KR20150099601A - HPV/HBs 키메라 단백질을 유효성분으로 하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 백신 - Google Patents

HPV/HBs 키메라 단백질을 유효성분으로 하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 백신 Download PDF

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히로시 요네무라
마사시 사카구치
타카시 이마무라
세이이치로 모리
타다히토 칸다
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잇빤 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼
고쿠리쯔 간센쇼 겐큐쇼쵸가 다이효스루 니혼고꾸
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Abstract

HPV-L2 펩티드와 HBs 단백질과의 키메라 단백질로써, HPV-L2 펩티드가, (1) 20아미노산의 코어서열 영역으로 이루어지는 펩티드, (2) Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly 이루어지는 6아미노산을 가지는 코어서열 영역내의 펩티드, 또는 (3) 코어서열 영역의 N말단측 및/또는 C말단측에 HPV L2 단백질 유래의 아미노산이 부가된 70개 이하의 아미노산으로 이루어지는 펩티드인, 상기 키메라 단백질; 및 그 키메라 단백질을 유효성분으로서 함유하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 백신. 본 발명의 키메라 단백질을 함유하는 백신은 숙주에 있어서의 발현량이 증가하고, 면역능력이 증강하고 있어(조기의 항체유도), 많은 HPV형에 유효한 넓은 스펙트럼을 가진 백신이다.

Description

HPV/HBs 키메라 단백질을 유효성분으로 하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 백신{VACCINE FOR HPV INFECTION AND/OR HEPATITIS B CONTAINING HPV/HBS CHIMERIC PROTEIN AS ACTIVE INGREDIENT}
본원발명은 인간 유두종 바이러스(Human papillomavirus: HPV) 유래의 펩티드와 인간 B형 간염 바이러스 표면 단백질(HBs 단백질)과의 키메라 단백질을 유효성분으로 하는 백신에 관한 것이다.
인간 유두종 바이러스(Human papillomavirus: HPV)는 파필로마바이러스과에 속하는 소형의 환상 더블-스트랜드 DNA 바이러스로 인간 유두종 바이러스라고도 불린다. HPV는 바이러스 게놈이 외곽 단백질(캡시드 단백질: Capsid protein)로 덮어진 직경 50-55nm의 정이십면체 구조를 취하지만, 캡시드를 덮는 엔벨로프는 존재하지 않는다. 게놈 사이즈는 종류에 따라 다르지만 약 8,000 염기 정도이고, 이 중에 초기 단백질(E1, E2, E4, E5, E6 및 E7)과 후기 단백질(L1 및 L2)이 코딩되어 있다. L1과 L2에서 HPV 입자의 캡시드가 형성되고, L2는 캡시드 형성에 보조적으로 작용하고 있다.
HPV의 숙주영역은 엄격해서 인간 이외의 동물에 감염되지 않는다. HPV는 접촉 감염에 의해 피부나 점막에 잠복 지속 감염하고, 자궁 경부암(편평상피암, 선암) 및 그 전구병변(cervical intraepithelial neoplasia(CIN) 2 및 3), 첨규 콘딜롬 등을 야기한다. 일본에서는, 년간 19000명이 자궁 경부암을 발병하고 있으며, 5600 명이 사망하고 있다(비특허문헌 5 참조). WHO에 의한 추정으로는 세계 여성의 악성 종양의 13％(53만명)에 HPV의 감염이 관계하고 있고, 3억 명이 HPV의 캐리어라고 볼 수 있다(비특허문헌 4 참조).
바이러스 증식에 관한 연구에서는 HPV 감염세포의 분열 시에 HPV 게놈은 복제하고, 딸 세포로 분배된다. 잠복감염세포가 표피형성의 분화를 시작하면, 분화 종반에서 바이러스 증식이 일어난다. 그렇지만, HPV는 바이러스입자로서 분리되는 것은 드물고, 게놈 DNA만이 클로닝되고 있다. 지금까지 HPV는 캡시드 단백질(L1) 유전자의 염기서열의 상동성에 의거해서 100종류 이상의 유전자형으로 분류되고 있다. HPV는 그 유전자형에 따라 감염 부위나 발병하는 병이 다르고, 피부병변으로 검출되는 것(상피형)과 점막병변으로 검출되는 것(점막형)으로 대별되고, 추가로 점막형의 HPV는 여러 암에 검출되는 고리스크형과 양성의 첨형 콘딜로마 등의 원인이 되는 저리스크형으로 분류된다. 고리스크형 HPV에는 자궁 경부암, 항문주위암 및 음경암 등에서 검출되는 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82형이 포함되고, 저리스크형 HPV에는 6 및 11형 등이 포함된다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2 및 비특허문헌 3 참조).
HPV 감염 예방백신에 관해서는, 2006년 6월에 미국 MERCK LTD.에 의해 개발된 HPV 6, 11, 16, 18형의 바이러스-유사 입자(VLP)를 혼합한 백신 「상품명 Gardasil(등록상표)(가다실)」이 미국 식품의약품국(FDA)에 의해 승인되고, 2007 년 5월에 영국 GlaxoSmithKline사에 의해 개발된 HPV 16, 18형의 VLP를 혼합한 백신 「상품명 Cervarix(서버릭스)」이, 오스트레일리아의 의약품심사 당국(TGA)에 의해 승인되었다. 일본에서는, 2009년 10월에 Cervarix, 2011년 7월에 Gardasil이 승인되었다.
이것들은 제1 세대 백신이라 불리고, L1 단백질을 코딩하는 유전자를 효모균이나 곤충세포에 발현시키고, VLP를 만들게 하고, 이것에 애주번트를 첨가한 것이다.(비특허문헌 6 참조). 모두 특정한 유전자형에 의해 발생되는 암에 대해서 승인된 것으로, Gardasil이라면 6, 11, 16 및 18형, Cervarix 이라면 16 및 18형 이외에서는 극히 일부의 형에 대한 예방효과밖에 인정되지 않고 있다(비특허문헌 12). 따라서 HPV 감염 저지, 그 후에 유발되는 암의 발병을 보다 효율적으로 억제하기 위해서, 모든 종류의 형의 HPV 감염에 유효하게 작용하는 백신의 개발이 요구된다(비특허문헌 5 및 비특허문헌 6 참조).
이러한 시도의 하나로서, Kanda들의 보고가 있다. 그들은, HPV 16형의 L2의 64-81번 위치 및 108-120번 위치의 아미노산 서열 중에 고리스크형 HPV에 공통인 중화 에피토프가 존재하는 것, 및 HPV 16형의 L2 유래의 펩티드를 16형 HPV의 L1에 삽입한 키메라 단백의 집합체인 VLP는 HPV 16형, 18형, 31형, 33형, 35형, 52형 및 6형의 감염을 저해하는 것을 밝혔다(특허문헌 1 및 특허문헌 2 참조). 또 18-38번 위치, 56-75번 위치 및 96-115번 위치의 각 L2 펩티드를 L1에 삽입한 키메라 단백질로 이루어지는 VLP에 관해서도 동일한 보고를 하고 있다(비특허문헌 13 참조). 한편, 삽입 펩티드의 길이가 에피토프 부분의 항원으로서의 제시에 영향을 주는 것도 보고되어 있다(특허문헌 1).
HPV의 L1 이외에, 여러 입자 형성능을 가지는 단백질에 외래 펩티드를 부가 또는 삽입해서 수득되는 키메라 단백질의 입자형성이나 백신으로서의 유용성에 관한 연구가 보고되어 있다. 예를 들면, B형 간염 바이러스(HBV)의 표면 단백질(HBs 단백질)의 N말단 또는 C말단에 HPV 16형의 L2의 일부로 이루어지는 펩티드(N말단에서 50-220아미노산 영역 및 100-220아미노산 영역)를 부가한 키메라 단백질을 마우스에 면역하고, ELISA에서 L2 및 HBs에 대한 항체의 상승이 있는 것을 확인하고 있다(특허문헌 7 참조). 그 외, HBs 단백질의 친수성 영역이나 HBsAg-S의 외측 루프 내의 노출 부위에 외래 유전자를 삽입해서 수득되는 키메라 단백질(특허문헌 3 및 특허문헌 4 참조), 및 HBs 단백질의 N말단측에 외래 펩티드를 결합시킨 키메라 단백질의 VLP 형성에 관한 보고가 있다(특허문헌 5 및 특허문헌 6 참조).
HBs 단백질은 효모유래의 재조합 침강 B형 간염백신의 유효성분으로서 사용되는 등, 백신으로서의 효과나 안전성이 높은 것이 실증되어 있다(비특허문헌 7 참조). 그렇지만, 외래 펩티드와 HBs 단백질의 키메라 단백질로 이루어지는 VLP는 삽입되는 외래 펩티드의 종류나 길이의 차이에 의해, VLP의 안정성, 세포로부터의 발현효율, 발현되었지만 구조변화 등에 영향을 미치는 경우도 있어서(특허문헌 4 참조), 반드시, 백신으로서의 유용성이 담보되는 것은 아니다.
WO2005/097987호 일본 공개특허공보 2007-45746호 일본 공개특허공보 H08-198897호 일본공표특허공보 2004-504067호 일본 공개특허공보 2011-115042호 일본 공개특허공보 2007-209343호 WO2010/001409호
바이러스 제56권 제2호, pp219-230, 2006 의학의 발자취 Vol.224 No9: 669-680, 2008 Munoz, N. et al.: New Engl J Med, 348, 518-527, 2003. Monitoring of Cancer Incidence in Japan MCIJ2007 March 2012 바이러스 제58권 제2호, pp155-164, 2008 산과와 부인과73(2): 217-225, 2006 국립감염증연구소 B형 간염백신에 관한 팩트시트(2000년 7월7일 판) Kawana. K, et al.: Common neutralization epitope in minor capsid protein L2 of human papillomavirus types 16 and 6. J. Virology., 73, 6188-6190, 1999(L2의 106-121) Ivonne Rubio et al.: Potent anti-HPV immune responses induced by tandem repeats of the HPV16 L2(20-38) peptide displayed on bacterial thioredoxin. Vaccine, 27, 1949-1956, 2009 Fujiyama, A. et al.: Nuc. Acid Res., 11(13), 4601-4610, 1983 Christophe, M. et al.: Emer. Inf. Dis., 14(11), 1777-1780, 2008 일본이비인후과학회 회보 Vol. 115 No. 2, 73-84, 2012 Kondo, K et al.: Journal of Medical Virology 80:841-846(2008)
본원발명의 목적은 HPV의 캡시드 구성요소의 하나로 L2라고 불리는 단백질(이하, 「L2 단백질」이라고 언급하기도 한다.)의 특정영역의 20개의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를, HBs 단백질의 N말단측 또는 C말단측에 부가 또는 HBs 단백질 내부에 삽입해서 수득되는 키메라 단백질을 유효성분으로 하는 인간 유두종 바이러스 감염증 및/또는 B형 간염을 예방하기 위한 백신을 제공하는 것에 있다.
