JP2013517284A - アパタイトの表面中和方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2010年1月15日に出願された米国特許仮出願第61/295,499号に基づいて優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために参照により組み入れられる。
ヒドロキシアパタイト及びフルオロアパタイトは、他のアパタイト固体支持体とともに、タンパク質、炭水化物、ポリヌクレオチド、及びウイルス粒子を含む、広い範囲の生体分子の精製に使用される。
(a) 標的分子を含む試料をアパタイト固体表面に接触させる工程であって、それによって標的分子を該固体表面に吸着させる、工程;
(b) 吸着された標的分子を含む固体表面を溶液と接触させる工程であって、該溶液がある濃度の
(i) 塩基性アミノ化合物及びアルカリ金属イオンもしくはアルカリ土類イオン;または
(ii) スルホン化されたアミン化合物及びアルカリ金属イオンもしくはアルカリ土類イオン
を、アパタイト固体表面を中和するのに十分な濃度で含み、標的分子が固体支持体に吸着されたままであるように該溶液が十分低いイオン強度を有する、工程;及び
(c) 固体支持体を工程(b)の溶液とは異なる溶液と接触させることにより、固体支持体から標的分子を溶出する工程であって、それによって試料中の該標的分子を精製する、工程。
(a) 標的分子を含む試料をアパタイト固体表面に接触させる工程であって、それによって標的分子を該固体表面に吸着させる、工程;
(b)吸着された標的分子を含む固体表面を溶液と接触させる工程であって、該溶液が
(i)塩基性アミノ化合物及びアルカリ金属イオン;または
(ii)スルホン化されたアミン化合物及びアルカリ金属イオン
を、アパタイト固体表面を中和するのに十分な量及び濃度で含み、標的分子が固体支持体に吸着されたままであるように該溶液が十分低いイオン強度を有する、工程;及び
(c) 固体支持体を、工程(b)の溶液とは異なる組成の溶液と接触させることにより、固体支持体から標的分子を溶出する工程であって、それによって試料中の標的分子を精製する、工程。
「固体アパタイト表面の中和」とは、固体表面がヒドロニウムイオンを、続く溶出緩衝液のpHに著しく影響を与える(すなわち、0.2を超える酸性寄りのpHシフトを起こす)ほど十分含まないように、アパタイト表面の表面を処理することをいう。
I.概説
本発明は、部分的には、アミノ化合物またはスルホン化アミン化合物を含む中和溶液が、アルカリ金属イオン、及び任意でアルカリ土類イオンと組み合わされると、後の段階で溶出されるべき標的分子を著しく溶出することなく、クロマトグラフィー精製に使用されるアパタイト固体表面を中和するのに効果的であるという発見に基づいている。本願は、標的分子(例えば、タンパク質または他の分子)をアパタイト固体表面に吸着させ、本明細書で述べるように中和溶液でアパタイト表面を中和し、その後、標的分子を分離溶液または中和溶液とは異なる組成を有する溶液で溶出する方法を提供する。
標的タンパク質または他の標的分子の、アパタイト表面からの溶出は、ヒドロニウムイオンを著しく放出し得、それは、標的分子及び/またはアパタイト固体表面に有害であり得、それにより、アパタイト材料を再利用する能力を損なう。本発明者らは、標的分子のアパタイト固体表面への吸着に続き、アパタイト表面をアミノ化合物またはスルホン化アミン化合物と、標的分子が実質的に溶出するのを避けるために十分低い濃度及びイオン強度のアルカリ土類またはアルカリ金属イオンとを組み合わせて接触させることによって、アパタイト上のヒドロニウムイオンを取り除き中和できることを発見した。
初めに、標的分子を含む試料が、クロマトグラフィー技術において公知のようにアパタイト表面に吸着される。アパタイト表面は、任意で、あらかじめ表面への標的の吸着に先立って、滅菌及び/または平衡化される。一つまたは複数の洗浄工程が任意に、中和工程の前または後に行われうる。いくつかの態様では、中和工程それ自体がまた、洗浄工程として、すなわち、実質的に固体支持体から試料の少なくとも一種類の成分を取り除く工程として、機能する。洗浄工程は、標的タンパク質を保持しつつ、試料の一種または複数種の非標的成分を取り除くようにデザインされうる。それに代わるものとして、または追加的に、さらなる洗浄工程が、一種または複数種のエンドトキシン、宿主細胞タンパク質、標的タンパク質の凝集塊または他の凝集塊、中性脂肪、多糖、小分子、荷電脂質、または、先立つ精製工程から出た沈殿剤の残留物のような他の非標的分子を、洗浄中固体支持体に標的タンパク質を実質的に保持しつつ(例えば、少なくとも80%、90%、95%、またはそれを越えて保持して)脱着するのに使用されうる。
