JP3417948B2

JP3417948B2 - 修飾された乳頭腫ウイルスｌ２タンパク質およびそれから形成されたｖｌｐ群

Info

Publication number: JP3417948B2
Application number: JP51978995A
Authority: JP
Inventors: フレイザー，イアン; ゾウ，ジアン
Original assignee: ザユニバーシィティオブクイーンズランド; シーエスエルリミテッド
Priority date: 1994-01-31
Filing date: 1995-01-31
Publication date: 2003-06-16
Anticipated expiration: 2018-06-16
Also published as: ES2187551T3; US5993821A; KR100353762B1; EP0750669A1; JPH09508273A; DE69528578T2; DE69528578D1; SG47362A1; ATE226253T1; NZ279166A; WO1995020659A1; EP0750669A4; DK0750669T3; AUPM358894A0; EP0750669B1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は修飾された乳頭腫ウイルスL2タンパク質およ
びそれから形成されたVLP群とりわけ前記VLP群を含む抗
原およびワクチンに関する。これら抗原およびワクチン
はこのようなウイルスにより起こる感染症の治療に有効
である。

従来技術乳頭腫ウイルス（PV）はヒトおよび動物両方に感染す
る（J.P.Sundberd著「Papilloma Virus Infections in
Animals」の評論参照。これはK.Syrjanen,L.Gissmannお
よびL.G.Koss編、Papilloma Viruses and Human Diseas
e,Springar−Verlag 1987に記載されている）。ヒト乳
頭腫ウイルスは小型DNAウイルスの仲間で、皮膚および
粘膜上皮の良性増殖過多病変をひき起こす。同定された
70種の異なるウイルス型のうち20種より多くが肛門性器
病変と関連がある（de Villiers,1989.J.Virol.63 4898
−4903）。

特にHPV16は泌尿性殖器の前悪性および悪性疾患、と
りわけ頚部癌、と関連がある（Durst等,1983.P.N.A.S.8
0 3812−3815;Gissmann等,1984.J.Invest.Dermatol.83
265−285）。HPV16感染症をもつ患者の血清中からHPV16
融合タンパク質に対する抗体（Jenison等,1990.J.Viro
l.65 1208−1218;Kchel等,1991.Int.J.Cancer 48 682
−688）および合成HPV16L1ペプチド（Dillner等,1990.I
nt.J.Cancer 45 529−535）が検出されたことにより、H
PVのキャプシドタンパク質中にＢエピトープが存在する
ことに確証が与えられたが、これら技術により同定され
たHPV16L1に特異的な抗体をもつ患者はわずかである。
インビトロでのPV増殖系はなく、HPV16感染と関連した
ヒト生殖器病変は殆どPV粒子を含まず、ウイルス構造タ
ンパク質の濃度は低い。従って、乳頭腫ウイルスに関す
るこれ以上の研究は制限されている。

PVキャプシドはL1およびL2と呼称されるウイルスによ
ってコード化された二つの構造タンパク質からなり、DN
A−タンパク質複合体上に構築されている（Galloway等,
1989.Adv.Virus Res 37 125−171）。単一のウイルスキ
ャプシドは72個の五量体カプソマーから構成されたＴ＝
7dイコサヘドロンで、その各々は５分子の主要キャプシ
ドタンパク質L1を含む（Baker等,1991.Biophys.J.60 14
45−1456;Finch等,1965 J.Mol,Biol.13 1−12）。少量
のキャプシドタンパク質L2はL1の量の約1/10で存在し
（Doorbar等,1987.J.Virol.61 2793−2799）、構造上の
未知の役割をもつ。L1タンパク質はＣ末端核局在化シグ
ナルによって核に向けられ（Zhou等,1991.Virology 185
625−632）、ウイルスの構築は核の中で起こる（Orth
等,1977.J.Virol,24 108−120;Pfister等,1987.Papillo
ma viruses:particles,genome organisation and prote
ins,p.1−18 K.Syrjanen,L.Gissmann,and L.G.Koss
（編）,Papilloma viruses and human disease.Springe
r−Verlag KG,ベルリン）。組換えL1タンパク質はウイ
ルスキャプシドに似た粒子に自己構築するが（Zhou等,1
993.J.Gen.Virol.74 763−768）、この構築はL2タンパ
ク質の存在で増進されるのでこのタンパクは感染性ビリ
オンの構築に必要なのかもしれない（Hagensee等,1993.
J.Virol.67 315−322;Zhou等,1991.Virology 185 251−
257）。

組換えPVL1タンパク質および組換えPVL1とPVL2タンパ
ク質とのコンビネーションは乳頭腫ウイルス感染症の予
防および治療用のワクチンの基礎となり、乳頭腫ウイル
ス検出のための抗原として使用される（国際出願公開WO
93/02184号明細書）。PVL2タンパク質の存在はワクチン
の免疫原性を増加させる（Zhou等,1991.Virology 185 2
51−257）。国際出願公開WO93/02184号明細書およびZho
u等により発表された研究論文（Zhou等,1991.Virology
185 251−257）の後に続いて、他の研究者達はヒト乳頭
腫ウイルスVLP群を発現させるための発現法を開発し
た。国際出願公開WO94/20137号明細書はヒト乳頭腫ウイ
ルスのL1タンパク質の発現およびバキュロウイルス発現
法を用いるSf−９昆虫細胞中でのVLP群の産生に関する
ものである。

また哺乳動物細胞および昆虫細胞中でのL1およびL2の
発現後のキャプシドの形成が二つの研究論文に開示され
ている（Hagensee等,1993,J.Virology 67 315およびKir
nbauer等,1992,PNAS 89 12180）。他の二つの国際出願
公開、即ち第WO94/00152号および第WO94/05792号明細
書、は組換え乳頭腫ウイルスL1タンパク質およびそれら
のワクチンとしての使用法ならびに診断目的の使用法に
向けられている。

しかし、PVL2タンパク質を含むVLP形成に関する一つ
の問題はキャプシド中へのDNAの取り込みである。乳頭
腫ウイルスVLPのキャプシド中にDNAが入ることはこれら
VLP群を含有するワクチンにとって望ましくない。事
実、ある国においては、ワクチン一回の注射量中に許容
されるDNAの量を制限することが法律で要求されてい
る。一回の注射量当りDNA10ピコグラムの濃度が上限と
して一般に使われている。この必要条件は一部には健康
な個人に外来DNAを導入することから来る感染のおそれ
によるのかもしれない。自然のままのL2タンパク質を含
有するワクチンに関する関心は、この濃度を超える量の
DNAが含まれているかもしれないということである。

発明の概要本発明の一つの目的は実質的に最小量のDNAを取り込
んだウイルス様粒子を提供することにある。

更に一つの目的は前記の問題を克服したワクチンを提
供することにある。

従って、本発明は、一つの方向において、実質的に最
小量のDNAを取り入れた１個以上の乳頭腫ウイルス様粒
子（VLP群）の製造法を包含するものであり、本法は（１）実質的に最小量のDNAと結合する乳頭腫ウイルスL
2タンパク質をコード化する組換えDNA分子を構築し、（２）前記組換えDNA分子を適当な宿主細胞中に導入し
て乳頭腫ウイルスL1タンパク質および前記乳頭腫ウイル
スL2タンパク質を発現せしめ、これから前記VLPを形成
させるという工程を含む。