본원발명자들은 상기의 목적을 달성하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, HPV 16형의 L2 단백질의 56-75번 위치의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드(서열번호 4; Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu)를, HBs 단백질의 N말단측 또는 C말단측에 부가해서 수득되는 키메라 단백질, 및 HBs 단백질 내부에 삽입해서 수득되는 키메라 단백질은, 바이러스 유사 입자(VLP)를 형성하고, HBs 단백질 및 그 펩티드에 대한 (중화)항체를 유도하는 것을 발견했다. 특히 C말단측에 부가한 키메라 단백질에 의해 생산된 항체는 그 펩티드에 대한 항체를 조기에 유도하는 것, HBs 단백질 및 그 펩티드의 양쪽에 강하게 결합하는 것, 또한 그 항체는 다종의 HPV형 유래의 L2 펩티드와 결합하는 것, 또, HBs 내부에 삽입된 키메라 단백질에 의해 생산된 항체는, 그 펩티드내의 2부분의 아미노산 서열(N말단측 및 C말단측 에피토프)을 인식하는 항체를 유도하는 것을 발견하고, 본원발명을 완성하기에 이르렀다.
본원발명에 따르면, HPV L2 단백질의 특정영역의 7∼20개의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 HBs 단백질과의 키메라 단백질, 그 키메라 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지는 DNA 단편, 그 DNA 단편이 통합된 발현벡터(바이러스 벡터를 포함하는), 그 발현벡터를 가지는 숙주, 그 키메라 단백질 및 그 DNA 단편을 사용한 HPV 감염증 및/또는 B형 간염을 예방하기 위한 백신, 및 그 백신의 제조방법이 제공된다.
본원발명의 키메라 단백질 및 그 키메라 단백질을 코딩하는 DNA를 가지는 발현벡터는 B형 간염 및/또는 HPV 감염증의 예방이나 치료에 유효하게 이용될 수 있는 것이다. 따라서 본원발명은 아래와 같다.
[1] 인간 유두종 바이러스(HPV) L2 단백질 유래의 펩티드(HPV-L2 펩티드)와 B형 간염 바이러스 표면 단백질(HBs 단백질)과의 키메라 단백질로써, HPV-L2 펩티드가, (1) 20아미노산의 코어서열 영역으로 이루어지는 펩티드, (2) Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly 이루어지는 6아미노산을 가지는 코어서열 영역 내의 펩티드, 또는 (3) 코어서열 영역의 N말단측 및/또는 C말단측에 HPV L2 단백질 유래의 아미노산이 부가된 70개 이하의 아미노산으로 이루어지는 펩티드인 상기 키메라 단백질.
[2] 상기 [1]에서, HPV-L2 펩티드가 코어서열 영역으로 이루어지는 키메라 단백질.
[3) 상기 [1] 또는 [2]에서, 상기 코어서열 영역이 Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa(X1aa, X2aa, X3aa, X4aa, X5aa 및 X6aa는 임의인 아미노산이라 한다.)(서열번호3)으로 나타내는 서열인 키메라 단백질.
(4) 상기 [3]에서, 상기 코어서열 영역이 하기 (1) ∼ (6)으로부터 선택되는 아미노산을 가지는 서열인 키메라 단백질.
(1) X1aa가 Thr 또는 Ser이다,
(2) X2aa가 Ser, Thr 또는 Ala이다,
(3) X3aa가 Thr 또는 Ser이다,
(4) X4aa가 Ser, Thr 또는 Ala이다
(5) X5aa가 Ile 또는 Val이다, 및
(6) X6aa가 Leu 또는 Ile이다
[5] 상기 [1] 또는 [2]에서, 상기 코어서열 영역이 Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu(서열번호 4)로 이루어지는 아미노산 서열인 키메라 단백질.
[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에서, 상기 키메라 단백질이 1∼11개의 HPV-L2 펩티드를 포함하는 키메라 단백질.
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에서, 상기 펩티드가 HBs 단백질의 N말단 아미노산, 서열번호 2의 127-128번 위치, 또는 C말단 아미노산의 적어도 1개소에 부가 또는 삽입된 키메라 단백질.
[8] 상기 [7]에서, 상기 펩티드가 HBs 단백질의 서열번호 2의 127-128번 위치에 삽입된 키메라 단백질.
[9] 상기 [7]에서, 상기 펩티드가 HBs 단백질의 C말단 아미노산에 부가된 키메라 단백질.
[10] 상기 [7]에서, 상기 펩티드가 HBs 단백질의 서열번호 2의 127-128번 위치에 삽입 및 C말단 아미노산에 부가된 키메라 단백질.
[11] 인간 유두종 바이러스(HPV) L2 단백질 유래의 펩티드(HPV-L2 펩티드)과 B형 간염 바이러스 표면 단백질(HBs 단백질)의 키메라 단백질로써, HPV-L2 펩티드가 20아미노산으로 이루어지고, Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu(서열번호 4)인 아미노산 서열에 대한 상동성이 50-100%, 70-100% 또는 80-100％인 키메라 단백질.
[12] 상기 [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 키메라 단백질을 코딩하는 DNA 단편.
[13] 상기 DNA 단편에 코딩되는 키메라 단백질을 발현할 수 있는 발현벡터.
[14] 상기 발현벡터로 형질 전환한 키메라 단백질 생산 숙주.
[15] (1) 없고 (11)중 어느 하나에 기재의 키메라 단백질을 유효성분으로서 함유하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 백신.
[16] 상기 [8]에 기재된 키메라 단백질 및 상기 [9]에 기재된 키메라 단백질을 유효성분으로 함유하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 백신.
[17] 상기 [13]에 기재된 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 DNA 백신.
[18] 하기 (1) 내지 (5)의 공정을 포함하는 인간 유두종 바이러스(HPV) L2 단백질 유래의 펩티드(HPV-L2 펩티드)와 B형 간염 바이러스 표면 단백질(HBs 단백질)의 키메라 단백질을 유효성분으로 함유하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 백신의 제조방법;
(1) 20 아미노산의 코어서열 영역으로 이루어지는 HPV-L2 펩티드, Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly인 6아미노산을 가지는 코어서열 영역 내의 HPV-L2 펩티드, 또는, 코어서열 영역의 N말단측 및/또는 C말단측에 HPV L2 단백질 유래의 아미노산이 부가된 70개 이하의 아미노산으로 이루어지는 HPV-L2 펩티드와 HBs 단백질의 키메라 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 조제하는 공정,
(2) 상기 (1)의 DNA 단편을 가지는 발현벡터를 조제하고, 그 발현벡터로 숙주를 형질 전환하는 공정,
(3) 상기 (2)에 의해 수득되는 형질 전환 숙주를 Geneticin 및 MTX의 존재 하에서 배양하고, 키메라 단백질 생산 형질 전환 숙주를 선택하는 공정,
(4) 상기 (3)에 의해 수득되는 키메라 단백질 생산 형질 전환 숙주를 확장 배양하고, 배양물로부터 상기 키메라 단백질을 정제하는 공정, 및
(5) 상기 (4)에 의해 수득되는 정제 키메라 단백질에 애주번트, 안정화제, 완충제, 등장화제 및 보존제를 첨가하고, 백신으로 하는 공정.
본원발명의 형태의 하나인 Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu로 이루어지는 펩티드와 HBs 단백질의 키메라 단백질은, 그 펩티드와 HBs 단백질의 양쪽의 항체 생산능을 가지므로, HPV 감염증 및/또는 B형 간염의 예방약의 호적한 재료가 될 수 있다. 특히, 그 펩티드를 HBs 단백질의 C말단측에 부가시켰을 경우, 숙주에 있어서의 발현량의 증가뿐만 아니라, 그 펩티드의 면역능력의 증강(조기의 항체유도)이 인정되고, 또, HBs 단백질의 내부에 삽입했을 경우, 그 펩티드 내의 적어도 2부분의 아미노산 서열에 대한 항체를 유도할 수 있다는 점에서, 백신의 생산성을 높이고, 품질을 향상시키는데 유용하다.
또, 상기 펩티드의 N말단측 6개의 아미노산 서열은 HPV의 주 사이에서 잘 보존되어 있으며, 많은 HPV형에 유효하다. 사실, 실시예에 나타나 있는 바와 같이, 본원발명의 키메라 단백질에 의해 유도되는 항체는 많은 형의 HPV와 반응한다. 따라서 본원발명에 따르면, 종래의 형 특이적인 백신과는 달리, 더 넓은 스펙트럼을 가진 백신의 제공이 가능하게 된다.
도 1은 항HBs 모노클로널 항체를 사용한 샌드위치 ELISA에 의해, 형질 전환 세포의 배양 상청액 중의 키메라 단백질 농도를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 키메라 단백질로 면역한 마우스 혈청(혼주혈청(pooled sera))과 같은 유전자형 유래의 HPV-L2 펩티드와의 반응성을 나타내는 도면이다.
도 3은 키메라 단백질로 면역한 마우스 혈청(개체별 혈청)과 같은 유전자형 유래의 HPV-L2 펩티드와의 반응성을 나타내는 도면이다.
도 4는 키메라 단백질로 면역한 마우스 혈청(혼주혈청)과 다른 유전자형 유래의 HPV-L2 펩티드와의 반응성을 나타내는 도면이다.
도 5는 키메라 단백질로 면역한 마우스 혈청(혼주혈청) 중의 HBs 항체가의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 키메라 단백질로 면역한 마우스 혈청(혼주혈청)의 에피토프 해석을 실시한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 키메라 단백질로 면역한 마우스 혈청(혼주혈청)과 다른 유전자형 유래의 HPV-바이러스 유사 입자(VLP)와의 반응성을 나타내는 도면이다.
