KR20030085528A - 포토랍두스 루미네센스 균주 ｔｔ01 게놈 및 그 용도 - Google Patents
포토랍두스 루미네센스 균주 ｔｔ01 게놈 및 그 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 살충제, 살균제, 살진균제로 사용될 수 있는, 톡신 또는 항생물질형 활성을 보이는 폴리펩티드 또는 이 톡신 또는 항생물질 생합성 오페론에 관계하는 폴리펩티드와 같은, 포토랍두스 루미네센스 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 서열 및 누클레오티드 서열, 이 서열을 포함하는 벡터 및 이 벡터로 형질 전환된 세포 또는 동물에 관한 것이다.
Description
포토랍두스 루미네센스는 선충 및 곤충 기생충과 공생하는 곤충병원성 장내 박테리아다. 이 박테리아는 많은 톡신(살충제, 살균제 및 살진균제)을 합성할 수 있고 많은 효소를 분비할 수 있기 때문에, 숙주-기생충 상호작용의 연구 모델일 뿐 아니라 산업적으로 많이 이용된다. 이 분비 및 합성 과정에 관여하는 유전자 결정인자들에 대한 종합적인 이해를 위해 포토랍두스 루미네센스 게놈을 서열분석 하였다.
본 발명에서 그 게놈 서열을 분석한, 포토랍두스 루미네센스 균주 TT01, 아종 라우몬디를 선택하는 것이 매우 중요한데 이는 이 균주가 하기 몇 가지 잇점을 갖기 때문이다.
- 게놈이 안정하고;
- 페트리접시에서 배양가능하고;
- 계통수의 중심에 있어 종을 대표하며;
- 연관된 선충이 공지되고 배양되어 있다 (Heterorhabditis bacteriophoraHP88, Trinidad).
이렇게, 본 발명은 포토랍두스 루미네센스 균주 TT01의 누클레오티드 서열 및 폴리펩티드 서열에 관한 것이다.
본 발명은, 살충제, 살균제, 살진균제로 사용될 수 있는, 톡신 활성이나 항생물질형 활성을 보이는 폴리펩티드 또는 이 톡신 또는 항생물질의 생합성 오페론에 관계하는 폴리펩티드와 같은, 포토랍두스 루미네센스의 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 서열과 누클레오티드 서열, 이 서열을 포함하는 벡터, 그리고 이 벡터로 형질 전환된 세포 또는 동물에 관한 것이다.
본 발명의 목적은, 포토랍두스 루미네센스 균주 TT01 게놈으로부터 제조한 게놈 라이브러리에 함유되어 있고 2000년 5월 12일자에 기탁번호 I-2478번으로 프랑스 국립 배양액 및 미생물 집합소(CNCM)에 기탁된, 포토랍두스 루미네센스 TT01 균주의 게놈 서열 및 이 게놈에 포함된 모든 유전자 및 비코딩 조절 서열을 개시하는 것이다.
포토랍두스 루미네센스 균주 TT01은 본 출원에서는 호환식으로 포토랍두스 루미네센스로 명명하기도 한다.
본 발명은 또한 포토랍두스 균주를 타이핑하는 새로운 수단에 관한 것이다. 이러한 수단은 DNA "칩" 형태이거나 다른 형태일 수 있다. 이러한 타이핑 수단의새로운 특성은 다음과 같다:
* 사용 신속성 및 간단성;
* 균주를 구별하기 위한 고 성능; 및
* 분석 균주의 게놈 내용에 대한 정보 제공 가능성.
따라서, 본 발명은 포토랍두스 루미네센스 게놈으로부터 유래한 분리된 누클레오티드 서열에 관한 것으로, 이는 서열 1 내지 서열 41 그리고 서열 5826 내지 서열 5834로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
서열 1 내지 서열 41은 전부 합쳐 포토랍두스 루미네센스 TT01 게놈 서열을 커버하는 41 콘티그 서열들을 나타낸다.
서열 1 내지 서열 41을 재조립한 후 이를 다시 포토랍두스 루미네센스 TT01 게놈 서열을 커버하는 9개의 새로운 콘티그로 매끄럽게 만드는 것이 가능했다. 서열 5826 내지 서열 5834는 이러한 9개의 콘티그 서열을 나타낸다.
서열 1 내지 서열 41과 서열 5826 내지 서열 5834는, "샷건(shotgun)" 기술 (cf.실시예)를 이용하여 포토랍두스 루미네센스 TT01 게놈의 서열을 분석하여 얻었다. 이 서열 1 내지 서열 41 또는 서열 5826 내지 서열 5834의 서열은 상당한 정확성을 가짐에도 불구하고, 이러한 서열은 조립 후에 포토랍두스 루미네센스 TT01 게놈을 100% 정확히 나타내지 못한다거나 이 서열 내에 흔하지 않은 몇 서열분석 오류나 불확정 영역을 남길 수 있다. 본 발명에서는, 이후 서열 리스트에서, 이러한 아미노산의 불확정 존재를 "Xaa"로 표시하고 누클레오티드의 불확정 존재를 "N" 또는 "n"으로 표시한다. 이러한 거의 드문 오류 또는 불확정은, 본 발명에 따른전체 염색체 및/또는 그 대표적인 단편들을 이용하고 - 이때, 얻은 서열들은 특히 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 서로 용이하게 비교할 수 있는데 - 증폭, 클로닝 및 서열화 표준 방법과 예컨대 후술하는 바와 같은 본 발명에 따른 서열 기록용 컴퓨터-판독 매체를 이용하여 당업자가 용이하게 증명하고 교정할 수 있다. 이 발생 가능한 드문 오류 또는 불확정을 교정한 후 얻은, 교정된 누클레오티드 서열은 여전히 서열 1 내지 서열 41 또는 서열 5826 내지 서열 5834와 97% 이상, 바람직하게는 98%, 98.5%, 99% 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는다.
본 발명은 또한 하기 a) 내지 f)로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 포토랍두스 루미네센스 게놈에서 유래한 분리된 누클레오티드 서열에 관한 것이다:
a) 서열 1 내지 서열 41 또는 서열 5826 내지 서열 5834 로부터 선택된 서열과 75%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 누클레오티드 서열;
b) 서열 1 내지 서열 41 또는 서열 5826 내지 서열 5834로부터 선택된 서열의 대표적인 단편을 포함하는 누클레오티드 서열;
c) 상기 a) 또는 b)에서 정의한 누클레오티드 서열에 상보적인 누클레오티드 서열;
d) 상기 a), b) 또는 c)에서 정의한 하나의 서열에 상응하는 RNA 누클레오티드 서열;
e) 상기 a), b), c) 또는 d)에서 정의한 서열을 변형시킨 누클레오티드 서열;
f) 서열 1 내지 서열 41 또는 서열 5826 내지 서열 5834로부터 선택된 서열과 높은 스트린전시 조건에서 하이브리드된 20 누클레오티드 이상, 바람직하게는 25, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 또는 2500 누클레오티드 이상을 포함하는 누클레오티드 서열.
보다 상세하게, 본 발명의 대상은 서열 1 내지 서열 41중 하나의 서열에 포함되는 누클레오티드 서열 또는 서열 5826 내지 서열 5834 서열 중 하나에 포함되는 서열로서, 이 서열은 서열 42 내지 서열 3855의 폴리펩티드 서열로부터 선택된 폴리펩티드 또는 서열 5835 내지 서열 10784가 코딩하는 폴리펩티드로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩한다.
바람직하게는, 서열 5835 내지 서열 10784 중 하나의 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드는 이 폴리펩티드의 5개 이상의 아미노산 서열이 서열 5835 내지 서열 10784의 첫 누클레오티드를 판독틀(reading frame)로서 취함으로써 얻어진 폴리펩티드이다.
더욱 바람직하게, 본 발명의 대상은, [표 1] 마지막 칼럼 또는 [표 2] 끝에서 두 번째 칼럼에 주석한 바와 같이, 톡신 및/또는 항생물질형 활성에 상응하는 기능 또는 이 톡신 및/또는 항생물질 합성에 관계하는 오페론에 상응하는 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 누클레오티드 서열에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 하기 a) 또는 b)중에서 선택된다:
a) 서열 61, 서열 62, 서열 67, 서열 171, 서열 221, 서열 268, 서열 288, 서열 380, 서열 426, 서열 438, 서열 448, 서열 453, 서열 455, 서열 456, 서열 458, 서열 501, 서열 516, 서열 530, 서열 542, 서열 551, 서열 720,서열 761, 서열 762, 서열 814, 서열 859, 서열 860, 서열 861, 서열 862, 서열 869, 서열 1079, 서열 1168, 서열 1174, 서열 1176, 서열 1413, 서열 1414, 서열 1415, 서열 1416, 서열 1417, 서열 1457, 서열 1651, 서열 1856, 서열 1869, 서열 2021, 서열 2080, 서열 2152, 서열 2162, 서열 2173, 서열 2251, 서열 2295, 서열 2306, 서열 2317, 서열 2328, 서열 2340, 서열 2342, 서열 2351, 서열 2500, 서열 3228, 서열 3230, 서열 3311, 서열 3317, 서열 3318, 서열 3319, 서열 3320, 서열 3322, 서열 3323, 서열 3326, 서열 3327, 서열 3328, 서열 3375, 서열 3376, 서열 3377, 서열 3378, 서열 3422, 서열 3489, 서열 3503, 서열 3609, 서열 3623, 서열 3624, 서열 3772, 서열 3783, 서열 3788 및 서열 3794; 또는
b) [표 2] 마지막 칼럼에 기재된 바와 같이, 상기 a)에서 정의한 서열과 동일성을 갖는 서열 5835 내지 서열 10784에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
톡신 또는 항생물질형 활성과 연관된 기능을 갖는 상기 a)에서 정의한 82개의 폴리펩티드 또는 상기 b)에서 정의한 바와 같이 [표 2]의 상동성 폴리펩티드는, 예컨대 이 기능과 연관된 컨센서스 모티브의 존재, 또는 이들을 게놈 위에 병렬시키고 이런 식의 활성을 갖는 서열의 존재에 의해 확인될 수 있다.
보다 일반적으로, 본 발명은 또한 서열 1 내지 서열 41 또는 서열 5826 내지 서열 5834로부터 유래하고 포토랍두스 루미네센스 폴리펩티드를 코딩함으로써, 서열 1 내지 41 또는 서열 5826 내지 서열 5834로부터 분리될 수 있는 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
또한, 하기 a) 내지 e)로부터 선택된 누클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 서열도 본 발명의 대상이다:
a) 서열 42 내지 서열 3855로부터 선택된 폴리펩티드 또는 서열 5835 내지 서열 10784 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드, 바람직하게는, 톡신 또는 항생물질형 활성과 연관된 기능으로 인해 선택된 상기 82개의 폴리펩티드 서열 또는 [표 2] 마지막 칼럼에 정의된 상동성 펩티드로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 누클레오티드 서열;
b) 상기 a)에서 정의한 누클레오티드 서열과 75% 이상의 동일성, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 누클레오티드 서열;
c) 상기 a) 또는 b)에서 정의한 서열에 상보적인 서열 또는 이에 상응하는 RNA 누클레오티드 서열;
d) 상기 a) 또는 c)에서 정의한 서열의 대표적인 단편에 해당하는 누클레오티드 서열; 및
e) 상기 a) 또는 c)에서 정의한 서열을 변형시킨 서열.
"핵산", "핵산 서열", "폴리누클레오티드", "올리고누클레오티드", "폴리누클레오티드 서열" 및 "누클레오티드 서열"이라는 용어들은, 본 발명에서는 별다르지 않게 사용되는데, 정확한 누클레오티드 서열을 나타내고자 하는 것으로, 변형되거나 변형되지 않을 수 있고, 핵산의 한 단편 또는 한 영역을 정의할 수 있고, 비천연 누클레오티드를 포함하거나 포함하지 않을 수 있으며, 똑같이 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA 및 DNA 전사물질에 해당할 수도 있다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산 서열은 펩티드 핵산(PNAs)도 포함한다.
