LV15006B - Daudzziedu airenes raibuma vīrusam līdzīgo daļiņu iegūšana - Google Patents

Description

Izgudrojums attiecas uz biotehnoloģiju, molekulāro bioloģiju kā arī uz vakcīnu, diagnostikas līdzekļu komponentu un jaunu nanomateriālu iegūšanu. Tā pamatā ir vīrusu izcelsmes polipeptīdu pašsavākšanās procesu rezultātā rauga Pichia pastoris šūnās izveidotas regulāras, organizētas nanometru izmēru ikozahedriskas struktūras.

Tehnikas līmeņa analīze

Vīrusiem līdzīgās daļiņas (VLP) ir multisubvienību proteīnu struktūras, kas ir identiskas vai strukturāli analoģiskas attiecīgajiem vīrusiem, tās nav spējīgas replicēties un nav infekciozas. VLP ir plaši pazīstamas kā vakcīnu kandidāti [1, 2]. No zināmajām VLP hepatīta B un cilvēka papilomas vīrusiem līdzīgās daļiņas ir vispopulārākās un tiek izmantotas komerciālajā medicīnas praksē kā vakcīnas pret hepatītu B un dzemdes kakla ļaundabīgo audzēju izraisītāju - papilomas vīrusu. Vīrusiem līdzīgo daļiņu efektivitāte imūnatbildes stimulēšanā ir labi zināma: strukturāli stingri sakārtoti un daudzkārtīgi atkārtoti aminoskābju sekvenču motīvi uz vīrusu virsmas proteīnu virsmas ir noteicošie signāli imūnsistēmas B-šūnu aktivēšanai un kalpo kā signāls imūnsistēmai, ka organismā ir nonācis svešas izcelsmes aģents [3ļ. Tādējādi, VLP izsauc efektīvu humorālo un šūnu imūnatbildi, pat bez plaši pielietoto adjuvanta klātbūtnes [4],

Nesen ir parādīts, ka vakcīnas uz VLP bāzes var tikt izmantotas ari terapeitiskiem mērķiem. Tā, balstoties uz bakteriofaga ζ)β VLP sistēmu, ir izveidota jauna terapeitisku līdzekļu grupa, kas ietver sevī vakcīnas pret smēķēšanu, pret paaugstināta asinsspiedienu un pret diabēta. Šīs vakcīnas jau ir izgājušas klīnisko pētījumu I vai II fāzi [5],

Augu vīrusi neizraisa zīdītāju organismu saslimšanu. Tomēr augu vīrusi un tiem līdzīgas, no to strukturālajiem proteīniem mākslīgi iegūtas daļiņas (vīrusiem līdzīgās daļiņas) var tikt izmantoti kā svešu aminoskābju sekvenču nesēji. Svešās sekvences var būt ari patogēniem raksturīgie epitopi, kuri tiek izvietoti uz strukturālo proteīnu virsmas. Jēdziens „epitops” tiek definēts kā īsākā aminoskābju sekvence, kura spējīga piesaistīt tam specifisko antivielu molekulas; epitopi vai· būt kā lineāri, tā ari konformacionāli [1]. Lineārie epitopi ir īsas aminoskābju sekvences (garumā no 4 līdz 10), kuru aktivitāti neietekmē to telpiskā struktūra. Konformacionālie epitopi veidojas no polipeptīdu ķēdes attālinātiem reģioniem, tiem izveidojot noteiktu telpisko struktūru.

Ideja par patogēniem raksturīgo peptīdu (epitopu) izmantošanu imunizācijā ir pazīstama jau vairāk 20 gadus. Ir zināms, ka zemmolekulārās vielas, tajā skaitā īsas aminoskābju sekvences (peptīdi), bieži izraisa vājas imūnatbildes. Tāpēc epitopus piesaista pie proteīnu-nesēju molekulām, kas izraisa paaugstinātas imūnatbildes zīdītāju organismos [6]. Tā, klonējot poliovīrusam raksturīgo peptīdu kodējošās DNS (kDNS) sekvences tabakas mozaīkas vīrusa (TMV) virsmas proteīna gēna

-2kDNS kopijā, un ekspresējot šos rekombinantos gēnus Escerichia coli, tika iegūts vakcīnas kandidāts. Uz TMV virsmas lokalizētie poliovīrusa epitopi izraisīja poliovīrusu neitralizējošas antivielas pēc injekcijas laboratorijas žurkās [7]. Līdzīga stratēģija tikusi demonstrēta arī vairāku citu augu vīrusu gadījumos, piem., Cowpea mosaic virus, Tomato bushy stunt virus, Cucumber mosaic virus, Potato virus X (PVX), Johnsongrass mosaic virus, Papaya mosaic virus [2]. Attiecīgo VLP vakcīnu kandidātu iegūšanai ir izmantoti dažādi saimniekorganismi, piem., ar rekombinantiem vīrusiem inficēti augi, ar modificētiem bakulovīrusiem inficētas insektu šūnas, raugu, un ari E. coli platformas [8]. Tā augu vīrusa CCMV VLP ir iegūtas no rauga Pichiapastoris ekspresijas sistēmas, kas ir vienīgais zināmais piemērs, kad augu VLP ir iegūtas no šī mikroorganisma šūnām [9]. Baktēriju vīrusu gadījumā šī sistēma izmantota vismaz 2 VLP iegūšanai, kamēr zīdītāju vīrusiem līdzīgās daļiņas iegūtas no P. pastoris šūnām pat 7 gadījumos (skat. apskatu [2]).

