ES2688118T3 - Mimotopos de alfa-sinucleína y vacunas de los mismos para el tratamiento de los trastornos neurodegenerativos - Google Patents

Mimotopos de alfa-sinucleína y vacunas de los mismos para el tratamiento de los trastornos neurodegenerativos Download PDF

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Markus Mandler
Harald Weninger
Radmila Santic
Edith Kopinits
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Abstract

Utilización de por lo menos un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en DQPVLPD, DMPVLPD, DSPVLPD, DQPVLPDN, DMPVLPDN, DSPVLPDN, HDRPVTPD, DRPVTPD, DVPVLPD, DTPVYPD, DTPVIPD, HDRPVTPDN, DRPVTPDN, DVPVLPDN, DTPVYPDN, DQPVLPDG, DMPVLPDG, DSPVLPDG, DHPVHPDS, DMPVSPDR, DRPVYPDI, DHPVTPDR, DTPVLPDS, DMPVTPDT, DAPVTPDT, DSPVVPDN, DLPVTPDR, DSPVHPDT, DAPVRPDS, DMPVWPDG, DRPVQPDR, YDRPVQPDR, DMPVDADN, DQPVLPD y DMPVLPD, en la que dicho compuesto comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable acoplado a la secuencia de aminoácidos, presentando dicho compuesto una capacidad de unión a un anticuerpo que es específico para un epítopo de alfa-sinucleína que comprende la secuencia de aminoácidos DMPVDPDN y resultando apto para inducir la formación in vivo de anticuerpos que se unen a la alfa-sinucleína para producir un medicamento para prevenir y/o tratar las sinucleinopatías.

Description

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DESCRIPCION
Mimotopos de alfa-sinucleína y vacunas de los mismos para el tratamiento de los trastornos neurodegenerativos
La presente invención se refiere a un medicamento destinado a la prevención y/o al tratamiento de las sinucleinopatías.
Las sinucleinopatías son un grupo diverso de trastornos neurodegenerativos que comparten una característica patológica común: en el examen neuropatológico pueden detectarse lesiones características que contienen agregados anormales de proteína alfa-sinucleína (alfa-sin "alpha-syn") en poblaciones seleccionadas de neuronas y células gliales. Alfa-sin (inicialmente denominada PARK1 y PARK4) es una proteína de 140 aminoácidos ampliamente expresada en el neocórtex, hipocampo, giro dentado, bulbo olfativo, cuerpo estriado, tálamo y cerebelo. Alfa-sin también se expresa a nivel elevado en células hematopoyéticas, incluyendo las células B, T y NK, así como en monocitos y plaquetas. No se conoce cuál es la función exacta en estas células pero se ha relacionado con la diferenciación de los megacariocitos (precursores de las plaquetas).
Entre las sinucleinopatías más comunes se incluyen, aunque sin limitación, los trastornos de cuerpos de Lewy (LBD), tales como la enfermedad de Parkinson (PD), la enfermedad de Parkinson con demencia (PDD) y la demencia con cuerpos de Lewy (DLB), así como la atrofia multisistémica (MSA) o la neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro de tipo I (NBIA de tipo I). Entre las opciones de tratamiento actuales para estas enfermedades se incluyen medicaciones sintomáticas tales como la L-dopa, los fármacos anticolinérgicos, así como los inhibidores de la monoamina oxidasa. Sin embargo, todas las oportunidades de tratamiento actuales sólo llevan a un alivio sintomático pero no inducen un efecto duradero de modificación de la enfermedad en el paciente.
Los trastornos de cuerpos de Lewy (LBD) son trastornos neurodegenerativos progresivos caracterizados por temblores, rigidez, bradiquinesia y pérdida de neuronas dopaminérgicas en el cerebro. En el caso de la DLB y la PDD, entre los signos también se incluyen alteraciones cognitivas. En los países occidentales hasta 2% de la población de más de 60 años desarrolla los signos típicos de LBD/PDD. En la actualidad sólo se dispone de tratamientos sintomáticos. Desafortunadamente estas terapias sólo proporcionan un alivio temporal de los primeros síntomas y no detienen la progresión de la enfermedad.
La patogénesis de LBD/PDD todavía no se entiende por completo pero aparentemente en el desarrollo de la enfermedad intervienen la susceptibilidad genética y los factores ambientales. A pesar de todos los avances en la genética, la LBD/PDD es considerada principalmente un trastorno esporádico sin causa conocida (también se denomina LBD/PDD idiopática). Los pacientes que sufren esta enfermedad desarrollan inclusiones intracelulares ubiquitinadas características denominadas cuerpos de Lewy (CL) en las áreas corticales y subcorticales del cerebro. Especialmente las regiones con un contenido elevado de neuronas dopaminérgicas o proyecciones neuronales muestran este típico rasgo patológico.
Recientemente varios estudios han podido demostrar que la proteína sináptica alfa-sin desempeña un papel crucial en la patogénesis de la LBD. En la LBD, se acumula alfa-sin en los cuerpos de Lewy (CL) en todas las áreas cerebrales afectadas. Además, ha podido demostrarse que las mutaciones puntuales, así como las duplicaciones o las multiplicaciones del gen alfa-sin están asociadas a formas familiares raras de parquinsonismo. Se destaca que, basándose en los resultados de estudios de sobreexpresión en ratones transgénicos (tg), así como en Drosophila melanogaster, su papel crucial en la patogénesis de LBD/PDD resulta corroborado, ya que estos modelos animales mimetizan varias características de la PD.
Otra sinucleinopatía muy importante es la atrofia multisistémica (MSA). La MSA es un trastorno neurodegenerativo esporádico que se caracteriza por síntomas de parquinsonismo resistente a L-DOPA, ataxia cerebelar y disautonomía. Los pacientes sufren pérdida neuronal multisistémica, que afecta a diversas áreas cerebrales, entre ellas el cuerpo estriado, la sustancia negra, el cerebelo, el puente, así como las olivas inferiores y la médula espinal. La MSA se caracteriza por inclusiones citoplasmáticas gliales (ICG) positivas para alfa-sin e inclusiones neuronales raras en todo el sistema nervioso central. Estas inclusiones se asocian a degeneración estriatonigral, atrofia olivopontocerebelar y afectación de los núcleos autonómicos de la médula y de la médula espinal. La importancia de las ICG para la patogénesis de la MSA es generalmente reconocida y ha sido corroborada por recientes análisis de modelos de ratón transgénico que analizan el efecto de la sobreexpresión de alfa-sin en la oligodendroglia. En ratones tg que sobreexpresan alfa-sin humana, se observan tanto agregados de tipo ICG como marcadores bioquímicos de MSA.
Aunque no se entienden por completo los mecanismos exactos por los que la acumulación de alfa-sin conduce a las características típicas de la neurodegeneración en las sinucleopatías y a los síntomas característicos de las sinucleopatías, algunos estudios recientes sugieren que la formación y acumulación anormales de oligómeros de alfa-sin participan en los procesos degenerativos subyacentes a la sinucleinopatía. En la actualidad se cree que dicha formación de oligómeros, por ejemplo, en los terminales sinápticos y axones, desempeña un papel importante en el desarrollo de la PD/LBD. Por lo tanto, la reducción de la deposición y oligomerización de alfa-sin debería resultar beneficiosa en el tratamiento de las sinucleopatías, especialmente de la LBD/PD y MSA idiopáticas y podría
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proporcionar la primera estrategia de tratamiento de estas enfermedades neurodegenerativas que se sume al mero alivio de los síntomas que resulta de las estrategias de tratamiento actuales tales como la aplicación de L-DOPA.
En Iwatsubo T. (Neuropathology 27(5):474-478, 2007), se examina la correlación de las deposiciones de alfa- sinucleína, así como su forma fosforilada, con la patogénesis de las alfa-sinucleopatías. El autor de dicha publicación ha descubierto que la serina 129 de la alfa-sinucleína depositada en las lesiones de la sinucleopatía se encuentra ampliamente fosforilada.
El documento US 2007/213253 se refiere a alfa-sinucleína humana mutante, así como a péptidos derivados de la misma, que pueden utilizarse para inhibir la agregación de la alfa-sinucleína humana de tipo salvaje.
