JP2019042728A

JP2019042728A - 塩基性の部位を備える物質を選択的に吸着する吸着材

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Publication number: JP2019042728A
Application number: JP2018081587A
Authority: JP
Inventors: 永田　夫久江; Fukue Nagata; 夫久江永田; 達也宮島; Tatsuya Miyajima; 加藤　且也; Katsuya Kato; 且也加藤
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2019-03-22
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: JP7137816B2

Abstract

【課題】塩基性の部位を備える物質を選択的に吸着する吸着材を提供する。【解決手段】塩基性の部位を備える物質を選択的に吸着する吸着材の一例は、ペクチンをコアとし、ヒドロキシアパタイト結晶層をシェルとするコアシェル型粒子である。ヒドロキシアパタイト結晶層の表面の結晶面は主にｃ面である。結晶面のｃ面の割合は９０％以上であることが好ましい。【選択図】図１

Description

本発明は、ヒドロキシアパタイト結晶層を表層に有し、塩基性の部位を備える物質を選択的に吸着する吸着材に関するものである。

タンパク質を選択的に吸着する材料を開発することは、液体クロマトグラフィー用担体、人工骨、細胞培養担体、またはフィルター材などへの応用に重要である。リン酸カルシウムセラミックスの一種であるアパタイトセラミックスは、タンパク質吸着材として知られている。さらに、アパタイトセラミックスは、その結晶系が六方晶であるが、結晶ａ面と結晶ｃ面に異なるタンパク質を吸着することでも注目されている。

具体的には、結晶ａ面にはカルシウム原子が表面に存在するため酸性タンパク質が吸着しやすく、結晶ｃ面にはリン酸の酸素が表面に存在するため塩基性タンパク質が吸着しやすい（特許文献１）。このため、アパタイトの結晶形態を制御することにより、タンパク質の選択性を高めようとする研究が数多くなされてきた。しかしながら、アパタイトの結晶形態制御に関する合成は数多くされているが、結晶ｃ面のみを大きく成長させた単結晶粒子は得られていなかった。

特開２０１０−２０８８９６号公報

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、塩基性タンパク質等の塩基性の部位を備える物質を選択的に吸着する吸着材を提供することを目的とする。

これまでのアパタイト粒子のタンパク質の選択吸着に関する研究では、結晶面の異方性を生じさせるための結晶成長の制御が主流であった。しかし、本発明では、従来のセラミックス粒子の常識を打ち破る“表面の大半がｃ面であるアパタイト粒子”である高機能化粒子を提示する。すなわち、セラミックス結晶面の概念を平面からトポロジカルに展開して曲面構造とする新機軸を提案し、表面の結晶面が主にｃ面であるヒドロキシアパタイト粒子を創製することを最大の特徴とする。

本発明の塩基性の部位を備える物質を選択的に吸着する吸着材は、ヒドロキシアパタイト結晶層を表層に有し、表層の表面の結晶面が主にｃ面である。

本発明の吸着材によれば、塩基性の部位を備える物質を選択的に表面に吸着できる。

（ａ）は実施例１のコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真、（ｂ）は（ａ）にコア部分とシェル部分の説明を追加した写真。（ａ）は実施例２のコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真、（ｂ）は（ａ）にコア部分とシェル部分の説明を追加した写真。（ａ）は実施例３のコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真、（ｂ）は（ａ）にコア部分とシェル部分の説明を追加した写真。実施例４のコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真。実施例５のコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真。実施例６のコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真。

以下、本発明の吸着材について、実施形態と実施例に基づいて説明する。なお、重複説明は適宜省略する。また、２つの数値の間に「〜」を記載して数値範囲を表す場合には、この２つの数値も数値範囲に含まれる。

本発明の実施形態に係る吸着材は、ヒドロキシアパタイト結晶層を表層に備えている。本実施形態の吸着材の表面は、塩基性の部位を備える物質を選択的に吸着する。「塩基性の部位を備える」とは、等電点が８．０以上であること、またはペプチドやタンパク質のように３次構造を備え、液体中で解離して水酸化物イオンを生じる官能基もしくは非共有電子対をもつ官能基が、この３次構造体の表面で高密度に存在する部分を有することをいう。例えば、ウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin：ＢＳＡ）やミオグロビンは、これらの官能基の多くが３次構造の内部にあるうえ、３次構造体の表面にこれらの官能基が点在している。したがって、ＢＳＡおよびミオグロビンは、塩基性の部位を備える物質ではない。

