ES2262333T3 - Procedimiento para purificar particulas similares a virus de papilomavirus humano. - Google Patents
Procedimiento para purificar particulas similares a virus de papilomavirus humano.Info
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Abstract
Un procedimiento para purificar partículas similares a virus (VLP) de papilomavirus recombinante que comprende: (a) poner en contacto un lisado de células que contiene VLP parcialmente purificadas con un medio de hidroxiapatito en una columna de cromatografía en NaCl 1, 25 M bajo condiciones tales que las VLP se unen al medio de hidroxiapatito; (b) eluir las VLP unidas con una solución que comprende aniones fosfato; y (c) recuperar las VLP eluidas.
Description
Procedimiento para purificar partículas
similares a virus de papilomavirus humano.
La invención se refiere a un procedimiento para
fabricar y purificar partículas similares a virus (VLP) de
papilomavirus (HPV), que se pueden usar como componente de
vacuna.
Las infecciones por papilomavirus suceden en una
diversidad de animales, que incluyen seres humanos, ovejas, perros,
gatos, conejos, monos, serpientes y vacas. Los papilomavirus
infectan a células epiteliales, generalmente induciendo tumores
epiteliales o fibroepiteliales benignos en el sitio de la infección.
Los papilomavirus son agentes infecciosos específicos de especies;
un papilomavirus humano no puede infectar a un animal no humano.
Los papilomavirus se pueden clasificar en
distintos grupos basados en el hospedador al que infectan. Los
papilomavirus humanos (HPV) se clasifican adicionalmente en más de
70 tipos basados en la homología de la secuencia de ADN (para una
revisión, véase Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (ed.),
CRC Press, Inc., 1990). Los tipos de papilomavirus parecen ser
inmunogenes de tipo específico en los que una inmunidad que
neutraliza la infección de un tipo de papilomavirus no confiere
inmunidad contra otro tipo de papilomavirus.
Los papilomavirus son virus de ADN pequeños
(50-60 nm), sin encapsular, icosaédricos, que
codifican hasta ocho genes tempranos y dos tardíos. Los marcos de
lectura abierta (ORF) de los genomas de los virus se designan E1 a
E7 y L1 y L2, donde "E" denota tempranos y "L" denota
tardíos. L1 y L2 codifican para proteínas de cápsides de virus. Los
genes tempranos (E) se asocian con funciones tales como la
replicación viral y la transformación celular.
La proteína L1 es la proteína de cápside
principal y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La
proteína L2 es una proteína de cápside menor que tiene un peso
molecular pronosticado de 55-60 kDa y un peso
molecular aparente de 75-100 kDa según se determina
por electroforesis de gel de poliacrilamida. Los datos inmunológicos
sugieren que la mayor parte de la proteína L2 es interna a la
proteína L1. Las proteínas L2 están altamente conservadas entre
diferentes papilomavirus, especialmente los 10 aminoácidos básicos
en el Terminal-C. El ORF de L1 está altamente
conservado entre diferentes papilomavirus.
La proteína L1 recombinante se ha fabricado en
una diversidad de hospedadores, y bajo condiciones apropiadas se
auto-ensambla en partículas similares a virus (VLP),
tanto sola como en combinación con L2. Las VLP son candidatas para
una vacuna comercial. Sin embargo, para que sean útiles en una
vacuna humana, las VLP tienen que estar altamente purificadas y
exentas de contaminantes de células hospedadoras. En el pasado, se
ha usado la ultrafiltración por flujo cruzado en un modo de
diafiltración para eliminar biomoléculas contaminantes. Sin embargo,
este procedimiento daba como resultado la degradación proteolítica
de HPV L1. Sería deseable tener un procedimiento de purificación de
proteína L1 que dé como resultado un producto altamente puro, no
degradado.
El documento
WO-A-95.31532 describe la
preparación y purificación de VLP que contienen proteínas L1 y L2
pero no menciona el uso de hidroxiapatito.
