JPH10215875A - 蛋白質の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高度な純度を持つ蛋白質を得ることができる
精製方法の提供。 【解決手段】 蛋白質、例えば、肝実質細胞増殖因子を
樹脂を用いて精製する方法において、粗蛋白質溶液を樹
脂に吸着させ、緩衝液で処理した後に溶出操作を行うこ
とを特徴とする蛋白質の精製方法。 【効果】 本発明の精製方法によれば、簡便な方法で目
的蛋白質から夾雑物を除去することができ、医薬品とし
て使用するのに十分高度な純度を有する蛋白質を得るこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は蛋白質の精製方法に
関し、更に詳細には肝実質細胞増殖因子（以下「ＨＧ
Ｆ」と略称することがある。）を始めとする蛋白質を高
度な純度を必要とする医薬品として応用する際の精製工
程において有用な蛋白質の精製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】これま
で蛋白質を精製するには、その蛋白質に適した樹脂を選
択し次にその樹脂に目的蛋白質を吸着させたり、また目
的蛋白質以外の夾雑物を吸着させたりして純度を上げて
いくのが一般的であった。樹脂に目的蛋白質を吸着させ
精製していくときはイオン交換クロマトグラフィーを例
にとると、蛋白質溶液（夾雑物を含む）を樹脂にアプラ
イ後、目的蛋白質が溶出してこない程度の塩濃度を有し
た緩衝液で洗浄後、塩濃度を上げることによって目的蛋
白質を溶出させる方法が一般的である。また、洗浄、溶
出時の線速度・空間速度の調節並びに分取液量の調整も
精製技術のうちの一つである。

【０００３】上記に挙げた精製技術では、まず目的蛋白
質に適合した樹脂の選択に時間・労力を要し、また夾雑
物の分離も十分できない事例が多く、続いて新たなクロ
マトグラフィーを組み合わせていかなければならない。
一方、ＨＧＦは、初代培養肝実質細胞の増殖を促進させ
うるヒト由来の蛋白性因子として、劇症肝炎患者血漿よ
り見い出された（特開昭６３−２２５２６号公報；以
下、ヒト由来の肝実質細胞増殖因子を「ｈＨＧＦ」と略
称することがある）。その後、ｈＨＧＦ蛋白質のアミノ
酸配列およびそれをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）（特
開平３−７２８８３号公報）、さらにこのｃＤＮＡを用
いた組換えｈＨＧＦ蛋白質（以下、「ｒｈＨＧＦ」と略
称することがある）の生産方法および形質転換体（特開
平３−２８５６９３号公報）が報告されている。

【０００４】ＨＧＦの樹脂を使用した精製方法として
は、これまで種々の方法が報告されているが、ＨＧＦを
医薬品として使用するために十分高度な純度を持つＨＧ
Ｆを得ることができ、かつ、簡便な精製方法が望まれて
いるのが現状である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＨＧＦを
はじめとする蛋白質を、高度な純度を必要とする医薬品
として応用する際の精製工程について探索、検討を進め
た結果、所望の塩基性蛋白質を樹脂を用いて精製する
際、蛋白質を樹脂に吸着させた後、溶出操作を行う前に
酸性緩衝液で処理することにより、目的蛋白質の樹脂へ
の吸着力を高めることができ、その結果、夾雑物が効率
よく除去できることを見出した。本発明は、これらの知
見に基づいて完成されたものである。

【０００６】すなわち、本発明の要旨は、蛋白質を樹脂
を用いて精製する方法において、粗蛋白質溶液を樹脂に
吸着させ、緩衝液で処理した後に溶出操作を行うことを
特徴とする蛋白質の精製方法に存する。更に、本発明の
好ましい態様によれば、蛋白質が塩基性蛋白質であり、
緩衝液が酸性緩衝液である上記方法；酸性緩衝液が、グ
リシン−塩酸緩衝液、フタル酸カリウム−塩酸緩衝液、
クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、β，β′−ジメ
チルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸
ナトリウム緩衝液、コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝
液、フタル酸カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、ヒス
チジン塩酸塩−水酸化ナトリウム緩衝液、ＭＥＳ−水酸
化ナトリウム緩衝液、カコジル酸ナトリウム−塩酸緩衝
液またはマレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液から選ばれる上記方法；

