KR101640147B1 - 변성된 아밀로이드 베타 펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 목적은 알츠하이머병의 예방 및 치료제로서 안전하고 효과적인 면역 반응을 증강할 수 있는 아밀로이드β의 서열을 기초로 하는 펩티드를 제공하는 것이다. 시스테인 또는 그의 유사체가 첨가 또는 삽입된 아밀로이드β 펩티드 또는 그의 일부, 및 상기 펩티드를 사용한 아밀로이드β에 대한 면역 반응 증강방법, 상기 면역 반응 증강 아밀로이드β 펩티드를 사용한 알츠하이머병의 예방 및 치료제, 동등한 효과가 기대되는 시스테인 또는 시스테인 유사체가 첨가 또는 삽입된 아밀로이드β 펩티드 또는 그에서 유래한 펩티드를 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 벡터.
Description
본 발명은 아밀로이드 β(이하, "Aβ"라 칭함.) 펩티드의 면역 반응 유도능을 증강하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 알츠하이머병의 원인 물질인 Aβ에서 유래하는 펩티드 또는 그의 일부에 시스테인 또는 그의 유사체를 첨가 또는 삽입하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병의 예방 및 치료를 위한 약제에 관한 것이다.
알츠하이머병은 뇌가 점차적으로 위축됨에 따른 인지 능력 저하 및 인격 변화를 주요 증상으로 하는 치매성 질환의 일종이다. 고령화 사회가 진행됨에 따라, 알츠하이머병 환자수는 계속 증가하고 있으며, 일본, 미국, 유럽에서는 환자수가 2004년 560만에서 2014년에는 730만명 규모가 될 것으로 예상된다. 따라서, 알츠하이머병에 대한 예방 및 치료약의 조기 개발이 강력히 요구되고 있다.
알츠하이머병의 병리학적 증상은 신경세포의 위축 및/또는 탈락, Aβ의 응집 및/또는 침착으로 인한 노인성 반점의 형성, 및 이상단백질로 인한 신경원섬유 변화 등의 3가지 특징을 포함한다. 알츠하이머병은 크게 가족성 알츠하이머병과 고립성 알츠하이머병으로 분류된다. 전자는 원인 유전자 변이를 동정하고 그의 표현형을 확인하여 뇌 안에서 아밀로이드 β 펩티드, 특히 42개의 아미노산 잔기를 포함하는 Aβ1-42의 생성 증가가 근본적 원인인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 엄밀한 의미에서 가족성 알츠하이머병으로 진단된 환자는 전체 환자 중 1% 이하였다. 질환의 원인 규명이 시급한 환자의 99% 이상을 차지하는 것은 고립성 알츠하이머병이다. 고립성 알츠하이머병은 동정되지 않은 유전적 위험인자의 중복, 열성 유전자의 존재, 환경위험인자의 존재 등이 원인으로 생각되고 있다. 현재는 상기한 가족성 알츠하이머병의 유전자 변이가, 결과적으로 응집성이 높은 Aβ42를 증가시키는 점에서 일치하고 있는 것을 근거로 하여 병리학적으로 같은 경과를 거치는 고립성 알츠하이머병의 원인도 Aβ42의 증가가 주요 원인이라고 생각되고 있다. 이러한 고찰은 아밀로이드 가설이라 불리며, 현재 이러한 가설에 기초하여 치료에 대한 연구가 진행되고 있다.
Aβ는 그의 전구체 단백질에서 막결합형 아스파라긴산 프로테아제에 의해 절단되어 생성된다. Aβ의 N 말단을 β-세크리타제(secretase)가, C 말단을 γ-세크리타제가 절단한다. 절단된 Aβ는 이후에 시냅스 활성에 의존하여 세포외로 분비된다. Aβ는 신속하게 자기응집하여 모노머 Aβ는 다이머, 트리머 및 가용성 올리고머를 거쳐서 전(前)섬유 구조체인 프로토피브릴(protofibril)을 형성한 후, 불용화된 아밀로이드 섬유를 형성하여 축적된다. 응집체가 된 가용성 Aβ 올리고머의 신경에 대한 네가티브한 작용이 알츠하이머병에 있어서 병태의 중요한 부분을 담당하고 있다는 생각이 현재 주류를 이루고 있다. 신경전달을 차단하는 가용성 Aβ 올리고머의 형태에 대한 수많은 보고들이 있으며, 다이머, 트리머, 아밀로스피로이드(amylospheroid)(53 kDA 응집체), Aβ56 (56 kDA 응집체) 및 40 아미노산 길이를 가지는 Aβ 응집체 등이 있다.
현재, 알츠하이머병의 발병 메카니즘에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보이는 Aβ를 클리어런스하는 것에 의한 치료방법이 널리 실시되고 있으며, 그 중 하나로서 Aβ에 대한 항체요법 연구가 있다. 안티Aβ 항체에 의해 Aβ를 클리어런스하는 작용 메카니즘은 항체의 Fc 수용체를 매개로 한 마이크로글리아(microglia)에 의한 포식, 섬유화 Aβ의 용해촉진 또는 응집억제 및 혈액 중 Aβ와 결합하여, 뇌에서 가용성 Aβ의 배출을 촉진하는 등을 포함하는 것으로 생각할 수 있어서 백신에 의한 안티Aβ 항체를 유도하는 능동면역과, 안티Aβ 항체 자체를 투여하는 수동면역 등의 2가지 방법이 제안되어 있다.
전자의 방법에 있어서는 Aβ 자체를 항원으로 하는 백신 AN1792가 제2상(相) 임상시험까지 진행되었지만, 시험 중에 6%의 환자에게 뇌수막염이 발병해, 임상시험이 중단되었다. 그러나, 항체 역가가 상승된 환자와 상승되지 않은 환자 간에 일부의 고차 기능에서의 차이가 관찰되었다(비특허문헌 1). 또한, 이 시험중 사망예의 뇌를 분석한 것에 따르면, 신피질에서 노인반이 사라졌다. 게다가 투여 전후의 MRI에서는 투여 그룹의 뇌의 체적이 플라시보 그룹과 비교하여 감소되었다. 이와 같이 부작용에 의해 임상시험은 중단되었지만, Aβ 자체를 항원으로 한 백신의 유효성도 입증되었다. 앞으로, 보다 안전한 백신의 개발이 기대된다
AN1792가 뇌수막염을 유발시키는 원인은 QS21이라는 강력한 아쥬반트를 사용하고 Aβ 서열 자체에 존재하는 T세포 에피토프에 의해서 유도된 세포성 면역의 결과로 생각된다. Aβ 서열 자체에 존재하는 T 세포 에피토프에 대해서는 수많은 연구가 수행되고 있으며, 적어도 Aβ 서열의 잔기 1 내지 10의 N 말단에서는 액성 면역을 유도하는 T 세포 에피토프가 존재하지만 세포성 면역을 유도하는 T 세포 에피토프는 없는 것으로 밝혀졌다(특허 문헌 2 내지 4).
선행기술 문헌
특허 문헌
비특허 문헌 1: Gilman S, Koller M, Black RS, Jenkins L, et al., NEUROLOGY, 2005; 64: p1553-1562
비특허 문헌 2: Michael G, Agadjanyan MG, et al., Journal of Immunology, 2005; 174: p1580-1586
비특허 문헌 3: Bard F, Barbour R, Cannon C, Carretto R, Fox M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: p2023-2028
비특허 문헌 4: Wanga CY. et al., Vaccine, 2007; 25: p3041-3052
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
상기한 바와 같이, Aβ의 전체 길이 서열과 QS21 등과 같은 강력한 아쥬반트와의 조합물에 의한 알츠하이머병의 백신 요법에는 부작용이 우려된다. 따라서, 보다 더 안전한 Aβ 펩티드의 형태와 더 안전한 아쥬반트의 조합물을 사용하는 보다 안전하고 효과적인 예방 및 치료 방법을 개발하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 목적은, Aβ 펩티드의 형태를 창안하여 보다 안전한 알츠하이머병의 백신 요법용 펩티드를 제공하는 것이다.
과제를 해결하기 위한 방법
본 발명자들은 지금까지 생체에 안전하고, 유효하며 저렴한 비용의 면역 방법 및 면역 증강 방법에 대해 연구한 결과, 목적하는 펩티드의 증강된 면역 반응을 유도하는 능력이 자연적으로 발생한 단백질을 구성하는 아미노산인 시스테인 잔기의 첨가 또는 삽입에 의해 증강되는 것을 발견하여 Aβ 펩티드의 전체 길이를 사용하지 않고 Aβ 펩티드의 일부 서열에 시스테인 분자를 첨가 또는 삽입하여 Aβ에 대한 증강된 면역 반응을 유도하는 특성을 얻을 수 있는 것을 입증하였다(PCT/JP2008/057612). 본 발명에 따라, 추가적인 연구에 의해 Aβ에 대한 증강된 면역 반응을 얻는 방법과 감소된 세포성 면역 반응을 유도할 것으로 기대되는 시스테인 분자가 첨가된 신규한 Aβ 펩티드를 발견하였다.
