LV15007B - Kartupeļu vīrusam PVM līdzīgo daļiņu iegūšana - Google Patents

Description

IZGUDROJUMA APRAKSTS

Izgudrojums attiecas uz biotehnoloģiju, molekulāro bioloģiju kā arī uz vakcīnu, diagnostikas līdzekļu komponentu un jaunu nanomateriālu iegūšanu. Tā pamatā ir vīrusu izcelsmes polipeptīdu pašsavākšanās procesu rezultātā izveidotas regulāras, organizētas nanometru izmēru pavedienveida struktūras, kuras satur mākslīgi pievienotas proteīnu sekvences.

Tehnikas līmeņa analīze

Vīrusiem līdzīgās daļiņas (VLP) ir multisubvienību proteīnu struktūras, kas ir identiskas vai strukturāli analoģiskas attiecīgajiem vīrusiem un nav infekciozas. Vīrusiem līdzīgās daļiņas ir plaši pazīstamas kā vakcīnu kandidāti [1]. Hepatīta B un cilvēka papilomas vīrusiem līdzīgās daļiņas ir vispopulārākās un tiek izmantotas komerciālajā medicīnas praksē kā vakcīnas pret hepatītu B un dzemdes kakla ļaundabīgo audzēju izraisītāju - papilomas vīrusu. Vīrusiem līdzīgo daļiņu efektivitāte imūnatbildes stimulēšanā ir labi zināma: strukturāli stingri sakārtoti un daudzkārtīgi atkārtoti aminoskābju sekvenču motīvi uz vīrusu virsmas proteīnu virsmas ir noteicošie signāli imūnsistēmas B-šūnu aktivēšanai un kalpo kā signāls imūnsistēmai, ka organismā ir nonācis svešas izcelsmes aģents [2]. Bez tam, vīrusiem līdzīgo daļiņu izmēri (pārsvarā zem 50 nm diametrā) ir piemēroti nokļūšanai dendrītiskajās šūnās, kur notiek VLP sašķelšana ar sekojošu imūnsistēmas T-šūnu aktivāciju [3], Tādējādi, VLP izsauc efektīvu humorālo un šūnu imūnatbildi, pat bez plaši pielietoto adjuvantu klātbūtnes [4],

Augu vīrusi neizraisa zīdītāju organismu saslimšanu. Tomēr augu vīrusi un tiem līdzīgas, no to strukturālajiem proteīniem mākslīgi iegūtas daļiņas (vīrusiem līdzīgās daļiņas - VLP) var tikt izmantoti kā epitopu nesēji, kuri eksponē patogēniem raksturīgus epitopus uz savu strukturālo proteīnu virsmas. Jēdziens „epitops” tiek definēts kā īsākā aminoskābju sekvence, kura spējīga piesaistīt tam specifisko antivielu molekulas; epitopi var būt kā lineāri, tā arī konformacionāli [1], Lineārie epitopi ir īsas aminoskābju sekvences (garumā no 4 līdz 10), kuru aktivitāti neietekmē to telpiskā struktūra. Konformacionālie epitopi veidojas no polipeptīdu ķēdes attālinātiem reģioniem, tiem izveidojot noteiktu telpisko struktūru.

Ideja par patogēniem raksturīgo peptīdu (epitopu) izmantošanu imunizācijā ir zināma jau vairāk 20 gadus. Ir zināms, ka zemmolekulārās vielas, tajā skaitā īsas aminoskābju sekvences (peptīdi), bieži izraisa vājas imūnatbildes. Tāpēc epitopus piesaista pie proteīnu-nesēju molekulām, kas izraisa paaugstinātas imūnatbildes zīdītāju organismos [5]. Attīstoties gēnu inženierijai un augu virusoloģijai, parādījās ideja, ka arī augu vīrusi var tikt izmantoti, kā svešu epitopu nesēji. Tā, klonējot poliovīrusam raksturīgo peptīdu kodējošās DNS sekvences tabakas mozaīkas vīrusa (TMV) virsmas proteīna gēna cDNS kopijā, un ekspresējot šos rekombinantos gēnus Escerichia

-2coli, tika iegūts vakcīnas kandidāts. Uz TMV virsmas lokalizētie poliovīrusa epitopi izraisīja poliovīrusu neitralizējošas antivielas pēc injekcijas laboratorijas žurkās [6]. Līdzīga stratēģija tikusi demonstrēta arī vairāku citu augu vīrusu gadījumos, piem., Cowpea mosaic virus, Tomato bushy stunt virus, Cucumber mosaic virus, Potato virus X (PVX), Johnsongrass mosaic virus, Papaya mosaic virus [7]. Attiecīgo vakcīnu kandidātu iegūšanai ir tikuši izmantoti dažādi saimniekorganismi, piem., ar rekombinantiem vīrusiem inficēti augi, ar modificētiem bakulovīrusiem inficētas insektu šūnas, raugu, un arī E.coli platformas.

Augu vīrusi vai no tiem atvasinātās VLP var tikt izmantotas arī jaunu nanomateriālu radīšanai. Tā uz tobamovīrusa bāzes ir izveidots jauns imunoadsorbents, kurš spējīgs piesaistīt līdz 2 g monoklonālo antivielu uz 1 g nesēja. Tas ir panākts, tobamovīrusa virsmas proteīnam C-galā ar gēnu inženierijas palīdzību pievienojot Staphylococcus aureus proteīna A funkcionālo fragmentu un izveidojot attiecīgo ekspresijas sistēmu VLP iegūšanai no tabakas lapām. Rezultātā tika iegūts nanodaļiņu materiāls (izmēri 18x200 nm), kur uz katras daļiņas virsmas ir izvietotas 2100 kopijas proteīna A atvasinājuma; autori piedāvāja to izmantot antivielu attīrīšanai kā ekonomisku, vienreiz lietojamu imūnadsorbentu [8].

Kartupeļu vīruss PVM pieder pie Carlavirus vīrusu grupas, pie kuras pieder 42 dažādu augu vīrusu sugas, tajā skaitā arī vēl citi kartupeļu vīrusi - PVP, PVS un PVX [9]. Genbank nukleotīdu sekvenču datubāzē atrodamas vairāk nekā 800 dažādu Carlavirus pārstāvju sekvenvces. Morfoloģiski PVM virioni ir viegli ieliektas, 650 x 12 nm pavedienveida struktūras (filamenti). To vienpavediena RNS sastāv no apmēram 8500 nukleotīdiem, kas kodē poliproteīnu, kurš sastāv metiltransferāzes, helikāzes un polimerāzes domēniem. Pārējie proteīni tiek sintezēti no 2 subgenomiskajām RNS (sgRNS), tajā skaitā virsmas proteīns (CP), kurš tiek translēts no mazākās, —1,5 kb sgRNS [10]. Nesen PVM virsmas proteīns ir ticis ekspresēts E.coli sistēmā sajūgtā formā ar nesējproteīnu GST pie +30°C, vīrusiem līdzīgo daļiņu veidošanās nav parādīta [11].

