JP5793080B2 - セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用する酸性タンパク質の精製 - Google Patents

Description

本発明は、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して、酸性タンパク質、例えば、Ｉｇ融合タンパク質から、部分的に活性なおよび／または不活性な産物由来の種、高分子量凝集体、および他の不純物を除去する方法を記載している。本発明で提供する特定の結合操作条件および溶出条件下において、酸性タンパク質産物、例えば、酸性Ｉｇ融合タンパク質産物を、高い樹脂結合能力および良好な産物収率で、目的物質由来および製造工程由来の不純物から分離することができる。

タンパク質の生物活性を破壊しない、または著しく低下させない有用なタンパク質精製方法を特定することが望ましい。酸性タンパク質調製物（例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質調製物）などのタンパク質調製物は、診断用途、治療用途、応用細胞生物学、および機能研究で使用可能となる前に、タンパク質調製物から夾雑物を除去しなければならない。例として、タンパク質調製物、例えば、酸性タンパク質調製物は、不活性なおよび／または部分的に活性な種および高分子量凝集体（ＨＭＷＡ）などの不要な成分（不純物）をしばしば含有している。不活性なおよび／または部分的に活性な種は、活性タンパク質に比べて標的への結合能力が著しく低いので、これらの種の存在は望ましくない。したがって、不活性なおよび／または部分的に活性な種の存在は、産物の効果を低減させる可能性がある。凝集体、例えば、ＨＭＷＡの形成は、投与時に補体活性化またはアナフィラキシーを引き起こすことによって、産物の安全性に有害な影響を及ぼす可能性がある。さらに、凝集体の形成は、産物収率の低下、ピークの広がり、および活性の損失を引き起こすことにより、製造プロセスを妨害する恐れがある。

最も一般的なタンパク質精製方法は、精製されるタンパク質と夾雑物との間のサイズ、荷電、および溶解性の差に基づいている。これらのパラメータに基づくプロトコルとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーが挙げられる。しかし、これらのクロマトグラフィー方法は、時に、タンパク質、例えば、ＩｇＧ含有タンパク質の凝集種または多重結合種の分離において技術的問題をもたらす。イオン交換クロマトグラフィーや疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの技術は、例えば、溶出中のタンパク質濃度の増加または緩衝液濃度および／もしくはｐＨの必要な変動に起因する凝集体形成を誘発する可能性がある。さらに、いくつかの場合では、タンパク質は、差が非常に小さいためにイオン交換クロマトグラフィーによってタンパク質を分離することができない等電点の差を示す。Ｔａｒｄｉｔｉ、（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、５９９：１３〜２０。サイズ排除クロマトグラフィーは、扱い難く、産物の著しい希釈をまねき、これは大規模な効率化に基づく製造プロセスにおいて障害となる。また、アフィニティークロマトグラフィーカラムからのリガンドの漏出も起こる可能性があり、それによって、溶出した産物の望ましくない汚染がもたらされる。Ｓｔｅｉｎｄｌ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３５：６１〜６９。興味深いことに、出願人は、イオン交換、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、不活性なまたは部分的に活性な種を除去することができなかった。

ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、マトリクスとリガンドの両方を形成する不溶性ヒドロキシル化リン酸カルシウム［Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２］を利用するタンパク質精製方法である。官能基は、正に荷電したカルシウムイオン（Ｃ部位）の対、および負に荷電したリン酸基（Ｐ部位）のクラスターからなる。ヒドロキシアパタイトとタンパク質との間の相互作用は、複雑であり、多様である。相互作用の一方法では、タンパク質の正に荷電したアミノ基は、負に荷電したＰ部位と会合し、タンパク質のカルボキシル基は、Ｃ部位への配位錯化によって相互作用する。Ｓｈｅｐａｒｄ（２０００）Ｊ．ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、８９１：９３〜９８。したがって、酸性および塩基性タンパク質は、様々な機構でｃＨＡ樹脂と通常相互作用しており、酸性タンパク質は、カルボキシル基への配位結合によってＣ部位に通常結合し、一方、塩基性タンパク質は、アミン基との荷電相互作用によってＰ部位に結合する。

結晶質ヒドロキシアパタイトは、クロマトグラフィーで使用された最初のタイプのヒドロキシアパタイトであったが、構造的な問題によって制限されていた。セラミックヒドロキシアパタイト（ｃＨＡ）クロマトグラフィーは、流速の制限など、結晶質ヒドロキシアパタイトに関連するいくつかの問題を克服するために開発された。セラミックヒドロキシアパタイトは、高い耐久性、良好なタンパク質結合能力を有し、結晶質ヒドロキシアパタイトよりも高い流速および圧力で使用することができる。Ｖｏｌａら（１９９３）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：６５０〜６５５。ｃＨＡを使用するクロマトグラフィー分離は、結合方式、フロースルー方式、または結合／フロースルー組合せ方式など、いくつかの別個の方式で行うことができる。

ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、タンパク質、核酸、ならびに抗体のクロマトグラフィー分離において使用されてきた。しかし、いくつかの場合では、研究者らは、ヒドロキシアパタイトから抗体を選択的に溶出させることができず、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが十分に純粋な産物をもたらさないことが分かった。Ｊｕｎｂａｕｅｒ、（１９８９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４７６：２５７〜２６８；Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ、（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７３：５２２〜５２９。結合、フロースルー、または結合／フロースルー組合せ方式のいずれかでｃＨＡクロマトグラフィーを使用する、抗体および他の塩基性タンパク質のＨＭＷＡなどの不純物からの分離の成功については、参照により本明細書にその全体を組み込む米国特許出願公開第２００５−０１０７５９４号に実証されている。本発明は、ｃＨＡクロマトグラフィー技術を使用して、酸性タンパク質、例えば、Ｉｇ融合タンパク質から、目的物質由来の部分的に活性なおよび／または不活性な種、ならびにＨＭＷＡなどの他の不純物を除去する新規な方法を提供する。

