JP2003520188A

JP2003520188A - ヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子の精製方法

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Publication number: JP2003520188A
Application number: JP2000565108A
Authority: JP
Inventors: クツク，ジエイムズ・シー，ザ・サード
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2003-07-02
Anticipated expiration: 2019-08-10
Also published as: AU5469899A; CZ2001570A3; DK1105466T3; AU760633B2; SK2232001A3; CA2339034C; DE69931053D1; PT1105466E; IL141130A0; CN1354787A; JP4440471B2; ES2262333T3; EP1105466B1; HUP0103091A3; KR20010072470A; BR9913026A; CA2339034A1; NZ509610A; HRP20010113A2; DE69931053T2

Abstract

(57)【要約】パピローマウイルスのウイルス様粒子（VLP）の精製方法は、部分精製されたVLP含有溶液をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムに通過させる工程を含む。ついでリン酸陰イオンを含有するバッファーを使用して該VLPを溶出する。この方法の利点には、高純度の無傷VLPの回収が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、ワクチン成分として使用しうるパピローマウイルス（HPV）のウイ
ルス様粒子（VLP）の製造方法および精製方法に関する。

【０００２】（発明の背景）パピローマウイルス感染症は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ヘ
ビおよびウシを含む種々の動物において生じる。パピローマウイルスは、上皮細
胞に感染し、一般には、良性の上皮性腫瘍または線維上皮腫を感染部位において
誘発する。パピローマウイルスは種特異的感染因子であり、ヒトパピローマウイ
ルスがヒト以外の動物に感染することはない。

【０００３】パピローマウイルスは、それらが感染する宿主に基づいて様々なグループに分
類することができる。ヒトパピローマウイルス（HPV）は更に、DNA配列相同性に
基づいて70個以上の型に分類されている（総説としては、Papillomaviruses and
Human Cancer, H. Pfister (編), CRC Press, Inc., 1990を参照されたい）。
ある1つのパピローマウイルス型に対する感染に対する中和免疫は別のパピロー
マウイルス型に対する免疫を付与しない点で、パピローマウイルスの型は型特異
的免疫原であるらしい。

【０００４】パピローマウイルスは、8個までの初期遺伝子および2個の後期遺伝子をコード
する小型（50〜60nm）でエンベロープを有さない二十面体DNAウイルスである。
そのウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム（ORF）はE1〜E7ならびにL
1およびL2と称され、この場合の「E」は初期を意味し、「L」は後期を意味する
。L1およびL2は、ウイルスカプシドタンパク質をコードする。初期（E）遺伝子
は、ウイルス複製および細胞トランスフォーメーションなどの機能に関連してい
る。

【０００５】 L1タンパク質は主要なカプシドタンパク質であり、55〜60kDaの分子量を有す
る。L2タンパク質は副次的なカプシドタンパク質であり、55〜60kDaの推定分子
量および75〜100kDaの見掛け分子量（ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定し
た場合）を有する。免疫学的データは、L2タンパク質の大部分がL1タンパク質の
内部に存在すると示唆している。L2タンパク質（特に、そのC末端の10個の塩基
性アミノ酸）は、種々のパピローマウイルス間で高度に保存されている。L1 ORF
は、種々のパピローマウイルス間で高度に保存されている。

【０００６】組換えL1タンパク質は種々の宿主において作製されており、それは単独で又は
L2と共に、適当な条件下で自己集合してウイルス様粒子（VLP）を形成する。VLP
は商業用ワクチンの候補である。しかしながら、VLPがヒトワクチンにおいて有
用であるためには、VLPが高度に精製され宿主細胞混入物を含まないものでなけ
ればならない。これまでのところ、混入生体分子を除去するためにダイアフィル
トレーション方式でのクロスフロー（cross-flow）限外濾過が用いられている。
しかしながら、この方法はHPV L1のタンパク質分解を引き起こした。高純度で非
分解性の産物を与えるL1タンパク質の精製方法を得ることが望ましいであろう。