Līdzīgi kā daudziem pavedienveida vīrusiem, Carlavirus, tajā skaitā PVM, kristālu struktūra nav zināma. Tas apgrūtina to izmantošanu kā svešu aminoskābju sekvenču nesējus, jo nav iespējams noteikt uz vīrusu virsmas lokalizētos reģionus un paredzēt, vai ievietotās sekvences atradīsies uz VLP virsmas un kā šo sekvenču ievietošana vīrusa virsmas proteīna struktūrā ietekmēs VLP veidošanos. Tomēr filamentozo vīrusiem, ir iespējams izveidot struktūras modeļus, kas ir balstīti uz imunoloģisku un bioķīmisku eksperimentu rezultātiem [12]. Jāatzīmē, ka filamentozajiem vīrusiem virsmas proteīnu N- un/vai C-gali nereti ir lokalizēti uz daļiņu virsmas, kas ļauj epitopus vai proteīnu domēnus ievietot virsmas proteīnu N- vai C-galos. Tādos gadījumos gan ir nepieciešams eksperimentāli pārbaudīt VLP veidošanos;

-3Ir zināmi vairāki piemēri, kad filamentozo augu VLP no E.coli ekspresijas sistēmām ir izmantotas kā medicīniski nozīmīgu epitopu nesēji ar augstu imunoloģisko aktivitāti. Papaya mosaic virus (PapMV - PVM radniecīgā Potexvirus grupa) VLP ar virsmas proteīna C-galā ievietotiem hepatīta C E2 epitopiem, kuras tika iegūtas no E.coli ekspresijas sistēmas, pēc izmantošanas imunizācijā inducēja ilgstošu humorālo imūnatbildi eksperimentālo dzīvnieku organismos. Interesanti, ka imūnatbilde tika novērota tikai tādā gadījumā, kad imunizācijā tika izmantotas E2-CP filamentozās daļiņas. E2-CP monomērs izrādījās vājš imunogēns [13]. Tādējādi, šie eksperimenti parāda epitopu multimerizācijas nozīmi efektīvas imūnatbildes izraisīšanā, ko panāk ar epitopu izvietošanu uz VLP virsmas. Jāatzīmē, ka filamentozas augu vīrusu daļiņas var tikt izmantotas arī kā antivielu veidošanos stimulējoši aģenti - adjuvanti [14]. Arī citu filamentozo augu vīrusu virsmas proteīnu C-gala sekvence ir izmantota svešu epitopu prezentācijai uz VLP virsmas, piem: Potyvirus grupas pārstāvji JGMV (Johnsongrass mosaic virus) [15] un PVA [16], kā arī Tobamovirus grupas vīrusi TMV [17] un CGMMV [18]. Jāatzīmē, ka pēdējie piemēri attiecas uz rekombinantu VLP iegūšanu no visai komplicētām augu ekspresijas sistēmām, un VLP šajos gadījumos satur infekciozas vīrusu nukleīnskābes, kas sarežģī to tālāko izmantošanu ražošanā un medicīnas praksē.

Mazāk ir zināmi gadījumi, kad svešu polipeptīdu sekvences ir ievietotas filamentozo vīrusu CP N-galos. Jau pieminētā infekciozu vīrusu un augu saimniekorganismu sistēma izmantota, lai Potexvirus PVX CP N-galā ievietotu īsus epitopus (6 aminoskābes) un panāktu relatīvi augstas imūnatbildes pret epitopu laboratorijas dzīvniekos [19], Afī jau pieminētā JGMV gadījumā virsmas proteīna N-gala 65 aminoskābes var tikt aizvietotas ar svešu proteīnu sekvencēm, netraucējot VLP veidošanos rekombinantu E.coli šūnās [20]. Tomēr šajā izgudrojumā nav datu par šādu VLP imunoloģiskajām īpašībām, kaut gan autori ir norādījuši uz šādi iegūtu VLP potenciālo pielietojumu kā vakcīnas. Šī darba autori ari apgalvoja, ka ir iespējams līdzīgā veidā daļēji vai pilnīgi aizvietot gan N- gan C-gala aminoskābes visu Potyvirus virsmas proteīnu struktūrās, netraucējot VLP veidošanos. Pretrunā ar šiem datiem, N- un C-gala aminoskābju būtisko nozīmi Potyvirus VLP veidošanā raksturo cita Potyvirus grupas vīrusa PVBV (Pepper vein banding virus) virionu veidošanās mehānisma modelis. Saskaņā ar šo modeli, virionu veidošanās sākas ar CP N- un C-gala pozitīvi un negatīvi lādēto aminoskābju mijiedarbību, izveidojot gredzenveida struktūras, kuras tālāk izveido vīrusu filamentus. Izveidojot PVBV CP N- vai C-termināli saīsinātus klonus, VLP veidošanās E.coli šūnās ir traucēta [21]. Tādējādi, apgalvojums, ka visu Potyvirus grupas vīrusu virsmas proteīniem ir iespējams aizvietot gan N-, gan C-galu aminoskābes, nav pareizs. To parāda arī mūsu nesenie dati par PVY vīrusiem līdzīgajām daļiņām, kur virsmas proteīna N-galā bija iespējams ievietot līdz 71 aminoskābju garus posmus, kamēr C-gala inserti izjauca VLP veidošanos. Bez tam, PVY nesējam VLP

-4veidošanās procesā notiek daļēja virsmas proteīna N-gala aminoskābju proteolītiska atšķelšana, kas noved pie samazināta ievietoto epitopu daudzuma uz VLP virsmas, kas savukārt var samazināt antivielu veidošanās aktivitāti pret šiem epitopiem [22].

Tādējādi, ir skaidri redzams, ka, neraugoties uz zināmajiem piemēriem, joprojām pastāv tehnoloģiska nepieciešamība pēc alternatīviem, uz VLP balstītiem polipeptīdu nesējiem, kuri var tikt iegūti no vienkāršām bakteriālām ekspresijas sistēmām un kuri var tikt izmantoti kā jauni nanomateriāli ar visdažādāko pielietojumu, ieskaitot imunoloģiski aktīvus materiālus un jaunus adsorbentus, kuri var tikt izmantoti antivielu iegūšanai, bioloģiski aktīvu vielu attīrīšanas procesos un jaunu bioķīmisku analīzes metožu izstrādē.