본 발명은, 천연상태의 염색체 환경에 있는, 즉, 천연상태로 있는 누클레오티드 서열에 관한 것이 아니라고 이해되어야 한다. 본 발명에 따른 서열은 분리 및/또는 정제된 서열로, 다시 말해서, 이 서열들은 예컨데 복사에 의해 적어도 그 일부가 변형된 환경으로부터 직 간접적으로 얻은 것이다. 따라서, 화학 합성으로 얻은 핵산도 나타내는 것으로 한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한, 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 "동일률(percent identity)"이란, 최적으로 정렬시킨 후 얻은, 비교 대상이 되는 두 서열 사이의 동일한 아미노산 잔기 또는 누클레오티드를 나타내는 것인데, 이 백분률은 순전히 통계적인 것이며 두 서열간의 차이는 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포할 수도 있다. "최상의 정렬" 또는 "최적의 정렬"이라는 용어는, 후술하는 바와 같이, 동일률이 최고라고 결정되는 정렬을 나타내는 것으로 한다. 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열간의 서열 비교는 통상적으로 두 개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후 두 서열을 비교하는데, 이 비교는 서열의 한 영역 또는 "비교창"을 대상으로 하여 지역(local region)의 서열 유사성을 확인하고 비교한다. 서열 비교를 위한 최적의 정렬은 수작업으로 하는 것 외에, 스미스와 와트만의 지역 상동성 알고리즘(1981, Ad. App. Math., 2:482)이나 피어슨과 립만의 유사성 조사(1988, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 85:2444) 또는 이 알고리즘을 이용한 컴퓨터 프로그램(위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지내의 GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)을 이용하여 수행할 수도 있다. 최적의 정렬을 얻기 위해 바람직하게는 BLOSUM 62 매트릭스를 이용하는 상기 BLAST 프로그램을 사용한다. PAM이나 PAM250 매트릭스를 이용할 수도 있다.
두 개의 핵산 또는 아미노산 서열간의 동일률은 이 서열들이 최적으로 정렬하였을 때 이 두 서열을 비교하여 결정하는데, 비교되는 두 서열은 두 서열간의 최적 정렬을 하는 동안 대비 서열(reference sequence)에 대해 부가 또는 결실을 포함할 수도 있다. 두 서열에서 서로 동일한 위치에 있는 누클레오티드 또는 아미노산 잔기의 숫자를 정한 후, 이 숫자를 비교되는 전체 위치 수로 나눈 다음 여기에 100을 곱하여 두 서열간의 동일률을 계산한다.
"최적 정렬 후 대비 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 동일률을 보이는 핵산 서열"이란, 대비 핵산 서열과 비교하였을 때, 특히 점 형태의 어떠한 변형, 특히 결실, 절단, 연장, 키메릭 융합 및/또는 치환 같은 변형을 나타내고 최적 정렬 후 대비 서열에 대해 75% 이상, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 동일률을 보이는 핵산 서열을 나타내는 것으로 한다. 바람직하게는, 이 서열은 그 상보적 서열이 대비 서열과 특이적으로 하이브리드될 수 있는 서열이다. 바람직하게는, 상기 특이적 또는 높은 스트린전시 하이브리드 조건이란 이들이 최적 정렬을 한 후, 비교되는 두 서열 중 어느 하나의 서열과 그 상보적 서열간에, 75% 이상, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 동일률을 보이는 핵산 서열이다.
높은 스트린전시 조건하의 하이브리드화란, 두 상보적 DNA 단편 사이에 하이브리드화를 유지할 수 있도록 온도와 이온 강도가 선택된 조건을 말한다. 예컨대,전술한 폴리펩티드 단편을 정의하기 위한 하이브리드 단계에서의 높은 스트린전시 조건이란 다음과 같은 것이 유리하다.
DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화는 두 단계로 진행된다: (1) 5 x SSC(1 x SSC는 0.15M NaCl + 0.015M 시트르산나트륨에 해당한다), 포름아미드 50%, 도데실황산나트륨 7%(SDS), 10 x 덴하르트 용액, 황산덱스트란 5% 및 연어정액 DNA 1%를 함유하는 완충액(20mM, pH 7.5)에서 3시간 동안 42℃에서 전-하이브리드화하는 단계; (2) 프로브 길이에 따른 특정 온도(즉, 길이가 100 누클레오티드 이상인 프로브 경우 42℃)에서 20 시간 동안 하이브리드화 그 자체를 수행한 후 20℃, 2 x SCC + 2% SDS 에서 20분간의 세척을 2회 하고 다시 20℃, 0.1 x SCC + 0.1% SDS 에서 20분간 세척을 1회한다. 길이가 100 누클레오티드 이상인 프로브 경우는, 60℃, 0.1 x SCC + 0.1% SDS 에서 30분간 최종 세척한다. 소정 길이의 폴리누클레오티드를 위한 전술한 높은 스트린전시 하이브리드 조건은, 당업자가 삼부룩 등의 저서(1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor)에 기재된 내용에 따라 조정할 수 있다.
또한, "본 발명에 따른 서열의 대표적 단편"이란, 이 단편이 유래한 원래의 서열에서 15개 이상의 연속 서열, 바람직하게는 20개, 25개, 30개, 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 300개 및 450개의 연속 서열을 포함하는 누클레오티드 단편을 나타내는 것으로 한다.
"대표적 단편"이라는 용어는, 특히 후에 정의되는 바와 같이, 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편을 코딩하는 핵산 서열을 나타내는 것으로 한다.
"대표적 단편"이라는 용어는, 또한 인터제닉 서열과 특히 조절 시그날(프로모터, 터미네이터 또는 심지어는 인핸서 등)을 운반하는 누클레오티드 서열을 나타내는 것으로 한다.
상기 대표적 단편 중 바람직한 것은 ORF 서열로 언급되는 개방 판독틀에 해당하는 누클레오티드 서열로서, 이 ORF 서열은 일반적으로 개시 코돈과 정지 코돈 사이에 존재하거나 두개의 정지 코돈 사이에 존재하고, 폴리펩티드, 바람직하게는 예컨대 후술되는 ORF 서열과 같은, 반드시 이에 국한되는 것은 아니나, 100 아미노산 이상을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
본 명세서에서 이후 사용될 ORF 누클레오티드 서열의 번호 매김은 서열 42 내지 서열 3855를 위한 ORF가 코딩하는 단백질의 아미노산 서열의 번호 매김에 상응한다. 서열 5835 내지 서열 10784의 ORF 누클레오티드 서열의 번호 매김은 상기 서열 5835 내지 서열 10784 ORF가 코딩하는 단백질의 아미노산 서열 번호 매김을 위해 본 발명에서 이후 사용될 것이다.
본 발명에 따른 대표적 단편들은, PCR 같은 특이적 증폭으로 얻을 수 있거나 본 발명에 따른 누클레오티드 서열을 제한 효소로 분해(digestion)한 후 PCR 증폭시켜 얻을 수 있는데, 이 방법은 특히 삼부룩 등(Sambrook et al.)의 저서에 기재되어 있다. 이 대표적 단편들이 그리 길지 않을 때는 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 화학 합성하여 얻을 수도 있다.
본 발명의 서열을 포함하는 서열 또는 그 대표적 단편들은, 본 발명에 따른 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 나타내는 서열에의해 자연스럽게 만들어진 서열을 포함하는 것으로 한다.
"변형된(시킨) 누클레오티드 서열"이라는 용어는, 당업자에게 잘 알려진 기술에 따라 돌연변이 시켜 얻은 서열로서, 정상 서열과 비교하여 변형된, 바람직하게는 정상서열과 비교하여 10% 이하로 변형된 누클레오티드를 모두 포함하며, 예컨대 폴리펩티드의 발현을 위한 조절 서열 및/또는 프로모터 서열이 돌연변이 되어 특히 폴리펩티드의 활성이나 발현이 변형된 누클레오티드를 의미하는 것으로 한다.
"변형된 누클레오티드 서열"이라는 용어는, 또한 하기 정의하는 변형된 폴리펩티드를 코딩하는 누클레오티드 서열을 모두 의미하는 것으로 한다.
본 발명에 따른 대표적 단편은 프로브 또는 프라이머일 수 있고 이들은 핵산 서열의 검출, 확인, 분석 또는 증폭 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 프로브 또는 프라이머는 단일-가닥 핵산 단편 또는 변성된 이중-가닥 단편으로 정의되는데, 예컨대 12 염기 내지 수 킬로 염기(kb), 특히 15 염기 내지 수백 염기, 바람직하게는 15 내지 50 또는 100 염기를 포함하고 주어진 조건에서 하이브리드화 특이성을 가져 표적 하는 핵산과 하이브리드화 복합체를 형성하는 단편이다.
본 발명에 따른 프로브와 프라이머는, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 방사능 또는 비방사능 화합물로 직 간접적으로 표지 시킴으로써 검출 및/또는 정량가능한 시그날을 얻을 수 있다 (특허 FR 78 10975 및 키론의 bDNA EP 225 807 및 EP 510 085).
본 발명에 따른 비표지된 폴리누클레오티드 서열은 프로브 또는 프라이머로직접 사용할 수 있다.
일반적으로는 서열을 표지화하여 여러 용도에 사용할 수 있는 서열을 얻는다. 방사능 원소 또는 비방사능 분자를 이용하여 본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브를 표지한다.
사용되는 방사능 동위원소들 중에서는32P,33P,35S,3H or125I를 들 수 있다. 비방사능 물질은, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 디곡시게닌, 햅텐, 염료와 같은 리간드나 방사발광물, 화학발광물, 생발광물, 형광물 또는 인광물과 같은 발광제로부터 선택된다.
따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 특히 PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 기술(Rolfs 등, 1991, Berlin: Springer-Verlag)을 이용하는 방법에서 프라이머 및/또는 프로브로 사용될 수 있다. 이 기술에서는 증폭시켜야 하는 단편을 구성하는 올리고누클레오티드 프라이머 쌍을 선택하는 것이 요구된다. 예컨대, 미국 특허 US 4,686,202호에 기재된 기술을 참고할 수 있다. 증폭시킨 단편은 예컨대 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 시키거나 겔투과 또는 이온 교환 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피를 실시한 후 확인할 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드의 누클레오티드 서열을 매트릭스로 이용하거나 이 서열을 포함하는 플라스미드 또는 유도된 증폭물을 이용하여 증폭 특이성을 조절할 수 있다. 증폭시킨 누클레오티드 단편은, 생물학적 샘플에 존재하는 이 단편에 상보적인 표적 핵산 서열의 존재를 증명하기 위한 하이브리드화 반응에서 시약으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 증폭시켜 얻은 핵산에 관한 것이다.
본 발명에 따른 누클레오티드 서열 프라이머 쌍을 이용하는, 표적 핵산을 증폭시키는 다른 방법을 PCR의 대안 (PCR-유사)으로 사용할 수 있다. "PCR-유사"라는 용어는 핵산 서열의 직 간접적인 복제품을 사용하는 방법이나 아니면 표지화 시스템이 증폭된 방법을 모두 나타내는데, 당연히 공지된 방법들이다. 일반적으로, 이 방법들은 폴리머라제에 의한 DNA 증폭을 포함하는데, 원래의 샘플이 RNA인 경우에는 사전에 역전사를 수행하여야 한다. 상당히 많은 방법들이 현존하는데, 예를 들면, SDA법(가닥 치환 증폭법) (Walker 등, 1992, Nucleic Acids Res., 20:1691), TAS법(전사-기초한 증폭 시스템법) (Kwoh 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1173), 3SR법 (자가-유지 서열 복제법) (Guatelli 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874), NASBA법(핵산 서열에 기초한 증폭법) (Kievitis 등, 1991, J. Virol. Methods, 35, 273), TMA법(전사 매개 증폭법), LCR법(리가아제 연쇄 반응법) (Landegren등, 1988, Science, 241, 1077), RCR법(복구사슬 반응법) (Segev, 1992, Kessler C. Springer Verlag, Berlin, New York, 197-205), CPR법(사이클링 프로브 반응법) (Duck, 1990, Biotechniques, 9, 142) 및 Q-베타-복제효소 증폭법 (Miele 등, 1983, J. Mol. Biol., 171, 281)이 있다. 이중 일부 방법들은 개량되었다.
