JP6882816B1 - リン酸アルミニウム化合物およびその製造方法、並びに、タンパク質精製用担体およびそれを用いたタンパク質精製方法 - Google Patents
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Abstract
精製能力に優れたリン酸アルミニウム化合物およびその製造方法、並びに、タンパク質精製用担体およびそれを用いたタンパク質精製方法が提供される。上記リン酸アルミニウム化合物は、水銀圧入法により得られるＬｏｇ微分細孔容積分布（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）において、細孔直径（Ｄ）が２０００ｎｍ以下の範囲に現れるピークに対応する細孔モード径が１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にある。
Description
本発明は、リン酸アルミニウム化合物およびその製造方法、並びに、タンパク質精製用担体およびそれを用いたタンパク質精製方法に関する。
タンパク質の精製技術として、従来より、塩析法、遠心法、カラムクロマトグラフィー法等の精製法が広く用いられている。タンパク質の中でも医薬品用抗体タンパク質やワクチン用抗原タンパク質については、ヒトに接種した場合の副作用の軽減や昨今の製剤基準の厳格化により、特に高度な精製技術が要求される。
特許文献１では、ワクチン等のタンパク質の精製に有用なタンパク質精製用担体として、無機化合物の中からリン酸アルミニウムに着目し、リン酸アルミニウムの構成元素ではない特定のイオンを更に含む水溶液を用いてリン酸アルミニウム化合物を製造する方法を開示している。
本発明者等による鋭意研究の結果、特許文献１に開示された製造方法を用いて得られるリン酸アルミニウム化合物は、タンパク質に対する吸着力は強いものの、高い回収率においてタンパク質を精製することは困難であり、タンパク質精製用担体として用いるためには精製能力の更なる改善が必要なことがわかった。
そこで本発明は、精製能力に優れたリン酸アルミニウム化合物およびその製造方法、並びに、タンパク質精製用担体およびそれを用いたタンパク質精製方法を提供することを目的とする。
本発明の実施形態（以下において、「本実施形態」という。）は、例えば、以下の通りである。
［１］ 水銀圧入法により得られるＬｏｇ微分細孔容積分布（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）において、細孔直径（Ｄ）が２０００ｎｍ以下の範囲に現れるピークに対応する細孔モード径が１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にあるリン酸アルミニウム化合物。
［２］ 上記細孔モード径が１００ｎｍ〜２００ｎｍの範囲にある、［１］に記載のリン酸アルミニウム化合物。
[３] 平均粒子径（Ｄ５０）が５０μｍ〜８０μｍの範囲にある、［１］又は［２］に記載のリン酸アルミニウム化合物。
［１］ 水銀圧入法により得られるＬｏｇ微分細孔容積分布（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）において、細孔直径（Ｄ）が２０００ｎｍ以下の範囲に現れるピークに対応する細孔モード径が１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にあるリン酸アルミニウム化合物。
［２］ 上記細孔モード径が１００ｎｍ〜２００ｎｍの範囲にある、［１］に記載のリン酸アルミニウム化合物。
[３] 平均粒子径（Ｄ５０）が５０μｍ〜８０μｍの範囲にある、［１］又は［２］に記載のリン酸アルミニウム化合物。
［４］ 平均粒子径（Ｄ５０）が５５μｍ〜７０μｍの範囲にある、［１］又は［２］に記載のリン酸アルミニウム化合物。
［５］ 非晶質である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
［６］ 硫黄とカリウムを含有する、［１］〜［５］のいずれか１項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
［７］ マグネシウムを含有しないか、含有する場合にはその含有率が０．０１質量％未満である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
［５］ 非晶質である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
［６］ 硫黄とカリウムを含有する、［１］〜［５］のいずれか１項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
［７］ マグネシウムを含有しないか、含有する場合にはその含有率が０．０１質量％未満である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
［８］ ［１］〜［７］のいずれか１項に記載のリン酸アルミニウム化合物を含むタンパク質精製用担体。
［９］ タンパク質が吸着した［８］に記載のタンパク質精製用担体を含む溶液をカラム、クロスフローフィルターまたはデッドエンドフィルターを用いて濾過する工程を含むタンパク質精製方法において用いられるタンパク質精製用担体。
［１０］ タンパク質を含む溶液を［８］又は［９］に記載のタンパク質精製用担体に接触させて、上記タンパク質を上記タンパク質精製用担体に吸着させること、
タンパク質が吸着した上記タンパク質精製用担体をカラム、クロスフローフィルターおよびデッドエンドフィルターのいずれかを用いた濾過により分離すること、および
分離された上記タンパク質精製用担から上記タンパク質を溶出剤で溶出すること
を含むタンパク質精製方法。
［９］ タンパク質が吸着した［８］に記載のタンパク質精製用担体を含む溶液をカラム、クロスフローフィルターまたはデッドエンドフィルターを用いて濾過する工程を含むタンパク質精製方法において用いられるタンパク質精製用担体。
［１０］ タンパク質を含む溶液を［８］又は［９］に記載のタンパク質精製用担体に接触させて、上記タンパク質を上記タンパク質精製用担体に吸着させること、
タンパク質が吸着した上記タンパク質精製用担体をカラム、クロスフローフィルターおよびデッドエンドフィルターのいずれかを用いた濾過により分離すること、および
分離された上記タンパク質精製用担から上記タンパク質を溶出剤で溶出すること
を含むタンパク質精製方法。
［１１］ リン酸イオンを含む水溶液Ａと、アルミニウムイオン、硫酸イオンおよびカリウムイオンを含む水溶液Ｂとを混合し、リン酸アルミニウム化合物を含む混合液を得ることを含むリン酸アルミニウム化合物の製造方法であって、上記水溶液Ａ中の前記リン酸イオンの濃度が０．６ｍｏｌ／Ｌ超であり、上記水溶液Ｂ中の前記アルミニウムイオンの濃度が０．３ｍｏｌ／Ｌ超であり、上記カリウムイオンの濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌ超である製造方法。
［１２］ 上記リン酸アルミニウム化合物が［１］〜［７］のいずれか１項に記載のリン酸アルミニウム化合物である、［１１］に記載の製造方法。
［１３］ 前記混合液から前記リン酸アルミニウム化合物を分離すること、分離した前記リン酸アルミニウム化合物を洗浄すること、および、洗浄した前記リン酸アルミニウム化合物をスプレードライヤーを用いて乾燥することを更に含む、［１１］または［１２］に記載の製造方法。
［１２］ 上記リン酸アルミニウム化合物が［１］〜［７］のいずれか１項に記載のリン酸アルミニウム化合物である、［１１］に記載の製造方法。
［１３］ 前記混合液から前記リン酸アルミニウム化合物を分離すること、分離した前記リン酸アルミニウム化合物を洗浄すること、および、洗浄した前記リン酸アルミニウム化合物をスプレードライヤーを用いて乾燥することを更に含む、［１１］または［１２］に記載の製造方法。
本発明により、精製能力に優れたリン酸アルミニウム化合物およびその製造方法、並びに、タンパク質精製用担体およびそれを用いたタンパク質精製方法を提供することが可能となった。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
＜第１実施形態：リン酸アルミニウム化合物＞
・細孔モード径
