HRP20010113A2 - Process for purifying human papillomavirus virus-like particles - Google Patents
Process for purifying human papillomavirus virus-like particles Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20010113A2 HRP20010113A2 HR20010113A HRP20010113A HRP20010113A2 HR P20010113 A2 HRP20010113 A2 HR P20010113A2 HR 20010113 A HR20010113 A HR 20010113A HR P20010113 A HRP20010113 A HR P20010113A HR P20010113 A2 HRP20010113 A2 HR P20010113A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- vlps
- hpv
- protein
- vlp
- hpv type
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 title claims description 42
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 21
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims abstract description 21
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 10
- -1 phosphate anion Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 12
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 10
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 abstract description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract description 12
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 4
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 4
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LVQFQZZGTZFUNF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-[4-(2-hydroxy-3-sulfonatopropyl)piperazine-1,4-diium-1-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCN(CC(O)CS(O)(=O)=O)CC1 LVQFQZZGTZFUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 239000007996 HEPPS buffer Substances 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 101100540286 Human papillomavirus type 16 E1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100102460 Human papillomavirus type 16 E2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000767631 Human papillomavirus type 16 Protein E7 Proteins 0.000 description 2
- 101150027802 L2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 239000012538 diafiltration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QHQZEEGNGSZBOL-UHFFFAOYSA-N 2-(aminomethyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(CO)(CO)CO QHQZEEGNGSZBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SFRDXVJWXWOTEW-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(CO)CO SFRDXVJWXWOTEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 3-(n-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCOCC1 NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 3-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCC(CO)(CO)NCC(O)CS(O)(=O)=O RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XCBLFURAFHFFJF-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-hydroxyethyl)azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)CS(O)(=O)=O XCBLFURAFHFFJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 239000007991 ACES buffer Substances 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700016232 Arg(2)-Sar(4)- dermorphin (1-4) Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 101150082674 E2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000007842 Fibroepithelial Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- GIZQLVPDAOBAFN-UHFFFAOYSA-N HEPPSO Chemical compound OCCN1CCN(CC(O)CS(O)(=O)=O)CC1 GIZQLVPDAOBAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 1
- 101100209954 Human papillomavirus type 16 L1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000641177 Human papillomavirus type 16 Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 1
- 101000742340 Human papillomavirus type 16 Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710157639 Minor capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 208000012999 benign epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000011968 cross flow microfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N glycinamide Chemical compound NCC(N)=O BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000011012 sanitization Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- YCLWMUYXEGEIGD-UHFFFAOYSA-M sodium;2-hydroxy-3-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].OCCN1CCN(CC(O)CS([O-])(=O)=O)CC1 YCLWMUYXEGEIGD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012437 strong cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002305 strong-anion-exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008362 succinate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20051—Methods of production or purification of viral material
Description
Područje izuma
Predmetni izum odnosi se na postupak pripravljanja i pročišćavanja papiloma virus (HPV) virusu sličnih čestica (VLP), koje se mogu koristiti kao komponenta u vakcini.
Pozadina izuma
Zaraze papiloma virusom događaju se kod raznih životinja, uključujući ljude, ovce, pse, mačke, zečeve, majmune, zmije i krave. Papiloma virusi inficiraju epitelne stanice, općenito izazivajući benigne tumore epitela ili fibroepitela na mjestu infekcije. Papiloma virusi su infektivni agensi specifični za pojedine vrste; humani papiloma virus ne može inficirati druge životinje.
Papiloma virusi mogu se klasificirati u različite grupe, prema domaćinu kojeg inficiraju. Humani papiloma virusi (HPV) se nadalje dijele u više od 70 vrsta, na osnovu homologije DNA sekvence (za pregled vidjeti Papiloma virus i rak kod ljudi, H. Pfister (izd), CRC Press, Inc., 1990). Vrste papiloma virusa su čini se imunogeni specifično po vrsti, utoliko što neutralizirajući imunitet na infekciju na jednu vrstu papiloma virusa ne garantira imunitet protiv druge vrste papiloma virusa.
Papiloma virusi su mali (50-60 nm), bez ovojnice, ikozaedarski, DNA virusi koji enkodiraju do osam ranih i dva kasna gena. Otvoreni okviri čitanja (ORF) genoma virusa su označeni E1 do E7 i L1 i L2, gdje "E" (early) označava rani a "L" (late) kasni. L1 i L2 kodiraju virusne kapsidne proteine. Rani (E) geni su vezani za funkcije kao što su replikacija virusa i transformacija stanica.
L1 protein je glavni kapsidni protein i ima molekularnu težinu od 55-60kDa. L2 je manje važan kapsidni protein, koji ima predviđenu molekularnu težinu 55- 60 kDa, i naizgled molekularnu težinu od 75-100 kDa kako je određeno elektroforezom na poliakrilamidnom gelu. Imunološki podaci pokazuju daje veći dio L2 proteina interno u L1 proteinu. L2 proteini se dobro očuvaju u raznim papiloma virusima, naročito 10 osnovnih amino kiselina na C-terminusu. L1 ORF je dobro očuvan među raznim papiloma virusima.
Rekombinantni L1 protein je napravljen kod raznih domaćina, te pod pravim uvjetima se asemblira u virusu slične čestice (VLP), sam ili u kombinaciji s L2. VLPi su kandidati za komercijalne vakcine. Međutim, da bi bili korisni u ljudskoj vakcini, VLPi moraju biti visoko pročišćeni i oslobođeni kontaminacije iz stanice domaćina. U prošlosti, kontaminirajuće biomolekule su uklanjane protočnom ultrafiltracijom u diafiltrirajućem modu. Međutim, ova metoda rezultirala je proteolitičkom degradacijom HPV L1. Bilo bi poželjno imati takav postupak pročišćavanja LI proteina, koji daje ne-degradirani produkt visoke čistoće.
Sažetak izuma
Ovaj izum odnosi se na postupak pročišćavanja rekombinantnih papiloma virus (HPV) virusu sličnih čestica (VLP), koji se sastoji od sljedećih koraka: dovođenja u kontakt djelomično pročišćenog VLPa koji sadrži stanični lizat sa medijem hidroksiapatitom u koloni za kromatografiju, pod takvim uvjetima da se VLPi vezuju na hidroksiapatitni medij; i eluiranja vezanog VLPa s otopinom koju čine fosfatni anioni; te odvajanja eluiranih VLPa.
