikke-transfiserte BSC-l-celler, dvs. celler infisert med villtype (vt) SV40.

I tillegg ble den immunologiske aktiviteten av anti-polypeptid-antistof f ene som uttrykte HBxAg-polypeptidet, inhibert eller blokkert ved forinkubasjon av antistoffene med deres komplementære (tilsvarende) polypeptid, dvs. poly-peptidimmunogenet som de ble produsert mot. Denne blokkeringen indikerer at antistoffene spesifikt gjenkjenner en antigen determinant i polypeptidet som forutsis å være HBxAg, og at de syntetiske polypeptider tilsvarte når det gjelder rekke-følge av aminosyrerester, antigendeterminanter i det forutsagte HBxAg-protein. Disse blokkeringsresultater ble oppnådd ved å bruke "Western Blot"-teknikken (se avsnittet ved-rørende materialer og metoder) etterfulgt av lokaliseringen av bundne antistoffer med <125>I-merket Staphyloccocus aureus protein A, etterfulgt av autoradiografisk fremkalling av prøven.

Disse resultatene er vist i fig. 10 for antisera mot polypeptidene 99 og 142. Felt 1 i fig. 10 viser i den immunologiske reaksjonen mellom anti-99 og SVHBV-3-infiserte cellelysat, mens felt 2 viser blokkering av den immunologiske reaksjonen ved forinkubasjon av antiserumet med polypeptid 99.

På samme måte reagerte anti-142 immunologisk med et celle-lysatprotein i felt 3, og den immunologiske reaksjon ble blokkert ved hjelp av forinkubasjon av det antiserumet med polypeptid 142. Feltene 5 og 6 viser at ingen immunologisk reaksjon fant sted med lysatet fra kontrollceller.

Polypeptidekspresjonsproduktet av SVHBV-3-transfiserte celler som ble spesifikt identifisert ved hjelp av antisera mot polypeptidene 99 og 142, som vist i fig. 10, hadde en molekylvekt på ca. 24.000 dalton. Som omtalt nedenunder er et polypeptid med en molekylvekt på ca. 28.000 dalton blitt identifisert i lysater fra den humane hepatom-avledede cellelinje til PLC/PRF/5. Det antas at molekylvektforskjellen hos polypeptidene (proteinene) uttrykt av de to cellelinjene skyldes det faktum at de uttrykte polypeptider fremkommer ved fusjon mellom X-proteinet og andre proteiner eller polypeptider.

Som allerede anført, mangler således SVHBV-3 en del

av det fullstendige X-kodende genom. Fig. 6 viser at den delen av X-genet som er omfattet av SVBHV-3, uttrykker kodoner for de første 22 aminosyrerestene i det antatte X-protein og omfatter methionin-startkodonet ATG.

Det ble derfor forutsagt at polypeptidet uttrykt ved hjelp av celler transfisert med SVHBV-3 vil være et fusjons-produkt med sekvensene til det strukturelle SV4 0-protein VP2 som er tilstede i vektoren. Den forutsagte størrelse av fusjonsproteinet (polypeptidet) ble spådd å være 24.500 dalton. Funnet av et uttrykt polypeptid med en molekylvekt på ca.

24.000 dalton er derfor i overensstemmelse med den forut-sigelsen. Det 28.000 dalton store fusjonsproteinet (polypeptidet) er omtalt nedenunder.

b. X- protein uttrykt i hepatom- cellér

Ekspresjon av HBxAg antas også å være en fusjon av

noen HBV-sykdomstilstander. F.eks. gjenkjente antistoffer mot polypeptid 99 (anti-99) spesifikt et 28.000 dalton protein uttrykt i den humane hepatom-avledede cellelinje PLC/PRF/5

(ATCC CRL 8024). Normalt kaninserum gjenkjente ikke dette proteinet og anti-99-gjenkjenning ble blokkert ved forinkubasjon med polypeptid 99. Det er kjent at denne cellelinje inneholder integrert HBV-DNA. Chakrabarty et al. (1980), Nature, 286:531-533, Edman et al. (1980), Nature,286:535-538, og Marion et al. (1980) Virol, 33:795-806. HBsAg er blitt påvist i denne hepatom-cellelinje, [McNab et al. (1976), Cancer, 34:509-515 og Aden et al. (1979), Nature, 282: 615-616] mens alle standardprøver for HBeAg og HBeAg har vært negative. Cellelinjen betegnet HepG2 (ATCC CCL 23) er også en human hepatom-cellelinje, men inneholder ikke integrert HBV-DNA-sekvenser. Aden et al., supra.

Disse resultatene ble erholdt ved radioaktiv merking av PLC/PRF/5-celleproteiner etterfulgt av gjentatte immunologiske utfellinger ved å bruke anti-99 og Staphyloccocus aureus protein A og deretter elektroforese av det utvundne bunnfall. 28.000 dalton proteinet ble så identifisert ved hjelp av autoradiografi. Denne fremgangsmåten er også omtalt i avsnittet vedrørende materialer og metoder.

Resultatene fra en lignende undersøkelse under anvendelse av lysater fra både PLC/PRF/5- og HepG2-celler er vist i fig. 7. Fig. 7 viser at et X-spesifikt protein med 28.000 dalton ble påvist i PLC/PRF/5-celler (felt 5). Den immunologiske reaktivitet gikk tapt når antistoff ble forinkubert med polypeptid 99 (felt 6), men ikke med et ikke-beslektet polypeptid (felt 7). Preimmunserumkontrollen reagerte ikke immunologisk (felt 8). Det ble ikke påvist noen X-spesifikk reaktivitet i kontroll-HepG2-lysatene (feltene 1 - 4). Disse resultatene fastslår at et X-genprodukt uttrykkes i en human hepatom-cellelinje som inneholder integrerte HBV-DNA-sekvenser.

c. X- proteinekspresjon i leverceller

I tillegg ble fire leverprøver fra menneske og sjimpanse, enten med eller uten forutgående HBV-infeksjon, undersøkt i en "Western Blot"-prøve for nærvær av et X-beslektet protein ved å bruke anti-X-polypeptidantistoffer. Resultatene av denne undersøkelse er vist i fig. 8. En human prøve (H) var fra en kronisk HBV-infisert hepatom-lever og den andre var fra en akuttfase HBV-infeksjon (H). En ikke-infisert sjimpanse

(C) og en kronisk infisert med HBV (C) ble begge brukt til

å erholde levercellelysater som ble omsatt med anti-X-polypeptidantistoffer.

Anti-99-antistoffer reagerte mot både et 45.000 og

et 28.000 (pil i venstre marg, p28 i høyre marg) dalton protein. Begge reaktivitetene ble blokkert når disse antistoffene ble forinkubert med polypeptid 99. Når anti-142-antistoffer ble omsatt med disse samme cellelysatene, ble det påvist spesifikke bånd ved 40.000 ,(p40) , 28.000 (p28) og 17.000 (pl7). Reaktivitetene mot disse proteinene betraktes som spesifikke ettersom de fjernes når anti-142-antistoffene forinkuberes med polypeptid 142.

Kontrollprøven, en ikke-infisert sjimpanselever (felt

3 på alle platene), oppviste det ca. 45.000 dalton store proteinet (p45) med anti-99-antistoffer og både p40 og pl7 med anti-142-antistoffer. Protein p28 ble bare uttrykt i HBV-inf iserte vev (felt 5). Den immunologiske reaktivitet gikk tapt når antistoff ble forinkubert med polypeptid 99 (felt 6), men ikke med et ikke-beslektet polypeptid (felt 7). Preimmunserumkontrollen reagerte ikke immunologisk (felt 8). Ingen X-spesifikk reaktivitet ble påvist i kontroll- og HepG2-lysatene (feltene 1 - 4). Disse resultatene fastslår at et X-genprodukt uttrykkes i en human hepatom-cellelinje som inneholder integrerte HBV-DNA-sekvenser.

Tilstedeværelsen av et 45.000 dalton protein ble også observert i en forholdsvis liten mengde i lysatene fra PLC/ PRF/5-celler vist i fig. 7. Den immunologiske reaksjon mellom anti-99-antistoffer og 45.000 dalton proteinet ble også blokkert ved forinkubasjon av antistoffene med det immuniserende polypeptid 99. Dette er vist i felt 6 i fig. 7.

Normale humane levercelleekstrakter (HBV seronegative) ble funnet å uttrykke bare 45.000 dalton proteinet i "Western Blot"-prøven under anvendelse av anti-99. Kontrollprøver som ble gjennomført ved å bruke kommersielt tilgjengelige antistoffer produsert mot HBs, HBc og HBe (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) kunne dertil ikke identifisere hverken det eller det andre proteinet lokalisert ved hjelp av antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse. Dette beviset antyder igjen at % 5.000"-proteinet har antigene determinanter som er homologe med HBxAg, men at "28.000"-proteinet gjenkjent ved hjelp av anti-99 er spesifikt for en HBV sykdomstilstand, og er forskjellig fra HBsAg, HBeAg og HBeAg.

d. X- gen i leverceller

Ekspresjonen av p28 i PLC/PRF/5-celler skjedde fra HBV-DNA integrert i vert-DNA-molekylet. Det var av interesse

å bestemme om dette var den eneste måten som X-protein kunne uttrykkes på.

Det ble derfor fremstilt prober av de lever-DNA-molekyler fra sjimpanse og menneske som ga X-protein, med HBV-DNA (fig. 9). Total DNA ble isolert fra levervevene som er representert i fig. 8, og ble analysert med hensyn på til-stedeværelse av HBV-DNA-sekvenser. DNA fra det 28.000 dalton proteinholdige sjimpansevev avslørte homologe bånd når den ble spaltet med BamHI, EcoRI eller når den var uspaltet (fig. 9, henholdsvis felt 1, 2 og 3) . BamHI spalter ringformet HBV-DNA i to fragmenter (1850 og 1350 basepar (bp)), båndet ved 5,8 kilobaser (Kb) (felt 1) representerer en integrert sekvens som er større enn genomet. Ettersom ingen bånd kunne sees under båndet for DNA med høy molekylvekt (felt 3), konkluderes det med at bare integrerte sekvenser av HBV er tilstede i denne DNA.

I tillegg bie det fremstilt DNA fra en HBcAg-positiv human lever, og det ble fremstilt prober med HBV-DNA. Restriksjonsenzymspalting med Hindlll, BamHI, EcoRI eller uspaltet DNA (fig. 9, henholdsvis feltene 7 - 10) avslørte homologe sekvenser som enten er lik med eller mindre enn genomstør-relsen, og eliminerte dermed alle tegn på at disse humane DNA-prøver inneholder integrerte sekvenser. Levervev fra sjimpanse og menneske som manglet "28.000"-proteinet var også negative med hensyn på HBV-DNA-sekvenser (fig. 9, henholdsvis feltene 4 - 6 og 11 - 14). Dataene vist i fig. 9 bekrefter X-protein uttrykkes i HBV-infiserte vev uansett tilstanden til HBV-genomet, og eliminerer derfor en forutsetning om HBV-DNA-integrering for X-ekspresjon.

e'. Oppsummering av resultater

Resultatene beskrevet ovenfor viser eksistensen av et tidligere ikke-identifisert, virus-kodet protein i HBV-infiserte levervev fra menneske og sjimpanse. Dette 28.000 dalton protein (p28) kodes for av HBV-genomet enten det foreligger fritt i en ekstrakromosomal form eller finnes integrert i den cellulære DNA.

