JP4665131B2 - 高分子電解質複合体およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、キトサンとカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）とが結合してゲル状となった高分子電解質複合体とその製造方法に関する。

キチン、キチンの脱アセチル化物であるキトサンおよびカルボキシメチルセルロースは直鎖状の多糖類であり、生体適合性を有するため、医薬、食品或いは農業の分野において注目されている。

例えば、特許文献１にはナノ微粒子に生物活性剤を包含せしめ、このナノ微粒子を生物系の組織または細胞に結合させて、生理活性物質の持続放出性を強化する内容が開示されている。
また特許文献２には、ＤＮＡなどの生物学的材料を標的細胞に送達するための
組成物、即ち、ＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）の媒体として、カルボキシメチルセルロース、キチンまたはキトサンと多価脂肪族アルコールまたはその誘導体を基にしたものが提案されている。
また特許文献３には、一般式がＭ−Ｓ−Ｌ−Ｚ（Ｍは磁性核粒子、Ｓはカルボキシメチルセルロースやキチンなどの生体適合性基質、Ｌはリンカー基、Ｚは核酸やタンパク質等）で表される磁性ナノ粒子が提案されている。

特表平１０−５１１９５７号公報 特表２００３−５０４３２０号公報 特表２００３−５０９０２４号公報

ところで、キトサンは水には溶解しないが酢酸などの弱酸には溶解する。そしてキトサンが弱酸に溶解すると、キトサンのアミノ基が水素イオンを受け取ってキトサン分子は正に帯電する。
一方、カルボキシメチルセルロースは水に溶解する。そしてカルボキシメチルセルロースが水に溶解すると、カルボキシメチルセルロースのカルボキシメチル基から水素イオンが離脱し、カルボキシメチルセルロース分子は負に帯電する。

上記正に帯電したキトサン分子を含む溶液と負に帯電したカルボキシメチルセルロース分子を含む溶液とを混合すると、互いの正負の官能基（アミノ基とカルボキシメチル基）が反応してキトサン分子とカルボキシメチルセルロース分子が絡み合い、これら分子は共に高分子であるため絡み合った高分子鎖が溶液全体に広がりゲルとなる。

上記のゲル中には荷電を持った物質を保持することが可能と考えられ、例えば生理活性物質などを保持せしめれば、ＤＤＳの媒体として極めて有効である。しかしながら、人体に存在しない物質が人体に入ると、肝臓や腎臓などの働き（異物認識機構）によって体外に排除される。この異物認識機構による異物の認識にも特異性がある。つまり、異物のサイズ（直径）が３００ｎｍ以下、特に数１０ｎｍ〜２００ｎｍ程度のサイズの異物は認識されにくいと考えられている。

そこで、上記のサイズの媒体を生体適合性に優れた材料で作製すれば、ＤＤＳの媒体などに極めて有効であるが、従来の技術ではサイズのコントロールが極めて困難である。
例えば、キトサンの分子量は通常１０万〜１００万程度であり、カルボキシメチルセルロースの分子量は通常１万〜１０万程度であるので、これらが絡まってできる高分子電解質複合体のサイズも大きなものになってしまう。

本発明は任意の大きさにコントロールされた高分子電解質複合体を提供することを目的とする。この高分子電解質複合体の構造は分解によって低分子化され且つ正に帯電したキトサンと、分解によって低分子化され且つ負に帯電したカルボキシメチルセルロースが、結合してゲル状となっている。

上記の高分子電解質複合体は、その粒径が３００ｎｍ以下、例えば数１０ｎｍに揃えることが可能で、しかも直鎖状の多糖類が絡まって構成されているため、内部に荷電を持った物質を保持させることができる。

高分子電解質複合体に内包する荷電物質としてはイオン性官能基（結合点になるので多い方が好ましい）を有する物質、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、Texas Red、トリプトファン、WSNSG、FITC−卵白アルブミン、サケカルシトニン、トリプシンインヒビターなどが挙げられる。

また、本発明に係る高分子電解質複合体の製造方法は以下の工程からなる。
１） キトサンを弱酸に溶解しキトサン分子を正に帯電させる工程。
２） 正に帯電したキトサン分子をキトサン分解酵素によって切断して低分子化する工程。
３） カルボキシメチルセルロースを水に溶解しカルボキシメチルセルロース分子を負に帯電させる工程。
４） 負に帯電したカルボキシメチルセルロース分子をカルボキシメチルセルロース分解酵素によって切断して低分子化する工程。
５） 前記工程２）で得られた低分子化したキトサン溶液と、前記工程４）で得られた低分子化したカルボキシメチルセルロース溶液とを混合し、互いの正負の官能基を反応させてゲル状に結合する工程。

尚、上記の製造方法では、キトサン分子を正に帯電させキトサン分子を低分子化した後、カルボキシメチルセルロース分子を負に帯電させカルボキシメチルセルロースを低分子しているが、これらの工程の前後を逆にしてもよい。