ヒドロキシアパタイトは、化学式（Ｃａ₁₀(ＰＯ₄)₆(ＯＨ)₂）で表わされ、結晶系が六方晶に属する。本実施形態の吸着材は、表層の表面の結晶面が主にｃ面である。このため、本実施形態の吸着材は、酸性物質および中性物質に対して、塩基性の部位を備える物質を選択的に吸着できる。塩基性の部位を備える物質としては、塩基性タンパク質のほか、塩基性の部位を備えるペプチド、塩基性の部位を備える抗体、塩基性の部位を備えるアレルゲン、塩基性の部位を備えるウイルス、塩基性の部位を備える細胞接着タンパク質、アンモニア、カフェイン、ニコチン、リドカインなどが挙げられる。

ヒドロキシアパタイト結晶層の表面の結晶面が主にｃ面であるとは、表面に出ている結晶面のｃ面の割合が８０％以上であることをいう。結晶面のｃ面の割合は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。吸着材の表面は、結晶の不可避的な欠陥を除いて、ヒドロキシアパタイト結晶のｃ面のみから構成されることが最も好ましい。酸性物質および中性物質に対する塩基性の部位を備える物質の吸着量の選択率が向上するからである。結晶面のｃ面の割合は、透過型電子顕微鏡で結晶構造を観察することから算出することができる。

本実施形態の吸着材は、基材をコアとし、ヒドロキシアパタイト結晶層をシェルとするコアシェル型粒子であってもよい。コアの形状は特に限定されず、球状、板状、棒状、繊維状等であってもよい。コアである基材は、固体であっても液体であってもよい。基材は、表面に親水性官能基を備えていてもよい。ヒドロキシアパタイト結晶層のシェルが形成しやすいからである。親水性官能基としては、例えばカルボキシル基、スルホ基、リン酸基などが挙げられるが、これらに限定されない。基材である親水性官能基を備える物質としては、ゼラチンやＢＳＡなどのタンパク質やペクチンなどの多糖類が挙げられる。

また、多糖類としては、ペクチン以外に、ヒアルロン酸、セルロース誘導体、およびカルボキシルメチルキトサンなどのキチンキトサン誘導体等が挙げられる。セルロース誘導体としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース等が挙げられる。シェルの厚みは１０ｎｍ以下であることが好ましい。また、基材は疎水性官能基を備える物質であってもよい。疎水性官能基を備える物質としてはポリ乳酸が挙げられる。

本実施形態の吸着材は、例えば、コアである基材の粒子の表面にシェルであるヒドロキシアパタイト結晶を積層して得られる。水または水溶液中に基材の粒子を分散させた分散液と、カルシウムイオンを含む溶液と、リン酸イオンを含む溶液を混合して、基材の粒子の表面にヒドロキシアパタイト結晶を形成する。このとき、基材の粒子を分散させた分散液が、カルシウムイオンまたはリン酸イオンを含んでいれば、これらのイオンを含む溶液は混合しなくてもよい。これらの分散液と溶液を混合する順番は、特に限定されない。

基材の粒子を水または水溶液中に分散させる方法は、基材の粒子が水中に分散していればよく、特に限定されない。必要に応じて、プロペラ型撹拌機やマグネティックスターラーなどを用いた撹拌によって分散できる。分散する媒体は、水または水溶液を用いることができ、カルシウムイオンを含む溶液やリン酸イオンを含む溶液も用いることができる。

カルシウムイオンを含む溶液は水溶液であることが好ましい。カルシウムイオンを含む水溶液としては、硝酸カルシウム四水和物水溶液、塩化カルシウム水溶液、塩化カルシウム一水和物水溶液、塩素酸カルシウム二水和物水溶液、過塩素酸カルシウム水溶液、臭化カルシウム水溶液、酢酸カルシウム水溶液などが挙げられるが、特に制限はない。カルシウムイオンを含む溶液中のカルシウムイオンの濃度は、１×１０^-6ｍｏｌ／Ｌ〜２ｍｏｌ／Ｌが好ましく、１×１０^-6ｍｏｌ／Ｌ〜２×１０^-1ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。基材の粒子の表面にヒドロキシアパタイト結晶を規則的に析出させることができるからである。

