KR20010072470A

KR20010072470A - 사람 유두종바이러스 바이러스-유사 입자의 정제방법

Info

Publication number: KR20010072470A
Application number: KR1020017001885A
Authority: KR
Inventors: 쿡3세제임스씨
Original assignee: 폴락 돈나 엘.; 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2001-07-31
Also published as: WO2000009671A1; CY1105084T1; US6602697B1; AU760633B2; HUP0103091A2; JP4440471B2; CA2339034C; SK2232001A3; SI1105466T1; EP1105466B1; HRP20010113A2; IL141130A0; HUP0103091A3; CZ2001570A3; ES2262333T3; EP1105466A4; PT1105466E; EP1105466A1; EA200100236A1; AU5469899A

Abstract

본 발명의 유두종바이러스 바이러스-유사 입자(VLP)의 정제방법은 부분적으로 정제된 VLP 함유 용액을 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과시킴을 포함한다. 이어서, VLP는 포스페이트 음이온을 함유하는 완충액을 사용하여 용출시킨다. 이 방법의 잇점에는 고수율로 완전한 VLP을 회수하는 것이 포함된다.

Description

사람 유두종바이러스 바이러스-유사 입자의 정제방법{Process for purifying human papillomavirus virus-like particles}

유두종바이러스 감염은 사람, 양, 개, 고양이, 토끼, 원숭이, 뱀 및 소를 포함한 각종 동물에서 발생한다. 유두종바이러스는 상피세포를 감염시켜, 일반적으로 감염 부위에 양성 상피세포 또는 섬유상피세포 종양을 유발시킨다. 유두종바이러스는 종 특이적인 감염원이어서, 사람 유두종바이러스가 사람 이외의 동물을 감염시킬 수는 없다.

유두종바이러스는, 이들이 감염시키는 숙주를 기본으로 별개의 그룹으로 분류될 수 있다. 사람 유두종바이러스(HPV)는 DNA 서열 상동성을 기본으로 하여 70가지 이상의 유형으로 추가 분류된다[참조 문헌: Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister(ed.), CRC Press, Inc., 1990]. 유두종바이러스 유형은 유형특이적인 면역원이어서 한가지 유형의 유두종바이러스 감염을 중화시키는 면역성이 다른 유형의 유두종바이러스에 대한 면역성을 부여하지는 않는 것으로 나타난다.

유두종바이러스는 8개 이하의 어얼리(early) 유전자 및 2개의 레이트(late) 유전자를 암호화하는, 작고(50 내지 60㎚) 외피가 없으며 20면체인 DNA 바이러스이다. 바이러스 게놈의 개방 판독 프레임(open reading frame; ORF)은 E1 내지 E7 및 L1 및 L2로 지정되어 있다(여기서, "E"는 어얼리를 의미하고 "L"은 레이트를 의미한다). L1 및 L2는 바이러스 캡시드 단백질을 암호화한다. 어얼리(E) 유전자는 바이러스 복제 및 세포 형질전환과 같은 기능과 연관되어 있다.

L1 단백질은 주요 캡시드 단백질로 분자량이 55 내지 60kDa이다. L2 단백질은 분자량이 55 내지 60kDa인 것으로 추정되고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정된 겉보기 분자량이 75 내지 100kDa인 소수 캡시드 단백질이다. 면역학적 데이타는 L2 단백질의 대부분이 L1 단백질에 내재되어 있다는 것을 제시한다. L2 단백질은 상이한 유두종바이러스 사이에서 잘 보존되어 있는데, 특히 C-말단에 10개의 염기성 아미노산이 보존되어 있다. L1 ORF도 상이한 유두종바이러스 사이에서 잘 보존되어 있다.

재조합 L1 단백질은 다양한 숙주를 이용하며, 적절한 조건하에 단독으로 또는 L2와 함께 바이러스-유사 입자로 자체 어셈블리된다. VLP는 시판용 백신의 후보자이다. 그러나, 사람의 백신으로 이용하기 위해서, VLP는 고도로 정제되어야 하며, 숙주 세포 오염물로부터 유리시켜야 한다. 과거에는 투과 여과 양식으로서 직교류식 한외여과법을 사용하여 오염 생물분자를 제거하였다. 그러나, 이 방법은HPV L1의 단백질분해를 야기시킨다. 고도로 정제되고 분해되지 않은 산물을 생성하는 L1 단백질 정제 방법을 갖는 것이 바람직할 것이다.