Postupak pročišćavanja može se koristiti s VLPima koji se sastoje uglavnom od L1 proteina, a može se korisititi i s VLPima koji sadrže L1 i L2 proteine.
Dodatno, može s koristiti kod himeričnih VLPa, tj. onih koji sadrže L1 protein i fuziju L2 proteina. Općenito, za korištenje u vakcini, VLPi koji sadrže samo L1 su pogodniji.
Postupak je primjenjiv na VLPe od praktično bilo koje vrste papiloma virusa. Poželjno je da se koristi ljudski papiloma virus (HPV). Poželjne vrste HPVa su one za koje je poznato da uzrokuju najteže bolesti i stanja, uključujući HPV tip 6a, HPV tip 6b, HPV tip 11, HPV tip 16, HPV tip 18, HPV tip 31, HPV tip 33 i HPV tip 45.
Općenito, stanica domaćina se transformira s vektorom koji enkodira L1 ili L1 i L2 proteine, ili L1 i L2:fuzijski protein.
Onako kako je korišten u specifikaciji i zahtjevima, izraz "L2:fuzijski protein" znači daje DNA enkodiranje L2 proteina operativno povezano s drugim DNA enkodiranjem željenog proteina, a poželjno, s drugim proteinom iz HPVa, kao stoje E1, E2, E3, E4, E5, E6 ili E7. L2 dio fuzijskog proteina može biti pune duljine, ili može imati brisanja i/ili skraćenja. Primjeri se mogu naći u US privremenoj patentnoj prijavi S.N. 60/096, 638, (odvjetinički broj prijave 20276PV, koji je ovim inkorporiran u svojoj cijelosti) koja je ovdje podnesena.
Stanica domaćina može biti bilo koja stanica domaćina koja se lako izdvaja u kulturama, stoje poznato u struci, uključujući kvasac (Saccharomyces cerevisiae), stanice insekata, bakterija ili sisavaca. Stanice kvasca su naročito poželjne.
Vektor može također sadržavati druge elemente poznate u struci, kao što su elementi kontrole transkripcije i translacije i/ili marker geni. Ekspresirani L1, L1 i L2, ili L1 i L2:fuzijski proteini se spontano asembliraju u VLP. Stanice domaćina su lizirane na uobičajen način, a zatim se stanični lizat djelomično pročišćava.
Korak djelomičnog pročišćavanja može uključivati poznate korake pročišćavanja, i nije kritičan u ovom izumu. Na primjer, stanični lizat može biti izložen postupku mikrofiltriran]a i najmanje jednom koraku kromatografije, kao kod kromatografije s izmjenom kationa.
Nađeno je u skladu s ovim izumom, da korak kromatografije, koristeći hidroksipatit kao medij u koloni, praćen eluiranjem s puferskom otopinom fosfatnih aniona, uklanja velike količine kontaminanata iz djelomično pročišćenih staničnih lizata.
Specifično, nađeno je da su uklonjeni iz lizata veći dio kontaminirajućih biomolekula, uključujući DNA, lipide i proteine.
U skladu s ovim izumom, konačni pročišćeni VLP preparat je općenito najmanje 75% čistoće, poželjno najmanje 80% čistoće, i najpoželjnije najmanje 90% čistoće, mjereno koristeći SDS/PAGE test.
Gotovo bilo koji komercijalno raspoloživ hidroksipatitski materijal za kolonu može se koristiti u ovom izumu. Poželjno je koristiti keramički hidroksipatit s veličinom čestica od približno 20-50 μm i veličinom pora od približno 800 A. Jedan takav komercijalno raspoloživ hidroksipatit prodaje BioRad kao "Keramički hidroksipatit, tip II". Međutim, drugi su jednako djelotvorni.
U pripravi koraka kromatografije u postupku pročišćavanja, preporuča se da je punjenje kolone s puferom pH 6-8, a poželjno oko 7. Poželjan pufer je 50 mM MOPS [3-(N-morfolin)propansulfonska kiselina] s pH 7.0 i također s 1.25MNaCl.
Drugi sistemi pufera koji se također mogu koristiti su poznati u struci i uključuju:
MES [2-(N-morfolino)etansulfonska kiselina];
BIS-TRIS [bis-(2-hidroksietil)amino]tris-(hidroksimetil)metan];
ADA [N-2-acetamidoimino octena kiselina, mononatrijeva sol];
ACES [N-2-acetamido-2-aminoetansulfonska kiselina, mononatrijeva sol];
PIPES [piperazin-N,N'-bis(2-etan-sulfonska kiselina)];
MOPSO [(3-N-morfolino)-2-hidroksipropan-sulfonska kiselina];
BIS-TRIS PROFAN [1,3-bis[tris(hidroksimetil)metil-amino]propan];
BES [N,N-bis-(2-hidroksimetil)-2-amino-etansulfonska kiselina];
TES [N-tris-(hidroksimetil)metil-2-aminoetan sulfonska kiselina]; i
2-2([2-hidroksi-1,1-bis(hidroksimetil)etil)amino]etan sulfonska kiselina];
HEPES [N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etan sulfonska kiselina];
DIPSO [3-(N,N-bis-(2-hidroksimetil)-amino)-2-hidroksi propansulfonska kiselina];
TAPSO [3-N-tris(hidroksimetil)metilamino]-2-hidroksi-propansulfonska];
TRIS [tris-(hidroksimetil)-aminoetan];
HEPPSO [N-(2-hidroksietil)-piperazin-N'-[2-hidroksi-propansulfonska kiselina];
POPSO [(piperazin-N,N'-bis-[2-hidrokspropansulfonska kiselina];
EPPS [N-[2-hidroksietil)-piperazin-N'-[3-propansulfonska kiselina i HEPPS];
TEA [trietanolamin];
TRICIN [N[tris-(hidroksimetil)metil]glicin];
BICIN [N,N-bis-(2-hidroksietil)-glicin];
TAPS [3-{[tris-(hidroksimetil)metil]amino}propan sulfonska kiselina];
imidazol;
HEPPS [N-2-hidroksietilpiperazin-N'-3-propan-sulfonska kiselina];
glicin amid, hidroklorid;
glicilglicin;
citrat;
acetat;
i sukcinatni puferi.