「実質的に最小量のDNA」という用語は、DNAがPVL2タ
ンパク質により本質的に結合されていない状態あるいは
ワクチン一回の注射量当りDNA10ピコグラム以下あるい
は法律で定められた他のDNA限界値で存在する状況を包
含する。

本発明の第二の面は、前記乳頭腫ウイルスL2タンパク
質をコード化する組換えDNA分子にあることは明らかで
あろう。

更に本発明のもう一つの面は、前記乳頭腫ウイルスL2
タンパク質にある。このL2タンパク質はそのＮ−末端に
隣接する１〜12個のアミノ酸残基のうちの１個以上を野
生型L2タンパク質と比べて異なるように修飾するのがよ
い。

本発明は後の図４に示されたL2変異体（複数のことが
ある）をその範囲内に含むことが最も好ましい。

もう一つの面においては、本発明は前記乳頭腫ウイル
スL1およびL2タンパク質から形成された新規乳頭腫ウイ
ルスVLPにある。VLPを形成するL2タンパク質は最小数の
アミノ酸修飾をもつことが好ましい。

本発明は他の面で乳頭腫ウイルスVLP群を適当なアジ
ュバントと共に、あるいは無しに、含むワクチンを包含
する。

工程（１）に関して、組換えDNA分子は乳頭腫ウイル
スゲノムの供給源から適当に構築され、それによりL2遺
伝子は適当に設計されたプライマーを使用するPCR増幅
により増幅しうる。組換えDNA分子はPVゲノムあるいは
その一部分を含む適当なプラスミドから増幅するのがよ
い。好ましいゲノムはHPV16ゲノムである。

プライマーは塩基１〜36の１個以上をL2遺伝子の５′
末端から変えるものがよい。変化はなるべく欠失または
置換によるのがよい。増幅に対して最も好ましいプライ
マーの一覧を下に列記する（図６、図７および図８参
照）。L1およびL2遺伝子は哺乳動物あるいはウイルスプ
ロモーターから哺乳動物のまたはウイルスのポリアデニ
ル化信号で転写できる。L1およびL2遺伝子はワクシニア
ウイルスプロモーターから転写するのがよく、そして後
者は、適当と考えるならば、初期プロモーターでも後期
プロモーターでもよい。このようなプロモーターの一覧
はDavidson＆Moss,1989.J.Mol.Biol.210 749−769 and
1989.J.Mol.Biol.210 771−784に示されている。L2遺伝
子の転写を開始する適当なプロモーターはワクシニアウ
イルス後期プロモーター4bである。

L1およびL2遺伝子は別個のベクターにコード化しても
よいしあるいは同じベクターにコード化してもよい。適
当なベクターはプラスミド、コスミドおよび組換えウイ
ルスである。組換えDNA分子は、細胞中に移入できる１
個以上の組換えウイルスに含まれるのがよい。この目的
のために使用できる適当なウイルスにはバキュロウイル
ス、ワクシニア、シンドビスウイルス、SV40、Sendaiウ
イルス、アデノウイルス、レトロウイルスおよびポック
スウイルスがある。適当な宿主細胞は上記ウイルスと融
和しうる宿主細胞であり、それらには昆虫細胞、例えば
Spodoptera frugiperda,CHO細胞、ニワトリ胚繊維芽細
胞、BHK細胞、ヒトSW13細胞、ドロソフィラ（drosophil
a）、蚊細胞（Aedes albopictusから誘導されたもの）
あるいはサルの上皮細胞がある。他の真核生物細胞は酵
母細胞または他の哺乳動物細胞を含みうることも明らか
であろう。

適当な発現系には原核発現系、例えばE.coliおよびプ
ラスミドまたはコスミド発現ベクターあるいは真核系、
例えば組換えウイルスベクターまたは別法として酵母細
胞および酵母プラスミドとのコンビネーションとした前
記宿主細胞が包含される。

VLP群は移入細胞から適当な精製手段により得られ
る。乳頭腫ウイルス様粒子の適当な製造法および精製法
は第WO93/02184号明細書に提供されている。VLP群は適
当なアジュバント、例えばISCOMS、ミョウバン、フロイ
ント不完全アジュバントまたは完全アジュバント、Quil
Aおよび他のサポニン類あるいは、例えばVanselow,198
7,S.Vet.Bull.57 881−896に記載された他のアジュバン
トとのコンビネーションとすることができる。

ここで例示された本発明の種々な特に適当な具体例を
引用することにする。これらの特に適当な具体例におい
ては、特定の乳頭腫ウイルス、VLP群およびDNA組換え分
子の特定の構築を例として示したことに注目すべきであ
る。

実験 1.修飾された乳頭腫ウイルスL2タンパク質の構築材料および方法プラスミドの構築:VV発現に対しては、474アミノ酸HP
V16L2コード化領域に対応する読み取り枠を、HPV16ゲノ
ムを含むプラスミドからのPCRにより増幅した。５′プ
ライマーはL2読み取り枠ATGから上流のBam H I部位を
導入し、また３′プライマーは終止コドンを越えて位置
したSmalを導入した。増幅されたL2フラグメントをアガ
ロースゲルから溶離により回収し、Bam H IおよびSmal
で切断し、RK19中に結合させ（Kent,1988.Ph.D.学位論
文。ケンブリッジ大学、ケンブリッジ、英国）、L2発現
がVV後期プロモーター4bにより推進されるRK19/16L2を
つくり出す。次にHPV16L2および4bプロモーターをrVV構
築のためVV発現ベクターpSX3に移した（Zhon等,1991,Vi
rology 185,251−257）。

単純化されたベクターpUC18/4b16L2をつくり、そして
変異体L2遺伝子をVV発現に用いたベクター間に移し易く
するため、VV4bプロモーターを有するKlenow−平滑化Ml
ul−EcoR Iフラグメントおよび全HPV16L2読み取り枠をR
K19/16L2から切り離しpUC18に挿入した。L2のＣ−末端
切断を行うように設計されたプライマーを用いて、この
プラスミドをPCR増幅のためのDNA鋳型として使用した。
共通５′プライマー（M13RSP）（Zhou等,1991.Virology
185 625−632）およびコドン374,384,394,404,および4
14に終止コドン（TAA）を導入する３′プライマーのパ
ネルを用いることにより、L2タンパク質の残基374,384,
394,404および414へＣ末端的に切り取った変異体△374,
△384,△394,△404および△414をつくり出した。Ｃ末端
切除および点突然変異をひき起こすため本発明者等は
５′プライマーのパネルを用いた。ATGコドンをアミノ
酸2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,20,40,60,80,お
よび100にそれぞれ相当する位置に導入するプライマー
のセットを使用することにより、Ｎ−末端欠失体（△１
−2,△１−3,△１−4,△１−5,△１−6,△１−7,△１−
8,△１−9,△１−10,△１−11,△１−12,△１−13,△１
−14,△１−15,△１−20,△１−40,△１−60,△１−80,
および△１−100）をつくり出した。Ｎ−末端点変異（H
3P;K4P;2,4,5,N;R5P;S6N;S6P;A7P;K8P;R9P;および8,9N
と呼称）に対しては、不適正プライマー法（Zhou et a
l.,1991.Virology 185 625−632）によりアミノ酸3,4,
5,6,7,8,および９をプロリン（Pro）またはアスパラギ
ン（Asn）のいずれかに変えた。すべての変異体は発現
プラスミドの直接配列決定により確認した。