본 발명은 신규한 면역 반응 증강방법, 보다 구체적으로 면역원성 펩티드에 시스테인 분자를 첨가 또는 삽입하는 것을 특징으로 하는 면역 반응을 증강하는 방법에 관한 것으로, 다음과 같은 발명을 포함한다:
(1) 이하의 (A) 내지 (F)에서 선택되는, 아밀로이드 β 펩티드의 일부 또는 아밀로이드 β 펩티드에서 유래한 서열에 시스테인 또는 시스테인 유사체가 첨가 또는 삽입되는 것을 특징으로 하는 펩티드;
(A) (a) 서열번호 1의 N 말단부터 1 내지 18번째의 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드 또는 그 일부로 구성되는 펩티드와 (b) 서열번호 1의 N 말단부터 28 내지 42번째의 아미노산 잔기 중, 서열번호 1의 N 말단부터 28 내지 36번째 아미노산 잔기를 포함하는 9개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드를 결합시키고, 시스테인 또는 시스테인 유사체가 펩티드 (a)와 펩티드 (b)의 조합물의 C 말단에 결합된 펩티드；
(B) 서열번호 1의 N 말단부터 1 내지 26번째 또는 1 내지 27번째 아미노산 잔기로 구성되고, 시스테인 또는 시스테인 유사체가 N 말단부터 18번째와 19번째 아미노산 잔기 사이에 삽입된 펩티드；
(C) 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그 일부로 구성되고, 시스테인 또는 시스테인 유사체가 N 말단부터 18번째와 19번째 아미노산 잔기 사이에 삽입되고, 시스테인 또는 시스테인 유사체가 그 C 말단에 결합된 펩티드；
(D) 서열번호 1의 N 말단부터 1 내지 18번째 아미노산 잔기 또는 그 일부로 구성되고, 그 C 말단에 시스테인 또는 시스테인 유사체가 결합되며, 여기에 서열번호 1의 N 말단부터 28 내지 42번째 아미노산 잔기 또는 그 일부로 구성되는 펩티드가 추가로 결합되고, 선택적으로 그 C 말단에 시스테인 또는 시스테인 유사체가 결합된 펩티드；
(E) 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그 일부로 구성되고, C 말단에 시스테인 유사체가 결합된 펩티드；
(F) 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그 일부로 구성되고, 그의 C 말단에 시스테인 또는 시스테인 유사체가 결합된 2개 이상의 펩티드가 상기 시스테인 또는 시스테인 유사체 간의 디설파이드 결합에 의해 서로 결합된 펩티드.
(2) 상기 (A)의 펩티드 (a)가, 서열번호 1의 N 말단부터 1 내지 10번째, 2 내지 10번째, 3 내지 10번째, 1 내지 9번째, 2 내지 9번째, 1 내지 18번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드로부터 선택되고, 상기 (A)의 펩티드 (b)가, 서열번호 1의 N 말단부터 28 내지 36번째, 28 내지 37번째, 28 내지 38번째, 28 내지 39번째, 28 내지 40번째, 28 내지 41번째, 28 내지 42번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드로부터 선택되는 펩티드인, 상기 (1) 기재의 펩티드.
(3) 상기 (C)의 펩티드가 서열번호 1의 N 말단부터 1 내지 28번째 아미노산 잔기로 구성되고, N 말단부터 18번째와 19번째 아미노산 잔기 사이에 시스테인 또는 시스테인 유사체가 삽입되고, 또한 시스테인 또는 시스테인 유사체가 상기 펩티드의 C 말단에 결합된 펩티드인, 상기 (1) 기재의 펩티드.
(4) 상기 (D)의 펩티드가, 서열번호 1의 N 말단부터 1 내지 18번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드의 C 말단에 시스테인 또는 시스테인 유사체가 결합되고, 여기에 서열번호 1의 N 말단부터 28 내지 37번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드가 추가로 결합되며, 선택적으로 그 C 말단에 시스테인 또는 시스테인 유사체가 결합된 펩티드인, 상기 (1) 기재의 펩티드.
(5) 상기 (E)의 펩티드가, 서열번호 1의 N 말단부터 1 내지 28번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드의 C 말단에 시스테인 유사체가 결합된 펩티드인, 상기 (1) 기재의 펩티드.
(6) 상기 (F)의 펩티드가, 서열번호 1의 N 말단부터 1 내지 28번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드의 C 말단에 시스테인 또는 시스테인 유사체가 결합된 2개 이상의 펩티드로 구성되고, 상기 2개 이상의 펩티드가 시스테인 또는 시스테인 유사체 간의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된 펩티드인, 상기 (1) 기재의 펩티드.
(7) 시스테인 유사체가 호모시스테인인 상기 (1) 내지 (6) 중 하나의 펩티드.
(8) 펩티드가 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 펩티드인 상기 (1) 내지 (6) 중 하나의 펩티드.
·서열번호 2 내지 19 중 하나의 펩티드;
·서열번호 20으로 각각 구성되는 2개의 펩티드를 디설파이드 결합에 의해 결합시킨 펩티드;
서열번호 20으로 구성되는 펩티드와 서열번호 21로 구성되는 펩티드를 디설파이드 결합에 의해 결합시킨 펩티드;
·서열번호 21로 각각 구성되는 2개의 펩티드를 디설파이드 결합에 의해 결합시킨 펩티드; 및
·서열번호 21로 구성되는 복수개의 펩티드를 디설파이드 결합에 의해 결합시킨 펩티드.
(9) 상기 (1) 내지 (8) 중 하나의 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 β에 대한 면역 반응 증강 방법.
(10) 상기 (1) 내지 (8) 중 하나의 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료제.
(11) 상기 (1) 내지 (8) 중 하나의 펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 유전자 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 유효한 DNA 백신.
본 발명은 또한 포유동물에 대해, 약학적으로 유효량의 본 발명의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는 포유동물의 알츠하이머병의 예방 또는 치료 방법, 및 포유동물에 대해, 약학적으로 유효량의 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 유전자 절편을 투여하는 것을 포함하는 포유동물의 알츠하이머병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 알츠하이머병의 예방 또는 치료제를 제조하기 위한 본 발명의 펩티드의 용도, 및 알츠하이머병의 예방 또는 치료제를 제조하기 위한 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 유전자 절편의 용도를 제공한다.
본 발명은, 아쥬반트 없이 단독으로 사용하는 경우에도 Aβ 펩티드에 대해서 충분한 면역 반응을 얻을 수 있는 면역 반응이 증강된 면역원성 펩티드를 제공한다. 본 발명에 따르면, Aβ 펩티드의 일부 또는 Aβ 펩티드에서 유래하는 서열의 펩티드에 시스테인 분자 또는 그 유사체를 첨가 또는 삽입하는 것 만으로도, 면역원성 펩티드의 항체 생성을 증강할 수 있다. 따라서, 종래의 아쥬반트를 첨가하는 것에 의한 단점도 없기 때문에, 제재의 설계도 용이하다.
또한, 본 발명에 의해 면역 반응이 증강된 면역원성 펩티드의 생체 투여에 의해, 혈액 내에서 Aβ 펩티드에 대한 특이적 항체를 신속하고 대량으로 유도할 수 있다. 시스테인의 독성은 알려져 있지 않으며, 오히려 생체 내에서는 시스테인 및 그 관련 물질은 항독적인 작용을 가지는 것으로 알려져 있기 때문에, 증강된 면역 반응을 유도하는 본 발명의 면역원성 펩티드는 생체에 대해 매우 안전하게 사용할 수 있다.
증강된 면역 반응을 유도하는 본 발명의 면역원성 펩티드는, 화학 합성에 의한 비생물학적인 방법으로 얻을 수 있어 종래의 컴퍼넌트(component) 백신과 비교하여 안정하고 균일하게 제조될 수 있다. 또한, 혼입 물질에 의한 독성, 감염성, 품질 저하의 위험성이 매우 낮아서 안전한 백신을 제공할 수 있다.
Aβ 펩티드에 대해서 증강된 면역 반응을 유도하는 본 발명의 면역원성 펩티드를 포함하는 펩티드 제제는, 피하 또는 근육내 투여 등의 주사에 의한 투여 뿐만 아니라, 경구, 경비, 경피 등의 투여 방법으로 투여할 수 있다. 이러한 방법에 의하면 주사에 의한 스트레스나 의료 사고도 방지할 수 있다.
[도 1] 디설파이드 결합에 의해 서로 결합된 시스테인 첨가 28 아미노산 Aβ 펩티드의 구조를 나타낸 것이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에 따라, 펩티드에 직접 시스테인 분자 또는 그의 유사체를 첨가 또는 삽입하거나 또는, 선택적으로 DNA 또는 RNA 서열에 시스테인을 발현하는 서열을 첨가 또는 삽입할 수 있다. 이 경우, 시스테인의 첨가 또는 삽입 위치는, Aβ 펩티드에 대해서 면역 반응의 증강 효과를 가지는 한 특별히 한정되지 않는다. 삽입하는 시스테인 분자수는 1개 이상일 수 있다. 복수의 시스테인 분자를 삽입하는 경우 연속적으로 또는 불연속적으로 삽입할 수 있다. 가장 단순한 구조는, Aβ 펩티드의 일부로, N 말단 또는 C 말단에 1개 시스테인이 결합한 구조가 된다.