검출할 표적 폴리펩티드가 mRNA인 경우, 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 증폭 반응을 수행하기 전 또는 본 발명의 프로브를 이용한 검출법을 수행하기 전에, 생물학적 샘플에서 얻은 mRNA로부터 cDNA를 얻기 위해 역전사 효소 타입의 효소를 사용하는 것이 유리하다. 얻은 cDNA는 본 발명에 따른 검출 방법 또는 증폭방법에서 프라이머나 프로브의 타겟으로 사용될 것이다.
다양한 방식으로 프로브 하이브리드화 기술을 수행할 수 있다 (Matthews et al., 1988, Anal. Biochem., 169, 1-25). 가장 일반적인 방법은, 세포나 다양한 조직 또는 배양 세포에서 추출한 핵산을 니트로셀룰로스, 나일론 또는 폴리스티렌과 같은 지지체에 고정시키고, 소정의 조건에서, 고정된 표적 핵산과 프로브를 항온 배양하는 것이다. 하이브리드 시킨 후, 과량의 프로브를 제거하고, 생성된 하이브리드 분자를 방사능 측정, 형광 측정 또는 프로브-연관 효소능 측정과 같은 적절한 방법을 사용해 검출한다.
본 발명에 따른 핵산 프로브에 관한 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 후자는 포획 프로브로 사용될 수 있다. 이 경우, "포획 프로브"로 명명되는 프로브는 지지체에 고정되어 생물학적 시험 샘플에서 특이적 하이브리드화 반응으로 얻은 표적 핵산을 포획하는데 사용된 후, 용이하게 검출될 수 있는 원소로 표지된 "검출 프로브"로 명명되는 다른 프로브에 의해 검출된다.
유리한 핵산 단편 중에서는, 특히 안티센스 올리고누클레오티드, 즉, 구조상 표적 서열과 하이브리드하여 이에 상응하는 물질의 발현을 억제하는 올리고누클레오티드를 들 수 있다. 또 하나는 센스 올리고누클레오티드를 들 수 있는데, 이 올리고누클레오티드는 그 상응하는 물질의 발현 조절에 관여하는 단백질과 상호 작용하여 발현을 억제시키거나 활성시킨다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 프로브 또는 프라이머는 공유 결합 또는 비공유 결합 형식으로 지지체에 고정된다. 보다 상세하게, 이 지지체는 DNA 칩이거나 고밀도 필터 또는 중밀도 필터일 수 있고, 역시 본 발명의 대상이다(특허 WO 97/29212, WO 98/27317, WO 97/10365 및 WO 92/10588).
"DNA칩" 또는 "고밀도 필터"라는 용어는, DNA 서열이 부착된 지지체를 의미하는데 각 서열을 그 지리적 위치에 따라 정확히 나타낼 수 있다. 이 칩 또는 필터는 주로 크기, 지지체 물질에 따라 구별되고, 경우에 따라서는, 부착되는 DNA 서열에 따라 구별된다.
본 발명에 따른 프로브 또는 프라이머는 다양한 제조 방법을 사용하여 고형 지지체, 특히, DNA 칩에 부착시킬 수 있다. 보다 상세하게, 광화학 어드레싱 또는 잉크젯으로in situ합성을 할 수 있다. 다른 방법으로는 기계적 또는 전자적 어드레싱 또는 잉크젯으로ex situ합성을 하여 프로브를 DNA 칩 지지체에 고정시키는 방법이 있다.
따라서 본 발명에 따른 누클레오티드 서열(프로브 또는 프라이머)은 특정 핵산 서열의 검출 및/또는 증폭을 가능하게 한다. 보다 상세하게, 프로브가 DNA 칩이나 고밀도 필터에 부착하면 이러한 서열들을 검출하는 것이 용이해진다.
DNA 칩 또는 고밀도 필터를 사용하면 사실 포토랍두스 루미네센스와 가까운 게놈 서열을 갖는 유기체에서 유전자의 발현을 결정하고 문제의 균주를 타이핑할 수 있다.
이 유기체들의 유전자를 확인하여 보완된, 본 발명에서 제시하는 바와 같은포토랍두스 루미네센스 게놈 서열은, 이러한 DNA 칩 또는 필터를 구성하는 기초가 된다.
이러한 필터 또는 칩의 제조는, 적합한 길이의 단편, 예컨대 약 300 내지 800 염기 길이의 단편을 증폭하기 위해, 유전자의 5' 및 3' 말단에 상응하거나 보다 내부의 단편에 상응하는 올리고누클레오티드를 합성하는 단계로 이루어진다. 이 올리고누클레오티드는 본 발명에서 개시하는 게놈 서열과 그 주석을 이용하여 선택한다. DNA상의 대응 위치에서 이 올리고누클레오티드를 짝짓기 위한 온도는 각 올리고누클레오티드에 대해 대략 동일하여야 한다. 이로써 고 자동화 환경에서 적합한 PCR 조건을 사용하여 각 유전자에 상응하는 DNA 단편을 제조하는 것이 가능하다. 증폭된 단편은 그 다음에 유리, 실리콘 또는 합성 고분자로 만들어진 필터 또는 지지체에 고정되고 이 배지들은 하이브리드화에 사용된다.
상기 필터 및/또는 칩과 그 상응하는 주석 게놈 서열을 이용하면, 상보적 DNA를 만든 후 이를 필터 또는 칩에 고정된 DNA나 올리고누클레오티드에 하이브리드시킴으로써, 포토랍두스 루미네센스, 특히 포토랍두스 루미네센스 TT01 유전자의 상당 부분, 심지어는 전체 유전자의 발현을 연구하는 것이 가능하다. 마찬가지로, 이 필터 및/또는 칩을 이용하면 연구하고자 하는 균주 또는 종들의 DNA를 만들어 이를 필터 또는 칩에 고정된 DNA 또는 올리고누클레오티드에 하이브리드시킴으로써 균주 또는 종의 다양성(variability)을 연구할 수 있다.
다양한 균주 게놈 또는 종 게놈 서열간의 차이는 하이브리드화의 강도에 크게 영향 미칠 수 있고 따라서 결과 해석을 방해할 수 있다. 따라서, 연구 대상이되는 균주의 정확한 유전자 서열을 확보하는 것이 필수적일 것이다. 게놈의 랜덤 단편 서열을 결정하고 이를 포토랍두스 루미네센스, 특히 포토랍두스 루미네센스 TT01 게놈 서열에 따라 정돈하는 것을 포함하는 - 이에 관하여는 후술한다 - 본 발명에 개시된 유전자 검출 방법이 매우 유용할 것이다.
본 발명에 따른 누클레오티드 서열은 돌연변이 분석을 위해 DNA 칩에 사용될 수 있다. 이 분석은 본 발명에 따른 누클레오티드 서열의 각 염기를 분석할 수 있는 칩을 구성하는 것을 기초로한다. 이를 위해, 특히, DNA 칩에 마이크로시퀀싱하는 기술을 이용할 수 있다. 분석되는 서열의 매트릭스와 하이브리드화하는 고정된 프라이머를 연장시키면, 찾고자 하는 돌연변이 누클레오티드 위치의 바로 인접 위치에서 돌연변이가 검출된다. 분석하는 서열의 단일 가닥 RNA 또는 DNA 매트릭스는, PCR형 기술에 따라 증폭된 물질을 이용하는 종래 방법에 따라 제조하는 것이 유리할 것이다. 이렇게 하여 얻은 단일 가닥 DNA 또는 RNA 매트릭스는, 고정된 프라이머에 특이적으로 하이브리드될 수 있는 조건에서 DNA 칩에 담겨진다.
예를 들어 Tth 또는 Taq DNA 폴리머라제와 같은 열 안정성 폴리머라제는, 변이가능한 위치에 있는 누클레오티드에 상보적인 표지된 누클레오티드 유사체를 가지고 고정된 프라이머의 3' 말단을 연장시킨다; 열 순환은 예컨대 형광성 디데옥시리보누늘레오티드 존재 하에 수행된다. 사용하는 칩, 고정 프라이머, 사용하는 폴리머라제 및 선택한 표지화 시스템에 따라 실험 조건이 조정될 것이다. 프로브 하이브리드화에 기초하는 기술과 비교하여 마이크로시퀀싱의 한가지 잇점은 균일한 반응 조건에서 돌연변이 가능한 누클레오티드를 최적의 식별력으로 확인할 수 있다는 것이다. DNA 칩에 사용되면, 흔하고 산업적인 멀티플렉스 변이 검출을 최적의 해상도와 특이성으로 수행할 수 있다.
DNA 칩과 필터는 미생물 결정, 검출 및/또는 확인에 매우 유리한 수단이 될 수 있다. 따라서, DNA 칩에 고정된, 하나 이상의 포토랍두스 루미네센스 이외의 미생물의 누클레오티드 서열을 포함하는 본 발명에 따른 DNA 칩 역시 바람직하다. 미생물은 포토랍두스 속(이하, 포토랍두스 루미네센스-관련 박테리아라 함) 또는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 변종 박테리아로부터 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 DNA 칩 또는 필터는 미생물, 특히 포토랍두스 루미네센스 종에 속하는 박테리아를 검출하는 키트 또는 세트에 매우 유용한 구성 요소인데, 이 키트 또는 세트도 본 발명의 대상이다.
더욱이, 포토랍두스 루미네센스에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 함유하는 본 발명에 따른 DNA 칩 또는 필터는 포토랍두스 루미네센스 유전자의 발현을 검출 및/또는 정량하는 키트 또는 세트에 매우 유용한 구성 요소이다.
구체적으로, 하나 이상의 새로운 유전자가 발현되도록 하거나 이미 세포내 존재하는 유전자의 발현을 조정하는 식의 유전자 발현의 조절은, 균주의 성장과 수확을 최적화 하는데 중요하다. 본 발명은 포토랍두스 루미네센스에서 천연적으로 활성을 갖고 유전자 발현을 허용하는 모든 서열들을 제공한다. 따라서, 포토랍두스 루미네센스에서 발현되는 모든 서열들을 결정하는 것이 가능하다. 이를 위해, 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 포토랍두스 루미네센스 유전자의 일부 또는 전체의 DNA를 증폭한 다음 예컨대 유리 또는 나일론 또는 DNA 칩과 같은 지지체에부착할 수 있고, 이로써 이 유전자들의 발현 프로필을 추적하는 수단을 구성할 수 있다. 코딩 서열을 함유하는 지지체로 구성된 이 수단은, 세포에서 발현된 mRNA를 반영하는 표지된 분자 혼합물 (특히 본 발명에 따른 표지된 프로브)에 대해 하이브리드화 매트릭스로서 제공된다. 다양한 시점에서 이 실험을 반복하고 적절한 처리로 모든 데이타를 통합함으로써, 이 모든 유전자의 발현 프로필을 얻는다. 소정의 조절 도식을 따르는 서열에 대해 알게 되면, 예컨대 상동성과 같은 직접적인 방식으로, 전체적으로 그러나 약간 다른 방식으로 동일한 조절 도식을 따르는 다른 서열을 찾는데 이용할 수 있다. 또한, 프로브로 작용하는, 서열의 상단 부분에 존재하는 각 조절 서열을 분리하고 리포터 유전자(루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, GFP)와 같은 적절한 수단을 사용해 그 활성을 추적하는 것이 가능하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 누클레오티드 서열, 바람직하게는 ORF 서열에 상응하는 이 서열의 대표적인 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 보다 상세하게, 포토랍두스 루미네센스 TT01의 서열 42 내지 서열 3855의 폴리펩티드 또는 서열 5835 내지 서열 10784에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 본 발명의 대상이다.