細胞およびウイルス。CV−１細胞は10％ウシ胎児また
は新生児血清（CSL,メルボルン，オーストラリア）で補
ったDulbeccoの修飾イーグル培地（GIBCO）で維持し
た。rVV群のプラーク精製単離物を、2.5％ウシ胎児血清
（CSL,メルボルン，オーストラリア）で補ったDulbecco
の修飾イーグル培地で発育させたCV−１細胞で増殖させ
た。

rVV構築。本発明者等はrVV構築のための既に既述され
た方法（Zhou等,1991.Virology 185 251−257）を使用
した。手短かに言えば、VV後期プロモーター4bから推進
された種々な変異体を含むHPV16L2遺伝子、選択可能マ
ーカーとしてのEscherichia coli gpt遺伝子（Coupar
等,1988.Gene 68 1−10;Falkner等,1988.J.Virol.62 18
49−1854）およびVV B24R遺伝子のフランキングフラグ
メント（Kotwal等,1989.J.Virol.63 600−606;Smith等,
1989.J.Gen;Virol.70 233−2343）あるいはチミジンキ
ナーゼ（TK）遺伝子を含むプラスミドを、VV WR株感染
（0.05PFU/細胞）CV−１細胞にリン酸カルシウム沈澱法
によって移入した。25μg/mlの濃度のマイコフェノール
酸存在下でCV−１細胞中のウイルスプラークを二回洗浄
した。

L1およびL2タンパク質の免疫沈降。CV−１細胞を約20
PFU/細胞の感染多量度でHPV16L1rVVまたはHPV16L2rVVに
より感染させた。48時間で、５×10⁵個の感染細胞をRIP
A緩衝液（150mM NaCl、１％Nonidet Ｐ−40,0.5％デ
オキシコーレート、0.1％硫酸ドデシルナトリウム［SD
S］、50mM Tris［pH8.0］）で溶解した。溶解した細胞
を12,000×ｇで短時間遠心し、その上澄を免疫沈降に用
いた。免疫沈降はモノクローナル抗HPV16L1抗体（McLea
n等,1990,J.Clin.Pathol.43 488−492）の1:20希釈ある
いは家兎抗HPV16L2抗体（D.A.Gallowayにより提供）の
1:2,000希釈液を用いて実施した。沈降したL1またはL2
タンパク質をタンパク質Ａ−セファロースビーズで集
め、RIPA緩衝液で４回洗浄した。タンパク質を、タンパ
ク質Ａ−セファロースビーズから、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（PAGE）試料緩衝液中で煮沸することによ
り取り出し、SDS−PAGEにより分析に供するため分離し
た。

サウスウェスタン分析。このサウスウェスタン（DNA
−タンパク質）分析は以前に公表された手順（McCall
等,1991.J.Invest.Dermatol.97 111−114;Moreland等,1
991.J.Virol.65 1168−1176）に基づいた。免疫沈降さ
せたHPV16L1およびHPV16L2タンパク質をSDS−10％ポリ
アクリルアミドゲル上で分離し、エレクトロブロッティ
ングによりニトロセルロースフィルターに移した。フィ
ルターを遮断緩衝液（10mM Tris［pH7.5］、５％脱脂
スキムミルク、10％グリセリン、2.5％Nonidet Ｐ−4
0、0.1mMジチオトレイトール［DTT］、150mM NaCl）で
４℃において12時間遮断した。次に、フィルターを結合
緩衝液（10mM Tris［pH7.5］、40mM NaCl、1mM EDT
A、1mM DTT、８％グリセリン、0.125％スキムミルク）
で洗浄した。³²P標識プローブを結合緩衝液に加え、イ
ンキュベーションを４℃で４時間続けた。結合緩衝液を
５回取り替えてフィルターを洗浄した。風乾後、それら
を包み、Ｘ線フィルムに当てた。その後フィルターを抗
HPV16L1または抗HPV16L2抗血清および¹²⁵I−タンパク質
Ａで再び厳密に調べタンパク質移動を確認した。

結合特異性分析。L2に特異的に結合するDNA配列は、
各25bpの二つの独特な配列によりはさまれた26個の無秩
序塩基対の中央区間を含む二本鎖76マーオリゴヌクレオ
チド（R76）のプールから選ばれた（Sovger等,1986,J.M
ol.Biol.191 639−658）。これらオリゴヌクレオチドの
配列は次の通りであった：ランダムオリゴヌクレオチド結合検定法は以前に本質
的に記述されたようにして（Treacy等,1991,Neture 35
0,577−584）実施した。手短かに言えば、免疫沈降法に
より精製されたL1およびL2タンパク質を、SDS−PAGEゲ
ル（10％ポリアクリルアミド）上で電気泳動にかけ、ニ
トロセルロースフィルターに移した。フィルターを50mM
KClおよび５％スキムミルクを含む緩衝液Ａ（20mM
Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタ
ンスルホン酸［HEPES］−HCl［pH7.9］,1mM DTT、10％
グリセリン、0.01％Nonidet Ｐ−40）中４℃で４時間
インキュベーションした。ランダムオリゴヌクレオチ
ドの³²P標識プールは、ランダム76−マ−オリゴヌクレ
オチド鋳型にアニールした前方プライマーにより開始さ
れた合成により調製し、フィルターに加え、４℃で一晩
インキュベーションした。洗浄は100mM KClに調節した
緩衝液Ａ中で（10分間洗浄２回）、次に200mM KClに調
節した緩衝液Ａ中で（10分間洗浄１回）４℃において行
った。フィルターをオートラジオグラフにかけ、結合し
たDNAに相当するフィルターの区域を切り取り、DNAを水
中100℃で加熱することにより溶離した。溶離されたDNA
を前方プライマーおよび後方プライマーを用いる30回の
PCRにより増幅し、２％アガロースゲル上で精製した。
その後の結合ラウンドに対し、76−bp生成物を、以前に
記述されたように（Sorger等,1986.J.Mol.Biol.191,639
−658）³²P標識ヌクレオチド存在下、18回のpCRにより
標識した。15回目の選択から得られたDNA（緩衝液Ａ中
での洗浄後もL2に結合したまま残った）を前記のように
溶離し、増幅し、pUC18にクローン化し、配列決定し
た。