【０００７】酸性緩衝液が、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝
液であることを特徴とする上記方法；塩基性蛋白質が、
肝実質細胞増殖因子、ブタ膵臓エラスターゼ、血液凝固
因子ＸＩ（血漿トロンボプラスチン前駆体）、ウマ心臓
シトクロームｃ、ウシ膵臓トリプシン、ウシ膵臓Ｋｕｎ
ｉｔｚインヒビター、ヒストン類、ニワトリ卵白リゾチ
ーム、ヒトリゾチーム、ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡま
たはヒトプラスミノーゲンプロアクチベーターから選ば
れる上記方法；

【０００８】塩基性蛋白質が、肝実質細胞増殖因子であ
ることを特徴とする上記方法；肝実質細胞増殖因子が以
下の理化学的性質： １）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；非還元条件下）による推
定分子量が約７６，０００〜９２，０００ダルトンであ
る、 ２）肝実質細胞を増殖させる活性を有する、 ３）８０℃、１０分間の加熱処理により上記活性が失活
する、 ４）トリプシンによる消化処理またはキモトリプシンに
よる消化処理により上記活性が失活する、および ５）ヘパリンに対して強い親和性を有するを有する蛋白
質である上記方法；肝実質細胞増殖因子がヒト由来の肝
実質細胞増殖因子である上記方法；

【０００９】肝実質細胞増殖因子がｃＤＮＡを用いた組
換え肝実質細胞増殖因子である上記方法；組換え肝実質
細胞増殖因子が配列番号１に示されるアミノ酸配列で表
される肝実質細胞増殖因子である上記方法；組換え肝実
質細胞増殖因子が配列番号１に示されるアミノ酸配列の
うち３０番目のグルタミン酸から７２８番目のセリンま
での配列で表される肝実質細胞増殖因子である上記方
法；

【００１０】組換え肝実質細胞増殖因子が配列番号１に
示されるアミノ酸配列のうち３２番目のグルタミンから
７２８番目のセリンまでの配列で表される肝実質細胞増
殖因子である上記方法；蛋白質が酸性蛋白質であり、緩
衝液が塩基性緩衝液である上記方法；塩基性緩衝液が、
ホウ酸緩衝液、ホウ酸−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸水素
ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸水素二ナ
トリウム−水酸化ナトリウム緩衝液または塩化カリウム
−水酸化ナトリウム緩衝液から選ばれる上記方法；酸性
蛋白質がアルブミン、アンチトロンビンIII 、キニノー
ゲン、血液凝固因子ＩＸ、α２ＨＳ−糖蛋白質、プロト
ロンビン、免疫グロブリンＧまたはレチノール結合蛋白
質から選ばれる上記方法；

【００１１】樹脂がイオン交換樹脂またはアフィニティ
ー樹脂から選ばれる上記方法；アフィニティー樹脂が硫
酸化セルロファインまたはヘパリンセファロースである
上記方法；イオン交換樹脂がスルホプロキル基又はカル
ボキシメチル基を有するイオン交換樹脂である上記方
法；緩衝液で処理した後にさらに界面活性剤を使用した
洗浄操作を行ってから溶出操作を行う上記方法が提供さ
れる。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明につき詳細に説明す
る。本発明の精製方法において使用される蛋白質として
は、高度な純度を必要とする医薬品として応用可能な蛋
白質であれば特に制限はなく、塩基性蛋白質、酸性蛋白
質いずれの場合も適用可能である。

【００１３】塩基性蛋白質としては、例えば、ＨＧＦ、
ブタ膵臓エラスターゼ、血液凝固因子ＸＩ（血漿トロン
ボプラスチン前駆体）、ウマ心臓シトクロームｃ、ウシ
膵臓トリプシン、ウシ膵臓Ｋｕｎｉｔｚインヒビター、
ヒストン類、ニワトリ卵白リゾチーム、ヒトリゾチー
ム、ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ、ヒトプラスミノーゲ
ンプロアクチベーター等が挙げられ、特に好ましくは、
ＨＧＦが挙げられる。

【００１４】かかるＨＧＦは、ＨＧＦを含有することの
知られているヒトやラット等のほ乳動物由来の体液や組
織、または自発的にＨＧＦを産生する細胞から天然のＨ
ＧＦを単離してもよいし、あるいは遺伝子組換え法によ
り該ＨＧＦｃＤＮＡを細胞に導入して得られる組換えＨ
ＧＦを用いてもよい。組換えＨＧＦを産生させる宿主と
しては、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物
細胞、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。