발명의 요약

본 발명은,

VLP가 하이드록시아파타이트 매질과 결합하도록 하는 조건하에, 부분적으로 정제된 VLP 함유 세포 용해물을 크로마토그래피 칼럼중에서 하이드록시아파타이트 매질과 접촉시키는 단계;

결합된 VLP를, 포스페이트 음이온을 포함하는 용액을 사용하여 용출시키는 단계; 및

용출된 VLP를 회수하는 단계를 포함하여, 재조합 유두종바이러스(HPV)의 바이러스-유사 입자(VLP)를 정제하는 방법에 관한 것이다.

상기 정제방법은 실질적으로 L1 단백질로 이루어진 VLP와 함께 사용될 수 있으며, L1 및 L2 단백질을 포함하는 VLP와도 함께 사용될 수 있다. 또한, 키메라인 VLP, 즉 L1 단백질 및 L2:융합 단백질을 포함하는 VLP와도 함께 사용될 수 있다. 일반적으로, 백신으로 사용되는 경우, L1 단백질만을 포함하는 VLP가 바람직하다.

상기 방법은 유두종바이러스의 어떤 균주의 VLP에도 실제 적용할 수 있다. 사람 유두종바이러스(HPV)를 사용하는 것이 바람직하다. HPV의 균주로는, HPV 유형 6a, HPV 유형 6b, HPV 유형 11, HPV 유형 16, HPV 유형 18, HPV 유형 31, HPV 유형 33 및 HPV 유형 45를 포함하여 가장 심각한 질환 및 상태를 유발시키는 것으로 공지된 것이 바람직하다.

일반적으로, L1, 또는 L1 및 L2 단백질, 또는 L1 및 L2:융합 단백질을 암호화하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킨다.

명세서 및 청구의 범위에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "L2:융합 단백질"은 L2 단백질을 암호화하는 DNA가 목적하는 단백질, 바람직하게는 HPV로부터의 다른 단백질(예: E1, E2, E3, E4, E5, E6 또는 E7)을 암호화하는 다른 DNA에 작동가능하게 연결되어 있음을 의미한다. 융합 단백질의 L2 단백질은 완전한 길이이거나, 결실되고/되거나 일부 절단될 수 있다. 이의 예는, 본건과 함께 출원된 계류중인 미국 가 특허원 제60/096,638호(Attorney Docket Number 20276PV, 본원에서 참조로서 인용됨)에서 찾을 수 있다.

숙주 세포는 효모(사카로마이세스 세레비지애; Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 세균 세포 또는 포유동물 세포를 포함하여, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 용이하게 배양되는 임의의 숙주 세포일 수 있다. 효모 세포가 특히 바람직하다.

벡터는 전사 및 해독 조절 요소 및/또는 마커 유전자와 같이, 당해 분야에서 공지된 다른 요소를 또한 포함할 수 있다. 발현된 L1, L1 및 L2, 또는 L1 및 L2:융합 단백질이 동시에 VLP로 어셈블리된다. 숙주 세포를 통상적으로 용해시킨 다음, 세포 용해물을 부분적으로 정제한다.

부분적인 정제 단계는 통상적으로 사용되는 정제 단계를 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 중요한 단계로 여겨지지는 않는다. 예를 들어, 세포 용해물은 미세여과 과정 및 하나 이상의 크로마토그래피 단계(예: 양이온 교환 크로마토그래피)를 거칠 수 있다.

본 발명에 이르러, 칼럼 매질로서 하이드록시아파타이트를 사용하여 크로마토그래피 단계를 수행한 후, 포스페이트 음이온을 포함하는 완충 용액으로 용출시켜, 부분적으로 정제된 세포 용해물로부터 다량의 오염물을 제거할 수 있음을 밝혀내었다. 구체적으로, DNA, 지질 및 단백질을 포함한 대부분의 오염 생물분자가 용해물로부터 제거되는 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따르면, 최종적으로 정제된 VLP 제제는 SDS/PAGE 검정을 사용하여 측정되는 바와 같이, 일반적으로 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 순수하다.

실제, 시판되는 임의의 하이드록시아파타이트 칼럼 물질을 본 발명에 사용할 수 있다. 입자 크기가 대략 20 내지 50㎛이고 공극 크기가 대략 800Å인 세라믹 하이드록시아파타이트를 사용하는 것이 바람직하다. 시판되는 이러한 하이드록시아파타이트중 하나는 바이오래드(BioRad)에서 "세라믹 하이드록시아파타이트, 유형 II"로 시판중이다. 그러나, 다른 것도 또한 효과적이다.