Attēlu apraksti

1. att. Ekspresijas plazmīda, kas satur aprakstīto PVM virsmas proteīna gēnu. PVM-CP gēns iegūts ar RT-PCR palīdzību no inficētiem kartupeļu meristēmu augiem, klonēts E.coli ekspresijas vektorā pET-28a+ (Novagen). Norādīta PVY-CP gēna, kanamicīna rezistences gēna (KmR) lokalizācija, kā arī daži nozīmīgākie restriktāžu šķelšanas saiti.

2. att. pET-28a+ E.coli ekspresijas plazmīdas fragments, kas satur aprakstīto PVM virsmas proteīna gēnu ar glicīna-serīna atkārtojumu cDNS gēna 5’ galā. Zem fragmenta attēlota PVM-CP proteīna aminoskābju sekvence, proteīna N-galā pievienotās aminoskābes pasvītrotas.

3. att. pET-28a+ E.coli ekspresijas plazmīdas fragments, kas satur aprakstīto PVM virsmas proteīna gēnu hepatīta B preSl epitopa sekvences un glicīna-serīna atkārtojuma cDNS gēna 5’ galā. Zem fragmenta attēlota PVM-CP proteīna aminoskābju sekvence, proteīna N-galā pievienotās aminoskābes pasvītrotas, preSl aminoskābes attēlotas kursīvā ar treknu druku.

4. att. pET-28a+ E.coli ekspresijas plazmīdas fragments, kas satur aprakstīto PVM virsmas proteīna gēnu ar glicīna-serīna atkārtojuma un dubultotu proteīna Α Z domēna sekvences cDNS gēna 5’ galā. Zem fragmenta attēlota PVM-CP proteīna aminoskābju sekvence, proteīna N-galā pievienotās aminoskābes pasvītrotas, abu Z domēnu aminoskābes attēlotas kursīvā ar treknu druku.

5. att. PVM-CP iegūšanas un attīrīšanas analīze SDS-poliakrilamīda gēlā.

M - proteīnu marķieris (Fermentas, Lietuva), T - kopējie proteīni, S - šķīstošie proteīni, P nešķīstošie proteīni, 1 - 6 saharozes gradienta frakcijas.

6. att. Kartupeļu vīrusam PVM līdzīgās daļiņas (VLP), kas iegūtas no rekombinantu E.coli pETPVM-CP šūnām. Apakšējā malā iezīmētā mēroga līnija atbilst 200 nm.

7. att. Kartupeļu vīrusam PVM līdzīgās daļiņas (VLP), kas iegūtas no rekombinantu E.coli pETPVM-CP-NpreSl šūnām. Apakšējā malā iezīmētā mēroga līnija atbilst 100 nm.

-58. att. Kartupeļu vīrusam PVM līdzīgās daļiņas (VLP), kas iegūtas no rekombinantu E.coli pETPVM-CP-Nzz šūnām. Labajā apakšējā stūrī iezīmētā mēroga līnija atbilst 100 nm.

Izgudrojuma apraksts

Šis izgudrojums parāda, ka no inficētiem kartupeļu augiem iegūta PVM vīrusa RNS virsmas proteīna (CP) gēna cDNS kopija (SEQ ID NO: 2), ja to ievieto E.coli ekspresijas plazmīdā (vektorā), ir spējīga izraisīt virsmas proteīna sintēzi ar augstu iznākumu baktēriju kultūrās. Kā ekspresijas vektors var tikt izmantots šeit pieminētais pET-28a+ vektors, kas satur T7 promotora sekvenci, ribosomu saistīšanās saitu, antibiotika (kanamicīna) rezistences gēnu un ekspresiju regulējošo Lāci gēnu. Tādā gadījumā nepieciešams izmantot tādus rekombinantus T7 polimerāzes gēnu saturošus E.coli celmus, kā BL21(DE3), C2566, C3010 vai arī citus, kas nodrošina aktīvu mērķproteīna sintēzi no T7 promotora pie dažādām kultivēšanas temperatūrām. Principā ir iespējams izmantot arī citus vektorus un baktēriju celmus. Tos ir iespējams pārbaudīt līdzīgā veidā, kā aprakstīts 1. piemērā.

Baktēriju šūnās CP molekulas (SEQ ID NO: 1) sintēzes procesa laikā spontāni izveido vīrusiem līdzīgas daļiņas (VLP), kuras morfoloģiski ir līdzīgas natīvajiem PVM virioniem, kā to parāda elektroumikroskopijas analīžu rezultāti. Izgudrojums demonstrē paņēmienus, kā, izmantojot piemērotas E.coli saimniekšūnas un ekspresijas vektorus, iegūt PVM vīrusiem līdzīgās daļiņas. Šo VLP sastāvā ar gēnu inženierijas metodēm var tikt ievadītas polipeptīdu sekvences, netraucējot VLP autopolimerizāeijas procesam baktēriju šūnās, kā tas ir aprakstīts 2. piemērā.

Šie polipeptīdi var būt visdažādākās izcelsmes aminoskābju sekvences, tajā skaitā dažādu slimību izraisītājiem raksturīgie antigēni - kā hepatīta B preSl epitops (SEQ ID NO: 10), proteīnu domēni, piem., proteīna A dubultots Z domēns (SEQ ID NO:16), kā ari mākslīgi izveidotas sekvences atkarībā no to plānotā izmantošanas veida. Mūsu eksperimentāli iegūtie dati liecina, ka kartupeļu vīrusa PVM virsmas proteīna N-galam var tikt pievienotas papildus aminoskābju sekvences tā, lai netraucētu vīrusiem līdzīgo daļiņu veidošanos heterologu saimnieku, it īpaši rekombinantu E.coli šūnās.

Fakts, ka iegūtās rekombinantās, svešus polipeptīdus saturošās VLP uzrāda augstu morfoloģisko līdzību ar natīvajiem vīrusiem, norāda uz iespēju, ka šie polipeptīdi izkārtoti VLP struktūrā regulāri organizētā veidā. PVM VIT gadījumā tas nodrošina vienmērīgu, regulāru polipeptīda izvietojumu uz pavedienveidīgās VLP virsmas. Šādi regulāri uz nesēja virsmas izvietoti epitopi vai proteīnu domēni ir nepieciešami kvalitatīvu antivielu iegūšanai imunizācijas procesā. Piedevām daudzskaitlīga noteiktas aminoskābju sekvences izvietošana uz VLP virsmas var kalpot arī par dažādu analītisku metožu būtisku komponentu, lai paaugstinātu signāla intensitāti uz laukuma vienību, kas, piemēram, ir svarīgi efektīvu mikročipu izveidošanā.