Djelomično pročišćeni VLP u puferiranoj otopini je doveden u kontakt s hidroksiapatitnim medijem pod uvjetima koji omogućavaju VLPu vezivanje na hidroksiapatit. Ovi uvjeti uključuju širok raspon temperatura; sobna temperatura je poželjna. Brzina protoka može znatno varirati, a preferirani opseg je 90 cm/satu.
Nakon vezivanja VLPa za hidroksiapatit, sljedeći je korak izdvajanje pročišćenog VLPa iz hidrokisapatita puferom za eluiranje. Poželjna otopina pufera za eluiranje sadrži fosfatni anion, kao stoje otopina natrij ili kalij fosfata. Poželjni molarni opsezi su od oko 0.05 M do oko l M, a najpoželjnije oko 0.2 M. pH pufera za eluiranje treba biti od oko pH 6-8, a najpoželjnije pH 7.
Druge prednosti metoda iz ovog izuma uključuju:
(a) nema zahtjeva za posebnom opremom i tehnikama kromatografije;
(b) metoda je brza, ne zahtjeva izmjene pufera, i
(c) metoda daje odličan prinos HPV L1.
Sljedeći ne-ograničavajući Primjeri su prikazani da bolje ilustriraju ovaj izum.
PRIMJERI
PRIMJER 1
PRIPRAVA DJELOMIČNO PROČIŠĆENOG LIZATA
Stanice kvasca transformirane da ekspresiraju VLP su sakupljene i smrznute na -70°C. Otopina smrznutih stanica kvasca je ostavljena da se otopi oko 3 sata na sobnoj temperaturi a zatim približno 18 sati na 4°C. BENZOSANE® (Nycomed Pharma A/S, Kopenhagen, Danska) (2.8 x 105 jedinica/mL i 0.21 mg proteina/mL) je dodano u staničnu otopinu do završne koncentracije od 750 jedinica po gramu težine mokre stanice, a u jednom je ogledu reducirana na 335 jedinica po gramu težine mokre stanice. Stanice su miješane 15 minuta, zatim razorene s pomoću dva prolaska kroz sanitiziran APV Gaulin 30CD homogenizator pri tlaku komore od 14,500 do 16,000 psi, rezultirajući disrupcijom stanica od 95%. Preostali lizat je lagano miješan 18 sati na 4°C.
Pročišćavanje mikrofiltracijom. Stanični lizat je pročišćen unakrsnom protočnom mikrofiltracijom u modu dijafiltracije, kako je opisano. Lizat je prebačen u sterilnu posudu za procesiranje s usjekom radijusa i inča, i izlaznim vratima. Mikrofilter je s porama od 0.65 mikrona, filterska kazeta od šupljeg fibera od 5 kvadratnih stopa površine (A/G Technologies #CFP-6-D-8A, Needham, MA), smještenom u A/G Technologies FlexStand® Benchtop Pilot sustav šupljeg fibera. Ostatak je dijafiltriran s 3 volumena dijafiltracijskog pufera (dolje) da se dobije pročišćeni lizat. Dijafiltracijski pufer je 0.2 M (Na+) MOPS, pH 7.0 + 0.4 M NaCl.
Kromatografija pročišćenog lizata. Pročišćeni lizat je frakcioniran kromatografijom na koloni koristeći POROS® 50 HS jaku kation -izmjenjivačku smolu za kromatografiju (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) pakiranu u kromatografskoj koloni. Kolona je isprana s 0.5 N NaOH prije uporabe. Kolona je ujednačena s HPV difiltracijskim puferom [0.2M (Na+) MOPS, pH 7.0 + 0.4 M NaCl] na sobnoj temperaturi. Hladni (4°C) pročišćeni lizat je pumpan na kolonu brzinom od 125 mL/minuti i kolona je isprana s 8 kolonskih volumena HPV kolonskog pufera A na sobnoj temperaturi [0.05M (Na+) MOPS, pH 7.0 + 0.5 M NaCl] pri 125 mL/minuti s linearnim gradijentom od 100% HPV kolonski pufer A prema 100% kolonski pufer B [0.05M (Na+) MOPS, pH 7.0 + 1.5 M NaCl]. Ukupni linearni gradijent je bio 10 kolonskih volumena i sakupljen je u 10 jednakih volumenskih frakcija. Prateći gradijent, kolona je isprana s dva kolonska volumena na sobnoj temperaturi HPV kolonskog pufera B pri 125 mL/minuti, koji su sakupljeni u dvije dodatne frakcije. Frakcije su sakupljene u sterilnim 2-litarskim plastičnim bocama i ostavljene na 4°C. Frakcije sa posljednjim UV-absorbirajućim pikom (A280 nm i A230 nm) u gradijentu su sakupljeni, filtrirani koristeći MILLIPAK-200 potrošnu filtersku jedinicu (Millipore, Bedford, MA) i ostavljeni na 4°C.
PRIMJER 2
HIDROKSIPATITNA KROMATOGRAFIJA
Svi koraci su izvršeni na sobnoj temperaturi. Kolona za kromatografiju (13 mm ID x 36), pakirana s keramičkim hidroksipatitom, tip II (BioRad kat.#7320081, Hercules, ČA), je ranije ekvilibrirana u 50 mM MOPS, pH 7.0 + 1.25 M NaCl. Djelomično pročišćena otopina HPVa iz Primjera l je stavljena na kolonu pri linearnom protoku od 90 cm/sat. Nakon što je aplikacija uzorka dovršena, kolona je isprana s osam kolonskih volumena pred-ekvilibracijskog pufera dok optička gustoća kolonskog efluenta nije dostigla gotovo nulu. HPV vakcinski produkt je eluiran s linearnim gradijentom od 0% do 100% eluacijskog pufera (0.2M natrij fosfat, pH 7.0 + 1.25 M NaCl), također uz linearni protok od 90 cm/sat. Ukupni volumen gradijenta bio je četiri volumena kolone. Frakcije koje sadrže produkt vakcine su određene pomoću RIA i Bradford proteinskog testa. Koncentracija proteina u produktu bila je 100 mg/mL.