본 발명의 알츠하이머병의 예방 및 치료에 유효한 펩티드는 1에서 42번째의 아미노산 잔기로 구성되는 Aβ 펩티드 (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV IA：서열번호 1)의 일부 또는 상기 서열에서 유래하는 펩티드에 시스테인(Cys) 또는 그 유사체가 첨가된 것을 들 수 있다. 이러한 펩티드의 예로는 아래와 같은 것을 들 수 있다: 여기서 사용된 시스테인의 유사체는 시스테인의 전구체 및 대사물질을 의미하며, 전형적으로는 호모시스테인이다.
(A) (a) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 18번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드 또는 그의 일부로 구성되는 펩티드 및 (b) 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 42번째 아미노산 잔기 중, 28 내지 36번째 아미노산 잔기를 포함하는 9개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드를 포함하고, 펩티드 (a)와 (b)는 서로 결합되어 있고 시스테인 또는 시스테인 유사체는 생성된 펩티드 (a)와 (b)의 결합체의 C 말단에 결합되어 있는 펩티드
(1) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 10번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 42번째 아미노산 잔기가 결합되어 있고, 그의 C 말단에 시스테인이 첨가된 펩티드(1-10·28-42AACys):
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC (서열번호 2)
(2) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 10번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 41번째 아미노산 잔기가 결합되어 있고, 그의 C 말단에 시스테인이 첨가된 펩티드(1-10·28-41AACys):
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIC (서열번호 3)
(3) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 10번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 40번째 아미노산 잔기가 결합되어 있고, 그의 C 말단에 시스테인이 첨가된 펩티드(1-10·28-40AACys):
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVC (서열번호 4)
(4) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 10번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 39번째 아미노산 잔기가 결합되어 있고, 그의 C 말단에 시스테인이 첨가된 펩티드(1-10·28-39AACys):
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVC (서열번호 5)
(5) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 10번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 38번째 아미노산 잔기가 결합되어 있고, 그의 C 말단에 시스테인이 첨가된 펩티드(1-10·28-38AACys):
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGC (서열번호 6)
(6) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 10번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 37번째 아미노산 잔기가 결합되어 있고, 그의 C 말단에 시스테인이 첨가된 펩티드(1-10·28-37AACys):
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGC (서열번호 7)
(7) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 10번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 36번째 아미노산 잔기가 결합되어 있고, 그의 C 말단에 시스테인이 첨가된 펩티드(1-10·28-36AACys):
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVC (서열번호 8)
(8) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 9번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 37번째 아미노산 잔기가 결합되어 있고, 그의 C 말단에 시스테인이 첨가된 펩티드(1-9·28-37AACys):
N 말단-DAEFRHDSGKGAIIGLMVGC (서열번호 9)
(9) 서열번호 1의 N 말단의 2 내지 10번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 37번째 아미노산 잔기가 결합되어 있고, 그의 C 말단에 시스테인이 첨가된 펩티드(2-10·28-37AACys):
N 말단-AEFRHDSGYKGAIIGLMVGC (서열번호 10)
(10) 서열번호 1의 N 말단의 3 내지 10번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 37번째 아미노산 잔기가 결합되어 있고, 그의 C 말단에 시스테인이 첨가된 펩티드(3-10·28-37AACys):
N 말단-EFRHDSGYKGAIIGLMVGC (서열번호 11)
(11) 서열번호 1의 N 말단의 2 내지 9번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 37번째 아미노산 잔기가 결합되어 있고, 그의 C 말단에 시스테인이 첨가된 펩티드(2-9·28-37AACys):
N 말단-AEFRHDSGKGAIIGLMVGC (서열번호 12)
(12) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 18번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 42번째 아미노산 잔기가 결합되어 있고, 그의 C 말단에 시스테인이 첨가된 펩티드(1-18·28-42AACys):
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGGVVIAC (서열번호 13)
(B) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 26번째 또는 1 내지 27번째 아미노산 잔기로 구성되고, 시스테인 또는 시스테인 유사체가 그 N 말단의 18번째와 19번째 아미노산 잔기 사이에 삽입되어 있는 펩티드
(1) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 27번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드(이하, "27 아미노산 Aβ 펩티드"라 함.)이며, 시스테인이 그 N 말단의 18번째와 19번째 사이에 삽입되어 있는 펩티드(1-18Cys19-27AA):
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSN (서열번호 14)
(2) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 26번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드(이하, "26 아미노산 Aβ 펩티드"라 함.)이며, 시스테인이 N 말단의 18번째와 19번째 아미노산 잔기 사이에 삽입되어 있는 펩티드(1-18Cys19-26AA)
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGS (서열번호 15)
(C) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되거나 또는 그의 일부로 구성되고, 시스테인 또는 시스테인 유사체가 그의 N 말단의 18번째와 19번째 아미노산 잔기 사이에 삽입되고, 또한 상기 펩티드의 C 말단에 시스테인 또는 시스테인 유사체가 결합된 펩티드
(1) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 28번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드(이하, "28 아미노산 Aβ 펩티드"라 함.)이며, 시스테인이 N 말단의 18번째와 19번째 아미노산 잔기 사이에 삽입되고, 또한 상기 펩티드의 C 말단에 시스테인이 결합된 펩티드(1-18Cys19-28AACys)
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNKC (서열번호 16)
(D) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 18번째 아미노산 잔기 또는 그의 일부로 구성되고, 그의 C 말단에 시스테인 또는 시스테인 유사체를 결합하고, 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 42번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드 또는 그의 일부로 구성되는 펩티드를 추가로 결합하여서 되며, 선택적으로 그의 C 말단에 시스테인 또는 시스테인 유사체가 결합된 펩티드
(1) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 18번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 시스테인을 결합하고, 그 뒤에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 37번째 아미노산 잔기로 구성되는 서열이 추가로 결합된 펩티드(1-18Cys28-37AA)
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVG (서열번호 17)
(2) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 18번째 아미노산 잔기로 구성되는 서열의 C 말단에 시스테인을 결합하고, 그 뒤에 서열번호 1의 N 말단의 28 내지 37번째 아미노산 잔기가 결합되고, 그의 C 말단에 시스테인이 첨가된 펩티드(1-18Cys28-37AACys)
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVGC (서열번호 18)
(E) 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 일부로 구성되는 펩티드의 C 말단에 시스테인 유사체가 결합된 펩티드
(1) 서열번호 1의 N 말단의 1 내지 28번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 호모시스테인이 첨가된 펩티드(28AA-호모시스테인)
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKX（서열번호 19）（X：호모시스테인)
(F) 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 일부로 구성되는 펩티드의 C 말단에 시스테인 또는 시스테인 유사체를 결합시킨 2개 이상의 펩티드를 상기 시스테인 또는 시스테인 유사체의 디설파이드 결합에 의해 결합시킨 펩티드
(1) 28-아미노산 Aβ 펩티드에 시스테인을 첨가시킨 펩티드 (28AAC)
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC (서열번호 20)
(2) 28-아미노산 Aβ 펩티드에 시스테인을 2개 첨가시킨 펩티드 (28AACC)
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCC (서열번호 21)
상기 28AAC와 28AAC를 디설파이드 결합에 의해 연결한 것(28AAC디설파이드28AAC), 28AAC와 28AACC를 디설파이드 결합에 의해 연결한 것(28AAC디설파이드28AACC), 28AACC와 28AACC를 디설파이드 결합에 의해 연결한 것(28AACC디설파이드28AACC；N 말단의 시스테인끼리 디설파이드 결합한 것, C 말단의 시스테인끼리 디설파이드 결합한 것, C 말단과 N 말단의 시스테인이 디설파이드 결합한 것, C 말단끼리와 N 말단끼리의 시스테인이 디설파이드 결합한 것, 및 각각 C 말단과 N 말단의 시스테인이 디설파이드 결합한 것을 포함한다), 및 복수의 28AACC를 디설파이드 결합에 의해 연결한 것(28AACC(28AAC)의 결합체)으로서, 그 구조를 도 1에 나타냈다.
상기의 시스테인을 첨가 또는 삽입한 Aβ 펩티드 가운데, Aβ 펩티드의 아미노산의 일부를 삭제한 펩티드에 시스테인을 첨가한 1-10·28-42AACys (서열번호 2), 1-10·28-41AACys (서열번호 3), 1-10·28-40AACys (서열번호 4), 1-10·28-39AACys (서열번호 5), 1-10·28-38AACys (서열번호 6), 1-10·28-37AACys (서열번호 7), 1-10·28-36AACys (서열번호 8), 1-9·28-37AACys (서열번호 9), 2-10·28-37AACys (서열번호 10) 및 1-18·28-42AACys (서열번호 13)의 펩티드, 28 아미노산 Aβ 펩티드에 시스테인 삽입 또는 첨가한 1-18Cys19-28AACys (서열번호 16), 1-18 Cys19-27AA (서열번호 14), 1-18Cys19-26AA (서열번호 15), 1-18Cys28-37AA(서열번호 17), 28 아미노산 Aβ 펩티드에 호모시스테인을 첨가한 28 AA-호모시스테인(서열번호 19), 또한 28AAC디설파이드28AAC 및 28AAC디설파이드28AACC가 특히 증강된 면역 반응을 유도할 수 있으므로, 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용할 수 있다.
