JPH08333387A - タンパク質分離精製方法 - Google Patents
タンパク質分離精製方法Info
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- JPH08333387A JPH08333387A JP14440695A JP14440695A JPH08333387A JP H08333387 A JPH08333387 A JP H08333387A JP 14440695 A JP14440695 A JP 14440695A JP 14440695 A JP14440695 A JP 14440695A JP H08333387 A JPH08333387 A JP H08333387A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】タンパク質をイオン交換的に吸着・分離させる
方法において、吸着剤としてのヒドロキシアパタイト、
特に１０００℃以下で焼成されたヒドロキシアパタイト
焼成物に金属塩溶液又はリン酸塩溶液を接触させた後、
タンパク質含有溶液を接触させ、酸性タンパク質又は塩
基性タンパク質を選択的に吸着・分離させることを特徴
とするタンパク質分離精製方法。 【効果】前記タンパク質分離精製方法では、簡易な方法
で、イオン交換的に酸性タンパク質または塩基性タンパ
ク質を選択的に吸着・分離することができる。
方法において、吸着剤としてのヒドロキシアパタイト、
特に１０００℃以下で焼成されたヒドロキシアパタイト
焼成物に金属塩溶液又はリン酸塩溶液を接触させた後、
タンパク質含有溶液を接触させ、酸性タンパク質又は塩
基性タンパク質を選択的に吸着・分離させることを特徴
とするタンパク質分離精製方法。 【効果】前記タンパク質分離精製方法では、簡易な方法
で、イオン交換的に酸性タンパク質または塩基性タンパ
ク質を選択的に吸着・分離することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生化学あるいは医療分
野において、タンパク質の分離精製や分離除去を行う
際、タンパク質の酸性または塩基性の相違に応じて選択
的に、しかも該選択率の低下を極力防止して分離精製す
ることが可能なタンパク質分離精製方法に関する。
野において、タンパク質の分離精製や分離除去を行う
際、タンパク質の酸性または塩基性の相違に応じて選択
的に、しかも該選択率の低下を極力防止して分離精製す
ることが可能なタンパク質分離精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】タンパク質を分離精製する方法として、
従来から液体クロマトグラフィーが用いられている。こ
の液体クロマトグラフィーでは、カラムに吸着剤を充填
し、そこへタンパク質含有溶液を流して吸着剤に吸着さ
せた後、特定の溶媒を流すことにより吸着したタンパク
質を溶出させることで分離精製することができる。この
ような液体クロマトグラフィーの中で、タンパク質の酸
性、塩基性を利用してタンパク質を分離精製する方法と
しては、イオン交換クロマトグラフィーが知られてい
る。このイオン交換クロマトグラフィーは、吸着剤とし
て陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂等のイオン交換
樹脂を使用しており、その際使用されるイオン交換樹脂
により、それぞれ酸性タンパク質または塩基性タンパク
質を特異的に吸着させることができる。
従来から液体クロマトグラフィーが用いられている。こ
の液体クロマトグラフィーでは、カラムに吸着剤を充填
し、そこへタンパク質含有溶液を流して吸着剤に吸着さ
せた後、特定の溶媒を流すことにより吸着したタンパク
質を溶出させることで分離精製することができる。この
ような液体クロマトグラフィーの中で、タンパク質の酸
性、塩基性を利用してタンパク質を分離精製する方法と
しては、イオン交換クロマトグラフィーが知られてい
る。このイオン交換クロマトグラフィーは、吸着剤とし
て陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂等のイオン交換
樹脂を使用しており、その際使用されるイオン交換樹脂
により、それぞれ酸性タンパク質または塩基性タンパク
質を特異的に吸着させることができる。
【０００３】またヒドロキシアパタイトを吸着剤として
用い、この吸着剤が充填されたカラムにタンパク質含有
溶液を流し込むことによって、酸性及び塩基性の両タン
パク質を吸着させた後、特定の溶媒を流し込んで、酸性
タンパク質と塩基性タンパク質とを溶媒の種類に応じて
選択的に分離精製する方法も提案されている。
用い、この吸着剤が充填されたカラムにタンパク質含有
溶液を流し込むことによって、酸性及び塩基性の両タン
パク質を吸着させた後、特定の溶媒を流し込んで、酸性
タンパク質と塩基性タンパク質とを溶媒の種類に応じて