【００１５】具体例には、上記ほ乳動物由来の胎盤、肝
障害患者肝組織及び血液、ＭＲＣ−５細胞、ＩＭＲ−９
細胞などの線維芽細胞株、あるいは特開平３−２８５６
９３号公報に記載された方法に従いｈＨＧＦをコードす
るｃＤＮＡを含む発現ベクターをＣＨＯ細胞等の宿主に
導入した産生株などから得られたものが該当する。ま
た、これらＨＧＦにおいては、その前駆体蛋白質や、肝
実質細胞を増殖させるという活性を損なわない範囲にお
いて一部のアミノ酸を置換、欠失、挿入、修飾するなど
の改変を行ったものを用いてもよい。かかる改変体とし
ては、例えば、特開平２−２８８８９９号公報、ＷＯ９
０／１０６５１号公報、特開平３−１３００９１号公
報、同３−２５５０９６号公報、同４−３００００号公
報、Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０−４４３（１９８
９）等に記載のものが挙げられる。

【００１６】本発明においては、ＨＧＦが特開昭６３−
２２５２６号公報および米国特許第５００４８０５号公
報に記載されている、以下の理化学的性質を有する蛋白
性因子であることが好ましい。 １）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；非還元条件下）による推
定分子量が約７６，０００〜９２，０００ダルトンであ
る、 ２）肝実質細胞を増殖させる活性を有する、 ３）８０℃、１０分間の加熱処理により上記活性が失活
する、 ４）トリプシンによる消化処理またはキモトリプシンに
よる消化処理により上記活性が失活する、および ５）ヘパリンに対して強い親和性を有する

【００１７】また、かかるＨＧＦはヒト由来であるもの
が好ましく、特に好ましいものとしては、特開平３−７
２８８３号公報、特開平４−８９４９９号公報およびヨ
ーロッパ公開特許第０４１２５５７号公報に記載の、後
記配列表の配列番号１に示されるアミノ酸で表されるも
の、配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち３０番目
のグルタミン酸から７２８番目のセリンまでの配列で表
されるもの、配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち
３２番目のグルタミンから７２８番目のセリンまでの配
列で表されるものを挙げることができる。

【００１８】酸性蛋白質としては、例えば、アルブミ
ン、アンチトロンビンIII 、キニノーゲン、血液凝固因
子ＩＸ、α２ＨＳ−糖蛋白質、プロトロンビン、免疫グ
ロブリンＧおよびレチノール結合蛋白質等が挙げられ
る。本発明の方法において精製対象となる上記蛋白質の
粗蛋白質溶液とは、組換えＤＮＡ技術を利用して、該蛋
白質を産生するように形質転換された組換え体、例え
ば、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、大腸菌、酵母等を適当な
培地および培養条件で培養して該蛋白質を産生、蓄積さ
せた後、この培養上清または細胞内から適当な方法で該
蛋白質を回収して得られるものである。粗蛋白質溶液に
は、上記培養物に限らず、天然の蛋白質溶液やヒト血清
等も含まれる。

【００１９】本発明においては、先ず上記粗蛋白質溶液
を樹脂に吸着させる。ここで使用される樹脂としては、
通常蛋白質の精製に使用される樹脂であれば特に制限は
されないが、陰イオンもしくは陽イオン交換樹脂等のイ
オン交換樹脂またはアフィニティー樹脂が好ましいもの
として挙げられる。イオン交換樹脂としてはスルホプロ
キル基またはカルボキシル基を有するイオン交換樹脂
が、アフェニティー樹脂としては硫酸化セルロファイ
ン、ヘパリンセルロファイン（以上生化学工業社）また
はヘパリンセファロース（Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）ＣＬ６Ｂ（ファルマシア社）等が好ましいも
のとして挙げられる。

【００２０】イオン交換樹脂の具体例としては、ＤＥＡ
Ｅ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ Ａ−５０、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−
２５、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０、ＤＥＡＥ
Ｓｅｐｈａｃｅｌ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６Ｂ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ｆｌ
ｏｗ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ｆｌ
ｏｗ、ＭｏｎｏＱ（以上ファルマシア社）、ＤＥＡＥ−
トヨパール６５０、ＱＡＥ−トヨパール５５０、Ｓｕｐ
ｅｒＱ−トヨパール６５０（以上東ソー社）、ＤＥＡＥ
−セルロファインＡ−２００−ｍ、ＤＥＡＥ−セルロフ
ァインＡ−５００−ｍ、ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−
５００−ｓｆ、ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００−
ｍ（以上生化学工業社）等の陰イオン交換樹脂；ＣＭ
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｃ−５０、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５、ＳＰ
−Ｓｅｐａｄｅｘ Ｃ−５０、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ＣＬ−６Ｂ、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ
Ｂｅａｄｓ、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔｆｌｏ
ｗ、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗ、
Ｍｏｎｏ Ｓ、Ｓ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ、ＳＰ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（以上ファルマシア社）、ＳＰ
−トヨパール６５０、ＳＰ−トヨパール５５０、ＣＭ−
トヨパール６５０（以上東ソー社）、ＣＭ−セルロファ
インＣ−２００−ｍ、ＣＭ−セルロファインＣ−５００
−ｍ、ＣＭ−セルロファインＣ−５００−ＳＦ（以上生
化学工業社）等の陽イオン交換樹脂が挙げられる。これ
らのイオン交換樹脂は市販されており、容易に入手でき
る。