본 발명은 또한 하기로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 포함한다:
a) 서열 42 내지 서열 3855의 폴리펩티드 또는 서열 5835 내지 서열 10784에 의해 코딩되는 폴리펩티드;
b) 본 발명에 따른 폴리펩티드와 80%, 85%, 90%, 95% 및 98% 동일성을 보이는 폴리펩티드 서열;
c) a)에서 정의한 폴리펩티드의 아미노산 5개 이상의 단편;
d) a)에서 정의한 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편;
e) a), b), c) 또는 d)에서 정의한 폴리펩티드를 변형시킨 폴리펩티드;
상기 폴리펩티드를 코딩하는 누클레오티드 서열도 본 발명의 대상이다.
본 발명의 설명에서, "폴리펩티드", "폴리펩티드 서열", "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 상호 호환 가능하다. "폴리펩티드"라는 용어는 항체 반응을 발생할 수 있는 아미노산 서열을 모두 포함한다.
본 발명은 천연형의 폴리펩티드에 관한 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 그 천연상태의 환경으로부터 선택되지 않는다. 반면, 본 발명은 천연원료로부터 정제하여 분리하거나 얻는 것이 가능한 폴리펩티드, 또는 유전자 재조합 또는 화학 합성으로 얻은 폴리펩티드에 관한 것이고, 따라서 후술되는 비천연 아미노산을 포함할 수 있다.
"다른 폴리펩티드와 어떤 동일률을 보이는 폴리펩티드"라는 표현은, "상동성 폴리펩티드"라는 말로도 사용되는데, 천연 폴리펩티드와 비교하여 어떤 변형, 특히 하나 이상의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환, 절단, 연장, 키메라 용액 및/또는 변이를 보이는 폴리펩티드, 또는 후-해독 변형을 보이는 폴리펩티드를 나타내는 것으로 한다. 상동성 폴리펩티드 중에서는, 그 아미노산 서열이 본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열과, 최적 정렬 후에, 80% 이상, 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 보이는 폴리펩티드가 바람직하다. 치환의 경우, 하나 이상의 보존 또는 비보존 아미노산(들)이 "균등" 아미노산으로 대치될 수 있다.
"균등 아미노산"이란 용어는, 후술되는 바와 같이, 그 상응하는 펩티드의 생물학적 활성이 실질적으로 변형되지 않으면서 기본 구조의 아미노산 하나가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산은 모두 의미하는 것으로 한다.
균등 아미노산은 이들이 치환하는 아미노산과의 구조 상동성에 근거하거나, 또는 생성될 수 있는 다양한 폴리펩티드간의 생물학적 활성 비교 분석 결과에 근거하여 결정될 수 있다.
예를 들어, 대응되는 변형된 폴리펩티드의 생물학적 활성이 심하게 변형되는 결과를 가져오지 않으면서도 발생할 수 있는 치환 가능성을 들 수 있다. 따라서, 류신을 발린이나 이소류신으로, 아스파르트산을 글루탐산으로, 글루타민을 아스파라긴으로, 아르기긴을 리신으로 치환하는 것이 가능하며 또한 동일한 조건에서 그 역으로의 치환도 생각할 수 있다.
상동성 폴리펩티드는 또한, 본 발명의 누클레오티드 서열과 특정 동일률을 보이거나 앞서 정의한 바와 같이 동일한 누클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 말하고, 따라서, 본 정의에서, 돌연변이된 폴리펩티드 또는 포토랍두스 속에 존재하는, 특히, 아미노산 잔기 하나 이상의 절단, 치환, 결실 및/또는 부가에 해당하는 종간 또는 종내 변이에 상응하는 폴리펩티드를 포함한다.
두 폴리펩티드간의 동일률은 두 핵산 서열간의 동일률 계산과 같다. 따라서, 두 폴리펩티드간의 동일률은 이 두 서열을 최대 상동성 창에 최적으로 정렬시킨 후 계산한다. 상기 최대 상동성 창을 정의하기 위해, 핵산 서열에서와 동일한 알고리즘이 사용될 수 있다.
"본 발명에 따른 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편"이란 표현은 후술하는 바와 같이, 특히, 일반적으로 예컨대 다음과 같이 부분 활성이라도 발휘할 수 있다는 점에서, 특히 본 발명에 따른 폴리펩티드의 하기 생물학적 특성 중 하나 이상을 나타내는 폴리펩티드를 나타내는 것으로 한다:
- 효소(대사) 활성 또는 유기 또는 무기 화합물의 생합성 또는 생분해에 관련된 활성, 바람직하게는 톡신 또는 항생물질 활성, 특히 곤충이나 미생물(박테리아 또는 진균)에 대한 항생물질 활성, 다르게는, 이 톡신 또는 항생제의 생합성에 관련된 활성; 효소 활성을 갖는 단백질은 이 활성을 변형시킬 수 있는, 특히 억제할 수 있는 화합물을 스크리닝하고/하거나 선택하는 방법에 특히 사용될 수 있다;
- 구조 활성(세포 엔벨롭, 샤프롱 분자, 리보좀). 특히 막외 단백질에 해당하는 단백질은, 특히 이 막외 단백질에 대해 특이성을 갖는 단일클론 항체 또는 다클론 항체를 생산하는 이뮤노겐으로 특히 사용될 수 있다;
- 운반 활성(에너지 운반, 이온 운반); 또는 단백질 분비에서의 활성;
- 특히, DNA, RNA 또는 단백질의 복제, 증폭, 제조, 전사, 해독 또는 성숙분열 과정에서의 활성.
"본 발명에 따른 폴리펩티드 단편"이란 표현은, 5개 이상의 아미노산, 바람직하기로는 10, 15, 25, 50, 100 및 150개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 나타내는 것으로 한다.
이 폴리펩티드 단편은, 포토랍두스 균주에 천연적으로 존재하는 분리 또는 정제된 단편에 상응하거나, 이 폴리펩티드를 트립신 또는 키모트립신 또는 콜라게나제와 같은 단백질 분해 효소로 절단하거나 화학 시약(시아노겐 브롬, CNBr)으로 절단하거나 또는 이 폴리펩티드를 상당히 산성인 환경(예, pH = 2.5)에 두어 얻을 수 있는 단편에 상응한다. 이 폴리펩티드 단편은, 이 단편이 발현되도록 할 뿐 아니라 적합한 조절 및/또는 발현 요소에 의해 제어되는 핵산을 함유하는 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질 전환된 숙주에서 화학 합성하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 "변형 폴리펩티드"라는 용어는 유전자 재조합이나 후술하는 바와 같은 화학 합성으로 얻은 폴리펩티드를 나타내고, 이는 정상 서열과 비교하여 하나 이상의 변형, 바람직하기로는 정상 서열과 비교하여 10% 이하의 아미노산 변형을 보인다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 활성 특이성 또는 활성 효율성에 필수적인 아미노산 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 구조 변형이나 전하 또는 소수성을 담당하는 아미노산에 특히 이 변형이 생길 수 있다. 따라서, 활성이 동등하거나 증가되거나 감소된 폴리펩티드, 또는 특이성이 동등하거나 더 엄격하거나 더 포괄적인 폴리펩티드를 만드는 것이 가능하다. 변형 폴리펩티드 중에서, 5개 이하의 아미노산이 변형될 수 있거나 N- 또는 C-말단이 절단되거나 아니면 결실 또는 부가된 폴리펩티드가 언급된다.
설명한 바와 같이, 폴리펩티드 변형의 목적은 특히 다음과 같다:
- 유기 또는 무기 화합물의 생합성이나 생분해 방법에 사용하거나, 톡신 또는 항생물질 합성 방법에 사용될 수 있도록 하는 목적,
- 특히 DNA, RNA 또는 단백질의 복제, 증폭, 전사 조절 및 복구, 해독 또는 성숙 방법에 사용될 수 있도록 하는 목적,
- 용해도 또는 활성의 효율성이나 특이성을 변형시키거나, 다르게는 정제를 용이하게 하기 위한 목적.
화학 합성 방법은 비천연 아미노산 또는 비펩티드 결합을 이용할 수 있다는 잇점도 있다. 따라서, 비천연 아미노산, 예컨대 D형의 아미노산, 또는 아미노산 유사체, 특히 황-함유형 아미노산을 이용하는 것이 유리할 수 있다
본 발명은 또한 WO 99/54472, WO 99/42589, WO 99/03328, WO 98/08932 및 EP 0 823 215에 개시된 핵산 또는 펩티드 서열을 제외한, 본 발명에 따른 핵산 또는 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 41 콘티그 또는 9 콘티그 형태의 포토랍두스 루미네센스 TT01의 누클레오티드 서열 및 어떤 폴리펩티드 서열을 제공한다.
하기의 핵산 또는 펩티드 서열은, 그 기능으로 특징되는데, [표 1]과 관련하여 그 누클레오티드 및 아미노산 서열로 확인될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 톡신 및/또는 항생물질형 활성을 갖는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 이 톡신 및/또는 항생물질 합성에 관계하는 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 아미노산 생합성에 관련된 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 조인자, 배합군(prosthetic group) 및 트랜스포터의 생합성에 관련된 포토랍두스 루미네센스 TT01 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 세포 엔벨롭 폴리펩티드 또는 포토랍두스 루미네센스 TT01 표면에 존재하는 폴리펩티드 또는 이들 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 세포 작용에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 중심 중간 대사(central intermediate metabolism)에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 에너지 대사에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 지방산 대사 및 인산 대사에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 누클레오티드, 퓨린, 피리미딘 또는 누클레오시드대사에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 조절 기능에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 복제 과정에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 전사 과정에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 해독 과정에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 단백질 수송 및 결합에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 비전형적인 환경에 적응하는 것에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 의약물질 및 그 유사체에 대한 감수성에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 트랜스포손 기능에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 포토랍두스 루미네센스 TT01에 특이성을 갖는 폴리펩티드 또는 그 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 관한 것이다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 톡신 및/또는 항생물질형 활성을 갖거나 이 톡신 및/또는 항생물질 합성에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 아미노산 생합성에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 조인자, 배합군 및 트랜스포터의 생합성에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 세포 엔벨롭 폴리펩티드 또는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 표면 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 세포 작용에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 중심 중간 대사에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 에너지 대사에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 지방산 또는 인산 대사에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 누클레오티드, 퓨린, 피리미딘 또는 누클레오시드 대사에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 조절 기능에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 복제 과정에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 전사 과정에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 해독 과정에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 단백질 수송 및 결합에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 비전형 환경에로의 적응에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 의약물질 및 그 유사체에 대한 감수성에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 트랜스포손에 관한 기능에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 TT01의 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
다른 면에서, 본 발명의 대상은 포토랍두스 루미네센스 TT01에 특이적인 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 톡신 및 /또는 항생물질의 합성에 관계하는 오페론에 관한 것이다.
[표 1]은 본 발명에 따른 특정 폴리펩티드 목록, 서열 1 내지 서열 41로 표현된 콘티그에서의 위치, 그리고 데이타 베이스에서 비교한 후 관찰한 유사성을 보여준다.
[표 2]는 본 발명에 따른 특정 폴리펩티드 목록, 서열 5826 내지 서열 5834로 표현된 콘티그에서의 위치, 그리고 데이타 베이스에서 비교한 후 관찰한 유사성을 보여준다. [표 2]에서, 콘티그 1 내지 9는 서열 5826 내지 서열 5834에 의해 확인된다.