Esta invención se refiere a un procedimiento de
purificar partículas similares a virus (VLP) de virus de
papilomavirus (HPV) recombinante que comprende las etapas de: poner
en contacto un lisado celular que contiene VLP parcialmente
purificadas con un medio de hidroxiapatito en una columna de
cromatografía en NaCl 1,25 M bajo condiciones tales que las VLP se
unen al medio de hidroxiapatito; y eluir las VLP unidas con una
solución que comprende aniones fosfato; y recuperar las VLP
eluidas.
El procedimiento de purificación se puede usar
con VLP que consisten sustancialmente en proteína L1, y también se
puede usar con VLP que comprenden proteínas L1 y L2. Además, se
puede usar con VLP que son quiméricas, es decir, contienen proteína
L1 y una proteína L2:fusión. En general para uso en vacunas, se
prefieren VLP que contengan solamente proteínas L1.
El procedimiento es aplicable a VLP de
virtualmente cualquier cepa de papilomavirus. Se prefiere que se use
un papilomavirus humano (HPV). Las cepas preferidas de HPV son
aquellas que se sabe que producen las enfermedades y dolencias más
graves, que incluyen: HPV tipo 6a, HPV tipo 6b, HPV tipo 11, HPV
tipo 16, HPV tipo 18, HPV tipo 31, HPV tipo 33, y HPV tipo 45.
En general una célula hospedadora es
transformada con un vector que codifica proteínas L1 o L1 y L2, o L1
y proteína L2:fusión.
Según se usa a lo largo de la memoria
descriptiva y reivindicaciones, la expresión "proteína
L2:fusión" significa que el ADN que codifica la proteína L2 ha
sido unido operativamente a otro ADN que codifica otra proteína de
HPV tal como E1, E2, E3, E4, E5, E6 o E7. La parte L2 de la proteína
de fusión puede ser de longitud completa, o puede tener deleciones
y/o truncaciones. Se pueden encontrar ejemplos en la solicitud
provisional de patente de EE.UU. pendiente de tramitación S.N.
60/096.638 (Expediente Número 20276PV), presentada con este
documento.
La célula hospedadora puede ser cualquier célula
hospedadora que se cultive fácilmente, como se sabe en la técnica,
que incluye levadura (Saccharomyces cerevisiae), células de
insectos, células bacterianas o de mamíferos. Se prefieren
particularmente las células de levaduras.
El vector también puede contener otros elementos
como se sabe en la técnica, tales como elementos que controlan
transcripción y translación y/o genes marcadores. Las proteínas
expresadas L1, L1 y L2, o L1 y L2:fusión se ensamblarán
espontáneamente en VLP. Las células hospedadoras son típicamente
sometidas a lisado y el lisado celular se purifica luego
parcialmente.
La etapa de purificación parcial puede incluir
etapas de purificación que se usan comúnmente, y no se ve como una
etapa crítica en esta invención. Por ejemplo, el lisado celular se
puede someter a un procedimiento de microfiltración, y al menos a
una etapa de cromatografía, tal como una cromatografía de
intercambio catiónico.
Se ha encontrado, de conformidad con esta
invención que una etapa de cromatografía, que usa hidroxiapatito
como el medio de columna, seguida por elución con una solución
tampón que contiene anión fosfato, elimina una gran cantidad de
contaminantes de un lisado celular parcialmente purificado.
Específicamente, se ha encontrado que se eliminan del lisado la
mayor parte de las biomoléculas contaminantes, que incluye ADN,
lípidos y proteínas.
De conformidad con esta invención, la
preparación final purificada de VLP es generalmente al menos 75%
pura, preferiblemente al menos 80% pura, y más preferiblemente al
menos 90% pura, según se mide usando el análisis SDS/PAGE.
Virtualmente se puede usar en esta invención
cualquier material de columna de hidroxiapatito comercialmente
disponible. Es preferible usar un hidroxiapatito cerámico con un
tamaño de partícula de aproximadamente 20-50 \mum
y aproximadamente un tamaño de poro de 800 Å. Un hidroxiapatito de
este tipo comercialmente disponible se vende por BioRad como
"Ceramic hydroxyapatite, Type II". Sin embargo, otros también
son eficaces.