【０００７】（発明の概要）本発明は、組換えパピローマウイルス（HPV）のウイルス様粒子（VLP）の精製
方法であって、部分精製されたVLP含有細胞ライセートとクロマトグラフィーカ
ラム内のヒドロキシアパタイト媒体とを、該VLPが該ヒドロキシアパタイト媒体
に結合する条件下で接触させ、リン酸陰イオンを含む溶液で該結合VLPを溶出し
、溶出したVLPを回収する工程を含んでなる方法に関する。

【０００８】該精製方法は、L1タンパク質より実質的になるVLPに使用することができ、L1
およびL2タンパク質を含むVLPにも使用することができる。また、それは、キメ
ラ体の（すなわち、L1タンパク質およびL2:融合タンパク質を含有する）VLPにも
使用することもできる。一般に、ワクチン用途には、L1タンパク質だけを含有す
るVLPが好ましい。

【０００９】該方法は、実質的に任意のパピローマウイルス株に由来するVLPに適用可能で
ある。ヒトパピローマウイルス（HPV）を使用することが好ましい。好ましいHPV
株としては、最も重篤な病態を引き起こすことが知られているHPV株（HPV 6a型
、HPV 6b型、HPV 11型、HPV 16型、HVP 18型、HVP 31型、HVP 33型およびHVP 45
型を含む）が挙げられる。

【００１０】一般には、L1またはL1およびL2タンパク質、あるいはL1およびL2:融合タンパ
ク質をコードするベクターで宿主細胞を形質転換する。

【００１１】本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり用いる「L2:融合タンパク質」
なる語は、L2タンパク質をコードするDNAが、所望のタンパク質（好ましくは、E
1、E2、E3、E4、E5、E6またはE7などのHPVに由来するもう1つのタンパク質）を
コードするもう1つのDNAに作動的に結合していることを意味する。該融合タンパ
ク質のL2部分は完全長であってもよく、あるいはそれは欠失および／またはトラ
ンケート化体を有していてもよい。具体例は、本出願と共に出願された同時係属
米国仮特許出願S.N. 60/096,638（Attorney Docket Number 20276PV; それを参
照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。

【００１２】該宿主細胞は、当技術分野において公知の容易に培養される任意の宿主細胞で
あってもよい。それらの宿主細胞には、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae））、昆虫細胞、細菌または哺乳類細胞が含まれる。酵
母細胞が特に好ましい。

【００１３】また、該ベクターは、当技術分野において公知の他の要素（例えば、転写およ
び翻訳制御要素、および／またはマーカー遺伝子）を含有していてもよい。発現
されたL1、L1およびL2、またはL1およびL2:融合タンパク質は、自発的に集合し
てVLPを形成するであろう。典型的には、宿主細胞を細胞溶解し、ついで該細胞
ライセートを部分的に精製する。

【００１４】該部分精製工程は、一般に用いられる精製工程を含むものであってもよく、本
発明における決定的な工程とはみなされない。例えば、該細胞ライセートを精密
濾過法、および少なくとも1つのクロマトグラフィー工程（例えば、陽イオン交
換クロマトグラフィー）に付すことができる。

【００１５】カラム媒体としてヒドロキシアパタイトを使用するクロマトグラフィー工程、
およびそれに続く、リン酸陰イオンを含有するバッファー溶液での溶出により、
部分精製細胞ライセートから大量の混入物が除去されることが、本発明において
見出された。特に、ほとんどの混入生体分子（DNA、脂質およびタンパク質を含
む）が該ライセートから除去されることが判明した。

【００１６】本発明では、最終的な精製されたVLP調製物は、一般には、少なくとも75％の
純度、好ましくは少なくとも80％の純度、より好ましくは少なくとも90％の純度
（SDS/PAGEアッセイを用いて測定した場合）を有する。

【００１７】商業的に入手可能な実質的に任意のヒドロキシアパタイトカラム物質を本発明
において使用することができる。約20〜50μmの粒径および約800オングストロー
ムの孔径を有するセラミックヒドロキシアパタイトが好ましい。そのような1つ
の商業的に入手可能なヒドロキシアパタイトは、BioRadから「セラミック・ヒド
ロキシアパタイトII型（Ceramic hydroxyapatite, Type II）」として販売され
ている。しかしながら、その他のものも有効である。

