JPH08505768A

JPH08505768A - 新規なタンパク質性粒子

Info

Publication number: JPH08505768A
Application number: JP6514974A
Authority: JP
Inventors: アダムス，サリー，エリザベス; バーンズ，ロバート，ナイジェル; リチャードソン，サイモン，マーク，ハロルド
Original assignee: ブリテッシュバイオテックファーマシューティカルズリミテッド
Priority date: 1992-12-29
Filing date: 1993-12-24
Publication date: 1996-06-25
Also published as: AU5711294A; US6060064A; GB9227068D0; ES2104339T3; DE69310768D1; DE69310768T2; EP0677111A1; WO1994014969A1; ATE153071T1; EP0677111B1

Abstract

(57)【要約】酵母レトロトランスポゾンと実質的に相同である自己集合性粒子形成第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とからなり、第２配列が抗原性で、第１のアミノ酸配列のエピトープ内に導入され、そのエピトープは第１のアミノ酸配列単独で形成された粒子で表面露出していることからなる非天然粒子形成タンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】新規なタンパク質性粒子この発明は、生物学的に有用な粒子に関する。特に、この発明は、酵母レトロトランスポゾンTy由来の改質粒子に関する。このようなタンパク質で形成された粒子は、免疫性であり、免疫治療または予防用ワクチンまたは診断剤として使用できる。理想の免疫原は、高分子の粒状コンプレックスに組立てた多抗原決定因子のポリマーである。ワクチン用に組換えＤＮＡ技術で作った大抵の抗原の本質的な欠点は、これらが通常簡単なモノマータンパク質として作られることである。これは、免疫系の成分を容易に架橋をしないので免疫抗原の理想の形態ではない。このような架橋は、体液と細胞の免疫を最大に刺激することを必要とする。このため、抗原を免疫化するため多価で、粒状のキャリヤー系を開発することが有利であろう。 WO-A-8803562とWO-A-8803563には、医薬、診断もしくは精製応用に、レトロトランスポゾンまたはRNAレトロウイルスから誘導されたある種の融合タンパク質の使用を開示している。このような粒子は、酵母レトロトランスポゾンTy由来のとき、ウイルス様粒子（VLP）と称される。このＰＣＴ公開出願では、多価粒子は、その多価の性質が使用した特殊な抗原に対し多くの抗体が作りうることから免疫化目的に有用であるとしている。粒子は、粒子形成配列、ある具体例では、少なくとも抗原配列を有する融合タンパク質で形成される。実施例では、抗原配列は、粒子形成配列のＣ末端に位置している。上記のアプローチは、有望である一方、抗原の粒子形成タンパク質のＣ末端での挿入が、全ての場合に免疫系を提供するのに最適ではないという問題がある。組換えVLPで免疫化した動物は、添加抗原に対するよりTy成分により高い力価の応答をすることがある。そのため、添加抗原への抗体応答が増大される抗原提供粒子を構築することがより有利であろう。このような粒子は、Ｔ細胞応答、細胞毒Ｔ−リンパ球（CTL）応答または天然キラー（NK）細胞応答のような細胞仲介免疫応答を刺激する能力も強化されるかもしれない。さらに、このような粒子での免疫化に続いて、粒子形成分の抗体応答が減少または好ましくは防止されれば有利であろう。粒子での免疫化に続いて、粒子形成分子の抗体応答か減少または好ましくは防止されれば有利であろう。抗原配列の免疫系への提示を改良する１つの方法は、興味のある抗原配列を粒子形成配列に挿入することである。しかし、抗原部位を粒子形成タンパク質内に正しく挿入することが、粒子形成で重要であるとみられる。挿入が、モノマーの二次と三次構造決定因子、または粒子形成に必要なモノマー間の四次相互作用を破壊するかも知れない。適切な表面露出挿入配列を演釈するための１つの試みは、Ｘ線結晶グラフィーで解析したウイルスの三次元構造の解釈を用いることである。ポリオウイルスの構造についてこのような精密な分析が粒状のキメラタンパク質を創製することを可能とし、これによって、異型の抗原配列がこのウイルスの表面露出エピトープに存在のアミノ酸に置換される（Dedieu et at.，J．Virol.（1992）66，3161〜3167；Burke et al．Natur e（1988）332，81〜82；Evans et al.，Nature（1989）339，385〜388）、しかし、このポリオウイルス構築は生ウイルスを作る必要があることから制限される。いくつかの非常に短い配列でも許容できない。ポリオウイルスについて述べたような詳細な分析は、結晶化されていないタンパク質にはできない。粒子が、十分に特性化された三次β−バレル構造を有する場合に、異型抗原配列を想定表面露出領域への内部挿入が、配列線列に基づく予測モデルを用いてなされている。たとえば、肝炎Ｂコア抗原と類似の二次構造を有するウイルス由来の抗原から作られたハイブリッド粒子が、粒子形成を保持し、挿入抗原の免疫原性を増強することが見出されている（Schodel et al.，J ．Virol.（1992）66,106〜114；Brown et al.，Vaccine 1991 9,595〜601）。異型ペプチドの肝炎Ｂ表面抗原の想定表面露出免疫決定領域への置換は、かなりの量の脂質が会合することが分かっているが、免疫原性の強化された粒状のキメラタンパク質を生ずる（von Brunn et al.，Vaccine 1991，9,477〜601）。しかし、レトロトランスポゾンは構造があまり分かっておらず、β−バレルを有すると現在考えられていない（Burns etal.，J．Mol．Biol.（1990）261，207 〜211）。従って、抗原のこれら粒子タンパク質への挿入の適切な部位は知られていないか予測できない。