【００２１】前記蛋白質のうち、塩基性蛋白質を精製す
る際には、使用する緩衝液としては酸性のものを、酸性
蛋白質を精製する際には、使用する緩衝液としては塩基
性のものを使用する。酸性緩衝液としては、ｐＨ７未
満、好ましくはｐＨ３〜６のグリシン−塩酸緩衝液、フ
タル酸カリウム−塩酸緩衝液、クエン酸−クエン酸ナト
リウム緩衝液、β，β′−ジメチルグルタル酸−水酸化
ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コハ
ク酸−水酸化ナトリウム緩衝液、フタル酸カリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液、ヒスチジン塩酸塩−水酸化ナト
リウム緩衝液、ＭＥＳ（２−ｍｏｒｐｈｏｒｉｎｏｅｔ
ｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−水酸化ナトリ
ウム緩衝液、カコジル酸ナトリウム−塩酸緩衝液および
マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム等が挙げられ
る。

【００２２】塩基性緩衝液としては、ｐＨ８〜１２、好
ましくはｐＨ９〜１１のホウ酸緩衝液（Ｈ₃ＢＯ₃−ＫＣ
ｌ−ＮａＯＨ）、ホウ酸−塩酸緩衝液（Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇−
ＨＣｌ）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸ナ
トリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化
ナトリウム緩衝液（Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇−ＮａＯＨ）、炭酸水
素ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸水素二
ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液および塩化カリウ
ム−水酸化ナトリウム緩衝液等が挙げられる。

【００２３】これら緩衝液の濃度は、通常５〜１００ｍ
Ｍ程度が適当であり、これに加えて塩化ナトリウム等の
塩類を加えるなど、精製対象とする蛋白質の種類により
適宜決定すればよい。蛋白質の精製を行う際、通常は上
記の樹脂を平衡化した後、蛋白質の粗抽出液を樹脂に吸
着させ、場合により洗浄操作を行ったのち、最後に溶出
操作を行い、目的とする蛋白質を精製する。しかし、本
発明は、粗蛋白質溶液を樹脂に吸着させた後、それぞれ
対応する緩衝液を樹脂に通じて前処理を施す点に一つの
特徴を有する。ここで、緩衝液による前処理を行うこと
により、夾雑物濃度を著しく減じることが可能となる。
樹脂に通じる緩衝液の量に特に制限はないが、通常樹脂
容積の２〜１０倍、好ましくは４〜８倍が適当である。

【００２４】上記のような緩衝液での前処理を行った
後、場合により洗浄操作を行い、最後に溶出操作を行う
ことにより、蛋白質の樹脂に対する吸着力を高めること
ができ、医薬品として使用可能な高度に精製された蛋白
質を得ることができる。ここで、洗浄操作を行う場合、
洗浄操作で用いる緩衝液にＴｗｅｅｎ２０やＴｗｅｅｎ
８０等の非イオン性界面活性剤を添加することにより、
目的蛋白質の極端な樹脂との結合を防止し、目的蛋白質
と相互作用している夾雑物を剥離させながら精製するこ
とが可能となる。

【００２５】

【発明の効果】本発明の精製方法によれば、簡便な方法
で目的蛋白質から夾雑物を除去することができ、医薬品
として使用するのに十分高度な純度を有する蛋白質を得
ることができる。

【００２６】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、その要旨を超えない限り、以下の実施例に
限定されるものではない。なお、以下の実施例で、ＨＧ
Ｆ培養上清は、特開平３−２８５６９３号公報に記載さ
れているＢＤ−２４株等を用いて、該公報に記載されて
いる方法に従って製造された精製前の組換えｈＨＧＦ培
養上清を使用した。

