KR101627763B1 - 신경퇴행성 장애의 치료를 위한 알파-시뉴클레인의 미모토프 및 이의 백신 - Google Patents

신경퇴행성 장애의 치료를 위한 알파-시뉴클레인의 미모토프 및 이의 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시뉴클레인병을 예방하고/하거나 치료하기 위한 약제를 생산하기 위한, 하기 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 화합물의 용도에 관한 것이다:
Figure 112010056356998-pct00020
(화학식 1),
상기 화학식에서, X1은 임의의 아미노산 잔기이고, X2는 아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 잔기이고, X3은 임의의 아미노산 잔기이고, X4는 임의의 아미노산 잔기이고, X5는 프롤린(P) 및 알라닌(A)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 잔기이고, X6은 아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 잔기이고, X7은 임의의 아미노산 잔기이고, n 및 m은 독립적으로 0 또는 0보다 큰 정수이며, 상기 화학식 1에 따른 아미노산 서열은, 아미노산 서열 DMPVDPDN을 가진 알파-시뉴클레인의 8-머 폴리펩티드 단편과 동일하지 않거나 이를 포함하지 않고, 상기 화합물은 아미노산 서열 DMPVDPDN을 포함하는 알파-시뉴클레인의 에피토프에 특이적인 항체에 대해 결합 능력을 지닌다.

Description

신경퇴행성 장애의 치료를 위한 알파-시뉴클레인의 미모토프 및 이의 백신{MIMOTOPES OF ALPHA-SYNUCLEIN AND VACCINES THEREOF FOR THE TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISORDERS}
본 발명은 시뉴클레인병(synucleinopathies)의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제(medicament)에 관한 것이다.
시뉴클레인병은 공통적인 병리학적 특성을 공유하는 신경퇴행성 장애의 다양한 그룹이다: 신경병리적 실험에서, 특유의 병변은 뉴런 및 교질세포의 선택된 집단 내에서 알파-시뉴클레인(알파-syn) 단백질의 비정상적 응집을 포함하며 감지될 수 있다. 알파-syn(처음에 PARKl 및 PARK4로 판명됨)은 신피질, 해마, 치상회, 후 신경구, 선조체, 시상 및 소뇌에서 광범위하게 발현되는 140개 아미노산의 단백질이다. 알파-syn은 또한 B-, T-, 및 NK 세포를 비롯하여 단백구 및 혈소판을 포함하는 조혈세포에서 높게 발현된다. 이러한 세포 내에서의 정확한 역할은 알려지지 않았으나, 거핵구(혈소판 전구체)의 분화와 관련이 있었다.
가장 흔한 시뉴클레인병은 루이소체병(Lewy body disorders, LBDs), 예컨대 파킨슨병(Parkinson's disease, PD), 치매를 동반한 파킨슨병(Parkinson's disease with dementia, PDD) 및 루이소체를 동반한 치매(dementia with Lewy bodies, DLB) 뿐만 아니라, 다발성 신경계 위축(Multiple system atrophy, MSA) 또는 뇌 철 침착 동반한 신경변성 I형(Neurodegeneration with brain iron accumulation type I, NBIA Type I)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 질환에 대한 현재의 치료 방법은 증상에 따른 투약, 예컨대 L-도파(L-dopa), 항콜린성 약물을 비롯하여 모노아민 산화효소 저해제를 포함한다. 그러나, 현재 주어지는 모든 치료적 기회는 단지 증상 완화를 유도할 뿐, 환자에게 지속적인 질환 개선 효과를 유도하지 않는다.
루이소체병(LBD)은 진전(tremor), 강직, 운동완서 및, 뇌 속의 도파민성 뉴런(dopaminergic neurons)의 손실을 특징으로 하는, 진행성 신경퇴행성 장애이다. DLB 및 PDD의 경우, 징후는 인지 장애를 또한 포함한다. 서방 국가에서 60세 이상 인구의 최대 2%가 PD/LBD의 일반적인 징후를 보인다. 현재는, 단지 증상에 따른 치료만이 이용가능하다. 불행하게도, 이러한 치료법은 조기 증상으로부터의 일시적인 구제만을 제공하고, 질환 진행을 멈추지 못한다.
PD/LBD의 병인은 여전히 완전하게 이해되지 않고 있으나, 유전적 감수성 및 환경적 요인이 이 질환의 발달에 관계된 것으로 보인다. 모든 유전적 진보에도 불구하고, PD/LBD는 주로 원인이 알려지지 않은(특발성 PD/LBD로도 불림) 산발적 장애이다. 이 질환에 걸린 환자는 뇌의 피질하 내 영역 및 피질에서 루이소체(LBs)로 불리는 고유의 유비퀴틴화된(ubiquitinated) 세포내 함유물(inclusions)을 발달시킨다. 특히 높은 함량의 도파민성 뉴런 또는 투사 신경세포(neuronal projection)를 지닌 영역은 이러한 전형적인 병적 특성을 나타낸다.
최근, 몇 가지 연구는 시냅스 단백질 알파-syn가 LBD 병인에서 중심 역할을 한다는 사실을 밝힐 수 있었다. LBD에서, 알파-syn는 영향을 받는 뇌 영역을 거쳐 LBs 내에 축적된다. 추가적으로, 알파-syn 내의 단일 지점 돌연변이를 비롯하여 중복 또는 증식은 파킨슨 증후군의 드문 패밀리형과 관련되어 있다는 것을 설명할 수 있었다. 중요한 것은, 유전자도입(tg) 마우스는 물론 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에서의 과다발현 연구로부터의 결과에 기초한, PD/LBD의 병인에서의 알파-syn의 핵심 역할이 강조되는데, 이는 이러한 동물 모델이 PD의 몇가지 특성을 모방하기 때문이다.
또 다른 매우 중요한 시뉴클레인병은 다발성 신경계 위축(MSA)이다. MSA는 L-DOPA-저항성 파킨슨 증후군, 소뇌성 운동실조(cerebellar ataxia), 및 자율신경이상증(dysautonomia)에 의해 특징화되는 산발적 신경퇴행성 장애이다. 환자들은 선조체, 흑색질, 소뇌, 뇌교를 비롯하여, 하올리브핵(inferior olives) 및 척수를 포함하는, 뇌의 다양한 영역에 영향을 미치는 다발성 신경 손실을 앓고 있다. MSA는 알파-syn-양성 교질세포질(glial cytoplasmic, GCI) 및 중추신경계 도처의 드문 신경 함유물에 의해 특징화된다. 이러한 함유물은 선조 흑질 변성(striatonigral degeneration), 올리브교소뇌위축(olivopontocerebellar atrophy), 및 수질 및 척수내의 자율 핵(autonomic nuclei)의 관여와 관련된다. MSA의 병인에 대한 GCIs의 중요성은 일반적으로 회돌기신경교(oligodendroglia)에서 알파-syn 과다 발현의 효과를 분석하는, 유전자도입 마우스 모델의 최근 분석에 의해 확인되고 이해되고 있다. 인간 알파-syn을 과다 발현시키는 tg 마우스에서, GCI-유사 응집체 및 MSA의 생화학적 마커 두 가지 모두가 발견되었다.
시뉴클레인병에서 알파-syn의 축적이 신경퇴행의 전형적인 특성을 유도하는 정확한 메카니즘 및 시뉴클레인병의 고유의 증상이 충분히 이해되지 않고 있음에도 불구하고, 최근 연구는 알파-syn의 올리고머의 비정상적 형성 및 축적이 잠재적인 시뉴클레인병의 퇴행성 진행에 관련됨을 암시하고 있다.