-6Turklāt izgudrojums demonstrē arī efektīvu rekomomantu PVM VLP attīrīšanas metodi, izmantojot vairākkārtēju frakcionēšanu ar ultracentrifugēšanas palīdzību.

Kartupeļu vīrusa PVM gadījumā efektīvs paņēmiens vīrusiem līdzīgo daļiņu iegūšanai no rekombinantām E.coli šūnām, kā arī PVM VLP ar virsmas proteīna struktūrā iekļautām heterologu proteīnu sekvencēm (līdz 137 papildus aminoskābēm) patentu un cita veida literatūrā nav atrasti.

Izgudrojumā aprakstītās VLP var tikt izmantotas kā imūnatbildi stimulējoši aģenti, ja tās ievada zīdītāju organismos. Ar epitopu un proteīnu domēnu saturošu PVM izcelsmes rekombinanto VLP palīdzību iegūtās antivielas var tikt izmantotas kā slimību ārstēšanā un profilaksē, tā ari attiecīgo saslimšanu diagnosticēšanā. Šādi iegūtas antivielas var tikt izmantotas arī kā pamatkomponents diagnostikas reaģentu komplektos (piemēram, ELISA kitos), lai konstatētu PVM infekcijas kartupeļos un citos PVM jūtīgās lauksaimniecības kultūrās. Bez tam, šādas VLP var izmantot jaunu nanomateriālu izveidošanai. Proteīna A Z-domēnus saturošas PVM VLP var tikt pielietotas monoklonālo antivielu attīrīšanā.

Kā tas ir saprotams tehnikas līmeņa speciālistiem, šī izgudrojums balstās uz tādām rekombinantu nukleīnskābju tehnoloģijām, kā DNS un RNS attīrīšanu no dažādu organismu šūnām, polimerāzes ķēdes un citām enzimātiskām reakcijām, klonēšanu, rekombinantu proteīnu ekspresiju prokariotu šūnās un to attīrīšanu un citām tehnoloģijām. Šīs tehnoloģijas speciālistiem ir labi pazīstamas un to detalizēti apraksti ir atrodami populāros metožu krājumos [24-27]. Izgudrojuma labākai izpratnei zemāk izklāstītajos piemēros ir parādīta PVM VLP iegūšana un polipeptīdu sekvenču ievietošana VLP struktūrā.

1. piemērs. PVM virsmas proteīna gēna klon ēšana, ekspresija E.coli šūnās, vīrusiem līdzīgo daļiņu iegūšana

Kopējā RNS no inficētiem kartupeļu meristēmu augiem augu tika izolēta ar TRI reaģentu (Sigma, USA) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Reakcijā izmantojot M-MuLV H(-) reverso transkriptāzi (Fermantas, Lietuva) ar „random” oligoheksamēriem, tika iegūta PVM cDNS.

Praimeru sekvences cDNS klonēšanai tika izvēlētas, analizējot Genbank datu bāzē publicētās

PVM sekvences virsmas proteīnu gēnu reģionos. Virsmas proteīna (CP) gēna klonēšanai tika izvēlēti praimeri no tādiem genoma reģioniem, kas iekļauj CP gēnu ar iespējami augstāko sekvenču identitāti starp zināmajiem izolātiem - PVM_CP1F (SEQ ID NO: 3) un PVM_CP1R (SEQ ID NO: 4). Tālāk PCR reakcijās ar šiem izvēlētajiem praimeriem ieguva CP gēna cDNS 1 kopiju.

Iegūtais vīrusu virsmas proteīna cDNS PCR produkts tika izolēts no agarozes gēla un tieši ligēti pTZ57R/T PCR produktu klonēšanas palīgvektorā (Fermentas, Lietuva). cDNS insertus saturošie

-7kloni tika sekvencēti ar universālajiem praimeriem M13/pUC tiešais (-46) un M13/pUC reversais (-46), lai pārliecinātos par gēna atbilstību nepieciešamai sekvencei saskaņā ar Applied Biosystems protokolu. Lai izvairītos no RT-PCR reakciju iespējamajām kļūdām, tika sekvencēti vismaz 4 dažādi kloni un salīdzināti ar Genbank datu bāzē atrodamajām sekvencēm kā nukleotīdu, tā arī aminoskābju līmenī.

Mūsu izolāta PVM CP gēna nukleotīdu sekvence (SEQ ID NO:2) ir atšķirīga no visām iepriekš zināmajām - tā atšķiras par 24 nukleotīdiem no tuvākā publicētā PVM izolāta (Genbank KC866622), gēns kodē proteīnu (SEQ ID NO:1), kuram salīdzinājumā ir divas atšķirīgas aminoskābes (Arg44/Lys un Tyr278/Phe).

No iegūtajiem cDNS sekvenču datiem tika atvasināta praimera sekvence attiecīgo CP gēnu subklonēšanai ekspresijas vektorā pET-28a+ (Novagen, USA) PVM_CP_Nco_F (SEQ ID NO:

5) un PVM_CP_Hind_R (SEQ ID NO: 6), pievienojot attiecīgi Ncol un HindIII restriktāžu šķelšanas saitus. Ar šiem praimeriem iegūtos PCR produktus un E.coli ekspresijas vektoru pET28a(+) šķēla pa restrikcijas saitiem Ncol un HindIII, iegūtie vektora un PVM-CP fragmenti tika savienoti ar T4 ligāzi (Fermentas, Lietuva) . Ar iegūto ligācijas maisījumu transformēja kompetentas E.coli XLI šūnas. Transformāciju maisījumi tika izsēti uz LB platēm ar kanamicīnu. Izolēto plazmīdu DNS tika pārbaudītas ar restrikciju analīzēm; kloniem ar atbilstošu restrikcijas ainu tika sagatavotas sekvenču reakcijas. Izanalizējot sekvencēšanas rezultātus, tika izvēlēta kartupeļu vīrusa PVM CP ekspresijas plazmīda virsmas proteīna iegūšanai no E.coli preparatīvos daudzumos.