本発明は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して、酸性タンパク質調製物から、高分子量凝集体、不活性なおよび／または部分的に活性な種、ならびに他の不純物などの不純物を除去する方法を提供する。したがって、本発明の一実施形態では、本発明は、対象となる少なくとも１種の酸性タンパク質を、不純物を含有するタンパク質調製物から精製する方法であって、二価金属陽イオンを含む平衡化緩衝液を、ヒドロキシアパタイト樹脂に注入するステップと、ヒドロキシアパタイト樹脂を充填緩衝液（ｌｏａｄ ｂｕｆｆｅｒ）中でタンパク質調製物と接触させるステップと、ヒドロキシアパタイト樹脂を、二価金属陽イオンを含む洗浄緩衝液で洗浄するステップと、リン酸塩を含む溶出緩衝液を用いて、少なくとも１種の酸性タンパク質をヒドロキシアパタイト樹脂から溶出させるステップとを含む方法を提供する。

本発明のいくつかの実施形態では、不純物は、少なくとも１種の酸性タンパク質の不活性なおよび／または部分的に活性な種である。したがって、本発明の別の実施形態は、対象となる少なくとも１種の酸性タンパク質を、その少なくとも１種の酸性タンパク質の不活性なおよび／または部分的に活性な種を含有するタンパク質調製物から精製する方法であって、ヒドロキシアパタイト樹脂をタンパク質調製物と接触させるステップと、対象となる少なくとも１種の酸性タンパク質を、不活性なおよび／または部分的に活性な種とは別々に溶出させるステップとを含む方法を提供する。本発明の別の実施形態は、対象となる少なくとも１種の酸性タンパク質を、その対象となるタンパク質の不活性なおよび／または部分的に活性な種を含有するタンパク質調製物から精製する方法であって、二価金属陽イオンを含む平衡化緩衝液を、ヒドロキシアパタイト樹脂に注入するステップと、ヒドロキシアパタイト樹脂を、二価金属陽イオンを含む充填緩衝液中でタンパク質調製物と接触させるステップと、ヒドロキシアパタイト樹脂を、二価金属陽イオンを含む洗浄緩衝液で洗浄するステップと、リン酸塩を含む溶出緩衝液を用いて、少なくとも１種の酸性タンパク質をヒドロキシアパタイト樹脂から溶出させるステップとを含む方法を提供する。

本発明の少なくともいくつかの実施形態では、不純物は、高分子量凝集体であり、少なくとも一実施形態では、本発明の方法は、高分子量凝集体の少なくとも約６０％の減少をもたらす。本発明の他の実施形態では、本方法は、高分子量凝集体の少なくとも約９０％の減少をもたらす。本発明の別の実施形態では、不純物は、プロテインＡおよび／または宿主細胞タンパク質である。

少なくともいくつかの実施形態では、平衡化緩衝液は、約１〜約２０ｍＭの二価金属陽イオンを含み、充填緩衝液は、約１〜約２０ｍＭの二価金属陽イオンを含み、洗浄緩衝液は、約１〜約２０ｍＭの二価金属陽イオンを含み、溶出緩衝液は、約２〜約５０ｍＭのリン酸塩を含む。別の実施形態では、溶出緩衝液は、約１〜約１００ｍＭのリン酸塩、または約５〜約５０ｍＭのリン酸塩、または約５〜約２０ｍＭのリン酸塩を含む。一実施形態では、平衡化緩衝液、充填緩衝液、および洗浄緩衝液は、約５ｍＭの二価金属陽イオンを含み、溶出緩衝液は、約６ｍＭのリン酸塩を含む。一実施形態では、充填緩衝液は、ＮａＣｌやＫＣｌなどの一価陽イオンを含む。いくつかの実施形態では、二価金属陽イオンは、ＣａＣｌ_２またはＭｇＣｌ_２のいずれかであり、一実施形態では、二価金属陽イオンは、ＣａＣｌ_２である。少なくともいくつかの実施形態では、リン酸塩は、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムのいずれかであり、一実施形態では、リン酸塩は、リン酸ナトリウムである。

本発明のいくつかの実施形態では、平衡化緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液は、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭのＨＥＰＥＳ、例えば、約１０ｍＭのＨＥＰＥＳをさらに含む。少なくともいくつかの他の実施形態では、平衡化緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液は、約６．１〜約８．１のｐＨ、例えば、約７．２のｐＨを有する。

本発明のいくつかの実施形態では、精製される酸性タンパク質は、免疫グロブリン融合タンパク質、例えば、受容体融合タンパク質である。本発明の一実施形態では、受容体融合タンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃである。別の実施形態では、融合タンパク質は、ｓＩＬ２１ｒ−Ｆｃである。

本発明のいくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイト樹脂は、セラミックヒドロキシアパタイトのタイプＩまたはタイプＩＩである。少なくともいくつかの実施形態では、本方法は、平衡化緩衝液を注入するステップの前に、タンパク質調製物に、プロテインＡクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、限外ろ過、ウイルス除去ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、およびそれらの組合せからなる群から選択される精製方法を施すステップをさらに含む。

例示的なＣａＣｌ_２充填ｃＨＡカラム実行のクロマトグラムを示す図である。 酸性Ｉｇ融合タンパク質（ｓＩＬ２１ｒＦｃ）の精製に関するｃＨＡクロマトグラムを示す図である。

本発明のタンパク質
本発明の方法を使用して精製するタンパク質は、好ましくは、酸性タンパク質、例えば、融合タンパク質、受容体融合タンパク質、免疫グロブリン融合タンパク質、可溶性受容体融合タンパク質、および他のポリペプチド産物である。

本明細書では、語句「ポリペプチド」または「ポリペプチド産物」は、用語「タンパク質」および「タンパク質産物」とそれぞれ同義であり、当技術分野で一般に理解されているように、連続するペプチド結合を介して連結されたアミノ酸の少なくとも１個の鎖を指す。ある種の実施形態では、「対象となるタンパク質」または「対象となるポリペプチド」などは、宿主細胞にトランスフェクトまたは形質転換された、例えば、宿主細胞に一時的または安定的にトランスフェクトまたは形質転換された外因性核酸分子によってコードされるタンパク質である。ある種の実施形態では、宿主細胞にトランスフェクトまたは形質転換された外因性ＤＮＡが「対象となるタンパク質」をコードする場合、外因性ＤＮＡの核酸配列がアミノ酸の配列を決定する。この配列は、天然に存在する配列であっても、または代替として人為的に遺伝子工学により作製された配列であってもよい。ある種の実施形態では、「対象となるタンパク質」は、内因性核酸分子によって宿主細胞または宿主生物にコードされるタンパク質である。