アミノ化合物とは、アミノ基、すなわち-NH2を持つ化合物をいう。実施例で示されるように、広い範囲のアミノ化合物を、ヒドロニウムイオン受容体として使用することができ、それにより、イオンを中和する。代表的なアミノ化合物は、ヒスチジン、アルギニン、Tris((HOCH2)3CNH2)及びリジンを含むが、これに限定されない。いくつかの態様において、アルギニンの濃度は5〜100mMであり、例えば、5〜50、5〜30、または10〜30mMである。いくつかの態様におけるアルギニン溶液のpHは7〜9であり、例えば、7.5〜8.5である。
スルホン化されたアミン化合物とは、スルホキシド基及びアミンを含む化学的化合物をいう。アミンは、一級、二級、三級、または四級アミンであり得る。スルホキシド基は、直接アミンに結合していてもよいが、そうでなくてもよい。
アルカリ金属陽イオン(及び任意でアルカリ土類陽イオンもまた)を、アパタイト表面からヒドロニウムイオンを置換するのに使用することができる。ヒドロニウムイオンは続いて、中和緩衝液の他の成分によって捕捉される。アルカリ金属イオン及び/またはアルカリ土類イオンは、始めはアミノ化合物またはスルホン化アミン化合物との塩の形態であり得、または、別途中和溶液に、例えば他の対イオン(例えば、-OH、-Cl等)の塩として添加され得る。
当業者は、数々の種類のアパタイト固体表面が、本発明において使用できることを認識するであろう。セラミックヒドロキシアパタイトの商業的事例は、CHTタイプI及びCHTタイプIIを含むが、これに限定されない。セラミックフルオロアパタイトの商業的事例は、CFT(商標)タイプI及びCFTタイプIIを含むが、これに限定されない。特に記載がなければ、セラミックヒドロキシアパタイト及びセラミックフルオロアパタイトは、任意の平均直径の、すなわち約10、20、40、及び80μmが含まれるが、これに限定されない直径の、ほぼ球状の多孔性粒子をいう。ヒドロキシアパタイトまたはフルオロアパタイト、タイプ、及び平均粒子直径の選択は、当業者により決定することができる。他の非セラミックタイプのアパタイト固体表面(「ゲル」として売られているものを含む)もまた、本発明に基づいて使用され得る。非セラミック固体アパタイトの例は、合成マイクロ結晶(例えば、HA Ultragel(登録商標)(Pall Corp.))及びマイクロ結晶(例えば、Bio-Gel HTP、Bio-Gel(登録商標)HT、DNA-Grade HT(Bio-Rad)及びHypatite C(Clarkson Chromatography))を含むが、これに限定されない。
本発明の方法は、本質的に、複合試料中の任意の標的分子を精製するために使用できる。いくつかの態様において、精製される標的分子は、生物学的試料の成分である。そのような成分の例は、タンパク質、脂質、糖、炭水化物、ウイルス粒子、アミノ酸、核酸を含むがこれに限定されず、それらの組み合わせ、例えば、脂質付加されたまたはグリコシル化されたタンパク質、またはそれらの混合物を含むことができる。いくつかの態様において、本方法が適用される試料は、天然の、合成された、または組替えによる原料からの、未精製または一部精製された生体分子を含む。未精製試料は、例えば、血漿、血清、腹水、乳、植物抽出物、溶菌液、酵母溶菌液、または条件細胞培地から由来しうる。いくつかの態様において、一部精製された試料は、少なくとも一回のクロマトグラフィー、限外濾過、沈殿、他の分画工程、またはそれらの任意の組み合わせによって処理された非精製調製物に由来する。代表的な標的分子は、抗体(モノクローナル抗体及び/または抗体断片を含むが、これに限定されない)または他のペプチドまたはポリペプチドである。クロマトグラフィーの一つの工程または複数の工程は、分子ふるい、親和性、陰イオン交換、陽イオン交換、プロテインA親和性、疎水性相互作用、固定化金属親和性クロマトグラフィー、または混合型クロマトグラフィーを含むが、これに限定されない任意の方法をも使用できる。沈殿工程または複数工程は、例えば、塩またはPEG沈殿、または有機酸、有機塩基、または他の薬剤を用いた沈殿を含みうる。他の分画工程は、結晶化、液液分離、または膜ろ過を含みうるが、これに限定されない。限外濾過は、試料の直接濃縮及び/またはダイアフィルトレーションを含みうる。