En la preparación de la etapa de cromatografía
del procedimiento de purificación, se recomienda que la alimentación
de la columna sea en un tampón con un pH de 6-8, y
preferiblemente aproximadamente 7. Un tampón preferido es MOPS
[ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico] 50
mM a un pH de 7,0 y que contiene también NaCl 1,25 M.
Otros sistemas tampón que también se pueden usar
son evidentes para un experto corriente en la técnica e incluyen:
tampones de MES [ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico];
BIS-TRIS
[bis-(2-hidroxietil)-amino]tris-(hidroximetil)-metano];
ADA [ácido
N-2-acetamidoiminodiacético, sal
monosódica]; ACES [ácido
N-2-acetamido-2-aminoetanosulfónico];
PIPES [ácido
piperacina-N,N'-bis(2-etanosulfónico];
MOPSO [ácido
(3-N-morfolino)-2-hidroxipropanosulfónico];
BIS-TRIS PROPANO [1,3-bis
[tris(hidroximetil)metil-amino]
propano]; BES [ácido
N,N-bis-(2-hidroxietil)-2-amino-etanosulfónico];
TES [ácido N-tris
(hidroximetil)metil)-2-amino-etanosulfónico
y ácido
2-2([2-hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)amino]etanosulfónico];
HEPES [ácido
N-2-hidroxietilpiperacina-N'-2-etanosulfónico];
DIPSO [ácido
3-(N,N-bis(2-hidroxietil)amino)-2-hidroxi-propanosulfónico];
TAPSO [ácido
3-(N-tris(hidroximetil)metilamino]-2-hidroxi-propanosulfónico];
TRIS [tris-(hidroximetil)-aminometano];
HEPPSO [ácido
N-(2-hidroxietil)-piperacina-N'[2-hidroxi-propanosulfónico];
POPSO [ácido
piperacina-N,N'-bis[2-hidroxipropanosulfónico];
EPPS [ácido
N-[2-hidroxietil]-piperacina-N'-[3-propanosulfónico
y HEPPS]; TEA [trietanolamina]; TRICINE
[N[tris-(hidroxime-
til)metil]glicina]; BICINE [N,N-bis-(2-hidroxietil)-glicina]; TAPS [ácido 3-{[tris-(hidroximetil)metil]amino}-pro-
panosulfónico]; imidazol; HEPPS [ácido N-2-hidroxietilpiperacin-N'-3-propanosulfónico]; amida de glicina, hidrocloruro; glicilglicina; citrato; acetato; y succinato.
til)metil]glicina]; BICINE [N,N-bis-(2-hidroxietil)-glicina]; TAPS [ácido 3-{[tris-(hidroximetil)metil]amino}-pro-
panosulfónico]; imidazol; HEPPS [ácido N-2-hidroxietilpiperacin-N'-3-propanosulfónico]; amida de glicina, hidrocloruro; glicilglicina; citrato; acetato; y succinato.
Se deja que se pongan en contacto las VLP
parcialmente purificadas en la solución tamponada con el medio de
hidroxiapatito bajo las condiciones que permiten que las VLP se unan
al hidroxiapatito. Estas condiciones incluyen un amplio intervalo de
temperatura; se prefiere temperatura ambiente. La velocidad de flujo
también puede variar mucho, y un intervalo preferido es
aproximadamente 90 cm/hora.
Después de que las VLP se han unido al
hidroxiapatito, la siguiente etapa es la recuperación de las VLP
purificadas del hidroxiapatito con un tampón de elución. Una
solución tampón de elución preferida contiene un anión fosfato, tal
como una solución de fosfato de sodio o potasio. Los intervalos
molares preferidos son de aproximadamente 0,05 M a aproximadamente 1
M, siendo preferido aproximadamente 0,2 M. El pH del tampón de
elución debería oscilar de aproximadamente pH 6-8,
siendo preferido un pH de aproximadamente 7.
Otras ventajas del procedimiento de esta
invención incluyen:
(a) no se requiere equipo ni técnicas especiales
de cromatografía; (b) el procedimiento es rápido, no requiere
cambios de tampón; y (c) el procedimiento proporciona un excelente
rendimiento de HPV L1.
Los siguientes Ejemplos no limitativos se
presentan para ilustrar mejor la invención.