Augu vīrusi vai no tiem atvasinātās VLP var tikt izmantotas arī jaunu nanomateriālu radīšanai. Tā uz tobamovīrusa bāzes ir izveidots jauns imūnoadsorbents, kurš spējīgs piesaistīt līdz 2 g monoklonālo antivielu uz 1 g nesēja. Tas ir panākts, tobamovīrusa virsmas proteīnam C-galā ar gēnu inženierijas palīdzību pievienojot Staphylococcus aureus proteīna A funkcionālo fragmentu un izveidojot attiecīgo ekspresijas sistēmu VLP iegūšanai no tabakas lapām. Rezultātā tika iegūts nanodaļiņu materiāls (izmēri 18x200 nm), kur uz katras daļiņas virsmas ir izvietotas 2100 kopijas proteīna A atvasinājuma; autori piedāvāja to izmantot antivielu attīrīšanai kā ekonomisku, vienreiz lietojamu imūnadsorbentu [10]. Viens no populārākajiem ikozahedriskajiem vīrusiem kā izejmateriāls jaunu nanodaļiņu konstruēšanai ir Cowpea mosaic virus (CPMV). Tā struktūrā ar gēnu inženierijas metodēm iespējams iebūvēt svešas aminoskābju sekvences. Izmantojot uz tā virsmas izvietotos brīvos lizīna atlikumus, ar ķīmiskām metodēm pie CPMV ir iespējams piesaistīt proteīnus, krāsvielas, organiskos metāla kompleksus un CdSe nanodaļiņas, iegūstot jaunus nanomateriālus ar visdažādāko pielietojumu (skat. apskata rakstu [11]).

Arī citas VLP sistēmas ir zināmas kā jaunu nanomateriālu kandidāti. Tā bakteriofaga QP VLP gadījumā ir parādīts, ka tās var izmantot imunoloģiski aktīvu nukleīnskābju jeb, šajā gadījumā t.s. nemetilētu CpG oligonukleotīdu iepakošanai. Šis nanomateriāls izrādījās ar izteikti paaugstinātām imūnstimilējošām īpašībām [12]. Kā parādīts I/IIa fāzes klīniskajos pētījumos, ζ)β ar G10 CpG oligonukleotīdu neizraisīja izteiktas blaknes un uzrādīja terapeitiskus efektus alerģiskās astmas pacientu ārstēšanā [13].

Daudzziedu airenes raibuma vīruss (Ryegrass mottle virus - RGMoV) ir vienpavediena (ss) RNS augu vīruss, kas pieder pie sobemovīrusu ģints [14], Tā dabīgais izplatības areāls ir Japāna. Vīruss inficē arī citus viendīgļlapjus, kā Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Avena sativa, Secale cereale un Setaria italica.

-3RGMoV genoma garums ir 4212 nukleotīdi (nt) [15], Tā genomu veido ssRNS(+) molekula, kuras 5’ galā ir kovalenti piesaistīts ar genomu saistītais virālais proteīns (VPg), bet 3' gals nesatur poliadenozīna segmentu. RGMoV genoms sastāv no četriem ORF. ORF1 kodē proteīnu Pl, ORF2a kodē poliproteīnu, kas sastāv no serīna proteāzes, VPg, kā arī no P18 domēna, kura funkcijas ir neskaidras. ORF2b kodē replikāzi RdRp, kas tiek translēta caur -1 ribosomālā rāmja nobīdi. ORF3 kodē apvalka proteīnu (CP).

RGMoV virionus veido 180 CP ikosahedriskas daļiņas ar T=3 simetriju, kuru diametrs ir 28 nm. RGMoV 3 dimensionālā struktūra ir zināma [16]. Šim vīrusam VLP iegūšanas paņēmieni nav zināmi. Tomēr par citiem radniecīgiem sobemovīrusiem ir zināms, ka, principā no tiem ir iespējams iegūt vīrusiem līdzīgās daļiņas, ekspresējot apvalka proteīna CP gēnu bakteriālās ekspresijas sistēmās, kā tas parādīts SeMV gadījumā [17]. SeMV VLP ir izmantotas, lai pētītu vīrusa pašsavākšanās mehānismus; autori nav paredzējuši to izmantošanu kā potenciālos vakcīnu nesējus vai kā jaunus nanomateriālus.

Tā kā apvalku proteīnu sekvences katram vīrusam ir atšķirīgas, tad arī uz to bāzes izveidotajām VLP ir sagaidāmas atšķirības stabilitātē, imunoloģiskajos raksturojumos, to spējā iepakot dažādus materiālus un daļiņu veidošanā no ģenētiski izmainītiem apvalka proteīniem ar svešām sekvencēm. Tādejādi, katram iespējamajam pielietojuma veidam ir nepieciešams atrast piemērotas VLP, jo universālas VLP nav zināmas. Turklāt, alternatīvu VLP nesēju pieejamība nodrošina plašāku imunoloģisko materiālu spektru vakcināciju vajadzībām. Atkārtotas pacientu imunizācijas ar atšķirīgiem imūnpreparātiem, kas izveidoti uz viena un to tā paša nesēju bāzes, var izraisīt augstas imūnatbildes pret izmantoto VLP nesēju un vakcinācijas efektivitāte var būt zema.

Tādējādi, ir skaidri redzams, ka, neraugoties uz zināmajiem piemēriem, joprojām pastāv tehnoloģiska nepieciešamība pēc alternatīviem, uz VLP balstītiem polipeptīdu nesējiem, kuri var tikt iegūti no mikroorganismu ekspresijas sistēmām. Jaunās VLP var tikt izmantotas kā jauni nanomateriāli ar visdažādāko pielietojumu, ieskaitot imunoloģiski aktīvus aģentus un jaunus proteīnu dabas nanokonteinerus, kuri var tikt izmantoti bioloģiski aktīvu vielu iepakošanai.