【００１８】該精製方法のクロマトグラフィー工程の準備の際、該カラムフィード（column
feed）をpH 6〜8、好ましくはpH 7のバッファー中に配置することが推奨される
。好ましいバッファーは、1.25M NaClをも含有する50mM MOPS [3-(N-モルホリノ
)プロパンスルホン酸]（pH 7.0）である。

【００１９】同様に使用することができる他のバッファー系は当業者に明らかであり、それ
らには、MES [2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸]、BIS-TRIS [ビス-(2-ヒドロ
キシエチル)-アミノ]トリス-(ヒドロキシメチル)メタン]、ADA [N-2-アセトアミ
ドイミノ二酢酸・一ナトリウム塩]、ACES [N-2-アセトアミド-2-アミノエタンス
ルホン酸]、PIPES [ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタン-スルホン酸)]、MOPSO [(3-
N-モルホリノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸]、BIS-TRIS PROPANE [1,3-ビ
ス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパン]、BES [N,N-ビス-(2-ヒド
ロキシエチル)-2-アミノ-エタンスルホン酸]、TES [N-トリス(ヒドロキシメチル
)メチル-2-アミノエタン-スルホン酸および2-2([2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロ
キシメチル)エチル)アミノ]エタンスルホン酸]、HEPES [N-2-ヒドロキシエチル
ピペラジン-N'-2-エタン-スルホン酸]、DIPSO [3-(N,N-ビス(2-ヒドロキシエチ
ル)アミノ)-2-ヒドロキシ-プロパンスルホン酸]、TAPSO [3-N-トリス(ヒドロキ
シメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシ-プロパンスルホン酸]、TRIS [トリス-(
ヒドロキシメチル)-アミノメタン]、HEPPSO [N-(2-ヒドロキシエチル)-ピペラジ
ン-N'-[2-ヒドロキシ-プロパンスルホン酸)]、POPSO [(ピペラジン-N,N'-ビス[2
-ヒドロキシプロパンスルホン酸)]、EPPS [N-[2-ヒドロキシエチル]-ピペラジン
-N'-[3-プロパンスルホン酸およびHEPPS]、TEA [トリエタノールアミン]、TRICI
NE [N[トリス-(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン]、BICINE [N,N-ビス-(2-ヒ
ドロキシエチル]-グリシン]、TAPS [3-{[トリス-(ヒドロキシメチル)メチル]ア
ミノ}-プロパンスルホン酸]、イミダゾール、HEPPS [N-2-ヒドロキシエチルピペ
ラジン-N'-3-プロパン-スルホン酸]、グリシンアミド塩酸塩、グリシルグリシン
、クエン酸塩、酢酸塩およびコハク酸塩バッファーが含まれる。

【００２０】該緩衝化溶液中の部分精製VLPと該ヒドロキシアパタイト媒体とを、該VLPが該
ヒドロキシアパタイトに結合するのを可能にする条件下で接触させる。これらの
条件は広い温度範囲を含むが、室温が好ましい。流速も多種多様となりうるが、
好ましい範囲は約90cm/時である。

【００２１】該VLPが該ヒドロキシアパタイトに結合した後の次の工程は、溶出バッファー
で該精製VLPを該ヒドロキシアパタイトから回収することである。好ましい溶出
バッファー溶液は、リン酸陰イオン、例えば、リン酸ナトリウムまたはカリウム
溶液を含有する。好ましいモル濃度範囲は、約0.05M〜約1Mであり、約0.2Mが好
ましい。該溶出バッファーのpHは約pH 6〜8の範囲であり、約7のpHが好ましい。

【００２２】本発明方法の他の利点には、（a）特別なクロマトグラフィー装置も技術も必
要としないこと、（b）該方法が迅速でありバッファーの交換を要しないこと、
および（c）該方法が優れた収量のHPV L1を与えること、が含まれる。