イムノ−DNA結合検定。HPV16L2 rVV感染細胞からの
抽出液を調製し、前記のように免疫沈降法にかけた。タ
ンパク質Ａ−セファロースビーズに付着した免疫複合体
を、DNA結合緩衝液（10mM Tris［pH7.4］100mM NaC
l、1mM MgCl₂、1mM EDTA、８％グリセリン、1mM DT
T、５％スキムミルク）中４℃で２時間BamH I−Pst1、
消化HPV16DNAとインキュベーションした。インキュベー
ション後、ビーズを同じ緩衝液で室温において５回洗浄
した。タンパク質−DNA複合体を１％SDS−5mM EDTA中6
5℃で溶離した。DNAをフェノールで２回抽出し、エタノ
ールで沈殿させた。試料を1.5％アガロースゲル上で移
動させ、ナイロン膜上にブロットした。膜に結合したDN
AをPst I−BamH Iで消化した³²P標識HPV16DNAを用いる
サザンブロッティングにより検出した。

DNA配列決定。ジデオキシDNAの配列決定はSequenase
バージョン2.0キット（U.S.Biochemicals、クリーブラ
ンド、オハイオ州）を用いて行った。配列決定のために
２本鎖DNAを変性させるため、２μｇのDNAを200mM水酸
化ナトリウム中37℃で30分間インキュベーションした。
DNAをエタノール沈殿させ、製造者により明細を指示さ
れた通りに配列決定を行った。

結果 HPV16L2はDNAと結合する。PV構造タンパク質のDNA結
合活性を調べるため、本発明者等はrVVを使用して真核
細胞中でHPV16L1またはHPV16L2を発現させた。L1および
L2タンパク質を細胞溶解物から免疫沈降法により精製
し、SDS−PAGE（10％ポリアクリルアミド）により分離
し、ニトロセルロースフィルターに移した。これらタン
パク質がDNAに結合していることを40mM NaClを含む緩
衝液中で³²P標識PVゲノムDNAおよびバクテリオファージ
λDNAを用いるサウスウェスタンブロッティングによ
り調べた。HPV16L2タンパク質はHPVゲノムDNAとλDNAの
両方に結合した（図1B,レーン２から５）。これとは著
しく異なって、HPV16L1タンパク質はいずれの標識DNAと
も結合しなかったが（図1A、レーン２から５）、抗HPV1
6L1モノクローナル抗体を用いることにより精製L1タン
パク質をフィルター上で検出することができた（図1A、
レーン１と６）。150mM NaClまで含む緩衝液中でのこ
れ以上の実験はDNAがHPV16L1に結合しないことを示した
（データは示さず）。これらの結果はHPV16L2タンパク
質がDNA結合配列を含むが、HPV16L1タンパク質はそうで
ないことおよびHPV16L2によるDNAは認識は配列特異的で
はないかもしれないことを示唆している。

HPV16L2N末端はDNA結合形成に重要である。DNAに対す
るL2の結合の原因となるタンパク質配列を確認するため
に、本発明者等は先ずHPV16L2の予想されるアミノ酸配
列中のDNA結合対象を調べた。HPV16L2はリジンおよびア
ルギニンに富む高度に帯電した二つの領域をもつ。第一
の領域はアミノ酸１−12からタンパク質のＮ末端をつく
り上げており（MRHKRSAKRTKR）、第二の領域はアミノ酸
456〜461からなりＣ末端内に存在する（RKRRKR）。

いずれの帯電領域がL2に対するDNA結合に関与するの
かを決定するために、本発明者等はHPV16L2における突
然変異で欠失変異体の系列をつくった。HPV16L2タンパ
ク質の種々なＣ末端あるいはＮ末端変異をコード化する
構築物を、rVV群でHPV16L1の合成を能率よく指図するこ
とが前以て示されたプラスミドpS×３中に挿入した（Zh
ou等,1991,Virology 185,625−632）。各変異体L2遺伝
子を含むrVVでCV−１細胞を感染させ、細胞溶解物を家
兎抗HPV16L2抗体を用いる免疫沈降法により分析した。
各変異タンパク質の期待される相対的大きさを、端を切
り取ったタンパク質の電気泳動的移動度を野生型L2タン
パク質と比較することによって確認した（データは示さ
ない）。

欠失変異体を、自然のままのL2タンパク質の結合と関
連する条件下で、サウスウェスタン法により³²P標識HPV
16ゲノムDNAへの結合について調べた。最も長い欠失を
受けた△374を含めて、試験したすべてのＣ末端欠失変
異体は存在する免疫反応性L2タンパク質の量に比例して
HPVDNAと結合した（図2A、レーン△374）。DNA結合に対
するL2のＮ末端の寄与を詳細に描写するために、本発明
者等はL2のＮ末端欠失変異体を構築した。L2の最初の60
個、80個および100個のアミノ酸を欠失させた３種の変
異体は各々HPVDNAと結合できなかった（図2A、レーン△
１〜60から△１〜100）。Ｎ−末端DNA結合領域を更に詳
しく特徴づけるため、本発明者等はアミノ酸１から15の
一連の小さい欠失体についてそのDNA結合活性を試験し
た。２位のアルギニン残基だけを失った最小の欠失体を
含めてこれらの各々はDNAと結合できなかった（図3A、
レーン△１〜２から△１〜15）。これらの結果は決定的
なDNA結合配列がL2のＮ末端にあること、そして結合は
２位のアルギニンを含む帯電したアミノ酸に依存するこ
とを示唆している。

L2タンパク質はDNA結合に対しアルギニンに富む対象
を使用している。１位から初めてHPV16L2に対するＮ末
端のアミノ酸配列はMRHKRSAKRTKR（帯電アミノ酸に下線
を引いた一文字符号）である。DNA結合におけるL2タン
パク質のＮ末端の役割を部位特異的変異誘発により更に
評定した。最初の９個のアミノ酸の変異をもつ10個の置
換変異体をrVVにより発現させ、それらのDNA結合活性を
³²P標識HPV16ゲノムDNAを用いたサウスウェスタンブロ
ッティングにより調べた。構築された種々な変異体L2タ
ンパク質の同様な量もDNA結合に利用した。これはK8Pを
除き、ブロット上の免疫反応性L2タンパク質の分析によ
り決定した（図3B、下方パネル）。幾つかの帯電アミノ
酸残基（Lys−4,Lys−8,Arg−９）のProまたはAsn（K4P
および8,9N）への変異はDNAとの結合を破壊したが（図3
B、レーンK4Pおよび8,9N）、Arg−５をProで置換（R5
P）すると結合活性を減少させる（レーンR5P）。これと
は著しく違って、Pro（R9P）によるArg−９の置換はDNA
結合に効果をもたなかった（レーンR9P）。Lys−Argク
ラスターの間での中性アミノ酸の変異はDNA結合活性に
対して余り影響をもたない。Proの代りにHis−3,Ser−
6,およびAla−７の置換を生じたH3P,S6P,およびA7Pで終
る変異は、野生型L2との結合に匹敵しうるDNAとの結合
を示した（レーンH3P,S6P,およびA7P）。これに対しSer
−６をAsn（S6N）に変えるとDNA結合形成を破壊した
（レーンS6N）。これらの結果はDNAとの結合に４個の帯
電アミノ酸のクラスターが重要であることを示唆する。
これらの帯電アミノ酸クラスターの各々において、DNA
結合に対しては少なくとも１個の帯電アミノ酸の保持が
必要なようである。柔軟性の二次構造もL2−DNA相互作
用に重要であるかもしれない。それはSer−６のProによ
る置換およびArg−５およびArg−９の置換はDNA結合を
破壊せず、それに対しSer−６をAsnで置換するとL2−DN
A結合機能が除かれるからである。L2−DNA相互作用の結
果の要約を図４に示す。