도 8a는 키메라 단백질로 면역한 마우스 혈청(혼주혈청)의 다른 유전자형 유래의 HPV16-가짜 바이러스(PsV)에 대한 중화능을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8b는 키메라 단백질로 면역한 마우스 혈청(혼주혈청)의 다른 유전자형 유래의 HPV18-가짜 바이러스(PsV)에 대한 중화능을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8c는 키메라 단백질로 면역한 마우스 혈청(혼주혈청)의 다른 유전자형 유래의 HPV35-가짜 바이러스(PsV)에 대한 중화능을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
본원발명의 특징은 HPV그룹 사이에서 매우 잘 보존된 HPV의 L2 단백질 유래의 펩티드와 B형 간염 바이러스 표면 단백질(HBs 단백질)의 키메라 단백질을, HPV 감염증 및/또는 B형 간염을 예방하기 위한 백신의 유효성분으로 하는 것에 있다.
전술한 바와 같이, HPV는 바이러스 입자로서 회수하는 것이 어렵고, 캡시드(L1) 유전자의 염기서열의 상동성에 의거해서 유전자형이 결정되고 있으며, 지금까지 100종류 이상의 유전자형이 분리되고 있다. 예를 들면, HPV의 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82형이 고리스크형의 HPV그룹으로, HPV의 6 및 11형이 저리스크형의 HPV그룹으로 분류된다. HPV의 L2 단백질에는 고리스크형의 HPV그룹 사이에서 매우 잘 보존된 아미노산 서열로 이루어지는 영역(이하, 「코어서열 영역」이라고 언급하기도 한다.)이 존재하고 있고, 저리스크형의 HPV그룹에 있어서도 동일한 코어서열 영역이 존재한다. 그 코어서열 영역으로 이루어지는 HPV L2 단백질 유래의 펩티드(이하, 「HPV-L2 펩티드」라고 언급하기도 한다.)가 본원발명에 사용된다. 이러한 코어서열 영역으로서 HPV16, 31 및 35형에서는 56∼75번째의 20아미노산, HPV 39, 45, 51, 52, 56, 58, 66 및 6형에서는 55∼74번째의 20아미노산, HPV 73형에서는 57∼76번째의 20아미노산, 및 HPV 11형에서는 54∼73번째의 20아미노산을 들 수 있다. 이것들의 20아미노산의 서열은 Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa(X1aa, X2aa, X3aa, X4aa, X5aa 및 X6aa는 임의인 아미노산이라고 한다.)인 식으로 표시할 수 있다(서열번호 3). 상기의 임의의 아미노산은 HPV주의 형 사이에서 돌연변이가 인정되는 부위로서,
(1) X1aa는 Thr 또는 Ser,
(2) X2aa는 Ser, Thr 또는 Ala,
(3) X3aa는 Thr 또는 Ser,
(4) X4aa는 Ser, Thr 또는 Ala,
(5) X5aa는 Ile 또는 Val, 및
(6) X6aa는 Leu 또는 Ile
로부터 선택된다.
Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu(서열번호 4)로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 HPV-L2 펩티드를, 동물에 면역해서 수득된 항체는 일부에 돌연변이를 가지는 코어서열 영역의 펩티드와도 반응하기 때문에, HPV주의 형 사에에서 전혀 돌연변이를 볼 수 없는 N말단측에서 6개의 아미노산 서열(Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly)에 공통인 에피토프가 존재하는 것은 용이하게 추인된다(실시예 6 참조). 따라서 본원발명에 사용되는 HPV-L2 펩티드는 20아미노산의 코어서열 영역으로 이루어지는 펩티드에 부가해서, 그 6아미노산으로 이루어지는 펩티드 및 그 6아미노산으로 이루어지는 펩티드의 N말단측 및/또는 C말단측에 HPV L2 단백질 유래의 아미노산이 부가된 여러 가지의 코어서열 영역 내의 펩티드를 포함한다.
또, 코어서열 영역의 N말단측 및/또는 C말단측에 HPV-L2 단백질 유래의 아미노산이 부가된 펩티드도 본원발명에 사용하는 것이 가능하고, HPV-L2 펩티드는 이것들의 펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 그 HPV-L2 펩티드의 아미노산의 총수는 70개 이하이다.
그 공통 에피토프를 가지는 코어서열 영역으로 이루어지는 HPV-L2 펩티드는, 모두 본원발명에 사용할 수 있지만, 서열번호 4의 아미노산 서열에 대해서 50-100%, 70-100% 또는 80-100%의 상동성을 갖는20아미노산으로 이루어지는 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 상기의 식(서열번호 3)으로 나타내는HPV-L2 펩티드의 아미노산 치환체가 사용된다. 가장 바람직하게는 Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu(서열번호 4)로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 HPV-L2 펩티드이다.
또, HPV-L2 펩티드는 후술하는 조건(항원활성 및 입자형태의 유지)을 만족시키는 것이라면, 상기 6아미노산 또는 그 6아미노산의 N말단측 및/또는 C말단측에 HPV-L2 단백질 유래의 아미노산이 부가된 7∼19아미노산, 및 20아미노산으로 이루어지는 코어서열 영역의 N말단측 또는 C말단측에 추가로 HPV-L2 단백질 유래의 아미노산이 부가된 것도 포함한다.
상기의 아미노산 치환체와는 별도로, HPV-L2 펩티드에 시스테인(Cys)을 부가 또는 삽입한 HPV-L2 펩티드 변이체도 본원발명의 1형태이다. 일반적으로, 펩티드 단독으로 동물을 면역했을 경우는 강한 면역효과를 얻는 것은 어려우므로, 캐리어(예를 들면, KLH)과 결합시키고, 게다가, 애주번트(예를 들면, Freund's complete adjuvant)을 첨가해 사용한다. 혹은, 펩티드 자체의 면역 부여 능력을 높이기 위해서 그 펩티드의 N말단측, C말단측, 및/또는 내부에 시스테인(Cys)을 부가 또는 삽입하는 것이 수행된다(WO 2010/044464 A1 및 WO 2011/024748 A1 참조). 예를 들면, 인플루엔자 바이러스A형의 M2의 아미노산 서열 중, 2∼24번째의 23아미노산으로 이루어지는 펩티드에 시스테인 잔기를 삽입한 M2 펩티드는 미변형의 M2 펩티드보다도 높은 면역원성(2배에서 20배)을 가지는 것이 보고되어 있다(WO 2011/024748 A1 참조). Cys으로의 치환이나 Cys의 부가에 의해 동일한 효과가 기대되는 경우에는, 본원발명의 HPV-L2 펩티드에 있어서도 HPV그룹 사이의 공통 에피토프가 보존되는 조건하에서, HPV-L2 펩티드의 1∼수개의 아미노산을 Cys로 치환 또는 부가할 수도 있다. 구체적으로는, HPV-L2 펩티드는 N말단측 6개의 아미노산은 HPV그룹 사이에서 완전히 동일한 서열을 가지므로, 그 아미노산 서열 이외의 부위에 Cys를 부가 또는 삽입하는 것이 바람직하다. 이하, 변형, 미변형의 구별이 불필요한 경우에는, 이것들을 종합해서, 단순하게, HPV-L2 펩티드라고 언급하는 경우도 있다.
HPV-L2 펩티드의 HBs 단백질으로의 부가 또는 삽입 부위는, HPV-L2 펩티드 및 HBs 단백질에 대한 면역원성이 유지되는 것이라면, 어느 부위일 수도 있다. 바람직하게는 HPV-L2 펩티드와 HBs 단백질의 키메라 단백질이 입자를 형성하며, 또, HPV-L2 펩티드가 그 입자의 표면에 위치하는 것이 바람직하다. 이러한 후보로서, HBs 단백질의 N말단측, C말단측, 및 HBs 단백질 내부의 특정부위(서열번호 2의 127-128번 위치)를 들 수 있다. 바람직하게는 HPV-L2 펩티드는 HBs 단백질의 C말단측에 부가 및/또는 HBs 단백질 내부의 특정부위(서열번호 2의 127-128번 위치)에 삽입된다.
HBs 단백질의 C말단측에 그 펩티드를 부가하는 것에 의해, 그 펩티드에 대한 항체를 조기에 유도할 수 있고, HBs에 대한 높은 항체가도 유지할 수 있다(실시예 1 및 실시예 7). 또, HBs 단백질 내부의 특정부위(서열번호 2의 127-128번 위치)에 삽입하는 것에 의해, HBs에 대한 항체유도는 저하되지만, 그 펩티드 내의 2부분의 아미노산 서열(2개의 에피토프)을 인식하는 항체가 유도된다. 이것은, 여러 HPV주에 대해서, 보다 스펙트럼이 넓은 항체가 유도되는 것을 의미한다(실시예 8). 따라서 더 효과적으로 HPV에 대한 항체를 유도하기 위해서는 HPV-L2 펩티드를 HBs 단백질의 C말단측에 부가하며, 또 HBs 단백질 내부의 특정부위(서열번호 2의 127-128번 위치)에 삽입하는 것이 바람직하다. 동일한 효과는, HPV-L2 펩티드를 HBs 단백질의 C말단측에 부가한 키메라 단백질과 그 펩티드를 HBs 단백질 내부의 특정부위(서열번호 2의 127-128번 위치)에 삽입한 키메라 단백질의 혼합물을 면역원으로 하는 것에 의해 수득된다. 이 경우, HBs 단백질에 대해서, 보다 높은 항체가의 유도가 기대된다. 최적의 효과를 얻기 위한 양 키메라 단백질의 혼합비는 통상의 방법에 의해 적당하게 조절할 수 있다.
외래 펩티드를 HBs 단백질의 N말단측에 부가하는 경우, 그 펩티드는 20∼70개의 아미노산인 것이 바람직하다. 이 사이즈보다 크면 입자형성에 영향을 미칠 가능성이 있고, 이 사이즈보다 작으면 항원으로서의 활성이 저하될 가능성이 있다. 따라서 본원발명에서는 항원활성 및 입자형태가 유지되는 것이라면, HPV-L2 펩티드를 연결해서 사용할 수 있다. 코어서열 영역으로 이루어지는 HPV-L2 펩티드(20아미노산)의 경우, 2∼3개를 연결해서 사용할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본원발명에는 코어서열 영역으로 이루어지는 HPV-L2 펩티드의 N말단측 또는 C말단측에 HPV L2 단백질 유래의 아미노산이 부가된 전장 21∼70개의 아미노산으로 이루어지는 펩티드를 사용할 수 있지만, 아미노산의 수가 21∼35개인 경우, 그 HPV-L2 펩티드를 2개 연결할 수 있다.
또, 코어서열 영역 내의 공통 에피토프 서열(Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly) 및 그 공통 에피토프 서열을 가지는 6∼19 아미노산으로 이루어지는 펩티드의 경우, 아미노산의 총수가 20∼70개가 되도록 펩티드 사이즈에 따라서 2∼11개의 HPV-L2 펩티드를 연결해서 사용할 수 있다.