（レトロトランスポゾンに非常に類似の構造である）レトロウイルスで、抗原をgag配列の中央への挿入が、この配列の粒子形成性を破壊すること報告している（Luo et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89，10527〜10531（1 992））。本発明者らは、酵母レトロトランスポゾンTy p1（yeast retrotramsposon Ty p1）内の表面露出免疫優性エピトープを同定した。免疫原部位は必ずしも表面露出を必要としない；高力価抗体が、コアタンパクか粒子の表面に露出していなくても（例えばインフルエンザ核タンパク質）ウイルス感染中コアタンパクに対し、しばしば惹起される。また、発明者らは、異型抗原配列をこのようなエピトープへの挿入が粒子形成を防止しないことも見出している。レトロトランスポゾンで、粒子形成を破壊せずに許容できる挿入サイズはかなり大きいと見られる。すなわち、一般に置換が好ましいとされる他の系で報告されているものより、さらに大きい。得られるハイプリド粒子は、粒子形成タンパク質の免疫原性が減少し、挿入配列への免疫応答が増強される。この発明の第１の観点によれば、酵母レトロトランスポゾンTy p1タンパク質と実質的に相同である第１の自己集合性粒子形成アミノ酸配列と第２のアミノ酸配列からなり、その第２のアミノ酸配列は、抗原性で、第１のアミノ酸配列のエピトープ内に導入され、そのエピトープか第１のアミノ酸配列単独で形成された粒子に表面露出されている非天然粒子形成タンパク質を提供する。このような構築は、抗原配列をこれらの表面エピトープに挿入して真実ハイフリッドを形成するか、このような部位に見出される天然アミノ酸を興味あるアミノ酸配列で置換するか、削除、置換と挿入の組合せによってなすことができる。表面表現エピトープは、一般に第１の粒子形成のタンパク質のＮ−末端ハーフ（half）に見出され、その配列はDobson et al（1984,EMBO J．3,1115）に開示させている。特に、３つのコンセンサス表面露出領域は、レトロトランスポゾン Tyの粒子形成タンパク質p1のＮ−末端ハーフ、図１で示されかつ表１に要約されているようにアミノ酸21-42（位置Ａ）、アミノ酸55〜74（位置Ｂ）とアミノ酸9 3〜142（位置Ｃ）にあることが同定された。第２アミノ酸配列が、第１アミノ酸配列のこれらの領域の少なくとも１つの中にあるタンパク質が好ましい。これらの領域内で、第２配列用に適当な挿入部位を選択することができる。これらの部位は、Tyタンパク質のアミノ酸30〜31、67〜68、113〜114と132〜133間が含まれ、部位Ａ、Ｂ、Ｃ₁、とＣ₂としてそれぞれ表わすが、他の部位も同様に好適である。 Ty由来の粒子は、ワクチンとして用いるのに、ポリオまたは肝炎由来のものより有利である。肝炎またはポリオワクチンへの予備ばく露が、キメラ（chimaera ）に対する続いての効果的な応答を傷つけることができる。従ってTy由来の粒子の使用は、予め存在する免疫応答のある患者の見込みを少なくするので好ましい。Tyは病原ではないので、Tyでのワクチン化は病原性抗原への接触とはならないであろう。表現“実質的に相同（substantially homologous）”とは、アミノ酸配列の天然タンパク質との関係で用いたとき、アミノ酸配列が、天然タンパク質と同一であるか、天然タンパク質の効果的しかし切頭または改質形であるか、天然タンパク質または改質形の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95または99％（後者優先順位）を占めることができるものを意味する。ここで“効果的”とは天然タンパク質の配列形成能が保持（または少なくとも実質的に損失しない）されることを意味する。または、加えて、アミノ酸配列をエンコードする核酸配列は、たとえばストリンジェント条件下に、天然タンパク質またはその切頭形をエンコードする核酸配列にハイブリッド化でき、または遺伝子コードの同義性を別にしてそうなるであろう。ストリンジェンドハイブリッド化条件は知られており、たとえば、約35〜65℃で約0.9モルの塩濃度である。抗原配列は、病因剤または腫瘍から由来または関連した配列に対応できる。病因剤は、ウィルス、バクテリア、菌類または寄生虫などの微生物がある。ウィルスとしては、HIV-１、HIV-２、HTLV-Ｉ、HTLV-II、HTLV-III、SIV、BIV、LAV、E LAV、CIAV、マウス白血病ウィルス、モロネイマウス白血病ウィルス、ネコ白血病ウィルスのようなレトロウィルス：インフルエンザＡまたはＢのようなオルソミクソウィルス；パラインフルエンザウィルス、おたふくかぜ、はしか、RSVおよびセンダイウィルスのようなパラミクソウィルス；HPVのようなパポバウィルス；ヒトもしくはマウスのLCMVのようなアレナウィルス；肝炎Ｂウィルスのようなヘパドナウィルス；HSV、VZV、CMVあるいはEBVのようなヘルペスウィルスがある。腫瘍関連もしくは由来抗原としては、たとえば、メラノーマ関連抗原のようなタンパク質性ヒト腫瘍抗原、胸部または結腸カルチノーマからのような上皮腫瘍関連抗原がある。抗原配列は、また、ナイセリア、カムピロバクター、ボルデテラ、リステリア、マイコバクテリア、リーシュマニア属のよなバクテリア、プラスモジウム属、特にプラスモジウムファルシパルムからの寄生体、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス、ヒストプラスマまたはブラストマイセス属のような菌類から誘導できる。抗原配列は、６〜６０アミノ酸、たとえば６〜５０、６〜４０または６〜３０の長さで変化するのが代表的であるが、厳密に統一的に最大と最小の略値を示すことはできない。配列は所望の免疫応答を与えるが、分子の残りに受容できないゆがみを与えない十分な長さであるべきである。好ましい抗原配列は、レトロウィルス、パラミクソウィルス、またはヘパドナウィルス、またヒト腫瘍細胞からのエピトープに対応する抗原配列である。次のものからの公知エピトープが例として含まれる。１）HIV（特にHIV-1）gp120、２）HIV（特にHIV-1）p24 ３）インフルエンザウィルス核蛋白とヘマグチニン、４）LCMV核蛋白質５）HPVLI,L2,E4,E6とE7タンパク質、６）p97メラノーマ関連抗原、７）GA733-2上皮腫瘍関連抗原、８）MUC-1上皮腫瘍関連抗原、９）マイコバクテリウムp6、 10）マラリアCSPまたはRESA抗原、 11）VZV gpI,gpIIまたはgpIII 特に好ましい抗原配列は、レンチウィルスの第３可変ドメインの抗原部分に実質的に相同の配列からなる。