Se recolectaron células de levadura
transformadas para expresar VLP y se congelaron para almacenamiento
a -70ºC. La suspensión celular de levadura congelada se sacó del
almacenamiento y se descongeló durante aproximadamente 3 horas a
temperatura ambiente seguidas de aproximadamente 18 horas a 4ºC. Se
añadió BENZONASE® (Nycomed Pharma A/S, Copenhague, Dinamarca)(2,8 x
10^{5} unidades/ml y 0,21 mg proteína/ml) a la suspensión celular
hasta una concentración final de 750 unidades por gramo de peso de
células húmedas, y en un experimento se redujo a 335 unidades por
gramo de peso de células húmedas. Se agitaron las células durante 15
minutos, se sometieron luego a rotura celular por dos pasadas a
través de un homogeneizador APV Gaulin 30CD higienizado a presiones
de cámara de 99,97 MPa a 110,32 MPa, dando como resultado un 95% de
rotura celular. El lisado restante se agitó suavemente durante 18
horas a 4ºC.
Clarificación por microfiltración. El
lisado celular de clarificó por microfiltración de flujo cruzado en
un modo de diafiltración como sigue. El lisado se transfirió a un
depósito de procedimiento estéril con orificios de entrada y salida
de 2,54 cm de diámetro. El microfiltro era un cartucho filtrante de
fibra hueca de 0,65 micrómetros de tamaño de poro y de área
superficial de 5 pies cuadrados (A/G Technologies
#CFP-6-D-8A,
Needham, MA) alojado en un sistema de A/G Tecnologies FlexStand®
Benchtop Pilot Hollow Fiber. El concentrado se diafiltró con 3
volúmenes de Tampón de Diafiltración (a continuación) para producir
el lisado clarificado. El Tampón de Diafiltración era (Na^{+})
MOPS 0,2 M, pH 7,0 + NaCl 0,4 M.
Cromatografía del lisado clarificado. El
lisado clarificado se fraccionó por cromatografía de columna usando
resina de cromatografía de intercambio catiónico fuerte POROS® 50HS
(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) empaquetado en una columna
de cromatografía. La columna se higienizó con NaOH 0,5 N previamente
a su uso. La columna se equilibró con Tampón de Diafiltración de HPV
[(Na^{+}) MOPS 0,2 M, pH 7,0 + NaCl 0,4 M] a temperatura ambiente.
El lisado clarificado frío (4ºC) se bombeó a la columna a 125
ml/minuto y la columna se lavó con 8 volúmenes de columna de Tampón
de Columna A de HPV [(Na^{+}) MOPS 0,05 M, pH 7,0 + NaCl 0,5 M] a
temperatura ambiente a 125 ml/minuto con un gradiente lineal de 100%
de Tampón de Columna A de HPV a 100% de Tampón de Columna B de HPV
[(Na^{+}) MOPS 0,05 M, pH 7,0 + NaCl 1,5 M]. El gradiente lineal
total era de 10 volúmenes de columna y se recogió en 10 fracciones
de igual volumen. Después del gradiente, la columna se lavó con dos
volúmenes de columna de Tampón de Columna B de HPV a temperatura
ambiente a 125 ml/minuto que se recogieron en dos fracciones
adicionales. Las fracciones de recogieron en botellas estériles de
plástico de 2 litros y se almacenaron a 4ºC. Las fracciones que
contenían el último pico absorbente de UV (A280 nm y A230 nm) en el
gradiente, se acumularon conjuntamente, se filtraron usando una
unidad filtrante desechable MILLIPAK-200 (Millipore,
Bedford, MA) y se almacenaron a 4ºC.