또, 부가 또는 삽입 펩티드의 사이즈가 70아미노산까지의 범위내라면, HPV-L2 펩티드에 부가해서, 다른 펩티드를 부가 또는 삽입할 수도 있다. 예를 들면, 상술한 M2 펩티드를 부가 또는 삽입하는 것에 의해, HPV 감염증, B형 간염 및 인플루엔자에 유효한 3가 백신으로 할 수 있다.
본원발명의 HPV-L2 펩티드와 HBs 단백질의 키메라 단백질은 이하의 방법에 의해 취득할 수 있다. 우선, 키메라 단백질의 모체가 되는 HBs 단백질을 코딩하는 유전자(HBs 유전자)가 제작된다. HBs 유전자의 염기서열은 지금까지 많은 특허문헌, 비특허문헌 및 데이터베이스(예를 들면, 비특허문헌 10 및 비특허문헌 11 참조)에 개시되어 있으므로, 그 HBs 유전자의 염기서열에 의거해서 Sambrook 들이 설명하고 있는 일반적인 유전자 재조합 기술(Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989)을 이용해서 용이하게 취득할 수 있다. 또, 사용하는 HBs 항원은 Large, middle 및 small의 어느 것을 사용해도 좋다.
다음에, PCR법이나 DNA합성을 사용한 방법에 의해, HPV-L2 펩티드와 HBs 단백질의 키메라 단백질을 코딩하는 DNA 단편(이하, 「키메라 단백질 DNA 단편」이라고 언급하기도 한다.)이 조제된다. 예를 들면, PCR법에 의해, HBs 단백질의 N말단측 또는 C말단측에 HPV-L2 펩티드를 부가한 키메라 단백질 DNA 단편을 조제할 때는, HPV-L2 펩티드를 코딩하는 염기서열 및 HBs 유전자의 일부의 염기서열로 이루어지는 프라이머와 HBs 유전자의 다른 한쪽의 프라이머(어느 쪽이 N말단측으로 오는 가에 따라서 프라이머의 방향이 결정된다.)가 사용된다. HBs 단백질의 내부에 HPV-L2 펩티드를 부가한 키메라 단백질 DNA 단편을 조정하는 경우도 동일한 조작이 수행된다.
HPV-L2 펩티드를 코딩하는 염기서열 및 HBs 유전자의 염기서열에 의거해서 설계되는 PCR용 프라이머는 DNA 합성 수탁기관(예를 들면, QIAGEN사) 등에 의뢰하면 용이하게 입수 가능하다. 이 때, 목적에 따라서 5'측에 KOZAK 서열(Kozak M, J. Mol. Biol., 196, 947(1987)) 이나 5' 및 3'말단측에 적절한 제한효소 인식부위의 염기서열이 부가된다. PCR에 의해 증폭한 DNA 단편은 클로닝 벡터, 예를 들면, pUC119(TAKARA BIO INC.), pBlueScript(Agilent TEchnologies), 또는 pCRII-TOPO(Invitrogen) 등에 클로닝하고, DNA 시퀀서(ABI Prism 377 Applied Biosystems)에 의해 염기서열의 결정이 이루어진다. 소망하는 키메라 단백질 DNA 단편의 확인은 수득된 염기서열의 결과와, 설계된 PCR용 프라이머 서열 및 기존의 HBs 유전자의 염기서열을 비교하는 것에 의해 수행된다.
이렇게 해서 수득된 본원발명의 키메라 단백질 DNA 단편을 적당한 발현벡터에 통합하고, 이것을 숙주에 도입하는 것에 의해서, 키메라 단백질 DNA 단편의 발현이 수행된다. 발현벡터로서는 플라스미드나 바이러스 벡터 등을 사용할 수 있다. 그 발현벡터에 포함되는 프로모터는 숙주로서 사용하는 미생물 또는 동물세포와의 조합에 의해, Lac, tac, pho5, adh, SV40 초기, SV40 후기, 및 β액틴 등의 프로모터로부터 선택할 수 있다. 숙주로서는 세균, 효모, 동물세포, 식물세포, 곤충세포 등이 사용되지만, 사용목적에 맞추어서 선택하면 좋다. 숙주세포를 형질 전환할 때에는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 인산 칼슘법, DEAE 덱스트란법, 리포펙틴계의 리포솜을 사용하는 방법, 프로토플라스트 폴리에틸렌글리콜 융합법, 일렉트로포레이션법 등을 이용할 수 있고, 사용하는 숙주세포에 의해 적당한 방법을 선택할 수 있다.
본원발명에서는 국립감염증연구소(칸다 박사 및 모리 박사)로부터 분여된 재조합 바큘로바이러스 벡터(조제예 참조)를 제한효소로 절단하는 것에 의해, 목적하는 키메라 단백질 유전자, 즉, HBs 단백질의 N말단, C말단 및 내부(서열번호 2의 127-128번 위치의 사이)의 어느 하나에HPV-L2 펩티드(서열번호 1의 56∼75번째의 20아미노산)가 부가 또는 삽입된 키메라 단백질 DNA 단편을 취득했다. 이어서, 각 키메라 단백질 DNA 단편을 동물세포용 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo(WO2003/004641 참조)에 통합하고, 그 발현 플라스미드를 인산 칼슘법변법에 의해 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포의 형질 전환 처리를 실시했다.
본원발명의 키메라 단백질을 발현하고 있는 형질 전환 세포는, 이하의 2단계의 방법으로 스크리닝된다. 우선, 형질 전환 처리를 실시한 세포를 10∼1,000 nmol의 L메토트렉사이트(MTX)와 100∼1,000㎍/㎖의 GENETICIN(Geneticin G418 sulfate)을 포함하는 배지에서 일정기간 배양해서 생존하는 세포를 선택/증식시키는 것에 의해 형질 전환 세포를 선택한다. 이어서, 수득된 형질 전환 세포 중에 키메라 단백질이 발현하고 있는 그 세포가 선택된다. 구체적으로는 본 발명의 키메라 단백질은 배양 상청액이나 세포 파쇄물에 대해서 HPV-L2 펩티드 또는 HBs 단백질로 특이적으로 결합하는 항체를 사용해서 ELISA나 WB 등을 실시하는 것에 의해 확인된다.
형질 전환 세포의 배양에는 통상의 세포를 배양할 때에 사용되는 조건을 사용할 수 있다. 즉, T7m 배지, Ex-cell SP2/0 배지, YMM-01B 배지, YMM-01C 배지, OptiCHO 배지, Ex-cell 302 배지 등, 혹은 이것들의 몇 가지를 혼합한 배지가 사용된다. 이것에, 소 태아혈청, 칼슘, 마그네슘, 아미노산, 비타민 등을 첨가하는 경우도 있다. 배양온도는 32℃∼38℃, 배양기간은 2∼20일간이다. 의약품을 제조하는 단계에서는 키메라 단백질발현 세포를 무혈청 배지에서 유지하는 것이 바람직하다.
본원발명의 키메라 단백질의 정제는 단백질 화학에 있어서 통상 사용되는 방법, 예를 들면, 원심분리, 염석법, 한외 여과법, 등전점 침전법, 전기영동법, 이온교환 크로마토그래피법, 겔여과 크로마토그래피법, 친화성 크로마토그래피법, 소수 크로마토그래피법, 하이드록시애퍼타이트 크로마토그래피법 등을 적당하게 조합시키는 것에 의해 달성된다. 수득된 키메라 단백질의 량은 BCA Protein Assay Reagent Kit(Pierce Biotechnology, Inc), 프로틴어세이 키트(Bio-Rad Japan, Inc.) 등을 사용해서 측정된다.
본 발명의 키메라 단백질은 HPV-L2 펩티드와 HBs 단백질을 개별적으로 발현시키거나 화학합성한 후, 그것들을 화학적으로 결합시킨 것이더라도 상관없다. 개별적으로 발현시킬 때는, 화학 합성한 DNA서열이나 플라스미드에 삽입된 DNA서열을 주형으로 해서, 공지의 유전자 증폭방법으로 증폭시키고, 상기의 방법으로 각각의 발현 플라스미드를 구축하는 것이 가능하다. 발현 플라스미드는 상기한 바와 같이 숙주에 도입해서, 소망하는 펩티드나 단백질을 입수하는 것이 가능하다.
화학적으로 결합시키는 경우에는 크로스 링커를 사용해서 결합시키는 방법이 예시된다. 그 경우, 단백질이나 펩티드에 존재하는 아미노기, 티올기(SH기), 당쇄의 알데히드기 등을 이용해서 결합시킬 수 있지만, 사용하는 작용기에 제한은 없다. 또 비오틴이나 아비딘 등의 생체분자끼리의 상호작용을 이용한 결합을 이용함으로써 화학적으로 결합하는 방법도 예시된다.
본원발명의 키메라 단백질의 백신으로서의 평가는 항원을 소동물, 예를 들면, 닭, 마우스, 랫트, 모르모트, 개, 또는 원숭이 등에 면역한 후, in vitro의 계에 있어서는, 면역 동물로부터 채혈후, 혈청을 분리하고, 당해 혈청 중의 본 발명의 키메라 단백질에 대한 항체역가나 HPV 및 B형 간염 바이러스에 대한 중화 항체가를 측정하는 것에 의해, 또, in vivo의 계에 있어서는, 상기 면역 동물에 의사 HPV를 투여하고, 그 후 면역 동물의 생사, 병상 등을 관찰하는 것에 의해 이루어진다. 일반적으로 in vitro의 계에 있어서의 항체의 측정에는 ELISA법, PHA법, 플라크 분석법 등이 상용된다. 더 구체적으로는, B형 간염 바이러스에 대한 중화항체는 HBs항체를 측정하는 것에 의해, 또, HPV에 대한 중화항체는 바이러스 유사 입자(Virus like particle: VLP)나 감염성 가짜 바이러스(Buck C B등, Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. J Virol 78: 751-757, 2004.)와의 결합능을 측정하는 것에 의해 수행된다.