Attēlu apraksti

1. att. Integrācijas plazmīda, kas satur RGMoV virsmas proteīna gēnu.

RGMoV CP gēns iegūts ar PCR palīdzību no E.coli ekspresijas vektora pET-RGCP, klonēts P.pastoris ekspresijas vektorā pPIC-3.5K (Invitrogen, ASV). Norādīta RGMoV CP gēna, ampicilīna rezistences gēna (AmpR) lokalizācija klonu atlasei E.coli, ΑΟΧ1 promoters integrācijai P.pastoris hromosomā un mērķproteīna ekspresijai, HIS4 P.pastoris rekombinantu pirmējai atlasei, kanamicīna rezistences gēna (KamR) lokalizācija, kas P.pastoris nodrošina rezistenci pret G418

-4antibiotiku (Gibco, ASV) multiinsertu saturošu klonu atlasei, kā arī daži nozīmīgākie restriktāžu šķelšanas saiti.

2. att. RGMoV-CP P.pastoris iegūšanas analīze SDS-poliakrilamīda gelā un imunoblotā.

M - proteīnu marķieris (Thermo Scientific, ASV); 1 - kopējie proteīni; 2, 4 - šķīstošie proteīni; 3, 5 - nešķīstošie proteīni, - - negatīvā kontrole imunoblotam; A - proteīnu paraugi pēc šūnu sagraušanas ar French preses palīdzību (Thermo Scientific, ASV); B - paraugi pēc bezkontakta ultraskaņas dezintegrātora S220 (Covaris, ASV); a - SDS-poliakrilamīda gels; b - imunoblots.

3. att. RGMoV-CP attīrīšanas analīze SDS-poliakrilamīda gelā un imunoblotā.

M - proteīnu marķieris (Thermo Scientific, ASV), 1 - nogulsnes pēc saharozes gradienta; 2-6 saharozes gradienta frakcijas; a - SDS-poliakrilamīda gels; b - imunoblots.

4. att. Daudzziedu airenes raibuma vīrusam RGMoV līdzīgās daļiņas (VLP), kas iegūtas no rekombinantu P.pastoris pPIC-RGMoV-CP šūnām. Apakšējā malā iezīmētā mēroga līnija atbilst 100 nm.

5. att. RGMoV-CP izjaukšanas un savākšanas ar G10 oligonukleotīdu analīze SDS-poliakrilamīda gelā un imunoblotā. Μ - M - proteīnu marķieris (Thermo Scientific, ASV); S - šķīstošā frakcija pēc 72000 rpm; P - nogulsnes pēc 72000 rpm; 1 - izjauktas RGMoV CP VLD; 2 - RGMoV CP savākts bez G10; 3 - RGMoV CP savākts ar G10 3 pg/μΐ; 4 - RGMoV CP savākts ar G10 1.5 pg/μΐ; 5 RGMoV CP savākts ar G10 0.75 pg/μΐ; + - pozitīvā kontrole natīvs RGMoV; a - SDSpoliakrilamīda gels; b - imunoblots.

6. att. RGMoV-CP izjaukšanas un savākšanas paraugu analīze agarozes gelā.

M - DNS marķieris (Thermo Scientific, ASV); 1 - natīvs RGMoV; 2 - RGMoV VLP; 3 - RGMoV VLP izjauktas pēc 72000 rpm; 4 - RGMoV CP savākts bez G10; 5 - RGMoV CP savākts ar G10 3 pg/μΐ; 6 - RGMoV CP savākts ar G10 1.5 pg/μΐ; 7 - RGMoV CP savākts ar G10 0.75 pg/pl.

7. att. RGMoV-CP izjaukšanas un savākšanas paraugu elektronmikroskopijas analīze.

a - RGMoV-CP VLP; b - izjauktas RGMoV-CP VLP; c - RGMoV CP inkubēts bez G10; d RGMoV CP inkubēts ar G10 3 pg/μΐ; e - RGMoV CP inkubēts ar G10 1.5 pg/μΐ; f - RGMoV CP inkubēts ar G10 0.75 pg/pl. Apakšējā malā iezīmētā mēroga līnija atbilst 100 nm.

Izgudrojuma apraksts

Šis izgudrojums parāda, ka no sobemovīrusa apvalka proteīna gēna kodējošās kDNS (SEQ ID NO: 2), ja to ievada heterologa saimnieka šūnās, it īpaši Pichia pastoris šūnās, ir spējīga izraisīt apvalka proteīna sintēzi ar augstu iznākumu un vīrusiem līdzīgo daļiņu veidošanos. Kā ekspresijas vektors var tikt izmantots Pichia pastoris pPIC-3.5 vektors, kas satur ampicilīna rezistences gēnu klonu atlasei E.coli, ΑΟΧ1 promotoru transgēna integrācijai P.pastoris hromosomā un ekspresijai, HIS4 P.pastoris rekombinantu pirmējai atlasei, kanamicīna rezistences gēnu, kas P.pastoris nodrošina ' -5- · · rezistenci pret G418 antibiotiku insertu(s) saturošu klonu atlasei. Principā ir iespējams izmantot arī citus P. pastoris vektorus un celmus. Tos ir iespējams pārbaudīt līdzīgā veidā, kā aprakstīts 1. piemērā.