また、高分子電解質複合体内に内包する荷電物質が負電荷を有する物質である場合には、低分子化されたキトサン溶液に前記被内包物の溶液を添加した後、低分子化されたカルボキシメチルセルロース溶液を添加する。一方、正電荷を有する物質を高分子電解質複合体内に内包せしめる場合には、低分子化されたカルボキシメチルセルロース溶液に被内包物の溶液を添加した後、低分子化されたキトサン溶液を添加する。

本発明に係る高分子電解質複合体は、肝臓や脾臓などの異物認識機構によって検知されにくいサイズの粒子を、低ｐＨ（ｐＨ３.０〜５.６）、高塩濃度（ＮａＣＩ:１Ｍ）或いは低温（０℃）でも形成することができ、しかも安定に存在する。

また、本発明に係る高分子電解質複合体は、荷電を持った物質、例えば活性ペプチドやタンパク質、ＤＮＡなどを保持することができる。これらを電解質複合体に取り込むことで、異物認識機構を逃れて体内に長時間滞留させることができ、また経口投与した際にはプロテアーゼなどが入り込めなくなって分解を抑制することができる。

以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明する。本発明に係る高分子電解質複合体は酵素処理されたキトサン溶液と酵素処理されたカルボキシメチルセルロース溶液を混合することで得られ、図１にキトサンの酵素処理法の手順を示し、図２にカルボキシメチルセルロースの酵素処理法の手順を示す。

先ず、キトサンを用意する。キトサンはキチンからアセチル基を外して抽出精製したものであり、キチンのアセチル基に代わってアミノ基が結合している。それぞれの構造式を以下に示す。

上記のキトサン０.５ｇに酢酸１ｍｌと純水９０ｍｌを加え、更に４Ｍ−ＮａＯＨを用いてｐＨ５.６に調整し、この後、純水を加えて１００ｍｌにして、キトサンの０.５％溶液を得る。
キトサンは水には不溶であるが酸には溶解する。キトサンを酢酸などの弱酸に溶解せしめると、以下の構造式に示すようにアミノ基が水素イオンを受け取りキトサン分子は正に帯電する。

次いで、上記０.５％キトサン溶液を４５℃に加温し、キトサン分解酵素であるキトサナーゼを用いて分解（低分子化）する。

一方、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を用意する。カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の構造式を以下に示す。

上記のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０.５ｇに純水９０ｍｌを加え、２Ｍ−ＨCｌを用いてｐＨ５.６に調整し、この後、純水を加えて１００ｍｌにして、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の０.５％溶液を得る。
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を水に溶かすと、以下の構造式に示すように、カルボキシメチル基が電離して負に帯電する。

次いで、上記０.５％カルボキシメチルセルロース溶液を４５℃に加温し、多糖分解酵素であるセルラーゼを用いて分解（低分子化）する。

このようにしてキトサンの部分分解物とカルボキシメチルセルロースの部分分解物が得られたら、図３に示すように、これらを混合する。すると、キトサンの部分分解物のアミノ基とカルボキシメチルセルロースのカルボキシル基がイオン相互作用で結合しゲルが形成される。キトサンの部分分解物及びカルボキシメチルセルロースの部分分解物は短く切断されているのでこれらが絡まって形成されるゲルの粒子径も小さくなる。

形成されるゲルの粒子径は、キトサンの部分分解物及びカルボキシメチルセルロースの部分分解物の分子量によってコントロールすることができる。また各分解物の分子量は酵素による分解の度合いによって定まる。また、キトサンとカルボキシメチルセルロースとの混合比を変えることでサイズをコントロールすることもできる。したがって、酵素による反応時間や混合比などによって得られるゲルの粒子径をコントロールすることができる。

図４は、上記によって得られた高分子電解質複合体の経過日数と粒子径との関係を示すグラフであり、条件はｐＨ５.６，２５℃で、粒子径は動的光散乱法で測定した。このグラフから、１週間経過しても粒径は殆ど変化せず、本発明によって得られたゲル粒子の安定性が高いことがわかる。

また、以下の（表１）は高分子電解質複合体粒子の分散している溶液の条件を変化させた時の粒子径について試験した結果を示すものである。尚、粒径の経時変化についても測定したが、前記同様、極めて安定していた。

この（表）から本発明に係る高分子電解質複合体粒子は、低ｐＨ、高塩濃度あるいは低温条件においても安定していることが分かる。

図５は高分子電解質複合体に荷電物質としてTexas Redを内包せしめる手順を示した図、図６はTexas Redの内包率を示すグラフである。
Texas Redを内包せしめるには、前記で得られた低分子化されたキトサン溶液（キトサン部分水解物）にTexas Redの１０ｍM溶液を加え、この後、前記で得られた低分子化されたカルボキシメチルセルロース溶液（CMC部分水解物）を添加する。