면역방법(예를 들면, 피하, 피내, 근육 내, 복강 내, 경비, 경구, 및 설하 등의 투여부위, 및 면역기간 등)은, 백신 등의 면역원성을 조사할 때에 상용되는 일반적인 면역수법을 사용할 수 있다. 면역에 사용하는 항원에는 그 면역능을 높이기 위해서 애주번트, 예를 들면, 수산화 알루미늄겔, 인산 알루미늄겔, CpG 올리고뉴클레오타이드, MDP, QS21, MPL+TDM 에멀션 등, 인간에 대해서 사용할 수 있는 것이라면 어느 쪽의 애주번트를 첨가해도 좋다. 추가로 항원의 안정성이나 형상유지를 위해서 의약품의 용도로서 허용할 수 있는 여러 가지의 첨가제를 첨가하는 경우도 있다. 이러한 첨가제로서, 안정화제(아르기닌, 폴리솔베이트 80, 마크로골 4000 등), 몰딩제(만니톨, 솔비톨, 자당, 및 락토오스), 완충제(인산수소 나트륨, 인산 2수소 나트륨, 염화나트륨 등), 등장화제(염화나트륨 등), 보존제(티메로살, 페녹시 에탄올 등), 불활화제(포르말린, β-프로피오락톤 등) 등을 들 수 있다.
이렇게 해서 수득되는 본 발명의 키메라 단백질은 HPV 감염 및 B형 간염의 증식 저지에 유효한 항체 생산능을 가지는 것으로, HPV 감염 및 B형 간염의 예방약의 재료로서, 혹은 HPV 및 B형 간염 바이러스의 검출계(예를 들면, ELISA법, 웨스턴 블롯법, 및 도트-블롯법 등의 항체 측정법에 의한 검출계)를 구축하기 위한 재료로서 사용할 수 있다.
또, 키메라 단백질을 코딩하는 DNA 단편이 생체 내에 투여되었을 때에 그 키메라 단백질을 발현할 수 있는 발현벡터를 사용해서 DNA백신으로 할 수도 있다. 이러한 발현벡터로서 대장균 유래의 플라스미드를 들 수 있다. 그 플라스미드에는 포유류의 세포 내에서 유전자를 발현시키기 위해서, 그 상류에 진핵생물에 있어서의 강력한 프로모터, 예를 들면, 시토메갈로바이러스의 IE(immediate-early) 프로모터, β-actin 프로모터, CAG 프로모터 등이 배치된다. 또, 그 DNA 단편을 바이러스나 세균 등에 도입하면, 생백신으로 할 수도 있다. 이러한 발현벡터로서 바이러스(백시니아바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 홍역바이러스 벡터 등), 세균(살모넬라 벡터 등), 원충(말라리아 원생동물 벡터 등) 등을 들 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 키메라 단백질을 코딩하는 DNA 단편이 통합된 백시니아바이러스 벡터(LC16m8주)를 사용했을 경우, 약독생균백신으로서의 기능뿐만아니라, 천연두 백신으로서의 효과를 기대할 수 있다. 약독생균백신은 백신재료의 정제공정을 간략화할 수 있어 제조 코스트의 저감에 연결된다. HBs 단백질이 통합된 재조합 백시니아바이러스는 HBs 단백질만으로 구성된 입자를 발현한다(Vaccine 1987 Mar; 5(1): 65-70). 따라서 본원발명의 키메라 단백질 DNA 단편이 통합된 재조합 백시니아바이러스(LC16m8주)는 동일하게 입자를 형성하는 것이 예측되고, HPV-L2 펩티드의 강한 면역원성이 유지된 약독생균백신이 되는 것이 기대된다.
또, 본원발명의 키메라 단백질을 유효성분으로 하는 백신은 단독으로 HPV 감염 및 B형 간염을 예방하기 위한 2가 백신으로서 사용할 수도 있고, 다른 바이러스(예를 들면, 인플루엔자 바이러스, A형 간염바이러스, 일본 뇌염바이러스 등), 세균(예를 들면, 헤모필러스인풀루엔자균, 파상풍균, 디프테리아균 등) 및 원충(예를 들면, 말라리아 등) 감염증에 대한 백신으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 1종류의 백신과 조합시키는 것에 의해 다가 혼합백신으로서 사용할 수도 있다.
이하, 실시예에 따라서, 본원발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 하기의 실시예에 전혀 한정되는 것은 아니다.
( 조제예 )
《HPV L2 56/75-HBs 키메라 유전자의 구축∼바큘로바이러스 발현 플라스미드 구축》
HPV 16형의 캡시드 L2의 아미노산번호 56로부터 75의 20아미노산을 HBs의 N말단, 아미노산 번호 127과 128의 사이, C말단에 도입하는 3종의 키메라 단백질을 코딩하는 유전자 및 대조의 HBs 유전자를 구축하고, 바큘로바이러스 발현 플라스미드에 도입했다.
(1) N말단 도입 키메라 유전자의 구축과 바큘로바이러스 발현 플라스미드 pFB1-HBsS56/75-N의 구축
HBs 효모 발현 플라스미드 pYG100L(T. Imamura, et al., J. Virol., 61, 3543-3549p, 1987)을 템플레이트에 이하의 Primer NF, Primer R을 사용해서 PCR에 의해 증폭했다.
Primer NF; 5'-gtcgacATGGGTGGGTTAGGAATTGGAACAGGGTCGGGTACAGGCGGACGCACTGGGTATATTCCATTGGAGAACACAACATCAGGATT (서열번호 18)
Primer R; 5'-ctgcagTTAAATGTATACCCAAAGAC (서열번호 19)
아가로스겔 전기영동으로 목적 사이즈의 약 750bp의 밴드를 확인했다. 이 밴드를 제한효소 Sal I-Pst I로 소화하고, 바큘로바이러스 발현 플라스미드 pFastBac1(Invitrogen)의 제한효소 Sal I-Pst I 소화단편에 도입하고, HBs 단백질의 N말단에 HPV-L2 펩티드(서열번호 1의 56∼75번째의 20아미노산)가 부가된 키메라 단백질(이하, 「56/75-N말단 도입 키메라」라고 언급하기도 한다.)을 코딩하는 DNA 단편을 가지는 발현 플라스미드 pFB1-HBsS56/75-N을 구축했다.
(2) HBs 아미노산 127-128번 위치 도입 키메라 유전자의 구축과 바큘로바이러스 발현 플라스미드 pFB1-HBsS56/75-127의 구축
앞에서 설명한 pYG100L을 템플레이트에, 이하에 기재한 Primer F 및 Primer 127R로 PCR 증폭한 단편, 및 Primer 127F와 앞에서 설명한 Primer R로 PCR 증폭한 단편을 얻었다. Primer F , Primer 127R, Primer 127F의 서열을 이하에 나타냈다.
Primer F ; 5'-gtcgacATGGAGAACACAACATCAGG (서열번호 20)
Primer 127R; 5'-TCCGCCTGTACCCGACCCTGTTCCAATTCCTAACCCACCAGGAATCGTGCAGGTCTTGCA (서열번호 21)
Primer 127F; 5'-CAGGGTCGGGTACAGGCGGACGCACTGGGTATATTCCATTGGCTCAAGGAACCTCTATGT (서열번호 22)
각각 증폭한 단편을 등량 혼합하고, 프라이머 F와 프라이머 R로 재차 PCR 증폭 함으로써 각각의 단편을 접속한 약 750bp의 유전자 단편을 얻었다. 이 유전자를 제한효소 Sal I-Pst I로 소화하고, 바큘로바이러스 발현 플라스미드 pFastBac1의 제한효소 Sal I-Pst I 소화단편에 도입하고, HBs 단백질의 내부(서열번호 2의 127-128번 위치의 사이)에 HPV-L2 펩티드(서열번호 1의 56∼75번째의 20아미노산)가 삽입된 키메라 단백질(이하, 「56/75-127번 위치 도입 키메라」라고 언급하기도 한다.)을 코딩하는 DNA 단편을 가지는 pFB1-HBsS56/75-127을 구축했다.
(3) C말단 도입 키메라 유전자의 구축과 바큘로바이러스 발현 플라스미드 pFB1-HBsS56/75-N의 구축
상술한 pYG100L을 템플레이트에, 상술한 Primer F와 이하에 나타낸 Primer CR을 사용해서 PCR증폭했다.
Primer CR; 5'-ctgcagTTACAATGGAATATACCCAGTGCGTCCGCCTGTACCCGACCCTGTTCCAATTCCTAACCCACCAATGTATACCCAAAGACAAA (서열번호 23)
아가로스겔 전기영동으로 목적 사이즈의 약 750 bp의 밴드를 확인했다. 이 밴드를 제한효소 Sal I-Pst I로 소화하고, 바큘로바이러스 발현 플라스미드 pFastBac1의 제한효소Sal I-Pst I 소화단편에 도입하고, HBs 단백질의 C말단에 HPV-L2 펩티드(서열번호 1의 56∼75번째의 20아미노산)가 부가된 키메라 단백질(이하, 「56/75-C말단 도입 키메라」라고 언급하기도 한다.)을 코딩하는 DNA 단편을 가지는 발현 플라스미드 pFB1-HBsS56/75-N을 구축했다.
(4) HBs 유전자의 구축과 바큘로바이러스 발현 플라스미드 pFB1-HBsS의 구축
대조의 HBs 유전자에 대해서도 유전자 양단에 제한효소 인식부위를 도입할 목적으로, 상술한 pYG100L을 템플레이트에, Primer F와 Primer R을 사용해서 PCR 증폭했다. 아가로스겔 전기영동으로 목적 사이즈의 약 690 bp의 밴드를 확인했다. 이 밴드를 제한효소 Sal I-Pst I로 소화하고, 바큘로바이러스 발현 플라스미드 pFastBac1의 제한효소 Sal I-Pst I소화단편에 도입하고, HBs 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 가지는 HBs 발현 플라스미드 pFB1-HBsS를 구축했다.
실시예 1
《동물세포 발현 플라스미드의 구축》
조제예에 기재된 (1) ∼ (4)의 발현 플라스미드를 제한효소 Sal I, Xho I로 소화하고, HPV-L2 펩티드와 HBs 단백질의 키메라 단백질을 코딩하는 DNA 단편 및 HBs 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 아가로오스 전기영동으로 추출했다. (1) ∼ (4)로부터 수득된 DNA 단편을 각각 56/75-N말단 도입 키메라 DNA 단편, 56/75-127번 위치도입 키메라 DNA 단편, 56/75-C말단 도입 키메라 DNA 단편, 및 HBsDNA 단편이라고 부른다.