최근, 이러한 올리고머-형성, 예를 들어, 시냅스 말단 및 축색돌기가 PD/LBD 발달에 중요한 역할을 한다고 믿어지고 있다. 따라서, 알파-syn 침전 및 올리고머화의 감소는 시뉴클레인병, 특히 특발성 LBD/PD 및 MSA의 치료에 효과적일 것이고, 최근 치료 전략, 예컨대 L-DOPA 적용으로 인한 증상의 단순한 완화와 더불어, 이러한 신경퇴행성 질환의 치료에 첫번째 전략을 제시할 수 있었다.
문헌[Iwatsubo T. (Neuropathology 27 (5) (2007): 474-478)]에서는, 알파-시뉴클레인 침전을 비롯한 이의 인산화와 알파-시뉴클레인의 병인과의 상관관계를 시험하였다. 이 문헌의 저자는 시뉴클레인병 병변에서 침전된 알파-시뉴클레인의 129개의 세린이 광범위하게 인산화되었음을 발견하였다.
US 2007/213253호는 돌연변이 인간 알파-시뉴클레인을 비롯하여 이것으로부터 유래된 펩티드에 관한 것으로, 이는 야생형 인간 알파-시뉴클레인의 응집을 억제하는데 사용될 수 있다.
WO 2004/041067호에서는, 알파-시뉴클레인 응집체에 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 수단 및 방법이 개시되어 있는데, 이는 알파-시뉴클레인 단편의 용도를 포함한다.
US 2003/166558에서는, 단백질 침전에 대한 면역 반응을 유도하는데 이용될 수 있는 펩티드를 개시하고 있다.
US 2005/198694호는 100개 이상의 아미노산을 포함하고, 1 내지 23개의 아미노산의 C-말단 결실을 지니는 알파-시뉴클레인 단편에 관한 것이다.
신경 영양 인자를 이용하고 도파민 세포를 이식(grafting)하는 실험적 치료법이 유망한 결과를 양산해왔다 할지라도, 알파-syn의 신경 축적을 감소시키도록 고안된 대안적 접근법이 필요하다.
최근, 능동 및 수동 면역요법은 신경퇴행성 질환, 예컨대 알츠하이머병(AD), 프리온 질병을 비롯하여, 헌팅턴 무도병 및 아밀로이드 측삭 경화증(ALS)에 대한 잠재적 새로운 치료 전략으로서 관심이 증가되고 있다. 예를 들어, AD의 tg 마우스 모델에서의 최근 연구는 베타-아밀로이드 1-42(Aβ)에 대한 항체가 뇌에서 아밀로이드의 제거를 촉진한 결과, 인지 성능이 향상되었음을 나타내었다. 중요한 것은, Aβ 분자는 주로 세포 외에 위치하고 따라서 면역 시스템에 접근가능한 에피토프를 구성하고 있다는 점이다. 면역요법에 대한 이러한'고전적' 표적과 반대로, 실험은 세포 내 병원성 분자의 축적을 감소시키면서 잠재적인 면역요법을 평가하도록 수행되었다. 프리온 단백질 및 헌팅틴(huntingtin)을 타겟팅한 백신접종 접근법은 tg 마우스의 뉴런에서 세포 내에서 축적된 상기 두 분자, 예컨대 알파-syn의 축적을 감소시키는데 효과적인 것으로 나타났다. 더욱이 최근 실험은 AD 및 ALS 각각에서 세포 내 병원성 단백질 응집체에 대한 신규한 치료 전략으로서 항-Tau 및 항-SOD1을 또한 기재하고 있다. 따라서, 뇌 세포 내에서의 세포 내 응집체가 면역요법에 의해 표적화될 수 있다는 설득력 있는 증거가 축적되고 있다. 실제로, 최근 시뉴클레인병의 치료에 대한 유사한 가능성이 나타났다. 인간 알파-syn를 과다발현시키는 Tg 마우스를 인간 알파-syn 단백질로 백신접종 하였다. 백신접종시 상대적으로 높은 친화력의 항체를 생산하는 마우스에서는, 신경세포체(neuronal cell bodies) 및 시냅스 내에서 응집된 알파-syn의 축적이 감소되었고, 이는 감소된 신경 퇴행과 연관되었다. 더욱이, 면역화된 동물에 의해 생산된 항체는 신경막과 연관된 비정상적으로 응집된 형태의 알파-syn을 또한 감지하고, 이러한 응집체의 분해(아마도 리소좀 경로를 통해)를 촉진하였다. 외인성으로 적용된 알파-syn-특이적 항체를 이용한 수동적 면역치료를 이용하여 유사한 효과가 관찰되었다. 이러한 결과는 백신 접종이 알파-syn 응집체의 신경 축적을 감소시키는데 효과적이라는 것을 시사하고, 이러한 접근법의 추가 개발은 LBD 및 시뉴클레인병의 치료에 유익한 효과를 도출할 수 있었다.
본 발명의 주제는 백신에 기초하여 시뉴클레인병을 예방하고 치료하는 약제를 제공하는 것이다.
따라서 본 발명은 시뉴클레인병을 예방하고/하거나 치료하기 위한 약제를 생산하기 위한, 하기 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 화합물의 용도와 관련이 있다:
Figure 112010056356998-pct00001
(화학식 1),
상기 화학식에서,
X1은 임의의 아미노산 잔기이고,
X2는 아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 잔기이고,
X3은 임의의 아미노산 잔기이고,
X4는 임의의 아미노산 잔기이고,
X5는 프롤린(P) 및 알라닌(A)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 잔기이고,
X6은 아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 잔기이고,
X7은 임의의 아미노산 잔기이고,
n 및 m은 독립적으로 0 또는 0보다 큰 정수이며,
상기 화학식 1에 따른 아미노산 서열은, 아미노산 서열 DMPVDPDN을 가진 알파-시뉴클레인의 8-머 폴리펩티드 단편과 동일하지 않거나 상기 단편을 포함하지 않고, 상기 화합물은 아미노산 서열 DMPVDPDN을 포함하는 알파-시뉴클레인의 에피토프에 특이적인 항체에 대한 결합 능력을 지닌다.
본 발명에 따른 화합물은 생체 내에서 알파-시뉴클레인, 특히 아미노산 서열 DMPVDPDN(상기 아미노산 서열을 포함하는 알파-시뉴클레인 단편 또한 포함)을 포함하는 알파-시뉴클레인의 에피토프로 유도된(결합하는) 항체의 형성을 유도할 수 있다. 그러나, 상기 에피토프로 유도된(결합하는) 항체는 알파-시뉴클레인 보다 베타-시뉴클레인에 상당히 더 낮은 면역 반응성을 보이거나, 면역 반응성을 보이지 않는다. 이와 대조적으로, DMPVDPDN을 포함하는 본래의 알파-시뉴클레인 에피토프와의 면역화에 의해 유도된 항체는 놀랍게도 알파-시뉴클레인 및 베타-시뉴클레인 둘 모두에 결합한다. 따라서 본래의 알파-시뉴클레인 또는 이의 단편(들)과는 달리, 본 발명에 따른 화합물은 상기 질병 관련 시약에 대한 특이성을 제공하고, 질병 비관련된 베타-시뉴클레인과의 교차반응성을 회피한다. 이것은 효능 및 안전성(안전성은 특히 베타-시뉴클레인에 대해 기재된 신경보호적 특성 때문임)에 관하여 상당한 우수성을 강력히 시사한다[Hashimoto M. et al., J Biol Chem. 2004 May 28;279(22) :23622-9. Hashimoto M, Neuron. 2001 Oct 25; 32 (2) : 213- 23].