ロードした後の表面中和は、下記のように決定された。ヒドロキシアパタイト(CHTタイプI)カラムは、滅菌用溶液(1M NaOH/1M NaCl)で滅菌され、平衡化バッファー(5mMリン酸ナトリウム/0.1M NaCl、pH6.5)で軽くリンスされ、再生バッファー(0.4Mリン酸ナトリウム、pH7.0)で調整され、平衡化バッファー20容量(平衡化に10カラム容量、シミュレートされたタンパク質ロードとして8カラム容量、及びロード後のリンスのために2カラム容量)でリンスされ、1.0カラム容量の、0.1Mのアルギニンを含むpH11のロード後の溶液と接触させられた。我々は1.0カラム容量のロード後の工程によりpHが急速に8以上にシフトすることを見出した。カラムは、その後溶出バッファー(0.55M NaCl/5mMリン酸ナトリウム、pH6.5)で溶出された。溶出バッファー流出液のカルシウムイオン濃度は検出されず、pH11の0.1Mアルギニンがアパタイト表面の中和に十分であることが示された。
記載と同じ条件が繰り返されたが、今回は、ロード後のカラム容量は、わずか0.8だった。塩基性へのpHシフトは、ロード後の減少したカラム容量の結果として最小限に抑えられた。このこと及び上記の実験は、アルギニンがCHTカラムの表面の中和に効果的であることを示した。
我々はその後、吸着タンパク質に対するアルギニンのロード後の溶液の効果を試験した。異なる記載がない場合、下記の各実験においては、論じたロード後の種々の溶液に続き、タンパク質は、溶出バッファー(0.55M NaCl、5mMリン酸ナトリウム、pH6.5)で溶出された。ウシIgGを始めにCHTカラムに吸着させ、このカラムを5mM PB、0.1 NaCl pH6.5で平衡化し、続いて、ロード後の処理として、0.8カラム容量の0.1Mアルギニン pH 11と接触させた。ウシIgGはカラムには保持されなかった。それはおそらく、アルギニン溶液の高いpHにより、タンパク質が陽イオン交換によって置換されたからであると考えられる。
0.1Mクエン酸アルギニンpH8が、ロード後の溶液として使用された。すべてではないがほとんどのウシIgGがこの条件下で溶出され、より低いpHが、陽イオン交換体としてアルギニンが作用し、IgGを置換する能力を減少させたことを示した。我々は、120mMクエン酸pH8.3の使用が有効な表面中和剤である一方、CHTカラムを溶解することを見つけたので、このことは特に興味深かった。
ロード後におけるクエン酸アルギニンpH8.0の濃度は、20mMに減らされた。このロード後の濃度は、ロード後の工程の間保持されたタンパク質の量を非常に増加させ、IgGの 90%より多くが、4.67カラム容量のロード後の工程の後、カラムに保持された。
我々は、ピペラジン2スルホン酸(PIPES)が、ロード後の処理として十分高いpHで、十分な量で適用されるとき、非常に有効なカラム中和剤であることを特定した。例えば、pH8.25の25mM PIPES/5mM リン酸ナトリウム/25mM NaCl/4ppmカルシウムが、ロード後の処理として少なくとも6カラム容量使用されるとき、カラムを中和するのに有効であった。溶出バッファー流出液に含まれるカルシウムイオンは、4ppm未満であった。通常、表面が中和されなければ、カルシウムイオン濃度は、52ppmである。
種々の代替のロード後の溶液が試された。4mMリン酸3ナトリウムpH8.1; 20mM炭酸水素ナトリウムpH8.1または9.0; 50mM MES pH7.13; 20mMヒスチジンpH8.0; 50mM酢酸ナトリウム pH7.51のどれも、カラムの中和に有効でなかった。しかし、pH8.4の25mMヒスチジン、25mM NaCl、5mMリン酸は、中和に効果的であった。同様に、pH8.4の20mM MES、25mM NaCl、5mMリン酸も、中和に効果的であった。