완전히 바람직하게, 본 발명의 대상은, [표 1]의 마지막 칼럼과 [표 2]의 끝에서 두 번째 칼럼에 주석된, 그 기능이 톡신 및/또는 항생물질형 활성에 상응하는 폴리펩티드 또는 이 톡신 및/또는 항생물질의 합성에 관계하는 폴리펩티드에 관한 것으로, 이 폴리펩티드는 하기로부터 선택된다:
a) 서열 61, 서열 62, 서열 67, 서열 171, 서열 221, 서열 268, 서열 288, 서열 380, 서열 426, 서열 438, 서열 448, 서열 453, 서열 455, 서열 456, 서열 458, 서열 501, 서열 516, 서열 530, 서열 542, 서열 551, 서열 720,서열 761, 서열 762, 서열 814, 서열 859, 서열 860, 서열 861, 서열 862, 서열 869, 서열 1079, 서열 1168, 서열 1174, 서열 1176, 서열 1413, 서열 1414, 서열 1415, 서열 1416, 서열 1417, 서열 1457, 서열 1651, 서열 1856, 서열 1869, 서열 2021, 서열 2080, 서열 2152, 서열 2162, 서열 2173, 서열 2251, 서열 2295, 서열 2306, 서열 2317, 서열 2328, 서열 2340, 서열 2342, 서열 2351, 서열 2500, 서열 3228, 서열 3230, 서열 3311, 서열 3317, 서열 3318, 서열 3319, 서열 3320, 서열 3322, 서열 3323, 서열 3326, 서열 3327, 서열 3328, 서열 3375, 서열 3376, 서열 3377, 서열 3378, 서열 3422, 서열 3489, 서열 3503, 서열 3609, 서열 3623, 서열 3624, 서열 3772, 서열 3783, 서열 3788 및 서열 3794의 폴리펩티드; 또는
b) 서열 5835 내지 서열 10784에 의해 코딩되고 상기 a)에서 정의한 서열에 상동성이며 [표 2]의 마지막 칼럼에 기재된 폴리펩티드.
본 발명의 대상은, 서열의 판독, 분석 및/또는 개발을 촉진시키는 형식과 속성을 갖는 기록 매체에 기록된 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 누클레오티드 및/또는 폴리펩티드 서열에 관한 것이기도 하다. 이 기록 매체는, 본 발명으로부터 뽑아낸 다른 정보, 특히 이미 공지된 서열과의 유사성 정보, 및/또는 식물 세포, 동물 세포, 포토랍두스 루미네센스 이외의 미생물, 특히 포토랍두스 루미네센스, 포토랍두스 속 박테리아 또는 포토랍두스 루미네센스 변종이 생산한 톡신 또는 항생물질에 감수성을 갖는 세포 또는 미생물의 누클레오티드 및/또는 폴리펩티드 서열에 관한 정보를 포함할 수 있다.
이러한 기록 매체 중에서, 자기 매체, 광학 매체, 전기 또는 하이브리드 매체와 같은 컴퓨터-판독 매체, 특히 컴퓨터 디스크, CD-ROM 및 컴퓨터 서버가 특히 바람직하다. 이 기록 매체들도 본 발명의 대상이다.
본 발명에 따른 기록 매체는, 정보가 주어지면, 포토랍두스 루미네센스 TT01 또는 이 균주와 연관(또는 관련된) 균주에서 유전자를 결정하기 위한 누클레오티드 프라이머 또는 프로브를 선택하는데 매우 유용하다. 마찬가지로, 포토랍두스 루미네센스 TT01 연관 균주의 유전자 다형 연구, 특히 대응직선성 영역을 결정하는 것에 의한 연구에 이 기록 매체를 사용하면 이 기록 매체가 포토랍두스 루미네센스 TT01의 게놈 누클레오티드 서열을 제공할 뿐 아니라 이 서열내의 게놈 조직도 제공하는 한에 있어 매우 유용하다. 따라서, 본 발명에 따른 기록 매체의 용도 또한 본 발명의 대상이다.
다양한 서열간의 상동성 분석은 사실 전술한 바와 같은 서열 비교 프로그램, 예컨대 BLAST 프로그램이나 GCG 패키지 프로그램을 사용하여 수행하는 것이 유리하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 누클레오티드 서열을 함유하는 클로닝 및/또는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 벡터는 바람직하게는 주어진 숙주에서 누클레오티드 서열의 발현 및/또는 분비를 가능케하는 요소를 포함한다.
이 벡터는 프로모터, 해독 개시 및 종결 시그날, 그리고 전사 조절에 적합한 영역을 포함하여야 한다. 이 벡터는 숙주 세포내에서 안정하게 남아 있을 수 있어야 하고, 해독된 단백질의 분비를 명시하는 특정 시그날을 포함할 수 있다. 이러한 다양한 요소들은 당업자가 사용되는 세포 숙주의 함수로서 선택하고 최적화 한다. 이러한 목적으로, 본 발명에 따른 누클레오티드 서열을, 선택된 숙주에서 자동으로 복제하는 벡터에 삽입 할 수도 있고 선택된 숙주에서 통합하는 벡터에 삽입할 수도 있다.
당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 이 벡터들을 제조하고 그 결과 생성된 클론을 리포펙션, 일렉트로포레이션, 열 쇼크 또는 화학적 방법과 같은 표준 방법을 사용해 적절한 숙주로 도입시킬 수 있다.
본 발명에 따른 벡터의 예로는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터가 있다. 이 벡터는 숙주 세포를 형질 전환시켜 본 발명에 따른 누클레오티드 서열을 클로닝시키거나 발현시키는데 유용하다.
이 벡터들 중, 서열 3856 내지 서열 5825 및 서열 5835 내지 서열 10784 로부터 선택된 누클레오티드 서열 또는 포토랍두스 루미네센스 게놈에서 유래한 그 단편 서열을 포함하는, 특히, 톡신 또는 항생물질 활성을 갖거나 이 활성에 관계된 폴리펩티드, 특히 [표 1]에 주석된 기능이 이 활성에 상응하는 전술한 바 있는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 클로닝 및/또는 발현 벡터가 바람직하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 벡터로 형질 전환된 숙주 세포도 포함한다.
세포성 숙주는 박테리아 세포와 같은 원핵 또는 진핵 생물로부터 선택되고 효모 세포나 동물 세포, 특히 포유 동물 세포로부터도 선택된다. 곤충 세포와 식물 세포도 사용 가능하다. 본 발명에 따른 바람직한 숙주로는 특히 원핵 세포, 바람직하게는 포토랍두스 속 또는 포토랍두스 루미네센스 종 또는 보다 상세하게는 포토랍두스 루미네센스 TT01에 속하는 박테리아가 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 형질 전환된 세포를 포함하는 식물 및 인간을 제외한 동물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질 전환된 세포는 본 발명에 따른 재조합 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 벡터 또는 이 벡터로 형질 전환된 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 폴리펩티드 제조 방법 그 자체도 본 발명에 포함된다. 바람직하게, 본 발명에 따른 벡터로 형질 전환된 세포는 전술한 폴리펩티드가 발현 될 수 있는 조건에서 배양되고, 전술한 재조합 폴리펩티드를 회수한다.
지금까지 설명한 바와 같이, 세포성 숙주는 원핵 또는 단핵 생물로부터 선택될 수 있다. 특히, 이러한 원핵 또는 진핵 생물에서 분비를 촉진하는 본 발명에 따른 누클레오티드 서열을 확인할 수 있다. 따라서, 이런 서열을 운반하는 본 발명에 따른 벡터는, 분비하고자 하는 재조합 단백질 생산에 유리하게 사용할 수 있다. 그 결과, 재조합 단백질이 숙주 세포 내부보다는 세포 배양액 상청액에 존재한다는 사실에 의해, 관심 있는 재조합 단백질의 정제가 촉진될 것이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 화학 합성 방법으로 제조할 수도 있다. 이러한 제조 방법은 본 발명의 대상이다. 당업자는 이러한 화학 합성 방법을 숙지하고 있는데, 예를 들면 고상을 이용하는 방법 (Steward 등, 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., (1984)) 또는 반고상을 이용하는 방법, 단편 농축법 또는 통상적인 용액내 합성법이 있다.화학 합성으로 얻은 폴리펩티드 및, 가능하게는 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드도 본 발명의 대상이다.
본 발명에 따른 하이브리드 폴리펩티드는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 특이적으로 인식할 수 있는 단일클론 항체 또는 다클론 항체를 얻는데 매우 유용하다.
이런 특이적 단일클론 또는 다클론 항체는, 이 폴리펩티드(또는 이에 상응하는 핵산)를 이용하여 포유동물을 면역화 시킨 후에, 또는, 예컨대 통상적인 하이브리도마 배양법(Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256, 495)을 이용하여 당업자에게 잘 알려진 표준 방법으로 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 인식하는 이러한 단일클론 또는 다클론 항체, 그 단편 또는 그 키메릭 항체도 본 발명의 대상이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 항체의 예로는 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 Fab 또는 F(ab')2단편이 있다. 이 항체들은 검출 가능한/하거나 정량가능한 시그날을 얻기 위해 표지화된 면역컨쥬게이트 또는 항체 형태일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 항체는, 생물학적 샘플에서 포토랍두스 속 및/또는 포토랍두스 루미네센스 종에 속하는 박테리아를 검출하고/하거나 확인하는 방법에 사용할 수 있는데, 이 방법은 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
a) 생물학적 샘플과 본 발명에 따른 폴리펩티드 항체를 접촉시키는 단계;
b) 형성되었을 항원-항체 복합체를 증명하는 단계.
본 발명에 따른 항체는 포토랍두스 루미네센스 TT01 유전자 발현을 검출하는데 사용될 수도 있다. 구체적으로, 포토랍두스 루미네센스 TT01 균주를 본 발명에 따른 항체와 접촉시킨 후 형성된 항원-항체 복합체의 존재에 의해, 발현 물질에 특이적인 항체에 의해 인식되는 유전자 발현 생성물의 존재를 검출할 수 있다. 사용한 박테리아 균주는 "제조"되었을 수도 있는데, 즉, 면역반응에 적합한 배지를 구성하는 적합한 시약에서 원심분리되고, 용해되고/되거나 위치가 정해질 수 있다. 특히, 웨스턴 블랏팅에 해당하는 유전자 발현 검출법이 바람직한데, 이 방법은 박테리아 용해물을 환원 조건(SDS-PAGE)의 존재 또는 부존재하에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 후 수행한다. 단백질이 폴리아크릴아미드상에서 이동 및 분리된 후 적절한 막(예, 나일론으로 된 막)으로 이동한 후 이 막을 본 발명에 따른 항체와 접촉시킴으로써 관심 있는 단백질 또는 폴리펩티드의 존재 여부를 검출한다.
따라서, 본 발명은 전술된 방법(포토랍두스 루미네센스 TT01 유전자 발현 검출 방법 또는 포토랍두스 루미네센스 종에 속하는 박테리아 확인 방법)을 수행하는 키트 또는 세트를 포함하는데, 이 키트 또는 세트는 하기 구성 요소를 포함한다:
a) 본 발명에 따른 단일클론 또는 다클론 항체;
b) 필요한 경우, 면역반응에 적합한 배지를 구성하는 시약;
c) 필요한 경우, 면역반응으로 생성된 항원-항체 복합체를 증명하는 시약.