정제 공정의 크로마토그래피 단계를 준비하는데 있어서, 칼럼 공급물이 pH가 6 내지 8, 바람직하게는 약 7인 완충액중에 존재하는 것이 권장된다. 바람직한 완충액은 pH 7.0에서 또한 1.25M의 NaCl을 함유하는 50mM MOPS[3-(N-모르폴리노)프로판설폰산]이다.

또한 사용할 수 있는 다른 완충 시스템은 당해 분야의 숙련가에게 있어 명백하고, 다음을 포함한다: MES[2-(N-모르폴리노)에탄설폰산]; BIS-TRIS[비스-(2-하이드록시에틸)-아미노]트리스-(하이드록시메틸)메탄]; ADA[N-2-아세트아미도이미노디아세트산 일나트륨염]; ACES[N-2-아세트아미도-2-아미노에탄설폰산]; PIPES[피페라진-N,N'-비스(2-에탄-설폰산)]; MOPSO[(3-N-모르폴리노)-2-하이드록시프로판-설폰산]; BIS-TRIS PROPANE[1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)메틸-아미노]프로판]; BES[N,N-비스-(2-하이드록시에틸)-2-아미노-에탄설폰산]; TES[N-트리스(하이드록시메틸)메틸-2-아미노에탄-설폰산 및 2-2([2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)아미노]에탄 설폰산]; HEPES[N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄-설폰산]; DIPSO[3-(N,N-비스(2-하이드록시에틸)아미노)-2-하이드록시-프로판설폰산];TAPSO[3-N-트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-2-하이드록시-프로판설폰산]; TRIS[트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄]; HEPPSO[N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-[2-하이드록시-프로판설폰산)]; POPSO[(피페라진-N,N'-비스[2-하이드록시프로판설폰산)]; EPPS[N-[2-하이드록시에틸]-피페라진-N'-[3-프로판설폰산 및 HEPPS]; TEA[트리에탄올아민]; TRICINE[N[트리스-(하이드록시메틸)메틸]글리신]; BICINE[N,N-비스-(2-하이드록시에틸)-글리신]; TAPS[3-{[트리스-(하이드록시메틸)메틸]아미노}-프로판 설폰산]; 이미다졸; HEPPS[N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-3-프로판-설폰산]; 글리신 아미드, 하이드로클로라이드; 글리실글리신; 시트레이트; 아세테이트 및 석시네이트 완충액.

완충 용액중의 부분적으로 정제된 VLP는, VLP와 하이드록시아파타이트의 결합을 허용하는 조건하에 하이드록시아파타이트 매질과 접촉한다. 상기한 조건에는광범위한 온도가 포함되지만 실온이 바람직하다. 유속도 매우 다양할 수 있는데, 바람직한 범위는 대략 90㎝/시간이다.

VLP를 하이드록시아파타이트에 결합시킨 후, 다음 단계는 용출 완충액을 사용하여 하이드록시아파타이트로부터 정제된 VLP를 회수하는 것이다. 바람직한 용출 완충액은 포스페이트 음이온을 포함하는데, 예를 들어 인산나트륨 또는 인산칼륨 용액이 있다. 바람직한 몰농도 범위는 약 0.05M 내지 약 1M인데, 대략 0.2M이 바람직하다. 용출 완충액의 pH는 약 pH 6 내지 8의 범위여야 하는데, pH가 약 7인 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 잇점에는 (a) 특별한 크로마토그래피 장치 및 기술이 필요하지 않고, (b) 방법은 신속하며 완충액을 교환할 필요가 없으며, (c) 방법은 HPV L1을 우수한 수율로 제공한다는 것이 포함된다.

다음의 비제한적 실시예는 본 발명을 보다 잘 설명할 것이다.

본 발명은 백신 성분으로 사용할 수 있는, 사람 유두종바이러스(Human papillomavirus; HPV)의 바이러스-유사 입자(virus-like particle; VLP)의 제조방법 및 정제방법에 관한 것이다.