28.000 dalton proteinet (p28) er ikke produktet av X-området alene, men inneholder ytterligere HBV-sekvenser. Den forutsagte størrelse av X-protein, basert på sekvensen rapportert av Galibert et al., supra, er ca. 17.000 dalton (Fig. 6). Molekylvekten for X-proteinet påvist ved hjelp av anti-X-peptidantistoffer i PLC/PRF/5-celler, såvel som i HBV-infiserte vev fra sjimpanse og menneske, er imidlertid 28.000 dalton. Avviket i størrelse skyldes ikke en fusjon mellom X-genet og cellulære sekvenser ettersom mangelen på integrert HBV-DNA i humanvev som uttrykker p28 (fig. 9, feltene 7 - 10) indikerer at X-proteinet (p28) bare translateres fra HBV-genomet.

Den økte størrelse på X-proteiner kan forklares dersom proteinet enten er en HBsAg-C- eller en X-HBcAg-fusjon. Sannsynligheten for en slik fusjon antydes av nærheten mellom disse HBV-gener i genomet.

Et forsøk på å bestemme eksistensen av en slik fusjon på RNA-nivået var mislykket, noe som skyldtes at transkrip-tene erholdt i PLC/PRF/5-cellene, som ble funnet å inneholde X-sekvenser, også ga enten overflate- eller kjernesekvenser

i tillegg til X (data ikke vist). Lignende resultater ble rapportert av Gough (1983), J. Mol. Biol., 165:683-699. Bevis for en X-kjernefusjon skriver seg fra DNA-sekvensen til et annet medlem av hepnadavirus-familien, hepatitt B virus hos and (DHBV), hvor begge gener translateres som et enkelt protein [Mandart et al. (1984), J. Virol., 49:782-792] og fra forskning utført av Feitelson et al. (1982), JP Virol., 43:687-696.

Det faktum at X-området hos HBV uttrykkes er blitt fastslått. Funksjonen til dette genproduktet er imidlertid forblitt ukjent. Et proteinmolekyl som har vært foreslått å være translasjonsproduktet til X-området, finnes i forbindelse med HBV-genomet, eller er nærmere bestemt kovalent bundet til 5'- "hakket" i L-kjeden, Gerlich et al. (1980), Cell, 21:801-809. Forslaget om at X-protein utgjør et DNA-bindende protein ble eliminert da DNAase-behandling av PLC/PRF/5-celler eller HBV-infiserte vev ikke lyktes i å fjerne eller endre p28-aktivitet (data ikke vist).

For tiden er lite kjent vedrørende biologien til HBV-infeksjon, eller korrelasjonen som gjøres mellom HBV-infeksjon og den derpå følgende begynnelse av hepatocellulært carcinorrii For dette formål er enhver ytterligere markør for HBV-infeksjon eller for tilstedeværelse av HBV-sekvenser av stor viktighet. Humane sera undersøkes for tiden med hensyn på eksistensen av anti-X-antistoffer og X-proteinet.

Uttrykket "svarende til" i sine forskjellige gramma-tikalske former er her og i kravene brukt i forbindelse med polypeptidsekvenser slik at det skal bety polypeptidsekvensen beskrevet pluss eller minus opp til tre aminosyrerester i én av eller både amino- og carboxylenden, og inneholdende bare konservative substitusjoner i bestemte aminosyrerester langs polypeptidsekvensen.

Uttrykket "konservativ substitusjon" er, slik det er brukt ovenfor, ment å betegne at en aminosyrerest er blitt erstattet med en annen, biologisk lik rest. Eksempler på konservative substitusjoner omfatter substitusjonen av en hydrofob rest som f.eks.Ile, Val, Leu eller Met med hverandre, eller substitusjonen av en polar rest med en annen som f.eks. mellom Arg og Lys, mellom Glu og Asp eller mellom Gin og Asn, og lignende.

I noen tilfeller er utbyttingen av en ionisk rest med en motsatt ladet ionisk rest, som f.eks. Asp med Lys, blitt kalt konservativ innen teknikken fordi disse ionegruppene bare antas å gi oppløselighetshjelp. Ettersom imidlertid de her omtalte utbyttinger vanligvis er på forholdsvis korte syntetiske polypeptidantigener sammenlignet med et helt protein, antas utbytting av en ionisk rest med en annen ionisk rest av motsatt ladning her å være en "radikalutbytting",

på samme måte som utbyttingen mellom ikke-ioniske og ioniske rester, og voluminøse rester som f.eks. Phe, Tyr eller Trp og mindre voluminøse rester som f.eks. Gly, Ile og Val.

Uttrykkene "ikke-ionisk" og "ionisk" rester er her brukt i sin vanlige betydning for å betegne de aminosyrerester som henholdsvis vanligvis ikke bærer noen ladning eller vanligvis bærer en ladning, ved fysiologiske pH-verdier. Eksempel-vise ikke-ioniske rester omfatter Thr og Gin, mens eksempel-vise ioniske rester omfatter Arg og Asp.

Ordet "antigen" har tidligere vært brukt for å betegne en enhet som bindes ved hjelp av et antistoff, og også for å betegne enheten som induserer produksjonen av antistoffet. Nyere bruk begrenser betydningen av antigen til enheten som bindes ved hjelp av et antistoff, mens ordet "immunogen"

brukes for enheten som induserer antistoffproduksjon.

I noen tilfeller er antigenet og immunogenet den samme enhet, slik som når det benyttes et syntetisk polypeptid for å indusere produksjon av antistoffer som binder seg til polypeptidet. De samme polypeptider (99, 100 eller 142) induserer imidlertid også antistoffer som binder seg til et helt protein som f.eks. HBxAg, et tilfelle hvor polypeptidet er både immunogen og antigen, mens HBxAg er et antigen. Når en enhet som her er omtalt, er både immunogen og antigen,

vil den vanligvis kalles et antigen.

5. Prøvesystemer og - metoder

Resultatene ovenfor indikerer at SVHBV-3 kan brukes

som en ekspresjonsvektor. Den gir ekspresjonskontrollele-menter for fremmede DNA-sekvenser føyet inn i avlesnings-

ramme nedstrøms for HBxAg-genet.

Resultatene indikerer også at syntetiske polypeptider

99, 100 og 142, og at de peptid-antistoffer mot disse kan brukes som del av et prøvesystem og en prøvemetode for påvisning av tilstedeværelse av HBxAg i en kroppsprøve som skal analyseres, som f.eks. hepatom-celler eller leverceller fra en dyrevert som mistenkes for å ha HBxAg, for å påvise vellykket transfeksjon med SVBHV-3, og for å overvåke ekspresjon når SVHBV-3 brukes som en ekspresjonsvektor.

Et slikt system omfatter minst ett første reagens som inneholder reseptormolekyler som omfatter et antistoff-bindende sete som f.eks. antistoffer, i det vesentlige hele antistoffer eller de velkjente Fab og F(ab')2 antistoffdeler,

og er i stand til å reagere immunologisk med et syntetisk polypeptid ifølge oppfinnelsen, dvs. produsert mot de syntetiske polypeptider ifølge oppfinnelsen. Indikasjonsmidler, slik som et fluorescerende fargestoff som fluorescein eller rhodamin, et radioaktivt element som jod-125 eller carbon-14,

eller et enzymbundet antistoff produsert mot reseptorene til det første reagenset (f.eks. peroxidasebundet geit-anti-kanin IgG), for å signalisere immunologisk reaksjon mellom reseptorene i det første reagenset og det ekspresjonsspesifikke HBxAg tilveiebringes også. Indikasjonsmidlene kan fra starten av være bundet eller frie fra det første reagens. Typiske anvendelser av et slikt HBxAg prøvereagenssystem omfatter en-zymbundne immunosorbentprøver (ELISA), radioimmunoprøver og immunofluorescerende prøver (IF).

Diagnostiske prøver for bestemmelse av tilstedeværelse av HBxAg i en kroppsprøve under anvendelse av polypeptidene ifølge oppfinnelsen og deres anti-polypeptid-antistoffer er allerede blitt beskrevet i store trekk. Ved en kommersiell utførelsesform av en slik diagnostisk prøve tenker man på et diagnostisk prøvesystem.

Ett slikt system omfatter tilveiebringelse av minst

én beholder med en anti-pplypeptid-reseptor som f.eks. anti-99 eller anti-142 som det første reagens. Den andre beholder med en mengde av polypeptidet som anti-polypeptid-antistoffet ble produsert mot, f.eks. polypeptid 99 eller polypeptid 142, kan også leveres for å tilveiebringe et andre reagens. Ytterligere beholder med de tidligere beskrevne indikasjonsmidler, én eller flere buffere og lignende som er vel kjent innen teknikken kan også tilveiebringes til det diagnostiske prøve-systemet.

En fremgangsmåte for å analysere med hensyn på tilstedeværelse av en påvisbar mengde HBxAg er også blitt beskrevet i store trekk ovenfor. I korte trekk omfatter den fremgangsmåten blanding av proteiner fra en kroppsprøve som skal analyseres, som f.eks. hepatom- eller leverceller, med reseptorer som omfatter et antistoffbindende sete som er i stand til å reagere immunologisk med et syntetisk polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse og med HBxAg, som f.eks. anti-99 eller anti-142, eller en Fab eller F(ab')-del derav, i nærvær

125

av et indikasuonsmidde1 som f.eks. I-merket Staphyloccocus~ aureus ( S. auréus)protein A eller en enzymmarkør, som pepperrotperoxidase bundet til en av de ovenfor nevnte reseptorer, for å signalisere en immunologisk reaksjon mellom HBxAg og

reseptorene. Blandingen opprettholdes i en tidsperiode som er tilstrekkelig lang til at indikasjonsmidlene kan signalisere at en immunologisk reaksjon har inntrådt, og nærværet av signalet bekreftes f.eks. ved et autoradiogram. Kroppsprøven, eller proteiner fra denne, adsorberes fortrinnsvis eller festes (bindes) på annen måte til en fast bærer som f.eks.

et nitrocelluloseark eller et preparatglass før blanding med reseptorene.

Når indikasjonsmidlet er et separat molekyl som f.eks. radioaktivt merket S_. aureus protein A, blandes den bundne kroppsprøven og reseptormolekylene først i fravær av indikasjonsmidlet, og blandingen opprettholdes i en tidsperiode som er tilstrekkelig lang til å danne et bundet produkt av den immunologiske reaksjon. Det bundne produkt av den immunologiske reaksjon skylles så. Indikasjonsmidlet som er et separat molekyl, blandes så med det bundne produktet av den immunologiske reaksjon og denne blandingen opprettholdes i en tidsperiode som er tilstrekkelig lang til at det kan dannes et bundet, andre reaksjonsprodukt. Det bundne, andre reaksjonsprodukt skylles så og tilstedeværelsen av et signal fra indikasjonsmidlet bestemmes.

Når indikasjonsmidlet er en del av reseptoren ifølge foreliggende oppfinnelse, blandes de merkede reseptorene med den bundne kroppsprøve som skal analyseres, og blandingen opprettholdes i en tidsperiode som er tilstrekkelig lang til at det dannes et produkt av en immunologisk reaksjon. Det bundne produkt av den immunologiske reaksjon skylles så og tilstedeværelsen av et signal fra indikasjonsmidlet bestemmes.

