JPWO2013002330A1 - たん白質の精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)以下の工程(a)〜(d)を少なくとも1以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
(a)たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。
(2)混合モード担体がイオン交換基および疎水性相互作用基を含む、前記(1)に記載の精製方法。
(3)混合モード担体がCapto adhere、Capto MMC、HEA HyperCel、PPA HyperCel、MEP HyperCel、TOYOPEARL MX−Trp−650Mから選択される、前記(1)または(2)に記載の精製方法。
(4)以下の工程(a)〜(c)を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
(a)たん白質組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
(b)陰イオン交換クロマトグラフィー担体を、不純物と陰イオン交換クロマトグラフィー担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程。
(5)精製たん白質の回収率が50%以上である前記(1)〜(4)のいずれか1に記載の精製方法。
(6)たん白質が糖たん白質である、前記(1)〜(5)のいずれか1に記載の精製方法。
(7)糖たん白質が、シアル酸が結合した糖鎖を含む糖たん白質である、前記(6)に記載の精製方法。
(8)シアル酸が結合した糖鎖を含む糖たん白質がアンチトロンビン、プロテインS若しくはエリスロポエチンまたはその誘導体である、前記(7)に記載の精製方法。
(9)精製糖たん白質のシアル酸結合数が最大付加可能数の70%以上である、前記(7)または(8)に記載の精製方法。
(10)第一クロマトグラフィー工程の後に、更に1以上の追加のクロマトグラフィー工程を含む前記(1)〜(9)のいずれか1に記載の精製方法。
(11)追加のクロマトグラフィー工程が、混合モード担体、陰イオン交換担体、陰イオン交換膜、陽イオン交換担体、陽イオン交換膜、疎水性相互作用担体、サイズ排除担体、ゲルろ過担体、逆相担体、ヒドロキシアパタイト担体、フルオロアパタイト担体、硫酸化セルロース担体、または硫酸化アガロース担体のいずれか1つが使用されるクロマトグラフィーである前記(1)〜(10)のいずれか1に記載の精製方法。
(12)前記1〜11のいずれか1に記載の方法で精製されたたん白質を含有する組成物。
(13)以下の工程(a)〜(d)を少なくとも1以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、アンチトロンビンの精製方法。
(a)アンチトロンビン組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有するアンチトロンビンの画分のみを得る工程。
(14)精製アンチトロンビンの平均シアル酸結合数が最大付加可能数の70%以上である、前記13に記載の精製方法。
(15)以下の工程(a)〜(d)を少なくとも1以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、アンチトロンビンの精製方法。
(a)アンチトロンビン組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
(b)陰イオン交換担体を、不純物と陰イオン交換担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有するアンチトロンビンの画分のみを得る工程。
(16)精製アンチトロンビンの平均シアル酸結合数が最大付加可能数の70%以上である、(15)に記載の精製方法。
(17)以下の工程(a)〜(d)を少なくとも1以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、プロテインSの精製方法。
(a)プロテインS組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有するプロテインSの画分のみを得る工程。
(18)以下の工程(a)〜(d)を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
(a)たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。
(19)以下の工程(a)〜(d)を少なくとも1以上含む第一クロマトグラフィー工程で、目的の品質を有する精製たん白質を得ることを特徴とするクロマトグラフィー工程を含む、たん白質の精製方法。
(a)たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。
(20)以下の工程(a)〜(d)を少なくとも2以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
(a)たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。
(21)以下の工程(a)〜(d)を少なくとも3以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
(a)たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。
(22)少なくとも以下の工程(a)および(b)を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