この領域は、V3ループもしくはGPGRループとして知られ、HIV-１のエンベロープグリコ蛋白gp120のアミノ酸300と330の間で、他のレンチウィルスと類似の位置に見出される。V3ループは、ジルスルフィド結合で結合した２つのフランキングシステイン残渣で定義され、少なくともHIV-１に対しウィルスの主要な中性化エピトープである（Putney et al,1986,Science 234, 1392;Rusche et al,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.,85,3198;Palker et al,1988Natl .Acad.Sci,85,1932;Goudsmit et al,1988,AIDS 2,157）。選択の抗原部分はV3ループの全体または半分を構成できる。しかし、V3ループの保存配列は（HIV-1のような）ウィルスの１以上の分離株に対する免疫性を与えるので有用であろう。多くのHIV-１の分離株は、V3ループの配列が分離株から分離株に変化していることが知られている。最も普通の分離株は、HXBII、RFとMNで、MAL、ELIとBHIO も重要であり、MN分離株が臨床上最も関連している。実験室分離株IIIBは株BH1O とHXBI Iの混合物である。この発明は特定の分離株のV3ループ由来の配列に限定されない。そのいくつかを以下に示す。この発明は、天然V3ループ配列に限定されない。この発明に使用できる変異V3 ループ配列の例には、次のものを含む。多くの異なったHIV-1の分離株からのV3ループの配列を比較すると分離株の間に大きな変動がある。V3ループに対して生じた抗体は、そのため通常タイプ特異性である。しかし、今日までの分離株の約60％はコンセンサス配列GPGRAFを有し、80％以上がループ先端にGPGRを有する。最近の研究によれば、GPGRAFコンセンサス配列を含有するペプチドでの免疫化または異なる分離株からの組換えgp120 での交差免疫化で分離株間で交差反応する抗体を誘因できることが分かっている。GPGRAFコンセンサス配列はそれ自体この発明に使用できる。この発明の他の具体例には、各種分離株の必ずしも保有されないV3の短い配列を使用することである。V3由来またはV3関連配列の何れが使用されても、得られる融合タンパク質またはそれを集合した少なくとも粒子は、それらが１以上の共通の抗体と交差反応する意味で、天然V3ループ配列に抗原的に類似するであろう。１以上のV3由来の配列が、この発明の融合タンパク質に存在できる。この具体例は、単一の融合タンパク質を１以上のHIV分離株に対する防御に有用にさせる。そのため異なるHIV分離株からのV3由来配列が同じ分子に存在できる。より一般的には、この発明は、抗原性第２アミノ酸配列の性質とこれらが（１以上である）第１アミノ酸配列内に存在できる方法にかなりの柔軟性を与えることが理解されよう。たとえば、２以上の同じ第２アミノ酸配列が同じ挿入部位に縦に挿入でき、２以上の同じ第２アミノ酸配列が異なる挿入部位に挿入でき、２以上の異なる第２アミノ酸配列が異なる挿入部位（または単一の挿入部位でも）に挿入でき、２以上の異なるアミノ酸配列が同じ抗原の異なるエピトープから由来できることが理解されよう。この発明による融合タンパク質は突然変異的に粒子にアセンブルするので、この発明の手段で多価粒子を作ることができる。この発明の第２観点によれば、上記のような複数の非天然タンパク質からなる粒子を提供する。この発明による粒子は、異型または好ましくは相同集団のタンパク質を含む。各タンパク質は上記の配置の何れかを有することができる。この発明の第３の観点によれば、上記したような融合タンパク質をコードする核酸（特にDNA）を提供する。核酸はタプライシングまたは抗終結なしで表現されることができる場合が一般にある。一般にフレームシフティングはないが、フレームシフティングは必ずしも常に除外されるものではない。この発明によれば、さらに、上記の核酸を含有するベクターを提供する。この発明による表現ベクターは通常プロモーターを含有するであろう。プロモーターの性質は、意図したホスト表現細胞によるであろう。酵母について、PGK が好ましいプロモーターであるが、必要または所望により他の適切なプロモーターも使用できる。例としては、GAPD、GALI-10、PHO5、ADH1、CYCl、Tyデルタ配列、PYKおよび１以上のプロモーターからの成分で作られたハイブリッドプロモーター（例：リストしたもの）。昆虫細胞に対し、好ましいプロモーターは、オートグラフィカカルホルニカ（Autographica californica）核ポリヘトロシスウィルス（AcNPV）からのポリヘドリンとp10プロモーターである。当業者は、これらまたは他の細胞での表現に適用される他の適当なプロモーターを決定できるであろう。プロモーターを含有しないベクターは、表現ベクターよりむしろクローニングベクターとして有用であろう。この発明は、また、宿主細胞たとえば、遺伝子発現に使用できる。Ｅ．コリーのような細菌細胞、サッカロマイセスセレビシエまたはピシアパストリスのような酵母細胞または動物細胞を含む。この発明による粒子の増強された免疫原性が特異特性を有する抗体の産生を促進する。従って、この発明は、この発明の粒子抗原で生じたか指向した抗体を提供する。このような抗原はポリクロナールまたはモノクロナールであってもよい。ヒトモノクロナール抗体の産生には、免疫動物からの脾細胞を腫瘍細胞を融合させてハイブリドーマ細胞が作られる。その後で、適当に分泌するハイブリドローマ細胞が選択できる。この発明による粒子抗原は、ワクチンたとえば免疫治療用ワクチンの製造に使用でき、これは発明のさらなる観点である。ワクチンは、粒子抗原と滅菌生理食塩水または滅菌PBSのような生理学的に受容な非毒性キャリヤーとからなる。滅菌は、一般に非経口投与用ワクチンに必須であろう。１以上の適当なアジュバントを存在させてもよいが常に必要ではない。適切なアジュバンドの例は、プロトタイプムラミルジペプチドのようなムラミルジペプチド化合物、水酸化アルミニウムとサポニンが含まれる。この発明によるワクチンは、１以上の抗原が存在してもよい。