En el documento WO 2004/041067 se dan a conocer medios y métodos para prevenir o tratar enfermedades asociadas a la agregación de la alfa-sinucleína que comprenden la utilización de fragmentos de alfa-sinucleína.
En el documento US 2003/166558 se describen péptidos que pueden utilizarse para inducir una respuesta inmunológica frente a depósitos de proteínas.
El documento US 2005/198694 se refiere a fragmentos de alfa-sinucleína que comprenden por lo menos 100 aminoácidos y que presenta una deleción C-terminal de 1 a 23 aminoácidos.
Aunque las terapias experimentales con factores neurotróficos y la injertación de células dopaminérgicas han proporcionado resultados prometedores, se necesitan enfoques alternativos diseñados para reducir la acumulación neuronal de alfa-sin.
Recientemente la inmunoterapia activa y pasiva ha despertado interés como potencial nueva estrategia de tratamiento para enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad priónica, así como la corea de Huntington y la esclerosis lateral amiloide (ELA). Por ejemplo, algunos estudios recientes en modelos de ratón tg de EA han demostrado que los anticuerpos contra el beta-amiloide 1-42 (Ap) fomentan la eliminación del amiloide del cerebro, resultando en un rendimiento cognitivo mejorado. Se destaca que las moléculas de Ap se localizan principalmente fuera de la célula y, de esta manera, constituyen epítopos accesibles al sistema inmunológico. En contraste con estas dianas 'clásicas' para la inmunoterapia, se han llevado a cabo experimentos para evaluar el potencial de la inmunoterapia en la reducción de la acumulación de moléculas patogénicas intracelulares. Se ha demostrado que los enfoques de vacunación con diana en la proteína priónica y la huntingtina resultan eficaces en las neuronas de ratones tg para reducir la acumulación de ambas moléculas, las cuales, al igual que alfa-syn, se acumulan intracelularmente. Además, algunos experimentos recientes también describen terapias anti-Tau y anti-SOD1 como nuevas estrategias de tratamiento contra agregados intracelulares de proteínas patogénicas en la EA y la ELA, respectivamente. De esta manera, se están acumulando pruebas convincentes de que los agregados intracelulares en las células cerebrales pueden ser dianas para la inmunoterapia. En efecto, recientemente se ha demostrado un potencial similar para el tratamiento de las sinucleopatías. Se han vacunado ratones tg que sobreexpresaban alfa-sin humana con proteína alfa-sin humana. En ratones que producían anticuerpos de afinidad relativa elevada tras la vacunación, se produjo una menor acumulación de alfa-sin agregada en los cuerpos de las células neuronales y sinapsis que se relacionó con una reducción de la neurodegeneración. Además, los anticuerpos producidos por los animales inmunizados también detectaron formas agregadas anormales de alfa-sin asociadas a la membrana neuronal y fomentaron la degradación de estos agregados, probablemente a través de rutas lisosómicas. Se observaron efectos similares utilizando inmunoterapia pasiva con un anticuerpo específico de alfa-sin aplicado exógenamente. Estos resultados sugieren que la vacunación resulta eficaz para reducir la acumulación neuronal de agregados de alfa-sin y que el desarrollo adicional de este enfoque podría inducir efectos beneficiosos en el tratamiento de la DLB y las sinucleinopatías.
Es un objetivo de la presente invención proporcionar un medicamento para prevenir y tratar sinucleinopatías basado en una vacuna. Por lo tanto, se proporciona la presente invención, como se define en las reivindicaciones.
Es divulgada además la utilización de por lo menos un compuesto que comprende la secuencia de aminoácidos
(X1 )nX2XaPVX4X5X6(Xy)m (formula 1)
en el que
X1 es cualquier residuo aminoácido,
X2 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en ácido aspártico (D) y ácido glutámico
(E),
X3 es cualquier residuo aminoácido, X4 es cualquier residuo aminoácido,
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X5 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en prolina (P) y alanina (A),
X6 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en ácido aspártico (D) y ácido glutámico
(E),
X7 es cualquier residuo aminoácido,
n y m, independientemente, son 0 o un número entero superior a 0,
y en el que la secuencia de aminoácidos según la fórmula I no es idéntica a, o no comprende, el fragmento de polipéptido 8-mero de alfa-sinucleína que presenta la secuencia de aminoácidos DMPVDPDN,
presentando dicho compuesto una capacidad de unión a un anticuerpo que es específico para un epítopo de alfa- sinucleína que comprende la secuencia de aminoácidos DMPVDPDN
para producir un medicamento para prevenir y/o tratar una sinucleinopatía.
Los compuestos según la presente invención pueden inducir la formación in vivo de anticuerpos dirigidos (ligantes) a la alfa-sinucleína, en particular al epítopo de la alfa-sinucleína que comprende la secuencia de aminoácidos DMPVDPDN (incluyendo también fragmentos de la alfa-sinucleína que comprenden dicha secuencia de aminoácidos). Sin embargo, los anticuerpos dirigidos (ligantes) a dicho epítopo muestran una inmunorreactividad nula o sólo significativamente más baja con la beta-sinucleína que con la alfa-sinucleína. En contraste con lo expuesto anteriormente, los anticuerpos inducidos mediante la inmunización con el epítopo de alfa-sinucleína original que comprende DMPVDPDN se unen inesperadamente a tanto la alfa-sinucleína como a la beta-sinucleína. Por lo tanto, al contrario que la alfa-sinucleína original o fragmento o fragmentos de la misma, los compuestos según la presente invención proporcionan una especificidad para el agente relacionado con la enfermedad y evitan la reactividad cruzada con la beta-sinucleína no relacionada con la enfermedad. Lo anterior sugiere fuertemente una superioridad significativa de eficacia y seguridad, especialmente ésta última debido a las características neuroprotectoras que han sido descritas para la beta-sinucleína (Hashimoto M. et al., J. Biol. Chem. 279(22):23622- 9, 28 de mayo de 2004; Hashimoto M., Neuron. 32(2):213-23, 25 de octubre de 2001).
Los anticuerpos específicos para alfa-sinucleína inducidos mediante la administración de los compuestos de la presente invención podrían no sólo unirse a formas monoméricas de la alfa-sinucleína sino también a formas multiméricas. Esto permite reducir la cantidad de oligómeros de alfa-sinucleína en el cuerpo del individuo que debe someterse a tratamiento. La reducción de la cantidad de alfa-sinucleína resulta particularmente beneficiosa en el tratamiento de las sinucleopatías.
La secuencia de aminoácidos (X-i)nX2X3PVX4X5X6(X7)m se considera que es un mimotopo del epítopo de la alfa- sinucleína que comprende la secuencia de aminoácidos DMPVDPDN. Según la presente invención, el término "mimotopo" se refiere a una molécula que presenta una conformación con una topología equivalente al epítopo del que es un mimético. El mimotopo se une a la misma región de unión a antígeno de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un antígeno deseado. El mimotopo inducirá una respuesta inmunológica en un huésped que es reactivo frente al antígeno del que es un mimético. El mimotopo también puede actuar como competidor del epítopo del que es un mimético en ensayos de inhibición in vitro (por ejemplo ensayos ELISA de inhibición) que incluyan el epítopo y un anticuerpo ligante de dicho epítopo. Sin embargo, un mimotopo de la presente invención puede no necesariamente bloquear o competir por la unión del epítopo del que es un mimético en un ensayo de inhibición in vitro, aunque sea capaz de inducir una respuesta inmunológica específica al administrarlo en un mamífero.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "epítopo" se refiere a una región inmunogénica de un antígeno que es reconocida por una molécula de antígeno particular. En general, un antígeno presentará uno o más epítopos, cada uno capaz de unirse a un anticuerpo que reconoce el epítopo particular.