選択的に分離精製する方法も提案されている。
【０００４】しかしながら、ヒドロキシアパタイトを吸
着剤とした方法では、酸性及び塩基性のタンパク質が一
度に吸着されるために、最終的に分離精製される酸性及
び塩基性のタンパク質の選択分離性が低下する恐れがあ
る。
着剤とした方法では、酸性及び塩基性のタンパク質が一
度に吸着されるために、最終的に分離精製される酸性及
び塩基性のタンパク質の選択分離性が低下する恐れがあ
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、吸着
剤としてヒドロキシアパタイトを使用して酸性及び塩基
性のタンパク質を選択的に分離精製する際に、その選択
率が低下するのを防止することができるタンパク質分離
精製方法を提供することにある。
剤としてヒドロキシアパタイトを使用して酸性及び塩基
性のタンパク質を選択的に分離精製する際に、その選択
率が低下するのを防止することができるタンパク質分離
精製方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、タンパ
ク質をイオン交換的に吸着・分離させる方法において、
吸着剤としてのヒドロキシアパタイトに金属塩溶液又は
リン酸塩溶液を接触させた後、タンパク質含有溶液を接
触させ、酸性タンパク質又は塩基性タンパク質を選択的
に吸着・分離させることを特徴とするタンパク質分離精
製方法が提供される。
ク質をイオン交換的に吸着・分離させる方法において、
吸着剤としてのヒドロキシアパタイトに金属塩溶液又は
リン酸塩溶液を接触させた後、タンパク質含有溶液を接
触させ、酸性タンパク質又は塩基性タンパク質を選択的
に吸着・分離させることを特徴とするタンパク質分離精
製方法が提供される。
【０００７】以下本発明を更に詳細に説明する。本発明
のタンパク質分離精製方法では、吸着剤としてヒドロキ
シアパタイトを使用し、イオン交換的に吸着・分離させ
る。ヒドロキシアパタイトの分子表面上には、タンパク
質の吸着サイトとして、マイナスに苛電した酸性タンパ
ク質がプラスの電位を持つカルシウムに吸着するＣａサ
イトと、プラスに苛電した塩基性タンパク質がマイナス
の電位を持つリン酸に吸着するＰサイトとが存在する。
従って通常ヒドロキシアパタイトにタンパク質含有溶液
を接触させると、酸性及び塩基性の両タンパク質が吸着
される。本発明では、このような酸性及び塩基性の両タ
ンパク質のヒドロキシアパタイトへの吸着に際して、イ
オン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーと同様に、吸
着の段階で酸性又は塩基性の違いによりタンパク質を特
異的に吸着させ、選択的に分離させる。
のタンパク質分離精製方法では、吸着剤としてヒドロキ
シアパタイトを使用し、イオン交換的に吸着・分離させ
る。ヒドロキシアパタイトの分子表面上には、タンパク
質の吸着サイトとして、マイナスに苛電した酸性タンパ
ク質がプラスの電位を持つカルシウムに吸着するＣａサ
イトと、プラスに苛電した塩基性タンパク質がマイナス
の電位を持つリン酸に吸着するＰサイトとが存在する。
従って通常ヒドロキシアパタイトにタンパク質含有溶液
を接触させると、酸性及び塩基性の両タンパク質が吸着
される。本発明では、このような酸性及び塩基性の両タ
ンパク質のヒドロキシアパタイトへの吸着に際して、イ
オン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーと同様に、吸
着の段階で酸性又は塩基性の違いによりタンパク質を特
異的に吸着させ、選択的に分離させる。
【０００８】本発明のタンパク質分離精製方法では、ま
ず吸着剤としてのヒドロキシアパタイトに金属塩溶液又
はリン酸塩溶液を接触させて、ヒドロキシアパタイトの
分子表面上に存在する前記Ｃａサイト又はＰサイトのい
ずれか一方のタンパク質吸着能を低下若しくはなくし、
酸性又は塩基性タンパク質のどちらか一方のみが選択的
に吸着するように処理する。
ず吸着剤としてのヒドロキシアパタイトに金属塩溶液又
はリン酸塩溶液を接触させて、ヒドロキシアパタイトの
分子表面上に存在する前記Ｃａサイト又はＰサイトのい
ずれか一方のタンパク質吸着能を低下若しくはなくし、
酸性又は塩基性タンパク質のどちらか一方のみが選択的
に吸着するように処理する。
【０００９】前記吸着剤として用いるヒドロキシアパタ
イトは、公知の方法により合成されたもの等を用いるこ
とができる。合成法としては、例えば水酸化カルシウム
５モルを水に懸濁させ、リン酸３モルを徐々に滴下して
反応させ、養生後乾燥させる湿式法や、ピロリン酸カル
シウム３モルと炭酸カルシウム４モルとを配合する乾式
法等の公知の方法により合成することができ、その後焼
成して粉砕するか、または粉砕して焼成し、５〜５００
μｍに分級する方法等により吸着剤とすることができ
る。前記ヒドロキシアパタイトの焼成温度は、酸性及び