실시예 1

부분적으로 정제된 용해물의 제조

VLP를 발현하도록 형질전환시킨 효모 세포를 수집하고, 저장하기 위해 -70℃에서 냉동시킨다. 냉동시킨 효모 세포 현탁액을 저장물로부터 꺼내어 실온에서 약 3시간, 이어서 4℃에서 약 18시간 동안 해동시킨다. BENZONASE^R(Nycomed PharmaA/S, Copenhagen, Denmark)(2.8x10⁵유니트/㎖ 및 0.21㎎ 단백질/㎖)를 세포 현탁액에 가하여 습식 세포 중량 g당 750유니트의 최종 농도를 수득하는데, 한 실험에서는 습식 세포 중량 g당 335유니트로 감소된다. 세포를 15분 동안 교반한 다음, 14,500 내지 16,000psi의 챔버압에서 소독된 APV 가울린(Gaulin) 30CD 균질기를 통해 2회 통과시킴으로써 파쇄하여 95%의 세포 파쇄를 수득한다. 잔류하는 용해물은 4℃에서 18시간 동안 온화하게 교반한다.

미세여과에 의해 청정화: 세포 용해물은 다음과 같은 투과 여과 양식에서 직교류식 한외여과에 의해 청정화한다. 용해물은 직경이 1인치인 주입구와 배출구를 갖는 멸균 공정 탱크로 옮긴다. 미세필터는, A/G 테크놀로지즈 플렉스스탠드^R(벤취탑 파이롯트 할로 파이버 시스템(A/G Technologies FlexStand^RBenchtop Pilot Hollow Fiber system)에 수용된, 표면적이 5제곱피트이고 공극 크기가 0.65㎛인 유공 섬유 필터 카트리지이다. 보유물은 다음의 여과 완충액 3용적을 사용하여 여과시켜 청정화된 용해물을 수득한다. 여과 완충액은 0.2M(Na⁺) MOPS, pH 7.0+0.4M NaCl이다.

청정화된 용해물의 크로마토그래피: 청정화된 용해물은 크로마토그래피 칼럼에 충전된 POROS^R50HS 강 양이온 교환 크로마토그래피 수지(PerSeptiveBiosystems, Framingham, MA)를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 분별한다. 칼럼은 사용하기 전에 0.5N NaOH로 소독한다. 칼럼은 실온에서 HPV 투과 여과 완충액[0.2M(Na⁺) MOPS, pH 7.0+0.4M NaCl]으로 평형화시킨다. 차가운(4℃) 청정화된 용해물을 125㎖/분에서 칼럼으로 펌핑하고, 칼럼은 100%의 HPV 칼럼 완충액 A[0.05M(Na⁺) MOPS, pH 7.0+0.5M NaCl]에서 100% HPV 칼럼 완충액 B[0.05M(Na⁺) MOPS, pH 7.0+1.5M NaCl]의 선형 구배를 적용하면서 125㎖/분에서 실온의 HPV 칼럼 완충액 A 8칼럼 용적을 사용하여 세척된다. 총 선형 구배물은 10칼럼 용적이며, 10등용적의 분획중에 수집한다. 구배화를 수행한 후, 실온의 HPV 칼럼 완충액 B 2칼럼 용적을 사용하여 125㎖/분으로 칼럼을 세척하여 2개의 추가 분획을 수집한다. 분획을 멸균된 2ℓ들이 플라스틱 병에 수집하고 4℃에서 저장한다. 구배중에서 최종 UV 흡수 피크(A280㎚ 및 A230㎚)를 포함한 분획을 수집하고, MILLIPAK-200 1회용 필터 유니트(Millipore, Bedford, MA)를 사용하여 여과하고 4℃에 저장한다.

실시예 2

하이드록시아파타이트 크로마토그래피

모든 단계는 실온에서 수행한다. 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 II(BioRad, Cat.#7320081, Hercules, CA)로 충전된 크로마토그래피 칼럼(13㎜ ID x 36㎜)을 50mM MOPS, pH 7.0+1.25M NaCl중에서 미리 평형화시킨다. 실시예 1의 부분적으로 정제된 HPV 용액을 90㎝/시간의 선형 유속으로 칼럼에 적용한다. 샘플적용을 완료한 후, 칼럼은 칼럼 유출물의 흡광도가 거의 0이 될 때까지 예비평형 완충액 8칼럼 용적으로 세척한다. HPV 백신 산물은 또한 90㎝/시간의 선형 유속으로, 용출 완충액(0.2M 인산나트륨, pH 7.0+1.25M NaCl)의 0%에서 100%의 선형 구배를 적용하여 용출시킨다. 구배물의 총 용적은 4칼럼 용적이다. 백신 산물을 포함하는 분획은 RIA 및 브래드포드 단백질 검정(Bradford protein assay)으로 확인한다. 산물의 단백질 농도는 100㎍/㎖이다.