本発明の好ましい一実施形態では、対象となるタンパク質は、酸性タンパク質である。酸性タンパク質は、中性ｐＨで負電荷を担持し、酸性の等電点（ｐＩ）を有するタンパク質である。一般に、酸性タンパク質は、アスパラギン酸やグルタミン酸などの酸性アミノ酸をより高い含有量で含有する。酸性タンパク質は、中性ｐＨでのそれらの負電荷のために、独特な結合特性、例えば、クロマトグラフィー用途において独特な特性を示す。

本発明のいくつかの実施形態では、対象となるタンパク質は、融合タンパク質である。本発明のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、受容体融合タンパク質などのＩｇ融合タンパク質である。他の実施形態では、融合タンパク質は、可溶性融合タンパク質、例えば、可溶性受容体融合タンパク質である。

融合タンパク質、例えば、受容体融合タンパク質は、当技術分野で周知の方法に従って生成することができる。本発明の一実施形態では、融合タンパク質は、２個のポリペプチド部分を含む。例えば、可溶性受容体融合タンパク質に関しては、第１の部分は完全長の受容体を含み、あるいは、第１の部分は、完全長よりも短い受容体、例えば、受容体の細胞外部分も含む。可溶性受容体はまた、さらなるポリペプチド（第２の部分）、例えば、ＧＳＴ、Ｌｅｘ−Ａ、ＭＢＰポリペプチド配列、または例えばＦｃフラグメントを包含する免疫グロブリン鎖、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥを包含する様々なアイソタイプの重鎖定常領域も含むことができる。本発明の一実施形態では、可溶性受容体融合タンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質である。別の実施形態では、融合タンパク質は、ｓＩＬ２１ｒ−Ｆｃである。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質の第２の部分は、免疫グロブリンでも、そのフラグメント（例えば、そのＦｃ結合フラグメント）でもよい。したがって、用語「免疫グロブリン融合タンパク質」、「Ｉｇ融合タンパク質」、「Ｆｃ融合タンパク質」、などは、第１の部分（すなわち、対象となるポリペプチドを含む部分）が免疫グロブリンまたはそのフラグメントに融合されている対象となるタンパク質を指す。免疫グロブリン融合ポリペプチドは、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，５１６，９６４号、同第５，２２５，５３８号、同第５，４２８，１３０号、同第５，５１４，５８２号、同第５，７１４，１４７号、および同第５，４５５，１６５号に記載されている。

いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド部分は、完全長免疫グロブリンポリペプチドを含む。あるいは、第２のポリペプチド部分は、完全長よりも短い免疫グロブリンポリペプチド、例えば、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、Ｆｖ、またはＦｃを含む。第２のポリペプチド部分は、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を包含してもよい。第２のポリペプチド部分はまた、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を包含してもよい。

いくつかの実施形態では、第２のポリペプチド部分は、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能よりも低いエフェクター機能を有する。Ｆｃエフェクター機能としては、例えば、Ｆｃ受容体結合、補体結合、およびＴ細胞枯渇活性（Ｔ ｃｅｌｌ−ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が挙げられる（例えば、米国特許第６，１３６，３１０号を参照）。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター機能、および抗体安定性のアッセイ方法は、当技術分野で周知である。一実施形態では、第２のポリペプチド部分は、Ｆｃ受容体に対する親和性が低いか、または親和性を有さない。代替の実施形態では、第２のポリペプチド部分は、補体タンパク質Ｃ１ｑに対する親和性が低いか、または親和性を有さない。

融合タンパク質、例えば、可溶性受容体融合タンパク質は、可溶性受容体またはそのフラグメントを第２の部分に接続するリンカー配列をさらに包含することができる。例えば、融合タンパク質は、ペプチドリンカー、例えば、長さが約２〜約２０、より好ましくは約５〜約１０アミノ酸のペプチドリンカーを包含することができる。

別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を包含することができる。ある種の宿主細胞（例えば、哺乳類の宿主細胞）では、融合タンパク質、例えば、可溶性受容体融合タンパク質の発現および／または分泌を、異種シグナル配列を使用して増大させることができる。融合タンパク質に包含され得るシグナルペプチドの一例は、ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号１）である。

本発明のキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。例えば、様々なポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来技術に従って、例えば、ライゲーション反応のための平滑末端化または突出末端化（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）された末端、適当な末端を生じる制限酵素による消化、必要に応じた付着末端の充填、望ましくない接続を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーション反応を使用することによって、インフレームでライゲーションする。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を包含する従来技術によって合成することができる。代替として、２個の連続的な遺伝子フラグメントの間に相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができ、続いて、これらの遺伝子フラグメントをアニールおよび再増幅して、キメラ遺伝子配列を得ることができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２を参照）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが、市販されている。

対象となるタンパク質、例えば、酸性タンパク質は、適切な宿主細胞として働き得る多くの細胞株で発現させることによって生成することができる。例えば、そのような細胞は、動物細胞でもよい。語句「動物細胞」は、無脊椎動物、非哺乳類脊椎動物（例えば、鳥類、爬虫類、および両生類）、および哺乳動物の細胞を包含する。無脊椎動物細胞の非限定的な例としては、以下の昆虫細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（カ）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（カ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）（カイコ／カイコガ）が挙げられる。対象となる単離ポリヌクレオチドを、バキュロウイルスベクターなどの１種または複数の昆虫発現ベクター中の適切な制御配列に作動可能に連結させ、昆虫細胞発現系を使用することによって、対象となるポリペプチドを組換えにより生成することができる。バキュロウイルス／Ｓｆ９発現系の材料および方法は、キット形態で市販されている（例えば、ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。

好ましい実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの哺乳動物細胞株は、対象となるタンパク質の組換え発現に適した宿主細胞である。哺乳動物宿主細胞株としては、例えば、ＣＯＳ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＴＭ４、ＶＥＲＯ０７６、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ−３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＭＭＴ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、ＣＨＯ、２９３Ｔ、Ａ４３１、３Ｔ３、ＣＶ−１、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２、Ｃｏｌｏ２０５、２９３、ＨｅＬａ、Ｌ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、ＦＲｈＬ−２、Ｕ９３７、ＨａＫ、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｒａｔ２、ＢａＦ３、３２Ｄ、ＦＤＣＰ−１、ＰＣ１２、Ｍ１ｘ、ネズミミエローマ（例えば、ＳＰ２／０およびＮＳ０）、およびＣ２Ｃ１２細胞、ならびに形質転換された霊長類細胞株、ハイブリドーマ、正常二倍体細胞、ならびに一次組織および初代外植体のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物に由来する細胞株が挙げられる。多数の細胞株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの商業的な供給元から入手できる。本発明の一実施形態では、対象となるタンパク質は、ＣＨＯ宿主細胞において発現される。