塩基性の両方のタンパク質が吸着する前記Ｃａサイトと
Ｐサイトとが分子表面上に存在する焼成温度であれば良
く、好ましくは１０００℃以下、特に好ましくは８００
〜１０００℃が望ましい。
イトは、公知の方法により合成されたもの等を用いるこ
とができる。合成法としては、例えば水酸化カルシウム
５モルを水に懸濁させ、リン酸３モルを徐々に滴下して
反応させ、養生後乾燥させる湿式法や、ピロリン酸カル
シウム３モルと炭酸カルシウム４モルとを配合する乾式
法等の公知の方法により合成することができ、その後焼
成して粉砕するか、または粉砕して焼成し、５〜５００
μｍに分級する方法等により吸着剤とすることができ
る。前記ヒドロキシアパタイトの焼成温度は、酸性及び
塩基性の両方のタンパク質が吸着する前記Ｃａサイトと
Ｐサイトとが分子表面上に存在する焼成温度であれば良
く、好ましくは１０００℃以下、特に好ましくは８００
〜１０００℃が望ましい。
【００１０】前記ヒドロキシアパタイトに接触させるリ
ン酸塩溶液は、酸性タンパク質が吸着する前記Ｃａサイ
トに作用して、酸性タンパク質の吸着能を低下若しくは
なくすことができる。リン酸塩溶液としては、カリウム
系かナトリウム系のものを好ましく挙げることができ
る。リン酸塩溶液の濃度は、陽イオンが塩基性タンパク
質の吸着を妨げないようにするため、５０ｍＭ以下、特
に３０〜５０ｍＭが好ましい。
ン酸塩溶液は、酸性タンパク質が吸着する前記Ｃａサイ
トに作用して、酸性タンパク質の吸着能を低下若しくは
なくすことができる。リン酸塩溶液としては、カリウム
系かナトリウム系のものを好ましく挙げることができ
る。リン酸塩溶液の濃度は、陽イオンが塩基性タンパク
質の吸着を妨げないようにするため、５０ｍＭ以下、特
に３０〜５０ｍＭが好ましい。
【００１１】前記ヒドロキシアパタイトに接触させる金
属塩溶液は、塩基性タンパク質が吸着する前記Ｐサイト
に作用して、塩基性タンパク質の吸着能を低下若しくは
なくすことができる。金属塩溶液の金属イオンとして
は、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ナトリウ
ムイオン、カリウムイオン、マンガンイオン、リチウム
イオン、ニッケルイオン、銅イオン、亜鉛イオン、鉄イ
オン、銀イオン等が挙げられ、特にカルシウムイオン、
マグネシウムイオンが好ましい。金属塩溶液中の金属イ
オン濃度は、陰イオンが酸性タンパク質の吸着を妨げな
いようにするために、２ｍＭ以下、特に１〜２ｍＭが好
ましい。
属塩溶液は、塩基性タンパク質が吸着する前記Ｐサイト
に作用して、塩基性タンパク質の吸着能を低下若しくは
なくすことができる。金属塩溶液の金属イオンとして
は、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ナトリウ
ムイオン、カリウムイオン、マンガンイオン、リチウム
イオン、ニッケルイオン、銅イオン、亜鉛イオン、鉄イ
オン、銀イオン等が挙げられ、特にカルシウムイオン、
マグネシウムイオンが好ましい。金属塩溶液中の金属イ
オン濃度は、陰イオンが酸性タンパク質の吸着を妨げな
いようにするために、２ｍＭ以下、特に１〜２ｍＭが好
ましい。
【００１２】前記ヒドロキシアパタイトへのリン酸塩溶
液又は金属塩溶液の接触は、ヒドロキシアパタイトをい
ずれかの溶液で平衡化させることができる方法であれば
良く、例えば浸漬させる方法、ヒドロキシアパタイトを
カラム等に充填し、該カラムに前記いずれかの溶液を流
通させる方法等により行うことができる。接触時期は、
分離精製すべきタンパク質含有溶液を接触させる前であ
れば、吸着剤としてのヒドロキシアパタイトをカラム等
へ充填する前後いずれであっても良い。
液又は金属塩溶液の接触は、ヒドロキシアパタイトをい
ずれかの溶液で平衡化させることができる方法であれば
良く、例えば浸漬させる方法、ヒドロキシアパタイトを
カラム等に充填し、該カラムに前記いずれかの溶液を流
通させる方法等により行うことができる。接触時期は、
分離精製すべきタンパク質含有溶液を接触させる前であ
れば、吸着剤としてのヒドロキシアパタイトをカラム等
へ充填する前後いずれであっても良い。
【００１３】本発明のタンパク質分離精製方法では、次
いで前記リン酸塩溶液又は金属塩溶液で処理されたヒド
ロキシアパタイトに、タンパク質含有溶液を接触させ
て、所望の酸性又は塩基性のタンパク質を選択的に吸着
させる。この際の接触は、ヒドロキシアパタイトを液体
クロマトグラフィー用カラム等に充填し、該カラムにタ
ンパク質含有溶液を常法により通過させる方法等により
行うことができる。またタンパク質含有溶液としては、
生化学分野あるいは医療分野等においてタンパク質分離
精製の対象とされるものであれば良い。
いで前記リン酸塩溶液又は金属塩溶液で処理されたヒド
ロキシアパタイトに、タンパク質含有溶液を接触させ
て、所望の酸性又は塩基性のタンパク質を選択的に吸着