이어서, 상기의 각 DNA 단편과, 미리 제한효소 Sal I로 소화하고, 송아지 소장 유래 알칼리포스파타제 처리에 의해 말단 탈인산화한 동물 세포용 발현 플라스미드 pCAGG-S1(Sal).dhfr.neo(WO2003/004641)을 Ligation High(TOYOBO사)로 연결 환상화하고, 56/75-N말단 도입 키메라 동물세포 발현 플라스미드(pCAGG.HBs56/75-N.dhfr.neo), 56/75-127번 위치 도입 키메라 동물세포 발현 플라스미드(pCAGG.HBs56/75-127.dhfr.neo), 56/75-C말단 도입 키메라 동물세포 발현 플라스미드(pCAGG.HBs56/75-C.dhfr.neo) 및 HBs 동물세포 발현 플라스미드(pCAGG.HBs56/75-N.dhfr.neo)를 구축했다.
실시예 2
《차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 사용한 키메라 유전자의 발현》
실시예 1에서 얻은 4종의 동물세포 발현 플라스미드를 각각 제한효소 Pvu I로 소화해서 선상화했다. 이 선상화된 플라스미드를 사용해서, CHO K1(FT Kao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 1275-1281p, 1968) 을 인산 칼슘법변법(C. Chen et al., Mol. Cell. Biol., 7, 2745-2752p, 1987)으로 형질 전환 처리했다. 형질 전환 처리 후, 100, 200, 500 nmol/L메토트렉세이트(MTX)와 500㎍/㎖의 GENETICIN을 포함하는 투석 소태아혈청, 및 칼슘, 마그네슘 첨가한 YMM-01C 배지(핵산 비함유 MEM 알파 배지에 아미노산, 비타민을 강화하고, 칼슘, 마그네슘을 포함하지 않는 자가 조제 배지; 이하, 「선택 배양지」라고 한다)에서 형질 전환체를 선택했다.
수득된 형질 전환체를, 0.25% 트립신을 사용해서 세포박리하고, 상술한 선택 배양지를 사용해서 세포의 확장을 실시했다. 확장 후, PBS(-)로 세정하고, 무혈청 배지(T7m: Ex-cell SP2/0; YMM-01B 3종 혼합배지(SAFC사의 특별 주문배지))로 배지 교환했다. 37℃에서 11일간 배양 후, 배양 상청액 중의 발현 단백질의 농도를 항HBs 모노클로널 항체를 사용한 샌드위치 ELISA로 정량했다. 그 결과, 56/75-C말단 도입 키메라의 발현량이 가장 많고, 이어서 56/75-127번 위치 도입 키메라, 56/75-N말단 도입 키메라의 순이었다. 56/75-C말단 도입 키메라의 발현량은 대조로 한 미도입 HBs 단백질의 2배 이상이었다(도 1).
실시예 3
《세포배양 상청액으로부터 키메라 단백질의 정제》
실시예 2에 의해 수득된 3종의 키메라 단백질 및 HBs 단백질을 발현하는 CHO K1세포를 선택 배양지를 사용해서 확장했다. 확장 후, PBS(-)로 세정 후, 무혈청 배지(T7m; Ex-cell SP2/0; YMM-01B 3종 혼합배지)로 배지 교환하고, 37℃, 10일간 이상 배양했다. 배양액을 원심분리로 청징화한 후, BENZONASE(Merck사) 공존 하, 배제한계 1,000 kDa의 카트리지식 UF(Vivacell100; Sartorius사)로 배양 상청액을 농축했다. 농축 후, PBS(-)에 버퍼 치환을 실시하고, 염화세슘을 1.2 g/ℓ의 밀도가 되도록 첨가한 후, 4℃, 23,000×g로 초원심분리를 실시했다. 키메라 단백질 또는 HBs 단백질을 포함하는 밴드를 추출하고, 배제한계 300kDa의 UF카트리지(Vivaspin; Sartorius사)에 의한 탈염, PBS(-)로의 버퍼 치환 후, 60%, 50%, 40%, 20% 자당을 포함하는 PBS(-)를 중층한 원심관에 키메라 단백질 또는 HBs 단백질을 포함하는 PBS(-)을 첨가한 불연속 밀도 구배 자당의 초원심분리를 실시했다. 4℃, 120,000×g의 원심조건으로 분리를 실시한 후, 키메라 단백질 또는 HBs 단백질을 포함하는 밴드를 추출하고, 배제한계 300 kDa의 UF카트리지로 탈당, PBS(-)로의 버퍼 교환을 실시했다. 수득된 키메라 단백질 및 HBs 단백질은 모두 바이러스 유사입자(VPL)를 형성하고 있었다.
실시예 4
《키메라 단백질의 마우스로의 면역》
실시예 3에서 수득된 키메라 단백질 및 HBs 단백질에 알루미늄 애주번트를 첨가해서 50㎍/㎖의 각 면역원을 조제하고, 각 0.1㎖를 암컷 Balb/c 마우스의 대퇴부에 근육 주사했다(각 그룹 10마리씩). 접종 후, 4주째에서 채혈해서 얻은 항혈청(1차 면역혈청) 및 첫회 접종으로부터 4주째에 동일 면역원을 상기와 동일하게 접종 후, 8주째에서 채혈해서 얻은 항혈청(2차 면역혈청)을 얻었다. 대조로서, 비투여그룹, 및 HPV-L2 유래 서열(서열번호 4)의 N말단에 Cys를 부가시킨 합성 펩티드와 KLH와의 컨쥬게이트에 알루미늄 애주번트를 첨가한 면역원을 투여한 그룹을 사용했다.
실시예 5
《동일 유전자형 유래 HPV-L2 펩티드와 항혈청의 반응성》
실시예 4에서 수득된 개체별의 1차 면역혈청 또는 이것들의 혼주 항혈청(개체별의 항혈청을 등량씩 혼합)을 사용해서, ELISA에 의해, 동일 유전자형 유래의 HPV-L2 펩티드에 대한 항체 생산능을 평가했다. 더 구체적으로는, 96 well ELISA 플레이트의 각 well에, PBS로 희석한 HPV의 16형의 L2 단백질(서열번호 1)의 56∼75번째의 20아미노 서열로 이루어지는 합성 펩티드(서열번호 4)(1.0㎍/well)를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 스탠딩했다. 블록킹 용액(1% BSA, 0.05% Tween20을 포함하는 PBS)으로 실온, 2시간 블록킹하고, 항원 고상화 플레이트로 했다. 블록킹 용액으로 1:100로 희석한 각 혈청을, 고상화한 펩티드와 실온에서 2시간 반응시켰다. PBST(0.05% Tween20 을 포함하는 PBS)로 세정 후, 블록킹 용액으로 1:2000로 희석한 호스래시디 페록시다아제(HRP) 표지 항 마우스 IgG 항체(Santa Cruz: sc-2031)를 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 세정 후, 기질용액(TMB+(DAKO사))을 첨가하고, 실온에서 10분 반응시킨 후, 450nm의 흡광도를 측정했다. 그 결과, 56/75-C말단 도입 키메라 면역그룹에서는 조기에 항체가 유도되고, 이 혼주혈청은 KLH컨쥬게이트 면역그룹보다 5배 정도 높은 항체가를 나타냈다(도 2). 또, 개체별의 항혈청에서 수득된 항체가의 평균값을 사용해서 t검정에 의한 검증을 실시한 결과, 양자간에 유의차가 인정되었다(p<0.05)(도 3). 또, 56/75-127번 위치 도입 키메라 면역그룹 및 56/75-N말단 도입 키메라 면역그룹의 항혈청 중에도 그 합성 펩티드와 결합하는 항체가 확인되었다.
실시예 6
《다른 유전자형 유래의 HPV-L2 펩티드와 항혈청의 반응성》
실시예 4에서 수득된 개체별의 1차 면역혈청 또는 이것들의 혼주 항혈청(개체별의 항혈청을 등량씩 혼합)을 사용해서, 실시예 5와 동일한 방법에 의해, 다른 유전자형 유래의 공통 영역의 HPV-L2 펩티드에 대한 결합능을 평가했다(HPV 18형, HPV 59형 및 HPV 68형은, HPV의 16형과 동일한 서열을 갖는다). 이하의 아미노산 서열로 나타내는 합성 펩티드를 사용했다. 또, 이하의 아미노산 서열에 있어서, *는 HPV 16형과 동일한 아미노산인 것임을 나타낸다.
고리스크형
HPV16-L2-56/75 56-GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (서열번호 4)
HPV31-L2-56/75 56-******S**********V** (2 아미노산 치환)(서열번호 5)
HPV33-L2-55/74 55-**********S******V*I (3 아미노산 치환)(서열번호 6)
HPV35-L2-56/75 56-******S*******S**V** (3 아미노산 치환)(서열번호 7)
HPV39-L2-55/74 55-********T*********** (1 아미노산 치환)(서열번호 8)
HPV45-L2-55/74 55-**********S******V** (2 아미노산 치환)(서열번호 9)
HPV51-L2-55/74 55-**********S********* (1 아미노산 치환)(서열번호 10)
HPV52-L2-55/74 55-********A*S***A**V** (4 아미노산 치환)(서열번호 11)
HPV56-L2-55/74 55-********T*S***A**V** (4 아미노산 치환)(서열번호 12)
HPV58-L2-55/74 55-*****************V** (1 아미노산 치환)(서열번호 13)
HPV66-L2-55/74 55-**********S***A**V** (3 아미노산 치환)(서열번호 14)
HPV73-L2-57/76 57-******S***S******V** (3 아미노산 치환)(서열번호 15)
계 12종
저리스크형
HPV6-L2-55/74 55-*****************V** (1 아미노산 치환)(서열번호 16)
HPV11-L2-54/73 54-********A*S***A***** (3 아미노산 치환)(서열번호 17)
계 2종
키메라 단백질 면역그룹의 항혈청은 모두 상기의 모든 합성 펩티드와 반응하는 것이 확인되었다. 특히 56/75-C말단 도입 키메라 면역그룹에서는 다른 그룹에 비해 높은 항체가를 나타냈다(도 4).
실시예 7
《항혈청 중의 HBs 항체가의 측정》
실시예 4에서 수득된 개체별의 1차 면역혈청을 등량씩 혼합한 혼주 항혈청에 대해서, HBs 단백질에 대한 항체가를 측정했다. 그 혼주 항혈청을 PBS(-)로 10배 단계 희석해서(10, 100, 1,000배), B형 간염 바이러스 표면항체 키트 E테스트 「TOSOH」II(HBsAb; TOSOH CORPORATION.)을 사용해서 전자동 엔자임 이뮤노어세이 장치 AIA-360로 항체가를 측정했다.
