JPS62176906A - 分離用ハイドロキシルアパタイトの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）発明の目的 ［産業上の利用分野］ 本発明は水溶液中の化学成分、特に蛋白質、核酸その他
の生体高分子物質の分離、精製の用に供する分離用ハイ
ドロキシルアパタイト　（ｌｌｙｄｒｏｘｙ−１ａｐａ
ｔｉｔｅ）　Ｃａ１ｏ（ＰＯ４）６（０８）２の製法に
関するものである。

［徒来の技術］ 蛋白質、核酸などの生体高分子物質の混合水溶液中から
それらを単離する方法として、固体粒子に吸脱着せしめ
る方法が検討され、各種性能の分離用固体粒子が考案堤
供されてきている。

チセリウスと彼の共同研究者は１９５６年、塩化カルシ
ウム溶液と第二燐酸ナトリウム溶液とを室温（２５℃付
近）で混合し、て得られる燐酸カルシウム沈殿をアルカ
リ中で煮沸してハイドロキシルアパタイトを調製し、こ
れが生体高分子混合液から各成分を分離精製するのに石
川なことを示した。

［エイ・チセリウス、ニス・ヒエ−ルチン、工・レヴイ
ン；アーカイヴズ　オブ　バイオケミストリイ　アンド
　バイオフイズイツクス　（＾、Ｔｉｓｅ−１ｉｕＳ、
　Ｓ、１１．１ｅｒｔｅｎ　ａｎｄ　Ｏ，Ｌｅｖｉｎ　
　：　　Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｌｌｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　ａｎｄ　８ｊｏｐｈｙｓｉｃｓ）　　６５巻、＋
３２−１５５頁　１９５６年］ ［発明が解決しようとする間暉点］ チセリウス等の方法による分離用ハイドロキシルアパタ
イトは汗体高分子の分離精製に利用されてきているが、
ガラス円筒その他のカラムに充填してカラムクロマトグ
ラフに供した場合、その粒子径が微小なため流速が極め
て遅いことが雑煮である。これを解決するため、従来は
、セルロース粒子を混合して使用したり、或いは中間体
の燐酸カルシウムを生成させる際、シリカを核として使
用するとか、アルカリ煮沸に際してｐＨを一定に維持す
ることなどが行われてきた。しかし、これらはいずれも
操作が煩雑であり、また、必ずしも報告３ｉｒ！４１の
結果は得られず、充分な改良はなされてきていなかった
ものである。

（２）発明のａ成 ［間顯点を解決するための手段］ 木発明者は上記ｒ点を解決することを目的とし、チセリ
ウス等の方法の各段階を改めて詳細に検討した結果、粒
子径の遥かに大きいハイドロキシルアパタイトを調製す
る特別の条件を発見し、本発明を完成するに至った。

即ち、チセリウス等の方法ではハイドロかジルアパタイ
トに導く前駆体としての燐酸カルシウム沈殿を調製する
ため、塩化カルシウム（Ｃａ　Ｃ１２）と第二燐酸ナト
リウム（Ｎ　ａ　２＋ｌ凹４）のそれぞれの水溶液を室
温（２５℃付近）で直接混合していたが、本発明者は２
５℃から１００℃に竿る広い範囲にわたってｇ度を変え
て実験し、その影響を検討した結果、０．５モルＮａＣ
１水溶液に両液を注入して反応せしめることにより、４
０〜５０℃及び９０〜１００℃の二つの温度範囲の条件
において塩化カルシウム溶液と第二燐酸ナトリウム溶液
とが混合された場合、得られた燐酸カルシウム沈殿の粒
子サイズは直径６０ミクロン乃至それ以上となり、他の
温度ｗ４域に比べて格段に大きく、そしてこれからアル
カリ中での加熱によって導かれるハイドロキシルアパタ
イトも同様の大きな粒子径を保ち、カラムクロマトグラ
フにおいて従来法にょるハイドロキシルアパタイトに可
能な展開溶出液流速の１０倍に及ぶ流速が可能となった
。

上記現象は本発明者も当初全く予想しなかったところで
あるが、この結果から、その生成機作は次の如く考えら
れる 即ち、ハイドロキシルアパタイトの前駆体である燐酸カ
ルシウム沈殿の結晶成長が、その際の温度により強く影
響されることである。

燐酸カルシウム沈殿はその生成時のＷＡ度が、２５°Ｃ
より１舅、するに従って次第に大きなプラッシャイト（
ｂｒｕｓｈｊｔｅ）ＣａｌｌＰＯ・２ＨＯ結晶として成
長するが、４５加を頂点として、それ以上では逆にブラ
ッシャイト結晶は次第に微小化する。そして、８゜℃近
辺から上では、微小ブラッシャイトは脱水されで微小な
モネタイト　（ｍｏｎｅｔｊｔｅ）　ｃａＨＰＯの結晶
となる。更に、温度が上昇して９０　’Ｃ以上になると
、生成燐酸カルシウム沈殿の粒子径は突如として増大叶
っ硬化する。　９０”Ｃを越える温度での不連続的な変
化は、この高温では発生期の棒微小ブラッシャイト結晶
が直ちに脱水されてモネタイトになると同時に凝結して
強固な粒子を形成するものと考えられる。８０〜９０℃
で生成したモネタイト結晶、或いは市販のモネタイトに
はこの凝結怖はなく、微細結晶に１トまる。