Pichia pastoris integratīvā ekspresijas sistēma izvēlēta ļoti būtiska iemesla dēļ: RGMoV CP gēna ekspresija E.coli šūnās, kur mērķproteīna sintēze notiek no citoplazmatiskajiem plazmīdu vektoriem, nedod VLP produkciju. Rūpīga analīze, izmantojot gēlu retardācijas eksperimentus un DNāzes testus, parādīja, ka bakteriāli sintezētais RGMoV apvalka proteīns piesaistās pie plazmīdas vektora. Šāda piesaistīšanās pie plazmīdas DNS, iespējams, bremzē mērķproteīna mRNS sintēzi, kas samazina attiecīgā proteīna ekspresijas līmeni. Turklāt, plazmīdas DNS izmēri pārsniedz to nukleīnskābju izmērus, kuri var tikt iepakoti RGMoV vīrusiem līdzīgo daļiņu iekšpusē. Rezultātā E.coli šūnās izveidojas nelieli daudzumi CP/plazmīdu agregātu, kuri nav piemēroti tālākajiem darbiem ar mērķi izveidot jaunus nesējus vai nanomateriālus. Jāatzīmē, ka ari rauga Saccharomyces cerevisiae/pFM sistēmā, kas arī ir balstīta uz mērķproteīna sintēzi citoplazmā no plazmīdas vektora, rezultāts bija analoģisks - RGMoV CP sintezējās ar nelielu iznākumu un VLP veidošanās netika novērota. Tāpēc tika izvēlēta Pichia sistēma, kur mērķproteīna kodējošais gēns tiek iebūvēts nevis plazmīdas vektorā, bet rauga hromosomā un mRNS sintēze notiek šūnas kodolā. Tādējādi, uzsintezētā mRNS nonāk citoplazmā, kur sākas apvalka proteīna sintēze. Šajā gadījumā, CP molekulas (SEQ ID NO: 1) vairs nenonāk kontaktā ar kDNS un spēj sintēzes procesa gaitā spontāni izveidot vīrusiem līdzīgas daļiņas, kuras morfoloģiski ir līdzīgas natīvajiem RGMoV virioniem, kā to parāda elektronmikroskopijas analīžu rezultāti. Šāda pieeja var būt efektīva arī citu vīrusu CP klonēšanas eksperimentos, kur ir zems apvalka proteīna ekspresijas līmenis heterologā sistēmā, vai ari apvalka proteīns mijiedarbojas ar ekspresijas sistēmas DNS vektoru (plazmīdu).

Izgudrojums demonstrē paņēmienus, kā, izmantojot piemērotas rauga saimniekšūnas un integratīvus ekspresijas vektorus, iegūt RGMoV vīrusiem līdzīgās daļiņas un, kā tāš attīrīt, izmantojot ultracentrifugas. Ir parādīta metode, kā šīs daļiņas izjaukt, izmantojot augsta jonu spēka sastāva šķīdumus, kas satur helatējošus aģentus. Turklāt ir parādīts, ka RGMoV CP pēc izjaukšanas var tikt „salikts” atpakaļ VLP struktūrās, izmantojot negatīvi lādētas substances. Šajā gadījumā kā negatīvi lādēta substance tika izmatots G10 oligonukleotīds (SEQ ID NO: 7), kurš ir plaši pazīstams ar savu imūnstimulējošo aktivitāti. Principā, līdzīgi kā daudzu citu VLP gadījumos, RGMoV VLP sastāvā ar gēnu inženierijas metodēm var tikt ievadītas polipeptīdu sekvences, netraucējot VLP autopolimerizācijas procesam. Šie polipeptīdi var būt visdažādākās izcelsmes aminoskābju sekvences, tajā skaitā dažādu slimību izraisītājiem raksturīgie antigēni jeb epitopi vai arī citi dabīgi vai mākslīgi proteīnu domēni atkarībā no to plānotā izmantošanas veida.

Fakts, ka iegūtās rekombinantās RGMoV VLP uzrāda augstu morfoloģisko līdzību ar natīvajiem vīrusiem, norāda uz iespēju, ka CP molekulas VLP struktūrā ir izkārtotas regulāri organizētā veidā.

-6Tas var nodrošināt arī vienmērīgu, regulāru svešu polipeptīdu izvietojumu uz ikozahedrisko VLP virsmas. Šādi regulāri uz nesēja virsmas izvietoti epitopi vai proteīnu domēni ir nepieciešami kvalitatīvu antivielu iegūšanai imunizācijas procesā. Piedevām daudzskaitlīga liganda izvietošana uz VLP virsmas var kalpot arī par dažādu analītisku metožu būtisku komponentu, lai paaugstinātu signāla intensitāti uz laukuma vienību, kas, piemēram, ir svarīgi efektīvu mikročipu izveidošanā. Turklāt izgudrojums demonstrē arī efektīvu rekombinantu RGMoV VLP attīrīšanas metodi, izmantojot vairākkārtēju frakcionēšanu ar ultracentrifugēšanas palīdzību.

Sobemovīrusa RGMoV gadījumā efektīvs paņēmiens vīrusiem līdzīgo daļiņu iegūšanai no rekombinantām mikroorganismu šūnām patentu un cita veida literatūrā nav atrasti.

Izgudrojumā aprakstītās VLP var tikt izmantotas kā imūnatbildi stimulējoši aģenti, ja tās ievada zīdītāju organismos. Ar epitopu un proteīnu domēnu saturošu RGMoV izcelsmes rekombinanto VLP palīdzību iegūtās antivielas var tikt izmantotas kā slimību ārstēšanā un profilaksē, tā arī attiecīgo saslimšanu diagnosticēšanā. Ar RGMoV VLP palīdzību iegūtas antivielas var tikt izmantotas arī kā pamatkomponents diagnostikas reaģentu komplektos (piemēram, ELISA kitos), lai konstatētu RGMoV infekcijas attiecīgajās lauksaimniecības kultūrās. Turklāt, šādas VLP var izmantot arī jaunu nanomateriālu izveidošanai, piemēram, iepakojot dažādas substances, ieskaitot terapeitiski nozīmīgas nukleīnskābes.

