CN109911874B

CN109911874B - 一种仿牙釉质有序结构的羟基磷灰石的制备方法

Info

Publication number: CN109911874B
Application number: CN201910270812.0A
Authority: CN
Inventors: 朱沛志; 孔维腾; 赵科
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: CN109911874A

Abstract

本发明涉及生物医药材料技术领域内一种仿牙釉质有序结构的羟基磷灰石的制备方法具体过程为：将钙盐和氢氧化钠溶液在搅拌条件下滴入油酸、乙醇和水的混合溶液中，反应4~12 h后，用水和乙醇将生成的不溶物洗净，得油酸钙固体；再将油酸钙固体真空下干燥除去水分，再在160~180℃的鼓风干燥箱中除去结晶水后降温再结晶，然后将再结晶的油酸钙在70~95℃水浴条件下，加入相应量的水并缓慢滴加磷酸溶液，反应12~24 h后，得到磷酸钙盐固体，用乙醇和水洗涤干净，干燥得磷酸钙盐固体；最后向磷酸钙盐固体中加入浓氢氧化钠溶液，80~95℃水浴4~10 h后静置陈化，用乙醇和水洗涤，干燥得到生物相容性好有序排列编织状的纳米级羟基磷灰石，为牙釉质的仿生合成提供了新的方向。

Description

一种仿牙釉质有序结构的羟基磷灰石的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药材料技术领域，特别涉及一种羟基磷灰石的制备方法，具体涉及一种编织状有序排列的羟基磷灰石的制备方法。

背景技术

羟基磷灰石（hydroxyapatite, HA），化学式为Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂，是脊椎动物骨骼和牙齿的主要成分。例如，人骨中HAP的质量分数约为60％，人牙的HAP质量分数约为95％。不仅具有较好的稳定性、生物活性和生物相容性，还具有良好的骨传导作用及诱导骨形成的能力，可生物降解，是人体骨损伤时性能优良且近于理想的骨修复及替代材料（Li Z Y,Wen T, Su Y L. et. al. Hollow hydroxyapatite spheres fabrication with three-dimensional hydrogel template[J]. The Royal Society of Chemistry, 2014, 16(20): 4202-4209）。现阶段，用油酸钙合成羟基磷灰石的研究中，多是合成的羟基磷灰石纳米线，在生物牙齿和骨组织修复方面的应用价值较低。

现有技术中，对牙釉质微观结构有一定研究，其微观结构与牙釉质的微观结构还有一定差距。可以用来制备牙膏，进入体内后，钙和磷会游离出材料表面，进而保护牙齿，但这只起到预防的作用，对于修复牙齿效果甚微。纳米级HAP颗粒对一些肿瘤细胞的生长具有抑制作用，但对正常细胞没有负面影响。因此，纳米HAP的制备和医学应用研究越来越受到研究者的关注。

发明内容

本发明目的是提供一种仿牙釉质有序结构、生物相容性良好的羟基磷灰石的制备方法，以制备编织状、有序排列的羟基磷灰石，用于牙齿的修复和仿生合成。

本发明的目的是这样实现的，一种仿牙釉质有序结构的羟基磷灰石的制备方法，包括如下步骤：

第一步，将钙盐和氢氧化钠溶液在搅拌条件下滴入油酸、乙醇和水的混合溶液中，其中钙盐、氢氧化钠溶液和油酸的摩尔比为1 : 1.5～2.5 : 1.5～2.5 , 反应4～12 h后，取固体反应物，用水和乙醇的混合液洗净后得到油酸钙固体;

第二步，将油酸钙固体置于反应器中，在110℃～140 ℃真空干燥去除水分，再在160℃～180 ℃的鼓风干燥箱中干燥除去结晶水后直接在箱内降温结晶；

第三步，将再结晶后的油酸钙连同反应器于70℃～95 ℃水浴条件下加入适量的水，再缓慢加入磷酸，反应12～24 h后，取固体反应物，用乙醇和水的混合液洗涤固体反应物，干燥后得到磷酸钙盐固体；

第四步，将磷酸钙盐固体置于另一反应器中，按钙盐和氢氧化钠摩尔比5:1～1.5加入摩尔浓度为0.1M～0.5 M的氢氧化钠溶液，80℃～95℃水浴反应6 h ～12 h，反应结束后静置陈化，用乙醇和水洗涤，干燥得到有序排列纳米级羟基磷灰石，通过本步的陈化处理后，使得磷酸钙盐转化为羟基磷灰石，纯度更高。