【００２３】以下に記載の非限定的な実施例は、本発明を更に例示するものである。

【００２４】（実施例）実施例1 部分精製ライセートの調製 VLPを発現するように形質転換された酵母細胞を収穫し、貯蔵用に-70℃で凍結
した。凍結酵母細胞懸濁液を貯蔵庫から取り出し、室温で約3時間、ついで4℃で
約18時間で融解した。BENZONASE（登録商標）（Nycomed Pharma A/S, Copenhage
n, Denmark）（2.8 x 10⁵単位/mLおよびタンパク質0.21mg/mL）を該細胞懸濁液
に、湿潤細胞重量1g当たり750単位の最終濃度まで加えた（1つの実験においては
、湿潤細胞重量1g当たり335単位に減らした）。細胞を15分間攪拌し、ついで14,
500〜16,000psiのチャンバー圧の衛生化APV Gaulin 30CDホモジナイザーに2回付
すことにより破壊して、95％の細胞破壊を達成した。残りのライセートを穏やか
に4℃で18時間攪拌した。

【００２５】精密濾過による清澄化以下のとおり、ダイアフィルトレーション方式のクロスフロー精密濾過により
、細胞ライセートを清澄化した。ライセートを、1インチ径の入口および出口を
有する無菌プロセスタンクに移した。該マイクロフィルター（microfilter）は
、A/G Technologies FlexStand（登録商標）Benchtop Pilot Hollow Fiber系内
に収容された孔径0.65ミクロンおよび表面積5平方フィートの中空線維フィルタ
ーカートリッジ（A/G Technologies #CFP-6D-8A, Needham, MA）であった。該濃
縮水を3容積のダイアフィルトレーションバッファー（後記）でのダイアフィル
トレーションに付して、該清澄化ライセートを得た。ダイアフィルトレーション
バッファーは0.2M (Na⁺) MOPS、pH7.0 + 0.4M NaClであった。

【００２６】清澄化ライセートのクロマトグラフィークロマトグラフィーカラム内に充填されたPOROS（登録商標）50HS強陽イオン
交換クロマトグラフィー樹脂（PerSeptive Biosystem, Framingham,MA）を使用
するカラムクロマトグラフィーにより、該清澄化ライセートを分画した。該カラ
ムを、使用前に0.5N NaOHで清潔にした。該カラムをHPVダイアフィルトレーショ
ンバッファー（Diafiltration Buffer）[0.2M (Na⁺)MOPS、pH7.0 + 0.4M NaCl]
で室温で平衡化した。該低温（4℃）清澄化ライセートを125mL/分で送り出し、8
カラム容積の室温HPVカラムバッファー（Column Buffer）A [0.05M (Na⁺)MOPS、
pH7.0 + 0.5M NaCl]を使用して、100％ HPVカラムバッファーAから100％ HPVカ
ラムバッファーB [0.05M (Na⁺)MOPS、pH7.0 + 1.5M NaCl]までの直線勾配で、12
5mL/分にて該カラムを洗浄した。全直線勾配は10カラム容積であった。それを10
個の等容積の画分中に集めた。該勾配洗浄の後、該カラムを2カラム容積の室温H
PVカラムバッファーBで125mL/分で洗浄し、それを2個の追加的な画分中に集めた
。画分を2リットルの無菌プラスチックボトル中に集め、4℃で保存した。該勾配
中の最後のUV吸収ピーク（A280nmおよびA230nm）を含有する画分をプールし、MI
LLIPAK-200使い捨てフィルターユニット（Millipore, Bedford, MA）を使用して
濾過し、4℃で保存した。