リン酸イオンを含む溶液は水溶液であることが好ましい。リン酸イオンを含む水溶液としては、リン酸水素二アンモニウム水溶液、リン酸二水素アンモニウム水溶液、リン酸水素二ナトリウム水溶液、リン酸二水素ナトリウム一水和物水溶液、リン酸二水素ナトリウム二水和物水溶液、リン酸カリウム水溶液、リン酸水素二カリウム水溶液、リン酸二水素カリウム水溶液、リン酸水溶液などが挙げられるが、特に制限はない。

これらの分散液と溶液を混合するとき、リン酸イオンを含む溶液中のリン酸イオンの物質量に対するカルシウムイオンを含む溶液中のカルシウムイオンの物質量の比、いわゆるモル比は、０．８〜２０であることが好ましい。シェルとして析出させたいヒドロキシアパタイトのこれらのモル比が１．７であり、用いる水溶液のこれらのモル比を同程度にすれば、ヒドロキシアパタイト結晶を効率よく析出させることができるからである。

これらの分散液と溶液を混合する方法は特に限定されない。例えば、プロペラ型撹拌機やマグネティックスターラーなどの撹拌手段を用いて撹拌することができる。撹拌時間は、例えば１０分〜１２０時間であり、基材の粒子の表面にリン酸カルシウムの析出を促すために、１時間〜７２時間であることが好ましい。こうして、ヒドロキシアパタイト結晶が基材の表面に形成されたコアシェル型粒子の水分散体が得られる。この水分散液を濾過、遠心分離、凍結乾燥などによって固液分離することにより、コアシェル型粒子が単離できる。このコアシェル型粒子の製造方法は、常温常圧で実施できるため、環境への負荷が少ない。また、必要に応じて加熱することもできる。なお、ヒドロキシアパタイト結晶が基材の表面に形成された後に、コアである基材を除去してもよい。

次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、実施例により限定されない。

［実施例１］
ペクチン０．０５ｇを蒸留水１６０ｍＬ中に分散した。０．０８０ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液２０ｍＬをこの分散液に加え、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで５分間撹拌した。０．０４８ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液２５ｍＬをさらに加えて撹拌した。その後、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで２４時間撹拌し、ペクチンの表面にヒドロキシアパタイト結晶が形成されたコアシェル型粒子の水分散液を得た。

この水分散液を遠心分離で固液分離した後、固形物を凍結乾燥させて、幅が約２０ｎｍで、長さが約５００ｎｍのペクチンの大きさに由来する形状をもったコアシェル型粒子を得た。このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真を図１に示す。この写真から、均一な面間隔の結晶層をシェルとするコアシェル型粒子であることがわかった。また、その面間隔の値（０．３４ｎｍ）から、このコアシェル型粒子は、表面の９８％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。コアシェル型粒子５ｍｇに０．５ｍｇのタンパク質を含む溶液１ｍＬを加え、４℃の恒温器内で２４時間撹拌した。その後、１４０００回転で１０分間遠心分離をしてコアシェル型粒子に吸着したタンパク質を沈殿させた。遠心分離後の上澄みに含まれるタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法で定量し、その値からコアシェル型粒子に吸着したタンパク質量を定量した。コアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが０μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが５μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが９２μｇであった。実施例１のコアシェル型粒子では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量が無限大倍、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量が１８倍であった。

［実施例２］
０．０１０ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液１００ｍＬ中にＢＳＡ５０ｍｇを加え、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで５分間撹拌した。０．００６ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液１００ｍＬをさらに滴下して撹拌した。その後、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで３時間撹拌し、ＢＳＡの表面にヒドロキシアパタイト結晶が形成されたコアシェル型粒子の水分散液を得た。

