JP2010154777A - 醸造酒用タンパク質除去剤 - Google Patents

Abstract

【課題】品質を劣化させることなく醸造酒（清酒原酒等）の中のタンパク質を迅速に吸着除去できる醸造酒用タンパク質除去剤を提供する。
【解決手段】ヒドロキシアパタイト類を原料とする醸造酒用タンパク質除去剤。該ヒドロキシアパタイト類はＣａ源とリン酸源とを反応させて調製するに際して、アルカリの代わりに炭酸アルカリ塩を加えることにより製造する。品質を劣化させることなく、清酒中のタンパク質を迅速に吸着除去させることができ、使用済みのタンパク質除去剤は、穏和な条件で吸着タンパク質を脱離させることができるので、除去剤を低コストに再生できるとともに、吸着したタンパク質を回収して有効利用を図ることができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、醸造酒中のタンパク質の吸着除去処理に使用される新規なタンパク質除去剤及びそれを簡易に製造できるタンパク質除去剤の製造方法に関する。さらに詳しくは、品質を劣化させずに清酒等の醸造酒のオリ（澱・滓）形成タンパク質や品質劣化に関与する酵素タンパク質を除去することを目的とした、タンパク質吸着能に特に優れたタンパク質除去剤の新規な製造方法及び新規なタンパク質除去剤に係るものである。

ここでは、醸造酒として清酒を例に採り説明する。本発明のタンパク質除去剤は、他の醸造酒、例えば、ぶどう酒、ビール、紹興酒等にも適用できる。

なお、特許請求の範囲等における数値限定の各数値は、「約」を付していないが、本発明における効果をより確実に奏する範囲を規定するもので、臨界的ではなく概数である。

清酒では、その保存中にオリやオリに起因する白濁が発生して製品の評価を下げることがある。

原因として、タンパク質の凝集によるもの(白ぼけ：白濁)と、火落菌の生育によるもの(火落ち)がある。保存中のオリや白濁の発生を防ぐため、清酒等の醸造酒においては、「オリ下げ（オリ引き）」、「濾過助剤の添加による濾過」及び「火入れ(酵素失活や加熱殺菌)」の各工程を含んで、オリ（主成分はタンパク質）を除去することが行われてきた。

しかし、使用後の濾過助剤は産業廃棄物となり、また、火入れ工程は熱エネルギーを多大に消費する。このため、製造コストの増大につながるとともに、環境への負荷も少なくない。また、複数回の火入れや過度な火入れは、製品の品質劣化をもたらす。

また、非加熱タイプの生酒では、時間の経過とともに「甘ダレ」、「老香」を引き起こすことがある。酵素（タンパク質）の活性が残存しているためである。

このように、清酒中に存在するタンパク質は清酒の潜在的な品質劣化要因となる。このため、品質を劣化させずにタンパク質を除去できることが望ましい。

従来、非加熱でオリ（澱）形成タンパク質を除去する方法として、(1)プロテアーゼ、(2)限外ろ過膜、又は(3)タンパク質吸着剤(タンパク質除去剤)を用いる方法等が提案されている。しかし、それらの方法は、下記のような問題点がある。

（1)プロテアーゼを用いる方法では、処理に時間がかかる上に、タンパク質であるプロテアーゼを除去する工程が別途必要となる。

（2)限外ろ過膜を用いる方法は、分子の大きさにより分離するものである。

この方法では、a）時間経過とともに、ろ過膜が目詰まりしてろ過速度が低下する、b)タンパク質以外の低分子成分まで除去することがあって、清酒の品質を変化させてしまう。さらに、ろ過膜の設定排除分子量以上のタンパク質であっても、タンパク質の形状によってはろ過膜を素通りしてしまい、十分なタンパク質除去ができない。

(3)タンパク質吸着剤としては、シリカ、活性炭、粘土系セラミックスなどの無機多孔体がよく用いられている（特許文献１〜３）。

これらの無機多孔体の場合、その細孔内に入るサイズのタンパク質類は吸着されるが、それより大きいタンパク質類は吸着除去できず、残存する。また分子間力に基づいた吸着原理（分子間力による物理的吸着）のため、タンパク質のような巨大分子の場合、吸着力が弱い。

このため、静電気による強い吸着力が期待できるヒドロキシアパタイト（ＨＡ：水酸化リン酸カルシウム）類をタンパク質除去剤の原料として使用することが考えられる。

しかし、ＨＡ類を、清酒等の醸造酒中のタンパク質除去に積極的に用いた例は寡聞にして知らない。

ＨＡ類は、中性付近のリン酸緩衝液中における特異的なタンパク質吸着特性が特徴であり、溶液pHが中性からはずれており且つ広範な分子量に亘る各種タンパク質を含む清酒のタンパク質除去には不適であるというのが、当業者常識であったためと推定される。

即ち、ＨＡ類は、主として、液体クロマトグラフィーの固定相として用いる等して、タンパク質の分離精製の分野で主として用いられてきたものである(特許文献４〜７)。

なお、特許文献４の段落０００８には、下記の如く記載されている。

「ハイドロアパタイトによる蛋白質類の分離機構は、・・・、イオンの電荷による吸着であるため、特定の蛋白質類に対し強度の吸着分離特性を有する。また、表面の吸着サイトの立体構造による選択性があるため、蛋白質類の表面の官能基の差異に対し敏感であり、蛋白質類の種類による吸着分離特性が良好となるなどの特性が期待される。」