본 발명에 따라, Aβ 펩티드의 일부 또는 Aβ 펩티드에서 유래하는 서열에 시스테인 또는 시스테인 유사체를 첨가 또는 삽입하여, 증강된 면역 반응을 유도할 수 있는 펩티드를 제조할 수 있다. 시스테인을 첨가 또는 삽입 후에 얻어진 펩티드가 면역 반응 증강 효과를 가지는지 아닌지는 상기 펩티드를 이용하고, 통상적인 기술에 따라 마우스를 면역 한 후, 혈중의 항Aβ IgG 항체 역가를 측정하는 것에 의해서 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 Aβ 펩티드의 일부 또는 Aβ 펩티드에서 유래하는 서열에 시스테인 또는 시스테인 유사체를 첨가 또는 삽입하여 얻을 수 있는 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, 면역 반응 증강 방법을 제공한다.
본 발명에 의해 얻을 수 있는 시스테인이 첨가된 펩티드를 포함하는 펩티드 약물 제형은, 피하, 경피, 근육내, 경구, 또는 경비(transnasal) 등의 경로로 투여할 수 있다. 바람직하게, 피하 또는 근육 내로 투여할 수 있다.
본 발명의 시스테인 첨가된 면역원성 펩티드는, 아쥬반트 없이 단독으로 투여해도 충분한 면역 효과를 제공할 수 있지만, 아쥬반트를 첨가하면 더 충분한 면역 효과를 제공할 수 있다. 여기에서 사용가능한 아쥬반트로는, 액성 면역을 활성화하지만, 세포성 면역을 자극하지 않는 것이 바람직하고, 전형적으로 알루미늄염 등을 들 수 있다.
또한, 상기에서 구체적으로 열거한, 본 발명에 의한 Aβ 펩티드의 일부 또는 Aβ 펩티드에서 유래하는 서열에 시스테인 또는 시스테인 유사체를 첨가 또는 삽입하여 얻을 수 있는 증강된 면역 반응을 유발하는 펩티드를 코드하는 유전자 절편을 포함하는 벡터는, 알츠하이머병을 효과적으로 예방 및 치료하는 DNA 백신으로서 사용할 수 있다. 시스테인을 코드하는 뉴클레오티드 서열로는, 예를 들면 tgt를 들 수 있지만, 시스테인을 코드하는 서열이라면 특별한 제한은 없다. 상기 42 아미노산 잔기로 구성되는 Aβ 펩티드를 코드하는 유전자 절편은 하기한 바와 같다. 다만, 이하에 나타낸 뉴클레오티드 서열은 전형적인 Aβ 펩티드의 유전자 서열이며, 동일한 아미노산을 코드하는 한 그 유전자 서열에 특별한 제한은 없다.
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc atagcg (서열번호 22)
상기 Aβ 펩티드 또는 그의 일부 또는 Aβ 펩티드에서 유래하는 펩티드에 시스테인(Cys)이 첨가 또는 삽입된 펩티드를 코드하는 유전자 절편의 예는 하기한 바와 같다. 다만, 이하에 나타낸 서열은 상기 펩티드 각각을 코드하는 전형적인 유전자 서열을 나타내고 있으며, 동일한 아미노산을 코드하는 한 그 유전자 서열에 특히 제한은 없다.
·1-10·28-42AACys를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtca tagcgtgt （서열번호 23）
·1-10·28-41AACys를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtca tatgt （서열번호 24）
·1-10·28-40AACys를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtct gt （서열번호 25）
·1-10·28-39AACys를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgtttgt （서열번호 26）
·1-10·28-38AACys를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggttgt （서열번호 27）
·1-10·28-37AACys를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc tgt （서열번호 28）
·1-10·28-36AACys를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgtgt （서열번호 29）
·1-9·28-37AACys를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggaaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt （서열번호 30）
·2-10·28-37AACys를 코드하는 유전자 절편：
gcagaattcc gacatgactc aggatataaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt （서열번호 31）
·3-10·28-37AACys를 코드하는 유전자 절편：
gaattccgac atgactcagg atataaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt （서열번호 32）
·2-9·28-37AACys를 코드하는 유전자 절편：
gcagaattcc gacatgactc aggaaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt （서열번호 33）
·1-18·28-42AACys를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcgt gt (서열번호 34）
·1-18Cys19-27AA를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc aaac （서열번호 35）
·1-18Cys19-26AA를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc a （서열번호 36）
·1-18Cys19-28AACys를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc aaacaaatgt（서열번호 37）
·1-18Cys28-37AA를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggc (서열번호 38)
·1-18Cys28-37AACys를 코드하는 유전자 절편：
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt （서열번호 39）
이하, 본 발명을 다음 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하였으며, 본 발명이 여기에 제한되지는 않는다.
실시예
실시예 1
Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 10으로 구성되는 서열에 다양한 C 말단 펩티드를 연결하고 그 C 말단에 시스테인을 첨가한 펩티드들의 항체 유도능 비교
(1) 시스테인을 첨가한 Aβ 펩티드의 제조
·시스테인이 첨가된 1 내지 10＋30 내지 42 아미노산 Aβ 펩티드 (1-10·30-42AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYAIIGLMVGGVVIAC(서열번호 40)
·시스테인이 첨가된 1 내지 10＋29 내지 42 아미노산 Aβ 펩티드 (1-10·29-42AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYGAIIGLMVGGVVIAC(서열번호 41)
·시스테인이 첨가된 1 내지 10＋28 내지 42 아미노산 Aβ 펩티드 (1-10·28-42AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC(서열번호 2)
·1 내지 10＋28 내지 42 아미노산 Aβ 펩티드 (1-10·28-42AA)：
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIA(서열번호 42)
상기한 펩티드를 합성하고(Sigma Aldrich Japan), 생리 식염수로 희석하여 5 mg/mL의 원액을 얻었다. 원액 100μL에 생리 식염수 900μL를 첨가하여 0.5 mg/mL의 농도를 만들고, 이 혼합물을 1.5 mL 튜브에 분주(면역원)하여 사용시까지 -80℃ 이하로 보관하였다.
(2) 면역 마우스
수컷 C57BL/6 마우스(7주령, SPF)를 일본 찰스 리버사(Japan Charles River Co., Ltd.)로부터 구입하여 SPF 환경하에서 사육하였다.
(3) 면역화 그룹의 구성
16 마리의 마우스를 4마리씩 4개 그룹으로 나누고, 제1그룹을 1-10·30-42AACys 투여그룹, 제2그룹을 1-10·29-42AACys 투여그룹, 제3그룹을 1-10·28-42AACys 투여그룹, 제4그룹을 1-10·28-42AA 투여그룹으로 하였다.
(4) 면역 방법 및 스케줄
각 면역원을 마우스 1마리 당 200μL씩 1 mL tuberculin용 주사기(Terumo, SS-01T2613S)를 사용하여 복부에 피부 내 또는 피부 하로 투여하였다(개체 당 투여량：100μg). 마우스는 2주 간격으로 3회 면역을 실시하였다.
(5) 채혈
최종면역으로부터 7일째에 모든 마우스를 펜토바비탈 소듐(Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentyl) 마취 하에 하복부 대정맥에서 채혈하였다. 채취한 혈액을 Microtainer(Becton Dickinson Co., Ltd)로 옮겨, 실온에서 충분히 응고시킨 후, 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 분리한 혈청은 각각 0.5 mL 튜브 2개에 분주하여 측정까지 -80 ℃에서 보관하였다.
(6) 항Aβ IgG 항체의 측정
Aβ 펩티드 (1-40의 아미노산 서열： N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK GAIIGLMVGGVV (서열번호 43), Hokkaido System Science Co., Ltd. 합성)를 0.1 M 탄산염 완충액, pH 9.6으로 10 μg/mL로 희석하고, 8 웰 스트립(Nalge Nunc K.K., Immobilizer Amino)에 100 μL/웰로 첨가하여 4 ℃에서 밤새 항온처리하였다. 다음날, 각 웰을 0.05% Tween20 함유-PBS(PBST) 300μL로 3회 세척하고, 10 mM 에탄올아민을 300 μL/웰씩 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다.
1시간 후, 10 mM 에탄올아민을 충분히 제거하고, PBST로 50 내지 10000배 희석된 검체를 각 웰에 100 μL씩 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 첨가한 각 희석 혈청을 버리고 300μL/웰의 PBST로 각 웰을 3회 세척하였다. 세척한 후, 웰 내의 세척액을 충분히 제거하고, 검체 희석용 용액으로 2000배 희석한 HRP 표지된 항마우스 IgG 염소 항체(American Curlex, A131PS)를 100μL/웰 농도로 첨가한 다음, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 표지된 항체 희석액을 버리고, 각 웰을 300μL/웰의 PBST로 2회, 동량의 증류수로 2회 세척하고, 여기에 100μL/웰의 발색 기질액 TMB+(Dako Inc.)를 첨가한 다음, 차광 하의 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 이 후, 1N 황산을 웰 당 100μL를 첨가하여 발색을 정지시키고, 450 nm에서 흡광도(OD450 값)를 측정하였다.