본 발명의 화합물의 투여에 의해 유도된 알파-시뉴클레인 특이적 항체는 알파-시뉴클레인의 모노머 형태 뿐만 아니라 멀티머 형태에도 결합할 수 있다. 이는 치료될 개개인의 신체에서 알파-시뉴클레인의 올리고머의 양을 감소시킨다. 알파-시뉴클레인의 감소는 특히 시뉴클레오병의 치료에 유리하다.
아미노산 서열
Figure 112010056356998-pct00002
은 아미노산 서열 DMPVDPDN을 포함하는 알파-시뉴클레인의 에피토프의 미모토프인 것으로 여겨진다. 본 발명에 따른 용어 "미모토프"는 에피토프의 모방체(mimic)로, 에피토프에 상응하는 위상(topology)을 가진 형태를 지닌 분자를 지칭한다. 미모토프는 요망되는 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체의 동일한 항원-결합 영역에 결합한다. 이 미모토프는 항원에 대한 모방체로서, 항원에 반응적인 숙주 내에서 면역반응을 유도할 것이다. 미모토프는 또한 에피토프 및 이 에피토프에 결합하는 항체가 관련된, 시험관 내 저해 분석(예를 들어, ELISA 저해 분석)에서 에피토프의 모방체로, 이 에피토프에 대해 경쟁자 역할을 할 수 있다. 그러나, 본 발명의 미모토프는 시험관 내 저해 분석에서 에피토프의 모방체로, 포유동물에 투여되었을 때 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다 할지라도, 반드시 에피토프의 결합을 막거나 이와 경쟁할 수 없다.
본원에서 사용된, 용어 "에피토프"는 특정 항체 분자에 의해 인지되는 항원의 면역원성 영역을 지칭한다. 일반적으로 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 것이고, 각각의 에피토프는 특정 에피토프를 인지하는 항체에 결합할 수 있다.
본 발명의 미모토프는 분리된 펩티드 또는 또 다른 펩티드 또는 폴리펩티드의 한 부분으로서, 당업계에 잘 알려진 화학적 합성 방법에 의해 합성적으로 생산될 수 있다. 대안적으로, 펩티드 미모토프는 펩티드 미모토프를 생산하는 미생물에서 생산될 수 있고, 그 후 분리시키고, 원한다면 추가적으로 정제한다. 펩티드 미모토프는 미생물, 예컨대 박테리아, 효모 또는 곰팡이, 진핵 세포, 예컨대 포유류 또는 곤충 세포, 또는 재조합 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki forest virus), 배큘로바이러스, 박테리오파지, 신드비스 바이러스 또는 센다이 바이러스에서 생산될 수 있다. 상기 펩티드 미모토프를 생산하기에 적합한 박테리아는 대장균(E. coli), B 서브틸리스(B. subtilis) 또는 펩티드, 예컨대 펩티드 미모토프를 발현할 수 있는 임의의 다른 박테리아를 포함한다. 펩티드 미모토프를 발현하기에 적합한 효모 유형은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 칸디다(Candida), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) 또는 펩티드를 발현할 수 있는 임의의 다른 효모를 포함한다. 상응하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한 재조합적으로 생산된 펩티드의 분리 및 정제 방법도 당업계에 잘 알려져 있고, 이 방법은, 예를 들어, 겔 여과, 친화 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등을 포함한다.
펩티드 미모토프의 분리를 용이하게 하기 위해, 융합 폴리펩티드가 사용될 수 있고, 여기서 이 펩티드 미모토프는 친화 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있는 이종의 폴리펩티드에 번역적으로(translationally) 융합(공유 결합적으로 연결)된다. 전형적인 이종 폴리펩티드는 His-Tag(예를 들어, His6; 6 히스티딘 잔기), GST-Tag(글루타치온-S-전이효소) 등이다. 융합 폴리펩티드는 미모토프의 정제를 용이하게 할 뿐만 아니라, 정제과정 동안 미모토프 폴리펩티드가 분해되는 것을 방지할 수 있다. 정제 후 이종 폴리펩티드가 제거되길 원한다면, 융합 폴리펩티드는 펩티드 미모토프와 이종 폴리펩티드 사이의 연결지점에 절단부위를 포함할 수 있다. 아미노산 서열로 이루어진 절단부위는 그 부위에서 아미노산 서열에 특이적인 효소(프로테아제)를 이용해 절단된다.
또한 본 발명의 미모토프는 이들의 N- 및/또는 C-말단 또는 근처를 개질시켜, 상기 위치에서 시스테인 잔기가 그곳에 결합할 수 있도록 한다. 바람직한 구체예에서, 말단쪽에 위치한(펩티드의 N- 및 C-말단에 위치함) 시스테인 잔기는 이황화 결합을 통해 펩티드를 환화(cyclize)시키는데 이용된다.
또한 본 발명의 미모토프는 다양한 분석 및 키트, 특히, 면역학적 분석 및 키트에 사용될 수 있다. 따라서, 미모토프는 또 다른 펩티드 또는 폴리펩티드, 특히 면역학적 분석에서 리포터로 사용되는 효소의 일부로 하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 리포터 효소는, 예를 들어, 알칼리성 포스파타아제 또는 호스래디쉬퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)를 포함한다.
본 발명에 따른 알파-시뉴클레인 미모토프는 바람직하게는 항원성 폴리펩티드인데, 이들의 아미노산 서열은 알파-시뉴클레인 또는 알파-시뉴클레인의 단편의 아미노산 서열과는 다르다. 이러한 관점에서, 본 발명의 미모토프는 1개 이상의 자연적으로 발생한 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함할 뿐만 아니라, 1개 이상의 비-자연적 아미노산(즉, 20개의 "고전적인" 아미노산으로부터 유래된 것이 아님)의 치환을 포함하거나, 이들은 완전히 이러한 비-자연적 아미노산으로 조립될 수 있다. 더욱이, 항-알파-시뉴클레인 항체를 유도하는 독창적인 항원은 D- 또는 L- 아미노산의 집합 또는 DL- 아미노산의 조합의 집합일 수 있고, 선택적으로, 이들은 추가 개질, 고리 닫힘 또는 유도체화에 의해 변화될 수 있다. 적합한 항-알파-시뉴클레인 항체-유도 항원은 시중에 판매되는 펩티드 라이브러리로부터 제공될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 펩티드는 7개 이상의 아미노산이고, 바람직한 길이는 최대 16개, 바람직하게는 최대 14개 또는 20개 아미노산 잔기(예를 들어, 7 또는 8 내지 20, 7 또는 8 내지 16 등)일 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 더 긴 펩티드 또한 항-알파-시뉴클레인 항체-유도 항원으로서 매우 잘 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 미모토프는 또한 폴리펩티드의 일부일 수 있고 그 결과 이들의 N- 및/또는 C- 말단에서 1개 이상의 추가 아미노산 잔기를 포함한다.
알파-시뉴클레인 미모토프(즉, 항-알파-시뉴클레인-항체-유도 항원)를 제조하기 위해, 물론 또한 파지 라이브러리, 펩티드 라이브러리가 적합하며, 예를 들어, 조합 화학으로 생산되거나, 가장 다양한 구조에 대한 고성능 스크리닝 기법에 의해 획득된다(Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al.; Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant MoI. Biol. 2002 Dec; 50 (6) : 837-54).