代替として、酵母などの下等真核生物、または原核生物において、対象となるポリペプチドを組換えにより生成することが可能であり得る。潜在的に適切な酵母菌株としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属菌株、およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌株が挙げられる。潜在的に適切な細菌株としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）が挙げられる。対象となるポリペプチドを酵母または細菌において作製する場合、機能性を得るために、例えば、適当な部位をリン酸化またはグリコシル化することによってそれらを修飾する必要があることがある。そのような共有結合は、周知の化学的または酵素的な方法を使用して達成することができる。

細菌での発現は、組換えタンパク質を組み込む封入体を形成する可能性がある。したがって、活性な材料またはより活性な材料を生成するために、組換えタンパク質のリフォールディングが必要とされることがある。正確にフォールドされた異種タンパク質を細菌の封入体から得るためのいくつかの方法は、当技術分野で周知である。これらの方法では、一般に、封入体からタンパク質を可溶化し、次いで、カオトロピック剤を使用して、タンパク質を完全に変性させる。システイン残基がタンパク質の一次アミノ酸配列中に存在する場合、ジスルフィド結合の正確な形成を可能にする環境（酸化還元系）でリフォールディングを達成することがしばしば必要である。リフォールディングの一般的な方法は、Ｋｏｈｎｏ（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：１８７〜９５に開示されている。欧州特許第０４３３２２５号および米国特許第５，３９９，６７７号は、他の適当な方法を記載している。

ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂
対象となるタンパク質を宿主細胞において発現させた後、対象となるタンパク質、例えば、酸性タンパク質を精製する。対象となるタンパク質は、対象となるタンパク質を発現する宿主細胞株の細胞抽出液から、または対象となるタンパク質を発現する組換え宿主細胞株を培養して得られる馴化培地（回収培地）から精製することができる。さらに、対象となるタンパク質は、動物の血清、腹水液、器官抽出物などを包含するが、それらに限定されない多くの他の供給源から精製することができる。アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの普通のタンパク質精製方法は、タンパク質調製物から、高分子量凝集体または不活性なおよび／もしくは部分的に活性な種などの不要な成分を十分には除去できない。したがって、本発明の方法は、対象となるタンパク質、例えば、酸性タンパク質の精製にヒドロキシアパタイト樹脂を利用する。

用語「高分子量凝集体」または「ＨＭＷＡ」は、対象となる少なくとも２個のタンパク質の会合を指す。会合は、共有、非共有、ジスルフィド、または非還元性架橋を包含するが、それらに限定されない任意の方法によって生じ得る。「高分子量凝集体」は、少なくとも２個の同じタンパク質間の会合、および／または、対象となるタンパク質と、細胞培養中に見られる他のタンパク質、例えば、宿主細胞タンパク質との間の会合であってもよい。

対象となるタンパク質の「不活性な種」および「部分的に活性な種」は、対象となるタンパク質と同じアミノ酸配列および分子量を有するが、それぞれ、標的に対する結合能力を示さない、または結合能力が著しく低いタンパク質である。本明細書で使用する、標的に対する著しく低い結合能力は、活性タンパク質に比べて、部分的に活性なタンパク質種の結合能力の少なくとも約１０％、２０％、または３０％の低減、好ましくは少なくとも約４０％の低減を指す。「不活性な種」および「部分的に活性な種」はまた、対象となるタンパク質と同じアミノ酸配列および分子量を有するが、それぞれ、活性を示さない、または活性タンパク質よりも活性が著しく低いタンパク質を指す。本明細書で使用する、著しくより低い活性とは、活性タンパク質に比べて、部分的に活性なタンパク質種の活性の少なくとも約３０％の低減、好ましくは少なくとも約４０％の低減を指す。結合能力および／または活性の低減パーセントは、例えば、ピーク溶出中のタンパク質の結合能力および／または活性を、ストリッピング画分中のタンパク質のそれと比較することによって測定することができる。

本発明の方法では、不純物、例えば、対象となるタンパク質の高分子量凝集体ならびに不活性なおよび／または部分的に活性な種は、ヒドロキシアパタイトｃＨＡクロマトグラフィー方法を使用して、対象となる活性タンパク質、例えば、酸性タンパク質からうまく分離される。

様々なヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー用樹脂が市販されており、材料の任意の利用可能な形態を本発明の実施において使用することができる。本発明の一実施形態では、ヒドロキシアパタイトは、結晶形である。本発明で使用するヒドロキシアパタイトは、凝集されて粒子を形成し、高温で、安定な多孔質セラミック塊に焼結されたものでもよい。

しかし、好ましい一実施形態では、ヒドロキシアパタイトは、セラミックヒドロキシアパタイトである。「セラミックヒドロキシアパタイト」または「ｃＨＡ」は、式［Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２］の不溶性ヒドロキシル化リン酸カルシウムを指し、これは、高温で、球状のマクロ多孔質セラミック形態に焼結されている。用語「ｃＨＡ」は、タイプＩおよびタイプＩＩセラミックヒドロキシアパタイトを包含するが、それらに限定されない。特記しない限り、「ｃＨＡ」は、２０、４０、および８０μｍを包含するが、それらに限定されない任意の粒径を指す。

ヒドロキシアパタイトの粒径は幅広く変えることができるが、典型的な粒径は、直径が約１μｍ〜約１，０００μｍの範囲であり、約１０μｍ〜約１００μｍでもよい。本発明の一実施形態では、粒径は、約２０μｍである。本発明の別の実施形態では、粒径は、約４０μｍである。本発明のさらに別の実施形態では、粒径は、約８０μｍである。

多くのクロマトグラフィー担体をｃＨＡカラムの調製に使用することができるが、最も広範に使用されるのは、タイプＩおよびタイプＩＩヒドロキシアパタイトである。タイプＩは、高いタンパク質結合能力、および酸性タンパク質に対してより良好な能力を有する。しかし、タイプＩＩは、タンパク質結合能力はより低いが、核酸およびある種のタンパク質のより良好な分解能を有する。タイプＩＩの材料はまた、アルブミンへの親和性が非常に低く、多くの種およびクラスの免疫グロブリンを精製するのに特に適している。特定のヒドロキシアパタイトタイプの選択は、当業者なら決定することができる。