上記のように、異なる粒子抗原のカクテルが使用でき、１以上のエピトープを有する粒子抗原の同種集団が使用できる。実際には、ワクチンが異なる粒子抗原の混合物を含有するのが簡単であろう。この発明の融合タンパク質と粒子抗原は、診断剤として有用である。診断目的の粒子抗原は特に有利である。なぜなら、これらは、遠心分離または濾過で物理的に分離でき、ガラス又はプラスチックスライド、浸液スティック、マクロもしくはミクロビーズ、テストチューブ、マイクロ滴定板のウエルなどのような固体の支持体に直接分散できるからである。この発明の粒子抗原は、固体支持体として吸着ディスク（米国特許第4632901号）、ストリップまたはクロマトカラムのような繊維質または水分吸収性材料にも分散できる。粒子と融合タンパク質は容易に固形支持体に付着する。粒子は精製後に融合タンパク質に粉砕でき、融合タンパク質は上で示したように表面に分散できる。これらの試薬は、各種の診断テストに有用である。たとえば、粒子抗原に対する抗体と蛍光または放射線ラベル化抗体を有すると思われるテストサンプルは、固体支持体上の粒子抗原または融合タンパク質と競合反応し、固形支持体の粒子抗原と結合するラベル化抗体の量が測られる。また、この発明の粒子抗原は、抗体との凝集反応に有用である。診断技術の当業者は、この発明の粒子抗原と融合タンパク質の診断目的への巾広い応用を認識するであろう。この発明の各観点の好ましい特徴は第１の観点に関して必要な変更を加えたものである。次の実施例は、この発明を例証するものであるが、その範囲を制限することは意図しない。実施例は添付の図で言及する。図１は、マウス血清のペプスカン（Pepscan）分析を示す。各プロットは、OD₄ ₉₂ （横軸）体p1についてＮ−末端での１から切形Ｃ末端での187のペプチド数（縦軸）を示し、各ペプチドのテスト血清中の抗体に対する反応性を示す。各テスト血清は、下記アジュバンド中OGS200 VLP（下記）で免疫化した5匹の近交マウスの血清溜りからのものである。図１ａ．RIBI、１ｂ：SAF-1、１ｃ：ケミバクス（Chemivax）、１ｄ：正常マウス血清、１ｅ：ミョウバン，１ｆ：アジュバンドなし。図２は３匹の別々のラットでエピトープ表面アクセス性を測定するのに用いた予備吸収実験のデータを示す。上のプロットは、ミョウバン中のOGS 200 VLPで免疫化したラットの血清中のペプスカン活性を示す。下のプロットは、４℃で一夜MA5260 VLPで予備培養し、ペプスカン分析後の同じ血清を示す。ペプチドとの反応性の損失は、原VLPの表面でのエピトープによって抗体が壊死巣分離（seque stration）されることによる。反応性の損失はある種のエピトープに特異的である。図３は、p1のエピトープの表面アクセス性の要約である。この要約に用いた血清は、フロイント中のMA5260 VLPで免疫化した２匹のウサギとミョウバン中OGS2 00VLPで免疫化した３匹のラットからである。不連続バーは、これらの血清中の抗体によりペプスカン分析で認識されたp1蛋白の領域を示す。図４は、ペプスカン分析での反応性ペプチドで定義される、p1の領域Ａ、ＢとＣ内での挿入部位Ａ、Ｂ、Ｃ₁とＣ₂の所在を示す。各配列の終りの数は、p1アミノ酸座標である。図５はプラスミドpOGS440を示す。実施例１ p1中エピトープの同定 Ty用に作られたペプスカン（PEPSCAN^TM）キツト（CRB、ケンブリッジ）は、Ty 1の野性型p1タンパク質の全長に相当する８つの残基をオーバラップする10マーペプチドからなる。187ペプチドがトランスケートp1タンパク質をカーバーしている。マイクロ滴定板の各ウエルにペプチドをコートし、抗Tyテスト血清を重ねる。エピトープペプチドに結合する抗体を２次抗体コンジュゲートと比色反応で検出した。５つの種（ヒト、マカークザル、兎、ラットとマウス）の血清を各種、すなわちVLP（OGS200:p1-HIV 24（WO-A-8803562に開示）、MA5620:p1単独（WO-A-88035 63に開示）、OGS561:p1-IIIB:MN:PFV3ループとOGS530で次のごとく免疫化して得た。OGS561は、出願中のPCT/GB92/01545に開示されているpOGS40の誘導体である。TyAの３末端に３つの連続V3ループがHXBII、MN、RFの順にある。これらは次のアミノ酸配列からなる。これらは２つの多重複アミノ酸グリシンとセリンをエンコードするBamH1部位で結合している。相当するヌクレオチド配列は当業者にとって容易に決定できるであろう。 pOGS 530（と下記のpOGS531）は、特許出願中のPCT/GB92/01545に開示のpOGS 40の誘導体である。これらは、MN（実施例10）またはHXBII V3ループをそれぞれエンコードするBam H1部位にオリゴヌクレオチド挿入片を有する。免疫化は異なるアジュバンド中（ミョウバン、RIBI DETOX^TM、CHEMIVAX^TM、SAF-１または完全フロインド）が行われた。血清はペプシカンで分析した。図１は、異なるアジュバンド中OGS200 VLPで免疫化したプールした群の５匹のマウスから取った代表的な粗データを示す。テストした全ての血清で認識されたペプチドの要約は表１に示す。エピトープの数はある程度、アジュバンドに従属する。図１のマウスのデータの要約を表２で示し、その従属性をアジュバンドなし、ミョウバン、ケミバクス、RIBIと SAF-1を比較して例証する。４つのアジュバンドの何れを使用しても、アジュバンドなしより抗体により多くのエピトープを誘引する。SAF-1は、RIBI（５）、ケミバクス（４）、ミョウバン（４）より抗体に多くのエピトープ（８）を惹起させる。同様の効果がウサギにみられた。ミョウバン中のOGS200 VLPで免疫化したウサギ血清は全部で８p1エピトープを認識した。SAF-1では12エピトープを認識した（表１）、フロイントは最も強いとみられる。19のp1エピトープはフロイント中OGS5620 VLPで免疫化したウサギ血清で認識された（表１）。工学用のエピトープの選択は広範である。しかし３つの“コンセンサス”エピトープがデータから分る。これらはペプチト11〜17、28〜33と、ペプチド47〜68 でカバーされた大きな領域内に含まれる。これらはp1タンパク質のアミノ酸残基 21〜42、55〜74と93〜142に対応し、それぞれＡ、Ｂ、Ｃと名付けた。