また、特許文献５〜７に記載されたＨＡ類は、焼結体として使用することを予定している。焼結体として、強度が増大するとともに、特定の結晶粒が生長して特定タンパク質除去能が増大することが期待できるためである。
特開２０００−１０６８６３号公報（「オリ下げ方法」；特許請求の範囲等） 特開平９−２５１１４号公報（「濾過剤用シリカゲル」：特許請求の範囲等） 特開平５−９７４２１号公報(「ビール安定化処理用シリカゲルの製造法」；特許請求の範囲等) 特開平９−１６９７９４号公報（「蛋白質類の分離方法」；特許請求の範囲等） 特開平８−３３３３８７号公報（「タンパク質分離精製法」；特許請求の範囲等） 特開２００３−１２６２４８号公報（「血液浄化用吸着剤及びその製造法」；特許請求の範囲等） 特開２００５−３１３１５０公報(「リン酸カルシウム系吸着剤及びその製造法」；特許請求の範囲等)

本発明は、清酒等の醸造酒のオリや白濁の原因となるタンパク質や品質劣化に関与する酵素タンパク質を迅速、高効率に吸着除去することができる新規な醸造酒用タンパク質除去剤の製造方法及び醸造酒用タンパク質除去剤を提供し、さらに、当該タンパク質除去剤を用いて、火入れを含む従来法で処理されたものと同等以上の品質の醸造酒（清酒等）を製造することを目的（課題）とする。

上記課題を解決するため、要求されるべきタンパク質除去剤の特徴として、吸着剤が人に対して安全であること、安価であること、さらには、醸造酒の品質を劣化させない等があげられる。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意開発に努力をする過程で、Ｃａ源とリン酸源（以下「Ｐ源」という。）とを反応させて得られるヒドロキシアパタイト（ＨＡ）類からなる又は該ＨＡ類を含むものに、清酒等の醸造酒に対して、火入れ不要となる乃至火入れ回数を低減できるレベルのタンパク質除去能を示す特異性（特性）を有するものがあることを知見して、本発明の醸造酒用タンパク質除去剤に想到した。

上記火入れ不要となるレベルの優れたタンパク質除去能とは、例えば、原酒（例えば清酒）に5質量％添加して12h×室温×攪拌接触させた後の醸造酒中の相対タンパク質除去率（原酒比：Bradford法によるタンパク質定量に基づく）において、70％以上（望ましくは75％以上）の特性を示すもののことである。

タンパク質除去能に優れる理由は、ＸＲＤによるピーク性状がブロード、すなわち結晶化度が低いため、特定のタンパク質ばかりでなく分子量の異なる多様なタンパク質が吸着されるためと推定される。

上記特性は、ＨＡ類が、カルシウム欠損ヒドロキシアパタイト（ＣＤＨＡ：calcium-deficient hydroxyapatite）Ｃａ_10-x(ＨＰＯ₄)_x(ＰＯ₄)_6-x(ＯＨ)_2-x(Ｈ₂Ｏ)（但し、ｘ＞０）を含有するものの中に多く見られる。

さらに、上記特性に加えて、酸度低下が小さい、即ち、原酒に5質量％添加して12h×室温×攪拌接触させた後の酸度低下量が0.5％未満を示す特性を有するものもあることも知見した。

そして、上記各特性乃至ＨＡ類組成の全てを有するタンパク質除去剤の場合は、例えば、Ｃａ源と、炭酸アルカリ塩（以下「Ｃ源」という。）を添加したＰ源とからなる反応原料を、25〜60℃（望ましくは30〜50℃）の範囲の設定温度で熟成させることにより、ＨＡ類の調製を行なうことができる。

上記ＨＡ類の調製に際して、前記Ｃａ源に対するリン酸源の添加、及び、前記炭酸アルカリ塩の添加をそれぞれ、一回的又は間欠的に行なうことが好ましい。

上記ＨＡ類の調製に際して、Ｃａ源／Ｐ源（mol比）＝10／2.5〜10／12（さらには10／5〜10／8）としたときにおいて、Ｃａ源／Ｃ源（mol比）＝10／0.5〜10／9（さらには10／1.5〜10／6）とすることが好ましい。タンパク質除去能がさらに向上する。

上記ＨＡ類の調製に際して、前記Ｃａ源をＣａＣｌ_２、前記Ｐ源をＮａ_２ＨＰＯ_４、前記Ｃ源をＮａＨＣＯ_３とすることが好ましい。

また、酸度低下量が小さい特性を要求されないタンパク質除去剤の場合は、ＨＡ類の調製を、例えば、Ｃａ源と、適宜Ｃ源を添加したＰ源とからなる反応原料を、熟成後ｐＨ10以上となるような量のアルカリ源を使用して、25〜65℃（望ましくは30〜50℃）の設定温度でアルカリ熟成させることにより、ＨＡ類の調製を行なうことができる。

さらに、酸度変化量が小さい特性が要求されず、且つ、ＨＡ類がＣＤＨＡを含有しない組成（ＨＡのみの組成）の場合は、例えば、Ｃａ源とＰ源とからなる反応原料を、熟成後ｐＨ10以上となるような量のアルカリ源を使用して、35〜70℃（望ましくは40〜60℃）の温度条件でアルカリ熟成させることにより、行なえばよい。

また、本発明の醸造酒用タンパク質除去剤の製造は、通常、反応終了後の反応液の固液分離により得られた固形物を、約80〜300℃の温度で乾燥させて調製する。乾燥温度が高すぎると、結晶粒生長や多形転移に起因して、本発明の作用「分子量の異なる各種タンパク質の除去」を安定して得難くなるおそれがある。