本发明的上述制备方法中，因第二步制得的油酸钙密度小于水，故将其在反应器中干燥后再升温至溶化然后再缓慢结晶凝固于反应器底部，有利于油酸钙分子依靠分子间作用力有序排列，进而促进下一步转换成的磷酸钙盐晶体的有序性。第三步中，再结晶后油酸钙与磷酸溶液混合加热，发生类似置换反应的作用，酸性较强的磷酸置换出酸性较弱的油酸，而油酸为难溶于水的液态物质，密度小于水，故可以自发脱离油酸钙的表面，上浮至溶液表面，而内部的油酸钙可以与溶液中的磷酸继续接触反应，此反应从热力学和动力学角度均有利于显著提高反应的化率。另外在结构上，第三步反应在酸性环境中进行，得到的产物应为难溶性的磷酸钙盐，作为无机小分子物质，稍加控制即可得到颗粒较大的单晶。而单晶是由内部原子/分子周期性排列而形成的，内部结构具有极大地有序性。便于控制此晶体的相均匀转变为羟基磷灰石相，即可获得规整排列的HA。而在较强的碱性条件下，羟基磷灰石是磷酸钙盐类物质中最稳定的结晶相之一，也就是，当磷酸钙盐在较强的碱性环境中后，其结晶相就会逐渐向羟基磷灰石相转变。经微观检测分析通过本发明的方法，可制得呈编织状排布的羟基磷灰石，更接近牙釉质的微观结构，可以促进细胞增殖，具有良好的生物相容性和生物活性。而且操作简便，原料廉价易得，绿色环保，反应效率和转化率高，适合工业化生产，并适合用于生物仿生合成，进行牙齿修复与牙釉质的仿生合成。

进一步地，第一步中，所述钙盐选自氯化钙和硝酸钙，且钙盐、氢氧化钠和油酸的摩尔比为1: 2: 2，反应的时间为6～8 h。

进一步地，第二步中，真空干燥温度为120℃～130 ℃，鼓风干燥箱中的温度为160～170 ℃。

第三步中，向油酸钙中加入水时的油酸钙和水的质量比为3：5～8 ,水浴温度为85～90 ℃。

进一步地，第三步中，加入磷酸溶液时，按钙离子与磷酸根离子的摩尔比为1:1.2～2浓度添加，反应时间为14～6 h。

进一步地，第三步中，磷酸溶液的质量浓度为85%。

进一步地，第三步中，干燥固体反应物的方法为：在烘箱中100℃～110 ℃干燥2～4 h。

进一步地，第四步中，NaOH的浓度为0.2 M～0.4 M，水浴温度为85～90℃。

附图说明

图1为实施例1中没经过NaOH转化的磷酸钙盐前驱体的扫描电镜图。

图2为实施例1制得的羟基磷灰石的5000倍放大倍数的扫描电镜图。

图3为实施例1制得的羟基磷灰石的1万倍放大倍数的扫描电镜图。

图4为实施例1制得的羟基磷灰石的3.5万倍放大倍数的扫描电镜图。

图5为MC3T3细胞在不含材料的培养基α-MEM(a、d) 、普通羟基磷灰石(b、e)和实施例1制得的羟基磷灰石(c、f)中的活死染色图，其中（a、b、c）和（d、e、f）分别是培养1天和3天的活死染色图。

图6为MC3T3细胞在不含HAP材料的培养基α-MEM、普通羟基磷灰石和实施例1制得羟基磷灰石中培养1天、3天和5天时，用CCK8测量的细胞增殖图。

图7为实施例2制得的羟基磷灰石的透射电镜图。

图8为实施例3制得的羟基磷灰石的红外光谱图。

图9为对比例1中在干燥箱内烘干前的油酸钙制得的磷酸钙盐的扫描电镜图。

图10为对比例1中在干燥箱内烘干后的油酸钙制得的磷酸钙盐的扫描电镜图。

图11为对比例2中磷酸钙和加入NaOH后水浴6小时，每个小时取一次样的xrd图，以及羟基磷灰石的标准PDF卡片PDF#09-0432。

具体实施方式

实施例1

第一步，称取66 g氯化钙和48 g氢氧化钠分并在搅拌条件下同时滴入338g油酸、100mL乙醇和100mL水的混合溶液中。反应6 h后，用水和乙醇将生成的不溶物洗净，得油酸钙固体；