더욱이, 본 발명에 따라, 핵산("압타머")에 기초한 항-알파-시뉴클레인-항체-유도 항원이 또한 사용될 수 있고, 이들 역시 가장 다양한(올리고뉴클레오티드) 라이브러리(예를들어, 2-180개의 핵산 잔기)에서 발견될 수 있다(예를 들어, Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5(5) (2002), 690-700; Famulok et al., Ace. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, 등). 핵산에 기초한 항-알파-시뉴클레인-항체-유도 항원에서, 핵산 백본은, 예를 들어, 포스포러스-디에스테르 화합물(phosphor-diester compounds)에 의해, 또는 포스포로티오에이트 또는 조합체 또는 화학적 변이체(예를 들어, PNA)에 의해 생산될 수 있고, 여기서, 염기로서, 본 발명에 따라 주로, U, T, A, C, G, H 및 mC가 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 뉴클레오티드의 2'-잔기는 바람직하게는 H, OH, F, Cl, NH2, 0-메틸, O-에틸, 0-프로필 또는 O-부틸이고, 여기서 핵산은 또한 별도로 즉, 예를 들어 보호기로 개질될 수 있는데, 이는 이들이 일반적으로 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되기 때문이다. 따라서 압타머-기초 항-알파-시뉴클레인-항체-유도 항원은 또한 본 발명의 범위 내에서의 바람직한 항-알파-시뉴클레인-항체-유도 항원이다.
본 발명에 따르면, 용어 "시뉴클레인병"은 병리학적 시뉴클레인 응집체를 특징으로 하는 모든 신경퇴행성 장애를 포함한다. 파킨슨병(PD), 루이소체병(LBD), 미만성 루이소체병(DLBD), 루이소체를 동반한 치매(DLB), 치매를 동반한 파킨슨 증후군(PDD), 다발성 신경계 위축(MSA) 및 뇌 철 침착 동반한 신경변성 I형(NBIA Type I)을 포함하는 몇 가지 신경퇴행성 장애는 시뉴클레인병으로서 집합적으로 그룹화된다.
본 발명에 따른 화합물은 시뉴클레인병의 치료에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 시뉴클레인병이 발달할 위험이 있는 개인(예를 들어, 시뉴클레인병이 발달하기 쉬운 체질, 예를 들어, 유전적으로 시뉴클레인병이 발달하기 쉬운 체질)에게 이 병을 예방하는데 사용될 수도 있다
본 발명에 개재된 아미노산 잔기의 약자는 IUPAC 권고를 따른다:
Figure 112010056356998-pct00003
Figure 112010056356998-pct00004
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, X1 및/또는 X7은 아세틸화된 아미노산 잔기 또는 시스테인(C)이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, X2는 글루탐산이고, 상기 글루탐산은 또한 피로글루탐산에서 유도될 수 있다. X2가 피로글루탐산을 포함할 경우, X1은 O이다.
본 발명의 추가 바람직한 구체예에 따르면, X3은 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 아르기닌(R), 아스파라긴(N), 발린(V), 히스티딘(H), 메티오닌(M), 티로신(Y), 알라닌(A) 및 루신(L)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 잔기이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, X4는 글루타민(Q), 트립토판(W), 트레오닌(T), 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 이소루신(I), 발린(V), 히스티딘(H), 프롤린(P), 티로신(Y), 알라닌(A), 세린(S) 및 루신(L)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 잔기이다.
본 발명의 화합물은 또한 7 내지 16개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 따라서 n 및 m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 및 25의 군에서 독립적으로 선택된 정수가 될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 아미노산 서열
Figure 112010056356998-pct00005
로 이루어질 수 있고, 여기서 n 및 m은 독립적으로 0 또는 1일 수 있거나, 7개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 10개 이상의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 15개 이상의 아미노산 잔기, 및/또는 최대 50개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 최대 30개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 16개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드의 일부 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 화합물은
Figure 112010056356998-pct00006
로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 포함한다.
놀랍게도, 상기 나열된 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 본 발명에 따른 화합물은 특히 시뉴클레인병을 치료 또는 예방하는데 사용되는 약제의 제조에 사용하기 적합하다는 것이 밝혀졌다. 이러한 펩티드(미모토프)는, 아미노산 서열 DMPVDPDN를 포함하는 인간 알파-시뉴클레인 및 인간 알파-시뉴클레인 단백질 자체의 본래의 에피토프로 유도된 항체의 생체 내 형성을 유도할 수 있다. 그러나, 상기 펩티드(미모토프)는 인간 베타-시뉴클레인 단백질에 대해 단지 매우 제한된 면역 반응만을 유도하거나, 유도할 수 없다. 놀랍게도, 본래의 알파-시뉴클레인에 의해 유도된 항체(아미노산 서열 DMPVD-PDN 포함)는 알파-시뉴클레인은 물론 베타-시뉴클레인에 특이적으로 결합한다. 따라서, 상기 펩티드(미모토프)는 본래의 펩티드에 비해서 더욱 정제된 면역 반응(항체)를 유도한다. 그러나, 미모토프 유도 면역 반응이 알파-시뉴클레인 및 베타-시뉴클레인 사이를 반드시 구별하는 것은 아니다. 펩티드 유도 항체는 알파-시뉴클레인(알파-시뉴클레인 응집체, 루이소체의 형성과 관련됨)의 제거 및/또는 각 개체 내에서 알파-시뉴클레인 응집체(루이소체)의 분해를 맡는다.
상기 나열된 펩티드는 n-말단에 시스테인 잔기를 포함하거나 그렇지 않고, 물론 C-잔기는 또한 C-말단에 첨가될 수 있다. 따라서, 본 발명은 N-말단 또는 C-말단에 시스테인 잔기가 없는 하기의 펩티드를 포함한다:
Figure 112010056356998-pct00007
본 발명에 따른 화합물은 알파-시뉴클레인병의 치료에 사용될 수 있는, 약제, 특히 백신의 제조에 사용될 수 있고, 상기 약제는 특히, 파킨슨병(PD), 루이소체병(LBD), 미만성 루이소체병(DLBD), 루이소체를 동반한 치매(DLB), 치매를 동반한 파킨슨 증후군(PDD), 다발성 신경계 위축(MSA) 및 뇌 철 침착 동반한 신경변성 I형(NBIA Type I)으로 이루어진 군에서 선택된 시뉴클레인병을 치료하는데 적합하다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 화합물은 약학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin), 테타누스 톡소이드, 알부민-결합 단백질, 소 혈청 알부민, 덴드리머(MAP; Biol. Chem. 358: 581), 펩티드 링커(또는 플랭킹 영역)를 비롯하여 문헌[Singh et al., Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081](특히 이 문헌의 표 1) 및 문헌[O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735](특히 이 문헌에 기재된 내생적 면역 증강 화합물 및 운반 시스템)에 기재된 애쥬번트 물질 및 기타 또는 이의 혼합물과 결합된다. 본원에서의 결합 화학(conjugation chemistry)(예를 들어, 이종이작용성 화합물, 예컨대 GMBS는 물론 "Bioconjugate Technigues", Greg T. Hermanson에 기재된 또 다른 물질)은 당업계에서 당업자에게 공지된 반응들에서 선택될 수 있다. 더욱이, 백신 조성물은 애쥬번트, 바람직하게는 가용성이 낮은 알루미늄 조성물, 특히 수산화 알루미늄과 함께 제형화될 수 있다. 물론 또한 애쥬번트, 예컨대 MF59 인산 알루미늄, 인산 칼슘, 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-12, GM-CSF), 사포닌(예를 들어, QS21), MDP 유도체, CpG 올리고스, IC31, LPS, MPL, 폴리포스파젠, 에멀젼(예를 들어, Freund's, SAF), 리포좀, 비로좀(virosomes), 이스콤스(iscoms), 코크리트(cochleates), PLG 미세입자, 폴록사머 입자, 바이러스-유사 입자, 열민감 장독소(LT), 콜레라 독소(CT), 돌연변이 독소(예를 들어, LTK63 및 LTR72), 미세 입자 및/또는 폴리머화된 리포좀이 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 바람직하게는 NHS-폴리(산화 에틸렌)(PEO)(예를 들어, NHS-PEO4-말레이미드)로 이루어진 군에서 선택된, 링커를 통해 담체 또는 애쥬번트에 결합한다.