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、Ｌｏｇ微分細孔容積分布（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）の細孔モード径が１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にあるという特定の細孔分布を有する非晶質のリン酸アルミニウム化合物である。
＜第１実施形態：リン酸アルミニウム化合物＞
・細孔モード径
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、Ｌｏｇ微分細孔容積分布（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）の細孔モード径が１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にあるという特定の細孔分布を有する非晶質のリン酸アルミニウム化合物である。
本実施形態において、Ｌｏｇ微分細孔容積分布の細孔モード径は、水銀圧入法により測定する。具体的には、水銀圧入法による測定結果に基づき、試料の細孔直径（Ｄ）を横軸に、Ｌｏｇ微分細孔容積（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）を縦軸にプロットした分布曲線を得る。縦軸のＬｏｇ微分細孔容積（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）は、測定点間の細孔容積の差分（差分細孔容積（ｄＶ））が、細孔直径（Ｄ）の差分の対数値（ｄｌｏｇＤ）で除された値である。このＬｏｇ微分細孔容積分布において、細孔直径が２０００ｎｍ以下の範囲に現れるピークのピークトップ（ｄＶ／ｄｌｏｇＤの最大値であり、最大頻度を表す。）に対応する細孔直径を細孔モード径と称する。
後述の比較例１および比較例２はそれぞれ、特許文献１の実施例１および２に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法をほぼ同様の条件で追試したものであるが、得られたリン酸アルミニウム化合物における細孔モード径はそれぞれ４２．９ｎｍ、４８．３ｎｍと小さい。本発明者等による鋭意研究により、特許文献１に開示された製造方法を用いて得られるリン酸アルミニウム化合物は、細孔モード径が小さいために、タンパク質に対する吸着力が強く、担体からのタンパク質の溶出に用いられる一般的な溶出剤では目的タンパク質を溶出できないため、高い回収率においてタンパク質を精製することが困難であることが見いだされた。
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、細孔直径が制御された特定の細孔分布を有するものであり、前述のとおり、Ｌｏｇ微分細孔容積分布（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）の細孔モード径が１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にあることを第一の特徴とする。リン酸アルミニウム化合物の細孔モード径が１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にあるとき、タンパク質などの被精製物に対する吸着力が適正化され、被精製物に対する吸着力と、溶出剤に対する溶出性の双方に優れたリン酸アルミニウム化合物が得られるため、高い回収率で目的被精製物を精製することができる。リン酸アルミニウム化合物の細孔モード径は、好ましくは２００ｎｍ〜３００ｎｍである。
・平均粒子径（Ｄ５０）
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、平均粒子径（Ｄ５０）が好ましくは５０μｍ〜８０μｍであり、より好ましくは５５μｍ〜７０μｍである。平均粒子径（Ｄ５０）は、粒子径と小粒子側からの積算頻度との関係を示す積算分布曲線において、積算頻度５０体積％に対する粒子直径（体積メジアン径）であり、本実施形態においてはレーザー回折散乱法により求められる。
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、平均粒子径（Ｄ５０）が好ましくは５０μｍ〜８０μｍであり、より好ましくは５５μｍ〜７０μｍである。平均粒子径（Ｄ５０）は、粒子径と小粒子側からの積算頻度との関係を示す積算分布曲線において、積算頻度５０体積％に対する粒子直径（体積メジアン径）であり、本実施形態においてはレーザー回折散乱法により求められる。
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物をタンパク質精製用担体として用いた後述するタンパク質精製方法においては、溶液中のタンパク質との接触によりタンパク質が吸着したリン酸アルミニウム化合物は、他の成分からの分離のために濾過される。リン酸アルミニウム化合物の平均粒子径（Ｄ５０）が上記範囲にある場合、タンパク質が吸着したリン酸アルミニウム化合物の濾過性が向上し、生産性も向上する。
・累積細孔容積、平均細孔直径、嵩密度、見かけ密度、気孔率、および骨格密度
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、タンパク質等の被精製物に対する吸着性をより良好にするなどの観点から、累積細孔容積が好ましくは１．５〜３．０ｍＬ／ｇ、より好ましくは２．０〜２．５ｍＬ／ｇであり、平均細孔直径が好ましくは１５０〜５００ｎｍ、より好ましくは２５０〜４００ｎｍであり、嵩密度が好ましくは０．２〜１．０ｇ／ｍＬ、より好ましくは０．３〜０．５ｇ／ｍＬであり、見かけ密度（真密度）が好ましくは０．３〜１．０ｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５〜０．７ｇ／ｍＬであり、気孔率が好ましくは３０〜７０％、より好ましくは４０〜５０％であり、骨格密度が好ましくは１．０〜３．０ｇ／ｍＬ、より好ましくは１．５〜２．５ｇ／ｍＬである。累積細孔容積、平均細孔直径、嵩密度、見かけ密度、気孔率、および骨格密度は、細孔モード径と同様、水銀圧入法によって測定することができる。
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、タンパク質等の被精製物に対する吸着性をより良好にするなどの観点から、累積細孔容積が好ましくは１．５〜３．０ｍＬ／ｇ、より好ましくは２．０〜２．５ｍＬ／ｇであり、平均細孔直径が好ましくは１５０〜５００ｎｍ、より好ましくは２５０〜４００ｎｍであり、嵩密度が好ましくは０．２〜１．０ｇ／ｍＬ、より好ましくは０．３〜０．５ｇ／ｍＬであり、見かけ密度（真密度）が好ましくは０．３〜１．０ｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５〜０．７ｇ／ｍＬであり、気孔率が好ましくは３０〜７０％、より好ましくは４０〜５０％であり、骨格密度が好ましくは１．０〜３．０ｇ／ｍＬ、より好ましくは１．５〜２．５ｇ／ｍＬである。累積細孔容積、平均細孔直径、嵩密度、見かけ密度、気孔率、および骨格密度は、細孔モード径と同様、水銀圧入法によって測定することができる。
・リン酸アルミニウム化合物の組成
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、後述するリン酸イオンを含む水溶液Ａと、硫酸イオン、アルミニウムイオンおよびカリウムイオンを含む水溶液Ｂとを用いた製造方法により製造されるため、リン酸アルミニウムだけでなく、硫黄とカリウムを更に含む。リン酸アルミニウム化合物が硫黄とカリウムを含んで構成されることでタンパク質等の被精製物に対する吸着性が向上し、精製用担体として有用な物質となる。
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、後述するリン酸イオンを含む水溶液Ａと、硫酸イオン、アルミニウムイオンおよびカリウムイオンを含む水溶液Ｂとを用いた製造方法により製造されるため、リン酸アルミニウムだけでなく、硫黄とカリウムを更に含む。リン酸アルミニウム化合物が硫黄とカリウムを含んで構成されることでタンパク質等の被精製物に対する吸着性が向上し、精製用担体として有用な物質となる。