시중에서 구입할 수 있는 Aβ에 대한 모노클로날 항체 (CHEMI-CON Corporation, MAB1560)를 표준 혈청으로 사용하였다. 표준 혈청을 PBST로 0.156, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 ng/mL가 되도록 희석하여 항체 역가 측정을 위한 표준물질을 제조하였다. 각각의 마우스 혈청 검체의 항Aβ IgG 항체를 측정하는 동시에, 각각의 희석된 검체의 OD450 값을 측정하였다. 각각의 마우스 혈청 검체의 항Aβ IgG 항체 역가를 얻어진 표준물질의 단위와 OD450 값의 표준 곡선을 사용하여 계산하였다.
각 면역 그룹에 있어서의 마우스 혈청 중의 계산된 항Aβ 항체 역가를 표 1에 나타냈다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 1-10·28-42AACys 투여그룹 및 1-10·28-42AA 투여그룹에서 Aβ에 대한 항체 유도가 관찰되었다. 또한 시스테인을 첨가하고 있지 않은 Aβ 펩티드 절편(1-10·28-42AA)으로 면역했을 때와 비교하여, 시스테인을 첨가한 Aβ 펩티드 절편(1-10·28-42AACys)으로 면역했을 경우가 Aβ에 대한 높은 항체 역가를 나타내었다.
실시예 2
Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 10으로 구성되고, 여기에 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 28 내지 42, 28 내지 41, 28 내지 40, 28 내지 39, 28 내지 38, 28 내지 37, 28 내지 36, 28 내지 35 또는 28 내지 34 서열을 각각 결합하고, 그 C 말단에 시스테인을 첨가한 펩티드들의 항체 유도능 비교
(1) 시스테인을 첨가한 Aβ 펩티드의 제조
·시스테인이 첨가된 1 내지 10＋28 내지 42 아미노산 Aβ 펩티드 (1-10·28-42AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC (서열번호 2)
·시스테인이 첨가된 1 내지 10＋28 내지 41 아미노산 Aβ 펩티드 (1-10·28-41AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIC (서열번호 3)
·시스테인이 첨가된 1 내지 10＋28 내지 40 아미노산 Aβ 펩티드(1-10·28-40AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVC (서열번호 4)
·시스테인이 첨가된 1 내지 10＋28 내지 39 아미노산 Aβ 펩티드 (1-10·28-39AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVC (서열번호 5)
·시스테인이 첨가된 1 내지 10＋28 내지 38 아미노산 Aβ 펩티드 (1-10·28-38AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGC (서열번호 6)
·시스테인이 첨가된 1 내지 10＋28 내지 37 아미노산 Aβ 펩티드 (1-10·28-37AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGC (서열번호 7)
·시스테인이 첨가된 1 내지 10＋28 내지 36 아미노산 Aβ 펩티드 (1-10·28-36AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVC (서열번호 8)
·시스테인이 첨가된 1 내지 10＋28 내지 35 아미노산 Aβ 펩티드 (1-10·28-35AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMC (서열번호 44)
·시스테인이 첨가된 1 내지 10＋28 내지 34 아미노산 Aβ 펩티드 (1-10·28-34AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLC (서열번호 45)
상기한 펩티드를 합성하고(Sigma Aldrich Japan), 생리 식염수로 희석하여 5 mg/mL의 원액을 얻었다. 원액 100μL에 생리 식염수 900μL를 첨가하여 0.5 mg/mL의 농도를 만들고, 이 혼합물을 1.5 mL 튜브에 분주(면역원)하여 사용시까지 -80℃ 이하로 보관하였다.
(2) 면역 마우스
수컷 C57BL/6 마우스(7주령, SPF)를 일본 찰스 리버사(Japan Charles River Co., Ltd.)로부터 구입하여 SPF 환경하에서 사육하였다.
(3) 면역화 그룹의 구성
36 마리의 마우스를 4 마리씩 9개 그룹으로 나누고, 제1그룹을 1-10·28-42 AACys 투여그룹, 제2그룹을 1-10·28-41AACys 투여그룹, 제3그룹을 1-10·28-40 AACys 투여그룹, 제4그룹을 1-10·28-39AACys 투여그룹, 제5그룹을 1-10·28-38 AACys 투여그룹, 제6그룹을 1-10·28-37AACys 투여그룹, 제7그룹을 1-10·28-36 AACys 투여그룹, 제8그룹을 1-10·28-35AACys 투여그룹 및 제9그룹을 1-10·28-34 AACys 투여그룹으로 하였다.
(4) 면역 방법 및 스케줄
각 면역원을 마우스 1마리 당 200μL씩 1 mL tuberculin용 주사기(Terumo, SS-01T2613S)를 사용하여 복부에 피부 내 또는 피부 하로 투여하였다(개체 당 투여량：100μg). 마우스는 2주 간격으로 3회 면역을 실시하였다.
(5) 채혈
최종면역으로부터 7일째에 모든 마우스를 펜토바비탈 소듐(Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentyl) 마취 하에 하복부 대정맥에서 채혈하였다. 채취한 혈액을 Microtainer(Becton Dickinson Co., Ltd)로 옮겨, 실온에서 충분히 응고시킨 후, 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 분리한 혈청은 각각 0.5 mL 튜브 2개에 분주하여 측정까지 -80 ℃에서 보관하였다.
(6) 항Aβ IgG 항체의 측정
항Aβ IgG 항체의 측정을 상기한 바와 같이 수행하였다. 각각의 면역 그룹에 있어서 마우스 혈청 중의 계산된 항Aβ 항체 역가를 표 2에 나타냈다. 표 2에 나타낸 바와 같이, Aβ에 대한 항체 유도가 1-10·28-42AACys, 1-10·28-41AACys, 1-10·28-40AACys, 1-10·28-39 AACys, 1-10·28-38AACys, 1-10·28-37AACys 및 1-10·28-36AACys 펩티드에서 관찰되었다.
실시예 3
Aβ 펩티드의 각종 N 말단 펩티드로 구성되고, 여기에 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 28 내지 37을 결합하고 그 C 말단에 시스테인을 첨가한 펩티드들의 항체 유도능 비교
(1) 시스테인을 첨가한 Aβ 펩티드의 제조
·시스테인이 첨가된 1 내지 9＋28 내지 37 아미노산 Aβ 펩티드 (1-9·28-37AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGKGAIIGLMVGC (서열번호 9)
·시스테인이 첨가된 1 내지 8＋28 내지 37 아미노산 Aβ 펩티드 (1-8·28-37AACys)：
N 말단-DAEFRHDSKGAIIGLMVGC (서열번호 46)
·시스테인이 첨가된 1 내지 7＋28 내지 37 아미노산 Aβ 펩티드 (1-7·28-37AACys)：
N 말단-DAEFRHDKGAIIGLMVGC (서열번호 47)
상기한 펩티드를 합성하고(Sigma Aldrich Japan), 생리 식염수로 희석하여 5 mg/mL의 원액을 얻었다. 원액 100μL에 생리 식염수 900μL를 첨가하여 0.5 mg/mL의 농도를 만들고, 이 혼합물을 1.5 mL 튜브에 분주(면역원)하여 사용시까지 -80℃ 이하로 보관하였다.
(2) 면역 마우스
수컷 C57BL/6 마우스(7주령, SPF)를 일본 찰스 리버사(Japan Charles River Co., Ltd.)로부터 구입하여 SPF 환경하에서 사육하였다.
(3) 면역화 그룹의 구성
12 마리의 마우스를 4 마리씩 3개 그룹으로 나누고, 제1그룹을 1-9·28-37 AACys 투여그룹, 제2그룹을 1-8·28-37AACys 투여그룹 및 제3그룹을 1-7·28-37 AACys 투여그룹으로 하였다.
(4) 면역 방법 및 스케줄
각 면역원을 마우스 1마리 당 200μL씩 1 mL tuberculin용 주사기(Terumo, SS-01T2613S)를 사용하여 복부에 피부 내 또는 피부 하로 투여하였다(개체 당 투여량：100μg). 마우스는 2주 간격으로 3회 면역을 실시하였다.
(5) 채혈
최종면역으로부터 7일째에 모든 마우스를 펜토바비탈 소듐(Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentyl) 마취 하에 하복부 대정맥에서 채혈하였다. 채취한 혈액을 Microtainer(Becton Dickinson Co., Ltd)로 옮겨, 실온에서 충분히 응고시킨 후, 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 분리한 혈청은 각각 0.5 mL 튜브 2개에 분주하여 측정까지 -80 ℃에서 보관하였다.
(6) 항Aβ IgG 항체의 측정
항Aβ IgG 항체의 측정을 상기한 바와 같이 수행하였다. 각각의 면역 그룹에 있어서 마우스 혈청 중의 계산된 항Aβ 항체 역가를 표 3에 나타냈다. 표 3에 나타낸 바와 같이, Aβ에 대한 항체 유도가 1-9·28-37AACys 펩티드에서 관찰되었다.
