JP5467432B2 - 板状ヒドロキシアパタイト単結晶の製造方法 - Google Patents
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Description
c面配向したHApは、前記a面配向した繊維状HApとは異なり、酸性タンパク質よりも塩基性タンパク質をより多く吸着する吸着材として期待されている。
しかしながら、前記特許文献1に開示された従来技術で得られた板状HApは、X線回折等で結晶構造を調べた結果、多結晶のHApが主体であることが判明した。
また、前記非特許文献2に開示された従来技術で得られた板状HApについても、単結晶に近い構造を有しているものの、多結晶パターンが混在していることが判明した。
このように、従来技術においては、c面配向した板状HAp単結晶を効率的に得ることができなかった。
本発明により得られる板状HAp単結晶は、c面配向した板状HAp単結晶であり、これを用いて塩基性タンパク質などの生理活性物質の分析、あるいは精製・単離を行う場合に、多結晶HApに比べて高い吸着性能及び分離性能が得られる。
・Ca2+イオン、PO4 3−イオン、尿素及びウレアーゼを含む酸性水溶液を調製する工程(1)と、
・次いで、該水溶液を容器に入れ、該酸性水溶液と外気とが気液接触した状態で保持し、ウレアーゼによる尿素の加水分解による水溶液のpH上昇にしたがって、HApの結晶核を生成させ、さらに該結晶核をa軸及びb軸方向に成長させる工程(2)と、
・次いで前記水溶液に浮上している析出物を水溶液から分離採取する工程(3)と、
・次いで前記析出物に水熱処理を施して板状HAp単結晶を得る工程(4)とを備えている。
また、前記酸性水溶液中のCa2+イオン濃度及びPO4 3−イオン濃度は特に限定されないが、綺麗な板状HAp単結晶を合成するには、Ca2+イオンが0.0025〜0.0100mol・dm−3の範囲、PO4 3−イオンが0.0015〜0.0060mol・dm−3の範囲とすることが好ましい。
容器から分離採取した析出物は、精製水等で十分に洗浄し、乾燥される。
(1−1)混合溶液の調製方法
まず、炭酸カルシウムとオルトリン酸及び尿素からなる懸濁液(1000cm3)を調製し、2時間撹拌した。この混合懸濁液に、硝酸(1.0mol・dm−3)をpH3.00になるように添加した。更に1時間撹拌し、ウレアーゼを添加した。
出発材料の炭酸カルシウム、オルトリン酸(H3PO4)、尿素およびウレアーゼ(140unit・mg−1)の配合割合を表1に示す。なお、ウレアーゼの添加量は、0.1質量%水溶液の添加量で表す。
前記(1−1)で得られた混合溶液(1000cm3)を外径12.3cmのガラスシャーレ8個(各シャーレに125cm3)に入れ密封し、インキュベーターの中で50℃、96時間の反応を行った。反応後、吸引ろ過器で液面上に浮かぶ生成物だけを吸引ろ過・洗浄し、110℃、24時間乾燥し、合成粉体を得た。ここでの合成の概略を図1に示す。
水熱処理では反応器にフッ素樹脂製内筒を有するオートクレーブ(耐圧硝子工業社製TVS−1型(容積50cm3))を用いた。前記(1−2)で得られた合成粉末0.1gを50cm3の純水中に加え、120℃、2.5時間加熱して水熱処理を行った。その後、処理物をろ過・洗浄して110℃、48時間で乾燥した。
(2−1)気液界面の析出物のキャラクタリゼーション
(2−1−1)Ca2+,PO4 3−濃度変動(表1中のNo.1−No.4)
尿素の濃度を1.0mol・dm−3、添加する0.1質量%ウレアーゼ水溶液の体積を当量である2.734cm3に固定し、CaCO3,H3PO4の濃度をパラメーターとして変動させ、50℃,96時間で加熱した。液面の析出物とシャーレ底部の生成物を分けて、それぞれろ過・乾燥を行った。
なお、以下の記載において、X線回折法(又は装置)はXRDと略記し、走査型電子顕微鏡法(又は装置)はSEMと略記し、透過型電子顕微鏡法(又は装置)はTEMと略記し、エネルギー分散型X線分析法(又は装置)はEDXと略記し、赤外吸光法(又は装置)はFT-IRと略記する。
水熱処理後のXRDパターンを図4に示す。すべての粉体は水熱処理により、OCPが消滅され、HApの単一相に転化した。Ca2+,PO4 3−濃度が低いほどHApのc面に相当する26°((002)面)の特徴ピークが強くなる傾向が見られる。また、Ca2+,PO4 3−高濃度の場合(No.3,No.4)、HApのa面に相当する32°((300)面)の特徴ピークも発達していることが検出された。
前記(2−1−1)の実験結果より、No.2のCaCO3,H3PO4の濃度条件では効率よく高い配向性を持つ板状HApを合成したため、ここではCaCO3,H3PO4の濃度およびウレアーゼの添加量を、それぞれ0.0050mol・dm−3,0.0030mol・dm−3および2.734cm3に固定し、尿素の濃度をパラメーターとして変動させ、50℃、96時間で加熱した。なお、ウレアーゼはNo.2の実験条件が当量添加となり、No.5では、ウレアーゼが2倍過剰、No.6及びNo.7では、それぞれ2/3倍および0.5倍過剰となる。液面の析出物とシャーレ底部の生成物を分けて、濾過・乾燥を行った。
水熱処理後のXRDパターンを図8に示す。すべての粉体は水熱処理により、OCPが消滅され、HApのc面に相当する26°((002)面)の特徴ピークが強くなるHApの単一相に転化した。
表3には各条件における収量および収率を示す。収量および析出物形態から考えると、1.0mol・dm−3(No.2)が尿素の最適値であると考えられる。