Attiecīgā plazmīdas karte (pET-PVM-CP) parādīta 1. att. Ar iegūto ekspresijas vektoru pETPVM-CP transformēja kompetentas E.coli C2566 (NEB, USA) ekspresijas šūnās. Lai atlasītu klonus ar visaugstāko ekspresijas līmeni, transformētās šūnas kultivēja analītiskos (20 ml) daudzumos 2xTY barotnē ar kanamicīnu (Km; 25 mg/l) uz kratītāja (200 apgr./min) pie +30°C līdz OD(600 nm) -0.8-1.0. Šūnas inducēja ar 0.2 mM IPTG, bez tam tika pievienoti 2mM CaClo un 5mM MgCE. Kultūras pēc inducēšanas tika kultivētas vēl 18 h uz kratītāja pie +20°C. Ekspresijas līmenis tika noskaidrots, analizējot SDS/poliakrilamīda gēlos šūnu kopējos Iizātus. Klons ar visaugstāko ekspresijas līmeni tika kultivēts preparatīvos daudzumos 200 ml kolbās tajos pašos apstākļos kā klonu atlases eksperimentos. Pēc fermentācijas iegūtā biomasa tika iesaldēta (-20°C). Šķīstošās frakcijas proteīni pēc šūnu sagraušanas PBS buferšķīdumā ar ultraskaņas dezintegrāciju un nešķīstošo proteīnu un membrānu fragmentu atdalīšanas tika frakcionēti ultracentrifugā (Beckman, USA; SW28 rotors, 25000 rpm, 6h, +5°C), saharozes gradientā (20-60%). Gradients tika sadalīts sešas frakcijās, sākot no gradienta apakšas, kuras tālāk tika analizētas ar SDS-poliakrilamīda (SDS/PAA) gēlā (5. att.). Kā redzams no SDS/PAA gēlu analīzes, PVM virsmas proteīns tika sintezēts ievērojamos daudzumos un atrodams pārsvarā

-8šķīstošo proteīnu frakcijās. PVM-CP proteīns pēc sadalīšanas gradientā tika konstatēts arī apakšējās l.un 2. frakcijā (50/60% saharozes), kas norāda uz to iespējamo klātbūtni augstmolekulāru agregātu formā. PVM-CP 1. un 2. frakcija tika apvienotas un dializētas pret 200 tilpumiem lx PBS, lai atbrīvotos no saharozes. Pēc dialīzes CP preparāti tika sakoncentrēti, izmantojot Amicon Ultra 15 centrifugējamu filtru (Millipore, USA). Nepieciešamības gadījumā, lai iegūtu tīrus preparātus, ultracentrifugācijas procedūra var tikt atkārtota. Koncentrētie vīrusu virsmas proteīnu preparāti tika analizēti ar elektronmikroskopijas palīdzību. Kā redzams no elektronmikroskopijas analīzēs iegūtā attēla (6. att.), klonētā kartupeļu vīrusa PVM virsmas proteīnu gēns, ekspresējot E.coli, veido vīrusiem līdzīgās daļiņas. No E.coli izdalītās PVM-CP VLP E.coli šūnās veido pavedienveida vīrusiem līdzīgās daļiņas, kuras morfoloģiski atgādina natīvos PVM virionus un to izmēri sasniedz līdz 600 nm.

2. piemērs. Heterologus polipeptīdus saturošu PVM VLP iegūšana

Lai izveidotu PVM CP konstrukciju, kas varētu kalpot par svešu epitopu vai proteīnu domēnu nesēju, vispirms bija nepieciešams izveidot starpkonstrukcijas, kurās ievietotie epitopi vai proteīnu domēni netraucētu CP aminoskābēm VLP savākšanās procesā. Tika nolemts PVM-CP N-galā pievienot glicīnu un serīnu atkārtojumu sekvences (SEQ ID NO:7), kura kalpotu par elastīgu aminoskābju starpposmu (linkeri) starp CP aminoskābēm un ievietojamo svešo proteīna sekvenci un nodrošinātu netraucētu VLP veidošanos. Pēc jau aprakstītās metodikas ar PCR palīdzību PVM-CP gēnā ar attiecīgajiem praimeriem linkera ievadīšanai N-galā (SEQ ID NO: 8/ SEQ ID NO: 9) 5’ galā tika ievestas (G4S)₃ kodējošā sekvence un papildus BamHI restriktāzes saits epitopu un proteīnu domēnu cDNS klonēšanai (2. att.). Ekspresijas vektoru pET-PVM-CP un PCR produktu šķēla pa restrikcijas saitiem Ncol un EcoRl (PVM CP gēna intemālais saits). Fragmenti tika izolēti no 0.8% agarozes gēla un ligēti ar T4 ligāzi; ar ligācijas maisījumiem tika transformētas E.coli XLI kompetentās šūnas. Pēc plazmīdu izolēšanas no atsevišķu koloniju kultūrām ar restrikcijas analīzes un sekvencēšanas palīdzību tika atlasīti kloni, kas atbilda attiecīgo gēnu sekvencēm. Tālāk ar izvēlēto pET-PVM-CP-NG4S plazmīdu transformēja E.coli C2566 ekspresijas celma šūnas.

PVM-CP-NG4S proteīns tika attīrīts saskaņā ar iepriekš aprakstīto protokolu (1. piemērs).

Līdzīgi kā PVM-CP gadījumā, liela daļa no pētāmā proteīna tika atrasta 50/60% saharozes gradienta frakcijās (frakcijas 1 un 2), kas liecina, ka tie veido lielmolekulāras VLP struktūras. Tādējādi, tika parādīts, ka PVM-CP N-galam var tikt pievienotas svešu peptīdu sekvences.

PVM VLP kā epitopu nesēja pārbaudei tika izvēlēts hepatīta B vīrusa preS 1 epitops (SEQ ID NO: 10), kura cDNS ir Latvijas Biomedicīnas centra kolekcijā [27].

-9Klonēšanai paredzētā preSl epitopa cDNS tika iegūta PCR reakcijā no komplementāriem specifiskiem praimeriem PVM-NpreSlF (SEQ ID NO: 11) un PVM-NpreSlR (SEQ ID NO: 12), neizmantojot references DNS („template DNA”). PCR produkts tika sagriezts ar Ncol un BamHI un ligēts plazmidā pET-PVM-CP-NG4S, kura tika sagriezta ar Ncol un daļēju BamHI šķelšanu. Ar ligācijas maisījumu transformēja XL1 šūnas, izolēja plazmīdu DNS. Ar sekvencēšanas palīdzību tika atlasīts klons, kura sekvence atbilda plānotajai, tādējādi iegūstot ekspresijas vektoru pET-PVM-CP-NpreS 1 (plazmīdas fragmenta karte un mērķproteīna aminoskābju sekvence - 3.att.), ko ar transformācijas palīdzību ievadīja C2566 ekspresijās šūnās. Pēc ekspresijas klonu atlases, kultūra ar augstāko ekspresiju tika kultivēta preparatīvos daudzumos, šūnu lizāts tika attīrīts saharozes gradientā, ultracentrifugējot saskaņā ar iepriekš aprakstīto protokolu. Līdzīgi kā PVM-CP gadījumā, mērķproteīns tika atrasts lielos daudzumos 50/60% saharozes frakcijās, kas liecina, ka tas, iespējams, veido multimēru struktūras. Lai pārliecinātos par VLP veidošanos no šī rekombinantā proteīna, minētās frakcijas tika apvienotas, dializētas un, pēc koncentrēšanas ar Amicon Ultra-15 (lOOkDa) ultrafiltrēšanas ierīci, sagatavotas elektronu mikroskopijas analīzei. Kā redzams no 7. attēla, izveidotā proteīna konstrukcija, kurā PVM virsmas proteīnam N-galā ir pievienotas HBV preSl 22 aminoskābes un 17 glicīna-serīna linkeris, spēj veidot vīrusiem līdzīgās daļiņas, kuras morfoloģiski neatšķiras no jau aprakstītajām PVM-CP VLP. Tas norāda, ka PVM VLP struktūrā var tikt „iebūvētas” svešu epitopu sekvences un tās netraucē VLP veidošanās procesu.