リン酸アルミニウム化合物中の硫黄（硫黄原子）の含有率は特に限定されないが、タンパク質吸着性をより良好にするなどの観点から、好ましくは０．３〜５．０質量％であり、より好ましくは１．０〜２．０質量％である。
リン酸アルミニウム化合物中のカリウム（カリウム原子）の含有率は、タンパク質吸着性をより良好にするなどの観点から、好ましくは０．３〜５．０質量％であり、より好ましくは０．５〜２．０質量％である。
リン酸アルミニウム化合物は、更に他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、水分およびカルシウム等が挙げられる。
ただし、特許文献１に開示された製造方法では、水溶液Ｂとして上記イオンに加え更にマグネシウムイオンを必須成分として含有する水溶液が使用され、得られるリン酸アルミニウム化合物はマグネシウムを０．０１質量％以上の含有率において含有するが（特許文献１の請求項１、３、６等参照）、本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物はマグネシウムを実質的に含有しないことが好ましい。そのメカニズムは定かではないが、マグネシウムが存在すると本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物の精製能力に悪影響を及ぼすためである。
ここで「マグネシウムを実質的に含有しない」とは、リン酸アルミニウム化合物を製造する過程で不可避的に不純物として混入するマグネシウムを含有する場合まで除くものではないことを意味する。具体的には、本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、マグネシウムを含有しないか、含有する場合には０．０１質量％未満であることが好ましく、０．００３質量％以下であることがより好ましい。
リン酸アルミニウム化合物中のアルミニウムの含有率は、上述の他の成分を含むことを限度として特に限定されないが、タンパク質吸着性をより良好にするなどの観点から、好ましくは８〜３５質量％であり、より好ましくは１０〜１６質量％である。
リン酸アルミニウム化合物中のリンに対するアルミニウムのモル比（Ａｌ（ｍｏｌ）／Ｐ（ｍｏｌ））としては、好ましくは０．３〜１．５であり、より好ましくは０．５〜１．０である。
＜第２実施形態：リン酸アルミニウム化合物の製造方法＞
細孔モード径が１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にあり、特定の細孔分布を有する本実施形態のリン酸アルミニウム化合物は、リン酸イオンを含む水溶液Ａと、硫酸イオン、アルミニウムイオンおよびカリウムイオンを含む水溶液Ｂとを混合することを含むリン酸アルミニウム化合物の製造方法において、水溶液Ａ中のリン酸イオン濃度、および、水溶液Ｂ中のアルミニウムイオン濃度およびカリウムイオン濃度を高濃度に設定することにより得ることができる。
細孔モード径が１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にあり、特定の細孔分布を有する本実施形態のリン酸アルミニウム化合物は、リン酸イオンを含む水溶液Ａと、硫酸イオン、アルミニウムイオンおよびカリウムイオンを含む水溶液Ｂとを混合することを含むリン酸アルミニウム化合物の製造方法において、水溶液Ａ中のリン酸イオン濃度、および、水溶液Ｂ中のアルミニウムイオン濃度およびカリウムイオン濃度を高濃度に設定することにより得ることができる。
・水溶液Ａ
水溶液Ａは、リン酸イオンを含む。水溶液Ａは、リン酸含有化合物が溶解された水性溶液として調製することができる。リン酸含有化合物としては、リン酸、リン酸無水素塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等が挙げられる。
水溶液Ａは、リン酸イオンを含む。水溶液Ａは、リン酸含有化合物が溶解された水性溶液として調製することができる。リン酸含有化合物としては、リン酸、リン酸無水素塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等が挙げられる。
リン酸は、オルトリン酸である。リン酸無水素塩は、水素塩ではないリン酸塩であり、リン酸アンモニウム（（ＮＨ４）３ＰＯ４）、リン酸三ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、リン酸三カリウム（Ｋ３ＰＯ４）、ヒドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）等が挙げられる。リン酸一水素塩は、一水素塩のリン酸塩であり、リン酸水素二アンモニウム（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸一水素カルシウム（ＣａＨＰＯ４）等が挙げられる。リン酸二水素塩は、二水素塩のリン酸塩であり、リン酸二水素アンモニウム（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）等が挙げられる。
リン酸含有化合物は、無水和物であってもよいし、水和物であってもよい。また、水和物の水和数は特に限定されない。これらリン酸含有化合物は、一種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
上述のリン酸含有化合物の中でも、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好にするなどの観点から、好ましくはリン酸一水素塩が挙げられ、より好ましくはリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）が挙げられる。
水溶液Ａ中のリン酸イオン濃度は、細孔モード径を上記範囲に制御する観点から、水溶液Ａの調製に用いた上述のリン酸含有化合物を構成するリン酸イオンの総量として、０．６ｍｏｌ／Ｌ超であり、好ましくは０．７ｍｏｌ／Ｌ以上であり、より好ましくは０．８ｍｏｌ／Ｌ以上である。水溶液Ａ中のリン酸イオン濃度の上限値は、リン酸イオンの総量として、例えば１．５ｍｏｌ／Ｌ以下であってよい。
水溶液Ａの液性としては特に限定されないが、例えば塩基性溶液として調製することができる。塩基性溶液としての水溶液Ａは、上述のリン酸含有化合物を水に溶解させることで調製してもよいし、上述のリン酸化合物を水に溶解させるとともに、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどの金属水酸化物の１種又は複数種を用いてｐＨを調整することにより調製してもよいし、あらかじめ調製した上記金属水酸化物の塩基性水溶液に上述のリン酸化合物を溶解させることで調製してもよい。
水溶液Ａの具体的なｐＨ（２３℃、以下において同様）としては、好ましくは、後述の水溶液Ｂと混合して得られる混合物のｐＨが２．０〜４．０となるように、水溶液ＢのｐＨを考慮して決定することができる。具体的には、水溶液ＡのｐＨは、例えば７．５〜１０．５であってよく、８．５〜９．５であってよい。
リン酸含有化合物を溶解させる方法としては、特に限定されず、例えば、撹拌、振とう、超音波溶解等が挙げられる。また、リン酸含有化合物を溶解させるときの温度及び圧力の条件も特に限定されず、例えば、常温常圧下及び加温常圧下等の条件が挙げられる。
水溶液Ａは、調製された溶液をフィルターろ過したものであることが好ましい。用いるフィルターの孔径としては、例えば０．２〜３μｍであってよく、０．４５〜１μｍであってよい。
・水溶液Ｂ
水溶液Ｂは、アルミニウムイオン、硫酸イオン、およびカリウムイオンを含む。このように、リン酸アルミニウムの構成元素でないカリウムイオンを含む水溶液を用いることによって、得られるリン酸アルミニウム化合物を、特にタンパク質に対する優れた吸着作用を有するタンパク質精製用担体として有用な物質として得ることができる。
水溶液Ｂは、アルミニウムイオン、硫酸イオン、およびカリウムイオンを含む。このように、リン酸アルミニウムの構成元素でないカリウムイオンを含む水溶液を用いることによって、得られるリン酸アルミニウム化合物を、特にタンパク質に対する優れた吸着作用を有するタンパク質精製用担体として有用な物質として得ることができる。
水溶液Ｂは、アルミニウムイオン、硫酸イオンおよびカリウムイオンを含む１種または２種以上の塩が溶解された水溶液として調製することができる。当該塩としては、単塩であってもよいし複塩であってもよい。