L2−DNA相互作用はDNA配列特異性を有しない。本発明
者等はオリゴヌクレオチドのライブラリーを用い、精製
したHPV16L2タンパク質にそれらを結合させて、高親和
性の標的DNA配列を選択した。このオリゴヌクレオチド
は26の位置でランダムであり、プライマーおよびクロー
ン化配列と接している。L2をこれらオリゴヌクレオチド
のプールとインキュベーション後、L2タンパク質に結合
したオリゴヌクレオチドを溶離し、その後の選択のラウ
ンドに向けてPCRにより増幅した。選択および増幅は６
回行なった。選択ラウンド５および６の後に回収された
DNAクローンの配列決定を行った。確率論によれば、52
のランダム26−マ−配列のうちトリヌクレオチドは20ク
ローン（95％信頼間隔、15から26）中に見出される筈で
あり、そして４ヌクレオチドの明記された配列は26−マ
−の５に見出される筈である（95％信頼間隔、０から
９）ことが予想される。52の26−マ−クローン中、最も
普通に観察されるトリヌクレオチド（GGG）は24クロー
ン（５で２倍、１で３倍）に存在するのに対し、4bp（G
GGG）の最も普通の系列は８クローン中に観察された。
従って短いヌクレオチドの配列が、これらクローンの中
に、偶然だけで予期されるよりも高い頻度で選ばれたと
いう証拠はなかった。更にまた、もっと複雑なヌクレオ
チド保存様式は標準配列整合プログラムを用いることに
よって観察されなかった。これらの結果は、L2とDNAと
の間の高親和性の結合がDNA配列と無関係な過程であこ
とを示唆する。二つの追加実験はこの観察を確証した。
第一に、HPV16L2rVVで感染させた細胞からの抽出物を抗
L2抗体で免疫沈降させ、沈殿したタンパク質−抗体複合
体を、セファロースビーズに付着させて、HPV16ゲノムD
NAからの制限フラグメントの混合物に結合させた。結合
しなかったDNAを洗浄し去った後、結合したDNAフラグメ
ントをアガロースゲル上で分割し、³²P標識HPV16DNAを
用いるサザンブロッティングにより検出した。セファロ
ースビーズに抗L2抗体と共に結合したHPV16L2含有抽出
物はHPV16DNAフラグメントの各々を保持したのに対し
（図5A、レーン3,6,および７）、これらフラグメントの
うち抗L1抗体と共にビーズに結合されたL1 rVV感染細
胞抽出物によって（データを示さず）、あるいはL2特異
的抗体と共にビーズに結合された野生型VV感染細胞抽出
物によって（図5A、レーン２）結合されたものはなかっ
た。第二に、固定量のL2タンパク質を³²P標識HPV DNA
フラグメントと共に、100倍（レーン４）または1,000倍
（レーン５）過剰の未標識λDNA存在下でインキュベー
ションし、そしてL2を結合DNAと共にL2に対する抗体に
よって混合物から免疫沈降させた。ファージλDNAはHPV
DNAの結合を防止できた。本発明者等は、これら基準
の各々により、L2はDNA配列特異的な仕方ではDNAと相互
作用しないと結論する。

2.修飾乳頭腫ウイルスL2タンパク質によるウイルス様粒
子の製造修飾された乳頭腫ウイルスL2タンパク質により生成す
るウイルス様粒子は、第WO93/02184号明細書に概述され
た手順により製造できる。ウイルス様粒子の適当な製造
法を例として下に示す。

10％ウシ胎児血清（CSL）で補ったDulbecco修飾イーグ
ル培地（GibcoまたはCSL）中５％CO₂の雰囲気で37℃に
おいて、CV−１細胞を組織培養フラスコの中で標準細胞
培養条件下80％の集密度まで培養した。次に、2.5％ウ
シ胎児血清で補なったDulbecco修飾イーグル培地中で、
細胞を１から2pfu/細胞の組換えワクシニアウイルス16L
1（pS×16L₁）および組換えワクシニアウイルス16L₂△
７（Rkgpt19△１〜７）により感染させた。この培地ヘ
マイコフェノール酸を最終濃度25μg/mlで加えた。この
細胞培養を更に48〜60時間インキュベーションした。次
に細胞を組織培養フラスコからすりはがし、４℃で1,50
0×ｇの遠心を10分間行うことによりペレット化した。
ペレットを溶かし、2mM PMSF（プロテアーゼ阻害物
質）を含むリン酸塩緩衝食塩水（pH7.4）20ml中に細胞
を再び浮遊させた。この細胞浮遊液を４℃で貯蔵する
か、−20℃で凍結し、この時精製手順を中断した。

次に細胞浮遊液をWheatonガラスダウンスホモジナイ
ザーに入れ、氷上に10分保持した。細胞をダウンス（Do
unce）ホモジナイザーの50回の往復運動により粉砕し
た。再浮遊液の少量の試料を顕微鏡により調べ、細胞が
粉砕されているかどうかを決定した。すべての細胞が粉
砕されるまで均一化を続けた。

溶解物を４℃で10分間1500×ｇで遠心した。くもった
上澄を捨て、ペレットを2mM PMSFを含むリン酸塩緩衝
食塩水（pH7.4）20ml中に吸引により再浮遊させた。こ
の再浮遊材料を、次に氷上で30秒間超音波処理し（Soni
cs Materials Inc.USAから市販されているVibra Cell S
onicator,80にセット）ウイルス粒子を核から解放し
た。2mM PMSFを含むリン酸塩緩衝（pH7.4）食塩水でこ
の超音波処理液を60mlに希釈した。