この水分散液を濾過して水を除去した後、固形物を凍結乾燥させて、粒径が２０〜３０ｎｍのコアシェル型粒子を得た。このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真を図２に示す。この写真から、均一な面間隔の結晶層をシェルとするコアシェル型粒子であることがわかった。また、その面間隔の値（０．３４ｎｍ）から、このコアシェル型粒子は、表面の９５％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、実施例１と同様の方法で、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。このコアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが１２μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが１０μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが６０μｇであった。実施例２のコアシェル型粒子では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量が５倍、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量が６倍であった。

［実施例３］
０．００４ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液１８０ｍＬ中に、アセトン５ｍＬに溶解したポリ乳酸４０ｍｇを加え、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで１０分間撹拌した。０．０２４ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液２０ｍＬをさらに滴下して撹拌した。その後、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで７２時間撹拌し、ポリ乳酸の表面にヒドロキシアパタイト結晶が形成されたコアシェル型粒子の水分散液を得た。この水分散液を濾過して水を除去した後、固形物を凍結乾燥させて、粒径が１０〜１００ｎｍのコアシェル型粒子を得た。このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真を図３に示す。この写真から、このコアシェル型粒子は、均一な面間隔の結晶層をシェルとするコアシェル型粒子であることがわかった。また、その面間隔の値（０．３４ｎｍ）から、表面の９５％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、実施例１と同様の方法で、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。このコアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが２６μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが１２μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが７７μｇであった。実施例３のコアシェル型粒子では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量が３倍、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量が６倍であった。

［比較例］
実施例１と同様の方法で、ヒドロキシアパタイト結晶体（太平化学産業株式会社、ＨＡＰ−１００、粒径２００ｎｍ）のタンパク質吸着評価を行った。なお、このヒドロキシアパタイト結晶体の表面には、結晶ａ面と結晶ｃ面が存在し、結晶ｃ面の割合は約２０％である。このヒドロキシアパタイト結晶体１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが６μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが１４μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが６μｇであった。比較例のヒドロキシアパタイト結晶体では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量が１倍、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量が０．４倍であった。

［実施例４］
ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬製、０８９−１０３４３）０．１ｇを蒸留水２００ｍＬ中に分散した。２．００ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液２ｍＬをこの分散液に加え、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで５分間撹拌した。１．２０ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液２ｍＬをさらに加えて撹拌した。その後、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで２４時間撹拌し、ヒアルロン酸の表面にヒドロキシアパタイト結晶が形成されたコアシェル型粒子の水分散液を得た。この水分散液を遠心分離で固液分離した後、固形物を凍結乾燥させて、直径が約２０ｎｍのコアシェル型粒子を得た。

このコアシェル型粒子を透過型電子顕微鏡（日本電子製、ＪＥＭ２０１０）で観察した。透過型電子顕微鏡写真を図４に示す。この写真から、このコアシェル型粒子は、ヒアルロン酸繊維が球状化したコアの周囲を、約５ｎｍの厚さのヒドロキシアパタイト結晶シェルが覆っている構造であることがわかった。さらに、このコアシェル型粒子表面の９０％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、実施例１と同様の方法で、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。コアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが１６μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが１１μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが６４μｇであった。実施例４のコアシェル型粒子では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量が４倍、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量が６倍であった。

［実施例５］
カルボキシメチルセルロース（和光純薬製、０３９−０１３３５）０．１ｇを蒸留水２００ｍＬ中に分散した。０．８０ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液２ｍＬをこの分散液に加え、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで５分間撹拌した。０．４８ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液２ｍＬをさらに加えて撹拌した。その後、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで２４時間撹拌し、カルボキシメチルセルロースの表面にヒドロキシアパタイト結晶が形成されたコアシェル型粒子の水分散液を得た。この水分散液を遠心分離で固液分離した後、固形物を凍結乾燥させて、繊維状コアシェル型粒子を得た。

このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真を図５に示す。この写真から、このコアシェル型粒子は、コアのカルボキシルメチルセルロース繊維を、約１０ｎｍの厚さのヒドロキシアパタイト結晶シェルが覆っている構造であることがわかった。さらに、このコアシェル型粒子表面の９８％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、実施例１と同様の方法で、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。このコアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが０μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが０μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが１００μｇであった。実施例５のコアシェル型粒子では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量と、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量がともに無限大倍であった。