본 발명에 따른 폴리펩티드와 항체를 지지체, 특히, 단백질 칩에 고정시킬 수 있다. 이러한 단백질 칩은 본 발명의 대상이며 하나 이상의 포토랍두스 루미네센스 이외의 다른 미생물 또는 포토랍두스 루미네센스 이외의 미생물 화합물에 대한 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 단백질을 함유하는 단백질 칩 또는 고밀도 필터는, 본 발명에 따른 DNA 칩과 동일한 방법으로 구성할 수 있다. 실제로, 단백질 칩에 직접 부착된 폴리펩티드를 합성할 수 있고, 합성된 폴리펩티드를 상기 칩에 부착한 다음ex situ합성을 실시할 수도 있다. 유전자 조작에 의해 유리하게 제조되는 상당한 크기의 단백질을 지지체에 부착하는 것이 목적인 경우에는 후자의 방법이 바람직하다. 그러나, 목적이 펩티드를 상기 칩 지지체에 부착하는 것이라면 이 펩티드를in situ에서 직접 합성하는 것이 유리하다.
본 발명에 따른 단백질 칩은 포토랍두스 루미네센스 종 연관 박테리아 또는 미생물을 검출 및/또는 확인하는 키트 또는 세트에 유리하게 사용될 수 있고, 보다 일반적으로는, 미생물 검출 및/또는 확인하는 키트에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드가 DNA 칩에 부착되면, 이 단백질 칩 지지체에 부착된 본 발명에 따른 항체가 이 항체에 특이적인 단백질의 확인을 가능하게 하므로 시험 샘플에 있는 항체의 존재를 찾게된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체가 단백질 칩 지지체에 부착되고 포토랍두스 루미네센스에 특이적인 상응하는 항원의 존재가 검출된다.
본 발명에 따른 DNA 칩 외에, 본 발명에 따른 단백질 칩도 전술한 유전자의 발현 프로필을 확립하기 위해 유전자 생성물 검출에 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 단백질 칩은 또한 식물 세포, 곤충 등의 동물 세포 또는 포토랍두스 루미네센스 이외의 미생물의 다양한 단백질간의 상호작용을 연구하는 단백질체학 실험에 대단히 유용하다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 단백질 칩을 포함하는데, 이 칩은 포토랍두스 루미네센스가 생산한 톡신 또는 항생물질에 감수성을 갖는 세포 또는 미생물로부터 선택된 식물 세포, 동물 세포 또는 포토랍두스 루미네센스 이외의 미생물의 폴리펩티드로서 상기 칩에 고정된 폴리펩티드를 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 한다.
단순한 방식으로 다양한 생물체 단백질의 대표적인 펩티드가 지지체에 고정된다. 그 다음 이 지지체는 표지된 단백질과 접촉하고, 필요에 경우, 세척 단계를 거친 후에, 이 표지 단백질과 단백질 칩에 부착된 펩티드간의 상호 작용이 검출된다.
따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드 서열 또는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 단백질 칩은, 이들을 포함하는 키트 또는 세트와 마찬가지로 본 발명의 대상이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 누클레오티드 서열을 이용하여 생물학적 샘플에서 포토랍두스 루미네센스 종에 속하는 박테리아를 검출 및/또는 확인하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 "생물학적 샘플"이라는 용어는 살아있는 조직(특히, 포유동물에서 취한 혈액, 조직, 기관 등)에서 취한 샘플 또는 생물학적 물질, 즉, DNA 또는 RNA를 포함하는 샘플에 관한 것으로 이해되어야 한다. 이러한 생물학적 샘플은 또한 박테리아를 함유한 식품 조성물(예, 치즈, 유제품), 효모 함유 식품 조성물(맥주, 빵) 등을 포함한다. "생물학적 샘플"이라는 용어는 이러한 샘플들이나 식품조성물에서 분리된 박테리아도 포함한다.
본 발명에 따른 누클레오티드 서열을 사용한 검출 및/또는 확인 방법은 그 속성상 다양할 수 있다.
바람직하게는, 다음 단계를 포함하는 방법이 있다:
a) 필요에 경우, 분석 샘플로부터 DNA를 분리하거나 이 샘플의 RNA로부터 cDNA를 얻는 단계;
b) 본 발명에 따른 프라이머를 하나 이상 사용하여 포토랍두스 루미네센스 속에 속하는 박테리아의 DNA를 특이적으로 증폭하는 단계;
c) 증폭 생성물을 증명하는 단계
이 방법은 특히 연쇄 증폭 반응을 통해 DNA를 특이적으로 증폭시키는데 기초한다.
바람직하게는, 다음 단계를 포함하는 방법도 있다:
a) 본 발명에 따른 누클레오티드 프로브를 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계로, 이 생물학적 샘플에 함유된 핵산은, 적합한 경우, 포토랍두스 루미네센스 종에 속하는 박테리아 핵산에 프로브가 하이브리드될 수 있는 조건에서 미리 하이브리드되기 용이하게 만들어져 있다;
b) 생물학적 샘플의 DNA와 누클레오티드 프로브간에 형성되었을 하이브리드를 증명하는 단계
이러한 방법은 생물학적 시험 샘플에 있는 DNA 존재를 검출하는 것으로만 제한되어서는 안되고, 이 샘플에 있는 RNA 검출에도 사용될 수 있다. 이런 방법으로는 특히 서던 블랏팅과 노던 블랏팅이 있다.
본 발명에 따른 다른 바람직한 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 본 발명에 따른 지지체에 고정된 누클레오티드 프로브를 생물학적 샘플에 접촉시키는 단계로, 이 생물학적 샘플에 함유된 핵산은, 적합한 경우, 포토랍두스 루미네센스 종에 속하는 박테리아 핵산에 프로브가 하이브리드될 수 있는 조건에서 미리 하이브리드되기 용이하게 만들어져 있다;
b) 지지체에 고정된 누클레오티드 프로브와 생물학적 샘플에 있는 핵산 사이에 형성된 하이브리드와 본 발명에 따른 표지된 누클레오티드 프로브를, 적합한 경우, 프로브와 하이브리드를 형성하지 않은 샘플내 DNA를 제거한 후에, 접촉시키는 단계;
c) b) 단계에서 형성된 신규 하이브리드를 증명하는 단계
이 방법은, 본 발명에 따른 DNA 칩을 사용하고, 이 칩 표면에 존재하는 프로브와 하이브리드하는 핵산을 찾은 다음, 표지된 프로브로 검출하는 것이 좋다. 이 방법은 DNA, 또는, 필요한 경우 역전사하여 얻은 상보적 DNA를 본 발명에 따른 프라이머로 증폭시키는 전단계와 결합하여 실시하는 것이 유리하다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 요소를 함유하는 것을 특징으로 하는 포토랍두스 루미네센스 종에 속하는 박테리아를 검출 및/또는 확인하기 위한 키트 또는 세트를 포함한다:
a) 본 발명에 따른 누클레오티드;
b) 필요한 경우, 하이브리드화 반응 수행에 필요한 시약;
c) 필요한 경우, 본 발명에 따른 프라이머 하나 이상 및 DNA 증폭 반응에 필요한 시약
유사하게, 본 발명은 하기 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 포토랍두스 루미네센스 TT01 종에 속하는 박테리아를 검출 및/또는 확인하기 위한 키트 또는 세트를 포함한다:
a) 포획 프로브로 명명되는 본 발명에 따른 누클레오티드 프로브;
b) 검출 프로브로 명명되는 본 발명에 따른 올리고누클레오티드 프로브;
c) 필요한 경우, 본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 및 DNA 증폭 반응에 필요한 시약
마지막으로, 하기 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 포토랍두스 루미네센스 종에 속하는 박테리아를 검출 및/또는 확인하기 위한 키트 또는 세트도 본 발명의 대상이다:
a) 본 발명에 따른 하나 이상의 프라이머 또는 프로브;
b) 필요한 경우, DNA 증폭 반응 수행에 필요한 시약;
c) 필요한 경우, 증폭된 단편 서열을 검정하는 성분, 보다 상세하게는 본 발명에 따른 올리고누클레오티드 프로브
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법 및/또는 키트 또는 세트에 사용되는 본 발명에 따른 상기 프라이머 및/또는 프로브 및/또는 폴리펩티드 및/또는 항체는, 포토랍두스 루미네센스 종에 특이적인 프라이머 및/또는 프로브 및/또는 폴리펩티드 및/또는 항체로부터 선택된다. 바람직하게는, 이러한 요소들은, 분비된 단백질을 코딩하는 누클레오티드 서열, 분비된 폴리펩티드 또는 포토랍두스 루미네센스의 분비 폴리펩티드에 대한 항체로부터 선택된다.
또한 본 발명은, 본 발명에 따른 누클레오티드 서열내, 특히, ORF 서열 또는 그 조절 인자(특히 프로모터)내에 하나 이상의 돌연변이(들)를 갖는 포토랍두스 루미네센스 TT01 균주를 대상으로 한다.
본 발명에 따라, 특히 톡신 또는 항생물질형 활성을 갖거나 그 생합성에 관계하거나, 또는, 다른 측면에서, 세포 작용에 관계하는, 특히 분비, 중심 중간 대사, 에너지 대사, 아미노산 합성 과정, 전사 과정, 해독 과정 및 폴리펩티드 합성 과정에 관계하는 폴리펩티드를 코딩하는 누클레오티드 서열내에, 하나 이상의 돌연변이를 보이는 포토랍두스 루미네센스 균주가 바람직하다.
상기 돌연변이는, 특히 이 변이가 유전자의 조절 요소에 위치하는 경우에, 유전자 불활성화나 과활성을 초래할 수 있다.
본 발명에 따라, 하나 이상의 돌연변이(들)를 보이는 포토랍두스 루미네센스 TT01은 포토랍두스 루미네센스의 야생형 유전자의 기능을 검정하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 예컨대 포토랍두스 루미네센스가 생산하는 하나 이상의 톡신 또는 항생물질에 대한 저항성이나 감수성을 변형시킬 필요가 있는, 하나 이상의 식물 또는 동물 세포 또는 포토랍두스 루미네센스 이외의 미생물에서 유전자 발현을 조정, 조절, 유도 또는 억제할 수 있는 유기 또는 무기 화합물을 선택하는데 사용되는, 본 발명에 따른 누클레오티드 서열의 용도, 본 발명에 따른 폴리펩티드의용도, 본 발명에 따른 항체의 용도 및/또는 본 발명에 따른 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 그 단편에 결합할 수 있는 화합물, 본 발명에 따른 누클레오티드 서열에 결합 할 수 있는 화합물 또는 본 발명에 따른 항체를 인식할 수 있는 화합물, 및/또는 유전자 발현을 조정, 조절, 유도 또는 억제할 수 있는 화합물, 및/또는 원핵 또는 진핵 세포의 성장이나 세포 증식을 변형시킬 수 있는 화합물, 또는 동물이나 식물에서 포토랍두스 루미네센스가 생산한 하나 이상의 톡신 또는 항생물질에 대한 저항성 또는 감수성을 유도, 억제 또는 증가시킬 수 있는 화합물을 선택하는 방법을 포함하는데, 이 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
a) 상기 화합물을 상기 폴리펩티드 또는 누클레오티드 서열 및/또는 본 발명에 따른 형질전환 세포와 접촉시키는 단계;
b) 상기 화합물의 상기 폴리펩티드 또는 누클레오티드 서열에 결합하는 능력, 유전자 발현을 조정, 조절, 유도 또는 억제하는 능력, 또는 세포의 성장 또는 증식을 조정하는 능력, 동물이나 식물에서 포토랍두스 루미네센스가 생산한 하나 이상의 톡신 또는 항생물질에 대한 저항성 또는 감수성을 유도, 억제 또는 증가시키는 능력을 결정하는 단계.