실시예 4
Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 2 내지 10 또는 3 내지 10 또는 4 내지 10으로 구성되고, 여기에 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 28 내지 37을 결합하고 그 C 말단에 시스테인을 첨가한 펩티드들의 항체 유도능 비교
(1) 시스테인을 첨가한 Aβ 펩티드의 제조
·시스테인이 첨가된 2 내지 10＋28 내지 37 아미노산 Aβ 펩티드 (2-10·28-37AACys)：
N 말단-AEFRHDSGYKGAIIGLMVGC (서열번호 10)
·시스테인이 첨가된 3 내지 10＋28 내지 37 아미노산 Aβ 펩티드 (3-10·28-37AACys)：
N 말단-EFRHDSGYKGAIIGLMVGC (서열번호 11)
·시스테인이 첨가된 4 내지 10＋28 내지 37 아미노산 Aβ 펩티드 (4-10·28-37AACys)：
N 말단-FRHDSGYKGAIIGLMVGC (서열번호 48)
·시스테인이 첨가된 2 내지 9＋28 내지 37 아미노산 Aβ 펩티드 (2-9·28-37AACys)：
N 말단-AEFRHDSGKGAIIGLMVGC (서열번호 12)
상기한 펩티드를 합성하고(Sigma Aldrich Japan), 생리 식염수로 희석하여 5 mg/mL의 원액을 얻었다. 원액 100μL에 생리 식염수 900μL를 첨가하여 0.5 mg/mL의 농도를 만들고, 이 혼합물을 1.5 mL 튜브에 분주(면역원)하여 사용시까지 -80℃ 이하로 보관하였다.
(2) 면역 마우스
수컷 C57BL/6 마우스(7주령, SPF)를 일본 찰스 리버사(Japan Charles River Co., Ltd.)로부터 구입하여 SPF 환경하에서 사육하였다.
(3) 면역화 그룹의 구성
16 마리의 마우스를 4 마리씩 4개 그룹으로 나누고, 제1그룹을 2-10·28-37 AACys 투여그룹, 제2그룹을 3-10·28-37AACys 투여그룹, 제3그룹을 4-10·28-37 AACys 투여그룹 및 제4그룹을 2-9·28-37AACys 투여그룹으로 하였다.
(4) 면역 방법 및 스케줄
각 면역원을 마우스 1마리 당 200μL씩 1 mL tuberculin용 주사기(Terumo, SS-01T2613S)를 사용하여 복부에 피부 내 또는 피부 하로 투여하였다(개체 당 투여량：100μg). 마우스는 2주 간격으로 3회 면역을 실시하였다.
(5) 채혈
최종면역으로부터 7일째에 모든 마우스를 펜토바비탈 소듐(Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentyl) 마취 하에 하복부 대정맥에서 채혈하였다. 채취한 혈액을 Microtainer(Becton Dickinson Co., Ltd)로 옮겨, 실온에서 충분히 응고시킨 후, 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 분리한 혈청은 각각 0.5 mL 튜브 2개에 분주하여 측정까지 -80 ℃에서 보관하였다.
(6) 항Aβ IgG 항체의 측정
항Aβ IgG 항체의 측정을 상기한 바와 같이 수행하였다. 각각의 면역 그룹에 있어서 마우스 혈청 중의 계산된 항Aβ 항체 역가를 표 4에 나타냈다. 표 4에 나타낸 바와 같이, Aβ에 대한 항체 유도가 2-10·28-37AACys, 3-10·28-37AACys 및 2-9·28-37AACys 펩티드에서 관찰되었다.
실시예 5
Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 10으로 구성되고, 여기에 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 28 내지 42를 결합하고 그 C 말단에 시스테인을 첨가한 펩티드와 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 18로 구성되고, 여기에 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 28 내지 42를 결합하고 그 C 말단에 시스테인을 첨가한 펩티드의 항체 유도능 비교
(1) 시스테인을 첨가한 Aβ 펩티드의 제조
·시스테인이 첨가된 1 내지 18＋28 내지 42 아미노산 Aβ 펩티드 (1-18·28-42AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGGVVIAC（서열번호 13）
·시스테인이 첨가된 1 내지 10＋28 내지 42 아미노산 Aβ 펩티드 (1-10·28-42AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC（서열번호 2）
상기한 펩티드를 합성하고(Sigma Aldrich Japan), 생리 식염수로 희석하여 5 mg/mL의 원액을 얻었다. 원액 100μL에 생리 식염수 900μL를 첨가하여 0.5 mg/mL의 농도를 만들고, 이 혼합물을 1.5 mL 튜브에 분주(면역원)하여 사용시까지 -80℃ 이하로 보관하였다.
(2) 면역 마우스
수컷 C57BL/6 마우스(7주령, SPF)를 일본 찰스 리버사(Japan Charles River Co., Ltd.)로부터 구입하여 SPF 환경하에서 사육하였다.
(3) 면역화 그룹의 구성
8 마리의 마우스를 4 마리씩 2개 그룹으로 나누고, 제1그룹을 1-18·28-42 AACys 투여그룹 및 제2그룹을 1-10·28-42AACys 투여그룹으로 하였다.
(4) 면역 방법 및 스케줄
각 면역원을 마우스 1마리 당 200μL씩 1 mL tuberculin용 주사기(Terumo, SS-01T2613S)를 사용하여 복부에 피부 내 또는 피부 하로 투여하였다(개체 당 투여량：100μg). 마우스는 2주 간격으로 3회 면역을 실시하였다.
(5) 채혈
최종면역으로부터 7일째에 모든 마우스를 펜토바비탈 소듐(Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentyl) 마취 하에 하복부 대정맥에서 채혈하였다. 채취한 혈액을 Microtainer(Becton Dickinson Co., Ltd)로 옮겨, 실온에서 충분히 응고시킨 후, 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 분리한 혈청은 각각 0.5 mL 튜브 2개에 분주하여 측정까지 -80 ℃에서 보관하였다.
(6) 항Aβ IgG 항체의 측정
항Aβ IgG 항체의 측정을 상기한 바와 같이 수행하였다. 각각의 면역 그룹에 있어서 마우스 혈청 중의 계산된 항Aβ 항체 역가를 표 5에 나타냈다. 표 5에 나타낸 바와 같이, Aβ에 대한 항체 유도가 1-18·28-42AACys 투여그룹과 1-10·28-42AACys 투여그룹 모두에서 비슷한 정도로 관찰되었다.
실시예 6
Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 18과 19 사이에 시스테인이 삽입된 펩티드와 C 말단에 시스테인이 첨가된 상기 펩티드의 항체 유도능 비교
·28 아미노산 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 18과 19 사이에 시스테인이 삽입된 펩티드(1-18Cys19-28AA)：
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNK (서열번호 49)
·28 아미노산 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 18과 19 사이에 시스테인이 삽입되고, 그 C 말단에 시스테인이 결합된 펩티드(1-18Cys19-28AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNKC (서열번호 16)
상기한 펩티드를 합성하고(Sigma Aldrich Japan), 생리 식염수로 희석하여 5 mg/mL의 원액을 얻었다. 원액 100μL에 생리 식염수 900μL를 첨가하여 0.5 mg/mL의 농도를 만들고, 이 혼합물을 1.5 mL 튜브에 분주(면역원)하여 사용시까지 -80℃ 이하로 보관하였다.
(2) 면역 마우스
수컷 C57BL/6 마우스(7주령, SPF)를 일본 찰스 리버사(Japan Charles River Co., Ltd.)로부터 구입하여 SPF 환경하에서 사육하였다.
(3) 면역화 그룹의 구성
8 마리의 마우스를 4 마리씩 2개 그룹으로 나누고, 제1그룹을 1-18Cys19-28AA 투여그룹 및 제2그룹을 1-18Cys19-28AACys 투여그룹으로 하였다.
(4) 면역 방법 및 스케줄
각 면역원을 마우스 1마리 당 200μL씩 1 mL tuberculin용 주사기(Terumo, SS-01T2613S)를 사용하여 복부에 피부 내 또는 피부 하로 투여하였다(개체 당 투여량：100μg). 마우스는 2주 간격으로 3회 면역을 실시하였다.
(5) 채혈
최종면역으로부터 7일째에 모든 마우스를 펜토바비탈 소듐(Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentyl) 마취 하에 하복부 대정맥에서 채혈하였다. 채취한 혈액을 Microtainer(Becton Dickinson Co., Ltd)로 옮겨, 실온에서 충분히 응고시킨 후, 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 분리한 혈청은 각각 0.5 mL 튜브 2개에 분주하여 측정까지 -80 ℃에서 보관하였다.
(6) 항Aβ IgG 항체의 측정
항Aβ IgG 항체의 측정을 상기한 바와 같이 수행하였다. 각각의 면역 그룹에 있어서 마우스 혈청 중의 계산된 항Aβ 항체 역가를 표 6에 나타냈다. 표 6에 나타낸 바와 같이, Aβ에 대한 항체 유도가 1-18Cys19-28AA 투여그룹과 1-18Cys19-28AACys 투여그룹 모두에서 비슷한 정도로 관찰되었다.