これらは、免疫化VLPとアジュバンド化様式に関係なく、血清の圧倒的大部分で認識される。表１は、ペプスカン^TM分析の動物血清のp1ペプチドに対する反応性を示す。表中の各セルは、応答動物のバックグランドに対する数を示し、ブランクは応答なしである。テストした16のヒト臨床血清中、１つのみがペプシカン分析で信頼できる反応性を与えるのに十分に高い抗Ty力価を有した。残る15の非応答動物を除去して、全カラム中最大の可能なスコアは33である。３つの“コンセンサス”エピトープＡ、ＢとＣはペプチド11〜17、28〜33と47〜68にそれぞれ対応する。表２は、各種のアジュバンド中OGS200 VLPで免疫化したマウスの血清反応性を示す。全ての免疫化は筋肉内による。陰影の列はペプチド11〜17、28〜33と47〜 68での３つの“コンセンサス”エピトープＡ、Ｂ、Ｃに相当する。表２実施例２ p1の表面エピトープの同定ペプスカン^TM分析は、p1の十分に明確な線状エピトープの何れも同定するであろう。この分析は短い線状ペプチドの認識に基づいていることから、配座もしくは非隣接エピトープ決定因子は検出できない。加えて、ペプスカン^TMデータは、原VLPの表面（すなわち抗体にアクセスできる）または埋没エピトープを区別しない。血清予備吸収研究は、p1のどの部位、特に上で同定した３つのエピトープのどの部位が表面アクセス性であるかを決めるのに用いた。ミョウバン中OGS200 VLP_s で免疫化した３匹のラットとフロイント中のMA5620 VLPで免疫化した２匹のウサギを、野生の精製MA5620 VLPと培養した。次いで、これらの血清をペプスカン^TM で分析した。表面アクセス性エピトープに対する抗体は野生VLPの表面に結合し、そのためペプスカン^TMペプチドへの結合がない。エピトープが表面アクセス性の場合、そのエピトープとの予め観察した反応性の損失が表面特性であることを示す。予備吸収実験では、粒子ポスト吸収をウエスタンブロットで分析して野生VLPの血清プロテアーゼによる蛋白分解をコントロールした。図２は予備吸収前後の３匹のラット血清からのペプスカン^TMデータを示す。これらのデータは、p1のＮ末端ハーフのエピトープが殆ど表面アクセス性であり、一方タンパク質のＣ末端ハーフのエピトープは主に非アクセス性である。上で同定した３つの主要の線状エピトープＡ、ＢとＣは全て表面アクセス性を示した。予備吸収実験データの要約図を図３に示すが、これはp1の線状エピトープのアクセス性を示す。ギャップは、テスト血清の何れかで抗体で認識されないタンパク質の領域による。この分析は、情報が入手しうる場合の表面アクセス性は、本質的にp1のＮ末端ハーフに限定されることを示す。実施例３工学用p1エピトープの選択同定した３つのコンセンサスエピトープは、抗原挿入用のターゲットとしてのいくつかの選択基準を満たしている。すなわち、これらは免疫原として用いたVL Pタイプとアジュバンド化様式に関係なく全テスト種からの血清で認識され、かつ全て表面露出である。 p1タンパク質内の４つの挿入点、ＡとＢで各１つ、Ｃで２つを選択した。これらはアミノ酸30-31、67-68、113-114と132-133の間にあり、それぞれＡ、Ｂ、Ｃ₁ とＣ₂とする（図４参照）。これらの４つの部位を評価に選択したが、定義した領域Ａ、ＢとＣ内の他の位置も等しく挿入部位として適当であろう。実施例４ TYA（d）遺伝子の操作 TyA（d）遺伝子を挿入点Ａ、Ｂ、Ｃ₁またはＣ₂でのユニークなNhe I制限部位を導入するのに操作し、外来DNA配列を挿入した。このようにして、選択した４つの挿入点で各々１つの４つのバージョンを構築した。この修正を含むベクターは次のようにして作った。AyA（ｄ）遺伝子のコード化配列を含むBal II/Bam H1 制限フラグメントをPOGS226から摘出し、Bgl II/Bam H1で消化したベクターpSP4 6に挿入し、pOGS460（pSP46は、ポリリンカーのHind IIIがBgl II部位に変換したpSP64の誘導体である）を得た。次いで、POGS 460をNheI（pSP46内にある制限部位）とPst1（TyA遺伝子内にある制限部位）で消化し、117bpフラグメントを放出させる。次いで、これをXbaI とPstIで消化したM13mp18に挿入した。次いで、部位指向突然変異誘発を用いて、NheI制御部位を挿入点Ａ、Ｂ、Ｃ₁またはＣ₂（すなわち、それぞれTyAヌクレオチド90-91、201-202、339-340と396-397の間）で導入した。 NheI部位は、MN分離株V3ループの３つのサイズ変形のそれぞれをエンコードする２重鎖（ds）オリゴヌクレオチドの挿入に用いた。突然変異誘発したTyA（d）配列をBgl II/Spl IフラグメントとしてM13から除去し、Bgl II/Spl I消化pOGS 440のベクターバックボーンに結さくした。TyA（d）遺伝子のSpl I制御部位は、PstI部位に対し５’である。これらの操作で次のプラスミド構築をした。 pOGS810は、位置ＡにNhe I部位を有するpOGS440等価物。 pOGS811は、位置ＢにNhe I部位を有するpOGS440等価物。 pOGS812は、位置Ｃ₁にNhe I部位を有するpOGS440等価物。 pOGS813は、位置Ｃ₂にNhe I部位を有するpOGS 440等価物。 pOGS440は、次のようにして構築した。pKV560はChamberset al（1989,Mol.Cel l.B1o.9,5516〜5524）に記載されている。pKV572はインターフエロン配列がBgl IIクローニング部位を残して除去されることを除いてpKV560と同じである。pKV5 72は、上記活性化配列に対する５’Bam H1クローニング部位を有する最低のアッセイプロモーターを含有し、pJC87のスタート点である。 GAL-10プロモーター配列を含有するpUG4ISから1kb EcoR₁-Xho1フラグメントを精製した。さらにこれをDde1で消化し510塩基体フラグメントを単離した。このフラグメントの５’突出末端を、DNAポリメラーゼのクレナウフラグメントで埋め、Bg1 IIオリゴヌクレオチドリンカーを添加した。次いで、このフラグメントをSau 3Aで消化し、360塩基対フラグメントを精製した。このフラグメントをBam HI消化、ホスフェート処理pKV572に結さくした。