Kā tas ir saprotams tehnikas līmeņa speciālistiem, šī izgudrojums balstās uz tādām rekombinantu nukleīnskābju tehnoloģijām, kā DNS un RNS attīrīšanu no dažādu organismu šūnām, polimerāzes ķēdes un citām enzimātiskām reakcijām, klonēšanu, rekombinantu proteīnu ekspresiju mikroorganismu šūnās un to attīrīšanu un citām tehnoloģijām. Šīs tehnoloģijas speciālistiem ir labi pazīstamas un to detalizēti apraksti ir atrodami populāros metožu krājumos [18-21],

Izgudrojuma labākai izpratnei zemāk izklāstītajos piemēros ir parādīta RGMoV VLP iegūšana no rekombinantu Pichia pastoris šūnām (1. piemērs) un oligonukleotīdu iepakošana RGMoV vīrusiem līdzīgo daļiņu iekšpusē, kas norāda uz vienu no iespējamajiem jauno VLP pielietojumiem (2. piemērs).

1. piemērs. RGMoV virsmas proteīna gēna klonēšana, ekspresija P.pastoris šūnās, vīrusiem līdzīgo daļiņu iegūšana

Par RGMoV virsmas proteīna (CP) gēna (SEQ ID NO: 2) PCR matricu kalpoja RGMoV pilna garuma kDNS kopija [15]. Oligonukleotīdu - RGCP-Pich-BamHI-F (SEQ ID NO:3) un RGCPPich-EcoRI-R (SEQ ID NO:4) dizains tika veidots tā, lai atbilstu P.pastoris izmantojamajam hromosomā integrējamajam vektoram pPIC-3.5K (Invitrogen, ASV). Ar virzītās PCR mutaģenēzes palīdzību CP gēnā tika ievadīti klonēšanai paredzētie restikcijas saiti BarnHI un BcoRI, kā arī „Kozaka” sekvence CP translācijas nodrošināšanai P.pastoris. PCR reakcija tika veikta ar Pfu

-7polimerāzi (Thermo Scientific, ASV) atbilstoši ražotāja protokolam uz programmējamā termostata Verity (Applied Biosystems, ASV). Iegūtais vīrusa CP cDNA PCR produkts tika izolēts no agarozes gela un pēc dATP pārkaru izveides, ligēts palīgvektorā pTZ-57R/T (Thermo Scientific, ASV), izmantojot InsTAclone PCR klonēšanas kitu (Thermo Scientific, ASV). Ligācijas maisījums pēc transformācijas XL1 kompetentās šūnas (Stratagene, ASV) un audzēšanas uz LB agarizētās barotnes ar ampicilīnu (100 mg/l, Sigma, ASV). Klonu atlase sākotnēji tika veikta ar restrikcijas analīzi, šķeļot izolētās plazmīdu DNS ar restiktāzēm BamHI (Thermo Scientific, ASV) un EcoRI (Thermo Scientific, ASV). Kloni ar pozitīvu restrikcijas ainu tika sekvencēti, lai pārliecinātos par gēna atbilstību nepieciešamai sekvencei saskaņā ar Applied Biosysteins (ASV) protokolu.

Atlasītais klons tika šķelts pa restrikcijas saitiem BamHI un EcoRI, kur BamHI gadījumā tika izmantota daļējā šķelšana, jo RGMoV CP gēns satur BamHI saitu. Pa šiem pašiem saitiem tika šķelts arī vektors pPIC-3.5K. Restrikcijā iegūtie fragmenti tika izolēti agarozes gela. Attīrītie fragmenti tika savienoti, izmantojot T4 DNS ligāzi (Thermo Scientific, ASV), vadoties pēc ražotāja protokola.

Ligācijas maisījumu transformēja XL1 kompetentajās šūnās un audzējas uz LB agarizētās barotnes ar ampicilīnu (100 mg/l). Insertu saturošo klonu atlasei tika izmantots restrikcijas tests, šķeļot plazmīdas ar BamHI un EcoRI, klonus ar atbilstošo restrikcijas ainu sekvencēja ar iekšējiem RGMoV CP oligonukleotīdiem - RG-CPseq-F (SEQ ID N:3) un RG-CPseq-R (SEQ ID N: 4). Izanalizējot sekvencēšanas rezultātus, tika izvēlēta daudzziedu airenes raibuma vīrusa RGMoV CP integrācijas plazmīda CP iegūšanai no P.pastoris preparatīvos daudzumos.

Attiecīgā plazmīdas karte (pPIC-RGCP) parādīta 1. att. Ar iegūto integrācijas vektoru pPIC-RGCP pēc tā linearizēšanas ar Sacī (Thermo Scientific, ASV) ΑΟΧ1 promotera reģionā un bagātināšanas ar balasta nukleīnskābēm (E.coli totālo nukleīnskābju kopa) tika veikta P.pastoris celma GS115 kompetento šūnu elektroporācija. Pēc elektroporācijas šūnas izsēja uz RDB atlases platēm bez histidīna. Klonu atlasei ar vairākiem insertiem, transformanti no RDB barotnes platēm tika apvienoti un izsēti uz platēm ar YEPD agarizēto barotni, kas satur G418 antibiotiku (Gibco, ASV) koncentrācijas 2 mg/ml un 4 mg/ml.