(a)たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(23)少なくとも以下の工程(a)〜(c)を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
(a)たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(24)以下の工程(a)〜(d)を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
(a)たん白質組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
(b)陰イオン交換クロマトグラフィークロマトグラフィー担体を、不純物と陰イオン交換クロマトグラフィー担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。
(25)以下の工程(a)〜(c)を含む第一クロマトグラフィー工程で、目的の品質を有する精製たん白質を得ることを特徴とするクロマトグラフィー工程を含む、たん白質の精製方法。
(a)たん白質組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
(b)陰イオン交換クロマトグラフィークロマトグラフィー担体を、不純物とイオン交換クロマトグラフィー担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程。
(26)目的の品質が、以下の少なくとも1つである前記(19)または(25)に記載の精製方法。
(a)たん白質あたりのシアル酸結合数が最大付加可能数の70%以上
(b)重合体または切断体の含有量が10%以下
(27)少なくとも以下の工程(a)〜(d)を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、アンチトロンビンの精製方法。
(a)アンチトロンビン組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有するアンチトロンビンの画分のみを得る工程。
(28)少なくとも以下の工程(a)〜(d)を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、アンチトロンビンの精製方法。
(a)アンチトロンビン組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
(b)陰イオン交換担体を、不純物と陰イオン交換担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有するアンチトロンビンの画分のみを得る工程。
(29)少なくとも以下の工程(a)〜(d)を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、プロテインSの精製方法。
(a)プロテインS組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有するプロテインSの画分のみを得る工程。
(a)たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。
(a)たん白質組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
(b)陰イオン交換クロマトグラフィークロマトグラフィー担体を、不純物と陰イオン交換クロマトグラフィー担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程。
また、(a)〜(c)の工程に更に、(d)目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程、を加えてもよい。
[実施例1]アンチトロンビン培養上清から混合モード担体を用いてシアリダーゼを除去し目的物を回収する方法の例
アンチトロンビン約380mgを含むCHO細胞培養上清を、緩衝液AA(100mmol/L塩化ナトリウム、20mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0)で平衡化した混合モードカラム(GEヘルスケア社製、Capto adhere、カラム体積38mL)に直接通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。
アンチトロンビン約380mgを含むCHO細胞培養上清を、緩衝液AC(300mmol/Lグリシン、100mmol/L塩化ナトリウム、20mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0)で平衡化した混合モードカラム(GEヘルスケア社製、Capto adhere、カラム体積38mL)に直接通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。
比較例1の溶出工程で得られたアンチトロンビンを含む水溶液に、終濃度0〜500mmol/Lのアルギニン塩酸塩またはグリシンを添加した。各溶液のノイラミニダーゼ活性を、実施例1と同様の方法で測定した。その結果を図1に示す。
アンチトロンビン約1.43gを含むCHO細胞培養上清を、実施例2と同様の方法(但し、緩衝液ACの代わりにAD(450mmol/L塩化ナトリウム、20mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0)を用いた)で精製し、特定範囲を回収することで回収液236mLを得た。本工程で回収されたアンチトロンビンの回収率は80%と良好であった。