Testovi: Bradfordovi proteinski testovi su izvođeni koristeći Coomassie Plus testni reagens (Pierce, Rockford, IL) koristeći kravlji serumski albumin (BSA) kao standard. Lowry proteinski testovi su vršeni po postupku iz Lowry i dr. 195 U. Biol. Chem. 193:265-270, koristeći BSA kao kalibracijski standard. Antigen je testiran višeslojnim ELISA-testom koristeći monoklonalno antitijelo koje je prepoznalo konformacijski epitop VLPa. Mikrofilterske ploče su prekrivene poliklonskim jarećim anti-HPV VLP antitijelima. Standardni i testni uzorci su razrijeđeni s PBS-om, s 1% w/v BSA, 0.1% TWEEN-20, i 0.1% natrij azida, te su dodani u jažice gdje je uhvaćen antigen, antitijelima vezanim na pločice. Monoklonalno anti-HPV LI VLP antitijelo (Chemicon, Temecula, ČA) je dodano u jažice da veže antigen uhvaćen antitijelima vezanim na pločice. Monoklonalna anti-HPV LI VLP antitijela su detektirana pomoću konjugata peroksidaze iz hrena sa anti-mišjim IgG antitjelima. Zatim je dodan kromogeni supstrat za hren peroksidazu, 3,3',5,5'-tetrametilbenzedin (Pierce) i mjerena je apsorpcija na 450 nm koja je proporcionalna koncentraciji LI VLPa u uzorku.
Dinamički kapacitet kolone za vakcinski produkt bio je 2.9 mg po mL smole po Bradfordu, i 4.6 mg po mL smole po RIA. Izdvajanje kroz ovaj korak bilo je 90% po Bradford proteinskom testu ili 82% po RIA, kada je kolona napunjena sa 100% kapaciteta. Izdvajanje je palo na 63% po Bradfordu i 50% po RIA, kada je kolona napunjena sa 8% kapaciteta.
PRIMJER 3
Uklanjanje drugih biomolekula HPV L1 uzorak pripravljen kako je opisano u Primjerima 1 i 2 je testiran na nazočnost DNA, koristeći PCR test. Rezultati, prikazani u tabeli dolje, pokazuju daje ova metoda kromatografije visoko djelotvorana u uklanjaju kontaminirajućeg DNA iz krajnjeg produkta.
[image]
PRIMJER 4
Pročišćavanje himernog VLP
Pročišćavanje HPV tip 16 L1/L2mini/E2 himernog VLP
Konstrukcija modificiranog L2 gena
YP3 Vektor (minimalni L2)
Ovaj vektor zadržava kodne sekvence za amino-kraj 69 amino kiselina i karboksi kraj 84 amino kiselina (aa) HPV 16 L2 , koji je fuziran u okviru pomoću sintetskog poli-linkera koji unosi jedinstvene Not I, Sac I, i Xho I restrikcijske emzimske lokacije i rezultira insertiranjem jednog ostatka glutaminske kiseline i mutacijom serinskog ostatka u glutaminsku kiselinu.
PCR "primeri" ili početnice (Midland Certified Reagents) su dizajnirani da amplificiraju L2 sekvence od nativnog L2 gena sadržanog u vektoru pGallO HPV 16 LI + L2.
"Primeri" I (5' - CTT CCC CCC GGG C AC AAA ACA AAA TGC -3'; SEKV. ID. BR. 1) i C (5' - CTC GAG CTC GCG GCC GCC TGT ACC CGA CCC - 3'; SEKV. ID. BR. 2) amplificirani na 265 bp sekvencu koja kodira amino kraj 69 aa i 23 bp uzvodne netranslirane sekvence, koja uključuje Srna I restrikcijsku enzimsku lokaciju.
"Primeri" C modificira i ekstendira L2 amino kraj -kodirajuću regiju i dodaju Not l, Sac I i Xho I restrikcijske enzimske lokacije nizvodno od L2 kodiraj ućih sekvenci.
"Primeri" A (5' - GCG GCC GCG AGC TCG AGG GTT ATA TTC CTG CAA ATA CAA-3'; SEKV. ID. BR. 3), C i D (5' - CCC TCC AGA TCT CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TG-3'; SEKV. ID. BR. 4) amplificiran na 285 bp sekvencu koja kodira karboksi kraj 84 aa L2 plus 6 bp koji je dodao Bgl II restrikcijsku enszmsku lokaciju. "Primer" A također je dodao 17 bp sekvencu s Not l, Sac I i Xho I lokacijama uzvodno od L2-kodirajuće sekvence.
Minimalna konstrukcija za L2 ekspresiju je asemblirana kroz komplementarne sekvence, dodane pomoću "primera" A i C. Izolirani DNA produkti I/C i A/D amplificirani gore navedenim reakcijama su oba korišteni u PCR reakciji koja je uključivala I i D oligose kao amplifikacijske "primere". Radi omogućavanja spajanja fragmenata kroz njihove 17 bp komplementarne sekvence, tri PCR ciklusa su izvedena na temperaturi vezivanja od 37°C, praćeno s 15 ciklusa na 57°C. Rezultirajući produkt amplifikacije bio je ligatiran tupim krajem u pcrScript (Stratagene, LaJolla) i transformiran u XL-1 plave MRF stanice (Stratagene, LaJolla). Pozitivni klonovi su identificirani PCR-om koristeći "primere" I i D, te potvrđeni restrikcijskom digest analizom. Konstrukcija je zatim verificirana automatskom analizom sekvence (Perkin Elmer, Inc., Foster City, ČA).
Plazmidska DNA iz odgovarajućeg izolata je zatim digestirana sa Sma I i Bgl II; fragment od približno 0.5 parova kilobaze (kb) je gel pročišćen i ligatiran s 15 kb Srna I i Bgl II pGALl 10 HPV16 LI vektorskim fragmentom. Kompetentne DH5 E. coli stanice (Gibco BRL, Rockville, MD) su transformirane u ligacijsku smjesu i transformanti odabrani na LB ampicilin pločama (Remel, Lenexa, KS). Klonovi su u početku pregledani PCR-om u kojem su korišteni uprimeri" D i I da amplificiraju dijelove L2; prikladni klonovi su zatim potvrđerni restrikcijskom digestivnom analizom. Klon kandidat YP3#1 je verificiran analizom sekvence, kako je gore navedeno.