結さくした製品をHW87に形質転換し、得られるプラスミドをDNA配列化による挿入の定位をスクリーニングした。GAL 1オリエンテーション中360塩基対GAL 1-10 Dde 1-Sau 3Aフラグメントを有するクローンを選択し、pJC78と称する。 pOGS 440はを図５に示す。このものは、pOGS226（WO-A-8803563に記載のpMA56 20の誘導体で、p1のＮ末端に隣近して挿入した付加的なBgl II部位を有する）の Bgl II/Sal IフラグメントをpJC78でBgl II/Sa IIに挿入して構築した。実施例５ p1の挿入部位突然変異型による粒子形成 Nhe I制限部位を実施例４に記載のTyA（d）遺伝子への挿入は、２つの付加アミノ酸（アラニンとセリン）をp1タンパク質へ導入する結果となった。この変化が選択した挿入部位（Ａ、Ｂ、Ｃ₁またはＣ₂）の何れかに粒子形成を干渉しないことを確かめる必要があった。プラスミドpOGS 810、 pOGS 811、pOGS 812とpOGS 813をS.セレビシエ種MC2に形質転換した。しかし、入手しうる何れの種も使用できる。形質転換細胞を培養し、収得し、次のようにシュクロース傾斜での分画によってVLPを単離した。酵母細胞を、30℃で濃度８×10⁶セル/mlに選択的に発育させた。次いで、細胞を低速遠心分離で集め、氷冷水で一回洗浄し、TEN緩衝液（10mMトリス、pH7.4、２mMEDTA、140mMNaCl）にセルの１リットル当り１mlで再懸濁した。細胞を＞70 ％が破壊されるまで、４℃でガラスビーズ（40メッシュ、BDH）でうずを作り破砕した。このビーズを、低速遠心分離（2000g）に付し、次いで上澄液を集め、くずを13000gで20分の遠心分離で除去した。澄明化した上澄液をSW28チューブに入れ、TEN中60w/v％シュクロース液３mlを入れた。次いで、チューブを28Krpmで90分間遠心分離して、VLPをシュクロース界面でバンドさせた。 VLPを回収、TENで透析してシュクロースを除去し、次いで、予備形成した直線（10-60％）シュクロース傾斜にバンドさせ（25Krpmで６時間遠心分離したSW41 チューブ）、さらに精製した。VLPを回収、透析、濃縮した。全て４つの構築は、実験用のポジ対照、pOGS440に比較しうるレベルで粒子p1 タンパク質を表現した。これは挿入点での２つの残基の付加が粒子形成に逆影響しないことを示すものである。実施例６抗原（GPGRAF）₃の挿入 DNAオリコヌクレオチドの相補対を、MN分離体からのgp120V3ループの中央の６つの残基（GPGRAF）をエンコードして合成した。これらはアニールした２重鎖オリゴヌクレオチドの末端は、pOGS810-813内のユニークなNhe I部位への結さく用のNhe Iカット末端と互換性である。最初に、形質転換体は、証明用のDNAシーケンス化前にオリゴヌクレオチド挿入で完全に破壊されているNhe I部位の非存在をスクリーニングされた。３つの縦列繰り返しコピーをpOGS811のTYA（d）の遺伝子中の位置Ｂに挿入してpOGS814を作る。このコード化コンシーケンスは次の通りはっきりした残基は、野生型p1残基で側面を接した挿入アミノ酸である。ASと SSモチーフは、オリゴヌクレオチドのNhe I突出末端でエンコードされる。（GPGRAF）₃挿入の構築か、位置Ｂで許容できる挿入サイズについての情報を提供した。この26残渣挿入が粒子形成をさせるのて、20と40残基V3ループサイズ変異体の挿入がその位置で許容されるべきである。原Tyエピトープは、p1モノマーの通常倍で干渉することなく拡大できる表面ループの形である意見を支持している。実施例７抗原：GPGRAFの挿入 Nhe I適合末端を有するGPGRAFをエンコードするオリゴヌクレオチドを上記のごとく合成した。一旦アニールしたものを４つの挿入部位の各々に結さくした。オリゴヌクレオチドを挿入してから、Nhe I部位を破壊した。従って得られる形質転換体はNhe I部位の損失をスクリーニングした。挿入の位置は、DNA配列で証明した。得られる構築物を次のように番号を付す。 pOGS 815:位置ＡにGPGRAFを有するpOGS 810 pOGS 816:位置ＢにGPGRAFを有するpOGS 811 pOGS 817:位置Ｃ₁にGPGRAFを有するpOGS 812 pOGS 818:位置Ｃ₂にGPGRAFを有するpOGS 813 全挿入配列は次の通りである ASGPGRAFSS （SEQ ID6）。挿入した抗原のＮとＣターミナルにフランキングするASとSS残基はそれぞれ、挿入オリゴヌクレオチドの各末端での変異Nhe I部位をエンコードしている。各プラスミドで、S.セレビシエ種MC２酵母細胞を形質転換した。実施例８抗原：ハーフV3ループの挿入次の配列をエンコードする DNAオリゴヌクレオチドの相補対を合成した。フランキングAS残基は、Nhe I適合オリゴヌクレオチド末端をエンコードしたものである。アニールしたオリゴヌクレオチドはEcoRI制限部位を有した。ベクターに結さくしてから５Nhe l部位を破壊し、一方３’Nhe I部位を再生した。残存する３’Nhe I部位は、所望によりさらに抗原を加えることができる。形質転換体をEcoRI制限消化でスクリーニングし、挿入の位置をDNAシーケンス化で決定した。得られる構築物は次のように番号を付す。 pOGS 819:位置ＡにハーフV3ループを有するpOGS 810 pOGS 820:位置ＢにハーフV3ループを有するpOGS 811 pOGS 821:位置Ｃ₁にハーフV3ループを有するpOGS 812 pOGS 822:位置Ｃ₂にハーフV3ループを有するpOGS 813 実施例９抗原：全V3ループの挿入次のごとき全V3ループを共にエンコードする次のDNAオリゴヌクレオチドの相補対の２つの対を合成した。フランキングAS残基はNhe I適合性末端をエンコードし、Ｃ^sはシステイン残基を示すが、これはジルスフィド結合でその塩基でループを閉鎖している。全挿入手は、２つの部分に構築され、これらは適当なベクターとの結さく前に結さくした。ハーフループオリゴヌクレオチドに関し、５’Nhe I部位は挿入で消失し、３’Nhe I部位は再創生される。挿入配列は、また、スクリーニングを助けるためEcoRI制限部位を保持する。得られる形質転換体は、制限酵素消化によりDNAフラグメントの存在と配置を選別した。