실시예 7
Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 18과 19 사이에 시스테인이 삽입된, 25, 26, 27 아미노산 Aβ 펩티드의 항체 유도 평가
(1) 시스테인을 첨가한 Aβ 펩티드의 제조
·27 아미노산 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 18과 19 사이에 시스테인이 삽입된 펩티드 (1-18Cys19-27AA)：
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSN (서열번호 14)
·26 아미노산 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 18과 19 사이에 시스테인이 삽입된 펩티드 (1-18Cys19-26AA)：
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGS (서열번호 15)
·25 아미노산 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 18과 19 사이에 시스테인이 삽입된 펩티드 (1-18Cys19-25AA)：
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVG (서열번호 50)
상기한 펩티드를 합성하고(Sigma Aldrich Japan), 생리 식염수로 희석하여 5 mg/mL의 원액을 얻었다. 원액 100μL에 생리 식염수 900μL를 첨가하여 0.5 mg/mL의 농도를 만들고, 이 혼합물을 1.5 mL 튜브에 분주(면역원)하여 사용시까지 -80℃ 이하로 보관하였다.
(2) 면역 마우스
수컷 C57BL/6 마우스(7주령, SPF)를 일본 찰스 리버사(Japan Charles River Co., Ltd.)로부터 구입하여 SPF 환경하에서 사육하였다.
(3) 면역화 그룹의 구성
12 마리의 마우스를 4 마리씩 3개 그룹으로 나누고, 제1그룹을 1-18Cys19-27AA 투여그룹, 제2그룹을 1-18Cys19-26AA 투여그룹 및 제3그룹을 1-18Cys19-25AA 투여그룹으로 하였다.
(4) 면역 방법 및 스케줄
각 면역원을 마우스 1마리 당 200μL씩 1 mL tuberculin용 주사기(Terumo, SS-01T2613S)를 사용하여 복부에 피부 내 또는 피부 하로 투여하였다(개체 당 투여량：100μg). 마우스는 2주 간격으로 3회 면역을 실시하였다.
(5) 채혈
최종면역으로부터 7일째에 모든 마우스를 펜토바비탈 소듐(Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentyl) 마취 하에 하복부 대정맥에서 채혈하였다. 채취한 혈액을 Microtainer(Becton Dickinson Co., Ltd)로 옮겨, 실온에서 충분히 응고시킨 후, 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 분리한 혈청은 각각 0.5 mL 튜브 2개에 분주하여 측정까지 -80 ℃에서 보관하였다.
(6) 항Aβ IgG 항체의 측정
항Aβ IgG 항체의 측정을 상기한 바와 같이 수행하였다. 각각의 면역 그룹에 있어서 마우스 혈청 중의 계산된 항Aβ 항체 역가를 표 7에 나타냈다. 표 7에 나타낸 바와 같이, Aβ에 대한 항체 유도가 1-18Cys19-27AA 투여그룹과 1-18Cys19-26AA 투여그룹에서 관찰되었다. 또한 1-18Cys19-25AA 투여그룹에서는 Aβ에 대한 항체 유도가 4개 시험 중 하나에서 관찰되었다.
실시예 8
Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 18로 구성되고, 여기에 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 28 내지 37이 결합되고 시스테인이 삽입된 펩티드의 항체 유도 평가
(1) 시스테인을 첨가한 Aβ 펩티드의 제조
·Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 18로 구성되고, 그의 C 말단에 시스테인을 결합하고, 그 뒤에 추가로 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 28 내지 37의 서열이 결합된 펩티드 (1-18Cys28-37AA)
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVG (서열번호 17)
·Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 18로 구성되고, 그의 C 말단에 시스테인을 결합하고, 그 뒤에 추가로 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 28 내지 37의 서열이 결합되고, 그의 C 말단에 시스테인이 결합된 펩티드 (1-18Cys28-37AACys)：
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVGC (서열번호 18)
·Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 18로 구성되고, 그의 C 말단에 추가로 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 28 내지 37의 서열이 결합되고 그의 C 말단에 시스테인이 결합된 펩티드 (1-18·28-37AACys)
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGC (서열번호 51)
·Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 1 내지 18로 구성되고, 그의 C 말단에 추가로 Aβ 펩티드의 아미노산 잔기 28 내지 37의 서열이 결합된 펩티드 (1-18·28-37 AA)
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVG (서열번호 52)
상기한 펩티드를 합성하고(Sigma Aldrich Japan), 생리 식염수로 희석하여 5 mg/mL의 원액을 얻었다. 원액 100μL에 생리 식염수 900μL를 첨가하여 0.5 mg/mL의 농도를 만들고, 이 혼합물을 1.5 mL 튜브에 분주(면역원)하여 사용시까지 -80℃ 이하로 보관하였다.
(2) 면역 마우스
수컷 C57BL/6 마우스(7주령, SPF)를 일본 찰스 리버사(Japan Charles River Co., Ltd.)로부터 구입하여 SPF 환경하에서 사육하였다.
(3) 면역화 그룹의 구성
16 마리의 마우스를 4 마리씩 4개 그룹으로 나누고, 제1그룹을 1-18Cys28-37AA 투여그룹, 제2그룹을 1-18Cys28-37AACys 투여그룹, 제3그룹을 1-18·28-37AACys 투여그룹 및 제4그룹을 1-18·28-37AA 투여그룹으로 하였다.
(4) 면역 방법 및 스케줄
각 면역원을 마우스 1마리 당 200μL씩 1 mL tuberculin용 주사기(Terumo, SS-01T2613S)를 사용하여 복부에 피부 내 또는 피부 하로 투여하였다(개체 당 투여량：100μg). 마우스는 2주 간격으로 3회 면역을 실시하였다.
(5) 채혈
최종면역으로부터 7일째에 모든 마우스를 펜토바비탈 소듐(Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentyl) 마취 하에 하복부 대정맥에서 채혈하였다. 채취한 혈액을 Microtainer(Becton Dickinson Co., Ltd)로 옮겨, 실온에서 충분히 응고시킨 후, 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 분리한 혈청은 각각 0.5 mL 튜브 2개에 분주하여 측정까지 -80 ℃에서 보관하였다.
(6) 항Aβ IgG 항체의 측정
항Aβ IgG 항체의 측정을 상기한 바와 같이 수행하였다. 각각의 면역 그룹에 있어서 마우스 혈청 중의 계산된 항Aβ 항체 역가를 표 8에 나타냈다. 표 8에 나타낸 바와 같이, Aβ에 대한 항체 유도가 1-18Cys28-37AA 투여그룹과 1-18Cys28-37AACys 투여그룹에서 관찰되었다.
실시예 9
시스테인의 전구체인 호모시스테인, 또는 시스테인의 대사물질인 글루타티온 을 첨가한 28 아미노산 Aβ 펩티드로 구성되는 펩티드의 항체 유도 평가
(1) 시스테인 전구체 또는 대사물질을 첨가한 Aβ펩티드의 제조
·28 아미노산 Aβ 펩티드에 호모시스테인을 첨가한 펩티드 (28AA-호모시스테인)：
N 말단 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-호모시스테인 (서열번호 19)
·28 아미노산 Aβ 펩티드에 글루타티온을 첨가한 펩티드 (28AA-글루타티온)：
N 말단 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-글루타티온 (서열번호 53)
상기한 펩티드를 합성하고(Sigma Aldrich Japan), 생리 식염수로 희석하여 5 mg/mL의 원액으로 제조한 후, 사용시까지 -80℃ 이하로 보관하였다.
(2) 면역 마우스
수컷 C57BL/6 마우스(7주령, SPF)를 일본 찰스 리버사(Japan Charles River Co., Ltd.)로부터 구입하여 SPF 환경하에서 사육하였다.
(3) 면역화 그룹의 구성
8 마리의 마우스를 4 마리씩 2개 그룹으로 나누고, 제1그룹을 28AA-호모시스테인 투여그룹으로 하고 제2그룹을 28AA-글루타티온 투여그룹으로 하였다.
(4) 면역 방법 및 스케줄
각 면역원을 마우스 1마리 당 200μL씩 1 mL tuberculin용 주사기(Terumo, SS-01T2613S)를 사용하여 복부에 피부 내 또는 피부 하로 투여하였다(개체 당 투여량：100μg). 마우스는 2주 간격으로 3회 면역을 실시하였다.
(5) 채혈
최종면역으로부터 7일째에 모든 마우스를 펜토바비탈 소듐(Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentyl) 마취 하에 하복부 대정맥에서 채혈하였다. 채취한 혈액을 Microtainer(Becton Dickinson Co., Ltd)로 옮겨, 실온에서 충분히 응고시킨 후, 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 분리한 혈청은 각각 0.5 mL 튜브 2개에 분주하여 측정까지 -80 ℃에서 보관하였다.
(6) 항Aβ IgG 항체의 측정
항Aβ IgG 항체의 측정을 상기한 바와 같이 수행하였다. 각각의 면역 그룹에 있어서 마우스 혈청 중의 계산된 항Aβ 항체 역가를 표 9에 나타냈다. 표 9에 나타낸 바와 같이, 28 AA-호모시스테인 투여그룹에서 Aβ에 대한 항체 유도가 관찰되었다.