YP3#1 je zatim korišten kao osnova za konstrukciju, u kojoj su insertirani geni koji kodiraju HPV16 E1, E2 ili E7 otvorene okvire čitanja.
Insercija HPV E protein-kodirajućih gena
Gen koji kodira HPV 16 E2 je dobiven PCR amplifikacijom HPV 16 pozitivnog kliničkog uzorka, koji je zatim direktno insertiran u u subklonski vektor pCRII (Stratagene, La Jolla, ČA) i sekvenca se verificira, kako je gore opisano. E2 gen je zatim modificiran na sljedeći način:
1) Okvirske Xho I, Nae I i Not I koje sadrže DNA sekvence su dodane na amino kraj E2. Dodatno, sekvence koje sadržavaju Not I, Nae I i Xho I su dodane na karboksil kraj E2 da olakšaju insertiranje unutar E2, na Not I i Xho I lokacijama.
2) DNA sekvence su izmjenjene PCR mutagenezom da kodiraju alanin ostatke, kodiraju na ostacima glutaminske kiseline 39 i izoleucina 73. Ovo je napravljeno radi inaktivacije E2 proteinske funkcije. Modificirani HPV16 E2 gen gore opisan, je digestiran s Not I i Xho I, te
ligatiran sa na sličan način digestiranim YP3#1 vektorom. Transformanti, koji su sadržavali pravilno insertirane E2 sekvence, su odabrani PCR-om, te sekvenca verificirana.
Ista strategija je korištena za gene koji kodiraju HPV16 E l i HPV16 E7. Za El, glicin 482 je izmjenjen u aspartinsku kiselinu; za E7, cistein 24 i glutaminska kiselina 26 su obje promjenjene u glicin, radi inaktivacije proteinske funkcije. Rezultirajući konstrukti su zatim korišteni u transformaciji kvasca za ekspresijsku analizu.
PRIMJER 5
Identifikacija i rast kvasca koji ekspresira himeričke VLP
Plazmidna DNA YP3#1 i derivati gore opisani su korišteni radi transformacije Saccharomyces cervisiae (MATa, Ieu2-04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, cir°) metodom sferoplasta (Hinnen i dr., 1978, Proc. Natl. Accad. Sci. USA 75:1929-1933). Transformirani sfereoplasti su stavljeni na selektivni medij (leucin minus) (Remel, Lenexa, KS). Klonovi su izolirani kroz dvije runde selekcije kolonije. Male tekuće kulture klonova kandidata su uzgojene do velike stanične gustoće na mediju s galaktozom. Sirovi ekstrakti su pripravljeni jakim mješanjem staklenim kuglicama, praćeno centrifugiranjem. Pročišćeni ekstrakti su analizirani na ekspresiju L1 i L2 komponente, a VLPi raznim metodama uključujući SDS PAGE, ELISA, imunoblotting, EIA, koristeći monoklonalna antitijela ili monospecifične poliklonalne antiserume koji prepoznaju L1 ili L2 ili amino ili karboksi kraj L2 ili L1 VLPa, ili E1, ili E2, ili E7, ili neki drugi protein ili peptid vezan na modificirani L2. Klonovi koji su ekspresirali L2 komponentu i formirali VLP, su odabrani za daljnju karakterizaciju. Jednolitarske ili 16-litarske kulture odabranih klonova su uzgajane u galaktozi, koja je sadržavala medij za pripravu himeričkih VLPa.
Peleti stanica su zamrznuti na -70°C. Smrznute stanice (mokra težina = 148g) su odmrznute i ponovno otopljene u 740 mL "breaking" pufera (200 mM MOPS, pH 7, l mM CaCl2) da se dobije približno 20% (w/v) smjese. Nukleaza BENZONASE® (Nycomed Pharma) je dodana u 750 jedinica/g mokre stanične težine. Stanična smjesa razbijena je pri tlaku od približno 19,000 psi u 5 koraka u Ml 10-Y mikrofluidizeru (Microfluidics Corp., Newton, MA). Stanični smjesa je sakupljena i držana na ledu za vrijeme lomljenja. Hematokrit test je pokazao > 80% loma.
Odstajali stanični lizat je pročišćen mikrofiltriranjem kroz kazetu sa šupljom teksturom, veličine pore 0.65 mikrona (A/G Technologies) koristeći aparat za mikrofiltraciju s tangencijalnim protokom u dijafiltracijskom modu. Lizat je dijafiltriran s tri volumena 0.25 M natrij citrata, 0.2 M MOPS, pH 7.0. Antigen je prošao kroz membranu i sakupljen je u Permeatu.
Dijafiltrirana 0.65 mm permeatska frakcija (3.9 L) je stavljena na 325 mL kolonu (l 1.2 cm ID x 3.3 cm) POROS® 50 HS smolu (Perspective Biosystems, Cambridge, MA), ekvilibriranu u 200 mM MOPS, pH 7, 250 mM natrij citrata. Kolona je isprana sa 8 volumena 50 mM MOPS, 0.5 M NaCl, 5 mM natrij fosfata, pH 7 i eluirana sa 10 volumenskim linearnim gradijentom od 0.5 do 1.5 M NaCl u istom puferu. Protočne i isprane frakcije su sakupljene na gomili, dok je l volumen frakcija sakupljen za vrijeme eluiranja. Kolonske frakcije su analizirane Western blot metodom i SDS-PAGE detekcijom s koloidnim Comassie. Frakcije koje su sadržavale uglavnom p55 protein su sakupljene.