본원의 화합물(미모토프) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신은 임의의 적합한 적용 모드, 예를 들어, 피내, 정맥내, 복강내, 근육내, 비강내, 구강내, 피하 등 및 임의의 적합한 전달 장치에 의해 투여될 수 있다(O'Hagan et al. , Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735). 본 발명의 화합물은 바람직하게는 정맥내, 피하, 피내 또는 근육내 투여용으로 제형화된다(예를 들어, 문헌[Handbook of 약학Manufacturing Formulations", Sar-faraz Niazi, CRC Press Inc, 2004] 참조).
일반적으로, 백신은 본 발명에 따른 화합물을 0.1ng 내지 10mg, 바람직하게는 10ng 내지 1mg, 특히 100ng 내지 100μg, 또는, 대안적으로, 예를 들어, 100fmol 내지 10μmol, 바람직하게는 10pmol 내지 1μmol, 특히 100pmol 내지 100nmol의 양으로 포함한다. 일반적으로, 백신은 또한 보조물질, 예를 들어, 완충용액, 안정제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는
Figure 112010056356998-pct00008
으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 지니는 펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 펩티드는 약학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 KLH와 결합된다.
본 발명의 또 다른 양태는, 본 발명에 따른 1개 이상의 펩티드를 포함하고,
Figure 112010056356998-pct00009
으로 이루어진 군에서 선택된, 약학적 제형, 바람직하게는 백신에 관한 것이다.
백신으로서 제형화, 예를 들어 피하, 정맥내 및/또는 근육내 투여될 수 있는, 본 발명에 따른 약학 제형은 어떠한 종류의 시뉴클레인 병의 치료에도 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예에서 추가적으로 설명되지만, 이에 제한되지 않는다.
도 1은 115-122 위치에서 인간 알파-시뉴클레인에 특이적인 모노클로날을 이용하여 ELISA에 의한 알파-시뉴클레인 특이적 에피토프의 감지를 나타내고 있다. 펩티드 p4446(알파-시뉴클레인), p4449 및 p4448(인간 에피토프)가 항체에 의해 감지되었다. 음성 대조군 펩티드 p4447(베타-시뉴클레인) 및 p4450, p4451(마우스 에피토프)는 감지되지 않았다. 무관한 펩티드 p1252는 ELISA 분석에서 결합을 보이지 않았다. 데이타는 선형 스케일로 제시되어 있다.
도 2는 115-122 위치에서 인간 알파-시뉴클레인에 특이적인 모노클로날을 이용하여 ELISA에 의한 미모토프의 감지를 나타내고 있다. 두 개의 미모토프(p4553, p4557)에 대한 데이타가 제시되어 있다. 펩티드 p4557는 본래의 펩티드 p4448보다 더욱 약한 결합을 보였다. 펩티드 p4553는 감지 항체에 대해 강한 결합을 보였다. 무관한 펩티드 p1253는 예상대로 ELISA 분석에서 어떠한 결합도 보이지 않았다. 상기 두 미모토프는 마우스의 백신접종시 역가 >1/20000를 유도하고, 강한 결합인자(binders)로 생각된다.
도 3은 115-122 위치에서 인간 알파-시뉴클레인에 특이적인 모노클로날을 이용하여 ELISA에 의한 미모토프의 경쟁의 감지를 나타내고 있다. 제시된 값은 저해 분석에서 40μg의 펩티드를 이용하여 ELISA에 의해 측정되었다. 무관한 펩티드 p1253 및 미모토프 p4492는 본래의 펩티드 p4448과 비교하여 경쟁을 보이지 않았다. 미모토프 p4490 및 p4491는 본래의 펩티드 p4448과 유사한 경쟁을 보였다. 경쟁은 40μg 펩티드 농도에서 ELISA에서 본래의 에피토프와 OD를 비교함으로서 계산되었다. 모든 미모토프를 이러한 참고 결과물과 경쟁지수로 비교하였다. 약 1 값은 높은 저해 능력을 나타낸다. 5보다 큰 경쟁지수를 가진 펩티드는 경쟁을 보이지 않는 것으로 평가된다.
도 4는 주입된 펩티드 및 무관한 펩티드에 대한 면역 반응을 나타내고 있다.
A) 면역화된 마우스의 혈청은 4번의 백신접종 후, 이들의 주입된 펩티드(본래의 에피토프(p4448) 및 미모토프(p4456, p4466 및 p4467 각각)에 대하여 높은 역가를 나타내었다. ELISA에서 측정된 역가는 약 1:10.000(OD 하프-맥스)이고, 데이타는 로그 스케일로 제시하였다. ELISA에 대한 양성 대조군으로서 알파-시뉴클레인 특이적 모노클로날 항체를 사용하였다(CTRL pos).
B) 면역화된 마우스의 동일한 혈청은 무관한 펩티드(p1253)를 감지하는데 실패하였다. ELISA에서 측정된 역가는 1:100(OD 하프-맥스) 이하이고, 무관한 펩티드에 특이적인 모노클로날 항체(CTRL pos)로부터의 신호보다 100배 이상 더 낮았다. 음성 대조군으로서, 1차 항체가 아닌 것을 사용하였다. 데이타는 선형 스케일로 제시되어 있다.
도 5는 반복된 미모토프 면역화에 따른 시뉴클레인에 대한 면역 반응을 나타내고 있다.
A) 각 그룹 안에 모든 동물의 집합 혈청은 p4448, 알파-시뉴클레인의 C-말단 부분에 위치한 펩티드에 대한 항체 역가를 나타낸다. 데이타는 로그 스케일로 제시되어 있다.
B) 면역화된 마우스의 집합 혈청(p4448, p4457 및 p4463)은 4회 백신접종 후, 알파-시뉴클레인에 대한 역가를 나타내며, 면역화된 마우스의 집합 혈청(p4466 및 p4467)은 알파 또는 베타-시뉴클레인 모두를 감지하지 않았다(ELISA에서 측정된 역가는 1:100 하프-맥스보다 훨씬 더 낮음). 본래의 에피토프로 면역화된 마우스의 집합 혈청(p4448)은 알파 및 베타-시뉴클레인을 감지하였다. ELISA에서 1:100 하프-맥스보다 적은 역가는 별표로 나타내었고, 이는 백그라운드에 가까운 값과 동일하다. 테스트된 미모토프 대부분은 베타-시뉴클레인과 교차 반응을 하지 않는 항체를 유도한다. 데이타는 로그 스케일로 제시되어 있다.