次にかくして生成させた燐酸カルシウム沈殿をアルカリ
中で加熱することによってハイドロキシルアパタイトに
転移させるのであるが、従来、この際、原材料の塩化カ
ルシウム（Ｃａ　Ｃ１２）　　１モル　　、に対し、１
モル以上の割合の大量のアルカリが添加されていた。

本発明者はこれについても吟味を加えた結果、アルカリ
添加量を低減することが可能であり、原材料のＣａＣｌ
２．　１モルに対して０．４〜０．６モルの割合、最も
好ましくは　０．５モルの割合で苛性ソーダ（Ｎｓ（１
１１）を添加するのが白いことを見出した。

従来の方法では′Ａ剰のアルカリを除去するために大量
の水乃至は憐酸塩緩衝液による洗浄を必要としたが、本
発明者がここに構案する方法による時は製品の洗浄・仕
上が著しく簡易化されるものである。

又製品のハイドロキシルアパタイトは従来、燐酸塩緩衝
液中に貯蔵されてきた。本発明の実施の態様に於ても、
勿論これを利用もするが、更に本発明者はより便宜な態
様をもこれに加えるものである。

即ち、生成したハイドロキシルアパタイトを沸ＰＡ温度
以ヒ２２０℃に至る温度で加熱乾燥しても、分鯉剤とし
ての向好な性能を保持したままで乾燥粉粒体を得られる
ことを見出した。

乾伶騨品は貯蔵・輸送に名犬な便宜を与えるものである
。

［実施例及び比較例］ 以下、実施例及び比較例によって、実施のＳ様とその効
果を具体的に示す。

比較例 ０．５　Ｍ　（モル＃度）　ＣａＣ１ｚ水溶液及び　０
．５ＭＮａ２１１Ｐ（１４水溶液の各々２１を用意し、
各々を毎分２．５−の割合で、所望の一定温度に保ち、
目つ可及的緩慢に攪拌しつつある１１の０．５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１水溶液中に注入する。注入の間中混合溶液の温度を
上記一定値に維持せしめる。

所望の一定温度として、２５．４０．４５．　Ｆｉ５．
７０゜８５　　及び９５℃の各温度を採り上げて実験し
た。

各実験温度での操作によって生成した燐酸カルシウム沈
殿を反応溶液から採取し、それぞれについて充分に水洗
し、５１の０．２５　Ｍ　Ｎａ０１＋に懸濁し、攪拌し
つつ１時間煮沸する。得られたハイドロキシルアパタイ
トを７０℃の温湯で良く洗い、次いで１０ｍＭ燐酸塩緩
衝液（ｐＨ６，９）で洗った後、同じ緩衝液中に貯蔵す
る。

各温度で生成された燐酸カルシウム由来のハイドロキシ
ルアパタイトの静【ト沈殿１　ｍｅを底にナイロン網を
置いた内径８．５　ｙａのガラス円筒に充填し、１０ｍ
Ｍ燐酸塩緩衝液を水柱８（１ｃｍの圧力下で逆過させて
その流速を測定すると共に、ハイドロキシルアパタイト
層の落ち着き高さを観測し、その占める充填層体＠　　
Ｖ　（ｍ／）を計算した。

なお、上記流速測定値から水柱１ｃｍ圧、充填層高１ｃ
ｍ１当りの値を計算し、これを基準化流速　ｔＪ（ｍｊ
／ｍｊｎ／ｃ＋ｎ／ｃｍＨｉ＋）で示す。

また、１０ｍＭ燐酸塩緩衝液に仔牛胸腺ＤＮＡを１００
μｇ／ｍＩの濃度に含む溶液を水柱８０　ｃｍの圧力下
で流し、カラムからの排出液中にＤＮＡが検知される迄
の通液量からＤＮＡ！着晋Ｃ（ｍｇ）を算出した。

各ハイドロキシルアパタイトの前駆体である燐酸カルシ
ウム沈殿を生成した温度を横軸に取り。

対応するハイドロキシルアパタイト試料による落ち着き
充填層体積Ｖ、基準化流速Ｕ、＃びにＤＮＡ吸着量Ｃを
縦軸に取って画いたグラフが第１図である。

図に靴る通り落着充填層体積Ｖ、ならびに基準化流速Ｕ
が、前駆体である燐酸カルシウムの生成温度によって大
きく異なることが明らかとなった。

そして４５℃および９５℃で生成した燐酸カルシウムか
らのハイドロキシルアパタイト（以下それぞれＨ４５，
Ｈ９５と略記）で極大が見られる。

殊に流速に於て大巾な違いが生じ、チセリウスが提示し
、従来用いられてきた室温付近の２５℃で生成された燐
酸カルシウムからのハイドロキシルアパタイト（以下Ｈ
２５と略記）のそれの１０倍にもｉ！つしている。