본 발명에 따른 형질 전환 세포는 포토랍두스 루미네센스가 생산하는 하나 이상의 톡신 또는 항생물질에 대한 저항성 또는 감수성을 담당할 수 있을 화합물을 연구, 확인 및/또는 선택하는 방법에 모델로서 사용될 수 있다. 선택 가능한 화합물로는 폴리펩티드 또는 탄수화물과 같은 유기 화합물이 있을 수 있고, 또는, 공지의 다른 유기 또는 무기 화합물이거나 당업자에게 공지된 분자 모델 기술에 의해 개발되고 화학 또는 생화학 합성에 의해 얻은 신규 유기 화합물이 있을 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 방법을 이용하여 선택할 수 있는 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기 화합물 중에서 선택된 화합물을, 필요한 경우, 약제학적 담체와 함께 포함하는, 특히, 살충성 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다:
a) 본 발명에 따른 누클레오티드 서열;
b) 본 발명에 따른 폴리펩티드;
c) 본 발명에 따른 벡터;
d) 본 발명에 따른 항체;
e) 본 발명에 따른 선택 방법을 이용하여 선택할 수 있는 화합물.
본 발명은 또한 포토랍두스 루미네센스가 생산한 하나 이상의 톡신 또는 항생물질에 감수성을 갖는 박테리아나 진균 같은 미생물 감염을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 포토랍두스 루미네센스가 생산한 하나 이상의 톡신 또는 항생물질에 감수성을 갖는 곤충 등의 동물 또는 박테리아나 진균 같은 미생물이 들끓는 식물을 예방 또는 치료하기 위한, 본 발명에 따른, 특히, 곤충, 박테리아 및/또는 진균에 대한 살충 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 포토랍두스 루미네센스가 생산한 하나 이상의 톡신 또는 항생물질을 제조하기 위해 사용되는 본 발명에 따른 형질 전환 세포의 용도에 관한 것이다.
"약제학적으로 허용되는 담체"라는 표현은 부작용을 유발하지 않으면서 약제학적 조성물을 구성하는 화합물 또는 화합물의 집합을 나타내는 것으로 이들은 예컨대 활성 화합물의 투여를 수월하게 하거나 유기체 내에서의 지속시간 및/또는 약효를 증가시키거나 액체에 대한 용해도를 증가시키거나 그 보존성을 개선시킨다. 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 공지이고, 선택된 활성 물질 성질과 투여 방법에 따라서 당업자가 조절할 수 있을 것이다.
바람직하게는, 이 약제학적 화합물은 특히 정맥투여, 근육투여, 경피투여 또는 피하투여와 같이 전신 투여한다.
투여 방법, 투여량 및 최적의 약제학적 제형은 환자에게 적합한 치료를 정할 때 일반적으로 고려되는 기준들, 예컨대 환자의 연령 또는 체중, 환자의 질환 상태의 심각성, 약물 치료에 대한 저항성 및 관찰된 부작용에 따라 결정할 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 포토랍두스 루미네센스가 생산한 하나 이상의 톡신 또는 항생물질에 감수성을 갖는 박테리아나 진균과 같은 미생물 감염증을 예방 또는 치료하는 약물을 제조하기 위한, 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 대상은 또한 포토랍두스 속, 바람직하게는, 포토랍두스 루미네센스, 바람직하기로는 그 TT01 균주 박테리아의 DNA 게놈 라이브러리이다.
본 발명에서 기재하는 DNA 게놈 라이브러리는, 특히, CNCM (프랑스 국립 배양물 및 미생물 집합소)에 2000년 5월 12일자에 기탁번호 I-2478로 기탁되고 포토랍두스 루미네센스 TT01 게놈을 커버하는 BAC 라이브러리다.
본 발명은 또한 다른 종류의 박테리아, 특히, 병원성 박테리아에는 존재하지 않는 하나 이상의 포토랍두스 루미네센스 누클레오티드 서열을 확인하는 방법 및/또는 포토랍두스 루미네센스 이외의 박테리아 게놈, 특히, 병원성 박테리아 게놈의 누클레오티드 서열로서 포토랍두스 루미네센스 게놈에는 존재하지 않는 누클레오티드 서열을 확인하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
a) 본 발명에 따른 포토랍두스 루미네센스 누클레오티드 서열 또는 본 발명에 따른 게놈 라이브러리에 함유된 누클레오티드 서열을 다른 종류의 박테리아 게놈 서열 또는 그 단편과 정렬시키는 단계; 및
b) 이렇게 정렬시켜 얻은 데이타를 처리하여 한 게놈 또는 나머지 다른 게놈에 존재하는 상기 서열(들)을 분리 및 확인하는 단계.
"공제 게놈법"으로도 불리는 이 방법은 그람음성 박테리아 등의 박테리아 병원성을 책임지는 서열을 확인하기 위해 여기서 사용될 수 있는데 이때 비병원성인 포토랍두스 루미네센스가 비교 모델로 제공된다.
따라서, 본 발명은 포토랍두스 균주에 존재하고 다른 균주나 종에는 존재하지 않는 관심 있는 폴리누클레오티드를 분리하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 예컨대 포토랍두스 게놈을 함유하는 플라스미드 pcDNA2.1에 기초하는 하나 이상의 DNA 라이브러리를 사용한다. 관심 있는 폴리누클레오티드를 분리하는 본 발명에 따른 이 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a) 포토랍두스 기원의 DNA 라이브러리 클론에 함유된 하나 이상의 폴리펩티드를 분리하는 단계;
b) 분리 단계:
- 상기 a) 단계의 DNA 라이브러리를 구성하는데 사용되는 포토랍두스 균주와는 다른 균주 또는 종에 속하는 박테리아의 하나 이상의 cDNA 또는 게놈 폴리누클레오티드, 다르게는,
- 상기 a) 단계의 DNA 라이브러리를 구성하는데 사용되는 포토랍두스 균주와 다른 균주 또는 종에 속하는 박테리아의 게놈으로부터 제조된 DNA 라이브러리 클론에 포함된 하나 이상의 폴리누클레오티드를 분리하고, 상기 a) 단계의 폴리누클레오티드를 b) 단계의 폴리누클레오티드에 하이브리드 시키는 단계;
c) 상기 b) 단계의 폴리누클레오티드와 하이브리드 복합체를 형성하지 않은 a) 단계의 폴리누클레오티드를 선택하는 단계;
d) 선택한 폴리누클레오티드를 특성화하는 단계;
상기 a) 단계 폴리누클레오티드는 하나 이상의 재조합 클론을 적합한 제한 효소로 분해하고, 필요한 경우, 그 결과물인 폴리누클레오티드 삽입물을 증폭시켜 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명 방법에 따라 당업자는 포토랍두스 속 박테리아와 예컨대 병원성 균주 또는 종의 게놈을 비교 연구할 수 있다.
특히, 이 균주들간의 다형 영역을 연구 및 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 서열 또는 폴리펩티드 용도에 관한 것이다:
- 생물학적 살충제, 특히 곤충톡신, 항생물질, 항진균제 및 세포톡신 제조 용도,
- 단백질 분비 용도,
- 독성 인자로서의 용도,
- 포토랍두스 루미네센스가 모델이 되는 인간 질병(특히 페스트 또는 백일해) 표적물질을 확인하기 위한, 쿼럼-센싱을 통한 제어 용도,
- 공제 게놈법을 사용하여(예컨대 대장균 또는 다른 병원성 그람-음성 박테리아와 비교하여) 병원성 그람-음성 박테리아에 대한 표적물질을 확인하는 용도.
본 발명은 또한 특히 효소 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성을 조정할 수 있는 화합물을 스크리닝하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 잇점은 하기 실시예에 나타낸다.
실시예 1: 재료 및 방법
포토랍두스 루미네센스 균주 TT01 게놈을 서열분석하기 위한 전략은 랜덤(샷건) 서열분석에 기초한다. 이 연구의 첫 단계는 포토랍두스 루미네센스 박테리아의 DNA 게놈을 다양한 벡터(플라스미드와 BACs)로 클로닝하는 것으로 구성하였다.
포토랍두스 루미네센스 DNA 게놈 라이브러리를 사용하였다.
세개의 DNA 게놈 라이브러리를 준비하였다:
I) - 고 카피수 박테리아 벡터 DNA 게놈 라이브러리 (pcDNA2.1, 인비트로겐). 평균 삽입 크기 1.5 kb.
II) - 저 카피수 박테리아 벡터 DNA 게놈 라이브러리 (pSYX34). 평균 삽입 크기 10 kb.
III) - BAC 벡터 DNA 게놈 라이브러리 (pBeloBAC00, 캘리포니아 기술연구소). 평균 삽입 크기 50 내지 100 kb.
포토랍두스 루미네센스 박테리아 TT01 균주 두 뱃치를 1998년 10월 30일 및 1999년 4월 14일에 추출하였다.
I)박테리아 벡터 pcDNA2.1 (인트로겐)에서 DNA 게놈 라이브러리 확립
A)벡터 pcDNA2.1 제조
제조사 권장 조건에 따라 두개의 평행 미디프렙스(QIAGEN KIT)를 실시하여 플라스미드 pcDNA2.1을 제조하였다. pcDNA2.1 벡터를 BstX1 제한 효소로 분해하였다.
B)포토랍두스 루미네센스 TT01 균주의 염색체 DNA 제조 및 pcDNA2.1 벡터로의 절단
1) DNA 용해
1998. 10. 30.자에 제조한, 상기 균주 TT01 게놈의 건조 펠렛을 10:1 TE 200㎕에 취한 다음, 65℃에서 30분간 용해하였다. 농도를 측정하니 0.15 ㎍/㎕이었다.
2) DNA 분무
2 ml가 충분히 되는 물에 함유된 50 ㎕의 TT01 균주 DNA 게놈을 질소 1바에서 45초간 분무한 다음 600 rpm으로 2분간 원심분리하여 총량을 얻었다.
3) DNA 침전
이 DNA를 아세트산 나트륨으로 침전시키고(DNA 2 ml + 3M 아세트산 나트륨 0.2 ml, pH 5.2 + 무수에탄올 5 ml; -20℃ 2 시간), 4 ℃, 14000 rpm에서 30분간 원심분리한 후 물 100 ㎕에 용해시켰다.
4) DNA 분석
1% 아가로스 TBE 겔에 4 ㎕ 로딩시켰다.
500 bp 내지 3 kb의 원하는 크기의 DNA 단편을 가시화 시켰다.
5) DNA 복구
DNA 단편 말단을 무디게 하기 위해 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 DNA 복구를 하였다.
별도의 2 튜브에서 하기 물질을 혼합하였다:
- 상기 3) 단계에서 얻은 DNA 48 ㎕,
- 물 100 ㎕,
- 5 X 연결(ligation) 완충액 20 ㎕,
- dNTP 믹스 (10 mM) 2 ㎕,
- T4 DNA 폴리머라제 (베링거) 5 ㎕.
주위 온도에서 25분간 항온배양 한 후 75℃에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다.
6) DNA 침전
이 DNA를 아세트산 나트륨(아세트산 나트륨 1/10분량과 무수 에탄올 2.5분량)으로 영하 20℃에서 밤새 침전시키고 원심분리한 후, 얻은 DNA 펠렛을 공중 건조시켜 물 30 ㎕에 용해시켰다.
7) DNA 연결
8) 삽입물 제조
70 볼트, 1% 아가로스 TAE 겔에서 링커에 연결된 DNA 이동 후, 관심 영역(1 내지 3kb 사이)을 4개의 단편으로 절단 하였다.
9) 삽입물 정제
관심 영역을 함유하는 상기 아가로스 단편을 진클린(Geneclean BIO101)을 사용하여 제조자 권장 조건에 따라 정제하였다.
정제 품질을 입증하기 위해 아가로스 미니겔에 한 분량을 로딩하였다.
10) 벡터 pCDNA2.1에 삽입물 연결
- DNA 4 ㎕ (진클린 정제 단계 8, 9 후에 삽입),
- 플라스미드 pCDNA2.1 2 ㎕ (BstX1 분해 및 진클린 정제 단계 후),
- 연결 완충액 2 ㎕ (10X),
- 물 10 ㎕ (총 부피: 20 ㎕).