本発明は、カラム中に、または連続環状クロマトグラフ中に緩く充填されたヒドロキシアパタイト樹脂を用いて使用することができる。本発明の一実施形態では、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂をカラム中に充填する。カラム寸法の選択は、当業者なら決定することができる。本発明の一実施形態では、小規模精製には、約２０ｃｍの床高さで、少なくとも約０．５ｃｍのカラム直径を使用することができる。本発明の別の実施形態では、約３５ｃｍ〜約６０ｃｍのカラム直径を使用することができる。本発明のさらに別の実施形態では、約６０ｃｍ〜約８５ｃｍのカラム直径を使用することができる。本発明のある種の実施形態では、ｐＨ約９．０の約２００ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４溶液中のセラミックヒドロキシアパタイト樹脂のスラリーを使用して、約４ｃｍ／分の一定流速で、または重力でカラムに充填することができる。

ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー精製方法
本発明の方法では、対象となるタンパク質、例えば、酸性タンパク質、例えば、酸性免疫グロブリン融合タンパク質を、結合方式のｃＨＡクロマトグラフィーを使用して、ＨＭＷＡおよび不活性なおよび／または部分的に活性な種などの不純物から精製する。

「結合方式」は、調製物中に含有される少なくとも１種のタンパク質はクロマトグラフィー樹脂または担体に結合するが、少なくとも１種の夾雑物または不純物は通過する、タンパク質調製物の分離技術を指す。結合方式は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーにおいて使用することができる。

本発明の方法は、中性ｐＨおよび低イオン強度で、二価金属溶液、例えば、二価陽イオン溶液で充填されたｃＨＡ担体を使用する。例えば、二価陽イオン溶液は、ＭｇＣｌ_２溶液またはＣａＣｌ_２溶液であってもよい。二価金属陽イオン充填カラムは、タンパク質のカルボキシルとカラムのリン酸塩部位との間のさらなる架橋形成により、酸性タンパク質とｃＨＡの結合を強化することができるので、対象となる酸性タンパク質を固定化するのに特に有用である。Ｇｏｒｂｕｎｏｆｆ（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：３２９〜３９。

本発明の好ましい一実施形態では、カラムの充填に使用する二価陽イオン溶液は、ＣａＣｌ_２溶液である。そのようなＣａＣｌ_２充填カラムは、対象となるタンパク質、不活性なおよび部分的に活性な種、ならびにＨＭＷＡを結合することができる。例えば、ｃＨＡカラムは、低イオン強度のＣａＣｌ_２溶液を含む平衡化緩衝液でカラムを平衡化することによって充填することができる。例えば、ＣａＣｌ_２溶液は、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、好ましくは約２ｍＭ〜約１０ｍＭのＣａＣｌ_２とすることができる。本発明の一実施形態では、ＣａＣｌ_２溶液は、約５ｍＭである。平衡化緩衝液は、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭのＨＥＰＥＳ、好ましくは約５０ｍＭ以下のＨＥＰＥＳ、最も好ましくは約１０ｍＭのＨＥＰＥＳをさらに含んでもよい。ＨＥＰＥＳの代わりに、平衡化緩衝液は、緩衝能を有する任意の他の溶媒を含有してもよい。ＣａＣｌ_２含有平衡化溶液のｐＨは、弱塩基性から弱酸性のｐＨの範囲とすることができる。例えば、平衡化緩衝液のｐＨは、約６．１〜約８．１の範囲とすることができ、好ましくは、平衡化緩衝液のｐＨは、約７．２である。

任意選択により、二価陽イオン溶液、例えば、ＣａＣｌ_２またはＭｇＣｌ_２を含む平衡化緩衝液でカラムを充填する前に、弱塩基性から弱酸性のｐＨの、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭのリン酸塩溶液および約０．１ｍＭ〜約２．０ｍＭの塩溶液を含む平衡化溶液を最初に注入することによって、カラムを２ステップで平衡化することができる。一実施形態では、ｐＨ約６．８、約０．３Ｍのリン酸ナトリウムおよび約１．０ＭのＮａＣｌを使用する。第１の平衡化ステップに使用するリン酸塩溶液および塩溶液およびｐＨが対象となるタンパク質に応じて変わることを当業者なら理解するであろう。第２の平衡化ステップでは、平衡化緩衝液は、弱塩基性から弱酸性のｐＨ、例えば約６．１〜約８．１など、好ましくは約７．２のｐＨの、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭの緩衝液、例えば約５０ｍＭ以下のＨＥＰＥＳなど、最も好ましくは約１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、または緩衝能を有する任意の他の溶媒を含むことができる。

本発明の方法では、カラムを二価金属陽イオン溶液、例えば、ＣａＣｌ_２溶液で充填した後、カラムを、対象となるタンパク質を含有する充填緩衝液で充填することができる。充填緩衝液は、任意の緩衝液、例えば、二価金属陽イオンを加えた、プロテインＡ精製ステップなどの先の精製ステップの緩衝液であってよい。代替として、対象となるタンパク質を、二価金属陽イオンを含有する充填緩衝液に緩衝液交換することができる。代替として、二価陽イオンを充填緩衝液に直接添加せずに、対象となるタンパク質をカラムに直接充填することができる。より詳細には、充填緩衝液は、ＮａＣｌなどの一価陽イオンを含むことができる。好ましくは、ｓＩＬ２１ｒ−Ｆｃの精製では、二価陽イオンを充填緩衝液に添加しない。本発明の別の実施形態では、対象となるタンパク質調製物を、約１ｍＭ〜約２０ｍＭの一価または二価金属陽イオン、例えば約２ｍＭ〜約１０ｍＭのＣａＣｌ_２などを含む充填緩衝液中に加えるまたは緩衝液交換することができる。本発明の別の実施形態では、対象となるタンパク質調製物に、約５ｍＭのＣａＣｌ_２を加えることができる。