３つの結さくジャンクション（挿入手の各末端と中央）は、DNA配列化で証明された。構築物は次のように番号を付した。 pOGS 823：位置Ａに全V3ループを有するpOGS 810 pOGS 824：位置Ｂに全V3ループを有するpOGS 811 pOGS 825：位置Ｃ₁に全V3ループを有するp0GS 812 pOGS 826：位置Ｃ₂に全V3ループを有するpOGS 813実施例10 位置ＢでのpOGS 814 VLP:（GPGRAF）₃の特徴付け精製pOGS 814DNAをS.セレビシエ種MC2に形質転換した。しかし他の入手しうる種も使用できる。細胞を採取し、手ビーズ破壊し（hand bead-beaten）、細胞オモジネートを9Kで20分遠心分離して澄明化した。次いで、この材料をシュクロース傾斜（6O％クッションを有し15〜45％）に付し、40Krpmで、1.5時間遠心分離した。グラジェントをSDS-PAGEで分画し検査した。OGS 814蛋白は、モノマータンパク質ソリュートとからよく分離し、グラジェントから下った中間の十分区割されたゾーンでVLPの特性を有し沈殿した。実施例11 OGS 814 VLPの免疫反応性実施例10で記載したグラジェントでのフラクションを３つの抗体でのウエスタンブロッティングで分析した。３つの抗体は、抗-Tyポリクロナール、V3ループチップ配列-RIQRGPGRAFVTIGKと反応するDuPont gp120 MAb 9305と、V3ループ-NN NTRKSIRIQR-の左側と反応するDuPont gp120モノクロナール9284。予期したように、OGS814 VLPはTyポリクロナールおよび9305MAbと反応したが、9284MAbと反応しなかった。コントロールはMA5620 VLPとOGS 531VLP（Ｃ末端で分離体HXB2からの全V3ループ）、全てのコントロールは予測した反応性を有した。ウエスタンブロット値は、表３に要約する。実施例12 OGS814 VLP中抗原の表面露出位置Ｂのp1エピトープは、その同族抗体の結合能により天然全VLPで表面露出（surface-exposed）されることが分かった。これは遠心分離中VLPとの共沈殿で溶液から除去できる。同様のアプローチを、位置ＢでのOGS814のGPGRAF成分も表面露出されるのを示すのに用いた。この場合に、同族抗体は、OGS814 VLPを認識するのか分かったMAb9305であった。この実験は、VLPとMAbとの培養、遠心分離によるVLPのペレッテング、V3ペプチドエリーザを使用して上澄液中に残存した未結合MAbの量を測定するものであった。 MAbの40アミノ酸HXB2gp120 V3ループペプチドへの結合の検出のためのエリーザて、100と500Mg/mlのVLPまたは200Mg/mlのペプチドを、貯蔵物からの1/100希釈の9305または9284MAbと培養した。溶液中の結合コントロールは、MA5620 VLP （陰性）とV3ペプチド（陽性）である。混合物を75Krpmで15分間遠心分離し、上澄液を残留MAbについてエリーザによって検定した。つまり、 1）MAb単独は心分離で溶液から除去されない。 2）陰性コントロールMA5620 VLPは上澄液に残存した抗体を結合しない。 3）陽性コントロールのペプチドは上澄液から全抗体反応性を除去した。すなわち未結合の抗体が残存しない。 4）OGS814 VLPは9305抗体を結合し、9284抗体を結合せず、これらのVLP中のGP GRAFモチーフが表面アクセス性であることを示す。実施例13 OGS814 VLPの免疫原性ラットを精製OGS 814 VLPで免疫化した。ラットを０週で感作させ、６と12週に追加免疫し、最終血液を14週に採取した。中間のテスト血液は６、８と12週に採取した。アジュバントの存在下と非存在下での免疫当り50と250μｇの２回の投与を５匹のラットの４つの群に、次のようにした。群１ 50μｇ−アジュバント／動物群２ 50μｇ＋アジュバント／動物群３ 250μｇ−アジュバント／動物群４ 250μｇ＋アジュバント／動物実施例14 OGS822 VLPの免疫原性 OGS822 VLPを、Typ1蛋白内のハーフV3ループの挿入に由来する改良免疫原性を検査するのに選択した。ラットに、水酸化アルミニウムアジュバント中の250Mg精製OGS 822 VLPを筋注して免疫化した。ラットを０週で感作、６と12週で追加免疫、最終血液を14週で採取した。血清中についてエリーザアッセイと中和アッセイの両方で抗V3抗体反応をテストした。結果を表４に示す。同じアッセイで、OGS259 VLP（Ｃ−末端に1/2 V3ループ）で免疫化したラットの抗血清プールで、2.27U/mlのエリーザ値と1:8の中和力価を得た。内部部位（この場合Ｃ₂）での抗原の挿入は、免疫原性の劇的な改良となった。実施例15 抗原:インフルエンザ核蛋白CTLエピトープの挿入次の配列をエンコードするDNAヌクレオチドの相補対を合成した。これは、インフルエンザ核蛋白CTLエピトープ（ボールドで示す）を含む。フランキングASRSとGSASアミノ酸は制限酵素部位をエンコードしている。この配列は、４つの部位Ａ、Ｂ、Ｃ₁とＣ₂の各々でp1蛋白に挿入した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/39 8318−4ＨＣ１２Ｎ 1/19 8828−4Ｂ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ａ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＺ，ＤＥ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者バーンズ，ロバート，ナイジェル英国、オックスフォードオーエックス４５エルワイカウリー、ウォトリントンロード（番地なし）ブリテッシュバイオテックファーマシューティカルズリミテッド (72)発明者リチャードソン，サイモン，マーク，ハロルド英国、オックスフォードオーエックス４５エルワイカウリー、ウォトリントンロード（番地なし）ブリテッシュバイオテックファーマシューティカルズリミテッド

Claims