Det tidligere nevnte andre reagens, f.eks. polypeptid

99 og 142, kan brukes som et kontrollreagens i en blok-kerende immunoreaksjonsundersøkelse for å verifisere at det har inntrådt spesifikk heller enn ikke-spesifikk immunologisk binding. Slike blokkeringsundersøkelser er illustrert i fig.

7, 8 og 10.

For å bruke SVHBV-3 som en ekspresjonsvektor føyes fremmed DNA inn nedstrøms for HBxAg-genet, fortrinnsvis i dets unike BamHI restriksjonssete, og den således fremstilte nye vektor benyttes til å transfisere celler. Ekspresjon, av HBxAg i en transfisert celle er sannsynlig bevis på ekspresjon av den fremmede DNA føyet inn i SVHBV-3. Ekspresjon av HBxAg påvist ved hjelp av det ovenfor beskrevne HBxAg ekspre-sjonsprøvesystemet indikerer ekspresjonen av fremmed DNA føyet inn i SVHBV-3.

Undersøkelse av cellekolonier produsert etter for-søket på transfeksjon under anvendelse av det ovenfor nevnte prøvesystem, kan således benyttes til å velge ut de koloniene hvor transfeksjon var vellykket. F.eks. festes og lyseres celler fra kolonier som resulterer fra forsøket på innføring av vektoren i eukaryote celler, og de cellulære proteiner ekstraheres. De ekstraherte cellulære proteiner separeres deretter på en SDA-polyacrylamidgel ved hjelp av elektroforese og de adskilte proteiner blottes på nitrocellulose. Ved å bringe de blottede proteiner i kontakt med et overskudd av reseptor og markør i det ovenfor beskrevne prøvesystem som f.eks. <125>I-merkede antistoffer mot syntetiske polypeptid 99 eller polypeptid 142, etterfulgt av skylling for å fjerne de ikke-immunreagerte antistoffer (reseptorer), kan så brukes for å fremstille et autoradiografi som indikerer tilstedeværelsen av den uttrykte HBxAg-del som er fusjonert med polypeptidet som kodes for av det fremmede gen.

De tidligere beskrevne prøvemetoder og -systemer er spesielt nyttige for å identifisere X-proteinet eller en vesentlig del derav, som kan være tilstede i én kroppsprøve, særlig en vevprøve som f.eks. i celler fra en leverbiopsi. Den diagnostiske prøve og fremgangsmåte som er beskrevet nedenunder er spesielt nyttig for å bestemme tilstedeværelsen av antistoffer mot X-proteinet som kan være tilstede i en kroppsprøve som f.eks. helblod, serum eller plasma. Som et eksempel på en slik diagnostisk fremgangsmåte vil det bli brukt en "Western Blot"- analyse. En kommersiell utførelses-form som benytter metoden er imidlertid et ELISA (enzymbundet immunosorbentprøve) diagnostisk system.

Her benyttes det fortrinnsvis et ekspresjonsprodukt fra SVHBV-3 vektor-transfiserte celler som f.eks. det omtrent 24.000 dalton protein (polypeptid) uttrykt i BSC-l-celler omtalt i forbindelse med fig. 10, som antigenet, selv om et foretrukket polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse som f.eks. polypeptid 99 ellér polypeptid 142, også kan brukes som et antigen. Således kan det som antigen brukes HBxAg-molekylet selv, brukt i vesentlig renset form slik det erholdes ved affinitetskromatografi som omtalt nedenunder, en vesentlig del av HBxAg-molekylet slik som det uttrykkes ved hjelp SVHBV-3-transfiserte BSC-l-celler (24.000 dalton polypeptid) eller et polypeptid som med hensyn til aminosyrerestsekvens svarer til en antigen determinant av HBxAg.

Antigenet bindes fortrinnsvis på (adsorberes til) eller festes på annen måte til en fast matrix som f.eks. det kryssbundne dextran som er tilgjengelig under varemerket Sephadex ® fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, New Jersey), agarose, glasskuler, polyvinylklorid, polystyren, kryssbundet acrylamid, nitrocellulose eller brønnene i en mikrotiterplate slik at det dannes en fast bærer.

Antigenet, fortrinnsvis bundet til en fast matrix som del av en fast bærer, blandes med en flytende kroppsprøve som skal analyseres slik at det dannes en faststoff/væske-faseblanding. Blandingen opprettholdes i en tidsperiode som er tilstrekkelig lang til at anti-X-protein (anti-HBxAg) antistoffer som er tilstede i kroppsprøven kan reagere immunologisk med antigenet. Tilstedeværelsen av den immunologiske reaksjonen : bestemmes så som med et indikasjonsmiddel for å signalisere tilstedeværelsen av anti-X-protein-antistoffer i den analyserte kroppsprøve. I en undersøkelse ble f.eks. SVHBV-3 vektortransfiserte BSC-l-cellelysater fremstilt, ad-skilt elektroforetisk og ble overført og bundettil. nitrocelluloseark som en fast matrix på en måte som i det vesentlige er lik med den som er omtalt i forbindelse med fig. 10, slik at det dannes en fast fase. Sera fortynnet 1:50 fra seks pasienter med forskjellige hepatitt-sykdommer ble deretter blandet hver for seg med de nitrocellulosebundne transfiserte BSC-l-celleproteiner slik at det dannes faststoff/væske-fase-blandinger. Disse blandinger ble bibeholdt i en tidsperiode (2 timer) som er tilstrekkelig lang til at anti-X-antistoffer som er tilstede i seraene kan reagere immunologisk med det bundne antigen.

Etter skylling for å adskille den faste fasen og væskefasen, ble de faste :fasener som resulterer fra ovenfor nevnte trinn blandet hver for seg med flytende oppløsninger som inneholdt 1:200 fortynninger av geit-anti-human- eller anti-kanin-antistoffer konjugert til pepperrotperoxidase som indikasjonsraiddel slik at det dannes andre, faststoff/væske-faseblandinger. De separate, andre faststoff/væske-fase-blandinger ble bibeholdt i en tidsperiode (1 time) som er tilstrekkelig lang til at de merkede antistoffer kan reagere med humane anti-X-antistoffer som hadde reagert immunologisk med det matrixbundne antigen. Kanin-anti-polypeptid-antistoffer ble brukt som kontroller med geit-anti-kanin-antistoffer. Den resulterende blanding av fast fase og flytende fase ble på nytt separert og skylt. De resulterende faste faser ble så utviklet ved å bruke oppløsninger som inneholdt 4-klor-l-nafthol som beskrevet for fig. 8.

Resultatene av denne undersøkelse indikerer at serum fra en pasient diagnostisert til å ha et heptacellulært carcinom inneholdt antistoffer som bandt seg til polypeptidet uttrykt ved hjelp av SVHBV-3-vektoren i de transfiserte BSC-l-celler. Disse antistoffene er således anti-X-antistoffer, og deres tilstedeværelse godtgjør at X-genproduktet er et autentisk antigen på ett eller annet trinn av HBV-infeksjon.

Når det omtrent 24.000 dalton store polypeptidekspresjonsproduktet som ble brukt i den ovenfor beskrevne "Western Blot"-prøve benyttes som antigenet i en ELISA, som omtalt nedenunder eller i andre lignende prøver, renses og isoleres polypeptidet fortrinnsvis før slik bruk. Denne rensing og isolering kan oppnåes ved hjelp av godt kjente teknikker.

F.eks. kan anti-99- eller anti-142-antistoffer, eller deres antistoffbindende seter, -fremstilles som beskrevet her og bindes til en fast matrix som f.eks. agarose og kryssbundne agarosederivater solgt under varemerkene Sepharose 6B<®1 >"CL6B", "4B" og "CL4B" av Pharmacia Fine Chemicals eller de som selges under varemerkene "Bio-Gel A-0,5M", "A-1,5M" og "A-50M" av Bio-Rad Laboratories, Richmond CA. Det tidligere beskrevne kryssbundne dextran som selges under varemerket Sephadex ®, og polyacrylamidkuler solgt under varemerkene "Bio-Gel P-2", "P-30", "P-100" og "P-300", også fra Bio-Rad Laboratories, er også nyttige faste matrixer. Bruk av en matrix bestående av et agarosederivat er omtalt illlustrativt nedenunder.

Agarosematrixen aktiveres vanligvis for binding ved å bruke cyanbromid. Den aktiverte matrix vaskes så og bindes til de ønskede antistoffmolekyler (reseptormolekyler) uten tørking av den aktiverte matrix. Det matrixbundne stoff vaskes så og er klart for bruk. Uomsatte reaktive grupper på matrixen kan om ønsket omsettes med et amin som f.eks. ethanolamin eller Tris, selv om disse reaktive grupper hurtig forsvinner.

Affinitetssorbanten kan brukes i sin løse tilstand, f.eks. i et begerglass eller en kolbe, eller den kan innelukkes i en kolonne. Før bruk er det foretrukket at affinitetssorbanten vaskes i bufferen eller et annet vandig medium som brukes til rensing av cellelysater som inneholder det omtrent 24..000 dalton polypeptidet for å eliminere ikke-spesifikt bundne proteiner eller de antistoffer som var ustabilt bundet til bæreren.

En vandig blanding som inneholder SVHBV-3 vektortrans-fisert cellelysat tilveiebringes og blandes så med affinitetssorbanten. Denne blandingen danner et reversibelt, bundet antistoff-antigen (reseptor-ligand) kompleks mellom det bundne antistoff (reseptor) og det omtrent 24.000 dalton store polypeptidet (antigenet).

Det bundne reseptor-ligand-kompleks separeres så fra

det gjenværende av den ikke-kompleksdannede vandige blanding hvorved polypeptidantigenet fåes i renset form bundet til affinitetssorbanten. Når blandingen finner sted i et begerglass eller en kolbe, kan denne separasjonen gjøres ved hjelp av filtrering og vasking. Når sorbanten er i en kolonne, kan separasjonen finne sted ved eluering av det ikke-kompleks-dannende vandige medium, igjen fortrinnsvis etterfulgt av et vasketrinn.

Når det rensede polypeptidantigen ønskes fritt for affinitetssorbant, kan det vanligvis erholdes ved hjelp av en lang rekke forskjellige fremgangsmåter. Ved alle disse fremgangsmåtene dissosierer reversibelt bundne reseptor-ligand-kompleks til sine bestanddeler av matrixbundet reseptor og polypeptidantigenligand etterfulgt av separering av polypeptid-antigenliganden fra den bundne reseptor hvorved det fåes en oppløsning av den rensede polypeptidantigenligand fri for affinitetssorbant. Oppløsningen kan brukes som sådan, eller den kan oppkonsentreres eller tørkes før bruk som beskrevet.

I noen tilfeller kan det være ønskelig å avsalte oppløsningen før bruk, noe som er kjent.