対象となるタンパク質を含有する充填緩衝液をカラムに充填した後、カラムを、カラムの充填に使用した平衡化溶液と同じｐＨを有し、その平衡化溶液とほぼ同じ濃度で同じ二価金属陽イオンを含む洗浄緩衝液で洗浄する。洗浄ステップは、緩く結合した不純物を除去するために実施する。したがって、洗浄緩衝液は、約１ｍＭ〜約２０ｍＭのＣａＣｌ_２、好ましくは約２ｍＭ〜約１０ｍＭのＣａＣｌ_２、最も好ましくは約５ｍＭのＣａＣｌ_２を含むことができる。洗浄緩衝液は、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭのＨＥＰＥＳ、好ましくは約５０ｍＭ以下のＨＥＰＥＳ、最も好ましくは約１０ｍＭのＨＥＰＥＳをさらに含むことができる。ＨＥＰＥＳの代わりに、洗浄緩衝液は、緩衝能を有する任意の他の溶媒を含有してもよい。一実施形態では、洗浄緩衝液は、ｐＨ約７．２の、約５ｍＭのＣａＣｌ_２および約１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む溶液である。続いて、すべての遊離ＣａＣｌ_２を除去するために、カラムを、別の緩衝液、例えば、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、好ましくは約５０ｍＭ以下のＨＥＰＥＳ、最も好ましくは約１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄することができる。２番目の洗浄緩衝液のｐＨは、約６．１〜約８．１、好ましくは約７．２とすることができる。

洗浄後、対象となるタンパク質を、リン酸塩含有溶出緩衝液、例えば、リン酸ナトリウム含有緩衝液またはリン酸カリウム含有緩衝液で溶出させる。例えば、溶出緩衝液は、約２ｍＭ〜約５０ｍＭのリン酸緩衝液を含有することができる。本発明の好ましい一実施形態では、リン酸塩含有溶出緩衝液は、約２ｍＭ〜約１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、例えば約６ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液などである。溶出緩衝液は、約１０〜約２００ｍＭのＨＥＰＥＳ、好ましくは約５０ｍＭ以下のＨＥＰＥＳ、最も好ましくは約１０ｍＭのＨＥＰＥＳをさらに含むことができる。ＨＥＰＥＳの代わりに、溶出緩衝液は、緩衝能を有する任意の他の溶媒を含有してもよい。溶出緩衝液のｐＨは、弱塩基性から弱酸性のｐＨの範囲とすることができる。例えば、溶出緩衝液のｐＨは、約６．１〜約８．１の範囲とすることができ、好ましくは、平衡化緩衝液のｐＨは、約７．２である。

対象となるタンパク質を溶出させた後、続いて、ＨＭＷＡおよび不活性なおよび／または部分的に活性な種は、樹脂から溶出されてもよい。

さらに、対象となるタンパク質を溶出させた後、カラムは、清浄化、すなわち、ストリッピングおよび再生されてもよい。典型的には、産物の微生物による汚染を防止するために、この手順を定期的に実施して、固相表面上への不純物の蓄積を最少にし、かつ／またはマトリクスを滅菌する。樹脂は、一般に、弱塩基性から弱酸性のｐＨ、例えば約６．８のｐＨなどの、リン酸ナトリウムおよび塩溶液、例えば約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭのリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ〜約２．０ＭのＮａＣｌ溶液など、例えば約０．３ｍＭのリン酸ナトリウムおよび約１．０ＭのＮａＣｌなどでストリッピングする。樹脂は、一般に、水酸化ナトリウムおよびリン酸カリウムの溶液を使用して再生する。

さらに、樹脂は、実行と実行の間、保存緩衝液中で任意選択により保存されてもよい。保存緩衝液は、一般に、水酸化ナトリウム緩衝液、例えば約１００ｍＭの水酸化ナトリウム緩衝液などである。

すべての緩衝液の例示的な成分は、表１に示している。緩衝液成分は、当業者の知識に従って調整することができる。すべての緩衝液またはステップが必要というわけではないが、あくまで例示のために示している。例えば、平衡化ステップ１および２を有する必要はない場合があり、ヒドロキシアパタイト樹脂をストリッピング、再生、または保存する必要はない場合がある。

本発明の方法では、対象となる溶出されたタンパク質、例えば、溶出された酸性タンパク質は、レベルが減少したＨＭＷＡおよび不活性なおよび／または部分的に活性な種を含む。一実施形態では、ＨＭＷＡのレベルは、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％減少する（例えば、充填での約５％〜約１５％が溶出ピークでは約２％未満になる）。溶出されたタンパク質中のＨＭＷＡの含有量を測定するために、いくつかの方法、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を使用することができる。ＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）アッセイおよび結合活性ＥＬＩＳＡアッセイは、不活性なおよび／または部分的に活性な種の除去を監視するのに使用することができる。

さらなる任意選択による精製ステップ
前述のように、本発明のｃＨＡベースの精製方法は、他のタンパク質精製技術と組み合わせて使用することができる。ｃＨＡクロマトグラフィーでは、最初の充填投与量が約４０ｍｇ／ｍＬ以下のｃＨＡ樹脂、例えば約２０ｍｇ／ｍＬのｃＨＡ樹脂などであることが望ましい。したがって、本発明の一実施形態では、ヒドロキシアパタイトステップより前の１つまたは複数のステップは、夾雑物または不純物の充填投与量を減少させるのに望ましい可能性がある。本発明の別の実施形態では、ヒドロキシアパタイトステップの後の１つまたは複数の精製ステップは、さらなる夾雑物または不純物を除去するのに望ましい可能性がある。

記載したｃＨＡ精製手順は、プロテインＡクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、限外ろ過、ウイルス除去ろ過、および／またはイオン交換クロマトグラフィーを包含するが、それらに限定されない他の精製ステップと任意選択により組み合わされてもよい。

一実施形態では、免疫グロブリン融合タンパク質用の回収培地は、ｃＨＡ精製ステップの前に、プロテイ孔径を制御された細孔ガラスに共有結合されたプロテインＡからなるＰＲＯＳＥＰ−Ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｕ．Ｋ．）は、有益に使用することができる。他の有用なプロテインＡ製剤としては、プロテインＡセファロースＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０ＭプロテインＡ（ＴｏｓｏＨａａｓ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）、およびＭＡＢＳＥＬＥＣＴカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が挙げられる。