【００２７】実施例2 ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーすべての工程を室温で行った。セラミックヒドロキシアパタイトII型（Cerami
c Hydroxyapatite, Type II）（BioRad Cat#7320081, Hercules, CA）を充填し
たクロマトグラフィーカラム（13mm ID x 36mm）を、50mM MOPS、pH7.0 + 1.25M
NaClで予め平衡化した。実施例1からの部分精製HPV溶液を、線流速90cm/時で該
カラムにアプライした。サンプルのアプライが完了した後、該カラム流出液の光
学濃度が0に近くなるまで該カラムを8カラム容積の前平衡化バッファーで洗浄し
た。該HPVワクチン産物を0％〜100％の直線勾配の溶出バッファー（0.2Mリン酸
ナトリウム pH7.0 + 1.25M NaCl）で、再び線流速90cm/時で溶出した。該勾配の
全容積は4カラム容積であった。該ワクチン産物を含有する画分をRIAおよびブラ
ッドフォード（Bradford）タンパク質アッセイにより同定した。該タンパク質の
タンパク質濃度は100μg/mLであった。

【００２８】アッセイ：ウシ血清アルブミンを標準体として使用するクーマシー・プラス・アッセイ試薬
（Coomassie Plus Assay Reagent）（Pierce, Rockford, IL）を用いて、ブラッ
ドフォードタンパク質アッセイを行った。BSAを検定標準として使用してLowryら
1951 J. Biol. Chem. 193:265-270の方法に従い、ローリータンパク質アッセイ
を行った。VLPのコンホメーションエピトープを認識するモノクローナル抗体を
使用する多層ELISAにより、抗原をアッセイした。マイクロタイタープレートを
ポリクローナルヤギ抗HPV VLP抗体でコートした。標準体および試験サンプルを
、1％ w/v BSA、0.1％ TWEEN-20および0.1％アジ化ナトリウムを含有するPBSで
希釈し、該ウェルに加え、該ウェル内で抗原を該プレート結合抗体により捕捉し
た。モノクローナル抗HPV L1 VLP抗体（Chemicon, Temecula, CA）を該ウェルに
加えて、該プレート結合抗体により捕捉された抗原に結合させた。該モノクロー
ナル抗HPV VLP抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役抗マウスIgG抗
体により検出した。ホースラディッシュペルオキシダーゼの発色基質3,3',5,5'-
テトラメチルベンジジン（Pierce）を加えた。450nmの吸収は該サンプル中のL1
VLPの濃度に比例した。

【００２９】該ワクチン産物に関する該カラムの動的容量は、ブラッドフォードでは樹脂1m
L当たり2.9mgであり、RIAでは樹脂1mL当たり4.6mgであった。この工程による回
収率は、該カラムに100％容量でローディングした場合には、ブラッドフォード
タンパク質アッセイでは90％、あるいはRIAでは82％であった。該カラムに8％容
量でローディングした場合には、該回収率はブラッドフォードでは63％、RIAで
は50％に低下した。

【００３０】実施例3 他の生体分子の除去実質的に実施例1および2に記載のとおりに調製したHPV 11 L1サンプルを、PCR
に基づくアッセイを用いてDNAの存在に関してアッセイした。以下の表に記載す
る結果は、このクロマトグラフィー法が、最終産物から混入DNAを除去するのに
非常に効果的であることを示している。

【００３１】

【表１】

【００３２】実施例4 キメラVLPの精製 HPV 16型L1/L2_mini/E2キメラVLPの精製修飾L2遺伝子の構築 YP3ベクター（最小L2）このベクターは、唯一のNotI、SacIおよびXhoI制限酵素部位を導入し1つのグ
ルタミン酸残基の挿入とセリンからグルタミン酸へ突然変異とをもたらす合成ポ
リリンカーによりインフレームで融合したHPV16 L2のアミノ末端の69アミノ酸お
よびカルボキシ末端の84アミノ酸（aa）をコード配列を保有する。

【００３３】ベクターpGal110 HPV16 L1 + L2内に含まれる天然L2遺伝子からL2配列を増幅
するようなPCRプライマー（Midland Certified Reagents）を設計した。

【００３４】プライマーI（5'-CTT CCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC-3'; 配列番号1）お
よびC（5'-CTC GAG CTC GCG GCC GCC TGT ACC CGA CCC-3'; 配列番号2）は、ア
ミノ末端の69アミノ酸および23bpの上流非翻訳配列（SmaI制限酵素部位を含む）
をコードする265bpの配列を増幅した。プライマーCは、L2アミノ末端コード領域
と、該L2コード配列の下流の追加的なNotI、SacIおよびXhoI制限酵素部位とを修
飾し伸長した。