Los mimotopos de la presente invención pueden ser producidos sintéticamente mediante métodos de síntesis química que son bien conocidos de la técnica, en forma de un péptido aislado o como parte de otro péptido o polipéptido. Alternativamente, el mimotopo péptido puede ser producido en un microorganismo que produce el mimotopo péptido, que seguidamente es aislado y, si se desea, purificado adicionalmente. El mimotopo péptido puede producirse en microorganismos, tales como bacterias, levaduras u hongos, en células eucarióticas tales como una célula de mamífero o de insecto, o en un vector vírico recombinante, tal como adenovirus, poxvirus, herpesvirus, virus del bosque Simliki, baculovirus, bacteriófagos, virus sindbis o virus sendai. Entre las bacterias adecuadas para producir el mimotopo péptido se incluyen E. coli, B. subtilis o cualquier otra bacteria que sea capaz de expresar péptidos, tal como el mimotopo péptido. Entre los tipos de levadura adecuados para expresar el mimotopo péptido se incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccaromyces pombe, Candida, Pichia pastoris o cualquier otra levadura capaz de expresar péptidos. Son bien conocidos en la técnica unos métodos correspondientes. También son conocidos en la técnica métodos para aislar y purificar péptidos producidos recombinantemente y entre ellos se
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incluyen, por ejemplo, la filtración en gel, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de intercambio iónico, etc.
Con el fin de facilitar el aislamiento del mimotopo péptido, puede prepararse un polipéptido de fusión en el que el mimotopo péptido se fusiona traduccionalmente (unión covalente) a un polipéptido heterólogo que permite el aislamiento mediante cromatografía de afinidad. Los polipéptidos heterólogos típicos son la etiqueta de His (por ejemplo His6, 6 residuos de histidina), la etiqueta GST (glutatión-S-transferasa), etc. El polipéptido de fusión facilita no sólo la purificación de los mimotopos sino que también evita que el mimotopo polipéptido resulte degradado durante la purificación. Si se desea eliminar el polipéptido heterólogo tras la purificación, el polipéptido de fusión puede comprender un sitio de corte en la unión entre el mimotopo péptido y el polipéptido heterólogo. El sitio de corte consiste de una secuencia de aminoácidos que es cortada con un enzima específico para la secuencia de aminoácidos en el sitio (por ejemplo proteasas).
Los mimotopos de la presente invención también pueden modificarse en los extremos N- o C-terminales o en un sitio próximo a los mismos, de manera que en dichas posiciones se una un residuo de cisteína. En una forma de realización preferida, se utilizan residuos de cisteína situados en una posición terminal (localizados en los extremos N- y C-terminales del péptido) para ciclizar los péptidos mediante un enlace disulfuro.
Los mimotopos de la presente invención también pueden utilizarse en diversos ensayos y kits, en particular en ensayos y kits inmunológicos. Por lo tanto, resulta particularmente preferido que el mimotopo sea parte de otro péptido o polipéptido, particularmente un enzima que se utiliza como informador en ensayos inmunológicos. Entre dichos enzimas informadores se incluyen, por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante.
Los mimotopos de alfa-sinucleína según la presente invención preferentemente son polipéptidos antigénicos que en su secuencia de aminoácidos varían respecto a la secuencia de aminoácidos de la alfa-sinucleína o de fragmentos de la alfa-sinucleína.
Según la presente invención, el término "sinucleinopatía" incluye todos los trastornos neurodegenerativos caracterizados por las agregaciones patológicas de sinucleína. Varios trastornos neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de cuerpos de Lewy (LBD), la enfermedad de cuerpos de Lewy difusa (LBDD), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB), el parquinsonismo con demencia (PDD), la atrofia multisistémica (MSA) y la neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro de tipo I (NBIA de tipo I) se agrupan colectivamente como sinucleinopatías.
El compuesto según la presente invención puede utilizarse no sólo para tratar las sinucleinopatías sino también prevenir dichas enfermedades en individuos en riesgo de desarrollar una sinucleinopatía (por ejemplo predispuestos, por ejemplo predispuestos genéticamente a desarrollar una sinucleinopatía).
Las abreviaturas de los residuos aminoácidos dadas a conocer en la presente invención siguen las recomendaciones de la IUPAC:
Aminoácido
Código de 3 letras Código de 1 letra
Alanina
Ala A
ARginina
Arg R
Asparagina
Asn N
Aspártico
Asp D
Cisteína
Cys C
Glutámico
Glu E
Glutamina
Gln Q
Glicina
Gly G
Histidina
His H
Isoleucina
Ile I
Leucina
Leu L
Lisina
Lys K
Metionina
Met M
Fenilalanina
Phe F
Prolina
Pro P
Serina
Ser S
Treonina
Thr T
Triptófano
Trp W
Tirosina
Tyr Y
Valina
Val V
Según una forma de realización preferida de la presente invención, el compuesto comprende además un residuo aminoácido acetilado o cisteína (C).
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Es divulgado asimismo que en la fórmula I X2 es ácido de glutamina, pudiendo así dicho ácido de glutamina asimismo derivar a un ácido piroglutámico. Si X2 comprende un ácido piroglutámico X1 es 0.
Es divulgado además que en la fórmula I X3 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en glutamina (Q), serina (S), treonina (T), arginina (R), asparagina (N), valina (V), histidina (H), metionina (M), tirosina (Y), alanina (A) y leucina (L).
Es divulgado además que en la fórmula I X4 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en glutamina (Q), triptófano (W), treonina (T), arginina (R), ácido aspártico (D), isoleucina (I), valina (V), histidina (H), prolina (P), tirosina (Y), alanina (A), serina (S) y leucina (L).
Es divulgado un compuesto que puede consistir en la secuencia de aminoácidos (X-i)nX2X3PVX4X5X6(Xy)m, en el que n y m son independientemente 0 o 1 o ser parte de un polipéptido que comprende por lo menos 7 residuos aminoácidos, preferentemente por lo menos 10 residuos aminoácidos, más preferentemente por lo menos 15 residuos aminoácidos y/o un máximo de 50 residuos aminoácidos, preferentemente un máximo de 30 residuos aminoácidos, más preferentemente 16 residuos aminoácidos.
Inesperadamente, ha resultado que los compuestos según la presente invención que comprenden las secuencias de aminoácidos presentadas anteriormente resultan particularmente adecuados para la utilización en la preparación de un medicamento destinado a la utilización en el tratamiento o la prevención de sinucleinopatías. Estos péptidos (mimotopos) pueden inducir la formación in vivo de anticuerpos dirigidos contra el epítopo original de la alfa- sinucleína humana que comprende la secuencia de aminoácidos DMPVDPDN y la proteína alfa-sinucleína humana misma. Sin embargo, dichos péptidos (mimotopos) no pueden inducir o sólo son capaces de inducir una inmunorreactividad muy limitada contra la proteína beta-sinucleína humana. Inesperadamente, algunos anticuerpos inducidos por la alfa-sinucleína original (que comprende la secuencia de aminoácidos DMPVDPDN) se unen a la alfa-sinucleína además de a la beta-sinucleína de manera específica. De esta manera, dichos péptidos (mimotopos) inducen una respuesta inmunológica (anticuerpos) más refinada que el péptido original. Sin embargo, las respuestas inmunológicas inducidas por mimotopo no discriminan necesariamente entre la alfa-sinucleína y la beta-sinucleína. Los anticuerpos inducidos por péptido son responsables de la eliminación de la alfa-sinucleína (que participa en la formación de agregados de alfa-sinucleína, cuerpos de Lewy) y/o de la disolución d agregados de alfa-sinucleína (cuerpos de Lewy) en un individuo.
Los péptidos presentados anteriormente pueden comprender en el extremo N-terminal el residuo de cisteína o no, evidentemente el residuo C también puede añadirse al extremo C-terminal. Por lo tanto, la presente invención comprende los péptidos siguientes sin el residuo de cisteína en su extremo N-terminal o C-terminal: DQPVLPD, DMPVLPD, DSPVLPD, DSPVWAE, DTPVLAE, DQPVLPDN, DMPVLPDN, DSPVLPDN, DQPVTAEN, DSPVWAEN, DTPVLAEN, HDRPVTPD, DRPVTPD, DVPVLPD, DTPVYPD, DTPVIPD, HDRPVTPDN, DRPVTPDN, DNPVHPEN, DVPVLPDN, DTPVYPDN, DTPVIPDN, DQPVLPDG, DMPVLPDG, DSPVLPDG, DSPVWAEG, DRPVAPEG, DHPVHPDS, DMPVSPDR, DSPVPPDD, DQPVYPDI, DRPVYPDI, DHPVTPDR, EYPVYPES, DTPVLPDS, DMPVTPDT, DAPVTPDT, DSPVVPDN, DLPVTPDR, DSPVHPDT, DAPVRPDS, DMPVWPDG, DAPVYPDG, DRPVQPDR, YDRPVQPDR, DMPVDPEN, DMPVDADN, EMPVDPDN y DNPVHPE.