ｃＨＡ精製の前の任意選択のステップとして、イオン交換クロマトグラフィーを使用することができる。この点に関して、クロマトグラフィーの陰イオン性または陽イオン性担体を形成するために、様々な陰イオン性または陽イオン性置換基をマトリクスに付加することができる。陰イオン性交換置換基としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチルアクリルアミド（ＴＭＡＥ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）、および第四級アミン（Ｑ）基が挙げられる。陽イオン性交換置換基としては、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスファート（Ｐ）、およびスルホナート（Ｓ）が挙げられる。ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ−２３、ＣＭ−３２、およびＣＭ−５２などのセルロースイオン交換樹脂は、Ｗｈａｔｍａｎ Ｌｔｄ．、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、Ｋｅｎｔ、Ｕ．Ｋ．から入手可能である。セファデックスベースの架橋イオン交換体も知られている。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−、およびＳＰ−セファデックス、ならびにＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−、およびＳ−セファロース、ならびにセファロースはすべて、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能である。さらに、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＭおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０ＳまたはＭなどの、ＤＥＡＥ誘導およびＣＭ誘導のエチレングリコール−メタクリレートコポリマーの両方が、Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡから入手可能である。

本発明の一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、結合方式でもフロースルー方式でも使用することができる。

ある種の実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーステップを最初に行い、イオン交換ステップを２番目に行い、ｃＨＡステップを３番目に行う。

さらなる不純物
ＨＭＷＡ、不活性なおよび／または部分的に活性な種の除去に加えて、ｃＨＡクロマトグラフィーは、タンパク質調製物から他の不純物を除去するのに有用であることが示された。本発明のｃＨＡクロマトグラフィー方法によって除去することができる他の不純物としては、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、外来ウイルス、および先行精製ステップの浸出したプロテインＡ夾雑物が挙げられるが、それらに限定されない。

本発明の一実施形態では、本方法は、タンパク質調製物から浸出プロテインＡを除去することができる。本発明のある種の実施形態では、最終調製物中に存在する浸出プロテインＡの量を、大幅に、例えば、約２８ｐｐｍから約１ｐｐｍに減少させることができる。

本発明の別の実施形態では、本方法は、タンパク質調製物から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去することができる。本発明のある種の実施形態では、最終調製物中のＨＣＰの量を、約７５００ｐｐｍから約７５０ｐｐｍに減少させることができる。ＨＣＰおよびプロテインＡのＥＬＩＳＡアッセイは、ＨＣＰおよび浸出プロテインＡの除去を監視するのに使用することができる。

以下の実施例は、本発明の理解を助けるために示すものであるが、本発明の範囲をいかなる意味でも限定することを意図せず、またそう解釈すべきではない。本実施例は、従来の方法、例えば、クローニング、トランスフェクション、細胞株にタンパク質を過剰発現させる方法の基本的態様、および任意のさらなる予備的精製ステップ（プロテインＡクロマトグラフィーなど）の実施方法についての詳細な説明を包含するものではない。そのような方法は、当業者には周知である。

（実施例１）
酸性免疫グロブリン融合タンパク質（ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ）を、ＣＨＯ細胞中で発現させ、ｒプロテインＡクロマトグラフィー（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって回収培地から精製した。ｒプロテインＡクロマトグラフィーからのタンパク質溶出物（ｅｌｕｔｉｏｎ）は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質を含有するが、著しいレベルの不活性なおよび部分的に活性な種ならびにＨＭＷＡも含有していた（表２の「充填」列を参照）。不活性なおよび部分的に活性なＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ種ならびにＨＭＷＡを除去するために、プロテインＡカラムからの溶出物をｃＨＡクロマトグラフィーにかけた。

ｃＨＡカラム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、最初に、ｐＨ６．８の、０．３Ｍのリン酸ナトリウム、１．０ＭのＮａＣｌを含有する平衡化緩衝液１で、続いて、ｐＨ７．２の、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する平衡化緩衝液２で平衡化した（表１）。平衡化緩衝液１は、高濃度のリン酸塩を含む緩衝液であり、平衡化緩衝液２は、リン酸塩を洗い流すのに使用する。続いて、カラムを、中性ｐＨおよび低イオン強度の塩化カルシウム溶液（ｐＨ７．２の、５ｍＭのＣａＣｌ_２および１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する平衡化緩衝液３）で平衡化して、カラムを充填用に調製した。ｒプロテインＡ溶出物プールを、５ｍＭの塩化カルシウム（充填）を含有するように調整し、ｃＨＡカラムに充填した。充填緩衝液条件下で、産物と、目的物質由来不純物（不活性なおよび部分的に活性な種ならびにＨＭＷＡ）と製造工程由来不純物（浸出プロテインＡ、宿主細胞タンパク質、およびＤＮＡ）とをすべて、ｃＨＡ樹脂に結合させた。次いで、カラムを、塩化カルシウム緩衝液（洗浄１）、続いて、第２洗浄緩衝液（洗浄２）で洗浄して、塩化カルシウムを除去し、中性ｐＨ７．２の、６ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳの緩衝液を使用して、活性産物、すなわち、活性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを、選択的に溶出させた（溶出）。続いて、より高濃度のリン酸緩衝液を使用して、不活性なおよび部分的に活性な種ならびにＨＭＷＡ種を包含する目的物質由来不純物を、樹脂からストリッピングした。最後に、水酸化ナトリウムおよびリン酸カリウムの溶液を使用して、樹脂を再生した。

図１は、ｃＨＡカラム実行のクロマトグラムを示している。対象となる産物の大部分は溶出画分中に溶出されているが、ストリッピング画分は不活性なおよび部分的に活性な種（モノマー）もＨＭＷＡも含有している。

規定した操作条件下でのｃＨＡクロマトグラフィーステップによる不純物クリアランスの結果を、表２に示す。不活性なおよび部分的に活性な種の除去の監視には、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用し、ＨＭＷＡ含有量の測定には、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用し、ＨＣＰおよび浸出プロテインＡの除去の監視には、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびプロテインＡ ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。充填およびストリッピング画分中のモノマーをＨＭＷＡから単離し、次いで、結合活性に関してＢＩＡＣＯＲＥアッセイで試験した。表２に示すように、溶出画分中の対象となる産物は、ストリッピングプール中に存在する不活性なおよび部分的に活性な種よりはるかに高い結合活性を有する。ｃＨＡステップを、パイロットおよび臨床用製造規模で実行した。大規模ｃＨＡカラム実行から得られたデータを、表３に示した。