第二步，将油酸钙固体置于反应器中，在120 ℃真空干燥去除水分，再在170 ℃的鼓风干燥箱中干燥除去结晶水熔化后直接在箱内降温结晶；

第三步，取再结晶后的油酸钙30.15 g于反应器内置于90 ℃水浴条件下加入50mL水，并缓慢滴加质量浓度为85%的磷酸溶液9.22g，反应18h后，用乙醇和水的等比例混合液洗涤固体反应物，再将得到的固体反应物于烘箱中100℃下干燥3.5 h后得到磷酸钙盐固体；

第四步，向上步制得的磷酸钙盐固体按钙盐和氢氧化钠摩尔比为5：1的比例中加入摩尔浓度为0.3 M 的氢氧化钠溶液， 90 ℃水浴8 h，反应结束后静置陈化，用乙醇和水的混合液洗涤，取固体反应物，置于烘箱中100℃干燥3h得到有序排列纳米级羟基磷灰石。

图1为本实施例中第三步得到的没经过NaOH转化的磷酸钙盐前驱体的扫描电镜图。从图中可以看出，磷酸钙盐前驱体是块状结构的，这为后面转化为羟基磷灰石有序结构的合成提供了条件。

图2至图4为本实施例中制得的羟基磷灰石的不同放大倍数的扫描电镜图。从图中可以看出，合成的羟基磷灰石呈编织状有序结构，与牙釉质的微观结构类似，具有良好的生物相容性。

图5为MC3T3细胞在不含材料的培养基α-MEM(a、d) 、普通羟基磷灰石(b、e)和实施例1制得的羟基磷灰石(c、f)中的活死染色图，其中（a、b、c）和（d、e、f）分别是培养1天和3天的活死染色图。从图中可以看出，本专利合成的羟基磷灰石的细胞成活率高，可以促进细胞增殖，比细胞自然增长和在普通HAP中增长的细胞要多，说明制得的羟基磷灰石具有良好的生物相容性和生物活性。

图6为MC3T3细胞在不含HAP材料培养基α-MEM、普通羟基磷灰石和本实施例制得羟基磷灰石中培养1天、3天和5天时，用CCK8测量的细胞增殖图。由图可以看出，本专利合成的羟基磷灰石可以促进细胞增殖，比细胞自然增长和在普通HA中的细胞增长的效果要好得多，说明制得的羟基磷灰石生物相容性好。

实施例2

第一步，称取33.3 g氯化钙和18g氢氧化钠分并在搅拌条件下同时滴入127.11油酸、50mL乙醇和50mL水的混合溶液中，反应4 h后，用水和乙醇将生成的不溶物洗净，得油酸钙固体；

第二步，将油酸钙固体置于反应器中，在110 ℃真空干燥去除水分，再在160 ℃的鼓风干燥箱中干燥除去结晶水熔化后直接在箱内降温结晶；

第三步，在70 ℃水浴条件下，称取15.075 g油酸钙于烧杯中加入50 mL水并缓慢滴加4.5g浓度为85%的磷酸溶液，反应12 h后，用乙醇和水的等比例混合液洗涤干净，再将得到的固体反应物于烘箱中110℃下干燥2 h后得到磷酸钙盐固体；

第四步，向上步制得的磷酸钙盐固体按钙盐和氢氧化钠摩尔比为5：1.5的比例中加入摩尔浓度为0.1 M的氢氧化钠溶液，80 ℃水浴6 h，反应结束后静置陈化，用乙醇和水的混合液洗涤，取固体反应物，置于烘箱中110 ℃干燥3h得到有序排列纳米级羟基磷灰石。

图7为本实施例制得的羟基磷灰石的透射电镜图。从图中可以看出，制得的羟基磷灰石呈块状且粒径小，属于纳米级羟基磷灰石。

实施例3

第一步，称取118 g四水硝酸钙和50g氢氧化钠分并在搅拌条件下同时滴入353.09g油酸、100mL乙醇和100mL水的混合溶液中。反应12 h后，用水和乙醇将生成的不溶物洗净，得油酸钙固体；

第二步，将油酸钙固体置于140 ℃真空下干燥除去水分，再在180 ℃的鼓风干燥箱中除去结晶水，然后箱内降温结晶；

第三步，在95 ℃水浴条件下，称取30.15 g结晶后的油酸钙于烧杯中加入50 mL水并缓慢滴加质量浓度为85 %的磷酸溶液11.529 g，反应24 h后，用乙醇和水的混合液洗涤干净，干燥箱中105 ℃下干燥3 h得到磷酸钙盐固体；