분석: 브래드포드 단백질 검정은 소 혈청 알부민(BSA)을 표준으로 사용하고, 쿠마시 플러스 검정 시약(Coomassie Plus Assay Reagent; Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 수행한다. 로리 단백질 검정(Lowry protein assay)은 보정 표준으로서 BSA를 사용하는 로리 등의 방법[참조 문헌: Lowry et al 1951 J. Biol. Chem. 193:265-270]에 따라 수행한다. 항원은 VLP의 적합한 에피토프를 인지하는 모노클로날 항체를 사용하는 다층 ELISA에 의해 분석한다. 미세역가 플레이트는 폴리클로날 염소 항-HPV VLP 항체로 피복시킨다. 표준 및 시험 샘플은, 1% w/v BSA, 0.1% TWEEN-20 및 0.1% 나트륨 아지드를 포함하는 PBS로 희석시키고, 플레이트에 결합된 항체에 의해 항원이 포획되는 웰에 이를 가한다. 모노클로날 항-HPV L1 VLP 항체(Chemicon, Temecula, CA)를 웰에 가하여, 플레이트에 결합된 항체에 의해 포획된 항원에 결합시킨다. 모노클로날 항-HPV VLP 항체는, 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 검출한다. 서양고추냉이 퍼옥시다제에 대한 발색원 기질인 3,3'5,5'-테트라메틸벤지딘(Pierce)을 가하면, 450㎚에서의흡광도는 샘플중 L1 VLP의 농도에 따라 비례한다.

백신 산물에 대한 칼럼의 동력학적 용량은 브래드포드의 경우 수지 ㎖당 2.9㎎이고 RIA의 경우 수지 ㎖당 4.6㎎이다. 칼럼에 100% 용량이 로딩되는 경우, 이 단계를 통해서, 브래드포드 단백질 검정에 의해서는 90%, RIA에 의해서는 82%가 회수된다. 칼럼에 8% 용량이 로딩되는 경우, 브래드포드 검정에 의해서는 63%, RIA에 의해서는 50%로 회수율이 떨어진다.

실시예 3

다른 생물분자의 제거

실시예 1 및 2에 기술한 바와 같이 본질적으로 제조한 HPV 11 L1 샘플은 PCR계 검정을 사용하여 DNA의 존재를 분석한다. 하기하는 표에 나타낸 결과는 상기한 크로마토그래피 방법이 최종 산물로부터 오염된 DNA를 제거하는데 매우 효과적임을 제시한다.

샘플	단백질(㎍/㎖)	DNA(pg/㎖)	DNA(pg)/단백질(㎍)의 비
칼럼 충전물	107	3270	30.6
통류액(분획 #6)	<10	196	>19.6
용출물(분획 #20)	230	<2.6	<0.011

실시예 4

키메라 VLP의 정제(HPV 유형 16 L1/L2 _mini /E2 키메라 VLP의 정제)

변형된 L2 유전자의 작제

YP3 벡터(최소 L2)

이 벡터는, 독특한 NotI, SacI 및 XhoI 제한효소 부위가 도입된 합성 폴리링커에 의해 프레임내에 융합되어 있는, HPV 16 L2의 아미노 말단의 69개 아미노산과 카복시 말단의 84개 아미노산(aa)에 대한 암호화 서열을 포함하는데, 그 결과 한개의 글루탐산 잔기가 삽입되고 세린 잔기가 글루탐산으로 돌연변이된다.

PCR 프라이머(Midland Certified Reagents)는 벡터 pGal110 HPV 16 L1+L2내에 포함된 고유 L2 유전자로부터의 L2 서열을 증폭시키도록 디자인한다.

프라이머 I(5'-CTT CCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC-3; 서열 1) 및 C(5'-CTC GAG CTC GCG GCC GCC TGT ACC CGA CCC-3'; 서열 2)는 아미노 말단의 69개 아미노산을 암호화하는 265bp 서열 및 SmaI 제한효소 부위를 포함한 상부스트림 비해독 서열 23bp를 증폭시킨다. 프라이머 C는 L2 아미노 말단 암호화 영역을 변형시키고 연장시키며, L2 암호화 서열의 하부스트림에 NotI, SacI 및 XhoI 제한효소 부위를 부착시킨다.