50HS pool uzorka je analiziran na ukupne proteine BCA testom (Pierce). Na osnovu ukupnih proteina (168 mg), kolona keramičkog hidroksipatita (HA) tip II (Bio-Rad) je pretočena da se dobije l mL smole/2 mg proteina. Kolona je bila 2.6 cm ID x 15.7 cm. Kolona je ekvilibrirana u 50 mM MPPS, pH 7, 1.25 M NaCl, 5mM natrij fosfat. 50HS pool uzorka (770 mL) je filtrirana kroz 0.22 mm i aplicirana na HA kolonu pri brzini protoka od 113 cm/sat. Protok je sakupljan na gomili. HA kolona je isprana sa 5 volumena ekvilibracijskog pufera i eluirana s 8 volumenskim linearnim gradijentom, od 5 do 200 mM natrij fosfata, pH 7 u 1.25 M NaCl. Frakcije sakupljene za vrijeme eluiranja su analizirane Western blot metodom i SDS-PAGE s koloidalnom Coomassie detekcijom. Frakcije koje su pokazivale usporedivu čistoću i obogaćenje L1 proteinom su sakupljane. Sakupljene frakcije su filtrirane aseptički kroz 0.22 mm membranu i ostavljene na 4°C.
Ostaci iz ovog procesa i produkt su analizirani na HPV16 L1 koristeći specifičan EIA i na protein BCA testom. Konačni prinos pročišćenog produkta bio je 27 mg proteina sa specifičnom aktivnošću od 1.00 mg L1/mg proteina. Elektronski mikroskop je potvrdio nazočnost netaknutih VLP čestica, srednjeg promjera 32 nm. Za SDS-PAGE analizu čistoće, alikvota finalnog produkta je ukocentrirana TCA precipitacijom i analizirana metodom Western blot i SDS-PAGE sa koloidalnom Coomassie detekcijom. Kvantifikacija L1 napravljena je koristeći 2.5 mg punjenja, a kontaminanti kvasca su kvantificirani s 20.0 mg punjenja. Pokazano je denziometrijom daje L1 protein > 94% homogen. Ko-pročišćavanje L1 i L2minje dokazano specifičnom imunoblot analizom frakcija postupka.
Claims (9)
1. Postupak za pročišćavanje papiloma virus-sličnih čestica (VLP), naznačen time, da se sastoji od:
(a) stavljanja u kontakt djelomično pročišćenog staničnog lizata koji sadrži VLP sa hidroksipatitnim medijem u koloni za kromatografiju, pod uvjetima takvim da se VLP-i vezuju na hidroksipatitni medij.
(b) eluiranja vezanog VLP s otopinom fosfatnih aniona; i
(c) izdvajanja eluiranih VLP.
2. Postupak prema Zahtjevom 1, naznačen time, da se VLPi sastoje uglavnom od L1 proteina.
3. Postupak prema Zahtjevu 1, naznačen time, da su VLPi humani papilomavirus (HPV) VLPi.
4. Postupak prema Zahtjevu 3, naznačen time, da su VLPi odabrani od skupine koju čine: HPV tip 6a, HPV tip 6b, HPV tip 11, HPV tip 16, HPV tip 18, HPV tip 31, HPV tip 33 i HPV tip 45.
5. Postupak prema Zahtjevu 4, naznačen time, da su eluirani VLPi najmanje 75% čistoće.
6. Postupak prema Zahtjevu 4, naznačen time, da su eluirani VLPi najmanje 90% čistoće.
7. Postupak prema Zahtjevu 1, naznačen time, da se VLPi sastoje od L1 proteina i L2:fuzijskog proteina.
8. Postupak prema Zahtjevu 7, naznačen time, da L2:fuzijski protein ima L2 dio koji je manji od pune duljine.
9. Postupak priprave pročišćenog humanog papilomavirusa VLP produkta, naznačen time, daje pogodan za korištenje u ljudskoj vakcini, koji se sastoji od:
a) djelomičnog pročišćavanja staničnog lizata, gdje je stanični lizat od stanica kvasca, koje su transformirane tako da ekspresiranju HPV L1 VLP;
(d) stavljanja u kontakt djelomično pročišćenog staničnog lizata koji sadrži VLP sa hidroksipatitnim medijem u koloni za kromatografiju, pod uvjetima takvim da se VLP-i vezuju na hidroksipatitni medij;
c) eluiranja vezanih VLP sa otopinom fosfatnih aniona; i
d) izdvajanja eluiranih VLP.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9656898P | 1998-08-14 | 1998-08-14 | |
| PCT/US1999/017930 WO2000009671A1 (en) | 1998-08-14 | 1999-08-10 | Process for purifying human papillomavirus virus-like particles |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP20010113A2 true HRP20010113A2 (en) | 2002-02-28 |
Family
ID=22257989
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR20010113A HRP20010113A2 (en) | 1998-08-14 | 2001-02-14 | Process for purifying human papillomavirus virus-like particles |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6602697B1 (hr) |
| EP (1) | EP1105466B1 (hr) |
| JP (1) | JP4440471B2 (hr) |
| KR (1) | KR20010072470A (hr) |
| CN (1) | CN1354787A (hr) |
| AT (1) | ATE324436T1 (hr) |
| AU (1) | AU760633B2 (hr) |
| BR (1) | BR9913026A (hr) |
| CA (1) | CA2339034C (hr) |
| CY (1) | CY1105084T1 (hr) |
| CZ (1) | CZ2001570A3 (hr) |
| DE (1) | DE69931053T2 (hr) |
| DK (1) | DK1105466T3 (hr) |
| EA (1) | EA200100236A1 (hr) |
| ES (1) | ES2262333T3 (hr) |
| HR (1) | HRP20010113A2 (hr) |
| HU (1) | HUP0103091A3 (hr) |
| IL (1) | IL141130A0 (hr) |
| NZ (1) | NZ509610A (hr) |
| PL (1) | PL347472A1 (hr) |
| PT (1) | PT1105466E (hr) |
| SI (1) | SI1105466T1 (hr) |
| SK (1) | SK2232001A3 (hr) |
| WO (1) | WO2000009671A1 (hr) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TR200101055T2 (tr) * | 1998-10-16 | 2001-09-21 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Adjuvan sistemler ve aşılar |
| JP2000262280A (ja) * | 1999-03-18 | 2000-09-26 | Asahi Optical Co Ltd | ウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法およびワクチンの製造方法 |
| US6436402B1 (en) * | 1999-10-15 | 2002-08-20 | Merck & Co., Inc. | Process for making human papillomavirus virus-like particles with improved properties |
| GB0206360D0 (en) * | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Viral antigens |