第四步，加入150 mL 0.5 M的氢氧化钠溶液，95 ℃水浴12 h，反应结束后静置陈化，用乙醇和水洗涤，将固体反应物于干燥箱中105 ℃下干燥3h得到有序排列纳米级羟基磷灰石。

图8为本实施例制得的羟基磷灰石的红外光谱图。由图中可知，968和1019 cm^-1处的吸收峰为磷酸盐υ1和υ3振动模式。在560和600 cm^-1处的吸收峰为磷酸盐υ4振动模式。3570 cm^-1的峰应归属为羟基的振动峰，因此，本专利合成的产物为纯的HAP。

对比例1

本对比例与实施例1实施过程基本相同，唯一不同的是未在经第二步的鼓风干燥箱中加热融化再结晶，而是直接进入第三步。

图9和图10分别为对比例1中在干燥箱内烘干前后的油酸钙制得的磷酸钙盐的扫描电镜图。通过对比图9和图10烘干前后油酸钙在相同条件下合成的磷酸钙盐的SEM照片可知，油酸钙中水的存在会导致产物呈现不规则的重叠层状的结构，而干燥后的油酸钙合成的产物晶体结构规则，颗粒大小较为均一，可认为干燥前后的油酸钙合成的磷酸钙盐分别为多晶和单晶。

对比例2

本对比例与实施例1基本相同，唯一不同的是步骤4中NaOH处理时，每隔1小时取一次样。

图11为对比例2中磷酸钙和加入NaOH后水浴6小时，每个小时取一次样的X射线衍射表征图谱，以及羟基磷灰石的标准PDF卡片PDF#09-0432。所有HA样品的衍射峰的2θ值分别为26.1，32.1，33.0，39.8，47.0，49.7和53.4与纯HA的（002），（211），（300），（310），（222），（213）和（004）晶面一一对应。在2θ= 26和2θ= 33附近的强吸收峰证明6 h的样品样品主要是纯HA。而1~5 h的样品在2θ值为26.6和31处的磷酸钙盐的峰随着时间的增长而减弱，到6h几乎消失不见，这表明反应6 h后样品为纯的HA，而不足6 h则会混有磷酸钙盐，反应不完全。

Claims

1.一种仿牙釉质有序结构的羟基磷灰石的制备方法，包括如下步骤：

第四步，将磷酸钙盐固体置于另一反应器中，按钙盐和氢氧化钠摩尔比5:1～1.5加入摩尔浓度为0.1M～0.5 M的氢氧化钠溶液，80℃～95℃水浴反应6 h ～12 h，反应结束后静置陈化，用乙醇和水洗涤，干燥得到有序排列纳米级羟基磷灰石。

2.根据权利要求1所述的仿牙釉质有序结构的羟基磷灰石的制备方法，其特征在于，第一步中，所述钙盐选自氯化钙和硝酸钙，且钙盐、氢氧化钠和油酸的摩尔比为1: 2: 2，反应的时间为6～8 h。

3.根据权利要求1所述的仿牙釉质有序结构的羟基磷灰石的制备方法，其特征在于，第二步中，真空干燥温度为120℃～130 ℃，鼓风干燥箱中的温度为160～170 ℃。

4.根据权利要求1所述的仿牙釉质有序结构的羟基磷灰石的制备方法，其特征在于，第三步中，向油酸钙中加入水时的油酸钙和水的质量比为3：5～8 ,水浴温度为85～90 ℃。

5.根据权利要求4所述的仿牙釉质有序结构的羟基磷灰石的制备方法，其特征在于，第三步中，加入磷酸溶液时，按钙离子与磷酸根离子的摩尔比为1:1.2～2浓度添加，反应时间为14～16 h。

6.根据权利要求4所述的仿牙釉质有序结构的羟基磷灰石的制备方法，其特征在于，第三步中，磷酸溶液的质量浓度为85%。

7.根据权利要求4所述的仿牙釉质有序结构的羟基磷灰石的制备方法，其特征在于，第三步中，干燥固体反应物的方法为：在烘箱中100℃～110 ℃干燥2～4 h。

8.根据权利要求1所述的仿牙釉质有序结构的羟基磷灰石的制备方法，其特征在于，第四步中，NaOH的浓度为0.2 M～0.4 M，水浴温度为85～90℃。