프라이머 A(5'-GCG GCC GCG AGC TCG AGG GTT ATA TTC CTG CAA ATA CAA-3'; 서열 3), C 및 D(5'-CCC TCC AGA TCT CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TG-3'; 서열 4)는 BglII 제한효소 부위 6bp가 가해진, L2의 카복시 말단의 84개 아미노산을 암호화하는 285bp의 서열을 증폭시킨다. 프라이머 A는 또한 L2 암호화 서열의 상부스트림에 NotI, SacI 및 XhoI 부위를 포함한 17bp를 부착시킨다.

최소 L2 발현 작제물은 프라이머 A 및 C에 의해 가해진 상보적인 서열을 통해 어셈블리된다. 상기한 I/C 및 A/D 증폭 반응의 분리된 DNA 산물은, 증폭 프라이머로서 I 및 D 올리고스를 포함하는 PCR 반응에 모두 사용된다. 17bp의 상보적인 서열을 통한 단편의 결합을 촉진시키기 위해서는, 37℃에서 어닐링시킨 후 57℃에서 15사이클을 실행하는 PCR 사이클을 3회 수행한다. 수득한 증폭 산물은 pcrScript(Stratagene, LaJolla)에 블런트-말단으로 연결시키고 XL-1 블루 MRF 세포(Stratagene, LaJolla)를 형질전환시킨다. 프라이머 I 및 D를 사용하는 PCR에 의해 양성 클론을 동정하고, 제한효소 분해 분석으로 이를 확인한다. 이어서, 자동 서열 분석기(Perkin Elmer, Inc., Foster City, CA)에 의해 작제물을 확인한다.

적절한 분리체로부터의 플라스미드 DNA를 SmaI 및 BglII로 분해한 다음, 대략 0.5킬로염기쌍(kb)의 단편을 겔 정제하고 14kb의 SmaI 및 BglII pGAL110 HPV 16 L1 벡터 단편과 연결시킨다. 수용성(competent) DH5 이. 콜라이 세포(Gibco BRL, Rockville, MD)를 연결 혼합물로 형질전환시키고, LB 암피실린 플레이트(Remel, Lenexa, KS)상에서 형질전환체를 선별한다. 프라이머 D 및 I를 사용하여 L2 부분을 증폭시키는 PCR에 의해 클론을 먼저 선별한 다음, 적절한 클론을 제한효소 분해 분석으로 확인한다. 후보 클론 YP3#1은 상기한 서열 분석으로 확인한다.

이어서, YP3#1을, HPV 16 E1, E2 또는 E7 개방 판독 프레임을 암호화하는 유전자가 삽입된 주쇄 작제물로서 사용한다.

HPV E 단백질 암호화 유전자의 삽입

HPV 16 E2를 암호화하는 유전자는 HPV 16 양성 임상학적 샘플을 PCR 증폭시켜 수득하고, 이어서 서브클로닝 벡터 pCRII(Stratagene, La Jolla, CA)에 직접 삽입시키고 상기한 바와 같이 서열을 확인한다. 이어서, E2 유전자 서열을 다음 방법으로 변형시킨다:

1) 프레임내에 XhoI, NaeI 및 NotI을 함유한 DNA 서열을 E2의 아미노 말단 부분에 가한다. 또한, NotI, NaeI 및 XhoI을 함유한 서열을 E2의 카복시 말단 부분에 가하여 NotI 및 XhoI 부위내로 E2의 삽입을 용이하게 한다.

2) DNA 서열은 PCR 돌연변이유발시켜 글루탐산 39번 및 이소류신 73번을 암호화하는 잔기가 알라닌 잔기를 암호화하도록 변화시킨다. 이는 E2 단백질 기능을 불활성화시키도록 디자인하는 것이다.

상기한 바와 같이 변형된 HPV 16 E2 유전자를 NotI 및 XhoI으로 분해하고, 유사하게 분해한 YP3#1 벡터와 함께 연결시킨다. 적절하게 삽입된 E2 서열을 포함하는 형질전환체를 PCR에 의해 선별하고 서열을 확인한다.