水溶液Ｂを調製するための塩としては、アルミニウムイオン、硫酸イオンおよびカリウムイオンをそれぞれ単独で含む塩が複数種組み合わされてもよいし、複数種のイオンを含む塩が単独又は複数種組み合わされてもよい。水溶液Ｂを調製するための塩を２種以上用いる場合、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、いずれの塩も、硫酸イオンをアニオンとして有するものであることが好ましい。
アルミニウムイオンを含む塩としては、例えば、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、硫酸アルミニウム（Ａｌ２（ＳＯ４）３）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ３）、硝酸アルミニウム（Ａｌ（ＮＯ３）３）、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２）等が挙げられ、好ましくは、硫酸アルミニウム（Ａｌ２（ＳＯ４）３）、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２）が挙げられ、より好ましくは、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２）が挙げられる。
硫酸イオンを含む塩としては、例えば、上述の硫酸アルミニウム（Ａｌ２（ＳＯ４）３）、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２）に加え、硫酸カリウム等が挙げられ、より好ましくは、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２）が挙げられる。
カリウムイオンを含む塩としては、上述の硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２）、硫酸カリウムに加え、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硝酸カリウム（ＫＮＯ３）等が挙げられ、好ましくは、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２）、硫酸カリウムが挙げられ、より好ましくは、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２）が挙げられる。
上述の塩は、無水和物であってもよいし、水和物であってもよい。また、水和物の水和数は特に限定されない。
水溶液Ｂ中のアルミニウムイオン濃度は、細孔モード径を上記範囲に制御する観点から、水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するアルミニウムイオンの総量として、０．３ｍｏｌ／Ｌ超であり、好ましくは０．４ｍｏｌ／Ｌ以上であり、より好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ以上である。水溶液Ｂ中のアルミニウムイオン濃度の上限値は、アルミニウムイオンの総量として、例えば２．４ｍｏｌ／Ｌ以下であってよい。
また、水溶液Ｂにおけるアルミニウムイオンの量としては、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好にするなどの観点から、水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するアルミニウムイオンの総量の下限として、水溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオン１ｍｏｌ当たり、好ましくは０．１ｍｏｌ以上であり、より好ましくは０．２ｍｏｌ以上である。上限として、水溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオン１ｍｏｌ当たり、好ましくは０．５ｍｏｌ以下であり、より好ましくは０．３ｍｏｌ以下である。
水溶液Ｂ中のカリウムイオン濃度は、細孔モード径を上記範囲に制御する観点から、水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するカリウムイオンの総量の下限として、０．２ｍｏｌ／Ｌ超であり、好ましくは０．３ｍｏｌ／Ｌ以上であり、より好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ以上である。水溶液Ｂ中のカリウムイオン濃度の上限値は、カリウムイオンの総量として、例えば２．４ｍｏｌ／Ｌ以下であってよい。
水溶液Ｂ中の硫酸イオンの濃度としては、細孔モード径を上記範囲に制御する観点、及び／又は、水溶液Ａと反応させて効率的にリン酸アルミニウム化合物を得る観点、及び／又は、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成する硫酸イオンの総量の下限として、例えば１．０ｍｏｌ／Ｌ以上であり、好ましくは１．３ｍｏｌ／Ｌ以上であり、上限として、例えば４．８ｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは３．０ｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは２．０ｍｏｌ／Ｌ以下である。
水溶液Ｂの液性としては特に限定されないが、例えば酸性溶液として調製することができる。酸性溶液としての水溶液Ｂは、上述の塩を水に溶解させることで調製してもよいし、上述の塩を水に溶解させるとともに、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸等の鉱酸の１種又は複数種を用いてｐＨを調整することにより調製してもよいし、あらかじめ調製した上記鉱酸の酸性水溶液に上述の塩を溶解させることで調製してもよい。水溶液Ｂの具体的なｐＨとしては、好ましくは、前述の水溶液Ａと混合して得られる混合物のｐＨが２．０〜４．０となるように、水溶液ＡのｐＨを考慮して決定することができる。具体的には、水溶液ＢのｐＨは、例えば１．５〜４．０であってよく、２．０〜３．５であってよい。
上述の塩を溶解させる方法としては、特に限定されず、例えば、撹拌、振とう、超音波溶解等が挙げられる。また、上述の塩を溶解させるときの温度及び圧力の条件も特に限定されず、例えば、常温常圧下及び加温常圧下等の条件が挙げられる。
水溶液Ｂは、調製された溶液をフィルターろ過したものであることが好ましい。用いるフィルターの孔径としては、例えば０．２〜３μｍであってよく、０．４〜１μｍであってよい。
・混合
水溶液Ａ及び水溶液Ｂは、混合することで、リン酸アルミニウム化合物を生じる。リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好にするなどの観点から、好ましくは、水溶液Ａに対して水溶液Ｂを添加することで混合することができる。添加方法としては特に限定されず、一括添加、滴下添加、分割添加、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好にするなどの観点から、好ましくは、滴下添加、分割添加、及びそれらの組み合わせが挙げられ、より好ましくは滴下添加が挙げられる。
水溶液Ａ及び水溶液Ｂは、混合することで、リン酸アルミニウム化合物を生じる。リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好にするなどの観点から、好ましくは、水溶液Ａに対して水溶液Ｂを添加することで混合することができる。添加方法としては特に限定されず、一括添加、滴下添加、分割添加、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好にするなどの観点から、好ましくは、滴下添加、分割添加、及びそれらの組み合わせが挙げられ、より好ましくは滴下添加が挙げられる。
得られた水溶液Ａと水溶液Ｂとの混合物のｐＨは特に限定されないが、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好にするなどの観点から、好ましくは２．０〜４．０である。水溶液Ａと水溶液Ｂとの混合によって、リン酸アルミニウム化合物は、沈殿物またはゲルとして得ることができる。
・後処理