そして、本発明の各醸造酒用タンパク質除去剤は、原酒に接触させて、原酒中のタンパク質の吸着除去処理を行うタンパク質除去操作を経て、品質を劣化させることなくタンパク質が除去された火入れが不要な醸造酒（清酒）を製造できる。

ＨＡ類は、骨や歯の構成成分であり、生体親和性も高いことから安全性が高い。本発明の製法に基づいたＨＡ類をタンパク質除去剤の原料として用いれば、醸造酒（例えば清酒）中のタンパク質を容易かつ迅速に除去できる。このとき、滓下げ剤の添加や火入れ（加熱殺菌）が不要であり、製品品質（香り、色等）を劣化させずに製造コストを低減できる。タンパク質を吸着除去した除去剤中のＨＡ類は、高濃度の塩溶液（例えば、リン酸カリウム）と接触させることにより容易に再生できるので、環境に優しく、製品の製造コストの削減にもつながる。また、本タンパク質除去剤の製造工程において有害な薬品を用いず、焼結工程も含まないので、製造工程においても低コストで環境負荷を低減できる。

以下、本発明の醸造酒用タンパク質除去剤の製法について、詳細に説明する。

以下の説明で、リン酸水素カルシウムを、モネタイト（Monetite）（ＣａＨＰＯ_４）、ブラッシュ石（Brushite）（ＣａＨＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ）と称することがある。

また、ヒドロキシアパタイト類とは、ヒドロキシアパタイト（hydroxyapatite）（ＨＡ）に加えて、下記一般式で示されるＣａ欠損ＨＡ（ＣＤＨＡ：calcium-deficient hydroxyapatite）を含むものである。

Ｃａ_１０−ｘ（ＨＰＯ_４）_ｘ（ＰＯ_４）_６−ｘ（ＯＨ）_２−ｘ（Ｈ_２Ｏ）
（但し：ｘ＞０）
本発明の醸造酒用タンパク質除去剤の原料とするＨＡ類は、Ｃａ源と、炭酸アルカリ塩（Ｃ源）を添加したリン酸源（Ｐ源）とを、微温（25〜60℃、望ましくは30〜50℃）の範囲の設定温度で熟成（反応）させて、アルカリ源を使用せずに前記ＨＡ類を調製する（生成させる）ことが、最も望ましい。

本発明の製法で調製したＨＡ類は、ｘが異なる各種のものが含まれると考えられる。

上記ＨＡ類の調製は、通常、湿式法による。湿式法を用いれば、簡便かつ安価に製造でき、スケールアップも容易である。

上記Ｃａ源としては、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）など水に溶解性を有するカルシウム塩であれば特に限定されない。これらの内で、ＣａＣｌ_２が好ましい。また、湿式法で行なう場合の水溶液中のカルシウム塩の濃度は、0.1〜1 mol/Lであることが好ましい。

上記Ｐ源（リン酸源）としては、リン酸及びリン酸塩を使用できる。リン酸塩としては、リン酸二アンモニウム、リン酸一アンモニウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウムなど、水に溶解性を有するものを好適に使用でき、特に限定されない。

これらの内で、リン酸一・二ナトリウム、特にリン酸二ナトリウムが好ましい。また、湿式法で行なう場合の水溶液中のリン酸源の濃度は、前記Ｃａ源に対して、モル比でＣａ源／Ｐ源＝10／2.5〜10／12、更には、10／5〜10／8となる量とすることが好ましい。

そして、Ｃａ源に対するＰ源の添加は、一回的乃至間欠的に行なうことが望ましい。一気に添加することにより、結晶が十分生長しないために、多様な結晶形態を持つ微結晶が得やすい。

上記Ｃ源（炭酸アルカリ塩）としては、炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウムカリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなど、水に溶解性を有するものであれば特に限定されない。これらの内で、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の炭酸アルカリ塩が好ましい。この炭酸アルカリ塩の添加量は、前記Ｃａ源に対して、Ｃａ／Ｃ（mol比）≒10／0.5〜10／9、更には、10／１.5〜10／6となる量とすることが好ましい。

添加剤である炭酸アルカリ塩を添加しても、調製後（熟成終了後、反応終了後）のｐＨは中性以下、通常、微酸性（ｐＨ7未満ｐＨ4以上）となる。適宜、ＮａＯＨ等のアルカリ源を二次反応の添加剤として少量添加することもできるが、その場合も、調製後ｐＨが塩基性側へ振れないようにすることが望ましい。

塩基性側で熟成させたものは、タンパク質吸着性能が劣ったり、醸造酒の酸度を低下させる場合がある。

Ｃａ源にＣ源を混合したＰ源を添加後、攪拌を継続して熟成させることにより、炭酸を発泡させてその揮散を促進させるとともに反応を終了させる。この熟成時間は、数時間〜30時間とする。反応終了（熟成）後の反応液（スラリー）は、遠心分離やろ過などにより固液分離し、精製水で十分洗浄した後、乾燥粉砕して粉末にしたり、造粒したりして本発明の醸造酒用タンパク質除去剤とする。

造粒方法は、特に限定されず、例えば、転動造粒、攪拌造粒、噴霧造粒、破砕造粒等などを好適に用いることができる。

なお、ＨＡ類の調製時や吸着剤の造粒時に、シリカゲルや活性炭を添加して、添着タイプやハイブリッドタイプのタンパク質除去剤とすることもできる。

上記乾燥温度は、約80〜300℃、望ましくは約90〜200℃、更に望ましくは100℃前後の範囲とする。温度が低すぎては乾燥時間が長くなって生産性の見地から望ましくない。また、温度が高すぎると、タンパク質除去剤中のＨＡ類の結晶粒の生長や結晶構造の変化が発生して、多様なタンパク質を除去する性能を得難くなるおそれがあるとともに、省エネルギーの見地から望ましくない。