HPV 16 E1 및 HPV 16 E7을 암호화하는 유전자에 대해서 동일한 전략을 사용한다. E1의 경우, 글리신 482번을 아스파르트산으로 변화시키고, E7의 경우, 시스테인 24번 및 글루탐산 26번 둘다를 글리신으로 변화시켜 단백질 기능을 불활성화시킨다. 이어서, 수득한 작제물을 사용하여 발현 분석용 효모를 형질전환시킨다.

실시예 5

키메라 VLP를 발현하는 효모의 확인 및 배양

상기한 YP3#1의 플라스미드 DNA 및 유도체를 사용하여 스페로플라스트 방법[참조 문헌: Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933]에 의해 사카로마이세스 세레비지애(MATα, leu2-04, prb1::HIS3, mnn9::URA3, cir^O)를 형질전환시킨다. 형질전환된 스페로플라스트를 선별(류신 비함유) 배지(Remel, Lenexa, KS)에 플레이팅한다. 2회의 단일 콜로니 선별을 통해 클론을 분리한다. 후보 클론의 작은 액체 배양물은 갈락토스를 함유한 배지중에서 높은 세포 밀도로 성장시킨다. 이를 유리 비드와 함께 격렬하게 교반한 다음, 원심분리시켜 조 추출물을 제조한다. 청정화된 추출물은, L1 또는 L2, 또는 L2의 아미노 또는 카복시 말단, L1 VPS, 또는 E1, E2 또는 E7, 또는 변형된 L2에 융합되는 다른 단백질 또는 펩타이드를 인지하는 모노클로날 항체 또는 단특이적 폴리클로날 항혈청을 사용하는 SDS PAGE, ELISA, 면역블롯팅 및 EIA를 포함한 다양한 방법에 의해, L1, L2 성분 및 VLP의 발현에 대해서 분석한다. L2 성분을 발현하고 VLP를 형성하는 클론은 추가로 특성규명하기위해 선별한다. 키메라 VLP를 대규모로 제조하기 위해, 선별된 클론의 1리터 또는 16리터 배양물을 갈락토스 함유 배지에서 성장시킨다.

세포 펠렛은 -70℃에서 냉동 저장한다. 냉동된 세포(습식 중량=148g)를 해동시키고, "파괴 완충액"(200mM MOPS, pH 7, 1mM CaCl₂) 740㎖중에 재현탁시켜 대략 20%(w/v)의 슬러리를 수득한다. 뉴클레아제 BENZONASE^R(Nycomed Pharma)를 750유니트/습식 세포 중량(g)으로 가한다. 세포 슬러리를 M110-Y 마이크로유동화기(Microfluidizer; Microfluidics Corp., Newton, MA)에 5회 통과시킴으로써 대략 19,000psi의 압력에서 파괴한다. 세포 슬러리를 수집하고, 파괴되는 동안에 얼음에 고정시킨다. 적혈구용적률(hematocrit) 검정은 파괴가 80%를초과하였음을 나타낸다.

숙성시킨 세포 용해물은 투과 여과 양식으로 접선식 미세여과 장치를 사용하여, 공극 크기가 0.65㎛인 유공 섬유 카트리지(A/G Technologies)를 통해 미세여과시켜 청정화한다. 용해물은 0.25M 나트륨 시트레이트, 0.2M MOPS(pH 7.0) 3용적을 사용하여 여과시킨다. 막을 통해 항원을 통과시켜 투과물중에 이를 수집한다.

여과된 0.65㎜의 투과 분획(3.9ℓ)은 200mM MOPS, pH 7, 250mM 나트륨 시트레이트로 평형화시킨 POROS^R50HS 수지(Perseptive Biosystems, Cambridge, MA)의 325㎖들이 칼럼(11.2㎝ ID x 3.3㎝)에 로딩한다. 칼럼은 50mM MOPS, 0.5M NaCl, 5mM 인산나트륨(pH 7) 8용적으로 세척하고, 동일한 완충액중 0.5에서 1.5M NaCl의 선형 구배 10용적을 사용하여 용출시킨다. 통류액 및 세척 분획을 대량으로 수집하는데, 용출되는 동안에 1용적의 분획이 수집된다. 칼럼 분획은 콜로이드성 쿠마시 검출을 사용하는 웨스턴 블롯팅 및 SDS-PAGE에 의해 분석한다. p55 단백질을 주로 함유하는 분획을 수집한다.