生成したリン酸アルミニウム化合物は、混合物からの分離、洗浄、乾燥等の後処理に供される。混合物からの分離、洗浄、乾燥の方法としては特に限定されない。混合物からの分離の方法としては、例えば、ろ過や遠心分離が挙げられる。分離されたリン酸アルミニウム化合物は、沈殿物またはゲルの状態で得ることができる。洗浄の方法としては、水洗、あるいは水溶液への懸濁および遠心分離が挙げられる。このような洗浄操作は、１回又は複数回行うことができる。洗浄されたリン酸アルミニウム化合物は、沈殿物またはゲルの状態で得ることができる。乾燥の方法としては、スプレードライヤー、棚式乾燥機を用いた方法等が挙げられる。なかでもスプレードライヤーによれば、リン酸アルミニウム化合物を、５０μｍ〜８０μｍの平均粒子径（Ｄ５０）を有する略球状に造粒することができ、後述のろ過性能力が向上するため好ましい。
生成したリン酸アルミニウム化合物は、混合物からの分離、洗浄、乾燥等の後処理に供される。混合物からの分離、洗浄、乾燥の方法としては特に限定されない。混合物からの分離の方法としては、例えば、ろ過や遠心分離が挙げられる。分離されたリン酸アルミニウム化合物は、沈殿物またはゲルの状態で得ることができる。洗浄の方法としては、水洗、あるいは水溶液への懸濁および遠心分離が挙げられる。このような洗浄操作は、１回又は複数回行うことができる。洗浄されたリン酸アルミニウム化合物は、沈殿物またはゲルの状態で得ることができる。乾燥の方法としては、スプレードライヤー、棚式乾燥機を用いた方法等が挙げられる。なかでもスプレードライヤーによれば、リン酸アルミニウム化合物を、５０μｍ〜８０μｍの平均粒子径（Ｄ５０）を有する略球状に造粒することができ、後述のろ過性能力が向上するため好ましい。
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、例えば固体触媒、触媒担体、吸着材、分離材などの材料として幅広い分野において好適に使用することができる。
＜第３実施形態：タンパク質精製用担体＞
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、タンパク質精製用担体として好適に用いられる。上述の通り、本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物はタンパク質に対する吸着力が適正化され、タンパク質に対する吸着力と、溶出剤に対する溶出性の双方に優れるため、高い回収率で目的タンパク質を精製することができる。
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、タンパク質精製用担体として好適に用いられる。上述の通り、本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物はタンパク質に対する吸着力が適正化され、タンパク質に対する吸着力と、溶出剤に対する溶出性の双方に優れるため、高い回収率で目的タンパク質を精製することができる。
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、例えば、無細胞系により合成したタンパク質、及び／又は、細菌、酵母、藻類、昆虫細胞、哺乳類細胞、及び動物培養細胞等を宿主として発現させたタンパク質の精製用担体として用いることができる。
タンパク質の種類としては特に限定されないが、例えば、医薬品用抗体タンパク質、ワクチン用抗原タンパク質等が挙げられる。
医薬品用抗体タンパク質としては、例えば、抗腫瘍抗体（例えば、トラスツズマブ、ベルツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、セツキシマブ、バニツムマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、ブレンツキシマブ）、免疫調節抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、トシリズマブ、オマリズマブ、エクリズマブ、バシリキシマブ、ナタリズマブ、モガムリズマブ、ニボルマブ）、抗インターロイキン抗体（例えば、ウステキヌマブ、カナキヌマブ、セクキヌマブ）、抗心血管系調節抗体（例えば、ベバシズマブ）、抗骨関連分子抗体（例えば、デノスマブ）、抗ウイルス抗体（例えば、バリビズマブ）等が挙げられる。
医薬品用抗体タンパク質としては、例えば、抗腫瘍抗体（例えば、トラスツズマブ、ベルツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、セツキシマブ、バニツムマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、ブレンツキシマブ）、免疫調節抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、トシリズマブ、オマリズマブ、エクリズマブ、バシリキシマブ、ナタリズマブ、モガムリズマブ、ニボルマブ）、抗インターロイキン抗体（例えば、ウステキヌマブ、カナキヌマブ、セクキヌマブ）、抗心血管系調節抗体（例えば、ベバシズマブ）、抗骨関連分子抗体（例えば、デノスマブ）、抗ウイルス抗体（例えば、バリビズマブ）等が挙げられる。
ワクチン用抗原タンパク質としては、例えば以下のワクチン向けのものが挙げられる。具体的には、インフルエンザワクチン、コレラワクチン、狂犬病ワクチン、ジフテリアワクチン、髄膜炎菌ワクチン、ダニ媒介性脳炎ワクチン、炭素菌ワクチン、腸チフスワクチン、肺炎球菌ワクチン、破傷風ワクチン、ヒトパピローマウイルスワクチン、百日咳ワクチン、ポリオワクチン、Ａ型肝炎ウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、コロナウイルスワクチン等が挙げられる。
その他医薬品等に用いられるタンパク質としては、例えばアルブミン、アンチトロンビン、インスリン類、インターフェロン類、インターロイキン、エリスロポエチン類、顆粒球コロニー刺激因子類、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、グルカゴン、血液凝固第VII因子、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、成長因子類、トロンビン、トロンボモジュリン、尿酸分解酵素、フィブリノゲン、フィブリン、副甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、リソソーム酵素、レプチン、ＤＮＡ分解酵素等が挙げられる。
また、その他研究用途に用いられるタンパク質としては、例えばＣＢＤタグ、ＣＢＰタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰタグ、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、ＭＢＰタグ、ｍｙｃタグ、ＲＦＰタグ、Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎタグが挙げられる。
＜第４実施形態：タンパク質の精製方法＞
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、上述の通り、タンパク質精製用担体として好適に用いることができる。この本実施形態に係るタンパク質精製用担体を用いたタンパク質の精製方法としては、公知の方法を用いることができる。
本実施形態に係るリン酸アルミニウム化合物は、上述の通り、タンパク質精製用担体として好適に用いることができる。この本実施形態に係るタンパク質精製用担体を用いたタンパク質の精製方法としては、公知の方法を用いることができる。
本実施形態に係るタンパク質精製用担体を用いたタンパク質精製方法は、一形態において、タンパク質を含有する溶液をタンパク質精製用担体に接触させて、上記タンパク質を上記タンパク質精製用担体に吸着させること、タンパク質が吸着した上記タンパク質精製用担体をカラム、クロスフローフィルターおよびデッドエンドフィルターのいずれかを用いた濾過により分離すること、および、分離された上記タンパク質精製用担から上記タンパク質を溶出剤で溶出することを含む。