어느 쪽의 키메라 단백질 면역그룹에 있어서도, HBs 단백질에 반응하는 항체가 검출되었다. 56/75-N말단 도입 키메라 면역그룹 및 56/75-C말단 도입 키메라 면역그룹은 HBs 단백질 단독 면역그룹과 동일한 높은 항체가가 수득되었지만, 56/75-127 번 위치 도입 키메라 면역그룹에서는 항체가 상승이 약 1/10로 억제되고 있었다(도 5).
실시예 8
《항혈청의 에피토프 해석》
실시예 4에서 수득된 개체별의 2차 면역혈청을 등량씩 혼합한 혼주 항혈청에 대해서, 이하의 아미노산 서열로 나타내는 합성 펩티드를 사용한 ELISA에 의해, HPV-L2 펩티드에 대한 결합능을 평가했다. 구체적으로는, HPV16 L2의 아미노산 53으로부터 75의 서열에, 결실, 혹은 알라닌 치환을 가지는 돌연변이 펩티드를, N말단에 부가한 시스테인을 통해서 BSA에 결합시킨 것을 항원으로 사용했다. 96 well ELISA 플레이트의 각 well에, PBS로 희석한 BSA 결합 펩티드(500 ng/well)를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 스탠딩했다. 블록킹 용액(5% 스킴밀크, 0.1% Tween20을 포함하는 PBS)으로 실온, 2시간 블록킹하고, 항원 고상화 플레이트로 했다. 블록킹 용액으로 1:100에서 1:2500까지 단계 희석한 각 혈청을, 고상화된 펩티드와 실온에서 2시간 반응시켰다. PBST(0.1% Tween20 을 포함하는 PBS)로 세정 후, 블록킹 용액으로 1:2000으로 희석한 호스래시디 페록시다아제(HRP) 표지 항 마우스 IgG 항체(Santa Cruz: sc-2031)를 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 세 정후, 기질용액(2g㎎/㎖의 o-페닐렌디아민, 및, 0.0065%의 과산화 수소수를 포함하는 0.1M 시트르산3나트륨, pH4.8)을 첨가하고, 실온에서 10분 반응시킨 후, 450nm의 흡광도를 측정했다.
HPV16-L2-14/27 14-SATQLYKTCKQAGT (서열번호 24)
HPV16-L2-53/73 53-VFFGGLGIGTGSGTGGRTGYI (서열번호 25)
HPV16-L2-53/70 53-VFFGGLGIGTGSGTGGRTAAA (서열번호 26)
HPV16-L2-53/67 53-VFFGGLGIGTGSGTGAAAAAA (서열번호 27)
HPV16-L2-53/64 53-VFFGGLGIGTGSAAAAAAAAA (서열번호 28)
HPV16-L2-55/75 55-FGGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (서열번호 29)
HPV16-L2-58/75 58-AAALGIGTGSGTGGRTGYIPL (서열번호 30)
HPV16-L2-60/75 60-AAAAAAGTGSGTGGRTGYIPL (서열번호 31)
HPV16-L2-64/75 64-AAAAAAAAASGTGGRTGYIPL (서열번호 32)
그 결과, 어느 쪽의 면역그룹도 높은 항체가를 가지고, 56/75-127번 위치 도입 키메라 면역그룹에서는, 코어서열 영역(20아미노산)의 N말단측 및 C말단측의 2부분의 아미노산 서열(N말단측 및 C말단측 에피토프)을 인식하는 항체가 유도되고, 56/75-N말단 도입 키메라 면역그룹 및 56/75-C말단 도입 키메라 면역그룹에서는 C말단측의 아미노산 서열(C말단측 에피토프)을 인식하는 항체가 유도되는 것이 나타났다(도 6).
실시예 9
《다른 유전자형 유래의 HPV-바이러스 유사입자(VLP)과 항혈청의 반응성》
실시예 4에서 수득된 개체별의 2차 면역혈청(56/75-127번 위치 도입 키메라 면역그룹)을 등량씩 혼합한 혼주 항혈청에 대해서, 이하의 방법에 의해, HPV-VLP에 대한 결합능을 평가했다.
(1) VLP의 제작
HPV 16 , 18, 31, 33, 35, 51, 52, 또는 58의 L1, 및, L2 발현 플라스미드를 293FT세포(Invitrogen)에 트랜스펙션했다. 2일 후, 세포를 Lysis Buffer(0.35% Brij58, 0.9mM CaCl2, 10mM MgCl2, 1㎕ Benzonase를 포함하는 PBS)에 용해하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이트했다. 최종농도 0.8M가 되도록 5M NaCl을 첨가하고 얼음 중에 10분간 스탠딩한 후, 10,000g, 4℃, 10분간 원심하고, 상청액을 회수했다. 상청액을 27%, 33%, 39%의 iodixanol (0.8M NaCl in PBS로 조정) 위에 중층하고, 50,000rpm, 16℃, 3.5시간 초원심했다. 초원심 후, VLP를 포함하는 프랙션을 회수했다.
(2) ELISA
96 well ELISA 플레이트의 각 well에, PBS로 희석한 VLP(100 ng/well)를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 스탠딩했다. 블록킹 용액(5% 스킴밀크, 0.1% Tween20을 포함하는 PBS)으로 실온, 2시간 블록킹하고, 항원 고상화 플레이트로 했다. 블록킹 용액으로 1:20에서 1:20000까지 단계 희석한 각 혈청을, 고상화된 VLP와 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후에 펩티드를 항원으로 하는 ELISA와 동일한 방법으로, VLP에 결합한 항체를 검출했다. 그 결과, 모든 HPV-VLP와 결합하고, HPV에 대해서 넓은 스펙트럼을 가지는 것이 나타났다(도 7).
실시예 10
《다른 유전자형 유래의 HPV-가짜 바이러스(PsV)와 항혈청의 반응성》
실시예 4에서 수득된 개체별의 2차 면역혈청(56/75-127번 위치 도입 키메라 면역그룹)을 등량씩 혼합한 혼주 항혈청에 대해서, 이하의 방법에 의해, HPV-PsV에 대한 중화능을 평가했다.
(1) PsV의 제작
HPV 16 , 18, 또는 35의 L1, 및, L2 발현 플라스미드와 분비형 알칼리포스파타아제(SEAP) 발현 플라스미드를 혼합하고, 293FT 세포로 트랜스펙션 했다. 2일 후에, VLP와 동일한 방법으로 PsV를 정제했다.
(2) 중화시험
세포 배양용 배지(10% FBS를 포함하는 페놀 레드 비함유 DMEM)에서 희석한 PsV와, 1:12.5에서 1:400까지 동일 배지에서 단계 희석한 각 혈청을 등량씩 혼화하고, 4℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후에 미리 96웰 플레이트에 준비한 293FT 세포(1×104개/well)에 감염시켰다. 3일 후에, 배양 상청액 중의 SEAP 활성을, Great EscAPe SEAP Assay Kit (Clontech)과 플레이트리더(ARVO MX, PerkinElmer)를 사용해서 측정했다. 그 결과, 어느 쪽의 가짜 바이러스에 대해서도 명확한 중화 활성이 인정되었다(도 8a∼도8c).
(산업상의 이용 가능성)
본원발명의 키메라 단백질은 인간 유두종 바이러스(HPV)감염증 및 B형 간염에 대한 예방약의 재료로 이용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE <120> A vaccine against HPV infection and/or Hepatitis B containing an HPV/HBs chimera protein as active ingredient <130> 671762 <150> JP 2012-280850 <151> 2012-12-25 <160> 32 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 473 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 1 Met Arg His Lys Arg Ser Ala Lys Arg Thr Lys Arg Ala Ser Ala Thr 1 5 10 15 Gln Leu Tyr Lys Thr Cys Lys Gln Ala Gly Thr Cys Pro Pro Asp Ile 20 25 30 Ile Pro Lys Val Glu Gly Lys Thr Ile Ala Glu Gln Ile Leu Gln Tyr 35 40 45 Gly Ser Met Gly Val Phe Phe Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser 50 55 60 Gly Thr Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ile Pro Leu Gly Thr Arg Pro Pro 65 70 75 80 Thr Ala Thr Asp Thr Leu Ala Pro Val Arg Pro Pro Leu Thr Val Asp 85 90 95 Pro Val Gly Pro Ser Asp Pro Ser Ile Val Ser Leu Val Glu Glu Thr 100 105 110 Ser Phe Ile Asp Ala Gly Ala Pro Thr Ser Val Pro Ser Ile Pro Pro 115 120 125 Asp Val Ser Gly Phe Ser Ile Thr Thr Ser Thr Asp Thr Thr Pro Ala 130 135 140 Ile Leu Asp Ile Asn Asn Thr Val Thr Thr Val Thr Thr His Asn Asn 145 150 155 160 Pro Thr Phe Thr Asp Pro Ser Val Leu Gln Pro Pro Thr Pro Ala Glu 165 170 175 Thr Gly Gly His Phe Thr Leu Ser Ser Ser Thr Ile Ser Thr His Asn 180 185 190 Tyr Glu Glu Ile Pro Met Asp Thr Phe Ile Val Ser Thr Asn Pro Asn 195 200 205 Thr Val Thr Ser Ser Thr Pro Ile Pro Gly Ser Arg Pro Val Ala Arg 210 215 220 Leu Gly Leu Tyr Ser Arg Thr Thr Gln Gln Val Lys Val Val Asp Pro 225 230 235 240 Ala Phe Val Thr Thr Pro Thr Lys Leu Ile Thr Tyr Asp Asn Pro Ala 245 250 255 Tyr Glu Gly Ile Asp Val Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ser Ser Asn Asp 260 265 270 Asn Ser Ile Asn Ile Ala Pro Asp Pro Asp Phe Leu Asp Ile Val Ala 275 280 285 Leu His Arg Pro Ala Leu Thr Ser Arg Arg Thr Gly Ile Arg Tyr Ser 290 295 300 Arg Ile Gly Asn Lys Gln Thr Leu Arg Thr Arg Ser Gly Lys Ser Ile 305 310 315 320 Gly Ala Lys Val His Tyr Tyr Tyr Asp Leu Ser Thr Ile Asp Pro Ala 325 330 335 Glu Glu Ile Glu Leu Gln Thr Ile Thr Pro Ser Thr Tyr Thr Thr Thr 340 345 350 Ser His Ala Ala Ser Pro Thr Ser Ile Asn Asn Gly Leu Tyr Asp Ile 355 360 365 Tyr Ala Asp Asp Phe Ile Thr Asp Thr Ser Thr Thr Pro Val Pro Ser 370 375 380 Val Pro Ser Thr Ser Leu Ser Gly Tyr Ile Pro Ala Asn Thr Thr Ile 385 390 395 400 Pro Phe Gly Gly Ala Tyr Asn Ile Pro Leu Val Ser Gly Pro Asp Ile 405 410 415 Pro Ile Asn Ile Thr Asp Gln Ala Pro Ser Leu Ile Pro Ile Val Pro 420 425 430 Gly Ser Pro Gln Tyr Thr Ile Ile Ala Asp Ala Gly Asp Phe Tyr Leu 435 440 445 His Pro Ser Tyr Tyr Met Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Leu Pro Tyr 450 455 460 Phe Phe Ser Asp Val Ser Leu Ala Ala 465 470 <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 2 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 3 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Xaa Gly Xaa Gly Xaa Gly Gly Arg Xaa Gly 1 5 10 15 Tyr Xaa Pro Xaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 4 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Gly Arg Thr Gly 1 5 10 15 Tyr Ile Pro Leu 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 5 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Gly Arg Thr Gly 1 5 10 15 Tyr Val Pro Leu 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 6 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Gly 1 5 10 15 Tyr Val Pro Ile 20 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 7 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Gly Arg Ser Gly 1 5 10 15 Tyr Val Pro Leu 20 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 8 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Arg Thr Gly Tyr 1 5 10 15 Ile Pro Leu <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 9 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Gly 1 5 10 15 Tyr Val Pro Leu 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 10 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Gly 1 5 10 15 Tyr Ile Pro Leu 20 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 11 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ala Gly Ser Gly Gly Arg Ala Gly 1 5 10 15 Tyr Val Pro Leu 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 12 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Thr Gly Ser Gly Gly Arg Ala Gly 1 5 10 15 Tyr Val Pro