Dissosiasjonen av det reversible komplekset kan be-virkes på flere måter. Vanligvis brukes en 0,2 molar glycin-hydrokloridoppløsning ved en pH-verdi på ca. 2,5. Alternativt kan den bundne polypeptidantigenligand konkurreres bort fra den tilknyttede reseptor ved blanding av det reversible kompleks med et overskudd av det immunogene polypeptid som ble anvendt til å produsere antistoffene, f.eks. polypeptid 99 hvor anti-99-antistoffer er bundet til matrixen. Med en slik konkurranse unngåes mulig denaturering av polypeptidantigenet. Separasjon av det dissosierte polypeptidantigen fra affinitetssorbanten kan oppnåes som ovenfor beskrevet.

Fremstillingen av affinitetssorbanter og anvendelse

av disse er kjent i store trekk fra tidligere. Slike materialer og anvendelser som inkorporerer antistoff- og antigen-molekylene som her er beskrevet,/har imidlertid hittil ikke vært tilgjengelige. En nærmere beskrivelse av affinitetssorbanter, fremgangsmåter for fremstilling av disse og anvendelse hvor antigenet er bundet til matrixen kan finnes i Antibody as a Tool, Marchalonis and Warr eds., John Wiley & Sons, New York, sider 64 - 67 og 76 - 96 (1982).

Ved en eksempelvis ELISA hvor den ovenfor nevnte fremgangsmåte benyttes, brukes en fast bærer bestående av et tidligere beskrevet antigen ifølge oppfinnelsen adsorbert på eller festet på annen måte til en fast matrix bestående av brønnene i en mikrotiterplate med 12 eller 96 brønner fremstilt av polystyren eller polyvinylklorid som utgjør den faste bærer. Ikke-spesifikke bindingsseter på mikrotiterbrønn-veggene blokkeres deretter vanligvis med et protein som f.eks. bovint serumalbumin (BSA). Alt ubundet antigen og BSA fjernes fra mikrotiterbrønnen ved skylling.

En kroppsprøve-aliquot som f.eks. menneskeserum, -blod eller -plasma blandes med den ovenfor beskrevne antigenbundne faste bærer hvorved man får en blanding som inneholder en fast fase og en væskefase. Blandingen av fast fase og væskefase opprettholdes i en tidsperiode som er tilstrekkelig lang til at anti-X-protein-antistoffer i kroppsprøven kan reagere immunologisk med antigenet, f.eks. ca. 30 minutter til ca. 2 timer. Den faste fase og væskefasen adskilles deretter vanligvis.

En væskeoppløsning av et andre, merket indikasjons-middelholdig antistoff, antistoff-bindende sete eller S. aureus protein A som reagerer med det førstnevnte antistoff blandes så med den faste fase hvorved det dannes en annen blanding av fast fase og væskefase. Et eksempel på et andre antistoff er et peroxidasemerket geit-anti-human Ig-antistoff hvor de førstnevnte antistoffer skriver seg fra en kroppsprøve fra menneske. Videre omfatter nyttige enzymmarkører alkalisk fosfatase, 3-D-galactosidase og glucoseoxidase.

Blandingen dannet av den faste fase (det faste matrixbundne antigen-antistoff-produktet av den immunologiske reaksjon) og den andre, merkede antistoffoppløsning opprettholdes (inkubert) i en tidsperiode (f.eks. 1 time) som er tilstrekkelig lang til å danne et reaksjonsprodukt mellom det bundne førstnevnte antistoff og indikasjonsmidlet som f.eks. en andre immunologisk reaksjon mellom de to antistoffene. Den faste fase og væskefasen separeres deretter.

Det andre antistoff beskrevet ovenfor kan også være spesifikt for å reagere immunologisk med bare én av immun-globelinklassene (f.eks. IgG, IgM, IgE, IgA eller IgD). Slike antistoffer gir mulighet for å identifisere immunglobulin-klassen til anti-X-protein-antistoff som er tilstede i kropps-prøven. Dertil kan det andre antistoff eller antistoff-bindende sete være spesifikt for å reagere immunologisk med bare én av de to typer lette kjeder i immunoglobulin (f.eks. kappa eller lambda). Disse antistoffer gir mulighet for å identifisere isotypen til immunglobulinmolekylet som er tilstede i kroppsprøven, og er velkj:ent.

En oppløsning som inneholder et substrat for enzym-markøren, som f.eks. hydrogenperoxyd for peroxidase, og en fargedannende fargestofforløper" som f.eks.o-fenylendiamin eller 4-klor-l-nafthol, eller p_-nitrofenylfosfat for alkalisk fosfatase blandes deretter med den faste fase. Den optiske tetthet ved en på forhånd valgt bølgelengde (eksempelvis henholdsvis 490 eller 405 nanometer) kan deretter bestemmes etter at en tilstrekkelig lang tidsperiode har forløpt (f.eks. 60 minutter) og sammenlignes med den optiske tetthet til en kontroll for å bestemme hvorvidt anti-X-proteinantistoffer - var tilstede i kroppsprøven.

En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse omfatter et diagnostisk system i prøvesettform som omfatter en fast bærer bestående av en fast matrix som f.eks. en mikrotiterstrimmel av polystyren med 12 brønner, og et tidligere beskrevet antigen ifølge oppfinnelsen absorbert (bundet) eller festet på annen måte til den faste matrix

slik at det dannes en fast bærer. Dette systemet omfatter fortrinnsvis også separat pakkede anti-human Ig-antistoffer med et bundet indikasjonsmidde1 som f.eks. peroxidasemerket geit-anti-human Ig-antistoffer, og kan også omfatte et substrat for det bundne indikasjonsmiddel som f.eks. hydrogenperoxyd, og en fargedannende fargestofforløper som f.eks. o-fenylendiamin, i ytterligere, separate pakninger. Hydrogenperoxyd er vanligvis ikke inkludert i settet på grunn av dets relative ustabilitet, og tilføres vanligvis av brukeren selv om en beholder med hydrogenperoxyd også kan være en bestanddel i det diagnostiske system. Buffersalter som er anvendelige i en prøve hvor dette systemet brukes, kan også være inkludert i én eller flere separate pakninger i tørr form eller i væskeform. Et foretrukket polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse som f.eks. polypeptid 99, kan også være inkludert i en separat pakning for bruk som en kontroll ved undersøkelser med konkurrerende binding. En prøve på tilstedeværelsen av anti-X-proteinantistoffer i en kroppsprøve som f.eks. serum, kan utføres med dette diagnostiske system, idet den tidligere beskrevne fremgangsmåte brukes.

6. Fremstilling av polymerer

Polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan knyttes sammen slik at det dannes en vannoppløselig eller vann-dispergerbar antigen polymer bestående av flere av de repeterende polypeptidenheter. En slik polymer har fordelen av forsterket immunologisk reaksjon. Når forskjellige polypeptider brukes for å lage polymeren, har slike polymerer den ytterligere evne at de induserer antistoffer som reagerer immunologisk med en rekke antigene determinanter i HBxAg.

En polymer kan fremstilles ved å syntetisere polypeptidene som omtalt nedenunder, slik at de inneholder to cysteinrester. De to cysteinrestene kan være tilstede i én ende og langs polypeptidkjeden, eller i både amino- og carboxylenden. Et polypeptid som inneholder to cysteiner henvises her generelt til som "diCys"-polypeptid, mens et polypeptid som inneholder to ende-cysteinrester her henvises til som et "diCys-terminert" polypeptid. Slike cysteinrester langs polypeptidkjeden eller i polypeptidkjedens ender kan være tilstede i HBxAg-sekvensen som polypeptidet svarer til, 'f ..eks...det sentrale cystein i polypeptid 142 (den syvende rest fra carboxylende-alaninet (Ala), carboxylende-cysteinet (Cys) i polypeptid 99 eller ende-cysteinresten kan tilføyes for det formål å fremstille polymeren.

Eksempler på brukbare diCys-polypeptider er de som

er representert ved formlene vist nedenunder, og som er skrevet fra venstre mot høyre i retningen fra aminoende til carboxylende:

1 2

hvor R og R begge er en cysteinrest, med den betingelse at

1 2

bare en av R og R er tilstede.

Som vist i fig. 6, inneholder hver av polypeptidene 99, 100 og 142 en cysteinrest som er tilstede i aminosyrerestsekvensen til det translaterte X-genom. Det gjentas at polypeptidene med aminosyrerestsekvensene til polypeptid 99 og 100 bortsett fra ende-cysteinrestene, også kan brukes her i blokkeringsundersøkelser med immunologisk reaksjon, og hvor det brukes kobling til en bærer på en annen måte enn ved MBS-reaksjonen, slik som omtalt nedenunder.

Når én eller to terminale cysteinrester føyes til for polymerfremstilling, og den gjenværende aminosyrerestsekvens svarer til en antigen determinant i HBxAg, ansees den repeterende polypeptidenhet fortsatt som svarende til en antigen determinant i HBxAg.

Ved en typisk laboratoriefremstilling oppløses 10 mg av diCys polypeptidet (inneholdende cysteinrester i ikke-oxydert form) i 250 ml 0,1 molar ammoniumbicarbonatbuffer med en pH-verdi på ca. 8. Det oppløste diCys-terminerte polypeptid luftoxyderes så ved å omrøre den resulterende oppløs-ning forsiktig i en periode på ca. 18 timer, eller inntil det ikke er noe påvisbart fritt mercaptan ved Ellman-testen.

[Se Ellman (1959), Arch. Biochem. Biophys, 82:70-70].

Den således fremstilte polymer inneholder en rekke av polypeptidene ifølge oppfinnelsen som repeterende enheter. Disse repeterende polypeptidenheter er sammenbundet ved hjelp av oxyderte cysteinrester.

En slik polymer som inneholder en rekke av polypeptidene ifølge oppfinnelsen, kan representeres ved formelen, skrevet fra venstre mot høyre og i retningen fra aminoende til carboxylende,

hvor A og B er forskjellige repeterende polypeptidenheter som f.eks. polypeptid 99, 100 og 142. Indeksbokstavene a og b er hele tall som hver har en gjennomsnittsverdi fra 0 til ca. 20 00 med den betingelse at summen av gjennomsnittsverdiene for a og b er minst to, slik at det er minst to repeterende polypeptidenheter tilstede i polymeren.

Summen av gjennomsnittsverdiene til indeksbokstavene

a og b er vanligvis ikke større enn ca. 2000 slik at den resulterende polymer har en gjennomsnittlig molekylvekt på

ca. 5.000.000 dalton. I en foretrukket utførelsesform er den gjennomsnittlige molekylvekten til polymeren ca. 50.000 til ca. 1.000.000 dalton.

Formelen ovenfor er ment å være en generalisert fremstilling av de repeterende enheter i polymeren og av det gjennomsnittlige antall for hver repeterende enhet som er tilstede. Polymerene ifølge oppfinnelsen som inneholder to forskjellige repeterende enheter er vanligvis uregelmessige co-polymerer. Den ovenfor angitte formel er derfor ikke ment å vise rekkefølgen i polymeren som de repeterende polypeptidenheter er tilstede i, f.eks. som i en blokkcopolymer.

De ovenfor beskrevne vannoppløselige eller vanndisperger-bare.polymerer ifølge oppfinnelsen er både immunogene og antigene, og er derfor her beskrevet som antigene, slik som omtalt tidligere. Slike antigene polymerer er, når de er dispergert i et fysiologisk tolererbart fortynningsmiddel og innført som ved immuniserende injeksjon i en mengde på 400 ug polymer pr. kanin, i stand til å indusere produksjon av antistoffer i New Zealand røde kaniner som reagerer immunologisk på HBxAg. Eksempler på fysiologisk tolererbare fortynnings-midler er velkjent innen immunologien og er nærmere omtalt nedenunder.