本実施形態に係るタンパク質精製用担体はタンパク質に対する吸着力が適正化され、吸着力だけでなく溶出剤に対する溶出性にも優れるため、タンパク質精製方法においては溶出剤として汎用されているものを使用することができる。また、タンパク質精製方法が含む濾過工程では、市販のカラム、クロスフローフィルター又はデッドエンドフィルターを使用することができるため、本実施形態に係るタンパク質精製用担体を用いたタンパク質精製方法は簡便でありながらタンパク質の精製能力に優れている。
＜リン酸アルミニウム化合物の製造＞
実施例１
リン酸水素二ナトリウム１２水和物５６．４ｋｇに精製水を加えて撹拌し、６０℃に加温して溶解し、全体で１３５Ｌの水溶液（リン酸イオン濃度：１．２ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。この水溶液を孔径１μｍのフィルターでろ過し、リン酸水素二ナトリウム水溶液（水溶液Ａ）を得た。
実施例１
リン酸水素二ナトリウム１２水和物５６．４ｋｇに精製水を加えて撹拌し、６０℃に加温して溶解し、全体で１３５Ｌの水溶液（リン酸イオン濃度：１．２ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。この水溶液を孔径１μｍのフィルターでろ過し、リン酸水素二ナトリウム水溶液（水溶液Ａ）を得た。
次に硫酸カリウムアルミニウム１２水和物４４．８ｋｇに精製水を加えて撹拌し、６０℃に加温して溶解し、全体で１２３Ｌの水溶液（アルミニウムイオン濃度：０．７７ｍｏｌ／Ｌ、硫酸イオン濃度：１．５ｍｏｌ／Ｌ、カリウムイオン濃度：０．７７ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。この液を孔径１μｍのフィルターでろ過し、硫酸カリウムアルミニウム水溶液（水溶液Ｂ）を得た。
上記リン酸水素二ナトリウム水溶液（水溶液Ａ）を６０℃に維持し１５０ｒｐｍで撹拌しながら、上記硫酸カリウムアルミニウム水溶液（水溶液Ｂ）を１時間かけて滴下した。得られた混合物をフィルタープレスでろ過した。さらにろ過ケーキを、ろ液導電率が５ｍＳ／ｃｍになるまで精製水で水洗した。
得られたケーキを固形分率１０質量％になるよう懸濁し、スプレードライヤー（大川原化工機製ＯＵＤＬ‐１６）にて入口温度２５０℃、出口温度１００℃、アトマイザー回転数１１０００ｒｐｍの条件で乾燥・造粒し、リン酸アルミニウム化合物ａを得た。
実施例２
実施例１に示した製造方法に対し、リン酸水素二ナトリウム水溶液（水溶液Ａ）中のリン酸イオン濃度を変更し（リン酸イオン濃度：０．８２ｍｏｌ／Ｌ）、硫酸カリウムアルミニウム水溶液（水溶液Ｂ）中のアルミニウムイオン濃度、硫酸イオン濃度、およびカリウムイオン濃度を変更（アルミニウムイオン濃度：０．５２ｍｏｌ／Ｌ、硫酸イオン濃度：１．０ｍｏｌ／Ｌ、カリウムイオン濃度：０．５２ｍｏｌ／Ｌ）した以外は、実施例１と同様の方法でリン酸アルミニウム化合物ｂを得た。
実施例１に示した製造方法に対し、リン酸水素二ナトリウム水溶液（水溶液Ａ）中のリン酸イオン濃度を変更し（リン酸イオン濃度：０．８２ｍｏｌ／Ｌ）、硫酸カリウムアルミニウム水溶液（水溶液Ｂ）中のアルミニウムイオン濃度、硫酸イオン濃度、およびカリウムイオン濃度を変更（アルミニウムイオン濃度：０．５２ｍｏｌ／Ｌ、硫酸イオン濃度：１．０ｍｏｌ／Ｌ、カリウムイオン濃度：０．５２ｍｏｌ／Ｌ）した以外は、実施例１と同様の方法でリン酸アルミニウム化合物ｂを得た。
比較例１
リン酸水素二ナトリウム１２水和物３５．９ｇに水を加えて撹拌して溶解し、全体で１０００ｍＬの水溶液（リン酸イオン濃度：０．２５ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。この水溶液を孔径０．２２μｍのフィルターでろ過し、リン酸水素二ナトリウム水溶液（水溶液Ａ）を得た。
リン酸水素二ナトリウム１２水和物３５．９ｇに水を加えて撹拌して溶解し、全体で１０００ｍＬの水溶液（リン酸イオン濃度：０．２５ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。この水溶液を孔径０．２２μｍのフィルターでろ過し、リン酸水素二ナトリウム水溶液（水溶液Ａ）を得た。
次に硫酸カリウムアルミニウム１２水和物２８．４ｇ及び硫酸マグネシウム７水和物９．８６ｇに水を加えて撹拌して溶解し、全体で１０００ｍＬの水溶液（アルミニウムイオン濃度：０．０６ｍｏｌ／Ｌ、硫酸イオン濃度：０．２ｍｏｌ／Ｌ、カリウムイオン濃度：０．０６ｍｏｌ／Ｌ、マグネシウムイオン濃度：０．０８ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。この水溶液を孔径０．２２μｍのフィルターでろ過し、上記組成の水溶液（水溶液Ｂ）を得た。
上記リン酸水素二ナトリウム水溶液（水溶液Ａ）を７００ｒｐｍで撹拌しながら、上記組成の水溶液（水溶液Ｂ）を１時間かけて滴下した。得られた混合物を２０７０×ｇで１５分間遠心分離し、ゲル状の沈殿物を回収した。回収したゲル状物を０．９ｍａｓｓ／ｖ％生理食塩水に投入し、超音波発生装置を用いて懸濁させて洗浄した。その後、２０７０×ｇで１５分間遠心分離を行って、ゲル状物を回収した。ゲル状物の生理食塩水への懸濁及び遠心分離を同じ条件でもう１回行った。得られたゲル状物をトレーに広げて１晩、６０℃で乾燥させた。これによって、白色結晶である乾燥ゲルを得た。乾燥ゲルを、手作業で破砕・粉末化し、リン酸アルミニウム化合物ｃを得た。
比較例２
リン酸水素二ナトリウム１２水和物３５．９ｇに水を加えて撹拌して溶解し、全体で１０００ｍＬの水溶液（リン酸イオン濃度：０．２５ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。この水溶液を孔径０．２２μｍのフィルターでろ過し、リン酸水素二ナトリウム水溶液（水溶液Ａ）を得た。
次に硫酸カリウムアルミニウム１２水和物２８．４ｇ及び硫酸マグネシウム７水和物９．８６ｇに水を加えて撹拌して溶解し、全体で１０００ｍＬの水溶液（アルミニウムイオン濃度：０．０６ｍｏｌ／Ｌ、硫酸イオン濃度：０．２ｍｏｌ／Ｌ、カリウムイオン濃度：０．０６ｍｏｌ／Ｌ、マグネシウムイオン濃度：０．０８ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。この水溶液を孔径０．２２μｍのフィルターでろ過し、上記組成の水溶液（水溶液Ｂ）を得た。
リン酸水素二ナトリウム１２水和物３５．９ｇに水を加えて撹拌して溶解し、全体で１０００ｍＬの水溶液（リン酸イオン濃度：０．２５ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。この水溶液を孔径０．２２μｍのフィルターでろ過し、リン酸水素二ナトリウム水溶液（水溶液Ａ）を得た。
次に硫酸カリウムアルミニウム１２水和物２８．４ｇ及び硫酸マグネシウム７水和物９．８６ｇに水を加えて撹拌して溶解し、全体で１０００ｍＬの水溶液（アルミニウムイオン濃度：０．０６ｍｏｌ／Ｌ、硫酸イオン濃度：０．２ｍｏｌ／Ｌ、カリウムイオン濃度：０．０６ｍｏｌ／Ｌ、マグネシウムイオン濃度：０．０８ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。この水溶液を孔径０．２２μｍのフィルターでろ過し、上記組成の水溶液（水溶液Ｂ）を得た。
上記リン酸水素二ナトリウム水溶液（水溶液Ａ）を２００ｒｐｍで撹拌しながら、約２秒で上記組成の水溶液（水溶液Ｂ）を添加した。得られた混合物を２０７０×ｇで１５分間遠心分離し、ゲル状の沈殿物を回収した。回収したゲル状物を０．９ｍａｓｓ／ｖ％生理食塩水に投入し、超音波発生装置を用いて懸濁させて洗浄し、その後、２０７０×ｇで１５分間遠心分離を行って、ゲル状物を回収した。ゲル状物の生理食塩水への懸濁及び遠心分離を同じ条件でもう１回行った。得られたゲル状物をトレーに広げて１晩、６０℃で乾燥させた。これによって、白色結晶である乾燥ゲルを得た。乾燥ゲルを、手作業で破砕・粉末化し、リン酸アルミニウム化合物ｄを得た。
なお、上掲の比較例１および２はそれぞれ、特許文献１（日本国特許第６６７７４２８号）の実施例１および２に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法をほぼ同様の条件で追試したものである。
実施例１、２、および比較例１、２で得られたリン酸アルミニウム化合物ａ〜ｄについて、以下に示す方法で物性を測定し、性能を評価した。実施例１及び比較例１については外観も観察した。
＜水銀圧入法による細孔特性＞