【００２７】実施例１ ガラス製のカラム（φ２．６×１０ｃｍ（５３ｍｌ））
に樹脂（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＢＢ（ファルマシ
ア社））を充填し平衡化リン酸緩衝液（０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ／１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））で１２
０ｃｍ／ｈの線速度で平衡化した。次にＨＧＦを含んだ
培養上清を線速度１２０ｃｍ／ｈでアプライし、続いて
０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０／１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い線速度１２０
ｃｍ／ｈで樹脂容積の１０倍量で洗浄した。

【００２８】更に０．５Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０）を用い、線速度１２０ｃｍ／ｈで樹
脂容積の５倍量、０．６Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０）を用い、線速度１２０ｃｍ／ｈで樹
脂容積の５倍量通じて前処理した。そして０．６Ｍ Ｎ
ａＣｌ／５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）と１．０Ｍ
ＮａＣｌ／５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を使っ
て線速度６０ｃｍ／ｈで樹脂容積の５倍量のグラジェン
ト溶出を行い、ＨＧＦを得た（図１）。

【００２９】一方、比較例として、上記の通りリン酸緩
衝液を用い、樹脂容積の１０倍量で洗浄した後に、更に
０．５Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）を用い、線速度１２０ｃｍ／ｈで樹脂容積の１０倍
量通じて前処理した。そして０．５Ｍ ＮａＣｌ／１０
ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）と１．０Ｍ ＮａＣｌ／
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を使って線速度６
０ｃｍ／ｈで樹脂容積の５倍量のグラジェント溶出を行
い、ＨＧＦを得た（図２）。

【００３０】図１および図２中、白丸は目的蛋白質（Ｈ
ＧＦ）、黒丸は夾雑物であるＦｏｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎ
ｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、黒四角はＣａｌｆ Ｓｅｒ
ｕｍ（ＣＳ）を示す。図２から、前処理をリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で行った場合、目的蛋白質（ＨＧＦ）に
付随してかなりの量の夾雑物が溶出されてしまうことが
わかる。一方、図１に示されるように、前処理を酸性緩
衝液で行った場合、目的蛋白質（ＨＧＦ）と付随して溶
出されてくる夾雑物は図２と比較して顕著に低減されて
いることが明らかである。

【００３１】図３に、図１および図２に示した目的蛋白
質（ＨＧＦ）画分を集め、再度夾雑物濃度を測定した結
果を示す。図中、縦軸は目的蛋白質（ＨＧＦ）との相対
的な重量比（ｐｐｍ）で示した夾雑物濃度を示し、ＦＢ
ＳはＦｏｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＣＳは
Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｎ、ＣＨＯＰはＣｈｉｎｅｓｅＨａ
ｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎを
示す。図３から、酸性緩衝液で前処理した場合（右側の
黒く塗り潰した棒グラフ）は、リン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で処理した場合（左側の棒グラフ）と比較して、Ｆ
ＢＳおよびＣＳで約５〜６倍、ＣＨＯＰで約３倍除去効
率が向上することがわかる。

【００３２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：７２８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ヒト 配列 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205 Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220 His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285 Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu 290 295 300 Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile 305 310 315 320 Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu 325 330 335 His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365 Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380 Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400 Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp 405 410 415 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480 Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg 500 505 510 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560 Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725

【図面の簡単な説明】

【図１】洗浄にリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、前
処理および溶出に酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いた時
の溶出プロファイルを示す図である。

【図２】洗浄、前処理および溶出にリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）を用いた時の溶出プロファイルを示す図であ
る。