도 6A는 인간 a-syn을 특이적으로 감지하는 시중에 판매되는 항체를 이용한 음성 대조군 균주를 나타낸다. 6B에서는, 동일한 영역의 유전자비도입 마우스 뇌를 염색하는데 동일한 항체가 이용되었는데, 이 항체는 이 동물이 인간 a-syn을 발현하지 않기 때문에, 임의의 a-syn 양성 조직을 감지하지 못한다. 도 6C에서, 6a에 제시된 염색과 유사한 특이적 a-syn 염색은 미모토프 유도 혈청(p4498 유도 혈청)에 의해 유도되었다. 뮤린 해마 내의 a-syn 양성 염색은 도 6A 및 6C에 나타낸 바와 같이 반점 염색 패턴에 의해 특징화된다. 화살표는 도 6A 및 6C 각각에서 이러한 a-syn 양성 함유물에 대한 세 가지 샘플을 가르킨다.
실시예 :
본 발명에 따른 미모토프 식별에 사용될 수 있는 항체는 인간 알파-시뉴클레인-유래 아미노산 서열 DMPVDPDN(= 본래의 에피토프, SEQ ID No. 1) 및 전장 인간 알파-시뉴클레인을 감지한다. 이것은 인간 베타-시뉴클레인을 인식하지 않는다. 상기 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 제조물 또는 임의의 항체 일부 또는 이의 유도체일 수 있고, 인간 알파-시뉴클레인의 DMPVDPDN 에피토프에 특이적으로 결합한다(즉, 이는 펩티드 및 전장 단백질에 결합하지만 인간 베타-시뉴클레인에는 결합하지 않는다).
미모토프는 이러한 모노클로날 항체(인간 알파-시뉴클레인 단백질의 아미노산 115-122 내의 서열을 감지) 및 펩티드 라이브러리와 동일시되고 추가적으로 특징화된다.
실시예 1: 본래의 인간 알파- 시뉴클레인 에피토프 C- DMPVDPDN 및 인간 알파-시뉴클레인(단, 인간 베타- 시뉴클레인이 아님)을 특이적으로 감지하는 모노클로날 항체의 생성
모노클로날 항체를 융합 "AFFiRiS 3"로부터 유래하였다: Balb/c 마우스를 애쥬번트로서 BTG(소 타이로글로불린) 및 CFA(프로인트(Freund's) 완전 애쥬번트; 첫번째 주입)를 비롯하여 IFA(프로인트 불완전 애쥬번트; 3 부스터 주입)와 결합된, 본래의 알파-시뉴클레인 에피토프 C-DMPVDPDN로 면역화시켰다. DMPVDPDN-펩티드-특이적, 항체-생성 하이브리도마를 ELISA에 의해 감지하였다(DMPVDPDN-펩티드-코팅된 ELISA 플레이트). 인간 알파-시뉴클레인(재조합 단백질)를 양성 대조군 펩티드로서 사용하였다: ELISA 플레이트 상에 고정된 재조합 단백질을 인식하는 하이브리도마를 포함하였는데 이는 이들이 펩티드 및 전장 알파-시뉴클레인 둘 모두에 특이적으로 결합하기 때문이다. 인간 베타-시뉴클레인(재조합 단백질)을 음성 대조군 펩티드로서 사용하였다: ELISA 플레이트 상에 고정된 상기 두 재조합 단백질을 인식하는 하이브리도마는 제외하였는데, 이는 이들은 두 개의 상이한 시뉴클레인 단백질을 구별하지 않기 때문이다.
천연 인간 알파-시뉴클레인 에피토프 DMPVDPDN의 특이적 감지에 대해 하이브리도마 클론(AFFiRiS3/9 (내부 명칭 "A509"; IgG1))을 분석하였다. A509는 ELISA에서 주입된 에피토프는 물론 전장 알파-시뉴클레인 단백질(재조합 단백질; rPeptide, Bogart, GA, USA로부터 획득됨)을 인식하였다. 그러나 이 에피토프는 ELISA에서 베타-시뉴클레인 단백질(재조합 단백질, rPeptide, Bogart, GA, USA로부터 획득됨)을 감지하지 않았다. 더욱이, A509 항체는 마우스 알파-시뉴클레인의 변이체를 엔코딩하는 펩티드를 감지하지 않았다. 시판되는 mAB 클론(즉, 알파-시뉴클레인(LB509) Monoclonal Antibody Catalog Number SIG-39725; Covance (Princton, NJ, USA))을 이용하여 유사한 결과를 얻을 수 있다.
실시예 2: 파지 디스플레이, 시험관 내 결합 및 저해 ELISA
본 실험에서 사용된 파지 디스플레이 라이브러리는: Ph.D. 7: New England BioLabs E8102L (선형 7머 라이브러리) 및 Ph.D. 12: New England BioLabs E8111L (선형 12머 라이브러리)이고, 이 파지 디스플레이는 제조업자의 프로토콜(www.neb.com)에 따라 수행되었다.
2 또는 3회의 패닝의 후속 라운드 후, 단일 파지 클론을 선별하였고, 패닝 절차에 사용된 항체로 코팅된 플레이트 상에서 파지 상층액에 ELISA를 수행하였다. 이 ELISA에서 양성이었던 파지 클론(타겟에 대해 강한 신호를 보이나, 비특이적 대조군에 대해서는 신호가 없음)을 시퀀싱하였다. DNA 서열로부터, 펩티드 서열을 추론하였다. 이러한 펩티드를 합성하고 결합 및 저해 ELISA에서 특징화하였다. 일부 펩티드를 위해, 추가적인 AA를 C-말단에 부착하였다. 스크린에서 식별된 미모토프로부터 서열 정보를 결합함으로서 추가적으로, 몇가지 신규한 미모토프를 생성하였다. 새롭게 디자인된 미모토프를 포함하는 두 가지 그룹을 미모토프 백신접종을 위한 보존서열(consensus sequence)의 확인을 돕는데 이용하였다.
1. 시험관 내 결합 분석( ELISA )
파지 디스플레이로부터 유래된 펩티드를 비롯하여 C-말단이 연장된 이의 변이체를 BSA와 결합하였고, ELISA 플레이트(1μM; as indicated in the respective figures)에 결합시켰으며, 후속하여 식별된 펩티드의 결합 능력을 분석하기 위해 스크리닝 절차에서 사용된 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션 시켰다.
2. 시험관 내 저해 분석( ELISA )
파지 디스플레이로부터 유래된 상이한 양의 펩티드(각각의 도면에 나타낸 바와 같이, 40μg 내지 0.3μg 범위의 농도(계열 희석))를 스크리닝 절차에서 이용된 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션시켰다. ELISA 플레이트상에 코팅된 본래의 인간 알파-시뉴클레인 에피토프(아미노산: 인간 알파-시뉴클레인 단백질의 115-122)에 대한 항체의 후속 결합을 약화시키는 펩티드는 본 분석에서 저해하는 것으로 생각되었다.