（実施例２）
ｃＨＡクロマトグラフィーは、ＩｇのＦｃドメイン（ｓＩＬ２１ｒ−Ｆｃ）に融合したＩＬ２１を含む別の酸性Ｉｇ融合タンパク質の精製中のＨＭＷＡ除去に優れていることが分かった。Ｅｔｔｉｎｇｅｒら、Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ、２００８；６７（Ｓｕｐｐｌ ＩＩＩ）：ｉｉｉ８３〜ｉｉｉ８６（ｓＩＬ２１ｒ−Ｆｃ融合タンパク質の説明に関して）を参照されたい。このプロセスステップの目的の１つは、後のクロマトグラフィーステップのＨＭＷＡおよびＨＣＰに対する能力を向上させるためにＨＭＷＡを除去することであった。カラムを、中性ｐＨおよび低イオン強度の塩化カルシウム溶液で平衡化した。ｒプロテインＡ溶出物プールを、塩化カルシウムとの接触時に観察された産物不安定性のために、このプロセスでは塩化カルシウムを添加するのではなく、ｒプロテインＡ溶出物プールを、２０〜３０ｇ／Ｌの樹脂充填投与量においてｃＨＡカラムに直接充填した。これらの緩衝液条件下で、産物はｃＨＡ樹脂に結合し、いくつかのＨＭＷＡ種はカラムを通過した。次いで、カラムを、中性ｐＨおよび低イオン強度の緩衝液で洗浄し、中性ｐＨの１０〜１７ｍＭのリン酸緩衝液を使用して、活性産物を選択的に溶出させた。続いて、より高濃度のリン酸緩衝液を使用して、さらなるＨＭＷＡ種を樹脂からストリッピングした。最後に、水酸化ナトリウムおよびリン酸カリウムの溶液を使用して、樹脂を再生した。

次の表（４）は、図２に例示するｓＩＬ２１ｒ−Ｆｃ精製の精製結果を示している。

Claims (23)

1. 対象となる少なくとも１種の酸性タンパク質を、不純物を含有するタンパク質調製物から精製する方法であって、
   （ａ）ＣａＣｌ_２を含む平衡化緩衝液を、ヒドロキシアパタイト樹脂に注入するステップと、
   （ｂ）ヒドロキシアパタイト樹脂を充填緩衝液中でタンパク質調製物と接触させるステップと、ここで充填緩衝液は一価陽イオンを含む、
   （ｃ）ヒドロキシアパタイト樹脂を、ＣａＣｌ_２を含む洗浄緩衝液で洗浄するステップと、
   （ｄ）２〜５０ｍＭのリン酸塩を含む溶出緩衝液を用いて、少なくとも１種の酸性タンパク質をヒドロキシアパタイト樹脂から溶出させるステップと
   を含む方法。
2. 平衡化緩衝液が、１〜２０ｍＭのＣａＣｌ_２を含み、充填緩衝液が、１〜２０ｍＭのＣａＣｌ_２を含み、洗浄緩衝液が、１〜２０ｍＭのＣａＣｌ_２を含む、請求項１に記載の方法。
3. 平衡化緩衝液、充填緩衝液、および洗浄緩衝液が、５ｍＭのＣａＣｌ_２を含み、溶出緩衝液が、６ｍＭのリン酸塩を含む、請求項２に記載の方法。
4. 不純物が、前記少なくとも１種の酸性タンパク質の不活性なまたは部分的に活性な種である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 不純物が、高分子量凝集体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. ヒドロキシアパタイト樹脂が、セラミックヒドロキシアパタイトのタイプＩまたはタイプＩＩである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. リン酸塩が、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. リン酸塩が、リン酸ナトリウムである、請求項７に記載の方法。
9. 平衡化緩衝液、洗浄緩衝液、または溶出緩衝液のうちの少なくとも１種が、１０ｍＭ〜２００ｍＭのＨＥＰＥＳをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 平衡化緩衝液、洗浄緩衝液、または溶出緩衝液のうちの少なくとも１種が、１０ｍＭのＨＥＰＥＳをさらに含む、請求項９に記載の方法。
11. 平衡化緩衝液、洗浄緩衝液、または溶出緩衝液のうちの少なくとも１種が、６．１〜８．１のｐＨを有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 平衡化緩衝液、洗浄緩衝液、または溶出緩衝液のうちの少なくとも１種が、７．２のｐＨを有する、請求項１１に記載の方法。
13. 酸性タンパク質が、免疫グロブリン融合タンパク質である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 免疫グロブリン融合タンパク質が、受容体融合タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
15. 受容体融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃである、請求項１４に記載の方法。
16. 融合タンパク質が、ｓＩＬ２１ｒ−Ｆｃである、請求項１３に記載の方法。
17. 一価陽イオンが、ＮａＣｌである、請求項１に記載の方法。
18. 高分子量凝集体の少なくとも６０％の減少をもたらす、請求項５に記載の方法。
19. 高分子量凝集体の少なくとも９０％の減少をもたらす、請求項１８に記載の方法。
20. 不純物が、プロテインＡまたは宿主細胞タンパク質である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 平衡化緩衝液を注入するステップの前に、タンパク質調製物に、プロテインＡクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、限外ろ過、ウイルス除去ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、またはそれらの組合せからなる群から選択される精製方法を施すステップをさらに含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 対象となる少なくとも１種の酸性タンパク質を、前記少なくとも１種の酸性タンパク質の不活性なまたは部分的に活性な種を含有するタンパク質調製物から精製する方法であって、
    （ａ）ＣａＣｌ_２を含む平衡化緩衝液を、ヒドロキシアパタイト樹脂に注入するステップと、
    （ｂ）ヒドロキシアパタイト樹脂を充填緩衝液中でタンパク質調製物と接触させるステップと、ここで充填緩衝液は一価陽イオンを含む、
    （ｃ）ヒドロキシアパタイト樹脂を、ＣａＣｌ_２を含む洗浄緩衝液で洗浄するステップと、
    （ｄ）２〜５０ｍＭのリン酸塩を含む溶出緩衝液を用いて、対象となる少なくとも１種の酸性タンパク質を、前記不活性なまたは部分的に活性な種とは別々に溶出させるステップと
    を含む方法。
23. 酸性タンパク質が、精製され、医薬品において使用するために製剤化される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。

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