４本の38ml超透明遠心管の各々の中で、リン酸塩緩衝
食塩水（pH7.4）中氷冷20％w/vショ糖23mlの上に、15ml
の氷冷再浮遊超音波処理液を重ねた。この超音波処理液
をSW−28ローター中４℃で２時間95000×ｇ（ローター
中央点）で遠心した。上澄およびショ糖を捨て、ペレッ
トをリン酸塩緩衝食塩水（pH7.4）で洗浄した。ペレッ
トを氷上60秒間超音波処理（Sonics Materials Inc.USA
から販売されているVibra Cell Sonicator,80にセッ
ト）により、2mM PMSFを含むリン酸塩緩衝食塩水（pH
7.4）10ml中に再浮遊させた。この再浮遊液を、2mM PM
SFを含むリン酸塩緩衝食塩水（pH7.4）で20mlに希釈し
た。0.481g/mlの塩化セシウムを最終体積23mlまで加え
た。再浮遊液をSW−41ローターで21℃において18時間22
0000×ｇ（中位管）で遠心した。遠心後、二つの帯が観
察された。上方の帯はメニスカスの約1cm下に観察され
たのに対して、下方の帯は上方の帯の約1cm下に認めら
れた。両帯ともウイルス様粒子を含んでいた。両端を吸
引により取り出した。上方の帯のウイルス様粒子は下方
帯からのウイルス様粒子ほどはよく形づくられないこと
が多かった。これらの帯をリン酸塩緩衝食塩水（pH7.
4）５に対し室温で２時間あるいは４℃で24時間まで
透析した。ウイルス様粒子調製物を−20℃で貯蔵した。

（ａ）L1およびL2タンパク質の検出塩化セシウムで精製したウイルス様粒子調製物の試料
を５×希釈緩衝液（0.05M（最終濃度）Tris−Cl（pH6.
8）、10％グリセリン、10％ドテシル硫酸ナトリウム（S
DS）、10％２−β−メルカプトエタノール（0.05％）、
水で100％にした）中に希釈した（1:10）。この希釈試
料をSDS−PAGE（10％ポリアクリルアミド）上に負荷
し、電気泳動にかけた。標準手順と条件に従った（Towb
in等,1979,Virology 175 1−９）。

タンパク質の分子量決定：電気泳動後、ゲルをクーマ
シーブルー染色材（クーマシーブリリアントブルー（1g
/）、40％メタノール、10％酢酸および50％水）で１
〜24時間染色した。このゲルをメタノール−酢酸溶液
（メタノール40％、酢酸10％および水50％）中で１〜24
時間染色を除き、乾燥した。

L1およびL2タンパク質の同定：別々の、ただし同一の
SDS−PAGEゲル上で、そこに含まれたタンパク質をウエ
スタンブロッティングにより分析し、L2タンパク質がウ
イルス様粒子上に存在するかどうかを決定した。標準ウ
エスタンブロッティング技術を用いた（Harlow and Lan
e,1988,Immunoblotting（Chapter 12）、Antibody−A l
aboratory manual,Harlow and Lane（編）、Cold Sprin
g Harbour Laboratory press）。

SDS−PAGEゲルから得たタンパク質をニトロセルロー
ス濾紙に移した。ニトロセルロース濾紙を小片に切り、
５％スキムミルク粉を含むリン酸塩緩衝食塩水（pH7.
4）で４℃において一晩遮断した。この第一抗体をニト
ロセルロース濾紙片と共に５％ミルク粉を含むリン酸塩
緩衝食塩水（pH7.4）中かきまぜながら室温で1.5時間イ
ンキュベーションした。この第一抗体はHPV16L1タンパ
ク質を検出するためのモノクローナルマウス抗HPV16L1
抗体とポリクローナル家兎抗HPV16L1抗体、およびHPV16
L2タンパク質を検出するためのポリクローナル家兎抗HP
V16L2抗体を含有した。第一抗体とのインキュベーショ
ン後、ニトロセルロース濾紙片を、0.05％Tween20を含
むリン酸塩緩衝食塩水（pH7.4）中で３回洗浄した（１
回洗浄当り10分間）。第二抗体をニトロセルロース濾紙
片と共に５％スキムミルク粉を含むリン酸塩緩衝食塩水
（pH7.4）中室温でかきまぜながら１時間インキュベー
ションした。この第二抗体はセイヨウワサビペルオキシ
ダーゼ抗家兎あるいはセイヨウワサビペルオキシダーゼ
抗マウス免疫グロブリンのいずれかである。前記のよう
に３回の洗浄を繰り返した。ニトロセルロース濾紙片を
リン酸塩緩衝液（pH7.4）で30秒から１分すすいだ。ニ
トロセルロース濾紙片を、DAB（ジアミノベナジン）18m
l、リン酸塩緩衝液（pH7.6）27ml、0.3％塩化コバルト3
mlおよび30％過酸化水素30μｌを含む溶液中に10〜90秒
間置いた後、あるいは帯が現われると直ちに発色させ
た。ニトロセルロース濾紙片を水ですすぎ、乾燥させ
た。

全タンパク質定量：各塩化セシウム勾配で精製した調
製物からの３本の５μｌ試料を、存在するタンパク質の
全量についてBCAタンパク質検定試薬により製造者（Pie
rce）の記載通りに分析した。

（ｂ）ウイルス様粒子形成の検出塩化セシウム勾配で遠心することにより精製し、0.1
から0.5M Tris−HClに対して少なくとも２時間、なる
べくは24時間４℃で透析して調製物から塩化セシウムを
除去したウイルス様粒子調製物の試料（約0.05ml）をホ
ルムバル（formvar）被覆したEMグリッド上に置き、１
％または２％いずれかのモリブデン酸アンモニウム（pH
6.5）で陰画様に染色した。試料を含むグリッドを日立
Ｈ−800透過型電子顕微鏡で検査した。

図の説明図1A HPV16L1DNA結合活性の特性。rVV感染CV−１細胞から
生じたHPV16L1タンパク質をL1特異性抗体により免疫沈
降させ、SDS−PAGEにより分離し、ニトロセルロースに
移した。DTTを含む遮断緩衝剤中でタンパク質をリネー
チャー（再生）し、HPV16（レーン２）、HPV6b（レーン
３）、HPV11（レーン４）、またはファージλ（レーン
５）からの³²P標識したDNAとインキュベーションした。
未結合DNAを除去し、DNA結合タンパク質をオートラジオ
グラフィーにより検出した。イムノブロット法により決
定したL1タンパク質の位置を示す（レーン１と６）。

図1B HPV16L2DNA結合活性の特性。rVV感染CV−１細胞から
生じたHPV16L2タンパク質をL2特異性抗体により免疫沈
降させ、SDS−PAGEにより分離し、ニトロセルロースに
移した。DTTを含む遮断緩衝剤中でタンパク質をリネー
チャーし、HPV16（レーン２）、HPV6b（レーン３）、HP
V11（レーン４）、またはファージλ（レーン５）から
の³²P標識DNAとインキュベーションした。未結合DNAを
除去し、DNA結合タンパク質をオートラジオグラフィー
により検出した。イムノブロット法により決定したL2タ
ンパク質の位置を示す（レーン１および６）。