実施例１、２および比較例１、２で得られたリン酸アルミニウム化合物ａ〜ｄを、水銀圧入法による細孔特性の測定サンプルとして用いた。水銀圧入法により、細孔直径約３．６ｎｍ〜２０００００ｎｍの範囲について各サンプルの細孔分布を測定し、細孔モード径、累積細孔容積、平均細孔直径、嵩密度、見かけ密度、気孔率、および骨格密度を得た。装置には、Ｐｏｒｅｍａｓｔｅｒ６０ＧＴ（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ社製）を使用した。
実施例１、２および比較例１、２で得られたリン酸アルミニウム化合物ａ〜ｄを、水銀圧入法による細孔特性の測定サンプルとして用いた。水銀圧入法により、細孔直径約３．６ｎｍ〜２０００００ｎｍの範囲について各サンプルの細孔分布を測定し、細孔モード径、累積細孔容積、平均細孔直径、嵩密度、見かけ密度、気孔率、および骨格密度を得た。装置には、Ｐｏｒｅｍａｓｔｅｒ６０ＧＴ（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ社製）を使用した。
［細孔モード径］
各サンプル０．１〜０．３ｇを正確に量り、測定セルに封入し、水銀の接触角を１４０°、水銀の表面張力を４８０ｄｙｎ／ｃｍとして、水銀圧入法により得られた各サンプルの測定結果に基づき、横軸を細孔直径（Ｄ）（ｎｍ）、縦軸をＬｏｇ微分細孔容積分布（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）（ｃｃ／ｇ）としてプロットしたＬｏｇ微分細孔容積分布を図１に示す。図１に示されるＬｏｇ微分細孔容積分布において、細孔直径（Ｄ）が３．６ｎｍ〜２０００ｎｍ以下の範囲に現れる第１ピークのピークトップ（ｄＶ／ｄｌｏｇＤの最大値）に対応するモード径を、リン酸アルミニウム化合物の細孔モード径として求めた。結果を後掲の表２に示す。
各サンプル０．１〜０．３ｇを正確に量り、測定セルに封入し、水銀の接触角を１４０°、水銀の表面張力を４８０ｄｙｎ／ｃｍとして、水銀圧入法により得られた各サンプルの測定結果に基づき、横軸を細孔直径（Ｄ）（ｎｍ）、縦軸をＬｏｇ微分細孔容積分布（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）（ｃｃ／ｇ）としてプロットしたＬｏｇ微分細孔容積分布を図１に示す。図１に示されるＬｏｇ微分細孔容積分布において、細孔直径（Ｄ）が３．６ｎｍ〜２０００ｎｍ以下の範囲に現れる第１ピークのピークトップ（ｄＶ／ｄｌｏｇＤの最大値）に対応するモード径を、リン酸アルミニウム化合物の細孔モード径として求めた。結果を後掲の表２に示す。
なお、図１に示す細Ｌｏｇ微分細孔容積分布（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）において、細孔直径Ｄが２０００ｎｍ超〜２０００００ｎｍの範囲に現れる第２ピークのピークトップに対応するモード径は、粒子間の隙間の空隙モード径である。
各リン酸アルミニウム化合物の細孔モード径、累積細孔容積、平均細孔直径、嵩密度、見かけ密度、気孔率および骨格密度の測定結果を後掲の表２に示す。
＜平均粒子径（Ｄ５０）＞
各リン酸アルミニウム化合物を、レーザー回折法による平均粒子径（Ｄ５０）の測定サンプルとして用いた。各サンプルをレーザー回折式粒度分布計（ＭＴ３３００ＥＸＩＩ：Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ社製）にＤＶ値０．１〜０．６になるように投入し、流速３２．５ｍＬ／秒で１０秒間循環させた後、測定時間２０秒、測定回数２回の条件で、精製水中で測定を行い、２回測定したＤ５０値の平均を平均粒子径として算出した。平均粒子径（Ｄ５０）の測定結果を後掲の表２に示す。
各リン酸アルミニウム化合物を、レーザー回折法による平均粒子径（Ｄ５０）の測定サンプルとして用いた。各サンプルをレーザー回折式粒度分布計（ＭＴ３３００ＥＸＩＩ：Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ社製）にＤＶ値０．１〜０．６になるように投入し、流速３２．５ｍＬ／秒で１０秒間循環させた後、測定時間２０秒、測定回数２回の条件で、精製水中で測定を行い、２回測定したＤ５０値の平均を平均粒子径として算出した。平均粒子径（Ｄ５０）の測定結果を後掲の表２に示す。
＜粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）＞
実施例１のリン酸アルミニウム化合物ａをメノウ乳鉢で粉砕した後、試料セル（ガラス製）に充填し、以下の測定条件で粉末Ｘ線回折スペクトルを測定した。得られた粉末Ｘ線回折スペクトルを表すグラフを図２に示す。図２からリン酸アルミニウム化合物ａは非晶質と判断される。
実施例１のリン酸アルミニウム化合物ａをメノウ乳鉢で粉砕した後、試料セル（ガラス製）に充填し、以下の測定条件で粉末Ｘ線回折スペクトルを測定した。得られた粉末Ｘ線回折スペクトルを表すグラフを図２に示す。図２からリン酸アルミニウム化合物ａは非晶質と判断される。
［測定条件］
Ｘ線管球 ：ＣｕＫα
光学系 ：集中法
管電圧・管電流 ：４０ｋＶ−３０ｍＡ
スキャン範囲 ：５−９０ｄｅｇ
スキャンステップ：０．０２ｄｅｇ
スキャンスピード：４０ｄｅｇ／分
検出器 ：１次元半導体検出器
測定装置：Ｘ線回折分析装置 ＳｍａｒｔＬａｂ（Ｒｉｇａｋｕ製）
Ｘ線管球 ：ＣｕＫα
光学系 ：集中法
管電圧・管電流 ：４０ｋＶ−３０ｍＡ
スキャン範囲 ：５−９０ｄｅｇ
スキャンステップ：０．０２ｄｅｇ
スキャンスピード：４０ｄｅｇ／分
検出器 ：１次元半導体検出器
測定装置：Ｘ線回折分析装置 ＳｍａｒｔＬａｂ（Ｒｉｇａｋｕ製）
＜電子顕微鏡観察＞
実施例１のリン酸アルミニウム化合物ａ及び比較例１のリン酸アルミニウムｃについて、電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）法により外観を観察した。各試料を採取し、１０００倍視野をＦＥ−ＳＥＭにて観察及び撮影した。装置には、ＦＥ−ＳＥＭ ＳＵ８２２０（日立ハイテク製）を使用した。実施例１のリン酸アルミニウム化合物ａのＳＥＭ写真を図３に、比較例１のリン酸アルミニウム化合物ｃのＳＥＭ写真を図４に示す。
実施例１のリン酸アルミニウム化合物ａ及び比較例１のリン酸アルミニウムｃについて、電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）法により外観を観察した。各試料を採取し、１０００倍視野をＦＥ−ＳＥＭにて観察及び撮影した。装置には、ＦＥ−ＳＥＭ ＳＵ８２２０（日立ハイテク製）を使用した。実施例１のリン酸アルミニウム化合物ａのＳＥＭ写真を図３に、比較例１のリン酸アルミニウム化合物ｃのＳＥＭ写真を図４に示す。
図３に示される通り、実施例１のリン酸アルミニウム化合物ａの粒子形状は略球形であるのに対し、図４に示される通り、粉砕物である比較例１のリン酸アルミニウム化合物ｃの粒子形状は不定形（非球形）であることが確認された。
＜元素分析＞
実施例１のリン酸アルミニウム化合物ａ、比較例１のリン酸アルミニウムｃおよび比較例２のリン酸アルミニウムｄについて、酸分解／ＩＣＰ−ＯＥＳ法により元素分析を行った。装置にはSPECTRO ARCOS（SPECTRO Analytical Instruments社製）を使用した。測定結果を表１に示す。
実施例１のリン酸アルミニウム化合物ａ、比較例１のリン酸アルミニウムｃおよび比較例２のリン酸アルミニウムｄについて、酸分解／ＩＣＰ−ＯＥＳ法により元素分析を行った。装置にはSPECTRO ARCOS（SPECTRO Analytical Instruments社製）を使用した。測定結果を表１に示す。