Lai pārbaudītu garāku, N-galā ievietotu polipeptīdu ietekmi uz VLP veidošanos PVM-CP autopolimerizācijas rezultātā, kā modeļproteīns tika izvēlēts dubultots Z domēns no Staphylococcus aureus, par kuru ir zināms, ka šīs domēns ir spējīgs piesaistīt dažādus imunoglobulīnus un var tikt izmantots antivielu attīrīšanas procesos. Z domēns ir'sekmīgi ekspresēts E.coli šūnās [29]. Dubultota Z domēna cDNS kopija (SEQ ID NO: 13) PCR amplifikācijai ir atrodama komerciālā vektorā pEZZ18 (Pharmacia, USA). Lai ieklonētu Z domēnu cDNS PVM CP gēna 5’ galā, attiecīgais pEZZ18 fragments tika amplificēts PCR reakcijā izmantojot specifiskus praimerus (SEQ ID NO: 14/(SEQ ID NO: 15). Līdzīgi kā iepriekš, iegūtais PCR produkts pa saitiem Ncol un BamHI tika tieši klonēts pET-PVM-CPNG4S. Ar restrikcijas analīzes un sekvencēšanas palīdzību tika atlasīts klons bez PCR kļūdām, iegūstot ekspresijas vektoru pET-PVM-CP-Nzz (4.att.). Šo plazmīdu ar transformācijas palīdzību ievadīja C2566 ekspresijās šūnās. PVM-CP-Nzz proteīns tika iegūts pēc analoģiska protokola, kā pārējie PVM-CP atvasinājumi. Arī šajā gadījumā saharozes gradientā attīrītais proteīns saskaņā ar elektronu mikroskopijas analīzēm ir autopolimerizējies vīrusiem līdzīgo daļiņu formā (8. att), kuru morfoloģija īpaši neatšķiras no PVM-CP VLP, kaut gan dominē īsāki filamenti nekā PVM-CP gadījumā. Tādējādi, ir parādīts, ka PVM N-galā var tikt pievienota

-10vismaz 137 aminoskābes gara polipeptīdu sekvence, kas satur no 116 Z domēna aminoskābes (SEQ ID NO: 16), netraucējot VLP veidošanās procesam.

Atsauces

1. Pumpens, P., Grens, E. (2002). Artificial genes for chimeric virus-like pārticies. In: Artificial DNA: Methods and Applications. Edited by Y.E.Khudyakov & H.A.Fields. CRC Press LLC, Boca Raton, pp. 249-327.

2. Bachmann, M.F., Hengartner, H. and Zinkemagel, R.M. (1995). T helper cellindependent neutralizing B celi response against vesicular stomatitis virus: role of antigen pattems in B celi induction. Eur. J. Immunol. 25: 3445-3451.

3. Fifis, T. et al. (2004). Size-dependent immunogenicity: Therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors, J. Immunol. 173: 3148-3154.

4. Lenz, P. et al. (2003). Interaction of papillomavirus virus-like pārticies with human myeloid antigen-presenting celis, Clin Immunol. 106: 231-237.

5. Chow, M. et al. (1985). Synthetic peptides from four separate reģions of the poliovirus type 1 capsid protein VP1 inducē neutralizing antibodies, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 82: 910-914.

6. Haynes, J.R. et al. (1986). Development of a genetically-engineered, candidate polio vaccine employing the self-assembling properties of the tobacco mosaic virus coat protein, Bio/Technology, 4: 637-641.

7. Zeltiņš A. (2009). Plant virus biotechnology platforms for expression of medicīnai proteīns. In: Medicīnai Protein Engineering, Y.E.Khudyakov, Ed., CRC Press, pp. 481517.

8. Wemer, S. et al. (2006). Immunoabsorbent nanoparticles based on a tobamovirus displaying protein A. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 103: 17678-17683.

9. Fauquet C. M. et al. (2005) Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses. 8th Report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses. New York: Elsevier-Academic Press.

10. Khan J.A., Dijkstra J. (2006). Description of positive-sense, single-stranded RNA viruses. In: Handbook of Plant Virology. Binghamton, Haworth Press.

11. Li et al. (2013) Discovery and Characterization of a Novel Carlavirus Infecting Potatoes in China. PLoS ONE 8(6): e69255.

12. Nemykh M.A. (2008). One more probable structural transition in potato virus X virions and a revised modei of the virus coat protein structure. Virology 373: 61-71.

-1113. Denis J. et al. (2007). Immunogenicity of papaya mosaic virus-like pārticies fused to a hepatitis C virus epitope: Evidence for the critical function of multimerization. Virology 363: 59-68.

14. Leclerc, D., Lopez-Macias C.R. Adjuvant virai particle. USA Patent appl. 20090280145.

15. Saini M., Vrati,S. (2003). A Japanese encephalitis virus peptide present on Johnson grass mosaic virus-like pārticies inducēs virus-neutralizing antibodies and protects mice against lethal challenge. J. Virol. 77: 3487-3494.

16. Pokorna, D. et al. (2005). DNA vaccines based on chimeric potyvirus-like pārticies carrying HPV16 E7 peptide (aa 44-60), Oncology Rep. 14: 1045-1053,.

17. Staczek, J. et al. (2000). Immunization with a chimeric tobacco mosaic virus containing an epitope of outer membrane protein F of Pseudomonas aeruginosa provides protection against challenge with P. aeruginosa. Vaccine 18, 2266-2274.

18. Ooi, A.S. et al. (2006). The full-length clone of cucumber green mottle mosaic virus and its application as an expression system for hepatitis B surface antigen. J. Biotechnol. 121: 471-481.

19. Marusic, C. et al. (2001). Chimeric plant virus pārticies as immunogens for inducing murine and human immune responses against human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 75: 8434-8439.