Lai atlasītu klonus ar visaugstāko ekspresijas līmeni, šūnas kultivēja analītiskos (20 ml) daudzumos. Pirms ekspresijas eksperimentu uzsākšanas izvēlētajiem kloniem tika izolēta genomiskā DNS pēc litija acetāta un SDS metodes [22], un ar PCR metodes palīdzību identificēts CP gēns. Mērķproteīna sintēze rekombinantā P.pastoris GS115 šūnās tika veikta atbilstoši ražotāja protokolam (Invitrogen, ASV) ar nelielām modifikācijām: sākuma kultūra tika atšķaidīta BMGY barotnē līdz OD590 0.05 un audzēta pie +30°C uz kratītāja (Infors, Šveice) pie 250 rpm. Kultūru audzēja, inducējot ar 1 % metanolu, katrā nākamajā dienā pievienojot metanolu līdz 2 % koncentrācijai. Kultivēšana tika turpināta 5 dienas, OD590 sasniedza 6-8.

-8Ekspresijas līmenis tika noskaidrots, analizējot šūnu kopējos lizātus SDS/poliakrilamīda (SDS/PAA) gelos un imunoblotos. Klons ar visaugstāko ekspresijas līmeni tika kultivēts preparatīvos daudzumos 200 ml kolbās tajos pašos apstākļos kā klonu atlases eksperimentos. Pēc fermentācijas iegūtā biomasa tika iesaldēta (-20°C). Šķīstošās frakcijas proteīni pēc šūnu sagraušanas 15 mM KHPO₄ pH 5.5, 150 mM NaCl, 0.1 % ΤΧ-100, 0.1 % PMSF, kam pievienoja 1/5 no tilpuma stikla lodītes (425-600 pm, Sigma, ASV) buferšķīdumā ar ultraskaņas dezintegrāciju, izmantojot bezkontakta ultraskaņas dezintegrātoru S220 (Covaris, ASV, 2. att. B) 30 min ar darbības ciklu 20%, pīķa intensitāti 500 un 500 cikliem vai French presi (Thermo Scientific, ASV, paraugu apstrāde 3 reizes ar 1200 psi lielu spiedienu, izmantota kā salīdzinošā metode, 2. att. A) un pēc nešķīstošo proteīnu un membrānu fragmentu atdalīšanas tika frakcionēti ultracentrifūgā (Beckman, ASV; SW28 rotors, 25000 rpm, 6h, +5°C), saharozes gradienta (20-60%). Gradients tika sadalīts sešās frakcijās, sākot no gradienta apakšas, kuras tālāk tika analizētas SDS/PAA gelā (3. att.) un imunoblotā. Kā redzams no SDS/PAA gelu un imunoblota analīzes, RGMoV CP sintezējas P.pastoris šūnās ar augstu aktivitāti.

RGMoV-CP proteīns pēc sadalīšanas gradienta tika konstatēts apakšējās 2.un 3. frakcijā (40/50% saharozes), kas norāda uz to iespējamo klātbūtni augstmolekulāru agregātu formā. RGMoV-CP 2. un 3. frakcija tika apvienotas un dializētas pret 200 tilpumiem 15 mM KHPO₄ pH 5.5,1 mM PMSF buferšķīdumā, lai atbrīvotos no saharozes. Pēc dialīzes CP preparāti tika sakoncentrēti, izmantojot Amicon Ultra 15 centrifugējamu filtru (Millipore, ASV). Nepieciešamības gadījumā, lai iegūtu tīrus preparātus, ultracentrifugācijas procedūra saharozes gradienta var tikt atkārtota. Koncentrētie vīrusu virsmas proteīnu preparāti tika analizēti ar elektronmikroskopijas palīdzību. Kā redzams no elektronmikroskopijas analīzēs iegūtā attēla (4. att.), klonētā RGMoV CP gēns, ekspresējot P.pastoris, veido vīrusiem līdzīgās daļiņas (VLP). RGMoV-CP P.pastoris šūnās veido T=3 simetrijas ikozahedrālas VLP, kuras morfoloģiski atgādina natīvos RGMoV virionus un to izmēri ir 30 nm robežās.

2. piemērs. RGMoV VLD izmantošana nukleīnskābju iepakošanai

Lai varētu veikt svešas nukleīnskābes iepakošanu, sākumā izjauca attīrītās RGMoV VLP. Daļiņu izjaukšana tika veikta 0.6 M NaCl, 30 mM EDTA, 1 mM PMSF un 2 mM DTT buferšķīdumā klātbūtnē, inkubējot to pie +4°C 12 h. Neizjauktās daļiņas no izjauktajām atdalīja ar ultracentrifugēšanas palīdzību (TLA 100.1 rotors, Beckman, ASV) pie 72000 rpm, lh, +5°C. VLP savākšanai, izmantoja dialīzi pret 200 tilpumiem 20 mM TRIS-HC1 pH 7.0, 1 mM PMSF, 2 mM CaCL buferšķīdumā, paraugiem gan bez G10 (SEQ ID NO: 7), gan ar G10 trīs dažādās koncentrācijas (3 pg/μΐ, 1.5 pg/μΐ, 0.75 pg/μΐ). Pēc dialīzes paraugus sakoncentrēja ar ultracentrifugēšanas palīdzību (TLA 100.1 rotors, Beckman, ASV) pie 72000 rpm, lh, +5°C. Paraugus pēc ultracentrifugēšans analizēja SDS/PAA gelā, imunoblotā (5. att.) un agarozes gelā (6.