我々は、Trisが、ロード後の処理として十分高いpHで、十分な量で適用されるとき、結合したたんぱく質を置換しない、有効なカラム中和剤であることを特定した。例えば、pH9.03または10.3の比較的高い濃度のTris(例えば、50mM)が、カラムの中和に十分であったが、IgGを著しく溶出する結果になった。しかし、25mM Tris、25mM NaCl、pH8.4は、ロード後の処理として6カラム容量が使用されるとき(1.9カラム容量では、カラムを中和するのに十分でなかった)、結合されたIgGを溶出しない一方、カラムを中和するのに有効であった。したがって、比較的低い濃度のTrisがいくつかのカラム容量を超えて適用されるとき、結合されたタンパク質の著しい溶出なしに(例えば、10%未満または5%未満)カラム表面を中和するのに有効である。
合格=中和された。
不合格:著しいカルシウム浸出またはカラム質量の減少を示す。不合格の回は、中和する洗浄バッファーの体積が不十分であるか、pHが低すぎるか、洗浄バッファー中のNaClが足りないか、それらの組み合わせを示しうる。
Claims (21)
- 試料中の標的分子を精製するための方法であって、以下の工程を含む方法:
(a) 標的分子を含む試料をアパタイト固体表面に接触させる工程であって、それによって標的分子を該固体表面に吸着させる、工程;
(b) 吸着された標的分子を含む固体表面を溶液と接触させる工程であって、該溶液が
(i) 塩基性アミノ化合物及びアルカリ金属イオン;または
(ii) スルホン化されたアミン化合物及びアルカリ金属イオン
を、該アパタイト固体表面を中和するのに十分な量及び濃度で含み、標的分子が固体支持体に吸着されたままであるように該溶液が十分低いイオン強度を有する、工程;及び
(c)固体支持体を工程(b)の溶液とは異なる組成の溶液と接触させることにより、固体支持体から標的分子を溶出する工程であって、それによって試料中の標的分子を精製する、工程。 - アルカリ金属イオンが、リチウム、ナトリウムまたはカリウムより選択される、請求項1記載の方法。
- アパタイトが、ヒドロキシアパタイト及びフルオロアパタイトからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 標的分子がタンパク質である、請求項1記載の方法。
- タンパク質が抗体である、請求項4記載の方法。
- 工程(b)の溶液が、pH6.5〜9.0である、請求項1記載の方法。
- 溶液が、100mMまたはそれ未満であるアルカリ金属イオンを有する、請求項1記載の方法。
- 一つまたは複数の追加的洗浄工程を、請求項1記載の工程(a)及び(b)の間または請求項1記載の工程(b)及び(c)の間にさらに含む、請求項1記載の方法。
- 一つまたは複数の追加的洗浄工程が、標的分子を固体支持体に実質的に保持している間に、固体表面から試料の少なくとも一種類の成分を取り除く、請求項8記載の方法。
- 成分が、エンドトキシン、宿主細胞タンパク質、凝集した標的タンパク質または他の凝集物、中性脂質、荷電脂質、多糖、沈殿剤、非標的小分子、及び凝集した標的タンパク質からなる群の少なくとも一つより選択される、請求項9記載の方法。
- 溶液が、スルホン化されたアミン化合物を含む、請求項1記載の方法。
- スルホン化されたアミン化合物が、PIPES、MES、MOPS、ACES、MOPSO、及びHEPESより選択される、請求項11記載の方法。
- スルホン化されたアミン化合物の濃度が、5〜100mMである、請求項11記載の方法。
- スルホン化されたアミン化合物の濃度が、5〜50mMである、請求項11記載の方法。
- 溶液がアミノ化合物を含む、請求項1記載の方法。
- アミノ化合物が、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、及びイミダゾールからなる群より選択される、請求項15記載の方法。
- 固体支持体がカラムであり、かつ工程(b)が、固体表面を少なくとも1カラム容量の溶液と接触させる工程を含む、請求項1記載の方法。
- アミノ化合物の濃度が、5〜100mMである、請求項15記載の方法。
- アミノ化合物の濃度が、5〜50mMである、請求項15記載の方法。
- アパタイトが、セラミックヒドロキシアパタイトまたはセラミックフルオロアパタイトである、請求項1記載の方法。
- アパタイトが、非セラミックアパタイトである、請求項1記載の方法。
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