20. Jagadish, M.N., Ward, C. W., Shukla, D. D. Self-polymerising expression system based on modified potyvirus coat proteins. World patent WO/1991/015587.

21. Anindya R., Savithri H.S. (2003). Surface-exposed amino- and carbox-terminal residues are crucial for the initation of assembley in Pepper vein banding virus: a flexuous rodshaped virus. Virology 316: 325-336.

22. Kalnciema I. et al. (2012). Potato virus y-like pārticies as a new carrier for the presentation of foreign protein stretches. Mol. Biotechnol. 52:129-39.

23. Sambrook, J. et al., eds. (1989). Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν.Υ.;

24. Ausubel, F. et al., eds., (1997). Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc.

25. Harlow, E., Lane, D. (1988). Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν.Υ.;

26. Scopes, R. K. (1994) Protein Purification Principles and Practice, 3 ^rd ed., SpringerVerlag, New York.

27. Bichko V. et al. (1985). Subtype ayw variant of hepatitis B virus. DNA primary structure analysis. FEBS Lett. 185:208-212.

-1228. Nilsson B. et al. (1987). A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein A. Protein Eng. 1:107-113.

SEQUENCE LISTING

SEQ ID NO: 1

ΤΥΡΕ: protein

LENGTH: 304 amino acids

ORGĀNISM: Potato virus M (PVM) TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: coat protein (CP)

SEQUENCE:1

Met Gly Asp

Ser Thr 5

Lys

Lys

Ala

Glu Ala Ala Lys 10

Asp

Vai

Gly 15

Thr

Ser

Gln

Glu

Lys

Arg

Glu

Ala

Arg

Pro

Leu

Pro

Thr

Ala

Ala

Asp

Phe

Glu

Gly

Arg

Asp

Thr

Ser

20

25

30

35

Glu

Asn

Thr

Asp

Gly

Arg

Ala

Ala

Asp

Ala

Asp

Gly

Glu

Met

Ser

Leu

Glu

Arg

Arg

40

45

50

55

Leu

Asp

Ser

Leu

Arg

Glu

Phe

Leu

Arg

Glu

Arg

Arg

Gly

Ala

Īle

Arg

Vai

Thr

Asn

60

65

70

75

Pro

Gly

Leu

Glu

Thr

Gly

Arg

Pro

Arg

Leu

Gln

Leu

Ala

Glu

Asn

Met

Arg

Pro

Asp

80

85

90

95

Pro

Thr

Asn

Pro

Tyr

Asn

Arg

Pro

Ser

Ile

Glu

Ala

Leu

Ser

Arg

Ile

Lys

Pro

Ile

100

105

110

Ala

Īle

Ser

Asn

Asn

Met

Ala

Thr

Ser

Glu

Asp

Met

Met

Arg

Ile

Tyr

Vai

Asn

Leu

115

120

125

130

Glu

Gly

Leu

Gly

Vai

Pro

Thr

Glu

His

Vai

Gln

Gln

Vai

Vai

Īle

Gln

Ala

Vai

Leu

135

140

145

150

Phe

Cys

Lys

Asp

Ala

Ser

Ser

Ser

Vai

Phe

Leu

Asp

Pro

Arg

Gly

Ser

Phe

Glu

Trp

155

160

165

170

Pro

Arg

Gly

Ala

Ile

Thr

Ala

Asp

Ala

Vai

Leu

Ala

Vai

Leu

Lys

Lys

Asp

Ala

Glu

175

180

185

190

Thr

Leu

Arg

Arg

Vai

Cys

Arg

Leu

Tyr

Ala

Pro

Vai

Thr

Trp

Asn

His

Met

Leu

Thr

195

200

205

His

Asn

Ala

Pro

Pro

Ala

Asp

Trp

Ala

Ala

Met

Gly

Phe

Gln

Tyr

Glu

Asp

Arg

Phe

210

215

220

225

Ala

Ala

Phe

Asp

Cys

Phe

Asp

Tyr

Vai

Glu

Asn

Thr

Ala

Ala

Vai

Gln

Pro

Leu

Glu

230

235

240

245

Gly

Leu

Ile

Arg

Arg

Pro

Thr

Pro

Arg

Glu

Lys

Ile

Ala

His

Asn

Thr

His

Lys

Asp

250

255

260

265

Ile

Ala

Leu

Arg

Gly

Ala

Asn

Arg

Asn

Gln

Vai

Tyr

Ser

Ser

Leu

Asn

Ala

Glu

Vai

270

275

280

285

Thr

Gly

Gly

Met

Asn

Gly

Pro

Glu

Leu

Thr

Arg

Asp

Tyr

Gly

Lys

Ser

Asn

Arg

Lys

290

295

300

SEQ ID NO: 2

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 912 bases

ORGANISM: Potato virus M

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: coat protein cDNA

SEQUENCE:2 atgggagattcaacgaagaaagctgaagctgccaaagatgtgggcacttcgcaagaaaag

-13agagaagcgcgaccactgccgactgctgctgactttgaggggagggacacatcggagaac 120 actgatgggcgtgctgcagatgctgatggggagatgtcattggagcggaggcttgacagc 180 ctccgagaattcctgcgagagcggaggggcgctattcgggtgacaaacccggggttagag 240 actggcaggccaaggttgcagctagctgaaaatatgcgccctgatcccacgaatccgtac 300 aacaggccgtccatagaagctctcagccggatcaaaccaatcgcgatctcaaacaatatg 360 gccacatctgaggatatgatgcgcatatatgtgaacctagaggggctaggggtgccgact 420 gagcacgtgcagcaggtggtgattcaggctgtgctattttgcaaggatgcgagcagctcc 480 gtattcctggatccgcgaggctcgtttgagtggccaaggggtgctataaccgctgatgcc 540 gtcttggctgtgctgaagaaggacgcagaaacactacgaagggtgtgtaggctgtatgcc 600 ccggtgacatggaatcatatgctgacgcacaacgcgcctccggccgactgggctgccatg 660 gggtttcagtatgaggatcgcttcgctgctttcgactgctttgattacgttgagaatact 720 gctgcagtccaacccctagagggattgatcaggcgacctaccccaagggaaaagatagct 780 cacaatacgcacaaagacatcgcactgcgtggagcaaatcgcaatcaggtgtacagctct 840 ctcaatgccgaggtcactggtggcatgaatggtccggagctcactagggattatgggaag 900 tcgaatagaaaa

SEQ ID NO: 3

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 25 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonucleotide

OTHER INFORMATION: PVM_CP1F primer

SEQUENCE: 3 cgtttgggtgtggttcctttaggtc 25

SEQ ID NO: 4

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 35 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonucleotide

OTHER INFORMATION: PVM_CPlR primer

SEQUENCE: 4 gcacactcagcaatactaaagcaatttcaaacaca 35

SEQ ĪD NO: 5

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 34 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonucleotide

OTHER INFORMATION: PVM_CP_Nco_F primer

SEQUENCE: 5 caccatgggagattcaacgaagaaagctgaagct 34

SEQ ID NO: 6

ΤΥΡΕ: nucleic acid

-14LENGTH: 34 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonucleotide

OTHER INFORMATION: PVM_CP_Hind_R primer

SEQUENCE: 6 gcaagctttaaagccaccttggttacgtgcttca 34

SEQ ID NO:7

ΤΥΡΕ: protein

LENGTH: 17 amino acids

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: amino acid linker

OTHER INFORMATION: PVM-CP N-terminal

SEQUENCE: 7

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15

SEQ ID NO: 8

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 93 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonucleotide

OTHER INFORMATION: PVM_Ng4sF primer

SEQUENCE: 8 taccatgggaaatgacggatccggaggaggtggaagcggaggaggtggatctggaggagg 60 tggttctatgggagattcaacgaagaaagctga 93

SEQ ID NO: 9

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 22 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonucleotide OTHER INFORMATION: PVM_EcoR primer

SEQUENCE: 9 cgctctcgcaggaattctcgga

SEQ ID NO:10

ΤΥΡΕ: protein

LENGTH: 21 amino acids

-15ORGANISM: hepatitis B virus

TOPOLOGĪ: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: preSl protein

OTHER INFORMATION: N-terminal fragment

SEQUENCE: 10

Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr 15 10 15

Ala Asn 20

SEQ ID NO: 11

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 55 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGĪ: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonucleotide

OTHER INFORMATION: PVM-NpreSlF primer

SEQUENCE: 15 taccatgggaaatgacaatcctctgggattctttcccgaccaccagttggaccca 55

SEQ ID NO: 12

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 58 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonucleotide

OTHER INFORMATION: PVM-NpreSlRprimer

SEQUENCE: 12 tccggatcctggatttgcggtgtttgctctgaaggctgggtccaactggtggtcggga 58

SEQ ID NO: 13

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 348 bases

ORGANISM: Staphylococcus aureus

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: duplicated antibody binding domain Z cDNA

SEQUENCE:13 gtagacaacaaattcaacaaagaacaacaaaacgcgttctatgagatcttacatttacct

-16aacttaaacgaagaacaacgaaacgccttcatccaaagtttaaaagatgacccaagccaa 120 agcgctaaccttttagcagaagctaaaaagctaaatgatgctcaggcgccgaaagtagac 180 aacaaattcaacaaagaacaacaaaacgcgttctatgagatcttacatttacctaactta 240 aacgaagaacaacgaaacgccttcatccaaagtttaaaagatgacccaagccaaagcgct 300 aaccttttagcagaagctaaaaagctaaatgatgctcaggcgccgaaa 348

SEQ ID NO: 14

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 51 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonucleotide

OTHER INFORMATION: PVM-NzzF primer

SEQUENCE: 14 taccatgggaaatgacgtagacaacaaattcaacaaagaacaacaaaacgc 51

SEQ ID NO: 15

ΤΥΡΕ: nucleic acid

LENGTH: 34 bases

ORGANISM: artificial sequence

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: synthetic oligonucleotide

OTHER INFORMATION: PVM-NzzF primer

SEQUENCE: 15 ccggatcctttcggcgcctgagcatcatttagct 34

SEQ ID NO:16

ΤΥΡΕ: protein

LENGTH: 116 amino acids

ORGANISM: Staphylococcus aureus

TOPOLOGY: linear

MOLECULAR ΤΥΡΕ: duplicated antibody binding domain Z OTHER INFORMATION: Sequence from pEZZ18

SEQUENCE: 16

Vai 1

Asp

Asn Lys

Phe

Asn Lys 5

Glu

Gln

Gln

Asn 10

Ala

Phe

Tyr

Glu

Ile 15

Leu

His

Leu

Pro

Asn

Leu

Asn

Glu

Glu

Gln

Arg

Asn

Ala

Phe

Ile

Gln

Ser

Leu

Lys

Asp

Asp

Pro

20

25

30

35

Ser

Gln

Ser

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Glu

Ala

Lys

Lys

Leu

Asn

Asp

Ala

Gln

Ala

Pro

40

45

50

55

Lys

Vai

Asp

Asn

Lys

Phe

Asn

Lys

Glu

Gln

Gln

Asn

Ala

Phe

Tyr

Glu

Ile

Leu

His

60

65

70

75

Leu

Pro

Asn

Leu

Asn

Glu

Glu

Gln

Arg

Asn

Ala

Phe

Ile

Gln

Ser

Leu

Lys

Asp

Asp

80

85

90

Pro

Ser

Gln

Ser

Ala

Asn

Leu

Leu

Ala

Glu

Ala

Lys

Lys

Leu

Asn

Asp

Ala

Gln

Ala

95

100

105

110

Pro

Lys

115

Claims (4)

1. Patenta pretenzijas

   1. Kartupeļu vīrusa PVM virsmas proteīna kodējoša nukleīnskābes molekula saskaņā ar SEQ ID NO:2.
2. 2. Pavedienveida vīrusiem līdzīgo daļiņu iegūšanas paņēmiens, kas ietver sevī (a) kartupeļu vīrusa PVM nukleīnskābes molekulas saskaņā ar SEQ ID NO: 2 sagatavošanu;

   (b) minētās nukleīnskābes ievadīšanu saimniekšūnās;

   (c) saimniekšūnu kultivēšanu tādos apstākļos, lai iegūtu proteīnu, kas spēj veidot vīrusiem līdzīgās daļiņas.
3. 3. Pavedienveida vīrusiem līdzīgo daļiņu iegūšanas paņēmiens saskaņā ar 2. pretenziju, kurā minētās saimniekšūnas ir Escherichia coli, kas tiek kultivētas pie +20°C.
4. 4. Pavedienveida vīrusiem līdzīgas daļiņas, kas satur vismaz vienu proteīnu no sekojošas grupas:

   (a) proteīns, kura sastāvā ietilpst aminoskābes 1-304 no SEQ ID NO:1;

   (b) proteīns, kura aminoskābju sekvence uzrāda vismaz 90% identitāti ar PVM virsmas proteīna aminoskābēm saskaņā ar SEQ ID NO:1;

   (c) proteīns, kura sastāvā ietilpst aminoskābes 1-304 no SEQ ĪD NO: 1 un kuram Ngalā ir pievienota līdz 137 aminoskābju gara polipeptīda sekvence.