させる。この際の接触は、ヒドロキシアパタイトを液体
クロマトグラフィー用カラム等に充填し、該カラムにタ
ンパク質含有溶液を常法により通過させる方法等により
行うことができる。またタンパク質含有溶液としては、
生化学分野あるいは医療分野等においてタンパク質分離
精製の対象とされるものであれば良い。
【００１４】本発明のタンパク質分離精製方法では、ヒ
ドロキシアパタイトに前記リン酸塩溶液を接触させた場
合には、次のタンパク質含有溶液を接触させることによ
り、塩基性のタンパク質が吸着剤に選択的に吸着され
る。従って吸着された塩基性のタンパク質を分離精製す
るには、金属イオン濃度の高い金属塩溶液をカラムに流
し込む常法の展開溶出によって行うことができる。一方
ヒドロキシアパタイトに前記金属塩溶液を接触させた場
合には、次のタンパク質含有溶液を接触させることによ
り、酸性のタンパク質が吸着剤に選択的に吸着される。
従って吸着された酸性のタンパク質を分離精製するに
は、リン酸イオン濃度の高いリン酸塩溶液をカラムに流
し込む常法の展開溶出によって行うことができる。
ドロキシアパタイトに前記リン酸塩溶液を接触させた場
合には、次のタンパク質含有溶液を接触させることによ
り、塩基性のタンパク質が吸着剤に選択的に吸着され
る。従って吸着された塩基性のタンパク質を分離精製す
るには、金属イオン濃度の高い金属塩溶液をカラムに流
し込む常法の展開溶出によって行うことができる。一方
ヒドロキシアパタイトに前記金属塩溶液を接触させた場
合には、次のタンパク質含有溶液を接触させることによ
り、酸性のタンパク質が吸着剤に選択的に吸着される。
従って吸着された酸性のタンパク質を分離精製するに
は、リン酸イオン濃度の高いリン酸塩溶液をカラムに流
し込む常法の展開溶出によって行うことができる。
【００１５】
【発明の効果】本発明のタンパク質分離精製方法では、
簡易な方法で、イオン交換的に酸性タンパク質または塩
基性タンパク質を選択的に吸着・分離することができ
る。
簡易な方法で、イオン交換的に酸性タンパク質または塩
基性タンパク質を選択的に吸着・分離することができ
る。
【００１６】
【実施例】以下、実施例により更に詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１７】
【実施例１】焼成温度９００℃のヒドロキシアパタイト
（粒径５０〜１５０μｍ）を、０．９ｃｍφ×１５ｃｍ
Ｌのカラムに充填し、３０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液
で平衡化した後、液体クロマトグラフ装置に取り付け
た。次いで、アルブミン(ＢＳＡ)（ｐＩ（等電点）：
４．７）、フィブリノゲン（ｐＩ：５．６）、リゾチー
ム（ｐＩ：１０．８）、チトクロームＣ（ｐＩ：１０．
６）のタンパク質混合溶液をカラム内に注入し、吸着さ
せた後、０．０３〜０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．４）のリニアグラジエントにより展開溶出試
験（流速：０．３ｍｌ／分、検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
を行った。結果を図１に示す。尚、図１より酸性タンパ
ク質であるアルブミンおよびフィブリノゲンの吸着分離
は認められず、塩基性タンパク質のみ良好に吸着分離さ
れることが判った。
（粒径５０〜１５０μｍ）を、０．９ｃｍφ×１５ｃｍ
Ｌのカラムに充填し、３０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液
で平衡化した後、液体クロマトグラフ装置に取り付け
た。次いで、アルブミン(ＢＳＡ)（ｐＩ（等電点）：
４．７）、フィブリノゲン（ｐＩ：５．６）、リゾチー
ム（ｐＩ：１０．８）、チトクロームＣ（ｐＩ：１０．
６）のタンパク質混合溶液をカラム内に注入し、吸着さ
せた後、０．０３〜０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．４）のリニアグラジエントにより展開溶出試
験（流速：０．３ｍｌ／分、検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）
を行った。結果を図１に示す。尚、図１より酸性タンパ
ク質であるアルブミンおよびフィブリノゲンの吸着分離
は認められず、塩基性タンパク質のみ良好に吸着分離さ
れることが判った。
【００１８】
【実施例２】３０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液の代わり
に、１ｍＭの塩化カルシウム溶液で平衡化した以外は、
実施例１と同様にタンパク質混合溶液を注入し、０〜
０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）のリ
ニアグラジエントにより展開溶出試験を行った。結果を