-9att.), lai varētu identificēt RGMoV CP/G10 kompleksus. Vīrusa virsmas proteīnu saturošie preparāti tika analizēti ar elektronmikroskopijas palīdzību. Kā redzams no elektronmikroskopijas analīzēs iegūtā attēla (7. att.) RGMoV CP bez G10 neveido VLD (7. att., c), bet G10 klātbūtnē veido VLD ar raksturīgo RGMoV T3 ikozahedrālo simetriju, gan TI simetriju. Proteīna degradācija, kas varētu būt cēlonis T=1 morfoloģijas daļiņu veidošanai, imunoblotā netika novērota (5. att. b). Tādējādi, ir parādīts, ka negatīvi lādētais oligonukleotīds G10 ir nepieciešams RGMoV VLP reasociācijai

Atsauces

1. Pumpens, P., Grens, E. (2002). Artificial genes for chimeric virus-like pārticies. In: Artificial DNA: Methods and Applications. Edited by Y.E.Khudyakov & H.A.Fields. CRC Press LLC, Boca Raton, pp. 249-327.

2. Zeltiņš A. (2013). Construction and Characterization of Virus-Like Pārticies: A Review. Mol Biotechnol. 53: 92-107.

3. Bachmann, M.F., Hengartner, H. and Zinkemagel, R.M. (1995). T helper cell-independent neutralizing B celi response against vesicular stomatitis virus: role of antigen pattems in B celi induction. Eur J Immunol., 25: 3445-3451.

4. Lenz, P. et al. (2003). Interaction of papillomavirus virus-like pārticies with human myeloid antigen-presenting celis, Clin Immunol. 106:231-237.

5. Bachmann M.F., Jennings G.T. (2011). Therapeutic vaccines for chronic diseases: successes and technical challenges. Phil. Trans. R. Soc. B. 366: 2815-2822

6. Chow, M. et al. (1985). Synthetic peptides from four separate reģions of the poliovirus type 1 capsid protein VP1 inducē neutralizing antibodies, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 82: 910914.

7. Haynes, J.R. et al. (1986). Development of a genetically-engineered, candidate polio vaccine employing the self-assembling properties of the tobacco mosaic virus coat protein, Bio/Tecbnology, 4: 637-641.

8. Zeltiņš A. (2009). Plant virus biotechnology platforms for expression of medicīnai proteīns. In: Medicīnai Protein Engineering, Y.E.Khudyakov, Ed., CRC Press, pp. 481-517.

9. Brumfīeld S. et al. (2004). Heterologous expression of the modified coat protein of Cowpea chlorotic mottle bromovirus results in the assembly of protein cages with altered architectures and function. J. Gen. Virol. 85: 1049-1053.

10. Wemer, S. et al. (2006). Immunoabsorbent nanoparticles based on a tobamovirus displaying protein A, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 103: 17678-17683.

-ΙΟΙ 1. Soto C.M, Ratna B.R. (2010). Virus hybrids as nanomaterials for biotechnology. Curr. Opinion Biotechnol. 21:426-438.

12. Bachmanņ M.F., Renner W.A. (2010). PACKAGED VIRUS-LIKE PARTICLES IN COMBINATION WITH CPG FOR USE AS ADJUVANTS WITH ALLERGENS: METHOD OF PREPARATION AND USE. European Patent EP1513552.

13. Senti G. et al. (2009). Use of A-type CpG oligodeoxynucleotides as an adjuvant in allergenspecific immunotherapy in humāns: a phase I/IIa clinical trial. Clin. Experiment. Allergy 39: 562-570.

14. Zhang F. et al. (2001). Complete Nucleotide Sequence of Ryegrass Mottle Virus : A New Species of the Gēnus Sobemovirus. J. Gen. Plant Pathol. 67: 63-68.

15. Balke I. et al. (2007). The Ryegrass mottle virus genome codes for a sobemovirus 3C-]ike serine protease and RNA-dependent RNA plymerase translated via -1 ribosomal frameshifting. Virus Genes 35: 395 - 398.

16. Plevka P.et al. (2007). The three-dimensional structure of ryegrass mottle virus at 2.9 A resolution. Virology 369: 364-374

17. Satheshkumar P. S. et al. (2004). Role of Mētai Ion-mediated interactions in the assembly and stability of Sesbania Mosaic Virus T=3 and T=1 capsids. J. Mol. Biol. 342: 1001-1014

18. Sambrook, J. et al., eds. (1989). Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν.Υ.;

19. Ausubel, F. et al., eds., (1997). Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc.

20. Harlow, E., Lane, D. (1988). Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν.Υ.;

21. Scopes, R. K. (1994) Protein Purification Principles and Practice, 3 ^rd ed., Springer-Verlag, New York.

22. Looke M. et al. (2011). Extraction of genomic DNA from yeast for PCR-based applications. BioTechniques 50: 325-328

-11SEQUENCE LISTING

SEQ ID NO: 1

ΤΥΡΕ: protein

LENGTH: 235 amino acids

ORGANISM: Ryegrass mottle virus (RGMoV) TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: coat protein (CP)