【００３５】プライマーA（5'-GCG GCC GCG AGC TCG AGG GTT ATA TTC CTG CAA ATA CAA-3'
; 配列番号3）、CおよびD（5'-CCC TCC AGA TCT CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC
TG-3'; 配列番号4）は、L2のカルボキシ末端の84アミノ酸をコードする285bpの
配列と、BglII制限酵素部位を付加する6bpとを増幅した。また、プライマーAは
、該L2コード配列の上流にNotI、SacIおよびXhoI部位を含有する17bpの配列を付
加した。

【００３６】最小L2発現構築物を、プライマーAおよびCにより付加された相補的配列を介し
て集合させた。前記のI/CおよびA/D増幅反応の単離されたDNA産物を共に、増幅
プライマーとしてIおよびDオリゴを用いるPCR反応において使用した。それらの
断片がそれらの17bpの相補的配列を介して結合するのを促進するために、3サイ
クルのPCRを37℃のアニーリング温度で行い、ついで15サイクルのPCRを57℃で行
った。得られた増幅産物を平滑末端化し、pcrScript（Stratagene, LaJolla、 C
A）内に連結し、XL-1 Blue MRF'細胞（Stratagene, LaJolla）内に形質転換した
。陽性クローンを、プライマーIおよびDを使用するPCRにより同定し、制限消化
分析により確認した。ついで該構築物を自動配列分析（Perkin Elmer, Inc., Fo
ster City, CA）により確認した。

【００３７】ついで適当な単離物からのプラスミドDNAをSmaIおよびBalIIで消化した。約0.
5キロベースペア（kb）の断片をゲル精製し、14kbのSmaI-BalII pGAL110 HPV16L
1ベクター断片に連結した。コンピテントDH5大腸菌（E. coli）細胞（Gibco BRL
, Rockville, MD）を該連結混合物で形質転換し、形質転換体をLBアンピシリン
プレート（Remel, Lenexa, KS）上で選択した。L2の部分を増幅するためにプラ
イマーDおよびIを使用するPCRにより、クローンを初期スクリーニングした。つ
いで適当なクローンを制限消化分析により確認した。候補クローンYP3#1を、前
記のとおりの配列分析により確認した。

【００３８】ついで、HPV16 E1、E2またはE7オープンリーディングフレームをコードする遺
伝子が挿入されたバックボーン構築物として、YP3#1を使用した。

【００３９】HPV Eタンパク質をコードする遺伝子の挿入 HPV 16 E2をコードする遺伝子をHPV16陽性臨床サンプルのPCR増幅により得、
ついでそれをサブクローニングベクターpCRII（Stratagene, LaJolla, CA）内に
直接挿入し、前記のとおりに配列を確認した。ついで該E2遺伝子配列を、以下の
とおりに修飾した。

【００４０】 1）インフレームXhoI、NaeI、NotI含有DNA配列をE2のアミノ末端部分に付加し
た。また、NotI、NaeIおよびXhoI含有配列をE2のカルボキシル末端部分に付加し
て、E2内のNotI、XhoI部位への挿入を容易にした。

【００４１】 2）グルタミン酸39およびイソロイシン73の残基がアラニン残基をコードする
よう、該DNA配列をPCR突然変異誘発により改変した。これは、E2タンパク質の機
能を不活性化するように設計された。

【００４２】前記の修飾HPV16 E2遺伝子をNotI、XhoIで消化し、同様に消化されたYP3#1ベ
クターに連結した。適切に挿入されたE2配列を含有する形質転換体をPCRにより
選択し、配列を確認した。

【００４３】同じ方法を、HPV16 E1およびHPV16 E7をコードする遺伝子に用いた。E1では、
グリシン482をアスパラギン酸に変化させ、E7では、システイン24およびグルタ
ミン酸26を共にグリシンに変化させてタンパク質機能を不活性化した。ついで、
得られた構築物を、発現分析のために酵母の形質転換に使用した。