GEヘルスケア社製、Capto adhere、GEヘルスケア社製、Q Sepharose Fast Flow、メルクミリポア社製、Eshmuno Q、東ソー社製、Toyopearl Q−600C ARを、1mLずつチューブに分注した後、緩衝液AE(20mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0)で平衡化し50%スラリー(計2mL)とした。
(単位担体量(1L)あたりのアンチトロンビン吸着量)=[(培養上清中のアンチトロンビン量)−(担体処理液上清のアンチトロンビン量)]/(担体体積)
プロテインS20.0mgを含むCHO細胞培養上清(pHを5.0に調整し、遠心操作により沈殿物を除去したもの)を、緩衝液PA(20mmol/Lリン酸ナトリウム、10mmol/Lクエン酸ナトリウム緩衝液、pH5.0)で平衡化した混合モードカラム(GEヘルスケア社製、Capto MMC、カラム体積3.9mL)に直接通過させることにより、プロテインSを吸着させた。
プロテインS84.4mgを含むCHO細胞培養上清のpHを5.0に調整し、遠心操作により沈殿物を除去した。この溶液を緩衝液PJ(50mmol/L酢酸、pH5.3)で平衡化した混合モードカラム(GEヘルスケア社製、Capto MMC、カラム堆積3.9mL)に直接通過させることにより、プロテインSを吸着させた。
プロテインS9.9mgを含むCHO細胞培養上清のpHをリン酸で5.0に調整し、遠心操作により沈殿物を除去した。この溶液を緩衝液PM(20mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液、pH5.0)で平衡化した混合モードカラム(GEヘルスケア社製、Capto MMC、カラム体積0.98mL)に直接通過させることにより、プロテインSを吸着させた。
アンチトロンビン428mgを含むCHO細胞培養上清を、緩衝液AC(300mmol/Lグリシン、100mmol/L塩化ナトリウム、20mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0)で平衡化した混合モードカラム(GEヘルスケア社製、Capto adhere、カラム体積28.5mL)に直接通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。
プロテインS19.9mgを含むCHO細胞培養上清(pHを5.0に調整し、遠心操作により沈殿物を除去したもの)を、緩衝液PA(20mmol/Lリン酸ナトリウム、10mmol/Lクエン酸ナトリウム緩衝液、pH5.0)で平衡化した混合モードカラム(GEヘルスケア社製、Capto MMC、カラム体積3.9mL)に直接通過させることにより、プロテインSを吸着させた。
エリスロポエチン118mgを含むCHO細胞培養上清を、緩衝液EA(10mmol/Lトリス緩衝液、pH6.4)で平衡化した混合モードカラム(GEヘルスケア社製、Capto adhere、カラム体積5.9mL)に直接通過させることにより、エリスロポエチンを吸着させた。
299mgのプロテインSを含むCHO細胞培養上清(pHを5.0に調整し、遠心操作により沈殿物を除去したもの)を、緩衝液PQ(50mmol/L酢酸溶液、pH5.0)で平衡化した混合モード担体カラム(GEヘルスケア社製、Capto MMC、カラム体積32.8mL)に直接通過させることにより、プロテインSを吸着させた。
精製水、1mol/Lアラニン溶液、1mol/Lアルギニン溶液または1mol/Lグリシン溶液を、それぞれエリスロポエチンを含む培養液と等量混合し、25℃で7日間静置した。その後、抗エリスロポエチン抗体固定化アフィニティーカラムを用いてエリスロポエチンを精製した後、エリスロポエチンに結合しているシアル酸の数をキャピラリー電気泳動装置[Biol.Pharm.Bull.33(9)1596-1599(2010)]にて測定した。その結果を図10に示す。
アンチトロンビン5.79gを含むCHO細胞培養上清を精製水で数倍に希釈した後、緩衝液AR(300mmol/Lグリシン、20mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0)で平衡化したカラム(メルク社製、Eshmuno Q、カラム体積456mL)を通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。
アンチトロンビン3.14gを含むCHO細胞培養上清を、実施例2と同様の方法(但し、緩衝液ACの代わりにAD(450mmol/L塩化ナトリウム、20mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0)を用いた、カラム体積を114mLにした)で精製し、特定範囲を回収することで回収液706mLを得た。本工程で回収されたアンチトロンビンの回収率は89%と良好であった。
プロテインS102.1mgを含むCHO細胞培養上清(pH5.0に調整し、遠心操作により沈殿物を除去したもの)を、緩衝液PQ(50mmol/L酢酸溶液、pH5.0)で平衡化した混合モード担体カラム(GEヘルスケア社製、Capto MMC、カラム体積15.7mL)に直接通過させることにより、プロテインSを吸着させた。
アンチトロンビン約380mgを含むCHO細胞培養上清を、緩衝液AJ(100mmol/L塩化ナトリウム、20mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0)で平衡化した混合モードカラム(GEヘルスケア社製、Capto adhere、カラム体積38mL)を通過させることにより、アンチトロンビンを吸着させた。