Todas las etapas se llevaron a cabo a
temperatura ambiente. Se equilibró previamente una columna de
cromatografía (13 mm DI x 36 mm) que empaqueta hidroxiapatito
cerámico, tipo II (BioRad Cat. #7320081, Hercules, CA) en MOPS 50
mM, pH 7,0 + NaCl 1,25 M. La solución de HPV parcialmente purificada
del Ejemplo 1 se aplicó a la columna a una velocidad lineal de flujo
de 90 cm/hora. Después de que se completó la aplicación de la
muestra, se lavó la columna con ocho volúmenes de columna de tampón
de equilibrado previo hasta que la densidad óptica del efluente de
la columna era cercana a cero. El producto de vacuna de HPV se eluyó
con un gradiente lineal de 0% a 100% de tampón de elución (fosfato
sódico 0,2 M, pH 7,0 + NaCl 1,25 M), también a una velocidad lineal
de flujo de 90 cm/hora. El volumen total del gradiente fue de cuatro
volúmenes de columna. Se identificaron las fracciones que contenían
el producto de vacuna por análisis de proteínas RIA y Bradford. La
concentración de proteína del producto fue 100 \mug/ml.
Análisis: Se llevaron a cabo análisis de
proteína de Bradford usando Reactivo de Análisis Coomassie Plus
(Pierce, Rockford, IL) usando albúmina de suero bovino (BSA) como
estándar. Se llevaron a cabo análisis de proteína de Lowry según el
procedimiento de Lowry y col., 1951 J. Biol. Chem.
193:265-270 usando BSA como estándar de calibración.
Se analizó antígeno por un ELISA de capa múltiple usando un
anticuerpo monoclonal que reconocía un epitopo conformacional de
VLP. Se revistieron placas microtituladoras con anticuerpos
policlonales VLP anti-HPV de cabra. Se diluyeron
muestras estándar y de prueba con PBS que contenía 1% peso/volumen
de BSA, 0,1% de TWEEN-20, y 0,1% de azida de sodio y
se añadieron a los pocillos donde se había capturado antígeno por
los anticuerpos unidos a la placa. Se añadió anticuerpo VLP
monoclonal anti-HPV L1 (Chemicon, Temecula, CA) a
los pocillos para unir el antígeno capturado por los anticuerpos
unidos a la placa. Los anticuerpos VLP monoclonales
anti-HPV se detectaron por medio de anticuerpos IgG
anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano
picante. Se añadió un substrato cromógeno para peroxidasa de rábano
picante, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Pierce) y la
absorbancia a 450 nm fue proporcional a la concentración de VLP de
L1 en la muestra.
\newpage
La capacidad dinámica de la columna para el
producto de vacuna fue 2,9 mg por ml de resina por Bradford, y 4,6
mg por ml de resina por RIA. La recuperación a lo largo de esta
etapa fue 90% por análisis de proteína de Bradford u 82% por RIA
cuando la columna se cargó al 100% de capacidad. La recuperación
cayó al 63% por Bradford y al 50% por RIA cuando la columna se cargó
al 8% de capacidad.
Se analizó una muestra de HPV 11 L1 preparada
esencialmente como se describe en los Ejemplos 1 y 2 con respecto a
la presencia de ADN usando un análisis basado en PCR. Los
resultados, que se presentan en la tabla a continuación, indican que
este procedimiento cromatográfico es altamente eficaz para eliminar
ADN contaminante del producto final.
Muestra | proteína (\mug/ml) | ADN (pg/ml) | Relación de pg ADN/\mug proteína |
Carga de Columna | 107 | 3270 | 30,6 |
Flujo de paso (fracción #6) | <10 | 196 | >19,6 |
Eluato (fracción #20) | 230 | <2,6 | 0,011 |
Este vector retiene las secuencias codificantes
para los aminoácidos amino-terminales 69 y los
aminoácidos carboxi-terminales 84 (aa) de HPV 16 L2
que se fusionan en el marco por un policonector sintético que
introduce sitios únicos de restricción de enzimas Not I, Sac I, y
Xho I y da como resultado la inserción de un resto ácido glutámico y
la mutación de un resto serina a ácido glutámico.
Se diseñaron iniciadores de PCR (Reactivos
Certificados Midland) para amplificar las secuencias L2 del gen L2
nativo contenido dentro del vector, pGal110 HPV 16 L1 + L2.
Los iniciadores I (5'-CTT CCC
CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC-3'; ID SEC Nº 1) y C
(5'-CTC GAG CTC GCG GCC GCC TGT ACC CGA
CCC-3'; ID SEC Nº 2) amplificaron una secuencia de
265 bp que codifica el amino-terminal 69 aa y 23 bp
de la secuencia sin trasladar aguas arriba que incluye un sitio de
restricción de enzima Sma I. El iniciador C modificó y extendió la
región que codifica el amino-terminal de L2 y anexó
los sitios de restricción de enzimas Not I, Sac I, y Xho I aguas
abajo de las secuencias que codifican L2.