このようにして製造したＨＡ類からなる又はＨＡ類を含むタンパク質除去剤は、バッチ式またはカラム式で、醸造酒に接触させてタンパク質の除去を行なう。

即ち、タンパク質除去剤を醸造酒に接触させて、該醸造酒中のタンパク質の吸着除去処理を行うタンパク質除去操作を経て、バッチ処理の場合は、更に固液分離操作を経て醸造酒を製造する。

ここで、醸造酒（被処理液）としては、非加熱醸造酒（原酒）を用いるが、火入れによるタンパク質の除去が不十分な加熱済み醸造酒に対しても本発明のタンパク質除去剤を適用することによって醸造酒の品質向上を図ることができる。この場合、火入れ温度を下げたり、火入れ回数を低減できる。

バッチ式の場合、処理条件は、例えば、添加濃度約0.05〜10質量％（望ましくは１〜7質量％）、処理（攪拌）時間0.5〜24時間（望ましくは１〜5時間）とする。

カラム式の場合、処理条件は、例えば、カラム（内径：15ｍｍ、長さ：289ｍｍ）に吸着剤（ＨＡ類）41.8ｇを充填した場合、流速約0.5〜1.0ｍＬ／minとする。

使用後のタンパク質除去剤中のＨＡ類は、高濃度の塩水溶液処理により除去剤からタンパク質を脱離させて再生させることができるので、タンパク質除去剤は繰り返し使用することができる。高濃度の塩水溶液とは、例えば、1Ｍリン酸カリウム水溶液を挙げることができる。

また、脱離させたタンパク質は、精製することにより、機能性タンパク質、ペプチド材料等の用途への展開が期待できる。

以下、本発明の効果を確認するために、比較例とともに行った実施例について説明する。

Ａ．製造例
様々な調製法（方法１〜５）により１１種類のＨＡ類（但し、ＣＡＰ−３、１０はリン酸水素カルシウム）を調製した。表１に調製条件の概略を示す。なお、ＣＡＰ−１１が、本発明の典型例である。各原料の混合比（mol比）は、Ｃａ源／Ｐ源＝10／6を基準とした。下記方法１〜３で使用した実験装置の概略図を図１に示す。また、方法４、５の攪拌も、マグネティックスターラにより行なった。

＜方法1＞
1) CAP-1
恒温槽温度50℃に設定下、1M Ca(NO₃)₂水溶液 0.3Lを丸底フラスコに入れて溶液を攪拌しながら、0.3M(NH₄)₂HPO₄水溶液 0.6Lを徐々に滴下(0.9L/min)後、60分攪拌した。続いて、丸底フラスコ内の溶液を攪拌しながら、2M NH₄OH 水溶液300mLを徐々に滴下(0.18L/min)後、さらに24時間撹拌熟成を継続して調製。

2) CAP-2
上記1)において、恒温槽設定温度を「95℃」に変更し、「2M NH₄OH水溶液」を「5M NH₄OH水溶液」に変更した以外は、同様にして調製。

＜方法2＞
1) CAP-3
恒温槽温度50℃の設定下、1M CaCl₂水溶液 0.3Lを丸底フラスコに入れて溶液を攪拌しながら、0.3M Na₂HPO₄水溶液 0.6Lを徐々に滴下(0.9L/min)後、30分攪拌熟成した。続いて、丸底フラスコ内の溶液を攪拌しながら、1M NaOH水溶液 27mLを徐々に滴下(0.18L/min)後、24時間撹拌熟成を継続して調製。

2) CAP-4
上記1)において、後段の「1M NaOH水溶液 27mL」を「2M NaOH水溶液 300mL」に変更した以外は、同様にして調製。

3) CAP-5
上記２）において、恒温槽設定温度を「95℃」に変更した以外は、同様にして調製。

＜方法3＞
尿素均一沈殿法にて調製。

１）CAP-6
恒温槽温度95℃に設定下、「1M Ca(NO₃)₂ +1.5M尿素」混合水溶液 0.3Lと、0.3M Na₂HPO₄水溶液(HNO₃にてpH3に調整したもの；試薬混合時の沈殿を防ぐため。) 0.6Lとを、一回的に丸底フラスコに入れて24時間撹拌熟成を継続して調製。

2) CAP-7
上記１）において、「1M Ca(NO₃)₂」を「1M CaCl₂」に、「HNO₃にてpH3に調製」を「HClにてpH3に調整」に変更した以外は、同様にして調製。

＜方法4＞
アルカリ無添加で調製する方法である。

1) CAP-10
恒温槽温度35℃に設定下、1M CaCl₂水溶液0.3Lを三角フラスコ(2L)に入れて、攪拌しながら0.3M Na₂HPO₄水溶液 0.6Lを35℃にて一気に注いだ後、24時間撹拌熟成を継続して調製。

(注：CAP-3と似ているが、CaとPを一気に混ぜること、温度が低く、アルカリ無添加の点が違う。混ぜた時点、やや微酸性。)

2) CAP-11
上記１）において、「0.3M Na₂HPO₄水溶液 0.6L」を「0.3M Na₂HPO₄ 0.6Lと0.4M NaHCO₃水溶液0.3Lとの混合液」と変更した以外は、同様にして調製。