アンチトロンビン約35.3gを含むCHO細胞培養上清を、限外ろ過膜(メルクミリポア社製、分画分子量30キロダルトン)にて約10倍濃縮した。上記工程で得た濃縮液にTritonX−100が1%、リン酸トリブチルが0.3%になるように混合した後、静かに攪拌した。
プロテインS16.1gを含むCHO細胞培養上清を、限外濾過膜(メルク社製、分画分子量10キロダルトン)を用いて濃縮後、緩衝液PX(20mmol/Lトリス緩衝液、120mmol/L NaCl、pH7.4)に緩衝液置換を行うとともに、濃縮液を約2倍希釈した。調製した溶液を緩衝液PY(20mmol/Lトリス緩衝液、150mmol/L NaCl、pH7.4)で平衡化した陰イオン交換カラム(GEヘルスケア社製、Q Sepharose Fast Flow、カラム体積589mL)に直接通過させることにより、プロテインSを吸着させた。
Claims (17)
- 以下の工程(a)〜(d)を少なくとも1以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
(a)たん白質組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有する精製たん白質の画分のみを得る工程。 - 混合モード担体がイオン交換基および疎水性相互作用基を含む、請求項1に記載の精製方法。
- 混合モード担体がCapto adhere、Capto MMC、HEA HyperCel、PPA HyperCel、MEP HyperCelおよびTOYOPEARL MX−Trp−650Mから選択される、請求項1または請求項2に記載の精製方法。
- 少なくとも以下の工程(a)〜(c)を含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、たん白質の精製方法。
(a)たん白質組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
(b)陰イオン交換クロマトグラフィー担体を、不純物と陰イオン交換クロマトグラフィー担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程。 - 精製たん白質の回収率が50%以上である請求項1〜4のいずれか一項に記載の精製方法。
- たん白質が糖たん白質である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の精製方法。
- 糖たん白質が、シアル酸が結合した糖鎖を含む糖たん白質である、請求項6に記載の精製方法。
- シアル酸が結合した糖鎖を含む糖たん白質がアンチトロンビン、プロテインS若しくはエリスロポエチンまたはその誘導体である、請求項7に記載の精製方法。
- 精製糖たん白質のシアル酸結合数が最大付加可能数の70%以上である、請求項7または8に記載の精製方法。
- 第一クロマトグラフィー工程の後に、更に1以上の追加のクロマトグラフィー工程を含む請求項1〜9のいずれか一項に記載の精製方法。
- 追加のクロマトグラフィー工程が、混合モード担体、陰イオン交換担体、陰イオン交換膜、陽イオン交換担体、陽イオン交換膜、疎水性相互作用担体、サイズ排除担体、ゲルろ過担体、逆相担体、ヒドロキシアパタイト担体、フルオロアパタイト担体、硫酸化セルロース担体、または硫酸化アガロース担体のいずれか1つが使用されるクロマトグラフィーである請求項1〜10のいずれか一項に記載の精製方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法で精製されたたん白質を含有する組成物。
- 以下の工程(a)〜(d)を少なくとも1以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、アンチトロンビンの精製方法。
(a)アンチトロンビン組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有するアンチトロンビンの画分のみを得る工程。 - 精製アンチトロンビンの平均シアル酸結合数が最大付加可能数の70%以上である、請求項13に記載の精製方法。
- 以下の工程(a)〜(d)を少なくとも1以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、アンチトロンビンの精製方法。
(a)アンチトロンビン組成物を陰イオン交換担体に接触させる工程、
(b)陰イオン交換担体を、不純物と陰イオン交換担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄、および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有するアンチトロンビンの画分のみを得る工程。 - 精製アンチトロンビンの平均シアル酸結合数が最大付加可能数の70%以上である、請求項15に記載の精製方法。
- 以下の工程(a)〜(d)を少なくとも1以上含む第一クロマトグラフィー工程が含まれる、プロテインSの精製方法。
(a)プロテインS組成物を直接混合モード担体に接触させる工程、
(b)混合モード担体を、不純物と混合モード担体の親和性を弱める緩衝液で洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(c)アミノ酸を含有する緩衝液で、洗浄および/または溶出することで不純物を除去する工程、
(d)目的とする品質を有するプロテインSの画分のみを得る工程。
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