| MY139500A (en) * | 2003-11-12 | 2009-10-30 | Merck Sharp & Dohme | Optimized expression of hpv 58 l1 in yeast |
| SG150501A1 (en) * | 2004-02-05 | 2009-03-30 | Millipore Corp | Porous adsorptive or chromatographic media |
| EP1730175B1 (en) * | 2004-03-24 | 2010-04-28 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Optimized expression of hpv 52 l1 in yeast |
| WO2006028214A1 (ja) | 2004-09-10 | 2006-03-16 | Asahi Glass Company, Limited | 経口投与ワクチン |
| EP1736538A1 (en) * | 2005-06-21 | 2006-12-27 | Cytos Biotechnology AG | Process for the preparative purification of virus-like-particles (VLPs) |
| WO2008027861A1 (en) * | 2006-08-30 | 2008-03-06 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | System and method for characterizing membranes and membrane filtration devices |
| LT2601970T (lt) * | 2006-09-29 | 2017-04-25 | Takeda Vaccines, Inc. | Vakcinos prieš noro virusą kompozicijos |
| AU2008217189B2 (en) * | 2007-02-22 | 2013-06-13 | Baxalta GmbH | Method of purification of hydrophobic proteins |
| CA2683977C (en) * | 2007-03-14 | 2017-04-25 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | A method of norovirus virus-like particle purification comprising ion exchange chromatography |
| US9428555B2 (en) | 2007-04-29 | 2016-08-30 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | Truncated L1 protein of Human Papillomavirus type 16 |
| US9364529B2 (en) | 2007-04-29 | 2016-06-14 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 18 |
| DK2154149T3 (da) * | 2007-05-29 | 2019-10-14 | Univ Xiamen | En trunkeret l1-protein af human papillomavirus 6 |
| US9433922B2 (en) * | 2007-08-14 | 2016-09-06 | Emd Millipore Corporation | Media for membrane ion exchange chromatography based on polymeric primary amines, sorption device containing that media, and chromatography scheme and purification method using the same |
| US20100266636A1 (en) * | 2007-09-18 | 2010-10-21 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Method of conferring a protective immune response to norovirus |
| KR20100083150A (ko) * | 2007-09-18 | 2010-07-21 | 리고사이트 파머슈티컬즈 인코퍼레이티드 | 노로바이러스에 대한 보호면역반응을 제공하는 방법 |
| EP2011573B1 (en) * | 2007-11-05 | 2010-07-21 | Agilent Technologies, Inc. | Freezing a microfluidic chip |
| US20090130738A1 (en) * | 2007-11-19 | 2009-05-21 | Mikhail Kozlov | Media for membrane ion exchange chromatography |
| CN102177233B (zh) * | 2008-08-08 | 2015-04-15 | 莱戈赛特医药股份有限公司 | 用于增强交叉反应性的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒 |
| WO2011088225A1 (en) * | 2010-01-15 | 2011-07-21 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Surface neutralization of apatite |
| SG184833A1 (en) | 2010-04-14 | 2012-11-29 | Emd Millipore Corp | Methods of producing high titer, high purity virus stocks and methods of use thereof |
| US8895707B2 (en) | 2010-08-18 | 2014-11-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Elution of proteins from hydroxyapatite resins without resin deterioration |
| EP2670704B1 (en) | 2011-02-02 | 2018-12-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Apatite surface neutralization with alkali solutions |
| CR20190540A (es) | 2011-07-11 | 2022-04-04 | Takeda Vaccines Inc | FORMULACIONES PARENTERALES DE VACUNAS CONTRA LOS NOVOVIRUS (Divisional 2014-0069) |
| RU2642287C2 (ru) * | 2011-12-01 | 2018-01-24 | Юниверсити Оф Кейп Таун | Химерная частица hpv |
| US9815695B2 (en) | 2012-05-30 | 2017-11-14 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | In situ restoration of apatite-based chromatography resins |
| JOP20130186B1 (ar) | 2012-06-22 | 2021-08-17 | Takeda Vaccines Montana Inc | تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات |
| KR101559622B1 (ko) * | 2012-07-30 | 2015-10-13 | 중앙대학교 산학협력단 | 인유두종바이러스 바이러스 유사입자의 고효율 정제방법 |
| JP6479305B2 (ja) * | 2013-07-12 | 2019-03-06 | 株式会社Ｕｍｎファーマ | ウイルス様粒子の精製方法 |
| WO2015200299A2 (en) | 2014-06-23 | 2015-12-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Apatite in-situ restoration |
| CN105392569B (zh) | 2014-06-23 | 2019-08-20 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 磷灰石预处理 |
| CN105907729B (zh) * | 2015-05-05 | 2019-08-16 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种制备人乳头瘤病毒l1蛋白类病毒样颗粒的方法 |
| CN108524929B (zh) * | 2017-03-06 | 2019-05-07 | 广州瑞贝斯药业有限公司 | 一种狂犬病疫苗的生产方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6078999A (ja) * | 1983-10-05 | 1985-05-04 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｓ抗原の精製方法 |
| SE9000650L (sv) | 1989-02-28 | 1990-08-29 | Asahi Optical Co Ltd | Separation av celler eller virus |
| CA2189882C (en) | 1994-05-16 | 2005-09-20 | Kathrin U. Jansen | Papillomavirus vaccines |
| JPH10506014A (ja) * | 1994-09-22 | 1998-06-16 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | ヒトパピローマウイルス６ａ型をコードするＤＮＡ |
| AR004464A1 (es) * | 1994-11-14 | 1998-12-16 | Merck Sharp & Dohme | Un metodo para producir una proteina de capside de papilomavirus |
| IL117459A (en) * | 1995-03-22 | 2005-11-20 | Merck & Co Inc | Dna encoding human papillomavirus type 18 |
| IL117591A0 (en) * | 1995-03-30 | 1996-07-23 | Merck & Co Inc | Synthetic DNA encoding human papillomavirus type 11 L1 protein |
| WO1997008298A1 (en) * | 1995-08-30 | 1997-03-06 | Genzyme Corporation | Chromatographic purification of adenovirus and aav |
-
1999
- 1999-08-10 PL PL34747299A patent/PL347472A1/xx unknown
- 1999-08-10 WO PCT/US1999/017930 patent/WO2000009671A1/en active IP Right Grant