El compuesto según la presente invención puede utilizarse para la preparación de un medicamento, en particular una vacuna, que puede utilizarse para tratar las alfa-sinucleinopatías, en el que el medicamento resulta particularmente adecuado para tratar una sinucleinopatía seleccionada de entre el grupo que consiste en enfermedad de Parkinson (PD), la enfermedad de cuerpos de Lewy (LBD), la enfermedad de cuerpos de Lewy difusa (TCLD), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB), el parquinsonismo con demencia (PDD), la atrofia multisistémica (MSA) o la neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro de tipo I (NBIA de tipo I).
Según la presente invención, el compuesto se acopla a un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente hemocianina de lapa americana (KLH), toxoide tetánico, proteína de unión a albúmina, albúmina de suero bovino, un dendrímero (MAP, Biol. Chem. 358:581), conectores peptídicos (o regiones flanqueantes), así como sustancias adyuvantes indicadas en Singh et al., Nat. Biotech. 17:1075-1081, 1999 (en particular las indicadas en la Tabla 1 de este documento) y O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9):727-735, 2003 (en particular los compuestos inmunopotenciadores endógenos y sistemas de administración descritos en dicho documento), y otros o mezclas de los mismos. La química de conjugación (por ejemplo mediante compuestos heterobifuncionales tales como GMBS y, evidentemente, también otros tal como se indica en "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson) en el presente contexto puede seleccionarse de entre reacciones conocidas por el experto en la materia. Además, la composición de vacuna puede formularse con un adyuvante, preferentemente una composición de aluminio de baja solubilidad, en particular hidróxido de aluminio. Evidentemente pueden utilizarse adyuvantes como fosfato de aluminio MF59, fosfato de calcio, citoquinas (por ejemplo IL-2, iL-12, GM-CSF), saponinas (por ejemplo QS21), derivados de MDP, oligos de CpG, IC31, LPS, MPL, polifosfacenos, emulsiones (por ejemplo de Freund, SAF), liposomas, virosomas, iscomas, cocleatos, micropartículas de PLG, partículas de poloxámero, partículas de tipo vírico, enterotoxina termolábil (ET), toxina del cólera (TC), toxinas mutantes (por ejemplo LTK63 y LTR72), micropartículas y/o liposomas polimerizados.
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El compuesto de la presente invención preferentemente se encuentra unido al portador o adyuvante mediante un conector, que se selecciona de entre el grupo que consiste en NHS-poli(óxido de etileno) (PEO) (por ejemplo, NHS- PEO4-maleimida).
Puede administrarse una vacuna que comprende el presente compuesto (mimotopo) y el portador farmacéuticamente aceptable mediante cualquier modo de aplicación adecuado, por ejemplo i.d., i.v., i.p., i.m., intranasalmente, oralmente, subcutáneamente, etc. y en cualquier dispositivo de administración adecuado (O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9):727-735, 2003). El compuesto de la presente invención preferentemente se formula para la administración intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular (ver, por ejemplo, "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc., 2004).
Típicamente, la vacuna contiene el compuesto según la invención en una cantidad de entre 0,1 ng y 10 mg, preferentemente de entre 10 ng y 1 mg, en particular de entre 100 ng y 100 |jg, o alternativamente, por ejemplo entre 100 fmoles y 10 jmoles, preferentemente entre 10 pmoles y 1 jmoles, en particular entre 100 pmoles y 100 nmoles. Típicamente, la vacuna puede contener además sustancias auxiliares, por ejemplo tampones, estabilizadores, etc.
Según una forma de realización preferida de la presente invención, el péptido se acopla a un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente KLH (hemocianina de lapa americana).
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una formulación farmacéutica, preferentemente una vacuna, que comprende por lo menos un péptido según la presente invención y que se selecciona de entre el grupo que consiste en (C)DQPVLPD, (C)DMPVLPD, (C)DSPVLPD, (C)DSPVWAE, (C)DTPVLAE, (C)DQPVLPDN, (C)DMPVLPDN, (C)DSPVLPDN, (C)DQPVTAEN, (C)DSPVWAEN, (C)DTPVLAEN, (C)HDRPVTPD, (C)DRPVTPD, (C)DVPVLPD, (C)DTPVYPD, (C)DTPVIPD, (C)HDRPVTPDN, (C)DRPVTPDN, (C)DNPVHPEN, (C)DVPVLPDN, (C)DTPVYPDN, (C)DTPVIPDN, (C)DQPVLPDG, (C)DMPVLPDG, (C)DSPVLPDG, (C)DSPVWAEG, (C)DRPVAPEG, (C)DHPVHPDS, (C)DMPVSPDR, (C)DSPVPPDD, (C)DQPVYPDI, (C)DRPVYPDI, (C)DHPVTPDR, (C)EYPVYPES, (C)DTPVLPDS, (C)DMPVTPDT, (C)DAPVTPDT, (C)DSPVVPDN, (C)DLPVTPDR, (C)DSPVHPDT, (C)DAPVRPDS, (C)DMPVWPDG, (C)DAPVYPDG, (C)DRPVQPDR, (C)YDRPVQPDR, (C)DMPVDPEN, (C)DMPVDADN, DQPVLPD(C), DMPVLPD(C), (C)EMPVDPDN y (C)DNPVHPE.
La formulación farmacéutica según la presente invención, que puede formularse como vacuna para, por ejemplo, la administración subcutánea, intravenosa y/o intramuscular, puede utilizarse en el tratamiento de cualquier tipo de sinucleinopatía.
La presente invención se ilustra adicionalmente en las figuras y ejemplos siguientes, aunque sin que se considere limitada a los mismos.
La figura 1 representa la detección de epítopos específicos de alfa-sinucleína mediante ELISA utilizando un anticuerpo monoclonal específico para la alfa-sinucleína humana en las posiciones 115 a 122.
Los péptidos p4446 (alfa-sinucleína), p4449 y p4448 (epítopos humanos) se detectan con el anticuerpo. Los péptidos de control negativo p4447 (beta-sinucleína) y p4450, p4451 (epítopos de ratón) no se detectan. El péptido irrelevante p1252 no muestra unión en el ensayo ELISA. Se presentan los datos en una escala lineal.
La figura 2 representa la detección de mimotopos mediante ELISA utilizando un anticuerpo monoclonal específico para la alfa-sinucleína humana en las posiciones 115 a 122. Se muestran los datos para dos mimotopos (p4553 y p4557). El péptido p4557 muestra una unión más débil que el péptido original p4448. El péptido p4553 muestra una unión fuerte al anticuerpo de detección. El péptido irrelevante p1253 no muestra ninguna unión en el ensayo ELISA, tal como se esperaba. Ambos mimotopos indujeron títulos>1/20.000 tras la vacunación de ratones y se consideran ligantes fuertes.
La figura 3 representa la detección de la competición de mimotopos mediante ELISA utilizando un anticuerpo monoclonal específico para la alfa-sinucleína humana en las posiciones 115 a 122.
Los valores ilustrados se midieron mediante ELISA utilizando 40 jg de péptido en el ensayo de inhibición. El péptido irrelevante p1253 y el mimotopo p4492 no muestran competición en comparación con el péptido original p4448. Los mimotopos p4490 y p4491 muestran una competición similar a la del péptido original p4448. Se calcula la competición mediante la comparación de la DO en el ELISA a una concentración de péptido de 40 jg con el epítopo original. Se compararon todos los mimotopos con dicha referencia, resultando en un índice de competición. Los valores de aproximadamente 1 indican una elevada capacidad de inhibición. Los péptidos con un índice de competición superior a 5 se consideran no competidores.