これはＨ４５，Ｈ９５が粒子径が大きく、しがもカラム
充填に於て、殆ど圧縮されないことを示唆する。一方Ｄ
ＮＡ吸着量は７０〜８５℃生成燐酸カルシウムからのハ
イドロキシルアパタイトに於て低いがそれ以外は殆ど変
わらず、特に本発明で焦点となっている４５℃と９５℃
は２５℃の場合と同等以上の能力を保有ししていること
が判る。

なお又、　Ｈ２５，Ｈ４５及びＨ９５の各ハイドロキシ
ルアパタイトを充填したカラムについて蛋白質として仔
牛血清アルブミンを、ＲＮＡとして酵母リボ核酸を、Ｄ
ＮＡとして仔牛胸腺デオキシリボ核酸を展開した成績を
第２図に示すが、Ｈ４５、■１９５は両者共に徒来法の
Ｈ２５と変わらない分難・分画精度を達することがＳ認
される。

実施例１ ０．５　Ｍ　（モル濃度）　ＣａＣ１ｚと０−５　Ｍ　
Ｎ　ａ　２１１　ＰＯ４の水溶液を各２ｅ用意し、４５
℃に保って可及的緩慢に攪拌しつつある１１の０．５Ｍ
　ＮａＣ１水溶液中に各々毎分２．５ｍｌの割合で注入
して混合、反応させる。生成した燐酸カルシウム（ブラ
ッシャイト）の大きな結晶をよく水洗して１１の水にＰ
ｉし、１１１０ｍ／の１０　Ｍ　ＮａＯＨを加えて１時
間煮沸する。

得られたハイドロキシルアパタイトを水及び燐酸緩衝液
で良く洗浄し、使用迄そのまま貯蔵する。

実施例２ ０．５　Ｍ　（モアＬ７濃度）　ＣａＣ１ｚ　ト０．５
Ｍ　Ｎｏ２ＨＰＯ４（７）水溶液を各２１用意し、９５
〜１００’Ｃに保って可及的緩慢に攪拌しつつある１１
の０．５Ｍ　ＮａＣ１水溶液中に各々毎分２．５−の割
合で注入して混合、反応させる。生成した燐酸カルシウ
ム（モネタイト）の大きく硬い粒子をよく水洗して１１
の水に＠Ｅｒし、１００　ｍｅの５ＭＮａＯＨを加えて
１時間煮沸する。

得られたハイドロキシルアパタイトは水で洗浄し、貯蔵
する。

実施例３ 実施例２と同様に操作して得た湿ったハイドロキシルア
パタイトを加熱し、乾燥する。

最終温度を２２０℃に革らしめ、乾燥粉末を得る。

（３）発明の効果 本発明の特許請求の範囲　１、並びに　２、記載の方法
によれば、生体高分子物質の分離用クロマトグラフ充填
剤として優れた分離・分画精度を持ち、しかも、高い展
開液流速が可能なことによって迅速に作業を進められる
、分離用ハイドロキシルアパタイトが調製できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はハイドロキシルアパタイト前駆体である燐酸カ
ルシウムを生成する際の温度とそれから導かれたハイト
ロキシルアバタイ１−の件部との関係を示す。 図中Ｖ及びＣはハイトロキシルアバタイ（−静止沈殿１
ｍｌ当りのカラム充填後の体積（−）並びに吸着Ｄ　Ｎ
　Ａ　ｔ　（ｎ＋ｇ）をそれぞれ示し、Ｕは展開液ｒｓ
化流速（ｍ＃／ｗｉｎ／ｃｍ／ａｍ間）を示す。 第２図は１１４５．１１９５並びに比較として　］１２
５を充填したカラ１１による仔牛血清アルブミン（Ｐ）
。 酵母リボ核酸（Ｒ）及び仔牛胸ＩＩ♀デオ念シリボ柱酸
（Ｄ）についてのクロマト分画パターンを示す。 特許出語１人　　Ｖ：村　ｉぐ− ＜＝？＋’１ｙｋ４１ｒ！Ｆ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、塩化カルシウム溶液と第二燐酸ナトリウム溶液とを
   ４０℃乃至５０℃の温度範囲、最も好ましくは４５℃の
   温度において混合し、得られる燐酸カルシウム沈殿をア
   ルカリ中で加熱してハイドロキシルアパタイトとするこ
   とを特徴とする分離用ハイドロキシルアパタイトの製法
   。 ２、塩化カルシウム溶液と第二燐酸ナトリウム溶液とを
   ９０℃乃至１００℃の温度範囲、最も好ましくは９５℃
   の温度において混合し、得られる燐酸カルシウム沈殿を
   アルカリ中で加熱してハイドロキシルアパタイトとする
   ことを特徴とする分離用ハイドロキシルアパタイトの製
   法。