［実施例６］
カルボキシメチルセルロース（和光純薬製、０３９−０１３３５）０．１ｇを蒸留水２００ｍＬ中に分散した。２．００ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液２ｍＬをこの分散液に加え、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで５分間撹拌した。１．２０ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液２ｍＬをさらに加えて撹拌した。その後、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで２４時間撹拌し、カルボキシメチルセルロースの表面にヒドロキシアパタイト結晶が形成されたコアシェル型粒子の水分散液を得た。この水分散液を遠心分離で固液分離した後、固形物を凍結乾燥させて、繊維状コアシェル型粒子を得た。

このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真を図６に示す。この写真から、このコアシェル型粒子は、幅約５ｎｍのカルボキシルメチルセルロース繊維をコアとし、その周囲を約５ｎｍのヒドロキシアパタイト結晶シェルが覆っている構造であることがわかった。さらに、このコアシェル型粒子表面の９８％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、実施例１と同様の方法で、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。このコアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが０μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが０μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが９７μｇであった。実施例６のコアシェル型粒子では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量と、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量がともに無限大倍であった。

［実施例７］
ペクチン（和光純薬製、１６４−００５５２）０．１ｇを蒸留水１６０ｍＬ中に分散した。０．０４０ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液２０ｍＬをこの分散液に加え、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで５分間撹拌した。０．０２４ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液２０ｍＬをさらに加えて撹拌した。その後、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで７２時間撹拌し、ペクチンの表面にヒドロキシアパタイト結晶が形成されたコアシェル型粒子の水分散液を得た。透析膜を用いてこの水分散液を脱塩した後、凍結乾燥させて、シート状コアシェル型粒子を得た。

このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真から、このコアシェル型粒子は、ペクチンをコアとし、その周囲を厚み約５ｎｍのヒドロキシアパタイト結晶シェルが覆った繊維状複合体が、短手方向に連なったシート構造を備えていることがわかった。さらに、このコアシェル型粒子表面の９５％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、実施例１と同様の方法で、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。このコアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが１μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが１２μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが８６μｇであった。実施例７のコアシェル型粒子では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は８６倍、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は７倍であった。

［実施例８］
０．０２０ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液および０．０１２ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液を用いた点、ならびにマグネティックスターラーを用いた撹拌を７２時間から２４時間に変更した点を除いて、実施例７と同様にしてシート状コアシェル型粒子を得た。このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真から、このコアシェル型粒子は、ペクチンをコアとし、その周囲を厚み約２ｎｍのヒドロキシアパタイト結晶シェルが覆った繊維状複合体が、短手方向に連なったシート構造を備えていることがわかった。さらに、このコアシェル型粒子表面の９０％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、実施例１と同様の方法で、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。このコアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが０μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが３μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが３７μｇであった。実施例８のコアシェル型粒子では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は無限大倍、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は１２倍であった。

［実施例９］
０．０８０ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液および０．０４８ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液を用いた点、ならびにマグネティックスターラーを用いた撹拌を７２時間から４８時間に変更した点を除いて、実施例７と同様にしてシート状コアシェル型粒子を得た。このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真から、このコアシェル型粒子は、ペクチンをコアとし、その周囲を厚み約５ｎｍのヒドロキシアパタイト結晶シェルが覆った繊維状複合体が、短手方向に連なったシート構造を備えていることがわかった。さらに、このコアシェル型粒子表面の９８％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、実施例１と同様の方法で、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。このコアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが０μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが２μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが９５μｇであった。実施例９のコアシェル型粒子では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は無限大倍、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は４８倍であった。

［実施例１０］
０．２４ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液および０．１４ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液２０ｍＬを用いた点、ならびにコアシェル型粒子の水分散液を遠心分離で固液分離した点を除いて、実施例８と同様にしてシート状コアシェル型粒子を得た。このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真から、このコアシェル型粒子は、ペクチンをコアとし、その周囲を厚み約８ｎｍのヒドロキシアパタイト結晶シェルが覆った繊維状複合体が、短手方向に連なったシート構造を備えていることがわかった。さらに、このコアシェル型粒子表面の９５％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、実施例１と同様の方法で、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。このコアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが３μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが４μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが８５μｇであった。実施例１０のコアシェル型粒子では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は２８倍、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は２１倍であった。