(注：CAP-10に対し、炭酸塩有り。)

＜方法5＞
前記＜方法４＞において、アルカリを添加する方法である。

1)CAP-1
恒温槽温度35℃に設定下、1M CaCl₂水溶液 0.3L を丸底フラスコ（3L)に入れて、攪拌しながら0.3M NaH₂PO₄水溶液 0.6Lを一気に注いだ。続いて、2M NaOH水溶液 300mLを徐々に滴下(0.18L/min)後、24時間撹拌熟成を継続して調製。

2)CAP-13
上記1)の前段操作において、「0.3M NaH₂PO₄水溶液0.6Ｌ」を「0.3M NaH₂PO₄0.6Ｌと0.4M NaHCO₃ 0.3Lとの混合液」に変更する以外は、同様にして調製。

(注：CAP-12に対し、炭酸塩有り。)

上記でそれぞれ調製したＨＡ類は、いずれも、終了後1〜2Lの水に懸濁してはNo.2濾紙にて吸引ろ過を3回以上繰り返し、pH中性も確認して100℃前後にて一晩から一日乾燥し、乾燥後、乳鉢にて粉砕して、吸着剤（タンパク質除去剤）として、デシケータにて常温保存した。
Ｂ．特性測定結果
上記で調製したＨＡ類及び市販のＨＡ類（以下「試料」という。）について、下記各特性分析を行なった。なお、市販ＨＡ類は、カラムクロマトグラフ用のナカライ製ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ−Ｎ）と和光純薬製ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ−Ｗ）を用いた。

（1）走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）による観察
各試料について走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。その結果を表２に収率とともに示し、更に、いくつかのＳＥＭ写真を図２に示す。

製法の違いにより、不定形（ＣＡＰ−５、ＣＡＰ−１１、ＨＡｐ−Ｗ）、針状（ＣＡＰ−６）、板状（ＣＡＰ−１３、ＨＡｐ−Ｎ）のように様々な大きさや形状のものが得られることが確認できた。

（2）粉末Ｘ線回折装置（ＸＲＤ）による測定
各試料についてＸＲＤを用いて測定（解析）を行なった。ＸＲＤ測定から求めた同定結果及びＣａ／Ｐ組成比を表３に示すとともに、いくつかのＸＲＤ測定グラフ図を図３に示す。

それらの結果から、ＣＡＰ−３、ＣＡＰ−１０を除く何れの試料もＨＡ相を含んでいることが分かった。そして、ＨＡ相を含む試料のうち、ピーク形状が非常にシャープなもの、すなわち結晶性がよいものと、ピーク形状がブロードなもの、すなわち結晶性のあまりよくないものがあることが分かった。

即ち、本発明の製造方法で調製したＣＡＰ−４、ＣＡＰ−１１、１２、１３及びＨＡｐ−Ｎ（市販品）、さらには、ＣＡＰ−５は、結晶化度が他の試料であるＣＡＰ−１、２、６、７及びＨＡｐ−Ｗに比して低いことが確認できた。

また、発明例である結晶粒の構成化合物は、ＣＤＨＡ（カルシウム欠損ヒドロキシアパタイト）が主体であることが確認できた。

Ｃ．適用例
＜清酒タンパク質の除去試験＞
(1)各種ＨＡ類のタンパク質除去性能の検討
図４に示した方法によりＨＡ類のタンパク質除去性能を評価した。すなわち、各試料（ＨＡ類）からなるタンパク質除去剤を、清酒原酒に対して5質量％添加して、一晩攪拌接触させた（12時間処理）。以下の実験における攪拌は、全てマグネティックスターラにより行なった。

処理後の試料をろ紙（アドバンテック、Ｎｏ．５Ｃ）にてろ過し、得られたろ液を非吸着画分として下記SDS-PAGE解析に供した。更に、ろ液のタンパク質濃度を下記Bradford法で定量した。

ａ）ＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析によるタンパク質検出
上記ろ液を、透析膜（分画分子量3500Ｄａ）を使用して蒸留水に対して一晩5℃で透析した。透析内液を凍結乾燥し、これに所定量の蒸留水を加えて溶解し、50倍濃縮液とした。濃縮液にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液を加え、沸騰水中で10分間加熱したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、4〜12％濃度勾配ゲルを使用し、20ｍA、120分間泳動した。CBB-R250で30分染色後、酢酸／メタノール溶液で2時間脱色して、タンパク質を検出した。結果を図５に示す。

処理前の原酒中には28ｋＤａ、49ｋＤａ付近、及び50ｋＤａ以上の広い分子量範囲のタンパク質が含まれている。この原酒を様々なタンパク質除去剤に接触させたところ、各タンパク質除去剤により吸着除去されるタンパク質が異なった。ＣＡＰ−４及びＣＡＰ−１１、１２、１３を除く大部分のタンパク質除去剤は50ｋＤａ以上の高分子領域のタンパク質を除去できないが、ＣＡＰ−４及びＣＡＰ−１１、１２、１３は低分子量から高分子量まで広い範囲に亘って原酒中のタンパク質をほぼ完全に除去できた。

ｂ）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（プロテインアッセイ法）によるタンパク質濃度測定
スタンダードとサンプル（サンプル量100μＬ）を分注し、5倍希釈の発色液（5ｍＬ）をそれぞれに添加して、攪拌後、室温で5分以上保持して、1時間以内に測定した。なお、発色液にはBIORAD社製のものを使用し、スタンダードには、BSA（牛血清アルブミン）を使用して、測定波長は、595ｎｍとした。