SEQUENCE:1

Met Ala Arg

Lys

Lys 5

Gly

Lys

Ser

Ala

Ser Gln Vai 10

Ile

Vai

Leu 15

Lys

Glu

Lys

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Gln

Lys

Ser

Arg

Gly

Gln

Gln

Pro

Thr

Arg

Gln

Vai

Thr

Pro

Vai

Ser

Ala

25

30

35

Pro

Ala

Ala

Met

Gly

Thr

Gln

Ile

Thr

Tyr

Arg

Gly

Pro

Gln

Vai

Vai

Thr

Gln

Tyr

Gly

45

50

55

Asp

Ile

Thr

Pro

Ala

Lys

Asn

Ser

Gly

Ser

Leu

Vai

Arg

Vai

Thr

Ser

Ser

Ala

Thr

Ala

65

70

75

Gly

Thr

Glu

Vai

Ser

Gly

Thr

Vai

Leu

Phe

Asn

Vai

Arg

Asn

Ala

Thr

Glu

Leu

Pro

Trp

85

90

95

Leu

Ser

Gly

Gln

Gly

Ser

Arg

Tyr

Ser

Lys

Tyr

Arg

Vai

Arg

Tyr

Ala

His

Phe

Thr

Trp

105

110

115

Glu

Pro

Ile

Vai

Gly

Ser

Asn

Thr

Asn

Gly

Glu

Vai

Ala

Met

Ala

Met

Leu

Tyr

Asp

Vai

125

130

135

Ala

Asp

Vai

Thr

Ser

Ile

Thr

Ile

Glu

Arg

Leu

Met

Gln

Thr

Arg

Gly

Gly

Thr

Trp

Gly

145

150

155

Pro

Ile

Trp

Ser

Pro

Thr

Arg

Lys

Arg

Leu

Ser

Tyr

Asp

Pro

Glu

His

Ala

Ser

Leu

Pro

165

170

175

Trp

Tyr

Leu

Ser

Gly

Vai

Ser

Ser

Gly

Ala

Ala

Ala

Gly

Asn

Ile

Gln

Thr

Pro

Phe

Gln

185

190

195

Īle

Ala

Trp

Ala

Ala

Gln

Ser

Ser

Leu

Vai

Ser

Thr

Thr

Leu

Gly

Arg

Ile

Met

Ala

Glu

205

210

215

Tyr

Leu

Vai

Glu

Leu

Thr

Asp

Pro

Vai

Asp

Vai

Thr

Ile

Asn

Gln

225

230

235

-12SEQ ID NO: 2

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 705 bases

ORGANĪSM: Ryegrass mottle virus

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: coat protein cDNA

SEQUENCE:2 atggcaaggaagaagggcaaatcggccagccaagtaatcgttttgaaggagaaatcccgg 60 aagaaacgacagaaaagcagaggccaacaacccaccagacaggttacaccggtttcagcg 120 ccggccgcgatggggacccagattacttatcggggaccccaagttgtaactcagtatggt 180 gacatcacccccgccaagaactctggctctttagtacgcgtcacatccagtgccaccgcc 240 ggcacggaggtgagcggcacggtgctctttaacgtacgcaatgcgactgagctaccgtgg 300 ctatctgggcaagggtcccgctattcgaagtacagggtgaggtatgcacacttcacctgg 360 gaaccaattgtgggatccaacaccaatggcgaggtagccatggctatgctgtatgatgtt 420 gctgatgtgactagcatcactatcgagcgactgatgcagacgagaggtggaacttgggga 480 cctatctggtctccgactaggaagcggctcagttatgaccctgagcacgcttctctacct 540 tggtacctaagtggagtctcctcaggcgccgcggcaggtaatatccagactcccttccag 600 atagcttgggctgcccaatcttcattggttagcacaacgctaggcagaataatggctgag 660 tacttggtggagttgaccgatccggttgatgtcacaatcaaccag 705

-13SEQ ID NO: 3

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 28 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonucleotide

OTHER INFORMATION: RGCP-Pich-BamHI-F primer

SEQUENCE: 3 ggatccaccatggcaaggaagaagggca 28

SEQ ID NO: 4

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 35 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonucleotide

OTHER INFORMATION: RGCP-Pich-EcoRI-R primer

SEQUENCE: 4 ggaattctcactggttgattgtgacatcaaccgga 35

SEQ ID NO: 5

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 35 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonucleotide OTHER INFORMATION: RG-CPseq-F primer

SEQUENCE: 5 atctgggcaagggtcccgctattcgaag

-14SEQ ID NO: 6

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 28 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonueleotide

OTHER INFORMATION: RG-CPseq-R primer

SEQUENCE: 6 ttgtgctaaccaatgaagattgggcagc 28

SEQ ID NO: 7

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 29 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonueleotide

OTHER INFORMATION: G10

SEQUENCE: 7 gggggggggggacgatcgtcgggggggggg 2 9

Claims (3)

1. Patenta pretenzijas

   1. Ikozahedrisku vīrusiem līdzīgo daļiņu iegūšanas paņēmiens, kas ietver sevī (a) daudzziedu airenes raibuma vīrusa (RGMoV) nukleīnskābes molekulas saskaņā ar SEQ ID NO: 2 sagatavošanu;

   (b) minētās nukleīnskābes ievadīšanu saimniekšūnās;

   (c) saimniekšūnu kultivēšanu tādos apstākļos, lai iegūtu proteīnu, kas spēj veidot vīrusiem līdzīgās daļiņas.
2. 2. Ikozahedrisku vīrusiem līdzīgo daļiņu iegūšanas paņēmiens, kurā 1. pretenzijā minētās saimniekšūnas ir Pichia pastoris.
3. 3. Ikozahedriskas vīrusiem līdzīgas daļiņas, kas satur vismaz vienu proteīnu no sekojošas grupas:

   (a) proteīns, kura sastāvā ietilpst aminoskābes 1-235 no SEQ ID NO:1;

   (b) proteīns, kura aminoskābju sekvence uzrāda vismaz 90% no daudzziedu airenes raibuma vīrusa (RGMoV) apvalka proteīna aminoskābēm saskaņā ar SEQ ID NO: 1.