7. Kobling av polypeptider til proteinbærere

De her anvendte syntetiske polypeptider ble koblet til "keyhole limpet" hemocyanin (KLH) ved å bruke den følgende velkjente metode. KLH-bæreren ble først aktivert med m-male-imidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester og ble deretter koblet til polypeptidet gjennom en cysteinrest som er tilstede i polypeptidets aminoende (polypeptid 100), carboxylende (polypeptid 99) eller ved å bruke det sentrale cystein i polypeptid 142, ved hjelp av en Michael addisjonsreaksjon som beskrevet i Liu et al. (1979), Biochem., 80, 690.

Et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan også kobles til

en bærer gjennom forskjellige midler, og kan også kobles til andre bærere enn KLH..F.eks. kan et polypeptid, f.eks. polypeptid 99b, kobles til en tetanustoxoid-bærer gjennom frie aminogrupper,idet det brukes en 0,04% glutaraldehydoppløsning som er vel kjent. Se f.eks. Klipstein et al. (1983), J. Infect. Dise., 147:318.

Cysteinrester tilstede i amino- eller carboxylendene eller i den sentrale delen av det syntetiske polypeptidet,

er funnet å være spesielt nyttige for å danne konjugater via disulfidbindinger og produkter av Michael-addisjonsreaksjon, men det kan også brukes andre fremgangsmåter som er velkjent innen teknikken, for å fremstille konjugater. Eksempler på ytterligere fremgangsmåter for binding (sammenknyttin<g->) omfatter bruken av dialdehyder som f.eks. glutaraldehyd (omtalt ovenfor)

og lignende, eller bruken av carbodiimid-teknikk som ved bruken av et vannoppløselig carbodiimid, f.eks. l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, hvorved det dannes amid-bindinger mellom bæreren og polypeptidet.

Anvendbare bærere er velkjent innen teknikken og er vanligvis selv proteiner. Eksempler på slike bærere er "keyhole limpet" hemocyanin (KLH), edestin, thyroglobulin, albuminer som f.eks. bovint serumalbumin eller humant serumalbumin (henholdsvis BSA eller HSA), røde blodlegemer som fveks. erythrocyter fra sau (SRBC), tetanus toxoid, cholera toxoid såvel som polyaminosyrer som f.eks. poly(D-lysin:D-glutamin-syre)og lignende.

Som også velkjent innen teknikken, er det ofte gunstig

å binde det syntetiske polypeptidet til dets bærer ved hjelp av en mellomliggende koblingsgruppe. Som tidligere angitt,

er glutaraldehyd en slik koblingsgruppe.

Når cystein brukes er imidlertid den mellomliggende koblingsgruppe fortrinnsvis en m-maleimidobenzoyl-N-hydroxi'--succinimid-ester (MBS) også omtalt tidligere. Vanligvis føyes først MBS til bæreren ved hjelp av en ester-amidombyttings-reaksjon. Deretter kan den ovenfor omtalte Michael reaksjon følges eller MBS-addisjonen kan etterfølges av en Michael-addisjon av en blokkert mercaptogruppe som f.eks. thiomelke-syre (CH^COSH) over maleimido-dobbeltbindingen. Etter av-spaltning av den acylblokkerende gruppe, dannes en disulfid-binding mellom mercaptanet i koblingsgruppen som er deblokkert, og mercaptanet i den tilføyede cysteinrest i det syntetiske polypeptid.

Valget av bærer er mer avhengig av den påtenkte slutt-anvendelse av antigenet enn av determinantdelen i antigenet,

og er basert på kriterier som ikke er spesielt involvert i foreliggende oppfinnelse. Dersom f.eks. et inokulum skal brukes i dyr, som ved produksjon av anti-polypeptid-antiT stoffer som skal brukes for å analysere med hensyn på tilstedeværelse av HBxAg, bør det velges en bærer som ikke gene-rerer en uheldig reaksjon i det bestemte dyret. Dersom et inokulum som f.eks. en vaksine mot HBxAg, skal brukes på mennesker, så omfatter de altoverskyggende hensyn fraværet av immunkjemiske reaksjoner eller andre bireaksjoner hos bæreren

og/eller det resulterende antigen, sikkerhet og effektivitet,

- de samme betraktninger som gjelder for enhver vaksine ment for anvendelse på mennesker.

8. Immuniseringsfremgangsmåter

Podestoffene som brukes til immunisering inneholder

en effektiv mengde polypeptid i form av en polymer av individuelle polypeptider koblet sammen gjennom oxyderte cysteinrester eller i form av et konjugat av polypeptidet koblet til en bærer. Den effektive mengde polypeptid pr. inokulasjon avhenger blant annet av dyrearten som skal inokuleres, kropps-vekten til dyret og den valgte inokulasjonsplan, noe som er vel kjent. Innpodingsstoffer fremstilles vanligvis fra det tørkede/ faste polypeptidkonjugatet eller polypeptidpolymeren ved å suspendere polypeptidkonjugatet eller polypeptidpolymeren i vann, saltoppløsning eller hjelpestoffer.

Disse innpodingsstoffer inneholder vanligvis polypep-tidkonsentrasjoner på ca. 20 ug til ca. 500 mg pr. inokulasjon. De angitte mengder polypeptid henviser til vekten av polypeptid uten vekten av en bærer når det brukes en bærer.

Innpodingsstoffene inneholder også et fysiologisk tolererbart (akseptabelt) fortynningsmiddel som f.eks. vann, fosfatbufret saltoppløsning eller saltoppløsning, og om-

fatter videre vanligvis et hjelpestoff som en del av fortynnings-midlet. Hjelpestoffer som f.eks. fullstendig Freund's hjelpestoff (CFA), ufullstendig Freund's hjelpestoff (IFA) og alun, er materialer som er velkjent innen teknikken, og som er kommersielt tilgjengelige fra flere kilder.

Forrådsoppløsninger av inokulum fremstilles med CFA,

IFA eller alun på følgende måte: En mengde av det syntetiske polypeptidkonjugat eller polymert polypeptid som er tilstrekkelig til å gi den ønskede mengde polypeptid pr. inokulasjon, oppløses i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) ved en pH-verdi på 7,2. Like store volumer CFA, IFA eller alun blandes så med polypeptidoppløsningen til et inokulum som inneholder polypeptid, vann og hjelpestoff hvor vann-til-olje-forholdet er ca. 1:1. Blandingen homogeniseres deretter til forråds-oppløsningen av inokulum.

Kaniner som her brukes til å produsere anti-polypeptid-antistof f er, ble injisert subkutant med et inokulum som omfatter 200 ug av et po.lypeptidkonjugat (polypeptid pluss bærer) emulgert i fullstendig Freund's hjelpestoff (SFA), 200 ug polypeptidkonjugat, ufullstendig Freund's hjelpestoff (IFA) og 200 ug polypeptidkonjugat med 4 mg alun injisert intra-peritonealt henholdsvis på dag 0, 14 og 21 i immuniserings-skjemaet. Hver inokulasjon (immunisering) besto av 4 injek-sjoner av inokulumet. Mus kan immuniseres på en lignende måte ved å bruke ca. en tiendedel av den ovenfor angitte dose pr. injeksjon.

Dyr tappes vanligvis 4 og 15 uker etter den første injeksjonen. Pre-immun-serum som kontroll ble tatt fra hvert dyr som blodprøve like før den første immunisering.

Forrådsoppløsninger av kontrollinokulum kan også fremstilles med "keyhole limpet" hemocyanin (KLH), KLH i IFA (ufullstendig Freund's hjelpestoff), KLH-alunabsorbert, KHL-alunabsorbert kikhoste, edestin, thyroglobulin, tetanustoxoid, tetanustoxoid i IFA, choleratoxoid og choleratoxoid i IFA.

Etter injeksjon eller annen innføring av antigenet eller inokulumet i vertdyret, reagerer immunsystemet hos dyret ved å produsere store mengde antistoff mot antigenet. Ettersom den spesifikke antigene determinant i det fremstilte antigen, dvs. antigenet dannet fra det syntetiske polypeptid koblet til bæreren eller polymeren, svarer til determinanten i det aktuelle naturlige antigen, produserer vertdyret antistoffer ikke bare mot det syntetiske polypeptidantigen, men også mot proteinet eller polypeptidet som det syntetiske polypeptidantigen svarer til, dvs. mot HBxAg.

9. Deponeringer

Materialene nummerert nedenunder ble deponert i American Type Culture Collection 8. mars 1984 og har de de-poner ingsnummere som er angitt for hvert enkelt. Alle be-tegnelser på cellelinjer, vektorer <p>g lignende som omfatter bokstavene "ATCC" etterfulgt av tallene og/eller bokstavene og tallene henviser til materialer deponert i den ovenfor nevnte American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852.

I tillegg til de ovenfor nevnte materialer deponert

i ATCC av de foreliggende oppfinnere, er også materialer fremstilt av andre og.som her er brukt, blitt deponert i ATCC. En liste over disse materialer er gjengitt nedenunder:

B. Materialer og metoder

1. Isolasjon og fremstilling av HBV- DNA

DNA fra område XHBV ble isolert fra Danepartikler, undertype adw, fra plasma til en HBs.Ag-positiv human donor

[National Institutes of Health nr. 737139) ved å følge fremgangsmåten til Robinscn. ( Am. J. Med. Sei., (1975) 270:151-159]. I korte trekk ble 1,0 ml plasma fortynnet til 3,0 ml med TN-buffer som inneholdt .0,001 molar (M) tris-HCL (pH 7,4)

og 0,5 M HCl. Det fortynnede plasma ble sentrifugert ved 10.000xg i 10 minutter for å fjerne store cellerester, og deretter spredd ut over 2,5 milliliter (ml) 30% (vekt/volum) sucrose som inneholdt TN, 0,001 MEDTA [0,1% 2-mercaptoethanol og 1 milligram/milliliter (mg/ml) bovint serumalbumin (BSA), som på forhånd var blitt sentrifugert ved 10.000xg i 10 minutter for å fjerne utfelt BSA]. Etter sentrifugering i 4 timer ved 50.000 opm, 4°C i en Spinco SW-65 sentrifuge (Beckman Instruments, Inc.), ble supernatanten forsiktig fjernet og pelleten ble resuspendert i 50 ul TN-buffer som inneholdt 1% Nonidet P-40 (polyoxyethylen-(9)-octylfenyletner; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) og 0,1% 2-mercaptoethanol.

Den énkjedede del av den ovenfor isolerte HBV-DNA

ble gjort dobbeltkjedet ved tilsetning av 25 ul blanding E

[0,2 M tris-HCl (pH 7,4), 0,08 M MgCl2, 0,24 M NH4C1 og 1,0 millimol (mM) av henholdsvis daTP, dTTP, dGTP og dCTP] til de 50 ul resuspendert HBV-DNA etterfulgt av inkubering ved 37°C i 3 timer. Robinson (1975), Am. J. Med. Sei., 270:151-159.