- 1999-08-10 US US09/762,662 patent/US6602697B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-10 NZ NZ50961099A patent/NZ509610A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-08-10 AT AT99940950T patent/ATE324436T1/de active
- 1999-08-10 CA CA 2339034 patent/CA2339034C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-10 EA EA200100236A patent/EA200100236A1/ru unknown
- 1999-08-10 PT PT99940950T patent/PT1105466E/pt unknown
- 1999-08-10 BR BR9913026A patent/BR9913026A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-08-10 KR KR1020017001885A patent/KR20010072470A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-08-10 EP EP99940950A patent/EP1105466B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-10 CN CN99811968A patent/CN1354787A/zh active Pending
- 1999-08-10 AU AU54698/99A patent/AU760633B2/en not_active Expired
- 1999-08-10 ES ES99940950T patent/ES2262333T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-10 SK SK223-2001A patent/SK2232001A3/sk unknown
- 1999-08-10 SI SI9930901T patent/SI1105466T1/sl unknown
- 1999-08-10 IL IL14113099A patent/IL141130A0/xx unknown
- 1999-08-10 DK DK99940950T patent/DK1105466T3/da active
- 1999-08-10 JP JP2000565108A patent/JP4440471B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-10 HU HU0103091A patent/HUP0103091A3/hu unknown
- 1999-08-10 CZ CZ2001570A patent/CZ2001570A3/cs unknown
- 1999-08-10 DE DE1999631053 patent/DE69931053T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-02-14 HR HR20010113A patent/HRP20010113A2/hr not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-07-11 CY CY20061100963T patent/CY1105084T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU5469899A (en) | 2000-03-06 |
| CZ2001570A3 (cs) | 2001-09-12 |
| DK1105466T3 (da) | 2006-08-14 |
| AU760633B2 (en) | 2003-05-22 |
| SK2232001A3 (en) | 2001-08-06 |
| CA2339034C (en) | 2010-10-12 |
| DE69931053D1 (de) | 2006-06-01 |
| JP2003520188A (ja) | 2003-07-02 |
| PT1105466E (pt) | 2006-07-31 |
| IL141130A0 (en) | 2002-02-10 |
| CN1354787A (zh) | 2002-06-19 |
| JP4440471B2 (ja) | 2010-03-24 |
| ES2262333T3 (es) | 2006-11-16 |
| EP1105466B1 (en) | 2006-04-26 |
| HUP0103091A3 (en) | 2002-03-28 |
| KR20010072470A (ko) | 2001-07-31 |
| BR9913026A (pt) | 2001-09-25 |
| CA2339034A1 (en) | 2000-02-24 |
| NZ509610A (en) | 2002-10-25 |
| DE69931053T2 (de) | 2006-11-23 |
| SI1105466T1 (sl) | 2006-08-31 |
| PL347472A1 (en) | 2002-04-08 |
| CY1105084T1 (el) | 2009-11-04 |
| EP1105466A4 (en) | 2002-05-15 |
| WO2000009671A1 (en) | 2000-02-24 |
| HUP0103091A2 (hu) | 2001-12-28 |
| US6602697B1 (en) | 2003-08-05 |
| EA200100236A1 (ru) | 2001-08-27 |
| ATE324436T1 (de) | 2006-05-15 |
| EP1105466A1 (en) | 2001-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HRP20010113A2 (en) | Process for purifying human papillomavirus virus-like particles | |
| Cook et al. | Purification of virus-like particles of recombinant human papillomavirus type 11 major capsid protein L1 from Saccharomyces cerevisiae | |
| KR101576219B1 (ko) | 바이러스 유사 입자 정제 | |
| Kim et al. | One-step chromatographic purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae | |
| Li et al. | Characterization of self-assembled virus-like particles of human polyomavirus BK generated by recombinant baculoviruses | |
| JPS61158795A (ja) | アデノウイルスプロモ−タ−の制御下で所定のポリペプチドをコ−ドしているヌクレオチド配列を含む組換えｄｎａ | |
| Sviben et al. | Recovery of infective virus particles in ion-exchange and hydrophobic interaction monolith chromatography is influenced by particle charge and total-to-infective particle ratio | |
| Lin et al. | Development of EV71 virus-like particle purification processes | |
| GB2604692A (en) | Method for preparing recombinant subunit vaccine against novel coronavirus | |
| JPS63500662A (ja) | 乳頭腫ウイルスの特徴を示すポリペプチドを含む組成物 | |
| SUN et al. | Sequences required for the nuclear targeting and accumulation of human papillomavirus type 6B L2 protein | |
| Wetzel et al. | Bioprocess optimization for purification of chimeric VLP displaying BVDV E2 antigens produced in yeast Hansenula polymorpha | |
| US20080044378A1 (en) | Methods and Compositions for Protein Production Using Adenoviral Vectors | |
| US6991795B1 (en) | Protein delivery system using human papillomavirus virus-like particles | |
| CA2339324C (en) | Protein delivery system using human papillomavirus virus-like particles | |
| Gerstweiler et al. | Virus‐like particle preparation is improved by control over capsomere‐DNA interactions during chromatographic purification | |
| Christensen et al. | Identification and characterization of a DNA binding domain on the adenovirus IVa2 protein | |
| Swartz et al. | Binding of Coxsackievirus A21 procapsids to immobilized glutathione depends on cell culture conditions during infection | |
| US5077213A (en) | Recombinant vaccinia virus | |
| KR20230118619A (ko) | 아데노바이러스의 정제 방법 | |
| JPH02475A (ja) | Ｖｅｒｏ細胞、酵母細胞又はｌ細胞からの組換えエプスタイン−バールウイルス抗原の精製 | |
| JP4268384B2 (ja) | 日本脳炎ウイルス抗原及びその製造方法 | |
| MXPA01001647A (en) | Process for purifying human papillomavirus virus-like particles | |
| WO2015128788A1 (en) | Purification of papillomavirus l2 protein | |
| Wong | Purification of the Bovine Papillomavirus Type 1 L1 Capside Protein from Escherichia Coli |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| OBST | Application withdrawn |