【００４４】実施例5 キメラVLPを発現する酵母の同定および増殖 YP3#1および前記誘導体のプラスミドDNAを使用して、サッカロミセス・セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）（MATa, leu2-04, prb::HIS3, mnn9::URA3,
cir⁰）をセフェロプラスト法（Hinnenら, 1978, Proc. Natl. Acad. USA 75:192
9-1933）により形質転換した。形質転換されたセフェロプラストを選択（ロイシ
ン-）培地（Remel, Lenexa, KS）上にプレーティングした。2ラウンドの単コロ
ニー選択により、クローンを単離した。候補クローンの小さな液体培養物を、ガ
ラクトース含有培地内で高い細胞密度にまで増殖させた。粗抽出物を、ガラスビ
ーズでの激しい攪拌により調製し、ついで遠心分離した。L1、またはL2、または
L2のアミノもしくはカルボキシ末端、またはL1 VLP、またはE1、またはE2、また
はE7、または該修飾L2に融合した他の任意のタンパク質もしくはペプチドを認識
するモノクローナル抗体または単特異性ポリクローナル抗血清を使用するSDS PA
GE、ELISA、免疫ブロットおよびEIAを含む種々の方法により、該清澄化抽出物を
L1、L2成分およびVLPの発現に関して分析した。L2成分を発現しVLPを形成したク
ローンを、さらなる特徴づけのために選択した。選択したクローンの培養物1リ
ットルまたは16リットルを、キメラVLPの大規模生産のためにガラクトース含有
培地内で増殖させた。

【００４５】細胞ペレットを-70℃で凍結保存した。凍結細胞（湿潤重量 = 148g）を融解し
、740mLの「破砕バッファー（Breaking Buffer）」（200mM MOPS、pH7、1mM CaC
l₂）に再懸濁させて、約20％（w/v）のスラリーを得た。ヌクレアーゼBENZONASE
（登録商標）（Nycomed Pharma）を、湿潤細胞重量1g当たり750単位まで加えた
。該細胞スラリーを、M110-Y-Microfluidizer（Microfluidics Corp., Newton,
MA）に5回付すことにより約19,000psiの圧力で破壊した。細胞スラリーを集め、
破壊中、氷上に維持した。ヘマトクリットアッセイは、>80％の破壊を示した。

【００４６】ダイアフィルトレーション方式で運転する接線方向流動（tangential-flow）
精密濾過装置を使用する孔径0.65ミクロンの中空繊維カートリッジ（A/G Techno
logies）に通過させる精密濾過により、該老化（aged）細胞ライセートを清澄化
した。該ライセートを3容積の0.25Mクエン酸ナトリウム、0.2M MOPS（pH7.0）で
のダイアフィルトレーションに付した。抗原は該膜を通過した。該抗原を透過物
として集めた。

【００４７】ダイアフィルトレーションに付された0.65mm透過画分（3.9L）を、200mM MOPS
、pH7、250mMクエン酸ナトリウムで平衡化されたPOROS（登録商標）50HS樹脂（P
erseptive Biosystems, Cambridge, MA）の325mLカラム（11.2cm ID x 3.3cm）
上にローディングした。該カラムを8容積の50mM MOPS、0.5M NaCl、5mMリン酸ナ
トリウム（pH 7）で洗浄し、同じサンプルバッファー中の0.5〜1.5M NaClの直線
勾配（10容積）で溶出した。流出および洗浄画分を一括して集め、一方、1容積
の画分を溶出中に集めた。カラム画分をウエスタンブロット法およびSDS-PAGE（
コロイドクーマシーブルーで検出）により分析した。p55タンパク質を主として
含有する画分をプールした。