전체 단백질의 경우, BCA 검정(Pierce)에 의해 50HS 풀을 분석한다. 전체 단백질(168㎎)을 기준으로 하여, 세라믹 하이드록시아파타이트(HA) 유형 II(BioRad)을 부어 단백질 2㎎당 수지 1㎖를 수득한다. 이 칼럼은 2.6㎝ ID x 15.7㎝이다. 칼럼은 50mM MOPS, pH 7, 1.25M NaCl, 5mM 인산나트륨중에서 평형화시킨다. 50HS 풀(770㎖)을 0.22㎜ 필터로 여과시키고 113㎝/시간의 유속으로 HA 칼럼에 적용시킨다. 통류액은 대량으로 수집한다. HA 칼럼을 평형 완충액 5용적으로 세척하고, 1.25M NaCl중 5 내지 200mM 인산나트륨(pH 7)의 선형 구배 8용적으로 용출시킨다. 용출되는 동안 수집된 분획은 콜로이드성 쿠마시 검출을 사용하는 웨스턴 블롯 및 SDS-PAGE에 의해 분석한다. 비교적 높은 순도를 나타내고 L1 단백질이 풍부한 분획을 수집한다. 수집한 분획은 0.22㎜의 막을 통해 무균 여과시키고 4℃에 저장한다.

상기 과정을 유지시키고, 산물은 HPV 16 L1의 경우에는 특이적인 EIA를 사용하고 단백질의 경우에는 BCA 검정을 사용하여 분석한다. 최종적으로 정제된 산물의 수율은 비활성이 1.00㎎ L1/㎎ 단백질인 27㎎의 단백질이다. 전자현미경으로 평균 직경이 32㎚인 완전한 VLP 입자의 존재를 확인하였다. SDS-PAGE 순도 분석을 위해, 최종 산물의 분취량을 TCA 침전에 의해 농축시키고, 콜로이드성 쿠마시 검출을 사용하는 웨스턴 블롯팅 및 SDS-PAGE에 의해 분석한다. L1은 2.5㎎의 로딩물에서 정량화하고, 효모 오염물은 20.0㎎의 로딩물에서 정량화한다. 밀도계에 의해 L1 단백질의 균질성이 94%를 초과하는 것으로 나타난다. L1 및 L2_mini/E2의 공동 정제는 공정 분획의 특이적인 면역블롯팅 분석에 의해 입증된다.

Claims

(a) VLP가 하이드록시아파타이트 매질과 결합하도록 하는 조건하에, 부분적으로 정제된 VLP 함유 세포 용해물을 크로마토그래피 칼럼중에서 하이드록시아파타이트 매질과 접촉시키는 단계;

(b) 결합된 VLP를, 포스페이트 음이온을 포함하는 용액을 사용하여 용출시키는 단계; 및

(c) 용출된 VLP를 회수하는 단계를 포함하여, 재조합 유두종바이러스의 바이러스-유사 입자(VLP)를 정제하는 방법.
제1항에 있어서, VLP가 필수적으로 L1 단백질로 이루어진 방법.
제1항에 있어서, VLP가 사람 유두종바이러스(HPV) VLP인 방법.
제3항에 있어서, VLP가 HPV 유형 6a, HPV 유형 6b, HPV 유형 11, HPV 유형 16, HPV 유형 18, HPV 유형 31, HPV 유형 33 및 HPV 유형 45로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제4항에 있어서, 용출된 VLP의 순도가 75% 이상인 방법.
제4항에 있어서, 용출된 VLP의 순도가 90% 이상인 방법.
제1항에 있어서, VLP가 L1 단백질 및 L2:융합 단백질을 포함하는 방법.
제7항에 있어서, L2:융합 단백질이 완전한 길이보다 작은 L2 부분을 갖는 방법.
(a) HPV L1 VLP를 발현하도록 형질전환시킨 효모 세포의 것인 세포 용해물을 부분적으로 정제하고;

(b) VLP가 하이드록시아파타이트 매질과 결합하도록 하는 조건하에, 부분적으로 정제된 VLP 함유 세포 용해물을 크로마토그래피 칼럼중에서 하이드록시아파타이트 매질과 접촉시키고;

(c) 결합된 VLP를, 포스페이트 음이온을 포함하는 용액을 사용하여 용출시키며;

(d) 용출된 VLP를 회수함을 포함하여, 사람 백신에 사용하기 적합한, 정제된 사람 유두종바이러스 VLP 산물을 제조하는 방법.