Los iniciadores A (5'-GCG GCC
GCG AGC TCG AGG GTT ATA TTC CTG CAA ATA CAA-3'; ID
SEC Nº 3), C Y D (5'-CCC TCC AGA TCT CTA GGC AGC CAA
AGA GAC ATC TG-3'; ID SEC Nº 4) amplificaron una
secuencia de 285 bp que codifica el carboxi-terminal
84 aa de L2 más 6 bp que añadió un sitio de restricción de enzima
Bgl II. El iniciador A también anexó una secuencia de 17 bp que
contenía sitios Not I, Sac I, y Xho I aguas arriba de la secuencia
que codifica L2.
El constructo de la expresión de L2 mínima se
ensambló a través de secuencias complementarias añadidas por los
iniciadores A y C. Los productos de ADN aislados de las reacciones
de amplificación I/C y A/D anteriores fueron usados ambos en una
reacción PCR que incluyó óligos I y D como iniciadores de
amplificación. Para facilitar la unión de los fragmentos a través de
su secuencia complementaria de 17 bp, se llevaron a cabo tres ciclos
PCR con la temperatura de recocido a 37ºC, seguidos de 15 ciclos a
57ºC. El producto de amplificación resultante se ligó en extremo
romo en pcrScript (Stratagene, La Jolla) y se transformó en células
XL-1 Azul MRF' (Stratagene, La Jolla). Se
identificaron clones positivos por PCR usando iniciadores I y D, y
se confirmaron por análisis de digestión con restricción. La
construcción se verificó luego por análisis de secuencia
automatizado (Perkin Elmer, Inc., Foster City, CA).
Se sometió luego a digestión ADN plásmido de un
aislado apropiado con Sma I y Bgl II; un fragmento de
aproximadamente 0,5 kilobase (kb) de pares se purificó en gel y se
ligó con 14 kb del fragmento de vector Sma I y Bgl II pGAL110 HPV 16
L1. Se transformaron células competentes DH5 de E. coli
(Gibco BRL, Rockville, MD) con la mezcla de ligación y se
seleccionaron transformantes sobre placas de ampicilina LB (Remel,
Lenexa, KS). Se tamizaron inicialmente clones por PCR en la que se
usaron iniciadores D e I para amplificar porciones de L2; se
confirmaron luego los clones apropiados por análisis de digestión
con restricción. Se verificó el clon candidato YP3#1 por análisis de
secuencia como anteriormente.
Se empleó luego YP3#1 como el constructo de
columna vertebral en el que se insertaron las estructuras de lectura
abierta de los genes que codifican HPV 16 E1, E2 o E7.
El gen que codifica HPV16 E2 se obtuvo por
amplificación PCR de muestra clínica positiva de HPV16 que fue luego
insertada directamente en el vector subclonante pCRII (Stratagene,
La Jolla, CA) y se verificó la secuencia como anteriormente. La
secuencia del gen E2 se modificó luego de la siguiente manera:
1) En la estructura se añadieron secuencias de
ADN que contenían Xho I, Nae I, Not I a la parte
amino-terminal de E2. Adicionalmente se añadieron
secuencias que contenían Not I, Nae I y Xho I a la parte
carboxilo-terminal de E2 para facilitar la inserción
dentro de E2 en los sitios Not I, Xho I.
2) Las secuencias de ADN se alteraron por
mutagénesis PCR para codificar restos alanina, codificar en los
restos ácido glutámico 39 e isoleucina 73. Esto se diseñó para
inactivar la función proteína E2.
El gen modificado HPV16 E2 anteriormente
descrito se sometió a digestión con Not I, Xho I y se ligó con el
vector YP3#1 sometido a digestión de modo similar. Los
transformantes que contenían las secuencias E2 propiamente
insertadas se seleccionaron por PCR y se verificó la secuencia.