前記(2−1−1)及び前記(2−1−2)の実験結果より、Ca2+,PO4 3−および尿素濃度をそれぞれ最適値に固定し、ウレアーゼの添加量をパラメーターとして変動させ、50℃、96時間で加熱した。液面の析出物とシャーレ底部の生成物に分けて、濾過・乾燥を行った。
図10に生成物のXRDパターンを示す。アパタイトに特徴的なピークのほか、4°付近のOCPの特徴ピークも現れたため、すべての生成物はHApとOCPの混合相であることが確認できた。また、アパタイトの26°((002)面)および53°((004)面)の特徴ピークが発達したことにより、生成したアパタイトはc面が多く露出していることが推察できる。
前記(2−1−1)、(2−1−2)及び(2−1−3)の実験結果より、Ca2+,PO4 3−、尿素濃度およびウレアーゼの添加量の最適比は、CaCO3 0.0050mol・dm−3,H3PO4 0.0030mol・dm−3、尿素 1.0mol・dm−3、ウレアーゼ 2.734cm3となる。ここでは、各試薬の濃度および添加量の比をこのように固定し、溶液の総濃度を変動させて実験を行った。液面の析出物とシャーレ底部の生成物を分けて、濾過・乾燥を行った。
前記(2−1−1)〜(2−1−4)の実験結果より、サンプルNo.2の合成条件、すなわち、CaCO3 0.0050mol・dm−3,H3PO4 0.0030mol・dm−3および尿素1.0mol・dm−3に、さらに0.1質量%ウレアーゼ水溶液を 2.734cm3添加した合成条件が最適であることが分かった。この濃度条件の生成物に対し、さらにTEM,EDX、FT-IRなどの装置を用いてキャラクタリゼーションを行った。
化学量論組成のCa/P比である1.67より低い値を示している。以上の結果を総合し、このNo.2の条件で合成したHApは、凝集した板状HAp単一相の単結晶であり、Ca/P=1.59の炭酸を含有するカルシウム欠損型ヒドロキシアパタイトである。
図1に示すように、シャーレに各材料を入れて50℃のインキュベーターに静置しておくと、反応の進行に伴い、図22に示すように気液界面から白い膜状の物質が析出してくる。この析出物の構造・組成の経時変化について調べた。
なお、本プロセスでは、反応がガラスシャーレ中において進行するため、溶液中のpHの経時変化を測定することが困難であるが、図26に示すように、フラスコを用いて溶液中のpH変化を模擬した。
サンプルNo.2の析出物を水熱処理してから、600℃、700℃、800℃、900℃、1000℃、1100℃および1200℃まで加熱し、それぞれの結晶相、形態を調べた。
表1に示したすべての濃度条件下で生成した、シャーレの下層の生成物は、配向性を持たない、OCPとHApの混合相であった。以下には、サンプルNo.2の下層生成物のキャラクタリゼーションの結果を示す。
本実施例では、混合溶液の気液界面からOCPを含有する膜状のHApを析出・成長させ、次いで、該析出物に水熱処理を行って、単一相の板状HApを得た。アパタイトの理論密度は3.16g・cm−3であるため、通常では液面にHApが安定して存在することはあり得ない。以下、本プロセスの特異的なメカニズムについて検討した。
ステップ2:図41に示すように、HApの過飽和度を越えると、HApの結晶核が生成し、気液界面付近のCa2+,PO4 3−およびOH−イオンの濃度が低くなるため、溶液中のイオンが気液界面に移動して補充する。
ステップ3:図42に示すように、液面と溶液中のCa2+,PO4 3−およびOH−イオンの濃度差が生じ、結晶のc軸方向よりa,b軸方向にはCa2+,PO4 3−およびOH−イオンが大量に存在するため(pH値も高い)、析出したアパタイトはa,b軸に沿ってc面が優先的に成長していく。
ステップ4:図43に示すように、気液界面から析出したHApの(−)に帯電するc面が溶液中のHAp核の(+)に帯電するa面を静電的に吸引し、凝集体(各結晶の間に新しい結合が生成する可能性がある)となる。
ステップ5:図44に示すように、界面の底部に存在する微細なHAp結晶は、溶液中のCa2+,PO4 3−およびOH−イオンを取り込み、大きく成長する。ここでは、静電的な反発および立体空間の障害などの影響により、a軸方向はc軸方向より著しく成長していくと考えられる。
ステップ6:気液界面では、図45に示すような小さい凝集体が多数生成し、互いにさらに凝集が起き、船のように気液界面で安定して浮かぶことができるようになる。
Claims (2)
- Ca2+イオン、PO4 3−イオン、尿素及びウレアーゼを含む酸性水溶液を容器に入れ、該酸性水溶液と外気とが気液接触した状態で保持し、ウレアーゼによる尿素の加水分解による水溶液のpH上昇にしたがって、ヒドロキシアパタイトの結晶核を生成させ、さらに該結晶核をa軸及びb軸方向に成長させ、次いで前記水溶液に浮上している析出物を水溶液から分離採取し、次いで前記析出物に水熱処理を施して板状ヒドロキシアパタイト単結晶を得ることを特徴とする板状ヒドロキシアパタイト単結晶の製造方法。
- 前記酸性水溶液中のCa2+イオンの濃度を0.0025〜0.0100mol・dm−3の範囲とし、PO4 3−イオンの濃度を0.0015〜0.0060mol・dm−3の範囲とし、尿素の濃度を0.5〜2.0mol・dm−3の範囲とし、ウレアーゼの濃度を前記尿素1当量に対して0.2倍当量から3倍当量の範囲とすることを特徴とする請求項1に記載の板状ヒドロキシアパタイト単結晶の製造方法。
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