La figura 4 representa la respuesta inmunológica contra el péptido inyectado y un péptido irrelevante.
A) Los sueros de ratones inmunizados mostraban unos títulos elevados contra los péptidos inyectados (epítopo original (p4448) y mimotopos (p4456, p4466 y p4467, respectivamente)) tras 4 vacunaciones. Los títulos
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medidos en el ELISA eran de aproximadamente 1:10.000 (DO semimáxima); los datos se representan en una escala logarítmica. Como control positivo para el ELISA se utilizó un anticuerpo monoclonal específico para la alfa-sinucleína (control pos.).
B) En los mismos sueros de ratones inmunizados no se consiguió detectar un péptido irrelevante (p1253). Los títulos medidos en el ELISA eran inferiores a 1:100 (DO semimáxima), más de 100 veces inferiores a la señal de un anticuerpo monoclonal específico para el péptido irrelevante (control pos.). Como control negativo se dejó de utilizar anticuerpo primario. Los datos se presentan en una escala lineal.
La figura 5 representa una respuesta inmunitaria contra las sinucleínas, tras las inmunizaciones repetidas con mimotopo.
A) Los sueros agrupados de todos los animales dentro de los grupos respectivos mostraban títulos de anticuerpos contra p4448, un péptido situado en la parte C-terminal de la alfa-sinucleína. Se presentan los datos en una escala logarítmica.
B) Los sueros agrupados de ratones inmunizados (p4448, p4457 y p4463) mostraban títulos contra la alfa- sinucleína tras 4 vacunaciones. Los sueros agrupados de los ratones inmunizados (p4466 y p4467) no detectaron ni la alfa-sinucleína ni la beta-sinucleína (los títulos medidos en el ELISA eran mucho menores que 1:100 semimax.). Los sueros agrupados de los ratones inmunizados con el epítopo original (p4448) detectaron la alfa-sinucleína y la beta-sinucleína. Los títulos en el ELISA, que eran inferiores a 1:100 semimax., se indican con un asterisco, correspondientes a valores próximos al nivel de fondo. La mayoría de los mimotopos sometidos a ensayo indujeron anticuerpos que no reaccionaban cruzadamente con la beta- sinucleína. Los datos se presentan en una escala logarítmica.
La figura 6A muestra una tinción de control positivo en la que se utiliza un anticuerpo disponible comercialmente que detecta específicamente a-sin humana. En 6B se utilizó el mismo anticuerpo para teñir cerebros de ratón no transgénico del mismo área, sin conseguir detectar ningún tejido positivo para a-sin, ya que este animal no expresaba la a-sin humana. En 6C una tinción de a-sin específica similar a la tinción presente en 6A fue inducida por un suero inducido por un mimotopo (suero inducido por p4498). Una tinción positiva para a-sin en el hipocampo murino se caracteriza por los patrones de tinción moteada mostrados en 6A y 6C. Las flechas indican tres ejemplos de dichas inclusiones positivas para a-sin en 6A y 6C, respectivamente.
Ejemplos
Un anticuerpo que puede utilizarse para la identificación de los mimotopos según la presente invención detecta la secuencia de aminoácidos derivada de la alfa-sinucleína humana DMPVDPDN (=epítopo original, SEC ID n° 1) y la alfa-sinucleína humana de longitud completa. No reconoce la beta-sinucleína humana. El anticuerpo puede ser una preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales o cualquier parte de anticuerpo o derivado del mismo y se une específicamente al epítopo DMPVDPDN de la alfa-sinucleína humana, es decir, se une al péptido y a la proteína de longitud completa pero no se une a la beta-sinucleína humana.
Se identificaron los mimotopos y se caracterizaron adicionalmente mediante la utilización de dichos anticuerpos monoclonales (que detectan una secuencia comprendida entre los aminoácidos 115 a 122 de la proteína alfa- sinucleína humana) y bibliotecas de péptidos.
Ejemplo 1: generación de anticuerpos monoclonales para detectar específicamente el epítopo C-DMPVDPDN de la alfa-sinucleína humana original y la alfa-sinucleína humana pero no la beta-sinucleína humana
Anticuerpo monoclonal derivado de la fusión "AFFiRiS 3": se inmunizaron ratones Balb/c con el epítopo de alfa- sinucleína original C-DMPVDPDN acoplado a TGB (tiroglobulina bovina) y ACF (adyuvante completo de Freund; primera inyección) así como AIF (adyuvante incompleto de Freund; 3 inyecciones de refuerzo) como adyuvante. Se detectaron mediante ELISA (placas de ELISA recubiertas con péptido DMPVDPDN) hibridomas productores de anticuerpos específicos de péptido DMPVDPDN. Se utilizó alfa-sinucleína humana (proteína recombinante) como péptido de control positivo: se incluyeron hibridomas que reconocían la proteína recombinante inmovilizada sobre placas de ELISA debido a que se unen tanto a péptido como a alfa-sinucleína de longitud completa de manera específica. Como péptido de control negativo se utilizó beta-sinucleína humana (proteína recombinante): los hibridomas que reconocían ambas proteínas recombinantes inmovilizadas sobre placas ELISA fueron excluidos porque no distinguían entre las dos proteínas de sinucleína diferentes.
El clon de hibridoma (AFFiRiS3/9 (nombre interno "A509", IgG1) se analizó para la detección específica del epítopo DMPVDPDN de la alfa-sinucleína humana natural. El A509 reconoce el epítopo inyectado, así como la proteína alfa- sinucleína de longitud completa (proteína recombinante, obtenida de rPeptide, Bogart, GA, USA) en el ELISA. Sin embargo, no detecta la proteína beta-sinucleína (proteína recombinante, obtenida de rPeptide, Bogart, GA, USA) en el ELISA. Además, los anticuerpos A509 no detectaban el péptido codificante de la variante de ratón de la alfa- sinucleína. Pueden obtenerse resultados similares con clones de mAb disponibles comercialmente (es decir,
5
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65
anticuerpo monoclonal de alfa-sinucleína (LB509) número de catálogo SIG-39725; Covance (Princeton, NJ, USA)). Ejemplo 2: expresión fágica, ELISA in vitro de unión e inhibición
Las bibliotecas de expresión fágica utilizadas en el presente ejemplo fueron: Ph.D.7: New England BioLabs E8102L (biblioteca de 7mero lineal) y Ph.D.12: New England BioLabs E8111L (biblioteca de 12mero lineal). La expresión fágica se llevó a cabo siguiendo el protocolo del fabricante (
www.neb.com).
Tras 2 o 3 rondas posteriores de inmunoadsorción ("panning"), se recolectaron los clones de fago único y los sobrenadantes fágicos se sometieron a ELISA sobre placas recubiertas con el anticuerpo utilizado para el procedimiento de panning. Se secuenciaron los clones fágicos que eran positivos en este ELISA (señal fuerte para la diana, pero sin señal para el control no específico). A partir de las secuencias del ADN, se dedujeron las secuencias de los péptidos. Se sintetizaron estos péptidos y se caracterizaron en ELISA de unión e inhibición. A algunos péptidos se unieron AA adicionales al extremo C-terminal. Además, se crearon algunos nuevos mimotopos mediante la combinación de información de secuencia de mimotopos identificados en el cribado. Se utilizaron ambos grupos que contenían mimotopos recién diseñados con el fin de apoyar la identificación de una secuencia de consenso para la vacunación con mimotopos.
1. Ensayo de unión in vitro (ELISA)
Se unieron péptidos derivados de la expresión fágica así como variantes prolongadas por el extremo C-terminal de los mismos a ASB, y se ligaron a placas de ELISA (1 jM, tal como se indica en las figuras respectivas) y posteriormente se incubaron con el anticuerpo monoclonal que se había utilizado para el procedimiento de cribado con el fin de analizar la capacidad de unión de los péptidos identificados.
2. Ensayo in vitro de inhibición (ELISA)
Se incubaron cantidades diferentes de péptidos (concentraciones comprendidas entre 40 jg y 0,3 jg (diluciones en serie), tal como se indica en las figuras respectivas) con el anticuerpo monoclonal que se había utilizado para el procedimiento de cribado. Los péptidos que redujeron la unión posterior del anticuerpo al epítopo de alfa-sinucleína humana original (aminoácidos 1l5 a 122 de la proteína alfa-sinucleína humana) recubiertos sobre placas de ELISA se consideraron inhibidores en el presente ensayo.