Se empleó la misma estrategia para los genes que
codifican HPV16 E1 y HPV16 E7. Para E1, se alteró glicina 482 a
ácido aspártico; para E7, cisteína 24 y ácido glutámico 26 fueron
ambos cambiados a glicina para inactivar la función de la proteína.
Los constructos resultantes se emplearon luego para transformar
levadura para análisis de expresión.
Se usaron ADN plásmido de YP3#1 y derivados
descritos anteriormente para transformar Saccharomyces cerevisiae
(MAT\alpha, leu2-04, prb1::HIS3, mnn9::URA3,
cirº) por el procedimiento de esferoplasto (Hinnen y col.
1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:
1929-1933). Los esferoplastos transformados fueron
colocados en placas sobre medio selectivo (leucina minus)
(Remel, Lenexa, KS). Se aislaron clones a través de dos rondas de
selección de colonia única. Se hicieron crecer pequeños cultivos
líquidos de los clones candidatos hasta alta densidad celular en
medio que contiene galactosa. Se prepararon extractos brutos por
agitación vigorosa con bolas de vidrio seguida de centrifugación.
Los extractos clarificados se analizaron respecto a expresión de L1,
el componente L2, y VLP por diversos procedimientos que incluyeron
SDS PAGE, ELISA, inmunodetección, y EIA, usando anticuerpos
monoclonales o antisueros policlonales específicos que reconocen L1,
o L2, o los términos amino o carboxi de L2, o L1 VLP, o E1, o E2, o
E7, o cualquier otra proteína o péptido fusionado al L2 modificado.
Los clones que expresaron el componente L2 y formaron VLP fueron
seleccionados para caracterización adicional. Cultivos de un litro
o de 16 litros de los clones seleccionados se hicieron crecer en
medio que contiene galactosa para preparación a gran escala de VLP
quimérico.
Los sedimentos de células se almacenaron
congelados a -70ºC. Se descongelaron las células congeladas (peso
húmedo = 148 g) y se resuspendieron en 740 ml de "Tampón de
Rotura" (MOPS 200 mM, pH 7, CaCl_{2} 1 mM) para dar una
suspensión de aproximadamente 20% (peso/volumen). Se añadió la
nucleasa BENZONASE® (Nycomed Pharma) a 750 unidades/g de peso de
células secas. La suspensión de células se rompió a una presión de
aproximadamente 131 MPa por 5 pasadas en un microfluidizador
M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). Se recogió
la suspensión de células y se mantuvo sobre hielo durante la rotura.
El análisis de hematocrito indicó >80% de rotura.
Se clarificó por microfiltración el lisado de
células envejecidas a través de un cartucho de fibra hueca de tamaño
de poro de 0.65 micrómetros (A/G Tecnologies) usando un aparato de
microfiltración de flujo tangencial que se hizo funcionar en modo de
diafiltración. El lisado se diafiltró con tres volúmenes de citrato
sódico 0,25 M, MOPS 0,2 M, pH 7,0. El antígeno pasó a través de la
membrana y se recogió en el permeado.
La fracción de permeado diafiltrada a 0,65 mm
(3,9 l) se cargó en una columna de 325 ml (11,2 cm DI x 3,3 cm) de
resina POROS® 50HS (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA)
equilibrada en MOPS 200 mM, pH 7, citrato sódico 250 mM. La columna
se lavó con 8 volúmenes de MOPS 50 mM, NaCl 0,5 M, fosfato sódico 5
mM, pH 7 y se eluyó con un gradiente lineal de 10 volúmenes de NaCl
de 0,5 hasta 1,5 M en el mismo tampón. El flujo de salida y las
fracciones de lavado se recogieron a granel mientras que se
recogieron fracciones de 1 volumen durante la elución. Se analizaron
las fracciones de la columna por inmunotransferencia y
SDS-PAGE con detección coloidal Coomassie. Se
acumularon conjuntamente las fracciones que contenían
predominantemente proteína p55.