図2A HPV16L2DNA結合領域の定義。L2タンパク質をSDS−PAG
Eにより分離し、ニトロセルロースフィルターに移し、
³²P標識したHPV16DNAでプローブ化した。Ｃ末端アミノ
酸欠失を次のように呼ぶ：アミノ酸374から474までを△
374,384から474までを△384,394から474までを△394,40
4から474までを△404,そして414から474までを△414。
Ｃ−末端の終りから100までのアミノ酸の除去はDNA結合
形成に対し影響がなかった。Ｎ−末端アミノ酸欠失を次
のように呼ぶ：アミノ酸１から60までを△１−60,1から
80までを△１−80、そして１から100までを△１−100。
Ｎ−末端配列の除去はDNA結合形成を著しく減じた。

図2B HPV16L2DNA結合領域の定義。L2タンパク質をSDS−PAG
Eにより分離し、ニトロセルロースフィルターに移し、L
2特異性抗血清でプローブ化した。Ｃ−末端アミノ酸欠
失を次のように呼ぶ：アミノ酸374から474までを△374,
384から474までを△384,394から474までを△394,404か
ら474までを△404,そして414から474までを△414。Ｎ−
末端アミノ酸欠失を次のように呼ぶ：アミノ酸１から60
までを△１−60、１から80までを△１−80、そして１か
ら100までを△１−100。L2帯を矢印により示す。

図3A L2 Ｎ−末端変異をもつ変異体を用いることにより定
義されるHPV DNA L2タンパク質相互作用。各レーンの
上に示した欠失をもつＮ末端切除L2タンパク質をSDS−P
AGEにより分離し、ニトロセルロース膜へ移し、³²P標識
したHPV16DNA（上方パネル）とインキュベーションし
た。³²P標識DNAを除去し、L2タンパク質の定量のため家
兎抗HPV16L2抗体で再標識した（下方パネル）。L2帯を
矢印により示し、分子質量マーカーを左に示す。置換を
次のように符号化する： WT,野生型VV;H3P,His−３をProに;K4P,Lys−４をProに;
2,4,5N,Arg−２をAsnに,Lys−４をAsnに,Arg−５をAsn
に;R5P,Arg−５をProに;S6N,Ser−６をAsnに;S6P,Ser−
６をProに;A7P,Ala−７をProに;K8P,Lys−８をProに;R9
P,Arg−９をProに;8,9N,Lys−８をAsnに、ArgをAsnに。

図3B L2 Ｎ−末端異変をもつ変異体を使用することにより
定義されるHPV DNA L2タンパク質相互作用。各レーン
の上に示したL2タンパク質の置換変異体を³²P標識HPV16
ゲノムDNAとインキュベーション（上方パネル）、ある
いは家兎抗HPV16L2抗血清とインキュベーション（下方
パネル）した。L2帯を矢印により示し、分子質量マーカ
ーを左に示す。置換を次のように符号化する： WT,野生型VV;H3P,His−３をProに;K4P,Lys−４をProに;
2,4,5N,Arg−２をAsnに,Lys−４をAsnに,Arg−５をAsn
に;R5P,Arg−５をProに;S6N,Ser−６をAsnに;S6P,Ser−
６をProに;A7P,Ala−７をProに;K8P,Lys−８をProに;R9
P,Arg−９をProに;8,9N,Lys−８をAsnに,Arg−９をAsn
に。

図４変異L2タンパク質のHPV DNAへの結合。各変異体に対
しタンパク質の配列を示す（一文字コード、保存された
アミノ酸をダッシュで示す）。サウスウェスタンブロッ
ト分析によるタンパク質へのDNAの結合を（＋または
−）により示す。

図5A rVVからのHPV16L2タンパク質に対するDNA結合検定。L
2タンパク質を抗L2抗体で免疫沈降させた。等量のL2タ
ンパク質をPst1−BamH I切断HPV16ゲノムDNAとインキュ
ベーションした。結合したDNA断片を１％SDSで溶離し、
³²P標識HPV16DNAによるサザンブロッティングにかけた
（レーン3,6および７）。幾つかの実験においては、HPV
DNAとL2タンパク質との最初のインキュベーションに
対し100倍（レーン４）または1,000倍（レーン５）モル
過剰のファージλDNAを加えた。野生型VV感染細胞から
の対照沈殿のMock検定も示す（レーン２）。左側の入力
DNA断片にＡからＧまでの符号をつけてある。

図5B HPV16DNAの直線化した地図を下に示す。制限部位はPs
t1（ｐ）およびBamH I（ｂ）であり、対応する断片に大
きさに応じてＡからＧの符号をつけた。

図６野生型HPV16L2タンパク質のアミノ酸配列。

図７野生型HPV16L2遺伝子のデオキシリボ核酸配列。

図８ HPV16L2変異体を構築するために用いたPCRプライマー
のヌクレオチド配列。

Ｃ−末端欠失 PCRで増幅した4bプロモーター/L2フラグメントをSma
Iで切断し、pS×３中にクローン化して（Zhou等,1990,
J.Gem.Viol.71,2185−2190）ワクシニア発現プラスミド
をつくった。

Ｎ−末端変異制限酵素BamH IおよびSma Iの部位に下線を付け、開
始コドンATGと終止コドンTAAはボールドで示す。増幅さ
れたPCR生成物をBamH IおよびSma Iで消化し、RK19BamH
I/Sma I部位にクローン化した（Kent,1988）。ワクシ
ニア4bプロモーターおよびL2変異体ORFをpS×３にクロ
ーン化し（Zhou等,1990）種々なL2変異体ORFを含むワク
シニア発現プラスミドを調製した。

配列表（２）配列番号:1: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:25塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号:2: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:25塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:2: （２）配列番号:3: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:25塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:3: （２）配列番号:4: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:25塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:4: （２）配列番号:5: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:12アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:5: （２）配列番号:6: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:6アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:6: （２）配列番号:7: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:12アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:7: （２）配列番号:8: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:8: （２）配列番号:9: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:29アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:9: （２）配列番号:10: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:16アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:10: （２）配列番号:11: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:11: （２）配列番号:12: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:12: （２）配列番号:13: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:13: （２）配列番号:14: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:14: （２）配列番号:15: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:15: （２）配列番号:16: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:16: （２）配列番号:17: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:17: （２）配列番号:18: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:18: （２）配列番号:19: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:19: （２）配列番号:20: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:20: （２）配列番号:21: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:21: （２）配列番号:22: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:22: （２）配列番号:23: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:23: （２）配列番号:24: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:24: （２）配列番号:25: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:473アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号:25: （２）配列番号:26: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:1422塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:26: （２）配列番号:27: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:17塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:27: （２）配列番号:28: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:41塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:28: （２）配列番号:29: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:45塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:29: （２）配列番号:30: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:44塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:30: （２）配列番号:31: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:47塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:31: （２）配列番号:32: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:41塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:32: （２）配列番号:33: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:32塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:33: （２）配列番号:34: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:37塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:34: （２）配列番号:35: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:37塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:35: （２）配列番号:36: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:39塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:36: （２）配列番号:37: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:37塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:37: （２）配列番号:38: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:38塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:38: （２）配列番号:39: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:36塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:39: （２）配列番号:40: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:36塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:40: （２）配列番号:41: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:43塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:41: （２）配列番号:42: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:40塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:42: （２）配列番号:43: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:37塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:43: （２）配列番号:44: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:37塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:44: （２）配列番号:45: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:35塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:45: （２）配列番号:46: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:39塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:46: （２）配列番号:47: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:37塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:47: （２）配列番号:48: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:37塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:48: （２）配列番号:49: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:37塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:49: （２）配列番号:50: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:36塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:50: （２）配列番号:51: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:36塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:51: （２）配列番号:52: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:34塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:52: （２）配列番号:53: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:34塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:53: （２）配列番号:54: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:43塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:54: （２）配列番号:55: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:34塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:55: （２）配列番号:56: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:43塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:56: （２）配列番号:57: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:34塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:57: （２）配列番号:58: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:37塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:58: （２）配列番号:59: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:43塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:59: （２）配列番号:60: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:43塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:60: （２）配列番号:61: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:46塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:61: （２）配列番号:62: （ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ:44塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（xi）配列：配列番号:62:

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/025 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者ゾウ，ジアンオーストラリア国 4074 クイーンズランド，ジンダリー，コランガストリート 21 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C07K 14/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】DNAと結合しないか、又は野生型の乳頭腫
ウイルスL2タンパク質に比べてDNAに結合する能力が弱
っている修飾乳頭腫ウイルスL2のアミノ酸配列を含む乳
頭腫ウイルスL2タンパク質であって、該乳頭腫ウイルス
L2タンパク質は野生型の乳頭腫ウイルスL2タンパク質に
比べて完全なＣ末端領域及び修飾又は欠失されたＮ−末
端配列を含む、上記乳頭腫ウイルスL2タンパク質。
【請求項２】該野生型乳頭腫ウイルスL2タンパク質が配
列番号:25を含む、請求項１に記載の乳頭腫ウイルスL2
タンパク質。
【請求項３】配列番号:25の１から15のアミノ酸残基の
一つ又はそれ以上が修飾されているか又は欠失されてい
る、請求項２に記載の乳頭腫ウイルスL2タンパク質。
【請求項４】該L2タンパク質のＮ−末端配列が、配列番
号:9、10、11、13、14、16、19、21、22、23及び24から
なる群から選択される、請求項１に記載の乳頭腫ウイル
スL2タンパク質。
【請求項５】サウスウエスタンブロットアッセイにおけ
る検出のとおり、DNAと結合しないか、又は野生型の乳
頭腫ウイルスL2タンパク質に比べてDNAに結合する能力
が弱っている、請求項１に記載の乳頭腫ウイルスL2タン
パク質。
【請求項６】請求項１に記載の乳頭腫ウイルスL2タンパ
ク質をコードする、ヌクレオチド配列。
【請求項７】請求項１の乳頭腫ウイルスL2タンパク質
を、適当なアジュバントと組み合わせて含む、乳頭腫ウ
イルス感染の治療又は予防用のワクチン。
【請求項８】DNAと結合しないか、又は野生型の乳頭腫
ウイルスL2タンパク質に比べてDNAに結合する能力が弱
っている、乳頭腫ウイルスL2タンパク質であって、野生
型の乳頭腫ウイルスL2タンパク質と比べて、修飾又は欠
失された一つ又はそれ以上のアミノ酸残基をＮ−末端領
域中に有し、かつ該L2タンパク質は乳頭腫ウイルスL1タ
ンパク質と結合し、ウイルス様の粒子を形成することが
できる、上記乳頭腫ウイルスL2タンパク質。
【請求項９】該野生型乳頭腫ウイルスL2タンパク質が配
列番号:25を含む、請求項８に記載の乳頭腫ウイルスL2
タンパク質。
【請求項１０】DNAと結合しないか、又は野生型の乳頭
腫ウイルスL2タンパク質に比べてDNAに結合する能力が
弱っている乳頭腫ウイルスL2タンパク質であって、野生
型の乳頭腫ウイルスL2タンパク質と比べ修飾又は欠失さ
れた、一又はそれ以上のアミノ酸残基をＮ−末端領域中
に有し、かつ、該L2タンパク質は融合タンパク質ではな
い、上記乳頭腫ウイルスL2タンパク質。
【請求項１１】該野生型乳頭腫ウイルスL2タンパク質が
配列番号:25を含む、請求項10の乳頭腫ウイルスL2タン
パク質。
【請求項１２】乳頭腫ウイルスL1タンパク質及び乳頭腫
ウイルスL2タンパク質を含む一又はそれ以上のウイルス
様粒子の製造方法であって、該乳頭腫ウイルスL2タンパ
ク質はDNAに結合しないか、又は野生型の乳頭腫ウイル
スL2タンパク質に比べてDNAに結合する能力が弱ってい
て、野生型の乳頭腫ウイルスL2タンパク質と比べて修飾
又は欠失された、一又はそれ以上のアミノ酸残基をＮ−
末端領域中に有し、かつ、該方法が工程：（１）該乳頭腫ウイルスL2タンパク質をコードするDNA
配列を含む組換えDNA分子であって、当該配列がプロモ
ーターに、作用可能なように結合している上記組換え分
子を構築する工程；（２）該組換えDNA分子を適当な宿主細胞に導入する工
程；（３）該乳頭腫ウイルスL1タンパク質の存在下、該宿主
細胞において該乳頭腫L2タンパク質を発現させて、一又
はそれ以上のウイルス様粒子を形成する工程；（４）該細胞から該一又はそれ以上のウイルス様粒子を
回収する工程、を包含する、上記製造方法。
【請求項１３】該乳頭腫ウイルスL2タンパク質は、配列
番号:25の１から15のアミノ酸残基の一つ又はそれ以上
が修飾又は欠失されていることを特徴とする、請求項12
に記載の方法。
【請求項１４】該L2タンパク質のＮ−末端配列が配列番
号:9、10、11、13、14、16、19、21、22、23及び24から
なる群から選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】該組換えDNA分子はまた、該乳頭腫ウイ
ルスL1タンパク質をコードする別のDNA配列を包含し、
該別のDNA配列はプロモーターに、作用可能なように結
合されている、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】該乳頭腫ウイルスL1タンパク質が、乳頭
腫ウイルスL2タンパク質をコードする組換えDNA分子と
は異なる組換えDNA分子にコードされ、そこから発現さ
れる、請求項12に記載の方法。
【請求項１７】該乳頭腫ウイルスL1タンパク質をコード
するDNA配列を含む異なる組換えDNA分子であって、該配
列がプロモーターに作用可能なように結合している上記
組換えDNA分子、を該宿主細胞に導入する工程をさらに
包含する、請求項12に記載の方法。
【請求項１８】請求項１に記載のタンパク質を含むウイ
ルス様粒子。
【請求項１９】適当なアジュバントとの組み合わせで一
又はそれ以上の請求項18のウイルス様粒子を含む、乳頭
腫ウイルス感染の治療又は予防用のワクチン。