その結果を図６に示す。タンパク質濃度とともに、原酒を100としたときの相対タンパク質濃度を図内に表示した。その結果は、図５のSDS-PAGE解析の結果と良く一致していることが確認できた。すなわち、ＣＡＰ−４及びＣＡＰ−１１、１２、１３さらには市販のＨＡｐ−Ｎは、原酒に5質量％添加して12h×室温×攪拌接触させた後の醸造酒中の相対タンパク質除去率（原酒比：Bradford法によるタンパク質定量に基づく）において、70％乃至75％以上を示した。

この結果、本発明の各タンパク質除去剤（ＨＡ類）（ＣＡＰ−４及びＣＡＰ−１１、１２、１３）は、火入れ不要乃至火入れ回数を低減できるレベルであることが確認できた。

(2) 試料の成分分析
表４に各試料の分析値を示す。全窒素、ホルモール窒素、アミノ酸度、アルコール、吸光度（ＯＤ）については何れのＨＡ系のタンパク質除去剤で処理した場合でも原酒との差はあまり認められなかったが、酸度に関しては異なるものも見られた。

SDS-PAGE解析及びBradford法の結果からタンパク質除去性能の良好であったＣＡＰ−４とＣＡＰ−１１、１２、１３のうち、ＣＡＰ−４、１２、１３では酸度が大きく低下したが、ＣＡＰ−１１では原酒との差はほとんど無かった。ＣＡＰ−１１で処理した清酒を官能検査したところ、７人のパネラーのうち３人が原酒との差が認められないとし、残りは原酒に比べてすっきりした味であるとの評価が得られた。

(3)タンパク質除去剤添加量の検討
ＣＡＰ−１１を原酒に対して、10、5、1又は0.1質量％添加して、１時間攪拌接触させた後、遠心分離して得られた上澄み液を非吸着画分とした（図４参照）。該非吸着画分について、上記(1)と同様の方法でSDS-PAGE解析およびBradford法によるタンパク質定量を行った。

Bradford法による結果を図７に示す。なお、図内の各棒表示の頭に付した数字は、原酒中のタンパク質濃度を100としたときの相対タンパク質濃度である（図８〜１２において同じ）。

ＣＡＰ−１１の添加量が5％であれば、タンパク質を90％以上除去でき十分であることが確認できた。

SDS-PAGE解析の結果でも、ＣＡＰ−１１の添加量が5％で殆どの分子量に亘るタンパク質が上澄から除去されていた。

(4)タンパク質除去剤接触時間の検討
ＣＡＰ−１１を原酒に対して、5質量％添加して、1時間、2時間、4時間及び12時間、攪拌接触させた後、遠心分離し得た上澄（非吸着画分）について、上記(1)と同様の方法でSDS-PAGE解析およびBradford法によるタンパク質定量を行った。

Bradford法による結果を図８に示す。ＣＡＰ−１１の添加量が5％であれば、接触時間が１時間でも90％以上除去でき、接触時間４時間では95％以上除去できたことから、長時間（10時間以上）接触させることが不要であることが確認できた。即ち、接触時間は、生産性に応じて、0.5〜5ｈで十分であることが確認できた。

なお、SDS-PAGE解析の結果でも、１時間以上で、殆どの分子量に亘るタンパク質が除去されていた。

(5)タンパク質除去剤製造時のＣａ源／Ｐ源比の検討
ＣＡＰ−１１を基本として、Ｃａ源／Ｐ源比（mol）＝10／3〜10／１0の範囲で変えて調製した実施例のタンパク質除去剤（ＨＡ類）を原酒に対して10質量％添加して、12時間接触させて試料を調製した。各試料について、上記(1)と同様の方法でSDS−PAGＥ解析およびBradford法によるタンパク質定量を行った。

Bradford法による結果を図９に示す。なお、棒表示の頭部の（）内数字は、上澄ｐＨである（図１０において同じ。）。

実験室下、７０℃で１時間火入れした従来法ではタンパク質が約50％残存した。なお、従来法は、原酒に対して、出願人の一人が従来行なっている滓下げろ過、火入れ（加熱殺菌）条件にて実験室で行なったものであるが、現場で従来法を行なった場合は、設定時間以上の長時間に亘って、原酒が火入れ温度に保持されるため、タンパク質除去率は、約90％以上となる。

一方、Ｃａ源／Ｐ源比が10／6では90％近くタンパク質除去ができた。Ｃａ源／Ｐ源比が10／3又は10／10でも80％以上清酒タンパク質を除去でき、本発明の効果を奏することが確認できた。すなわち、本発明のタンパク質除去剤は、火入れ不要なレベル乃至火入れ回数を低減できるレベルのタンパク質除去能を有することが確認できた。なお、Ｃａ源／Ｐ源比が高い10／3では、処理済み清酒のｐＨが上昇する。このため、Ｃａ源／Ｐ源＝10／5〜10／8が望ましい。

SDS-PAGE解析の結果でも、全てのＣａ源／Ｐ源比の範囲内で、殆どの分子量に亘るタンパク質が上澄から除去されていた。

また、同時に各実施例について、ＸＲＤ測定により求めた同定結果及びＣａ／Ｐ組成比を、調製後溶液ｐＨとともに表５に示す。

いずれも、ＣＤＨＡを含有していることが分かる。また、調製後ｐＨも弱酸性（ｐＨ4〜6）であることが分かる。

（6）タンパク質除去剤製造時のＣａ源／Ｃ源比の検討
ＣＡＰ−１１を基本として、Ｃａ源／Ｃ源比（mol）＝10／0〜10／8の範囲で変えて調製した実施例のタンパク質除去剤（ＨＡ類）を原酒に対して10質量％添加して、12時間攪拌接触させ、上記と同様にて遠心分離後の非吸着画分について、SDS−PAGＥ解析およびBradford法によるタンパク質定量を行った。