Se analizó el acumulado 50HS respecto a la
proteína total por análisis BCA (Pierce). Sobre la base de la
proteína total (168 g), se rellenó una columna de hidroxiapatito
cerámico (HA) Tipo II (Bio-Rad) para dar 1 ml de
resina/2 mg de proteína. Esta columna era de 2,6 cm DI x 15,7 cm. La
columna se equilibró en MOPS 50 mM, pH 7, NaCl 1,25 M, fosfato
sódico 5 mM. El acumulado 50HS (770 ml) se filtró a 0,22 mm y se
aplicó a la columna HA a una velocidad de flujo de 113 cm/hr. El
flujo de salida se recogió a granel. La columna HA se lavó con 5
volúmenes de tampón de equilibrado y se eluyó con un gradiente
lineal de 8 volúmenes de fosfato sódico de 5 hasta 200 mM, pH 7 en
NaCl 1,25 M. Las fracciones recogidas durante la elución se
analizaron por inmunotransferencia y SDS-PAGE con
detección coloidal Coomassie. Las fracciones que mostraban pureza y
enriquecimiento de proteína L1 similares se acumularon
conjuntamente. Las fracciones acumuladas conjuntamente se filtraron
asépticamente a través de una membrana de 0,22 mm y se almacenaron a
4ºC.
Se analizaron las retenciones y el producto del
procedimiento respecto a HPV 16 L1 usando un EIA específico y
respecto a proteína por análisis BCA. El rendimiento final del
producto purificado fue de 27 mg de proteína con una actividad
específica de 1,00 mg L1/mg de proteína. El microscopio electrónico
confirmó la presencia de partículas intactas de VLP con un diámetro
medio de 32 nm. Para el análisis de pureza SDS-PAGE,
se concentró una parte alícuota del producto final por precipitación
de TCA y se analizó por inmunotransferencia y
SDS-PAGE con detección coloidal Coomassie. La
cuantificación de L1 se hizo usando una carga de 2,5 mg y los
contaminantes de levadura se cuantificaron a una carga de 20,0 mg.
Por medio de densitometría se mostró que la proteína L1 era >94%
homogénea. La co-purificación de L1 y L2_{mini}/E2
se demostró por análisis específico de inmunodetección de las
fracciones del procedimiento.
Claims (9)
1. Un procedimiento para purificar partículas
similares a virus (VLP) de papilomavirus recombinante que
comprende:
(a) poner en contacto un lisado de células que
contiene VLP parcialmente purificadas con un medio de hidroxiapatito
en una columna de cromatografía en NaCl 1,25 M bajo condiciones
tales que las VLP se unen al medio de hidroxiapatito;
(b) eluir las VLP unidas con una solución que
comprende aniones fosfato; y
(c) recuperar las VLP eluidas.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que las VLP consisten esencialmente en proteína L1.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que las VLP son VLP de papilomavirus humano (HPV).
4. Un procedimiento según la reivindicación 3,
en el que las VLP se seleccionan entre el grupo constituido por: HPV
tipo 6a, HPV tipo 6b, HPV tipo 11, HPV tipo 16, HPV tipo 18, HPV
tipo 31, HPV tipo 33, y HPV tipo 45.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4,
en el que las VLP eluidas son al menos 75% puras.
6. Un procedimiento según la reivindicación 4,
en el que las VLP eluidas son al menos 90% puras.
7. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que las VLP comprenden proteína L1 y una proteína L2:fusión,
en el que la proteína L2 se une operativamente a una proteína E1,
E2, E3, E4, E5, E6 o E7 de HPV.
8. Un procedimiento según la reivindicación 7,
en el que la proteína L2:fusión tiene una parte de L2 que es menor
que la longitud completa.
9. Un procedimiento de fabricación de un
producto VLP de papilomavirus humano purificado, adecuado para uso
en una vacuna humana que comprende:
(a) purificar parcialmente un lisado de células,
en el que el lisado de células es de células de levadura que han
sido transformadas para expresar VLP de HPV L1;
(b) poner en contacto el lisado de células que
contienen VLP parcialmente purificadas con un medio de
hidroxiapatito en una columna de cromatografía en NaCl 1,25 M bajo
condiciones tales que las VLP se unen al medio de
hidroxiapatito;
(c) eluir las VLP unidas con una solución que
comprende aniones fosfato; y
(d) recuperar las VLP eluidas.
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