［実施例１１］
カルボキシメチルセルロース（和光純薬製、０３９−０１３３５）０．０５ｇを蒸留水１６０ｍＬ中に分散した。０．０２０ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液２０ｍＬをこの分散液に加え、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで５分間撹拌した。０．０１２ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液２０ｍＬをさらに加えて撹拌した。その後、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで７２時間撹拌し、カルボキシメチルセルロースの表面にヒドロキシアパタイト結晶が形成されたコアシェル型粒子の水分散液を得た。透析膜を用いてこの水分散液を脱塩した後、凍結乾燥させて、シート状コアシェル型粒子を得た。

このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真から、このコアシェル型粒子は、カルボキシルメチルセルロース繊維をコアとし、その周囲を厚み約３ｎｍのヒドロキシアパタイト結晶シェルが覆った繊維状複合体であるか、この繊維状複合体が短手方向に連なったシート構造を備えていることがわかった。さらに、このコアシェル型粒子表面の９８％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、実施例１と同様の方法で、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。このコアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが０μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが２μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが９０μｇであった。実施例１１のコアシェル型粒子では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は無限大倍、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は４５倍であった。

［実施例１２］
カルボキシメチルセルロース（和光純薬製、０３９−０１３３５）０．０５ｇを蒸留水１６０ｍＬ中に分散した。０．２０ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液２０ｍＬをこの分散液に加え、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで５分間撹拌した。０．１２ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液２０ｍＬをさらに加えて撹拌した。その後、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで７２時間撹拌し、カルボキシメチルセルロースの表面にヒドロキシアパタイト結晶が形成されたコアシェル型粒子の水分散液を得た。この水分散液を遠心分離で固液分離した後、固形物を凍結乾燥させて、シート状コアシェル型粒子を得た。

このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真から、このコアシェル型粒子は、カルボキシルメチルセルロース繊維をコアとし、その周囲を厚み約５ｎｍのヒドロキシアパタイト結晶シェルが覆った繊維状複合体が、短手方向に連なったシート構造を備えていることがわかった。さらに、このコアシェル型粒子表面の９８％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、実施例１と同様の方法で、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。このコアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが４μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが５μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが９７μｇであった。実施例１２のコアシェル型粒子では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は２４倍、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は１９倍であった。

［実施例１３］
カルボキシメチルセルロース（和光純薬製、０３９−０１３３５）０．５ｇを蒸留水１８０ｍＬ中に分散した。０．０２０ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液２０ｍＬをこの分散液に加え、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで５分間撹拌した。０．０１２ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液２０ｍＬをさらに加えて撹拌した。マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで７２時間撹拌した後、室温から３５℃まで昇温してシート状コアシェル型粒子を得た。このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真から、このコアシェル型粒子は、カルボキシルメチルセルロース繊維をコアとし、その周囲を厚み約１０ｎｍのヒドロキシアパタイト結晶シェルが覆った繊維状複合体が、短手方向に連なったシート構造を備えていることがわかった。さらに、このコアシェル型粒子表面の９５％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、実施例１と同様の方法で、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。このコアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質の吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが０μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが９μｇであったのに対して、塩基性タンパク質であるリゾチームが６１μｇであった。実施例１３のコアシェル型粒子では、酸性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は無限大倍、中性タンパク質の吸着量に対する塩基性タンパク質の吸着量は７倍であった。

［実施例１４］
ペクチン（和光純薬製、１６４−００５５２）０．１ｇを蒸留水１６０ｍＬ中に分散した。０．２０ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液２０ｍＬをこの分散液に加え、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで５分間撹拌した。０．１２ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液２０ｍＬをさらに加えて撹拌した。その後、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで７２時間撹拌し、ペクチンの表面にヒドロキシアパタイト結晶が形成されたコアシェル型粒子の水分散液を得た。透析膜を用いてこの水分散液を脱塩した後、凍結乾燥させて、シート状コアシェル型粒子を得た。

このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真から、このコアシェル型粒子は、ペクチンをコアとし、その周囲を厚み約５ｎｍのヒドロキシアパタイト結晶シェルが覆った繊維状複合体が、平面方向に連なった板状構造を備えていることがわかった。さらに、このコアシェル型粒子表面の９５％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。

つぎに、実施例１と同様の方法で、このコアシェル型粒子のタンパク質吸着評価を行った。このコアシェル型粒子１ｍｇ当たりの各種タンパク質吸着量は、酸性タンパク質であるＢＳＡが０μｇ、中性タンパク質であるミオグロビンが７μｇであったのに対して、塩基性の部位を備えるタンパク質であるＩｇＧ抗体が３５μｇであった。実施例１４のコアシェル型粒子では、ＢＳＡの吸着量に対するＩｇＧ抗体の吸着量は無限大倍、ミオグロビンの吸着量に対するＩｇＧ抗体の吸着量は４倍であった。実施例１４のコアシェル型粒子では、血液中に存在するタンパク質の吸着量に対して、ＩｇＧ抗体の吸着量が多いことがわかった。

［実施例１５］
アセトン５ｍＬに溶解したポリ乳酸２０ｍｇを蒸留水１６０ｍＬ中に加え、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで１０分間撹拌した。０．０２０ｍｏｌ／Ｌの酢酸カルシウム水溶液２０ｍＬをこの分散液に加え、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで５分間撹拌した。０．０２４ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二アンモニウム水溶液２０ｍＬをさらに滴下して撹拌した。その後、マグネティックスターラーを用いて３００ｒｐｍで７２時間撹拌し、ポリ乳酸の表面にヒドロキシアパタイト結晶が形成されたコアシェル型粒子の水分散液を得た。この水分散液を濾過して水を除去した後、固形物を凍結乾燥させて、粒径が１０〜１００ｎｍのコアシェル型粒子を得た。

このコアシェル型粒子の透過型電子顕微鏡写真から、このコアシェル型粒子は、表面の９５％以上の結晶面がｃ面であることがわかった。つぎに、このコアシェル型粒子のペプチド吸着評価を行った。１６ｍｇ／Ｌのヒスチジンペプチド溶液０．４ｍＬに、このコアシェル粒子０．１ｍｇを入れたところ、この溶液中のヒスチジンペプチドの９８質量％がこのコアシェル型粒子に吸着した。

本発明の吸着材は、塩基性の部位を備える物質である塩基性タンパク質、抗体、ペプチドを選択的に吸着するので、タンパク質吸着分離用担体やフィルターなどに利用できる。

Claims

ヒドロキシアパタイト結晶層を表層に有し、塩基性の部位を備える物質を選択的に吸着する吸着材であって、
前記表層の表面の結晶面が主にｃ面である吸着材。
請求項１において、
前記ヒドロキシアパタイト結晶層をシェルとするコアシェル型粒子である吸着材。
請求項２において、
親水性官能基を備える物質をコアとするコアシェル型粒子である吸着材。
請求項３において、
前記親水性官能基を備える物質がタンパク質である吸着材。
請求項４において、
前記タンパク質がＢＳＡである吸着材。
請求項３において、
前記親水性官能基を備える物質が多糖類である吸着材。
請求項６において、
前記多糖類がヒアルロン酸である吸着材。
請求項６において、
前記多糖類がセルロース誘導体である吸着材。
請求項８において、
前記セルロース誘導体がカルボキシメチルセルロースである吸着材。
請求項６から９のいずれかにおいて、
前記シェルの厚みが１０ｎｍ以下である吸着材。
請求項３において、
親水性官能基を備える物質がペクチンである吸着材。
請求項２において、
疎水性官能基を備える物質をコアとするコアシェル型粒子である吸着材。
請求項１２において、
前記疎水性官能基を備える物質がポリ乳酸である吸着材。
請求項１から１３のいずれかにおいて、
前記結晶面のｃ面の割合が９０％以上である吸着材。
請求項１から１４のいずれかにおいて、
前記塩基性の部位を備える物質が塩基性タンパク質である吸着材。
請求項１から１４のいずれかにおいて、
前記塩基性の部位を備える物質が抗体である吸着材。
請求項１から１４のいずれかにおいて、
前記塩基性の部位を備える物質がペプチドである吸着材。