【００４８】該50HSプールを、BCAアッセイ（Pierce）により総タンパク質に関して分析し
た。該総タンパク質（168mg）をベースとして、セラミックヒドロキシアパタイ
ト（HA）II型（Bio-Rad）のカラムを注いで1mL樹脂/2mgタンパク質を得た。この
カラムは2.6cm ID x 15.7cmであった。該カラムを50mM MOPS（pH 7）、1.25M Na
Cl、5mMリン酸ナトリウムで平衡化した。該50HSプール（770mL）を0.22mmで濾過
し、113cm/時の流速でHAカラムにアプライした。流出液を一括して集めた。該HA
カラムを5容積の平衡化バッファーで洗浄し、1.25M NaCl中の5〜200mMリン酸ナ
トリウム（pH 7）の直線勾配（8容積）で溶出した。該溶出中に集めた画分をウ
エスタンブロットおよびSDS-PAGE（コロイドクーマシーブルーで検出）により分
析した。L1タンパク質の比較しうる純度および含量を示す画分をプールした。そ
れらのプールした画分を0.22mm膜で無菌的に濾過し、4℃で保存した。

【００４９】プロセスを維持し、産物を、特異的EIAによりHPV16 L1に関して及びBCAアッセ
イによりタンパク質に関して分析した。最終的な精製産物収量は、1.00mg L1/mg
タンパク質の比活性を有するタンパク質27mgであった。電子顕微鏡検査は、平均
径32nmを有する無傷VLP粒子の存在を証明した。SDS-PAGE純度分析のために、最
終産物のアリコートをTCA沈殿により濃縮し、ウエスタンブロットおよびSDS-PAG
E（コロイドクーマシーブルーで検出する）により分析した。L1の定量を、2.5mg
のローディング量を用いて行い、酵母混入物を20.0mgのローディングで定量した
。該L1タンパク質は>94％の均一性であることがデンシトメトリーにより示され
た。L1およびL2_mini/E2の共沈降が、プロセス画分の特異的免疫ブロット分析に
より示された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 39/12 Ｃ１２Ｒ 1:865 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＭ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡＦターム(参考） 4B024 AA01 BA32 DA12 EA04 GA11 HA03 HA11 HA12 4B064 AG31 CA06 CA19 CC24 CE02 CE10 DA01 4C085 AA03 BA51 CC08 CC22 DD36 4H045 AA11 AA20 BA10 BA40 CA01 DA86 EA31 FA74 GA01 GA10 GA21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】組換えパピローマウイルスのウイルス様粒子（VLP）の精製
方法であって、（a）部分精製されたVLP含有細胞ライセートとクロマトグラフィーカラム内の
ヒドロキシアパタイト媒体とを、該VLPが該ヒドロキシアパタイト媒体に結合す
る条件下で接触させ、（b）リン酸陰イオンを含む溶液で該結合VLPを溶出し、（c）溶出したVLPを回収する工程を含んでなる方法。
【請求項２】該VLPがL1タンパク質より実質的になる、請求項１に記載の
方法。
【請求項３】該VLPがヒトパピローマウイルス（HPV）VLPである、請求項
１に記載の方法。
【請求項４】該VLPが、HPV 6a型、HPV 6b型、HPV 11型、HPV 16型、HVP 1
8型、HVP 31型、HVP 33型およびHVP 45型よりなる群から選ばれる、請求項３に
記載の方法。
【請求項５】溶出したVLPが少なくとも75％の純度を有する、請求項４に
記載の方法。
【請求項６】溶出したVLPが少なくとも90％の純度を有する、請求項４に
記載の方法。
【請求項７】該VLPがL1タンパク質およびL2:融合タンパク質を含む、請求
項１に記載の方法。
【請求項８】該L2:融合タンパク質が、完全長より小さいL2部分を有する
、請求項７に記載の方法。
【請求項９】ヒトワクチンでの使用に適した精製されたヒトパピローマウ
イルスVLP産物の製造方法であって、（a）HPV L1 VLPを発現するように形質転換された酵母細胞に由来する細胞ラ
イセートを部分精製し、（b）部分精製されたVLP含有細胞ライセートとクロマトグラフィーカラム内の
ヒドロキシアパタイト媒体とを、該VLPが該ヒドロキシアパタイト媒体に結合す
る条件下で接触させ、（c）リン酸陰イオンを含む溶液で該結合VLPを溶出し、（d）溶出したVLPを回収する工程を含んでなる製造方法。