【図３】目的蛋白質（ＨＧＦ）画分を集め、再度夾雑物
濃度を測定した結果を示す図である。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 蛋白質を樹脂を用いて精製する方法にお
   いて、粗蛋白質溶液を樹脂に吸着させ、緩衝液で処理し
   た後に溶出操作を行うことを特徴とする蛋白質の精製方
   法。
2. 【請求項２】 蛋白質が塩基性蛋白質であり、緩衝液が
   酸性緩衝液であることを特徴とする請求項１記載の精製
   方法。
3. 【請求項３】 酸性緩衝液が、グリシン−塩酸緩衝液、
   フタル酸カリウム−塩酸緩衝液、クエン酸−クエン酸ナ
   トリウム緩衝液、β，β′−ジメチルグルタル酸−水酸
   化ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コ
   ハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液、フタル酸カリウム−
   水酸化ナトリウム緩衝液、ヒスチジン塩酸塩−水酸化ナ
   トリウム緩衝液、ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液、カ
   コジル酸ナトリウム−塩酸緩衝液またはマレイン酸ナト
   リウム−水酸化ナトリウム緩衝液から選ばれることを特
   徴とする請求項２記載の精製方法。
4. 【請求項４】 酸性緩衝液が、酢酸−酢酸ナトリウム緩
   衝液であることを特徴とする請求項２または３記載の精
   製方法。
5. 【請求項５】 塩基性蛋白質が、肝実質細胞増殖因子、
   ブタ膵臓エラスターゼ、血液凝固因子ＸＩ（血漿トロン
   ボプラスチン前駆体）、ウマ心臓シトクロームｃ、ウシ
   膵臓トリプシン、ウシ膵臓Ｋｕｎｉｔｚインヒビター、
   ヒストン類、ニワトリ卵白リゾチーム、ヒトリゾチー
   ム、ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡまたはヒトプラスミノ
   ーゲンプロアクチベーターから選ばれることを特徴とす
   る請求項２記載の精製方法。
6. 【請求項６】 塩基性蛋白質が肝実質細胞増殖因子であ
   ることを特徴とする請求項２記載の精製方法。
7. 【請求項７】 肝実質細胞増殖因子が以下の理化学的性
   質を有する蛋白性因子であることを特徴とする請求項６
   に記載の精製方法。 １）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
   電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；非還元条件下）による推
   定分子量が約７６，０００〜９２，０００ダルトンであ
   る、 ２）肝実質細胞を増殖させる活性を有する、 ３）８０℃、１０分間の加熱処理により上記活性が失活
   する、 ４）トリプシンによる消化処理またはキモトリプシンに
   よる消化処理により上記活性が失活する、および ５）ヘパリンに対して強い親和性を有する
8. 【請求項８】 肝実質細胞増殖因子がヒト由来の肝実質
   細胞増殖因子である請求項６または７記載の精製方法。
9. 【請求項９】 肝実質細胞増殖因子がｃＤＮＡを用いた
   組換え肝実質細胞増殖因子である請求項６から８のいず
   れかに記載の精製方法。
10. 【請求項１０】 組換え肝実質細胞増殖因子が配列番号
    １に示されるアミノ酸配列で表される肝実質細胞増殖因
    子である請求項９記載の精製方法。
11. 【請求項１１】 組換え肝実質細胞増殖因子が配列番号
    １に示されるアミノ酸配列のうち３０番目のグルタミン
    酸から７２８番目のセリンまでの配列で表される肝実質
    細胞増殖因子である請求項９記載の精製方法。
12. 【請求項１２】 組換え肝実質細胞増殖因子が配列番号
    １に示されるアミノ酸配列のうち３２番目のグルタミン
    から７２８番目のセリンまでの配列で表される肝実質細
    胞増殖因子である請求項９記載の精製方法。
13. 【請求項１３】 蛋白質が酸性蛋白質であり、緩衝液が
    塩基性緩衝液であることを特徴とする請求項１記載の精
    製方法。
14. 【請求項１４】 塩基性緩衝液が、ホウ酸緩衝液、ホウ
    酸−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、
    炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸−
    水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム−水酸化
    ナトリウム緩衝液、リン酸水素二ナトリウム−水酸化ナ
    トリウム緩衝液または塩化カリウム−水酸化ナトリウム
    緩衝液から選ばれることを特徴とする請求項１３記載の
    精製方法。
15. 【請求項１５】 酸性蛋白質が、アルブミン、アンチト
    ロンビンIII 、キニノーゲン、血液凝固因子ＩＸ、α２
    ＨＳ−糖蛋白質、プロトロンビン、免疫グロブリンＧま
    たはレチノール結合蛋白質から選ばれることを特徴とす
    る請求項１３記載の精製方法。
16. 【請求項１６】 樹脂がイオン交換樹脂またはアフィニ
    ティー樹脂から選ばれる請求項１から１５のいずれかに
    記載の精製方法。
17. 【請求項１７】 アフィニティー樹脂が硫酸化セルロフ
    ァインまたはヘパリンセファロースであることを特徴と
    する請求項１６記載の精製方法。
18. 【請求項１８】 イオン交換樹脂がスルホプロキル基又
    はカルボキシメチル基を有するイオン交換樹脂であるこ
    とを特徴とする請求項１６記載の精製方法。
19. 【請求項１９】 緩衝液で処理した後にさらに界面活性
    剤を使用した洗浄操作を行ってから溶出操作を行うこと
    を特徴とする請求項１から１８のいずれかに記載の精製
    方法。