図６はTexas Redの内包率を示すグラフであり、内包率は、前記で得られた
Texas Redを内包するナノ粒子をＰＢＳに懸濁せしめ、３７℃で２，４，８，２４時間経過した後、ＨＰＬＣ分析（カラム；ＣＭ cellulose、検出；蛍光550/603ｎｍ）によって得た。このグラフから本願の高分子電解質複合体はTexas Redを高効率に且つ安定して長時間内包することができることが分かる。

図７は高分子電解質複合体に負の荷電を有する物質（以下、代表して酸性物質とする）を内包せしめる手順を示した図であり、酸性物質を高分子電解質複合体内に内包せしめる場合には、低分子化されたキトサン溶液（キトサン部分水解物）に酸性物質溶液を加え、この後、低分子されたカルボキシメチルセルロース溶液（ＣＭＣ部分水解物）を添加してナノ粒子を得る。

各種酸性物質を内包物としたナノ粒子を上記の工程で作製し、得られたナノ粒子をゲルろ過しまたはイオン交換カラムに供し、カプセル・非カプセルを分離・定量して内包率を測定した結果を以下の（表２）に示す。この（表２）から酸性物質であるTexas RedとFITC−卵白アルブミンの内包率は高いことが分かる。

図８は高分子電解質複合体に正の荷電を有する物質（以下、代表して塩基性物質とする）を内包せしめる手順を示した図であり、塩基物質を高分子電解質複合体内に内包せしめる場合には、低分子されたカルボキシメチルセルロース溶液（ＣＭＣ部分水解物）に塩基性物質溶液を加え、この後、低分子化されたキトサン溶液（キトサン部分水解物）を添加してナノ粒子を得る。

前記同様、塩基性物質としてサケカルシトニンとトリプシンインヒビターを選定した場合の内包率を測定した結果を以下の（表３）に示す。この（表３）から、塩基性物質については、先ず、低分子化されたカルボキシメチルセルロース溶液に加えることで内包率が高くなることが分かる。

キトサンの酵素処理法の手順を示した図 カルボキシメチルセルロースの酵素処理法の手順を示した図 キトサンの部分分解物とカルボキシメチルセルロースの部分分解物とが混合して本発明に係る高分子電解質複合体になる過程を説明した図 本発明方法によって得られた高分子電解質複合体の経過日数と粒子径との関係を示すグラフ 高分子電解質複合体にTexas Redを内包せしめる手順を示した図 Texas Redの内包率を示すグラフ 高分子電解質複合体に酸性物質を内包せしめる手順を示した図 高分子電解質複合体に塩基性物質を内包せしめる手順を示した図

Claims (4)

1. 分解によって低分子化され且つ正に帯電したキトサンと、分解によって低分子化され且つ負に帯電したカルボキシメチルセルロースが、結合してゲル状となった高分子電解質複合体であって、この高分子電解質複合体は内部に荷電を持った物質を保持していることを特徴とする高分子電解質複合体。
2. 請求項１に記載の高分子電解質複合体において、前記ゲル状となった高分子電解質複合体の粒子径は３００ｎｍ以下であることを特徴とする高分子電解質複合体。
3. 以下の工程からなることを特徴とする高分子電解質複合体の製造方法。
   １） キトサンを弱酸に溶解しキトサン分子を正に帯電させる工程。
   ２） 正に帯電したキトサン分子をキトサン分解酵素によって切断して低分子化する工程。
   ３） 工程２）で低分子化されたキトサン溶液に負の荷電を有する物質の溶液を添加する工程。
   ４） カルボキシメチルセルロースを水に溶解しカルボキシメチルセルロース分子を負に帯電させる工程。
   ５） 負に帯電したカルボキシメチルセルロース分子をカルボキシメチルセルロース分解酵素によって切断して低分子化する工程。
   ６） 工程３）で得られた低分子化したキトサン溶液と、前記工程５）で得られた低分子化したカルボキシメチルセルロース溶液とを混合し、互いの正負の官能基を反応させてゲル状に結合する工程。
4. 以下の工程からなることを特徴とする高分子電解質複合体の製造方法。
   １） キトサンを弱酸に溶解しキトサン分子を正に帯電させる工程。
   ２） 正に帯電したキトサン分子をキトサン分解酵素によって切断して低分子化する工程。
   ３） カルボキシメチルセルロースを水に溶解しカルボキシメチルセルロース分子を負に帯電させる工程。
   ４） 負に帯電したカルボキシメチルセルロース分子をカルボキシメチルセルロース分解酵素によって切断して低分子化する工程。
   ５） 工程４）で低分子化されたカルボキシメチルセルロース溶液に正の荷電を有する物質の溶液を添加する工程。
   ６） 工程２）で得られた低分子化したキトサン溶液と、前記工程５）で得られた低分子化したカルボキシメチルセルロース溶液とを混合し、互いの正負の官能基を反応させてゲル状に結合する工程。