図２に示す。尚、図２より塩基性タンパク質であるリゾ
チウムおよびチトクロームＣの吸着分離は認められず、
酸性タンパク質のみ良好に吸着分離されることが判っ
た。
に、１ｍＭの塩化カルシウム溶液で平衡化した以外は、
実施例１と同様にタンパク質混合溶液を注入し、０〜
０．３５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）のリ
ニアグラジエントにより展開溶出試験を行った。結果を
図２に示す。尚、図２より塩基性タンパク質であるリゾ
チウムおよびチトクロームＣの吸着分離は認められず、
酸性タンパク質のみ良好に吸着分離されることが判っ
た。
【図１】実施例１で行った展開溶出試験の結果を示すク
ロマトグラムである。
ロマトグラムである。
【図２】実施例２で行った展開溶出試験の結果を示すク
ロマトグラムである。
ロマトグラムである。
Claims (2)
- 【請求項１】 タンパク質をイオン交換的に吸着・分離
させる方法において、吸着剤としてのヒドロキシアパタ
イトに金属塩溶液又はリン酸塩溶液を接触させた後、タ
ンパク質含有溶液を接触させ、酸性タンパク質又は塩基
性タンパク質を選択的に吸着・分離させることを特徴と
するタンパク質分離精製方法。 - 【請求項２】 前記ヒドロキシアパタイトが、１０００
℃以下で焼成された焼成物であることを特徴とする請求
項１記載のタンパク質分離精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14440695A JPH08333387A (ja) | 1995-06-12 | 1995-06-12 | タンパク質分離精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14440695A JPH08333387A (ja) | 1995-06-12 | 1995-06-12 | タンパク質分離精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08333387A true JPH08333387A (ja) | 1996-12-17 |
Family
ID=15361438
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14440695A Pending JPH08333387A (ja) | 1995-06-12 | 1995-06-12 | タンパク質分離精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08333387A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004007533A1 (en) * | 2002-07-10 | 2004-01-22 | National Blood Authority | Processes for the preparation of fibrinogen |
| JP2010154777A (ja) * | 2008-12-26 | 2010-07-15 | Aichi Prefecture | 醸造酒用タンパク質除去剤 |
| JP2012507550A (ja) * | 2008-10-31 | 2012-03-29 | ワイス・エルエルシー | セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用する酸性タンパク質の精製 |
-
1995
- 1995-06-12 JP JP14440695A patent/JPH08333387A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004007533A1 (en) * | 2002-07-10 | 2004-01-22 | National Blood Authority | Processes for the preparation of fibrinogen |
| US7816495B2 (en) | 2002-07-10 | 2010-10-19 | Nhs Blood And Transplant | Processes for the preparation of fibrinogen |
| JP2012507550A (ja) * | 2008-10-31 | 2012-03-29 | ワイス・エルエルシー | セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用する酸性タンパク質の精製 |
| JP2010154777A (ja) * | 2008-12-26 | 2010-07-15 | Aichi Prefecture | 醸造酒用タンパク質除去剤 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20030401 |