실시예 10
디설파이드 결합이 형성된, 시스테인을 첨가한 28 아미노산 Aβ 펩티드로 구성되는 펩티드에서 항체 유도 평가
(1) 시스테인을 첨가한 Aβ펩티드의 제조
·시스테인이 첨가된 28 아미노산 Aβ 펩티드로 구성되는 펩티드(28AAC)
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-C (서열번호 20)
·시스테인 2개가 첨가된 28 아미노산 Aβ 펩티드로 구성되는 펩티드(28 AACC)
N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-CC (서열번호 21)
(2) 디설파이드 결합시킨 시스테인 첨가 Aβ 펩티드의 제조
28AAC와 28AAC를 디설파이드 결합한 펩티드(28AAC디설파이드28AAC), 및 28 AAC와 28 AACC를 디설파이드 결합한 펩티드(28AAC디설파이드28AACC)를 제조하였다. 얻어진 펩티드의 구조는, 2개의 펩티드가 C 말단의 시스테인으로 디설파이드 결합에 의해 연결되는 구조 또는, N 말단-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-CC를 포함한 다이머에 추가로 디설파이드 결합하여 트리머 및 폴리머를 형성할 수 있다(도 1).
(3) 면역 마우스
수컷 C57BL/6 마우스(7주령, SPF)를 일본 찰스 리버사(Japan Charles River Co., Ltd.)로부터 구입하여 SPF 환경하에서 사육하였다.
(4) 면역화 그룹의 구성
8 마리의 마우스를 4 마리씩 2개 그룹으로 나누고, 제1그룹을 28AAC디설파이드28AAC 투여그룹 및 제2그룹을 228AAC디설파이드28AACC 투여그룹으로 하였다.
(5) 면역 방법 및 스케줄
각 면역원을 마우스 1마리 당 200μL씩 1 mL tuberculin용 주사기(Terumo, SS-01T2613S)를 사용하여 복부에 피부 내 또는 피부 하로 투여하였다(개체 당 투여량：100μg). 마우스는 2주 간격으로 3회 면역을 실시하였다.
(6) 채혈
최종면역으로부터 7일째에 모든 마우스를 펜토바비탈 소듐(Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentyl) 마취 하에 하복부 대정맥에서 채혈하였다. 채취한 혈액을 Microtainer(Becton Dickinson Co., Ltd)로 옮겨, 실온에서 충분히 응고시킨 후, 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 분리한 혈청은 각각 0.5 mL 튜브 2개에 분주하여 측정까지 -80 ℃에서 보관하였다.
(7) 항Aβ IgG 항체의 측정
항Aβ IgG 항체의 측정을 상기한 바와 같이 수행하였다. 각각의 면역 그룹에 있어서 마우스 혈청 중의 계산된 항Aβ 항체 역가를 표 10에 나타냈다. 표 10에 나타낸 바와 같이, 디설파이드 결합된 시스테인을 첨가한 28 아미노산 Aβ 펩티드는 28AAC디설파이드28AAC 투여그룹과 228AAC디설파이드28AACC 투여그룹 모두에서 Aβ에 대한 항체의 유도가 관찰되었다.
산업 상의 이용가능성
본 발명에 의한 Aβ 펩티드 또는 그에서 유래하는 서열에 시스테인 또는 그 유사 물질을 첨가 또는 삽입하여 제조되는 펩티드를 이용한 면역 반응 증강 방법은, 알츠하이머병의 예방 및 치료를 목적으로 한 펩티드 백신 또는 DNA 백신 등에 있어서 안전하고 간편한 면역 반응 증강 방법으로 사용될 것으로 기대된다.
SEQUENCE LISTING
<110> THE CHEMO-SERO-THERAPEUTIC RESEARCH INSTITUTE
<120> Modified amyloid beta peptide
<130> 669353
<150> JP 2008-267992
<151> 2008-10-16
<160> 53
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
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20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
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<213> Artificial
<220>
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1 5 10 15
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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20
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
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1 5 10 15
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1 5 10 15
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<213> Artificial
<220>
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Leu Val Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile
20 25 30
Ala Cys
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
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Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Cys Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn
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<223> Synthesized Peptide
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20 25
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<400> 17
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Cys Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly
20 25
<210> 18
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<400> 18
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Cys Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Cys
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa is Homocysteine
<400> 19
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
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Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Xaa
20 25
<210> 20
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
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Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Cys
20 25
<210> 21
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<400> 21
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Cys Cys
20 25 30
<210> 22
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt 60
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc 120
atagcg 126
<210> 23
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 23
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ggtgttgtca tagcgtgt 78
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
<400> 24
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc 60
ggtgttgtca tatgt 75
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<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
<400> 25
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc 60
ggtgttgtct gt 72
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<213> Artificial
<220>
<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
<400> 26
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
<400> 27
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ggttgt 66
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<213> Artificial
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<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
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tgt 63
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<212> DNA
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<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
<400> 29
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
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<210> 31
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
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<212> DNA
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<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
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gcagaattcc gacatgactc aggaaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt 57
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
<400> 34
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gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcgt gt 102
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
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tttgcagaag atgtgggttc aaac 84
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
<400> 36
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc 60
tttgcagaag atgtgggttc a 81
<210> 37
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
<400> 37
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tttgcagaag atgtgggttc aaacaaatgt 90
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
<400> 38
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ggtgcaatca ttggactcat ggtgggc 87
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<212> DNA
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<220>
<223> DNA coding for amino acids sequence of synthesized peptide
<400> 39
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ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt 90
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<400> 40
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Ala Ile Ile Gly Leu Met
1 5 10 15
Val Gly Gly Val Val Ile Ala Cys
20
<210> 41
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<400> 41
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gly Ala Ile Ile Gly Leu
1 5 10 15
Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Cys
20 25
<210> 42
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<400> 42
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Lys Gly Ala Ile Ile Gly
1 5 10 15
Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
20 25
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
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Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Lys Gly Ala Ile Ile Gly
1 5 10 15
Leu Met Cys
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<400> 45
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Lys Gly Ala Ile Ile Gly
1 5 10 15
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<211> 19
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
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1 5 10 15
Gly Cys
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<400> 48
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1 5 10 15
Gly Cys
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<400> 49
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<400> 50
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Cys Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly
20 25
<210> 51
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<400> 51
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Cys
20 25
<210> 52
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<400> 52
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly
20 25
<210> 53
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthesized Peptide
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa is Glutathione
<400> 53
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Xaa
20 25
Claims (11)
- 이하의 (A) 내지 (F) 중에서 선택되는 펩티드:
(A) (a) 서열번호 1의 N 말단으로부터 1 내지 10번째, 2 내지 10번째, 3 내지 10번째, 1 내지 9번째, 2 내지 9번째 또는 1 내지 18번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드로부터 선택되는 펩티드와 (b) 서열번호 1의 N 말단으로부터 28 내지 36번째, 28 내지 37번째, 28 내지 38번째, 28 내지 39번째, 28 내지 40번째, 28 내지 41번째 또는 28 내지 42번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드 중에서 선택되는 펩티드를 결합시키고, 시스테인 또는 호모시스테인이 펩티드 (a)와 펩티드 (b)의 조합물의 C 말단에 결합된 펩티드；
(B) 서열번호 1의 N 말단으로부터 1 내지 26번째 또는 1 내지 27번째 아미노산 잔기로 구성되고, 시스테인 또는 호모시스테인이 N 말단으로부터 18번째와 19번째 아미노산 잔기 사이에 삽입된 펩티드；
(C) 서열번호 1의 N 말단으로부터 1 내지 28번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 N 말단으로부터 18번째와 19번째 아미노산 잔기 사이에 시스테인 또는 호모시스테인이 삽입되고, 그의 C 말단에 추가로 시스테인 또는 호모시스테인이 결합된 펩티드；
(D) 서열번호 1의 N 말단으로부터 1 내지 18번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 시스테인 또는 호모시스테인이 결합되고, 추가로 서열번호 1의 N 말단으로부터 28 내지 37번째 아미노산 잔기로 구성되는 펩티드가 결합되고, 그의 C 말단에 시스테인 또는 호모시스테인이 결합된 펩티드；
(E) 서열번호 1의 N 말단으로부터 1 내지 28번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 호모시스테인이 결합된 펩티드；
(F) 서열번호 1의 N 말단으로부터 1 내지 28번째 아미노산 잔기로 구성되고, 그의 C 말단에 시스테인 또는 호모시스테인이 결합된 2개 내지 5개의 펩티드를 상기 시스테인 또는 호모시스테인의 디설파이드 결합에 의해 연결시켜서 되는 펩티드. - 제1항에 있어서, 펩티드가
·서열번호 2 내지 19 중 어느 하나의 펩티드;
·서열번호 20으로 각각 구성되는 2개의 펩티드를 디설파이드 결합에 의해 결합시킨 펩티드;
·서열번호 20으로 구성되는 펩티드와 서열번호 21로 구성되는 펩티드를 디설파이드 결합에 의해 결합시킨 펩티드;
·서열번호 21로 각각 구성되는 2개의 펩티드를 디설파이드 결합에 의해 결합시킨 펩티드; 및
·서열번호 21로 구성되는 복수개의 펩티드를 디설파이드 결합에 의해 결합시킨 펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 펩티드인 펩티드. - 제1항 또는 제2항에 따른 펩티드를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료제.
- 제1항 또는 제2항에 따른 펩티드의 아미노산 서열을 코드 하는 유전자 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 유효한 DNA 백신.
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