Leu 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 13 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Gly Arg Thr Gly 1 5 10 15 Tyr Val Pro Leu 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 14 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly Gly Arg Ala Gly 1 5 10 15 Tyr Val Pro Leu 20 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 15 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Gly 1 5 10 15 Tyr Val Pro Leu 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 16 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Gly Arg Thr Gly 1 5 10 15 Tyr Val Pro Leu 20 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> human papillomavirus <400> 17 Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ala Gly Ser Gly Gly Arg Ala Gly 1 5 10 15 Tyr Ile Pro Leu 20 <210> 18 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5' Primer to obtain a chimera protein that HPV L2 peptide is added to the N-terminal site of HBs protein by PCR. <400> 18 gtcgacatgg gtgggttagg aattggaaca gggtcgggta caggcggacg cactgggtat 60 attccattgg agaacacaac atcaggatt 89 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3' Primer to obtain a chimera protein that HPV L2 peptide is added to the N-terminal site of HBs protein by PCR. <400> 19 ctgcagttaa atgtataccc aaagac 26 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5' Primer to obtain a chimera protein that HPV L2 peptide is added to the C-terminal site of the peptide consisting of the N-terminal half of HBs protein by PCR. <400> 20 gtcgacatgg agaacacaac atcagg 26 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3' Primer to obtain a chimera protein that HPV L2 peptide is added to the C-terminal site of the peptide consisting of the N-terminal half of HBs protein by PCR. <400> 21 tccgcctgta cccgaccctg ttccaattcc taacccacca ggaatcgtgc aggtcttgca 60 <210> 22 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5' Primer to obtain a chimera protein that HPV L2 peptide is added to the N-terminal site of the peptide consisting of the C-terminal half of HBs protein by PCR. <400> 22 cagggtcggg tacaggcgga cgcactgggt atattccatt ggctcaagga acctctatgt 60 <210> 23 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3' Primer to obtain a chimera protein that HPV L2 peptide is added to the C-terminal site of HBs protein by PCR. <400> 23 ctgcagttac aatggaatat acccagtgcg tccgcctgta cccgaccctg ttccaattcc 60 taacccacca atgtataccc aaagacaaa 89 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Human papillomavirus <400> 24 Ser Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Thr Cys Lys Gln Ala Gly Thr 1 5 10 <210> 25 <211> 21 <212> PRT <213> Human papillomavirus <400> 25 Val Phe Phe Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Gly 1 5 10 15 Arg Thr Gly Tyr Ile 20 <210> 26 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A HPV L2-derived peptide to which three alanines are added at its C-terminal. <400> 26 Val Phe Phe Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Gly 1 5 10 15 Arg Thr Ala Ala Ala 20 <210> 27 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A HPV L2-derived peptide to which six alanines are added at its C-terminal. <400> 27 Val Phe Phe Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Ala 20 <210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A HPV L2-derived peptide to which nine alanines are added at its C-terminal. <400> 28 Val Phe Phe Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Ala 20 <210> 29 <211> 21 <212> PRT <213> Human papillomavirus <400> 29 Phe Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Gly Arg Thr 1 5 10 15 Gly Tyr Ile Pro Leu 20 <210> 30 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A HPV L2-derived peptide to which three alanines are added at its N-terminal. <400> 30 Ala Ala Ala Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Gly Arg Thr 1 5 10 15 Gly Tyr Ile Pro Leu 20 <210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A HPV L2-derived peptide to which five alanines are added at its N-terminal. <400> 31 Ala Ala Ala Ala Ala Ile Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Gly Arg Thr 1 5 10 15 Gly Tyr Ile Pro Leu 20 <210> 32 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A HPV L2-derived peptide to which nine alanines are added at its N-terminal. <400> 32 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Thr Gly Gly Arg Thr 1 5 10 15 Gly Tyr Ile Pro Leu 20

Claims (18)

  1. 인간 유두종 바이러스(HPV) L2 단백질 유래의 펩티드(HPV-L2 펩티드)와 B형 간염 바이러스 표면 단백질(HBs 단백질)과의 키메라 단백질로써,
    HPV-L2 펩티드가,
    (1) 20아미노산의 코어서열 영역으로 이루어지는 펩티드,
    (2) Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly인 6아미노산을 가지는 코어서열 영역 내의 펩티드, 또는
    (3) 코어서열 영역의 N말단측 및/또는 C말단측에 HPV L2 단백질 유래의 아미노산이 부가된 70개 이하의 아미노산으로 이루어지는 펩티드인 상기 키메라 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, HPV-L2 펩티드가 코어서열 영역으로 이루어지는 키메라 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 코어서열 영역이 Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-X1aa-Gly-X2aa-Gly-X3aa-Gly-Gly-Arg-X4aa-Gly-Tyr-X5aa-Pro-X6aa(X1aa, X2aa, X3aa, X4aa, X5aa 및 X6aa는 임의의 아미노산이라 한다.)(서열번호 3)로 나타내는 서열인 키메라 단백질.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 코어서열 영역이 하기 (1) 내지 (6)에서 선택되는 아미노산을 가지는 서열인 키메라 단백질.
    (1) X1aa = Thr 또는 Ser,
    (2) X2aa = Ser, Thr 또는 Ala,
    (3) X3aa = Thr 또는 Ser,
    (4) X4aa = Ser, Thr 또는 Ala
    (5) X5aa = Ile 또는 Val, 및
    (6) X6aa = Leu 또는 Ile.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 코어서열 영역이 Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu(서열번호 4)로 이루어지는 아미노산 서열인 키메라 단백질.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 1∼11개의 HPV-L2 펩티드를 포함하는 키메라 단백질.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 HBs 단백질의 N말단 아미노산, 서열번호 2의 127-128번 위치, 또는 C말단 아미노산의 적어도 1개소에 부가 또는 삽입된 키메라 단백질.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 펩티드가 HBs 단백질의 서열번호 2의 127-128번 위치에 삽입된 키메라 단백질.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 펩티드가 HBs 단백질의 C말단 아미노산에 부가된 키메라 단백질.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 펩티드가 HBs 단백질의 서열번호 2의 127-128번 위치에 삽입 및 C말단 아미노산에 부가된 키메라 단백질.
  11. 인간 유두종 바이러스(HPV) L2 단백질 유래의 펩티드(HPV-L2 펩티드)와 B형 간염 바이러스 표면 단백질(HBs 단백질)의 키메라 단백질로써,
    HPV-L2 펩티드가 20아미노산으로 이루어지고, Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Tyr-Ile-Pro-Leu(서열번호 4)인 아미노산 서열에 대한 상동성이 50-100%, 70-100% 또는 80-100％인 상기 키메라 단백질.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 단백질을 코딩하는 DNA 단편.
  13. 상기 DNA 단편에 코딩되는 키메라 단백질을 발현할 수 있는 발현벡터.
  14. 상기 발현벡터로 형질 전환된 키메라 단백질 생산 숙주.
  15. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 단백질을 유효성분으로 함유하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 백신.
  16. 제 8 항에 기재된 키메라 단백질 및 제 9 항에 기재된 키메라 단백질을 유효성분으로 함유하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 백신.
  17. 제 13 항에 기재된 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 DNA 백신.
  18. 하기 (1) 내지 (5)의 공정을 포함하는 인간 유두종 바이러스(HPV) L2 단백질 유래의 펩티드(HPV-L2 펩티드)와 B형 간염 바이러스 표면 단백질(HBs 단백질)의 키메라 단백질을 유효성분으로 함유하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 백신의 제조방법;
    (1) 20아미노산의 코어서열 영역으로 이루어지는 HPV-L2 펩티드, Gly-Gly-Leu-Gly-Ile-Gly 이루어지는 6아미노산을 가지는 코어서열 영역 내의 HPV-L2 펩티드, 또는, 코어서열 영역의 N말단측 및/또는 C말단측에 HPV L2 단백질 유래의 아미노산이 부가된 70개 이하의 아미노산으로 이루어지는 HPV-L2 펩티드와 HBs 단백질의 키메라 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 조제하는 공정,
    (2) 상기 (1)의 DNA 단편을 가지는 발현벡터를 조제하고, 그 발현벡터로 숙주를 형질 전환하는 공정,
    (3) 상기 (2)에 의해 수득되는 형질 전환 숙주를 Geneticin 및 MTX의 존재 하에서 배양하고, 키메라 단백질 생산 형질 전환 숙주를 선택하는 공정,
    (4) 상기 (3)에 의해 수득되는 키메라 단백질 생산 형질 전환 숙주를 확장 배양하고, 배양물로부터 상기 키메라 단백질을 정제하는 공정, 및
    (5) 상기 (4)에 의해 수득되는 정제 키메라 단백질에 애주번트, 안정화제, 완충제, 등장화제 및 보존제를 첨가하고, 백신으로 하는 공정.
KR1020157020040A 2012-12-25 2013-11-28 HPV/HBs 키메라 단백질을 유효성분으로 하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 백신 KR20150099601A (ko)

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