Ejemplo 3: ensayo in vivo de mimotopos, análisis de inmunogenicidad y reactividad cruzada
1. Ensayos in vivo de mimotopos
Se acoplaron los péptidos inhibidores, así como los no inhibidores, a KLH y se inyectaron en ratones (ratones C57/B16 de tipo salvaje, inyección subcutánea en el flanco) conjuntamente con un adyuvante apropiado (hidróxido de aluminio). Los animales se vacunaron 4 a 6 veces a intervalos de dos semanas y se extrajeron sueros también cada dos semanas. Los títulos contra los péptidos inyectados, así como contra un péptido irrelevante, se determinaron con cada suero. Los títulos contra proteína alfa-sinucleína humana recombinante y beta-sinucleína humana recombinante se determinaron a partir del suero 3, respectivamente. Los sueros agrupados se sometieron a ensayo frente al epítopo de la alfa-sinucleína humana original (aa115-122). En general, se analizaron los sueros mediante la reacción contra péptidos acoplados a albúmina de suero bovino (ASB) y proteínas de longitud completa recombinantes que se habían inmovilizado- sobre placas de ELISA. Se determinaron los títulos utilizando anticuerpos específicos anti-IgG de ratón. Ver los resultados detallados en las figuras 4 y 5.
2. Ensayos in situ de mimotopos
Los sueros seleccionados que inducían una reactividad cruzada contra a-sin también se sometieron a ensayo para la capacidad de detectar a-sin humano en secciones de cerebro de ratón in situ. Ver los resultados detallados en la figura 6.
3. Resultados
3.1. Identificación de un anticuerpo monoclonal (mAb) específico para alfa-sinucleína
La figura 1 ilustra la caracterización del anticuerpo monoclonal específico para alfa-sinucleína AFFiRiS3/9 (nombre interno: "A509", IgG1), derivado de la fusión AFFiRiS 3.
3.2. Cribado con mAb específico para alfa-sinucleína
3.2.1. Bibliotecas de expresión fágica Ph.D. 7 y 12
3.2.1.1. Cribado con anticuerpo monoclonal dirigido contra DMPVDPDN
Se identificaron 51 secuencias mediante el cribado de las bibliotecas de expresión fágica PhD7 y PhD12 en el presente cribado: la Tabla 1 resume los péptidos identificados y su capacidad de unión en comparación con la del epítopo original.
Tabla 1: unión de mimotopos de alfa-sinucleína al anticuerpo parental
Número interno de péptido
SEC ID n° Secuencia Capacidad de unión
p4456
2 CDQPVLPD 3
p4457
3 CDMPVLPD 3
p4458
4 CDSPVLPD 3
p4460
5 CDSPVWAE 1
p4461
6 CDTPVLAE 1
p4462
7 CDQPVLPDN 3
p4463
8 CDMPVLPDN 3
p4464
9 CDSPVLPDN 3
p4465
10 CDQPVTAEN 3
p4466
11 CDSPVWAEN 3
p4467
12 CDTPVLAEN 3
p4484
13 CHDRPVTPD 3
p4485
14 CDRPVTPD 3
p4486
15 CDNPVHPE 1
p4487
16 CDVPVLPD 3
p4488
17 CDTPVYPD 3
p4489
18 CDTPVIPD 3
p4490
19 CHDRPVTPDN 3
p4491
20 CDRPVTPDN 3
p4492
21 CDNPVHPEN 3
p4493
22 CDVPVLPDN 3
p4494
23 CDTPVYPDN 3
p4495
24 CDTPVIPDN 3
p4496
25 CDQPVLPDG 3
p4497
26 CDMPVLPDG 3
p4498
27 CDSPVLPDG 3
p4499
28 CDSPVWAEG 3
p4553
29 CDRPVAPEG 3
p4554
30 CDHPVHPDS 3
p4555
31 CDMPVSPDR 3
p4556
32 CDSPVPPDD 3
p4557
33 CDQPVYPDI 3
p4558
34 CDRPVYPDI 3
p4559
35 CDHPVTPDR 1
p4560
36 CEYPVYPES 3
p4561
37 CDTPVLPDS 3
p4562
38 CDMPVTPDT 3
p4563
39 CDAPVTPDT 3
p4564
40 CDSPVVPDN 3
p4566
41 CDLPVTPDR 3
p4567
42 CDSPVHPDT 3
p4568
43 CDAPVRPDS 3
p4569
44 CDMPVWPDG 3
p4570
45 CDAPVYPDG 3
p4571
46 CDRPVQPDR 3
p4572
47 CYDRPVQPDR 3
p4635
48 CDMPVDPEN 3
p4636
49 CDMPVDADN 3
p4640
50 DQPVLPDC 3
p4641
51 DMPVLPDC 3
p4648
52 CEMPVDPDN 3
Leyenda de la Tabla 1: la capacidad de unión está codificada siguiendo el código de unión siguiente: 1:X indica el 10 factor de dilución del anticuerpo parental.
Código de unión
DO semimáxima 1:X
0
Unión nula :0
1
Unión débil :<5.000
2
Unión media :5.000-20.000
3
Unión igual a la del epítopo original (unión fuerte) :20.000-128.000
3.3. Caracterización in vitro de mimotopos identificados en el cribado de bibliotecas de expresión fágica con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la alfa-sinucleína 5
Las figuras 2 y 3 muestran ejemplos representativos de ensayos de unión e inhibición utilizados para caracterizar mimotopos in vitro. Los datos obtenidos se resumen en las Tablas 1 y 2, respectivamente.
De las 51 secuencias presentadas, 29 inhibían la unión del anticuerpo monoclonal específico para alfa-sinucleína en 10 experimentos in vitro de competición. Se identificaron 22 secuencias adicionales que no inhibían la unión del anticuerpo monoclonal en experimentos in vitro de competición aunque conservaban la capacidad de unión al anticuerpo parental.