Radioaktivt merket HBV-DNA for anvendelse som en genom-probe, ble laget ved å bruke den ovenfor nevnte utfyllingsfrem-gangsmåte ved å erstatte dCTP og dGTP med 0,25 ul av henholdsvis 3HdCTP og 3HdGTP (begge 21 curie pr. mM).

2. Kloning av HBxAg

En del av HBV-genomet som inneholder DNA-sekvensen

som koder for HBxAg, ble klonet ved å bruke plasmid pBR322 innført i E. coli. Dobbeltkjedet, ikke-merket HBV-DNA isolert som ovenfor ble spaltet med restriksjonsendonukleasen BamHI

[50 mM NaCl, 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl, 1 mM dith-iothreitol]. Reaksjonsblandingen ble underkastet elektroforese i en 0,6% agarose, horisontal plategel ved 100 ampere i 2 timer (0,04 tris-acetat, 0,002 M EDTA).

Farging med 1% ethidiumbromid avslørte tre HBV-DNA-fragmenter, noe som indikerer tilstedeværelse av to BamHI-restriksjonsseter i genomet. Et fragment med 3200 basepar (bp) utgjorde hele HBV-genomet i rettkjedet form som et resultat av å ha blitt kuttet i bare ett av BamHI-setene. Fragmentene med 1850 bp og 1350 bp tilsvarte genomet kuttet i to fragmenter som et resultat av fullstendig BamHI-spalting.

Kopier av de tre BamHI-HBV-DNA-restriksjonsfragmenter isolert ovenfor ble erholdt ved kloning i plasmidet pBR322 (ATCC 37017) [Sutcliffe (1978), P. Nati. Acad. Sei., USA, 75:3737-3791]. For å føye HBV-DNA- BamHI-fragmentene inn i pBR322, ble plasmidet gjort rettkjedet ved spalting med BamHI [50 nM NaCl, 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2., 1 mM dithiothreitol] for å danne ender som er komplementære med HBV-fragmentene. De tre HBV-DNA-fragmentene og pBR322-fragmentet ble blandet og ble underkastet DNA-ligering med T4-DNA-ligase [66 mM tris-HCl (pH 7,6), 66 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol og 0,4 mM ATP]. Ligeringsreaksjonsproduktet erholdt i den ovenfor nevnte reaksjon er en ringformet DNA avledet fra pBR322 som er gjort rettkjedet, og HBV-fragmenter som er tilknyttet i deres komplementære ender.

De ringformede rekombinante plasmider ble innført i

E. coli stamme HB101 (ATCC 33694, levert av Dr. Dean Hunter ved National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD), idet fremgangsmåten til Cohen et al. (1972), Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 69:2110-2114, ble fulgt. I korte trekk ble en kultur av E. coli HB101 inkubert i e9n oppløsning av 0,03 M CaCl„ ved 0°C

i 20 minutter. Ca. 5 x 10 bakterieceller ble satt til 0,3 ml av den samme oppløsning hvortil det var tilsatt 100 nanogram (ng) rekombinante plasmider. Denne transformasjonsreaksjons-blanding ble inkubert ved 0°C i 60 minutter.

Plasmidet pBR322 inneholder gener som gir ampicillin-

og tetracyklinresistens. Legemiddelsensitive bakterieceller transformert med dette plasmidet oppviser ampicillin- og tetracyklinresistens.. Ettersom pBR322-DNA bare har ett BamHI-spaltingssete som befinner seg på tetracyklinresistensgenet, ødelegger innføringen av HBV-fragmentene i BamHI-setet dette genet. Legemiddelsensitiv E. coli HB101 transformert med et plasmid avledet fra pBR322 med et HBV-DNA-fragment føyet inn i BamHI- setet (kloningsvektor) oppviser derfor ampicillinresistens og tetracyklinsensitivitet.

Transformert E. coli, dvs. de som inneholder plasmid-genet som gir ampicillinresistens, ble valgt ved utplating av transformasjonsreaksjonsblandingen på et LB agarnærings-medium [et dyrkningsmedium som pr. liter inneholder 10 g Bactoagar, 10 g Bactotryptone, 5 g Bacto gjærekstrakt (alle fra Difco Labs, Detroit, MI) og 5 g NaCl] som inneholder 50. ug ampicillin pr. ml. Den utplatede E. coli ble inkubert ved 37°C i 2 dager.

Blant koloniene som oppviste ampicillinresistens etter transformasjon ved den ovenfor nevnte fremgangsmåte, ble tetracyklinsensitive...kolonier valgt ut ved utplating av kolonier på et LB naeringsmedium svarende til det ovenfor angitte, men med 50 ug tetracyklin pr. ml i stedet for ampicillin. Disse utplatede kolonier ble også inkubert ved 37°C . i 2 dager. Stammer av E. coli HB101 som inneholdt pBR322

med HBV-DNA-fragmenter føyet inn i BamHI-spaltingssetet i genet for tetracyklinresistens, ble erholdt på denne måten.

3. Ekstraksjon av plasmid- DNA

Cellene av E. coli HB101 som inneholdt den ovenfor isolerte rekombinante DNA, ble dyrket i LB næringsmediet som inneholdt 20 ug/ml ampicillin, under tilsetning av klor-am-fenicol til en konsentrasjon på 170 jag/ml i den logaritmiske vekstfase. Dyrkingen ble fortsatt i flere timer for å formere plasmid-DNA.

Cellene ble deretter lysert ved iblanding av 5 ml

25% sucrose i en oppløsning av 50 mM tris-HCl (pH 8,0) til 500 ml celler. Etter inkubasjon i 10 minutter ved 0°C, ble iblandet 1 ml av en oppløsning av 1% lysozym i 0,25 M tris-HCl (pH 7,5). Etter inkubasjon i 10 minutter ved 0°C, ble det forsiktig iblandet 2 ml 0,25 M EDTA (pH 8,0). Etter inkubasjon i 10 minutter ved 0°C, ble det iblandet 8 ml av 1% Triton X-100 <®> [polyoxyethylen-(9)-octylfenylether] i 0,15 M tris-HCl (pH 8,0), 0,2 M EDTA (pH 8,0) og på nytt inkubert i 10 minutter ved 0°C.

Det resulterende lysat ble sentrifugert ved 30.000 opm i en Spinco SW-65 sentrifuge (Beckman Instruments) for å fjerne denaturert protein og cellerester. DNA ble utfelt fra det klargjordte lysat ved iblanding av 1/10 volumdeler 2,5 natriumacetat og 2,5 volumdeler 99% ethanol, og inkubert ved

-20°C i 30 minutter. DNA-utfellingen ble pelletert ved sentri-

fugering ved lO.OOOxg i 30 minutter.

Avproteinisering ble utført to ganger med 1 ml fenol mettet med 0,01 M tris-HCl (pH 7,6), 0,1 M NaCl og 0,0012 MEDTA. Landers et al. (1977), J. Virol.,23:368-376. Vann-sjiktet fra den ovenfor nevnte fremgangsmåte ble tatt vare på og DNA felt ut fra dette ved å tilsette 1/10 volumdeler 2M natriumacetat og 2,5 volumdeler 99% ethanol og inkubere ved -20°C i 2 0 minutter. Sentrifugering i 10 minutter ved lO.OOOxg ga en pellet av fullstendig dobbeltkjedet DNA som omfattet genet som koder for HBxAg.

4. Analyse av plasmid- DNA

Tilstedeværelsen av HBV-DNA i klonene ble bekreftet ved å bruke "Southern" overførings- og hybridiseringsteknikk. Southern (1975), Mol. Biol, 98:503. 10 mg plasmid-DNA fra hver klon isolert som ovenfor ble spaltet med BamHI (50 mM NaCl, 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol) . Reaksjonsblandingen ble underkastet elektroforese i en 0,6% agarose, horisontal plategel ved 100 ampére i 2 timer (0,04 M tris-acetat, 0,002 M EDTA).

DNA-en i gelen ble denaturert ved bløtlegging av gelen i flere volumdeler 1,5 M NACl og 0,5 M NaOH i 1 time ved værelsetemperatur under konstant omrøring eller risting. I noen tilfeller ble DNA-en i gelen hydrolysert ved syre-depurinering før alkalidenaturering med bløtlegging av gelen to ganger i 15 minutter i 0,25 M HC1 ved værelsetemperatur. Etter denaturering ble gelen nøytralisert ved bløtlegging i flere volumdeler av en oppløsning av 1 M tris-HCl (pH8,0)

og 1,5 M NaCl i 1 time ved værelsetemperatur under konstant risting.

DNA-en i gelen ble overført på nitrocellulose i det vesentlige som beskrevet i Maniatis et al. (1982), J. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor. I korte trekk ble nitrocellulose (Katalog nr. BA85, Schleicher & Schuel, Ohio) plassert på toppen av gelen og flere lag med Whatman 3 mm papir ble plassert over nitrocellulosen. Denne lagdelte sammensetning ble deretter plassert med gelsiden ned på en Whatman 3 mm veke med ender senket ned i en buffer som inneholdt 0,9 M NaCl og 0,09 M NaCl og 0,09 M natriumcitrat.

Den kapillære bevegelse av bufferen overførte derved DNA-en fra gelen til nitrocellulosen. DNA-en ble festet til nitrocellulosen ved oppvarming ved 80°C i 2 timer under vakuum.

Plasmid-DNA-en på nitrocellulosen fremstilt ovenfor (Southern-filtere) ble analysert med hensyn på tilstedeværelse av HB-DNA-fragmenter ved å bruke fremgangsmåten til Mariiatis et al., supra.

I korte trekk ble Southern-filtrene forhybridisert ved bløtlegging i forhybridiseringsvæske, 0,9 M NaCl, 0,09 M natriumcitrat, 0,5% SDS (Natriumdodecylsulfat), 100 mg/ml denaturert laksesperm-DNA og 5X Denhardt<*>s oppløsning (som pr. liter inneholder 1 g Ficoll, 1 g polyvinylpyrrolidon og 1 g BSA fraksjon V i 4 timer ved 68°C.

Hybridisering ble utført i en varmeforseglbar plast-pose med akkurat tilstrekkelig mye hybridiseringsoppløsning til å holde Southern-filtrene våte (50 ul/cm 2 filter). Hybri-diseringsoppløsningen inneholdt 0,9 M NaCl, 0,09 M natriumcitrat, 0,01 M EDTA, 5X Denhardt's oppløsning, 0,5% SDS,

100 ug/ml denaturert lakse-sperm-DNA og 5 x 10 7 cmp av den radioaktivt merkede HBV-DNA fremstilt ovenfor. Southern-filteret ble inkubert i hybridiseringsoppløsningen i 12

timer ved 68°C.

Etter vasking av filteret i 2 timer (0,3 M NaCl, 0,03 M natriumcitrat), ble røntgenfilm (XRP-1, Kodak) eksponert mot filteret for å få et autoradiografisk bilde.

Tre rekombinante plasmider ble isolert ved å bruke fremgangsmåten ovenfor og ble betegnet AM6, AM7 og AMI. AM6 inneholdt pBR322-DNA og hele HBV-genomet. AM7 inneholdt pBR322-DNA og et 1350 bp HBV-DNA-fragment. AMI inneholdt pBR322-DNA og et 1850 bp HBV-DNA-fragment som omfattet genet som koder for HBxAg.