실시예 3: 미모토프의 생체내 테스트: 면역원성 및 교차반응성 분석
1. 미모토프의 생체내 테스트
저해는 물론 비-저해 펩티드를 KLH와 결합시키고 적절한 애쥬번트(수산화알루미늄)와 함께 마우스(야생형 C57/B16 마우스; 플랭크 내로 피하 주입)에 주입시켰다. 동물을 2주 간격으로 4-6회 백신접종하였고, 혈청 역시 2주 간격으로 수집하였다. 주입된 펩티드를 비롯하여 무관한 펩티드에 대한 역가를 모든 혈청에서 측정하였다. 재조합 인간 알파-시뉴클레인 단백질 및 재조합 인간 베타-시뉴클레인에 대한 역가를 혈청 3을 시작으로 각각 측정하였다. 본래의 인간 알파-시뉴클레인 에피토프(aall5-122)에 대해 수집된 혈청을 테스트하였다. 일반적으로, ELISA 플레이트상에 고정된 재조합 전장 단백질 및 소 혈청 알부민(BSA)과 결합된 펩티드에 대한 반응에 의해 혈청을 분석하였다. 항 마우스 IgG 특이적 항체를 이용해 역가를 측정하였다. 상세한 결과에 대해 도 4 및 5를 참조하라.
2. 미모토프의 동일계( in situ ) 테스트
또한 a-syn 교차 반응을 유도하는 선별된 혈청을 동일계에서 마우스 뇌 절편 상에서 인간 a-syn를 감지하는 능력에 대해 테스트하였다. 상세한 결과에 대해 도 6을 참조하라.
3. 결과
3.1 알파- 시뉴클레인 특이적 mAB 의 식별:
도 1은 융합 AFFiRiS 3에서 유래된 알파-시뉴클레인 특이적 모노클로날 항체 AFFiRiS3/9 (내부 명칭 "A509"; IgG1)의 특성을 나타내고 있다.
3.2 알파- 시뉴클레인 특이적 mAB 를 이용한 스크리닝:
3.2.1. 파지 디스플레이 라이브러리 Ph.D. 7 및 12
3.2.1.1. DMPVDPDN에 대해 유도된 모노클로날 항체를 이용한 스크리닝
51개의 서열을 이 스크린에서 PhD 7 및 PhD 12 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로서 식별하였다: 표 1은 식별된 펩티드 및 이들의 결합 능력을 본래의 에피토프와 비교하여 요약한 것이다.
표 1: 모 항체에 대한 알파-시뉴클레인 미모토프 결합
Figure 112010056356998-pct00010
Figure 112010056356998-pct00011
표 1에 대한 범례: 결합 능력은 하기 결합 코드에 의해 코드화되었다: 1:X는 모 AB의 희석 인자를 기재하고 있다.
Figure 112010056356998-pct00012
3.3. 알파- 시뉴클레인에 대해 유도된 모노클로날 항체를 이용한 스크리닝 파지 디스플레이 라이브러리 내에서 식별된 미모토프의 시험관 내 특성 결정:
도 2 및 3은 생체 외에서 미모토프를 특징짓는데 이용된 결합 및 저해 분석에 대한 대표적인 예시를 도시하고 있다. 획득된 데이타를 표 1 및 2에 각각 요약하였다.
제시된 51개의 서열로부터 29개의 서열은 시험관 내 경쟁 실험에서 알파-시뉴클레인 특이적 모노클로날 항체의 결합을 저해한다: 시험관 내 경쟁 실험에서 모노클로날 항체의 결합을 저해하지 않으나, 모 항체에 대한 결합 능력을 여전히 유지하는 추가 22개의 서열이 식별되었다:
표 2: 저해 분석에서 긍정적인 결과를 보인 본 발명에서 식별된 알파-시뉴클레인 미모토프
Figure 112010056356998-pct00013
Figure 112010056356998-pct00014
표 2에 대한 범례: 저해 능력은 하기 코드에 의해 코드화된다:
약한 저해는 본래의 에피토프와의 결합보다 AB 결합을 더 낮추기 위해 더 많은 펩티드가 필요로 한다는 것을 의미하고; 강한 저해는 미모토프 및 본래의 에피토프에 대한 AB 결합을 낮추기 위해 유사한 양의 펩티드가 필요하다는 것을 의미한다. 미모토프는 기본적으로 본래의 펩티드와 비교된다. 이 분석에서 사용된 40μg 펩티드에서의 OD는 본래의 펩티드와 비교한 경쟁 능력을 계산하는데 이용된다.
Figure 112010056356998-pct00015
표 3: 비-미모토프 펩티드 및 단백질:
Figure 112010056356998-pct00016

3.4. 알파- 시뉴클레인에 대해 유도된 모노클로날 항체를 이용한 스크리닝 파지 디스플레이 라이브러리에서 식별된 미모토프의 생체 내 특성 결정:
암컷 C57/B16 마우스(그룹 당 5-6마리 마우스)를 KLH와 결합한 30μg 펩티드로 면역화시켰다. 대조군에 p4448-KLH 컨쥬게이트를 투여하였다. 애쥬번트로서 명반(alum)을 사용하였다(마우스당 항상 1 mg). 투여한 모든 펩티드는, 일부 펩티드가 시험관 내에서(시험관 내 저해 분석에서) 본래의 에피토프의 이의 모 항체에 대한 결합을 저해하지 않았음에도 불구하고, 인간 알파-시뉴클레인의 aa115-122에 결합한 모노클로날 항체에 특이적으로 결합할 수 있었다. 2주 간격으로 각각 백신접종시킨 후, 단일 마우스의 혈청 또는 수집 혈청을 이용하여(도 5 참조) 항체 역가를 측정하기 위한 시험관 내 ELISA 분석을 수행하였다(도 4 및 도 5 각각을 참조). ELISA 플레이트의 웰을 미모토프-BSA 컨쥬게이트 및 무관한 펩티드-BSA 컨쥬게이트(음성 대조군)으로 코팅하였다. 각각의 미모토프-BSA 컨쥬게이트와 모 항체의 반응에 의해 양성 대조군을 수행하였다. 항-마우스 IgG를 이용해 감지하였다. 추가적으로, 재조합 단백질을 ELISA 플레이트에 고정시켰고 이에따라 혈청이 반응하였다.
C57/B16 마우스에서 테스트된 모든 미모토프의 경우, 반복된 백신 접종 후, 개별 주입된 펩티드에 반응하는 항체를 감지할 수 있었다. 추가적으로, 상술된 미모토프 4개 중에 2개는(도 5 및 표 1 각각 참조) 인간 알파-시뉴클레인과는 반응하지만 인간 베타-시뉴클레인과는 반응하지 않는 항체를 발달시켰다. 2/4는 재조합 단백질과 교차 반응성을 보이지 않았다. 중요한 것은, 본래의 에피토프 DMPVDPDN이 두개의 재조합 시뉴클레인 단백질 사이가 구별되지 않는 면역 반응을 유발했다는 것이다.
도 4 및 5는 생체 내에서 미모토프를 특징짓는데 이용되는 분석에 대한 대표적인 예를 도시하고 있다. 도 4는 주입된 펩티드 및 비관련된 서열을 포함하는 무관한 펩티드에 대한 면역 반응을 분석함으로서, 미모토프 백신접종에 의해 유도된 면역반응의 생체 내 특성에 대한 예를 도시하고 있다. 본래의 에피토프 p4448, 양성 대조군 펩티드, 및 미모토프 p4456, p4466 및 p4467은 주입된 펩티드(그 자체)에 대한 면역 반응은 유도하였으나, 비관련된 서열(p1253)에 대한 비특이적 면역 반응을 유도하는데는 실패하였다.