Tabla 2: mimotopos de alfa-sinucleína identificados en la presente invención que proporcionan resultados positivos 15 en ensayos de inhibición
Número interno de péptido
SEC ID n° Secuencia Inhibición
p4462
7 CDQPVLPDN 2
p4463
8 CDMPVLPDN 2
p4464
9 CDSPVLPDN 2
p4490
19 CHDRPVTPDN 2
p4491
20 CDRPVTPDN 1
p4493
22 CDVPVLPDN 2
p4494
23 CDTPVYPDN 2
p4495
24 CDTPVIPDN 1
p4496
25 CDQPVLPDG 1
p4497
26 CDMPVLPDG 1
p4498
27 CDSPVLPDG 1
p4554
30 CDHPVHPDS 1
p4555
31 CDMPVSPDR 1
p4557
33 CDQPVYPDI 1
p4558
34 CDRPVYPDI 2
p4559
35 CDHPVTPDR 1
p4561
37 CDTPVLPDS 2
p4562
38 CDMPVTPDT 2
p4563
39 CDAPVTPDT 1
p4564
40 CDSPVVPDN 1
p4566
41 CDLPVTPDR 1
p4567
42 CDSPVHPDT 1
p4569
44 CDMPVWPDG 1
p4570
45 CDAPVYPDG 1
p4571
46 CDRPVQPDR 1
p4572
47 CYDRPVQPDR 1
p4640
50 DQPVLPDC 2
p4641
51 DMPVLPDC 2
p4648
51 CEMPVDPDN 1
Leyenda de la Tabla 2: la capacidad de inhibición está codificada siguiendo el código siguiente: inhibición débil se refiere a que se requiere más péptido para reducir la unión de anticuerpo que con el epítopo 20 original; inhibición fuerte se refiere a que se requieren cantidades similares de péptido para mimotopo y epítopo original para reducir la unión del anticuerpo. Se comparan los mimotopos con el péptido original a modo de estándar. Se utilizó la DO con 40 |jg de péptido en el ensayo para calcular la capacidad de competición en comparación con el péptido original.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Código de competición
0
Inhibición nula (DO de 40 jg de péptido más de 5 veces la del péptido original)
1
Más débil que el epítopo original (DO de 40 jg de péptido menos de 5 veces la del péptido original)
2
Inhibición fuerte (igual a la del epítopo original; DO de 40 jg de péptido menos de 2 veces la del péptido original)
Tabla 3: péptidos y proteínas no mimotopos
Número interno de péptido
SEC ID n° Secuencia
1 DMPVDPDN
p4446
Alfa-sin humana (de longitud completa, n° de acc. de NCBI: NP 000336)
p4447
Beta-sin humana (de longitud completa, n° de acc. de NCBI: NP 001001502)
p4448
53 CDMPVDPDN
p4449
54 DMPVDPDNC
p4450
55 CDMPVDPGS
p4451
56 DMPVDPGSC
3.4. Caracterización in vivo de mimotopos identificados en el cribado de bibliotecas de expresión fágica con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la alfa-sinucleína
Se inmunizaron por vía subcutánea ratones C57/B16 hembra, 5 a 6 ratones en cada grupo, con 30 |jg de péptido acoplado a KLH. En los grupos de control se administró conjugado p4448-KLH. Como adyuvante se utilizó alúmina (en todos los casos 1 mg en cada ratón). Todos los péptidos administrados pudieron unirse a anticuerpos monoclonales de unión específica a aa115-122 de la alfa-sinucleína humana, aunque algunos de los péptidos no inhibieron la unión del epítopo original a su anticuerpo parental in vitro (en un ensayo de inhibición in vitro). El ensayo ELISA in vitro para determinar el título de anticuerpos se llevó a cabo con sueros de ratones individuales o sueros agrupados (ver la figura 5), después de cada vacunación a intervalos de dos semanas (ver las figuras 4 y 5, respectivamente). Los pocillos de la placa de ELISA se recubrieron con conjugado de mimotopo-ASB y un conjugado de péptido irrelevante-ASB (control negativo). El control positivo se llevó a cabo mediante reacción del anticuerpo parental con el conjugado de mimotopo-ASB respectivo. La detección se llevó a cabo con anticuerpo anti- IgG de ratón. Además, se inmovilizaron proteínas recombinantes en placas de ELISA y se hicieron reaccionar los sueros del mismo modo.
Para todos los mimotopos sometidos a ensayo en ratones C57/B16 pudieron detectarse anticuerpos que reaccionaban con el péptido inyectado individual tras la vacunación repetida. Además, 2 de 4 mimotopos ilustrados (ver la figura 5 y la Tabla 1, respectivamente) desarrollaron anticuerpos que reaccionaban con la alfa-sinucleína humana pero no con la beta-sinucleína humana. 2/4 no mostraron reactividad cruzada con las proteínas recombinantes. Se destaca que el epítopo original DMPVDPDN condujo a una respuesta inmunológica que no distinguía entre las dos proteínas de sinucleína recombinantes.
Las figuras 4 y 5 muestran ejemplos representativos de ensayos utilizados para caracterizar mimotopos in vivo. La figura 4 muestra un ejemplo de caracterizaciones in vivo de la respuesta inmunológica inducida por la vacunación con mimotopos mediante el análisis de la respuesta inmunológica contra el péptido inyectado y un péptido irrelevante, que contenía una secuencia no relacionada. El epítopo original p4448, el péptido de control positivo y los mimotopos p4456, p4466 y p4467, indujeron respuestas inmunológicas contra el péptido inyectado (a sí mismos), pero no consiguieron inducir una respuesta inmunológica inespecífica contra una secuencia no relacionada (p1253).
La figura 5 muestra un ejemplo de caracterización in vivo de la respuesta inmunológica inducida por la vacunación con mimotopos contra la alfa-sinucleína y la beta-sinucleína de longitud completa. Todas las vacunas sometidas a ensayo en el presente ejemplo generaron una respuesta inmunológica detectable contra el epítopo 115-122. Prácticamente la totalidad de los mimotopos y el epítopo original sometido a ensayo en el presente ejemplo (excepción: p4466 y p4467) además también mostraron reactividad con la alfa-sinucleína de longitud completa. Sin embargo, la respuesta inmunológica inducida por el epítopo original también detectó la proteína beta-sinucleína de longitud completa, perdiendo de esta manera la especificidad para la alfa-sinucleína y la capacidad de distinguir entre las dos proteínas. En contraste con este resultado, en la mayor parte (aunque no la totalidad) de los sueros inducidos con mimotopo no se consiguió detectar beta-sinucleína, conservando de esta manera la capacidad de discriminar entre las dos proteínas sinucleína y garantizando una elevada especificidad anti-alfa-sinucleína de un programa de inmunización activa, obteniendo eficacia y un excelente perfil de seguridad.
5
10
15
20
25
30
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65
3.5. Ensayos in situ de mimotopos
Los mimotopos que inducen una respuesta inmunológica específica de a-sin también pueden detectar inclusiones inmunorreactivas con a-sin en tejido cerebral de ratones transgénicos. Tal como se ilustra en la figura 6, los sueros derivados de los animales vacunados con mimotopo fueron capaces de teñir estructuras positivas para a-sin presentes en las secciones de cerebro de ratón procedentes de animales que sobreexpresaban a-sin humana. Brevemente, los sueros positivos para reactividad con a-sin humana en el ELISA se utilizaron para inmunohistoquímica (IHQ). Se sometieron a IHG secciones de 7 pm de cerebro de ratón incluidas en parafina y montadas en portaobjetos de vidrio Superfrost Plus. Las secciones se incubaron con sueros (diluciones 1:100 y 1:400 en PBS) y posteriormente se tiñeron siguiendo protocolos estándares de inmunohistoquímica utilizando los sistemas de bloqueo DAB y MOM de VECTASTAIN ABC Systems (todas las reacciones se llevaron a cabo utilizando reactivos disponibles comercialmente obtenidos de Vector Labs, respectivamente y se llevaron a cabo siguiendo los protocolos del fabricante). La contratinción se llevó a cabo con hematoxilina. Los portaobjetos se montaron en Entellan y después se documentaron utilizando microscopía de campo brillante convencional. Se utilizó un anticuerpo monoclonal específico para a-sin humana (LB509, Covance) como control positivo para la detección de sinucleína a una dilución final de 1/250.
En la figura 6A se ilustra una tinción de control positivo. En 6B se utilizó el mismo anticuerpo en cerebro de ratón no transgénico del mismo área, no detectando ningún tejido positivo para a-syn, ya que este animal no expresaba a-sin humano. En 6C, una tinción específica de a-sin similar a la tinción presente en 6A fue inducida por un suero inducido por mimotopo (suero inducido por p4498). Una tinción positiva para a-sin en el hipocampo murino se caracteriza por los patrones de tinción moteada, tal como se muestra en 6A y 6C. Entre los ejemplos de potencial de inducción de anticuerpos específicos para a-sin se incluyen, aunque sin limitación, las vacunas basadas en p4456, p4498 y p4562, respectivamente.