結果を図１０に示す。従来法（実験室下）では、タンパク質が約50％残存するのに対し、Ｃａ源／Ｃ源比＝１0／1.5〜１0／6の範囲では約90％の清酒タンパク質を除去でき、タンパク質除去率が特に高いことが確認できた。

SDS-PAGE解析の結果でも、Ｃａ源／Ｃ源比＝10／1.5〜10／6の範囲で、殆どの分子量に亘るタンパク質が上澄から除去されていた。

また、同時に各実施例について、ＸＲＤ測定により求めた同定結果及びＣａ／Ｐ組成比を、調製後溶液ｐＨとともに表６に示す。

いずれも、Ｃａ源／Ｃ＝10／0の場合を除いてＣＤＨＡを含有していることが分かる。また、調製後ｐＨも、Ｃａ源／Ｃ源＝10／8を除いて弱酸性（ｐＨ4〜6）であることが分かる。

なお、ＸＲＤ及び赤外分光の測定結果から、Ｃ源比率が高いＣａ源／Ｃ源＝10／8でも炭酸基は検出されなかった。

なお、前記条件のカラムにＣＡＰ−１１を充填して、流速：0.7ｍＬ／minで36min通液して、原酒400ｍＬを処理した清酒について、非吸着画分のタンパク質濃度をBradford法で定量するとともにｐＨ測定を行なった。その結果、非吸着画分のタンパク質濃度（相対値）が10.1％、ｐＨ4.99とバッチ処理と同等の良質な非熱処理清酒が得られた。

＜バッチ式タンパク質除去操作における除去剤再生試験＞
原酒100ｍＬにＣＡＰ−１１を10ｇ添加して、ＣＡＰ−１１が沈殿しないように1時間攪拌を行って、タンパク質除去操作を行なった。

ＣＡＰ−１１を固液分離して調製した上澄について、SDS-PAGE分析を行なうとともに、タンパク質濃度をBradford法により定量した。

そして、固液分離後のＣＡＰ−１１：10ｇに対して1Ｍリン酸カリウム、蒸留水100ｍＬの順で添加・懸濁・遠心分離をする操作を2回繰り返して、再生処理を行った。

こうして調製した再生ＣＡＰ−１１を用いて、上記と同様、タンパク質除去操作を行なった。

再生ＣＡＰ−１１を固液分離して調製した上澄について、SDS-PAGE分析を行なうとともに、タンパク質濃度をBradford法により定量した。

これらのタンパク質除去剤再生／再生材によるタンパク質除去操作を、４回繰り返したが、図１１に示す如く、４回再生使用しても、タンパク質除去能は低下しなかった。

SDS-PAGE解析の結果でも、再生回数が４回まで、殆どの分子量に亘るタンパク質が上澄から除去されていた。

＜カラム式タンパク質除去操作における除去剤再生試験＞
前記条件でカラム式タンパク質除去操作に使用したＣＡＰ−１１をカラムに充填したまま、１Mリン酸カリウムを、流速：1.0ｍＬ／minで60min通液して再生した。清酒を再生ＣＡＰ−１１充填カラムに通液して得られた溶出液について、SDS-PAGE分析を行なうとともに、タンパク質濃度をBradford法により定量した。

これらのカラムの再生及び再生カラムを用いたタンパク質除去操作を４回繰り返したが、図１２に示す如く、再生３度使用でも、タンパク質除去能は低下しなかった。

SDS-PAGE解析の結果でも、再生回数３度まで、殆どの分子量に亘るタンパク質が上澄から除去されていた。

以上の如く、本発明のタンパク質除去剤は、再生処理が容易であるとともに、再生性も良好であることが確認できた。

実験例（実施例）において各種ＨＡ類を調製するのに用いた実験装置の概略図である。 実験例で調製したＨＡ類及び市販ＨＡ類のタンパク質除去剤のいくつかのＳＥＭ写真である。 同じくＨＡ類のいくつかについて粉末ＸＲＤ装置を用いて測定した結果を示すグラフ図である。 SDS−PＡGE解析及びタンパク質濃度測定（Bradford法）に供する試料（非吸着画分）の調製方法を示す流れ図である。 実験例で調製したＨＡ類及び市販ＨＡ類をタンパク質除去剤として用いて原酒を12時間処理して製造した清酒の非吸着画分のSDS−PＡGE像である。 同じく各ＨＡ類をタンパク質除去剤として用いて原酒を12時間処理して製造した清酒の非吸着画分のタンパク質濃度結果を示す棒グラフである。 実施例（ＣＡＰ−１１）であるタンパク質除去剤を各所定濃度となるように原酒に添加して1時間処理後の非吸着画分のBradford法から得たタンパク質濃度結果を示す棒グラフである。 実施例（ＣＡＰ−１１）であるタンパク質除去剤を5%濃度となるように原酒に添加して各所定時間処理後の非吸着画分のBradford法から得たタンパク質濃度結果を示す棒グラフである。 ＣＡＰ−１１（Ｃａ源／Ｐ源＝10／6）を基準としてＣａ源／Ｐ源のmol比を上下に振って調製した各実施例のタンパク質除去剤を10%濃度となるように原酒に添加して12時間処理後の非吸着画分のBradford法から得たタンパク質濃度の結果を示す棒グラフである。 ＣＡＰ−１１（Ｃａ源／Ｃ源＝10／4）を基準としてＣａ源／Ｃ源のmol比を上下に振って調製した各実施例のタンパク質除去剤を10%濃度となるように原酒に添加して12時間処理後の非吸着画分のBradford法から得たタンパク質濃度の結果の棒グラフである。 バッチ式タンパク質除去操作に使用したＣＡＰ−１１の再生材のタンパク質除去能の確認試験結果であるBradford法から得たタンパク質濃度結果を示す棒グラフである。 カラム式タンパク質除去操作に使用したＣＡＰ−１１の再生材のタンパク質除去能の確認試験結果であるBradford法から得たタンパク質濃度結果を示す棒グラフである。