5. Konstruksjon av et replikasjonsplasmid som inneholder en SV40/ HBxAg ekspresjonsvektor- DNA

Defekt SV40-virus erholdt fra Dean Hamer, supra, ble underkastet BamHI- og EcoRI-spalting i en buffer inneholdende 50 mM NaCl, 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 og 1 mM dithiothreitol. Plasmid pBR322-DNA ble utsatt for den doble spalting omtalt tidligere for å danne ender som er komplementære til den således spaltede SV40-DNA. Spaltingsproduktene fra hver av disse spaltingen ble separert og renset ved hjelp av cesiumklorid tetthetsgradientsentrifugering. Tanaka et al.

(1975), J. Bact.f 121:354-362. Det således isolerte 4492 bp SV40-fragment og 3987 bp pBR322-fragment ble underkastet DNA-ligering med T4-DNA-ligase i en buffer som inneholdt 66 mM tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol og 0,4 mM ATP, hvorved det ble dannet pBRSV (se fig. 4). Reaksjonsproduktet av ligeringen erholdt i den ovenfor nevnte reaksjon, er en ringformet DNA avledet fra pBR322 3982 bp og SV40 4492 bp fragmentene som er gjort rettkjedet, og som er tilknyttet de komplementære EcoRI- og BamHI-ender. Dette ringformede plasmid ble så gjort rettkjedet ved spalting i BamHI-restriksjonssetet dannet under ligering, noe som skapte BamHI-kohesive ender i hver ende. Et 1850 bp HBV-DNA-fragment som omfattet genet som koder for HBxAg, ble isolert ved å utsette plasmid AM6 isolert som ovenfor, for spalting med BamHI i en buffer som inneholdt 50 mM NaCl, 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 og 1 mM dithiothreitol. Reaksjonsblandingen ble underkastet elektroforese ved 100 ampere i 2 timer under anvendelse av 0,8% agarose, og det 1850 bp lange båndet ble kuttet ut og smeltet ved 68°C i 15 minutter. 1/10 volumdeler 3M natriumacetat ble tilsatt og den resulterende oppløsning ble underkastet de-proteiniseringsfremgangsmåten beskrevet tidligere. Det således isolerte HBxAg gen-holdige HBV-DNA-fragment hadde BamHI-komplementære ender. Dette DNA-fragment ble så ligert til pBR-SV fremstilt som ovenfor ved å bruke T4-DNA-ligase i en buffer som inneholdt 66 mM tris-HCl (pH 7,6),

mM MgCl2/ 10 mM dithiothreitol og 0,4 mM ATP.

Produktet fra den ovenfor nevnte ligeringsreaksjon var en ringformet plasmid-DNA betegnet SVAM191. Den inneholdt, i rekkefølge med urviserne, et 4492 bp SV40-DNA-fragment fra dens BamHI-sete i grunnposisjon 2468 til dens EcoRI-sete i grunnposisjon 1717, et 3987 bp pBR322 DNA-fragment fra dens EcoRI-sete i grunnposisjon 0 til BamHI-setet i grunnposisjon 375, og et 1850 bp HBV-DNA-fragment fra dens BamHI-sete i grunnposisjon 1400 til BamHI-setet i grunnposisjon 28. Plasmid SVAM191 er vist skjematisk i fig. 4.

SVAM191 ble innført i E. coli HB101 ved å bruke trans-formasjonsfremgangsmåten beskrevet ovenfor. Ettersom disse transformerte E. coli også var ampicillinresistente og tetra-cyklinsensitive, ble de underkastet den samme isolasjons-fremgangsmåte beskrevet tidligere for E. coli kloningsvektoren. Fremgangsmåtene for produksjon, isolering, rensing og analyse beskrevet tidligere ble anvendt for å oppnå milli-grammengder av hovedsakelig ren SVAM191-DNA.

6. Konstruksjon av SV4 0/ HBxAg ekspresjonsvektor

En vektor med evne til å indusere produksjon av HBxAg

i eukaryote celler ble laget ved å fjerne en del av SVAM191-DNA. Dette ble utført ved å spalte SVAM191-DNA med Haell - endonuklease i en buffer som inneholdt 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 og 1 mM dithiothreitol for å spalte SVAM191

i Haell-setene i grunnposisjon 767 i SV40-DNA-området og grunnposisjon 1437 i HBV-DNA-området.

De to erholdte DNA-fragmenter fra reaksjonen ovenfor ble separert ved den tidligere beskrevne elektroforetiske agarosegelfremgangsmåte. Det således isolerte store fragment som inneholdt bare SV40- og HBV-DNA ble gjort ringformet ved å underkaste dets HaeII-komplementære ender for den tidligere beskrevne fremgangsmåte for T4-DNA-ligering.

Den ovenfor dannede, ringformede DNA-ekspresjonsvektor ble betegnet SVHBV-3 (figurene 4 og 5).Den inneholder ekspre-sjonskontrollelementer fra SV40 og et gen som koder for HBxAg fra HBV.

7. Transfeksjon av eukaryote vertceller med SVHBV- 3

BSC-1 nyrecellelinjen fra afrikansk grønnape (ATCC.!.

CCl 26; erholdt fra Dr. G.B. Thornton, Jbhnson. & Johnson Bio-technology Center, Inc., La Jolla, California), en fakultativ vert for SV40, ble valgt for transfeksjon med SVHBV-3. Sammenflytende monolag med ca. 10 7 celler ble erholdt ved dyrkning ved 37°C i Eagle1 s'minimal essential medium" (EMEM) supplert med 10% serum fra kalveforster, 100 enheter penicillin/ml,

100 Hg/ml streptomycin og 3 mM L-glutamin. Monolagene ble infisert med vektor-SVHBV-3-DNA i nærvær av DEAE-dextran som beskrevet av Ganem et al. (1976), J. Mol. Biol., 101:57-83.

En kolbe ble infisert med 1,6 ug av den rekombinante

SVHBV-3 sammen med 0,05 jag SV40-tsA239~DNA som hjelpestoff. Kontroller mottok bare ekvivalente mengder av DNA-ene fra vektorhjelpestoffet. Kulturene ble inkubert ved 40°C i 12

dager og ble deretter lysert ved frysing/tining og lagret ved -70°C.

Cellulære proteiner ble ekstrahert fra de fryste/tinte cellepulvere erholdt ovenfor ved først å tilsette 2 mg celle-pulver til 1 ml protein-ekstraksjonsbuffer [2% SDS, 10% glycerol, 0,08 M tris-HCl (pH 6,8), 2 mM fenylmethylsulfonyl-fluorid, 0,1 M dithiothreitol, 0,001% bromfenol-blått] .Opp-løsningen ble deretter kokt i 5 minutter, sentrifugert ved 15.000 opm i 10 minutter og supernatantene ble tatt vare på.

En supernatantmengde tilstrekkelig til å gi et 100 ug prøveprotein ble deretter underkastet SDS-polyacrylamidgel-elektroforese i "Western Blot"-fremgangsmåten beskrevet nedenunder.

8. Polypeptidsynteser

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen ble syntetisert

kjemisk ved fastfase-fremgangsmåter som beskrevet i Merrifield et al. (1963), J. Am. Chem. Soc, 85:2149; Merrifield et al.

(1970), A. Rev. Biochem., 39:841-866 og Houghten et al.

(1980), Int. J. Peptide Prot. Res., 16:311-320. De forholds-vise korte polypeptider som her er brukt, svarer til antigene determinanter i HBxAg. Fig. 6 viser 154 aminosyrerestsekvensen til HBxAg. Aminosyrerestsekvensene i de her beskrevne, foretrukkede syntetiske polypeptider (99, 100 og 142), er vist i fig. 6. Sammensetningen av begge de syntetiske polypeptider ble bekreftet ved hjelp av aminosyreanalyse.

Generelt lages et immunogen eller et syntetisk polypeptid ved å tilveiebringe en rekke forskjellige passende beskyttede aminosyrer som svarer til aminosyrerestene i en antigen determinant som finnes i HBxAg, og syntetisere disse aminosyrene inn i et polypeptid med en aminosyrerestsekvens som svarer til den antigene determinantens polypeptidamino-syrerestsekvens. Det produserte syntetiske polypeptid kan brukes til å produsere et inokulum, vanligvis ved å koble det til en bærer slik at det dannes et konjugat, og deretter dispergere en effektiv mengde av konjugatet i et fysiologisk tolererbart fortynningsmiddel.

Polypeptidene syntetiseres fortrinnsvis i henhold til fastfase-fremgangsmåtene som det er vist til ovenfor, ved å bruke en cysteinharpiks. Se Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., Supra. Ved å bruke den fremgangsmåten beskyttes a-amino-gruppen i hver tilsatt aminosyre vanligvis med en tertiær butoxycarbonyl(t-BOC)-gruppe før aminosyren føyes inn i den voksende polypeptidkjede. t-BOC-gruppen fjernes så før tilsetningen av den neste aminosyre til den voksende polypeptidkjede. Sidekjedene på individuelle aminosyrer er beskyttet på følgende måte: Arg-tosyl; Ser-, Thr-, Glu- og Asp-O-benzyl, Tyr-O-brombenzyloxycarbamyl, Trp-N-formyl, S-methoxybenzyl for cystein, 2-klorbenzoxycarbonyl for lysin og dinitrofenyl for histidin. Når asparagin brukes, tilsettes en like stor molar mengde N-hydroxy-benztriazol til den beskyttende aminosyre og dimethylformamid (DMF) brukes som koblingsoppløsnings-middel. N-formylgruppen på Trp-restene fjernes etter spalting av polypeptidet fra harpiksbæreren ved behandling med 1,0 molar ammoniumbicarbonat ved en polypeptidkonsentrasjon på 1,0 mg/ml i 16 timer ved værelsetemperatur. Yamashiro et al. (1973), J. Org. Chem., 38:2594-2597. Koblingseffektivi-teten i hvert trinn kan overvåkes med ninhydrin eller picrin-syre, og er fortrinnsvis større enn 99% i alle tilfellene.

Se Gisin (1972), Anal. Chem. Acta., 58:248-249 og Kaiser

(1980), Anal. Biochem., 34:595-598.

Etter fremstilling av et ønsket polypeptid, behandles en del av det resulterende, beskyttede polypeptid (ca. lg) med 2 ml anisol, og vannfritt hydrogenfluorid, ca. 20 ml, kondenseres inn i reaksjonskaret ved tørris-temperatur. Den resulterende blanding omrøres ved ca. 4°C i ca. 1 time for å avspalte beskyttelsesgruppene og fjerne polypeptidet fra harpiksen. Etter avdamping av hydrogenfluoridet ved en tempera-tur på 4°C med en strøm av N2, ekstraheres resten med vannfri diethylether tre ganger for å fjerne anisolen, og resten tørkes under vakuum.

Det vakuumtørkede materiale ekstraheres med 5% vandig eddiksyre (3 ganger 50 ml) for å adskille det frie polypeptid fra harpiksen. Den ekstraktholdige oppløsning frysetørkes

hvorved man får et monomert, ikke-oxydert polypeptid.