試験例１ ［ＧＦＰタンパク質の精製能力評価］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ Ｋ−１２株：ＢＩＯ‐ＲＡＤ社製）にＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現させた後、ＢａｃｔＹｅａｓｔ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＡＴＴＯ社製）に懸濁して菌体を溶解し、遠心上清を回収した。これによって、粗タンパク質液を得た。この粗タンパク質液５０μＬと、担体として実施例１、２および比較例１、２で作製した各リン酸アルミニウム化合物６．５ｍｇを混合して、タンパク質を吸着させた。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ Ｋ−１２株：ＢＩＯ‐ＲＡＤ社製）にＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現させた後、ＢａｃｔＹｅａｓｔ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＡＴＴＯ社製）に懸濁して菌体を溶解し、遠心上清を回収した。これによって、粗タンパク質液を得た。この粗タンパク質液５０μＬと、担体として実施例１、２および比較例１、２で作製した各リン酸アルミニウム化合物６．５ｍｇを混合して、タンパク質を吸着させた。
各担体を懸濁したタンパク質液を２０００×ｇで５分の遠心操作で担体と上清に分離し、上清を取り除いた。各担体を、洗浄液（ＢａｃｔＹｅａｓｔ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）を５０μＬずつ用いて３回洗浄した。その後、各担体を、溶出液（８０ｍＭ ＥＤＴＡ−２ＮＡを添加したＢａｃｔＹｅａｓｔ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）を５０μＬずつ用いて２回洗浄し、その液を回収し、溶出画分とした。粗タンパク質液及び回収した溶出画分のタンパク質濃度を、ＢＣＡ法により定量した。さらに、粗タンパク質液及び回収した溶出画分を、同量の２×サンプルバッファーと混和し、９５℃で３分ボイリングした。この液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した。ゲルとしては、アクリルアミドの濃度が均一なゲル（１５％ゲル）を用い、粗タンパク質液４μＬおよび溶出画分８μＬをそれぞれアプライした。
得られたゲルをＣＢＢ染色液で染色した後脱色し、デンシトメトリーによって各レーンのＧＦＰ濃度を算出し、以下の計算式によってＧＦＰの回収率を計算した。結果を表２に示す。
ＧＦＰの回収率（％）＝［溶出画分のＧＦＰ濃度×２／粗タンパク質液のＧＦＰ濃度］×１００
ＧＦＰの回収率（％）＝［溶出画分のＧＦＰ濃度×２／粗タンパク質液のＧＦＰ濃度］×１００
試験例２ ［ろ過性評価］
実施例１および２で作製した各リン酸アルミニウム化合物５gを、５００ｍＬの水に懸濁した。メンブレンフィルター（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製Ｍｉｘｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｅｓｔｅｒ φ４７ｍｍ 孔径０．２μｍ）をフィルターホルダーにセットし、吸引ろ過鐘とアスピレーター（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製 ＰＳＡ１５２ＡＢ）を用いて懸濁液を吸引ろ過し、全量をろ過するのにかかった時間を記録した。結果を表２に示す。
実施例１および２で作製した各リン酸アルミニウム化合物５gを、５００ｍＬの水に懸濁した。メンブレンフィルター（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製Ｍｉｘｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｅｓｔｅｒ φ４７ｍｍ 孔径０．２μｍ）をフィルターホルダーにセットし、吸引ろ過鐘とアスピレーター（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製 ＰＳＡ１５２ＡＢ）を用いて懸濁液を吸引ろ過し、全量をろ過するのにかかった時間を記録した。結果を表２に示す。
表２から、例えば、細孔モード径が１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にある実施例１及び２は、細孔モード径が１００ｎｍ未満である比較例１及び２に比べ、ＧＰＦの回収率（％）が高いことがわかる。
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々に変形することが可能である。また、各実施形態は適宜組み合わせて実施してもよく、その場合組み合わせた効果が得られる。更に、上記実施形態には種々の発明が含まれており、開示される複数の構成要件から選択された組み合わせにより種々の発明が抽出され得る。例えば、実施形態に示される全構成要件からいくつかの構成要件が削除されても、課題が解決でき、効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。
Claims (12)
- 水銀圧入法により得られるＬｏｇ微分細孔容積分布（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）において、細孔直径（Ｄ）が２０００ｎｍ以下の範囲に現れるピークに対応する細孔モード径が１００ｎｍ〜２００ｎｍの範囲にあるリン酸アルミニウム化合物。
- 平均粒子径（Ｄ５０）が５０μｍ〜８０μｍの範囲にある、請求項１に記載のリン酸アルミニウム化合物。
- 平均粒子径（Ｄ５０）が５５μｍ〜７０μｍの範囲にある、請求項１に記載のリン酸アルミニウム化合物。
- 非晶質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
- リン酸アルミニウム化合物を含むタンパク質精製用担体であって、前記リン酸アルミニウム化合物は、水銀圧入法により得られるＬｏｇ微分細孔容積分布（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）において、細孔直径（Ｄ）が２０００ｎｍ以下の範囲に現れるピークに対応する細孔モード径が１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にあるリン酸アルミニウム化合物であるタンパク質精製用担体。
- 前記リン酸アルミニウム化合物における前記細孔モード径が１００ｎｍ〜２００ｎｍの範囲にある、請求項５に記載のタンパク質精製用担体。
- 前記リン酸アルミニウム化合物における平均粒子径（Ｄ５０）が５０μｍ〜８０μｍの範囲にある、請求項５又は６に記載のタンパク質精製用担体。
- 前記リン酸アルミニウム化合物における平均粒子径（Ｄ５０）が５５μｍ〜７０μｍの範囲にある、請求項５又は６に記載のタンパク質精製用担体。
- 前記リン酸アルミニウム化合物は非晶質である、請求項５〜８のいずれか１項に記載のタンパク質精製用担体。
- タンパク質が吸着した請求項５〜９のいずれか１項に記載のタンパク質精製用担体を含む溶液をカラム、クロスフローフィルターまたはデッドエンドフィルターを用いて濾過する工程を含むタンパク質精製方法において用いられるタンパク質精製用担体。
- タンパク質を含む溶液を請求項５〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質精製用担体に接触させて、前記タンパク質を前記タンパク質精製用担体に吸着させること、
タンパク質が吸着した前記タンパク質精製用担体をカラム、クロスフローフィルターおよびデッドエンドフィルターのいずれかを用いた濾過により分離すること、および
分離された前記タンパク質精製用担体から前記タンパク質を溶出剤で溶出すること
を含むタンパク質精製方法。 - 水銀圧入法により得られるＬｏｇ微分細孔容積分布（ｄＶ／ｄｌｏｇＤ）において、細孔直径（Ｄ）が２０００ｎｍ以下の範囲に現れるピークに対応する細孔モード径が１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲にあるリン酸アルミニウム化合物の製造方法であって、
リン酸イオンを含む水溶液Ａと、アルミニウムイオン、硫酸イオンおよびカリウムイオンを含む水溶液Ｂとを混合し、リン酸アルミニウム化合物を含む混合液を得ることを含み、前記水溶液Ａ中の前記リン酸イオンの濃度が０．６ｍｏｌ／Ｌ超であり、前記水溶液Ｂ中の前記アルミニウムイオンの濃度が０．３ｍｏｌ／Ｌ超であり、前記カリウムイオンの濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌ超である製造方法。
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