【特許請求の範囲】１．酵母レトロトランスポゾンと実質的に相同である自己集合性粒子形成第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とからなり、第２配列が抗原性で、第１のアミノ酸配列のエピトープ内に導入され、そのエピトープは第１のアミノ酸配列単独で形成された粒子で表面露出していることからなる非天然粒子形成タンパク質。２．第２のアミノ酸配列が表面露出エピトープに挿入されている請求項１に記載の粒子形成タンパク質。３．第２のアミノ酸配列が表面露出エピトープに通常存在する天然アミノ酸に代って置換されている請求項１に記載の粒子形成タンパク質。４．表面露出エピトープに通常存在する天然アミノ酸が削除されている請求項１〜３の何れかに記載の粒子形成タンパク質。５．表面露出エピトープが第１アミノ酸配列のＮ末端ハーフに存在する請求項１〜４の何れかに記載の粒子形成タンパク質。６．レトロトランスポゾンTyの第１アミノ酸配列p1タンパク質がＣ−末端で切形されている請求項５に記載の粒子形成タンパク質。７．表面露出エピトープがアミノ酸21-42の間に局在している請求項６に記載の粒子形成タンパク質。８．表面露出エピトープがアミノ酸55-74の間に局在している請求項６に記載の粒子形成タンパク質。９．表面露出エピトープがアミノ酸93-142の間に局在している請求項６に記載の粒子形成タンパク質。 10．第２のアミノ酸配列がアミノ酸30-31の間に挿入されている請求項７に記載の粒子形成タンパク質。 11．第２のアミノ酸配列がアミノ酸67〜68の間に挿入されている請求項８に記載の粒子形成タンパク質。 12．第２のアミノ酸配列がアミノ酸113〜114の間に挿入されている請求項９に記載の粒子形成タンパク質。 13．第２のアミノ酸配列がアミノ酸132〜133の間に挿入されている請求項９に記載の粒子形成タンパク質。 14．抗原性の第２のアミノ酸配列（または配列類）が病因剤または腫瘍に由来または関連の配列に相当する請求項１〜13の何れか１つに記載の粒子形成タンパク質。 15．病因剤がウィルス、細菌、菌類または寄生虫のような微生物である請求項14 に記載した粒子形成タンパク質。 16．ウィルスが、HIV-1、HIV-2、HTLV-I、HTLV-II、HTLV-III、SIV、BIV、ELAV 、CIAV、マウス白血病ウィルス、モロネイマウス白血病ウィルス、ネコ白血病ウィルスのようなレトロウィルス；インフルエンザＡまたはＢのようなオルソミクソウィルス；パラインフルエンザウィルス、おたふくかぜ、はしか、RSVとセンダイウィルスのようなパラミクソウィルス；HPVのようなパポバウィルス；ヒトまたはマウスのLCMVのようなアレナウィルス；肝炎Ｂウィルスのようなヘパトナウィルス； HSV、VZV、CMVまたはEBVのようなヘルペスウィルスである請求項９に記載した粒子形成タンパク質。 17．腫瘍関連または由来抗原が、メラノーマ関連抗原のようなタンパク質性ヒト腫瘍抗原または胸部または結腸カルシノーマからのような上皮腫瘍関連抗原である請求項14に記載した粒子形成タンパク質。 18．抗原配列が、ナイセリア、ボルデテラ、リステリアマイコバクテリアまたはリーシュマニア属のような細胞；プラスモジム属のような寄生虫；またはカンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス、ヒストプラズモまたはブラストマイセス属のような菌数から由来のものである請求項14に記載した粒子形成タンパク質。 19．抗原配列が、長さ６〜60アミノ酸の間である請求項１〜18の何れかに記載した粒子形成タンパク質。 20．抗原配列が、１）HIV（特にHIV-I）gp120、２）HIV（特にHIV-I）p24 ３）インフルエンザウィルス核蛋白とヘマグチニン、４）LCMV核蛋白質５）HPVLI,L2,E4,E6とE7タンパク質、６）p97メラノーマ関連抗原、７）GA733-2上皮腫瘍関連抗原、８）MUC-1上皮腫瘍関連抗原、９）マイコバクテリウムp6、 10）マラリアCSPまたはRESA抗原、 11）VZV gpI,gpIIまたはgpIII からのエピトープである請求項１４に記載の粒子タンパク質。 21．エピトープが、レンチウィルムのエンベロープ糖蛋白gp１20のV3ループマタハGPGRループである請求項20に記載した粒子形成タンパク質。 22．２以上の表面露出エピトープが、導入された抗原性アミノ酸配列を有する前記請求項の何れか１つに記載した粒子形成タンパク質。 23．表面露出エピトープの１つに導入された抗原性アミノ酸配列が他の表面露出エピトープ内に導入された抗原性アミノ酸配列と異なる請求項22に記載した粒子形成タンパク質。 24．１以上の抗原性アミノ酸配列が、何れかの単一の表面露出エピトープ内に導入されている前記請求項の何れか１つに記載した粒子形成タンパク質。 25．何れかの単一の表面露出エピトープに導入された抗原性アミノ酸配列が全て同一ではない請求項24に記載した粒子形成タンパク質。 26．抗原性アミノ酸配列が、表面露出エピトープに縦に導入されている請求項24 または17に記載したタンパク質。 27．異なる第２のアミノ酸配列が同性抗原の異なるエピトープに由来する請求項 23、25または26に記載したタンパク質。 28．請求項１〜27の何れかで記載した複数の相同タンパク質からなる粒子。 29．請求項１〜27の何れかで記載した複数の異型タンパク質からなる粒子。 30．請求項１〜27の何れか１つに記載した融合タンパク質をコードする核酸。 31．請求項30で記載した核酸を含有するベクター。 32．請求項31で記載したベクターを担持する宿主細胞。 33．宿主細胞がE.コリである請求項32に記載した宿主細胞。 34．宿主細胞が、サッカロマイセスセレビシエまたはピシアパストリスのような酵母細胞である請求項32に記載した宿主細胞。 35．宿主細胞が、スポドフテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperda）のような昆虫細胞である請求項32に記載した宿主細胞。 36．請求項１〜29の何れかに記載した粒子抗原で惹起または指向した抗体。 37．請求項１〜29の何れか１つで記載したハイグリドタンパク質および／または粒子を免疫治療または予防用ワクチンの製造への使用。 38．請求項１〜29に記載した粒子抗原の診断剤への使用。 39．請求項１〜29の何れか１つに記載したタンパク質と医薬的および／または獣医的に受容な担体とからなる医薬または獣医用組成物。