도 5는 전장 알파-시뉴클레인 및 베타-시뉴클레인에 대한 미모토프 백신접종에 의해 유도된 면역 반응의 생체 내 특성에 대한 예시를 도시하고 있다. 이 실시예에서 테스트된 모든 백신은 본래의 알파-시뉴클레인 에피토프 115-122에 대해 감지가능한 면역 반응을 시작하였다. 이 실시예에서 테스트된 본래의 에피토프 및 거의 모든 미모토프(예외: p4466 및 p4467)는 더욱이 전장 알파-시뉴클레인과도 반응을 보였다. 그러나, 본래의 에피토프-유도 면역 반응은 전장 베타-시뉴클레인 단백질을 또한 감지하므로, 알파-시뉴클레인에 대한 특이성 및 두 단백질 사이를 구별하는 능력이 감소된다. 이러한 발견과는 반대로, 대부분(전부는 아님)의 미모토프-유도 혈청은 베타-시뉴클레인을 감지하는데 실패하였고, 따라서 두 시뉴클레인 단백질 사이를 구별하는 능력을 보유하며 활성 면역 프로그램(active immunisation programme)의 항 알파-시뉴클레인의 높은 특이성을 보장하여, 효능 및 우수한 안정성 프로파일을 획득할 수 있었다.
3.5 미모토프의 동일계 테스트
a-syn 특이적 면역 반응을 유도하는 미모토프는 또한 유전자도입 마우스 뇌 조직에서 a-syn 면역반응 함유물을 감지할 수 있다. 도 6에서 나타내었듯이, 미모토프 백신접종된 동물로부터 유래된 혈청은, 인간 a-syn가 과다발현된 동물로부터 마우스 뇌 영역상에 나타난 a-syn 양성 구조를 염색할 수 있다. 간략히, ELISA에서 인간 a-syn 반응성에 대해 양성인 혈청은 면역조직화학(IHC)에서 사용되어 왔다. 마우스 뇌의 7μM 영역이 박힌 파라핀을 슈퍼프로스트 플러스(Superfrost Plus) 유리 슬라이드상에 올려놓고, IHC를 수행하였다. 섹션을 혈청(PBS 내 희석도 1:100 및 1:400)과 함께 인큐베이션시켰고, 후속하여 ECTASTAIN ABC 시스템, DAB 및 MOM 블로킹(모든 반응은 벡터 연구소(Vector labs)로부터 획득된 시판되는 시약을 각각 이용하여 수행되고, 제조자의 프로토콜에 따라 수행됨)을 이용하여 면역조직화학에 대한 표준 프로토콜에 따라 염색하였다. 헤매톡실린(Haematoxylin)을 이용해 대비염색을 수행하였다. 슬라이드를 엔텔란(Entellan)에 고정시키고 후속하여 종래의 명시야 현미경을 이용하여 문서화하였다. 인간 a-syn에 특이적인 항체(LB509, Covance)를 최종 희석도 1/250에서 시뉴클레인 감지에 대한 양성 대조군으로 사용하였다.
도 6A에서는, 양성 대조군 염색이 도시되어 있다. 도 6B에서, 동일한 항체를 유전자비도입 마우스 뇌의 동일 영역 상에 사용하였는데, 이 항체는 이 동물이 인간 a-syn을 발현시키지 않기 때문에, 임의의 a-syn 양성 조직도 감지하는데 실패하였다. 도 6C에서는 6A에 제시된 염색과 유사한 비특이적 a-syn 염색을 미모토프 유도 혈청(p4498 유도 혈청)에 의해 유도하였다. 뮤린 해마에서 a-syn 양성 염색은 도 6A 및 6C에 나타내었듯이 반점 염색 패턴에 의해 특징화된다. a-syn 특이적 항체를 유도할 가능성이 있는 예들은 p4456, p4498 및 p4562 각각에 기초한 백신을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Affiris AG <120> Mimotope <130> R 53709 <150> A 297/2008 <151> 2008 02 22 <160> 57 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial peptide <400> 1 Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial peptide <400> 2 Cys Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial peptide <400> 3 Cys Asp Met Pro Val Leu Pro Asp 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial peptide <400> 4 Cys Asp Ser Pro Val Leu Pro Asp 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial peptide <400> 5 Cys Asp Ser Pro Val Trp Ala Glu 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial peptide <400> 6 Cys Asp Thr Pro Val Leu Ala Glu 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial peptide <400> 7 Cys Asp Gln Pro Val Leu Pro Asp Asn 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> 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Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

Claims (21)

  1. CDQPVLPD, CDMPVLPD, CDSPVLPD, CDQPVLPDN, CDMPVLPDN, CDSPVLPDN, CHDRPVTPD, CDRPVTPD, CDVPVLPD, CDTPVYPD, CDTPVIPD, CHDRPVTPDN, CDRPVTPDN, CDVPVLPDN, CDTPVYPDN, CDQPVLPDG, CDMPVLPDG, CDSPVLPDG, CDHPVHPDS, CDMPVSPDR, CDRPVYPDI, CDHPVTPDR, CDTPVLPDS, CDMPVTPDT, CDAPVTPDT, CDSPVVPDN, CDLPVTPDR, CDSPVHPDT, CDAPVRPDS, CDMPVWPDG, CDRPVQPDR, CYDRPVQPDR, 및 CDMPVDADN으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 시뉴클레인병(synucleinopathies)을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 화합물이 7 내지 16개 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 상기 시뉴클레인병이 루이소체병(Lewy body disorders, LBDs), 다발성 신경계 위축(Multiple system atrophy, MSA) 또는 뇌 철 침착 동반한 신경변성 I형(Neurodegeneration with brain iron accumulation type I, NBIA Type I)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 루이소체병이 파킨슨병(Parkinson's disease, PD), 치매를 동반한 파킨슨병(Parkinson's disease with dementia, PDD) 또는 루이소체를 동반한 치매(dementia with Lewy bodies, DLB)인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  9. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 상기 화합물이 약학적으로 허용가능한 담체와 결합된 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체가 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  11. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 상기 화합물이 정맥내, 피하, 피내 또는 근육 내 투여용으로 제형화되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  12. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 상기 화합물이 애쥬번트와 함께 제형화되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 애쥬번트가 수산화 알루미늄인 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  14. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 상기 화합물이 약제 내에 0.1ng 내지 10mg의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 화합물이 약제 내에 10ng 내지 1mg의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 화합물이 약제 내에 100ng 내지 100㎍의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  17. CDQPVLPD, CDMPVLPD, CDSPVLPD, CDQPVLPDN, CDMPVLPDN, CDSPVLPDN, CHDRPVTPD, CDRPVTPD, CDVPVLPD, CDTPVYPD, CDTPVIPD, CHDRPVTPDN, CDRPVTPDN, CDVPVLPDN, CDTPVYPDN, CDQPVLPDG, CDMPVLPDG, CDSPVLPDG, CDHPVHPDS, CDMPVSPDR, CDRPVYPDI, CDHPVTPDR, CDTPVLPDS, CDMPVTPDT, CDAPVTPDT, CDSPVVPDN, CDLPVTPDR, CDSPVHPDT, CDAPVRPDS, CDMPVWPDG, CDRPVQPDR, CYDRPVQPDR, 및 CDMPVDADN로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 펩티드가 약학적으로 허용가능한 담체와 결합되는 것을 특징으로 하는, 펩티드.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체가 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)인 것을 특징으로 하는, 펩티드.
  20. 제 17항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 시뉴클레인병을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 제형.
  21. 제 20항에 있어서, 백신인 약학적 제형.
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