Listado de secuencias
<110> Affiris AG
<120> Mimotopo
<130> R 66975
<150> A 297/2008 <151> 2008 02 22
<160> 57
<170> PatentIn versión 3.4
<210> 1 <211>8 <212> PRT >213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 1
Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn 15
<210> 2 <211>8 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 2
Cys Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp 15
5
10
15
20
25
30
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40
45
50
55
60
65
<220>
<223> péptido artificial <400> 3
Cys Asp Met Pro Val Leu Pro Asp 15
<210>4 <211>8 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 4
Cys Asp Ser Pro Val Leu Pro Asp 15
<210> 5 <211>8 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 5
Cys Asp Ser Pro Val Trp Ala Glu 15
<210> 6 <211>8 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 6
Cys Asp Thr Pro Val Leu Ala Glu 15
<210>7 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 7
Cys Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp Asn 15
<210> 8 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
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55
60
65
<210>9 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 9
Cys Asp Ser Pro Val Leu Pro Asp Asn 15
<210> 10 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 10
Cys Asp Gln Pro Val Thr Ala Glu Asn 15
<210> 11 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 11
Cys Asp Ser Pro Val Trp Ala Glu Asn 15
<210> 12 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 12
Cys Asp Thr Pro Val Leu Ala Glu Asn 15
<210> 13 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 13
Cys His Asp Arg Pro Val Thr Pro Asp 15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> péptido artificial <400> 14
Cys Asp Arg Pro Val Thr Pro Asp 15
<210> 15 <211>8 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 15
Cys Asp Asn Pro Val His Pro Glu 15
<210> 16 <211>8 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 16
Cys Asp Val Pro Val Leu Pro Asp 15
<210> 17 <211>8 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 17
Cys Asp Thr Pro Val Tyr Pro Asp 15
<210> 18 <211>8 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 18
Cys Asp Thr Pro Val Ile Pro Asp 15
<210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 20 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 20
Cys Asp Arg Pro Val Thr Pro Asp Asn 15
<210> 21 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 21
Cys Asp Asn Pro Val His Pro Glu Asn 15
<210> 22 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 22
Cys Asp Val Pro Val Leu Pro Asp Asn 15
<210> 23 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 23
Cys Asp Thr Pro Val Tyr Pro Asp Asn 15
<210> 24 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 24
Cys Asp Thr Pro Val Ile Pro Asp Asn 15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> péptido artificial <400> 25
Cys Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp Gly 15
<210> 26 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 26
Cys Asp Met Pro Val Leu Pro Asp Gly 15
<210> 27 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 27
Cys Asp Ser Pro Val Leu Pro Asp Gly 15
<210> 28 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 28
Cys Asp Ser Pro Val Trp Ala Glu Gly 15
<210> 29 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 29
Cys Asp Arg Pro Val Ala Pro Glu Gly 15
<210> 30 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 31 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 31
Cys Asp Met Pro Val Ser Pro Asp Arg 15
<210> 32 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 32
Cys Asp Ser Pro Val Pro Pro Asp Asp 15
<210> 33 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 33
Cys Asp Gln Pro Val Tyr Pro Asp Ile 15
<210> 34 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 34
Cys Asp Arg Pro Val Tyr Pro Asp Ile 15
<210> 35 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 35
Cys Asp His Pro Val Thr Pro Asp Arg 15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> péptido artificial <400> 36
Cys Glu Tyr Pro Val Tyr Pro Glu Ser 15
<210> 37 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 37
Cys Asp Thr Pro Val Leu Pro Asp Ser 15
<210> 38 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 38
Cys Asp Met Pro Val Thr Pro Asp Thr 15
<210> 39 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 39
Cys Asp Ala Pro Val Thr Pro Asp Thr 15
<210> 40 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 40
Cys Asp Ser Pro Val Val Pro Asp Asn 15
<210> 41 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 42 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 42
Cys Asp Ser Pro Val His Pro Asp Thr 15
<210> 43 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 43
Cys Asp Ala Pro Val Arg Pro Asp Ser 15
<210> 44 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 44
Cys Asp Met Pro Val Trp Pro Asp Gly 15
<210> 45 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 45
Cys Asp Ala Pro Val Tyr Pro Asp Gly 15
<210> 46 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 46
Cys Asp Arg Pro Val Gln Pro Asp Arg 15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> péptido artificial <400> 47
Cys Tyr Asp Arg Pro Val Gln Pro Asp Arg 1 5 10
<210> 48 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 48
Cys Asp Met Pro Val Asp Pro Glu Asn 15
<210> 49 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 49
Cys Asp Met Pro Val Asp Ala Asp Asn 15
<210> 50 <211>8 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 50
Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp Cys 15
<210> 51 <211>8 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 51
Asp Met Pro Val Leu Pro Asp Cys 15
<210> 52 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 52
Cys Glu Met Pro Val Asp Pro Asp Asn 15
<210> 53 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 53
Cys Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn 15
<210> 54 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 54
Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Cys 15
<210> 55 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 55
Cys Asp Met Pro Val Asp Pro Gly Ser 15
<210> 56 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> péptido artificial <400> 56
Asp Met Pro Val Asp Pro Gly Ser Cys 15
<210> 57 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> secuencia de consenso <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1)
<223> Xaa=(cualquier residuo aminoácido)n, en el que n=0 o un número entero superior a 0 <220>
5
10
15
20
25
30
<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2)
<223> Xaa=un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E)
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3)
<223> Xaa=cualquier residuo aminoácido <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6)
<223> Xaa=cualquier residuo aminoácido <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7)
<223> Xaa=un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en prolina (P) y alanina (A)
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8)
<223> Xaa=un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E)
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9)
<223> Xaa=(cualquier residuo aminoácido)n, en el que n=0 o un número entero superior a 0 <400> 57
Xaa Xaa Xaa Pro Val Xaa Xaa Xaa Xaa 15

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Utilización de por lo menos un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en DQPVLPD, DMPVLPD, DSPVLPD, DQPVLPDN, DMPVLPDN, DSPVLPDN, HDRPVTPD, DRPVTPD, DVPVLPD, DTPVYPD, DTPVIPD, HDRPVTPDN, DRPVTPDN, DVPVLPDN, DTPVYPDN, DQPVLPDG, DMPVLPDG, DSPVLPDG, DHPVHPDS, DMPVSPDR, DRPVYPDI, DHPVTPDR, DTPVLPDS, DMPVTPDT, DAPVTPDT, DSPVVPDN, DLPVTPDR, DSPVHPDT, DAPVRPDS, DMPVWPDG, DRPVQPDR, YDRPVQPDR, DMPVDADN, DQPVLPD y DMPVLPD,
    en la que dicho compuesto comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable acoplado a la secuencia de aminoácidos, presentando dicho compuesto una capacidad de unión a un anticuerpo que es específico para un epítopo de alfa-sinucleína que comprende la secuencia de aminoácidos DMPVDPDN y resultando apto para inducir la formación in vivo de anticuerpos que se unen a la alfa-sinucleína
    para producir un medicamento para prevenir y/o tratar las sinucleinopatías.
  2. 2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada por que el compuesto comprende además un residuo aminoácido acetilado o cisteína (C).
  3. 3. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada por que el compuesto es un polipéptido que comprende 7 a 16 residuos aminoácidos.
  4. 4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que la sinucleinopatía se selecciona de entre el grupo que consiste en trastornos de cuerpos de Lewy (LBD), la enfermedad de Parkinson con demencia (PDD) y la demencia con cuerpos de Lewy (DLB), así como la atrofia multisistémica (MSA) o la neurodegeneración con acumulación de hierro cerebral de tipo I (NBIA de tipo I).
  5. 5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que la sinucleinopatía es la enfermedad de Parkinson (PD).
  6. 6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que el vehículo farmacéuticamente aceptable es la KLH (hemocianina de lapa americana).
  7. 7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por que el compuesto se formula para la administración intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular.
  8. 8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada por que el compuesto se formula con un adyuvante, preferentemente hidróxido de aluminio.
  9. 9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada por que el compuesto está contenido en el medicamento en una cantidad de desde 0,1 ng a 10 mg, preferentemente 10 ng a 1 mg, en particular 100 ng a 100 |jg.
  10. 10. Péptido que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en DQPVLPD, DMPVLPD, DSPVLPD, DQPVLPDN, DMPVLPDN, DSPVLPDN, HDRPVTPD, DRPVTPD, DVPVLPD, DTPVYPD, DTPVIPD, HDRPVTPDN, DRPVTPDN, DVPVLPDN, DTPVYPDN, DQPVLPDG, DMPVLPDG, DSPVLPDG, DHPVHPDS, DMPVSPDR, DRPVYPDI, DHPVTPDR, DTPVLPDS, DMPVTPDT, DAPVTPDT, DSPVVPDN, DLPVTPDR, DSPVHPDT, DAPVRPDS, DMPVWPDG, DRPVQPDR, YDRPVQPDR, DMPVDADN, DQPVLPD y DMPVLPD.
  11. 11. Péptido según la reivindicación 10, caracterizado por que el péptido está acoplado a un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente KLH (hemocianina de lapa americana).
  12. 12. Formulación farmacéutica, preferentemente una vacuna, que comprende por lo menos un péptido según la reivindicación 10 u 11.
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