Som en generalisert fremgangsmåte for hvert polypeptid, omsettes i korte trekk 4 mg KLH i 0,25 ml 10 millimolar natriumfosfat-buffer (pH 7,2) med 0,7 mg MBS oppløst i DMF, og den resulterende blanding omrøres i 30 minutter ved værelsetemperatur. MBS-oppløsningen tilsettes dråpevis for å sikre at den lokale konsentrasjon av DMF ikke ble for høy ettersom KLH er uoppløselig ved DMF-konsentrasjoner på ca. 30% eller høyere. Reaksjonsproduktet, KLH-MB, sendes gjennom en kroma-tograferingskolonne fremstilt med Sephadex G-25 ® (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) ekvilibrert med 50 millimolar natriumfosfatbuffer (pH 6,0) for å fjerne fritt MBS. KLH-utvinning fra toppfraksjoner av kolonneeluatet, overvåket ved 280 nanometer, er vanligvis omtrent 80%.

Det således fremstilte KLH-MB omsettes så med 5 mg polypeptid oppløst i 1 ml buffer. pH-verdien i den resulterende reaksjonsblanding justeres fra 7 til 7,5, og reaksjonsblandingen omrøres ved værelsetemperatur i 3 timer hvorved det fåes et polypeptid-bærer-konjugat.

9. " Western Blotting"

Anti-polypeptid-antistoffene (anti-99, anti-100 og anti-142) ble undersøkt ved å bruke "Western Blot"-teknikken for å bekrefte deres forutsagte spesifisitet for HBxAg og for å bekrefte ekspresjonen av den vesentlige polypeptiddelen av HBxAg i transfiserte celler. De cellulære proteiner som omfatter HBxAg, ble separert ved hjelp av 12,5% SDS-polyacrylamidgel-elektroforese. Se Laemmli (1970), Nature, 277:680-685 og Towbin et al. (1979), Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 76: 4350-4354.

Proteiner ble elektroforeseoverført til nitrocellulose (Schleicher & Schuel, katalognr. BA85) som beskrevet av Towbin et al., supra, ved å bruke en elektroblot-apparatur (E.C. Apparatus Corp., Jacksonville, Florida) med en buffer bestående av 25 mM Tris-Base, 192 mM glycin, 20% methanol og 0,1% SDS (pH 8,3). Etter overføringen ble nitrocellulosen blokkert i BLOTTO ["Bovine Lacto Transfer Technique Opti-mizer", Johnson et al. (1983), J. Exp. Med.,159:1751-1756,

5% vekt/volum tørrmelk uten fett, 0,01% "anti-foam A" (Sigma, katalognr. A5758) og 0,0001% merthiolat (Sigma, katalognr.

5125) i PBS ved pH 7,2] for å redusere ikke-spesifikk binding. Blottene ble omsatt med 100 ul antipeptid-antistoff i 10 ml BLOTTO i 3 timer og deretter vasket 3 ganger i 1 time med 50 ml frisk BLOTTO.

Anti-polypeptid-antistoffer bundet til vektor-spesifikt protein ble påvist ved å omsette flekkene med 20 ul 125

I-merket Staphyloccocus aureus protein A i 10 ml BLOTTO i

1 time. Flekkene ble deretter vasket i 50 ml frisk BLOTTO

i 5 minutter 4 ganger og deretter under en kontinuerlig vann-strøm i 20 minutter.

125

10. l- merking av hepatom- celleekstrakter

Monolag av den humane hepatom-avledede cellelinje PLC/PRF/5 som er kjent for å inneholde integrerte sekvenser

av HBV [Alexander et al. (1976), African Med. J., 50:21-24, ATCC CRL 8024 ble frysetørket. Cellepulveret ble oppløst i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) slik at det ble oppnådd en 1 mg/ml proteinkonsentrasjon. Etter sentrifugering med lO.OOOxg for å fjerne cellerester, ble 50 ul av den ovenfor nevnte oppløsning blandet med 75 ul RIPA [0,15 M NaCl, 10 mM natriumfosfat (pH 7,5), 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS og 20 ul 0,2 M natriumfosfat (pH 7,5). I én undersøkelse ble det således oppløseliggjorte celleprotein merket med 5 millicurie <125>I ved å bruke kloramin T-reaksjonen. I undersøkelsen vist i fig. 7 ble cellelysatene merket med

125

3 mikroCurie I ved å bruke den samme reaksjon.

Den ovenfor nevnte reaksjonsblanding ble sendt gjennom kolonnen med Sephadex G-25 <®> (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) vasket med PBS. Den radioaktivt merkede toppfraksjon (9 x IO<6> cpm/ml) som ble erholdt, ble forinkubert med normalt kaninserum for å fjerne ikke-spesifikk binding. I korte trekk ble 25 ul av en toppfraksjon blandet med 1,0 ml RIPA, 20 ul Trasylol ^ (et varemerke for et protinin, Sigma, februar 1984, katalogside 163) og 100 ul NRS. Etter inkubasjon i 1 time ved 0°C ble 500 ul formalinfikserte celler av Staphyloccocus aureus (Staph. A; Carbiochem. La Jolla', CA) tilblandet og blandingen ble inkubert ved 0°C i 30 minutter. Utfellingen av Staph A ble fjernet ved sentrifugering ved 10.000 xg i 10 minutter, og supernatanten ble utvunnet.

11. Immunutfellinger ( IP)

Anti-polypeptid-antiserum fra kanin mot polypeptid 99 (anti-99) ble omsatt med de ovenfor erholdte radiojod-merkede celleproteiner. I korte trekk ble 10 ul anti-99 blandet med

6 o

2 x 10 cpm merket ekstrakt og inkubert i 1 time ved 0 C.

40 ul Staph A ble deretter iblandet og inkubert i 30 minutter ved 0°C. Utfellingen av Staph A ble fjernet ved sentrifu-ger ing ved lO.OOOxg i 10 minutter og pelleten ble utvunnet. Pelleten ble resuspendert i 1 ml RIPA og sentrifugert som ovenfor. Den resulterende pellet ble resuspendert i 1,0 ml LiCl-oppløsning (100 mM Tris HC1, 500 mM LiCl), og ble på nytt sentrifugert. Behandlingen med LiCl-oppløsning ble gjen-tatt og pelleten utvunnet.

Den ovenfor erholdte pellet ble resuspendert i 50 ul prøvebuffer og kokt i 3 minutter. Blandingen ble sentrifugert ved lO.OOOxg i 1 minutt og supernatanten utvunnet, og ble underkastet elektroforese på 12,5% SDS-poly-acrylamidgel. De ovenfor nevnte geler ble eksponert mot XRP-1 røntgenfilm hvorved man fikk et autoradiografi.

12. Fremstilling og analyse av levercelleekstrakter fra sjimpanse og menneske

Leverprøver fra to kronisk HBV-infiserte sjimpanser og et menneske, og fra normale sjimpanse- og menneskelevere (HBV sero-negative) ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og ble malt opp til et pulver. Pulveret ble blandet inn i prøvebuffer (0,0625 m tris HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol og 0,.001% bromfenol-blått) og kokt i 5 minutter. Blandingen ble sentrifugert ved lO.OOOxg i 30 minutter for å fjerne cellerester. Prøvene ble så underkastet "Western Blot"-analyse som beskrevet tidligere ved å bruke 75 ug protein pr. gelfelt.

13. Identifikasjon av anti- HBxAg- antistoffer i humansera

20 ug pr. felt med SVHBV-3-transfiserte BSC-l-celleekstrakter ble underkastet SDS-PAGE på 12% acrylamidgeler og de separerte proteiner ble overført elektroforetisk til nitrocelluloseark som tidligere beskrevet. De resulterende nitrocelluloseark ble blandet med 1:50 fortynninger av serum fra 6 mennesker som var blitt diagnostisert til å ha HBV-relaterte infeksjoner, inkludert en symptomatisk bærer og en pasient med et heptacellulært carcinom. Kontrollark ble blandet med kanin-anti-polypeptid-antistoffer beskrevet ovenfor.

Blandingene av nitrocellulose og proteinserum ble oppbevart i 2 timer ved værelsetemperatur. Arkene ble deretter skylt og blandet med en 1:200 fortynning av geit-anti-human- eller anti-kanin-antistoffer koblet til pepperrotper-oxydase, noe som var hensiktsmessig. Denne blandingen ble oppbevart i en tidsperiode på 1 time for at bundne anti-X-antistoffer skulle få reagere med de passende anti-antistoffer. Arkene ble vasket og deretter fremkalt med 4-klor-l-nafthol som tidligere beskrevet. Serumet fra pasienten med heptacellulært carcinom oppviste sterk immunreaktivitet med omtrent 24.000 dalton polypeptid uttrykt ved hjelp av de SVHBV-3-transfiserte celler.

14. Cellelinjer og vevprøver

PLC/PRF/5- og HepG2-celler ble levert av Dr. D. Milich, Department of Basic & Clinical Research, Scripps Clinic and Research Foundation (Scripps), La Jolla CA. Levervevprøver

fra sjimpanse ble levert av henholdsvis Dr. R. Purcell og P. Kaplan ved National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, MD, og Ortho Diagnostics, Inc., Raritan, NJ. Levervevprøver fra menneske ble levert av henholdsvis

Dr. F. Chisari, J. Dienstag og A. Yu, Scripps, Department of Medicine, Harvard University, Boston, MA, og Department of Pediatrics, University of California-San Diego, La Jolla, CA.

Claims

1. Antigent, syntetisk polypeptid, karakterisert ved at det inneholder opptil 40 aminosyrerester som i aminosyrerestrekkefølge svarer til en antigen determinant i HBxAg, hvor polypeptidet omfatter en aminosyrerestsekvens valgt fra gruppen av polypeptidsekvenser representert ved formlene skrevet fra venstre mot høyre og i retning fra aminoende til carboxylende:

2. Vannoppløselig eller vanndispergerbar antigen polymer, karakterisert ved at den inneholder et stort antall sammenføyde syntetiske repeterende polypeptidenheter bundet sammen ved hjelp av oxyderte cysteinrester, hvor de repeterende enheter er representert ved en formel skrevet fra venstre mot høyre i retning fra aminoende til carboxylende som er valgt fra gruppen bestående av: hvor hver av R<1> og R<2> er en cysteinrest, med den betingelse at bare én av R<1> og R<2> er til stede.

3. Reseptormolekyl, karakterisert ved at det omfatter et anti-stof fbindende sete som er i stand til å reagere immunologisk med et antigent, syntetisk polypeptid som inneholder opptil 40 aminosyrerester valgt fra gruppen bestående av polypeptidsekvenser representert ved formlene skrevet fra venstre mot høyre og i retning fra aminoende til carboxylende:

4. Diagnostisk prøvesystem for bestemmelse av tilstedeværelse av HBxAg i en kroppsprøve, karakterisert ved at det omfatter minst én beholder med et første reagens, idet det første reagens omfatter reseptormolekyler som omfatter et antistoffbindende sete som er i stand til å reagere immunologisk med HBxAg og med et antigent, syntetisk polypeptid ifølge krav 1.

5. Diagnostisk prøvesystem ifølge krav 4, karakterisert ved at reseptoren er en reseptor ifølge krav 3.

6. Diagnostisk prøvesystem ifølge krav 4, karakterisert ved at det videre omfatter et andre reagens i en andre beholder hvor det andre reagens er det antigene syntetiske polypeptid som reseptoren reagerer immunologisk med.

7. Anvendelse av et antigent, syntetisk polypeptid ifølge krav 1 til in vitro diagnose.