Claims (14)

1. 醸造酒中のタンパク質の吸着除去処理に使用されるタンパク質除去剤において、Ｃａ源とリン酸源（以下「Ｐ源」という。）とを反応させて得られるヒドロキシアパタイト（ＨＡ）類からなる又は該ＨＡ類を含み、清酒等の醸造酒に対して火入れ不要となる乃至火入れ回数を低減できるレベルのタンパク質除去能を有することを特徴とする醸造酒用タンパク質除去剤。
2. 原酒に5質量％添加して12h×室温×攪拌接触させた後の醸造酒中の相対タンパク質除去率（原酒比：Bradford法によるタンパク質定量に基づく）において、70％以上を示すものであることを特徴とする請求項１記載の醸造酒用タンパク質除去剤。
3. 前記ＨＡ類が、カルシウム欠損ヒドロキシアパタイト（ＣＤＨＡ：calcium-deficienct hydroxyapatite、Ｃａ_10-x(ＨＰＯ₄)_x(ＰＯ₄)_6-x(ＯＨ)_2-x(Ｈ₂Ｏ)）（但し、ｘ＞０）を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の醸造酒用タンパク質除去剤。
4. 原酒に5質量％添加して12h×室温×攪拌接触させた後の酸度低下量が酸度で0.5％未満を示すものであることを特徴とする請求項１、２又は３記載の醸造酒用タンパク質除去剤。
5. 請求項１〜４いずれか一記載の醸造酒用タンパク質除去剤を製造する方法であって、
   Ｃａ源と、炭酸アルカリ塩（以下「Ｃ源」という。）を添加したＰ源とからなる反応原料を、25〜60℃の範囲の設定温度で熟成させることにより、前記ＨＡ類の調製を行なうことを特徴とする醸造酒用タンパク質除去剤の製造方法。
6. 前記ＨＡ類の調製に際して、Ｃａ源／Ｐ源（mol比）＝10／2.5〜10／12としたときにおいて、Ｃａ源／Ｃ源（mol比）＝10／0.5〜10／9とすることを特徴とする請求項５記載の醸造酒用タンパク質除去剤の製造方法。
7. 前記ＨＡ類の調製に際して、前記Ｃａ源をＣａＣｌ_２、前記Ｐ源をＮａ_２ＨＰＯ_４、前記Ｃ源をＮａＨＣＯ_３とすることを特徴とする請求項５又は６記載の醸造酒用タンパク質除去剤の製造方法。
8. 請求項１、２又は３記載の醸造酒用タンパク質除去剤を製造する方法であって、
   Ｃａ源と、適宜、Ｃ源を添加したＰ源とからなる反応原料を、熟成後ｐＨ10以上となるような量のアルカリ源を使用して、25〜60℃の設定温度でアルカリ熟成させることにより、前記ＨＡ類の調製を行なうことを特徴とする醸造酒用タンパク質除去剤の製造方法。
9. 前記ＨＡ類の調製に際して、前記Ｃａ源をＣａＣｌ_２、前記Ｐ源をＮａＨ_２ＰＯ_４、前記Ｃ源をＮａＨＣＯ_３とし、前記アルカリ源をＮａＯＨ又はＫＯＨとすることを特徴とする請求項８記載の醸造酒用タンパク質除去剤の製造方法。
10. 請求項１又は２記載のタンパク質除去剤を製造する方法であって、
    Ｃａ源とＰ源とからなる反応原料を、熟成後ｐＨ10以上となるような量のアルカリ源を使用して、35〜70℃の温度条件でアルカリ熟成させることにより、前記ＨＡ類の調製を行なうことを特徴とする醸造酒用タンパク質除去剤の製造方法。
11. 前記ＨＡ類の調製に際して、前記Ｃａ源をＣａＣｌ_２、前記Ｐ源をＮａ_２ＨＰＯ_４、前記アルカリ源をＮａＯＨ又はＫＯＨとすることを特徴とする請求項１０記載の醸造酒用タンパク質除去剤の製造方法。
12. 前記ＨＡ類の調製に際して、反応終了後の反応液の固液分離により得られた固形物の乾燥を、80〜300℃で行うことを特徴とする請求項５〜１１のいずれか一記載の醸造酒用タンパク質除去剤の製造方法。
13. 請求項１〜４のいずれか一記載のタンパク質除去剤を原酒に接触させて、該原酒中のタンパク質の吸着除去処理を行うタンパク質除去操作を経て醸造酒を製造することを特徴とする醸造酒の製造方法。
14. 請求項１〜４のいずれか一記載のタンパク質除去剤を原酒に接触させて、該原酒中のタンパク質の吸着除去処理を行うタンパク質除去操作を経て清酒を製造することを特徴とする清酒の製造方法。