이 혼합물을 16℃에서 밤새 항온배양 하였다.
11) 울트라컴피턴트 XL2 블루 세포의 형질 전환 (스트라타진)
상기 10) 단계에서 얻은 DNA 게놈 라이브러리를 제조자 권장 조건에 따라 울트라컴피턴트 XL2 블루 세포(스트라타진)에 통합하였다.
PvuII 제한 효소에 의한 24 클론 삽입물의 분석 및 그 말단의 서열분석을 하여 만족스런 결과를 얻었다.
II)박테리아 벡터 pSYX34에서 DNA 게놈 라이브러리 확립
실험실에서 개발된 부분 채우기(PARTIAL FILL-IN)법을 이용하여 플라스미드 pSYX34로 클론된 포토랍두스 루미네센스 TT01 균주의 DNA 게놈 라이브러리를 구성하였다.
주의: 이 경우, Sal I 제한 효소로 벡터 pSYX34를 분해하면 하기 말단을 자른다:
5'TCGAC-
G-5'
dCTP 및 dTTP 데옥시누클레오티드 존재하여 부분 채우기 법을 수행하였다.
5'TCGAC-
CTG-5'
A)벡터 pSYX34 제조
1) 벡터 생산
제조사 권장 조건에 따라 두개의 평행 미디프렙스(QIAGEN KIT)를 실시하여 플라스미드 pSYX34를 제조하였다.
2) Sal I 제한 효소로 플라스미드 pSYX34 분해
최종 부피는 100 ㎕가 될 것이다:
- pSYX34 20 ㎕,
- 완충액 H 10 ㎕,
- 물 66 ㎕,
- Sal I 4 ㎕.
이 혼합물을 37℃에서 2시간 항온배양 하였다.
정제 품질의 검정을 위해 일 분량의 그리고 일 분자량의 마커를 아가로스 미니겔에 로딩하였다.
3) 클로로포름 추출
클로로포름으로 추출하면 효소 분해를 종결시키고 단백질 흔적들의 제거할 수 있다.
분해 후, 95 ㎕를 회수하고,
10 mM TE 105 ㎕를 가하고,
클로로포름 200 ㎕를 가하였다.
이 혼합물을 1000 rpm에서 1분간 회전 및 원심분리한다.
수상(상층)을 회수한다.
4) 아세트산 나트륨에 의한 침전
- 아세트산 나트륨(3M, pH:5.2) 1/10 분량, 즉, 20 ㎕를 가한다.
- 맑은 무수 에탄올 2.5 분량, 즉 500 ㎕(영하 20℃ 보관병)를 가한다.
- 이 혼합물을 4℃(냉실)에서 30분간 14000 rpm으로 원심분리한다.
- 진공 펌프로 상청액을 제거한다.
- 70% 에탄올 400 ㎕를 가하고 혼합물을 4℃, 14000 rpm 에서 5분간 원심분리한다.
- 진공 펌프로 상청액을 제거하고 펠렛을 남겨 벤치에서 약 1시간 정도 건조한다.
- 펠렛을 10 mM TE(1/10) 20 ㎕에 재현탁한다.
5) 부분 채우기
반응 최종 부피: pSYX34 50 ㎕, 20 ㎕를 Sal I로 분해한다.
- 합성 완충액 5 ㎕,
- 1 mM 누클레오티드 (C-T) 혼합물 2.5 ㎕,
- 물 20.5 ㎕,
- 클레나우 2 ㎕.
이 혼합물을 주위 온도에서 30분간 방치한다.
영하 20℃로 냉동시킨 후, 1% 아가로스 미니겔에서 검정한다.
C-T 누클레오티드 혼합물:
혼합:
- T 누클레오티드(100 mM) 2 ㎕,
- C 누클레오티드(100 mM) 2 ㎕,
- pH 7.5의 트리스 10 mM 16 ㎕,
누클레오티드를 1/10으로 희석하여 10 mM 농도로 한다.
10 mM 트리스 완충액에서 다시 한번 희석하여 농도를 1 mM로 한다.
또한, 반응 동안, 이 누클레오티드를 1/20(50 ㎕에 2.5 ㎕)로 희석하여 누클레오티드 최종 농도 50 μM을 얻는다.
6) 벡터 pSYX34 정제: 예비 겔
1% 아가로스 TAE 겔을 만들고, 샘플을 위해 큰 웰이 제공될 것이다.
부분 채우기 후에 pGB2 30 ㎕를 취하고(따라서 20 ㎕가 냉동실에 남을 것이다), 로딩액 6 ㎕를 가한다. 평행으로 분자량 마커를 하기 분량대로 로딩한다:
- 물 5 ㎕,
- 1 kb DNA 마커 5 ㎕,
- 로딩액 2 ㎕.
70 볼트에서 이동시킨다.
메스로 겔의 마커쪽을 절단하고, 사진촬영 및 자를 이용하여, 관심 있는 영역의 위치를 정한다; 우리는 4 kb에 상응하는 밴드를 취한다. 각 샘플을 반으로 절단한다. 각 샘플의 중량으로 그 적합한 부피를 나타낸다.
따라서, 진클린 II로 정제할 4 개의 샘플이 생길 것이다.
7) 벡터 pSYX34의 정제
- 요오드나트륨 용액 3 부피(샘플 0.2g 당 1 ml)에 넣고, 아가로스가 완전히 용해될 때까지 2분마다 흔들면서 49℃에 둔다.
- 마이크로비드 GLASSMILK R 8 ㎕를 가하고, 주위 온도에 5-10분간 방치하면 DNA가 마이크로비드에 부착된다.
14000 rpm에서 2분간 원심분리 하고, 상청액을 흡입 제거한다.
- 뉴 와시액으로 3회 세척한다(600 ㎕/에펜도르프, 10000 rpm에서 수초간 회전, 원심분리); 이 용액을 제조하여 영하 20℃에 저장한다.
- 펠렛을 물 10 ㎕에 재현탁하고, 회전시킨 후, 49℃에 5분 방치한다. 이렇게 하여 DNA를 마이크로비드에서 이탈시킨다.
- 14000 rpm으로 2분간 원심분리한다.
- 새 에펜도르프(1번, 2번 등)에 있는 상청액을 회수한다.
- 물 10 ㎕를 펠렛에 가하여 모든 물질을 확실히 회수하고, 회전시킨 후, 49℃에 2분간 방치한다.
- 14000 rpm으로 2분간 원심분리한다.
- 상기 에펜도르프(1번, 2번 등)에서 상청액을 회수한다.
- 약 20 ㎕의 상청액이 있으며, 14000 rpm으로 2분간 원심분리한다.
- 상청액을 새 에펜도르프로 옮겨 더 이상의 마이크로비드가 남지 않도록 한다.
- 각 제조물 1 ㎕ (+ 물 5 ㎕ + 로딩액 2 ㎕)를 1% 아가로스 미니겔에 로딩하여 80 볼트에서 2시간 이동시킨다.
가장 농축된 샘플을 남겨, 영하 20℃ 냉동시킨다.
B)포토랍두스 루미네센스 TT01 균주의 염색체 DNA 제조
1) DNA 용해
TT01 균주의 DNA 게놈 건조 펠렛을 취해 10:1 TE 200 ㎕에 가한 후, 65℃에서 30분간 용해하였다. 농도를 측정하니 0.15 ㎍/㎕이었다.
2) Sau3A 제한 효소에 의한 DNA 게놈 부분 분해
DNA 15 ㎕를, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0265 또는 0.03125 유닛 Sau3A 제한 효소로 37℃에서 한 시간 분해하였다.
3) 클로로포름 추출
클로로포름으로 추출하면 효소 분해를 종결시키고 단백질 흔적들을 제거할 수 있다.
분해 후, DNA 100 ㎕를 회수한다.
10 mM TE 105 ㎕를 가하고,
클로로포름 200 ㎕를 가한다.
이 혼합물을 1000 rpm에서 1분간 회전하여 원심분리한다.
염색체 DNA를 함유하는 수상, 즉 상층을 회수하였다.
4) 아세트산 나트륨에 의한 침전
- 아세트산 나트륨(3M, pH:5.2) 1/10 분량, 즉, 20 ㎕를 가한다.
- 맑은 무수 에탄올 2.5 분량, 즉 500 ㎕(영하 20℃ 보관병)를 가한다.
- 이 혼합물을 4℃(냉실)에서 30분간 14000 rpm으로 원심분리한다.
- 진공 펌프로 상청액을 제거한다.
- 70% 에탄올 400 ㎕를 가하고, 혼합물을 4℃, 14000 rpm 에서 5분간 원심분리한다.
- 진공 펌프로 상청액을 제거하고 펠렛을 남겨 벤치에서 약 1시간 정도 건조한다.
- 펠렛을 10 mM TE(1/10) 20 ㎕에 재현탁한다.
5) 아세트산 나트륨에 의한 침전 후, 부분 분해의 검정
1% 아가로스 TBE 겔을 제조한다. 침전 총 부피의 1/10, 즉 DNA 2 ㎕ + 물 8 ㎕ + 로딩액 2 ㎕를 로딩하였다.
평행하게, 분자량 마커를 로딩하였다: 1 ㎕ +물 9 ㎕ + 로딩액 2 ㎕.
6) 부분 채우기
반응 최종 부피: 약 50 ㎕
- 부분 분해된(0.25, 0.125, 0.0625 또는 0.03125 유닛 Sau3A 제한 효소에 의해 분해된 DNA) DNA 36 ㎕,
- 합성 완충액 5 ㎕,
- 1 mM 누클레오티드 (A-G) 혼합물 10 ㎕ ⇒ 최종 농도: 200 ㎕,
- 물 20.5 ㎕,
- 클레나우 2 ㎕ (2U/㎕).
이 혼합물을 주위 온도로 30분간 방치하였다.
A-G 누클레오티드 혼합물:
혼합:
- A 누클레오티드(100 mM) 2 ㎕,
- G 누클레오티드(100 mM) 2 ㎕,
- pH 7.5의 트리스 10 mM 16 ㎕,
이 누클레오티드를 1/10 희석하여 10 mM 농도로 하였다.
물로 다시 한번 희석하여 농도를 1 mM로 하였다.
7) 클로로포름 추출
클로로포름으로 추출하면 효소 분해를 종결시키고 단백질 흔적들을 모두 제거할 수 있다.
분해 후, 염색체 DNA 53 ㎕를 회수한다.
10 mM TE 47 ㎕를 가한다.
클로로포름 100 ㎕를 가한다.
혼합물을 1000 rpm에서 1시간 회전시켜 원심분리한다.
염색체 DNA를 포함하는 수상, 즉, 상층을 회수한다.
8) 아세트산 나트륨에 의한 침전
- 아세트산 나트륨(3M, pH:5.2) 1/10 분량, 즉, 10 ㎕를 가한다.
- 맑은 무수 에탄올 2.5 분량, 즉 250 ㎕(영하 20℃ 보관병)를 가한다.
- 이 혼합물을 영하 20℃에 1시간 이상 방치한다 (영하 20℃로 밤새 두어도 된다)
- 이 혼합물을 4℃ (냉실)에서 30분간 14000 rpm으로 원심분리한다.
- 진공 펌프로 상청액을 제거한다.
- 70% 에탄올 400 ㎕를 가하고, 혼합물을 4℃, 14000 rpm 에서 5분간 원심분리한다.
- 진공 펌프로 상청액을 제거하고 펠렛을 남겨 벤치에서 약 1시간 정도 건조한다.
- 펠렛을 물 20 ㎕에 재현탁한다.
9) 염색체 DNA 정제: 예비 겔
1% 아가로스 TAE 겔을 만들고, 샘플을 위해 큰 웰이 제공될 것이다.
전체 DNA, 즉, 20 ㎕을 취해 로딩액 4 ㎕를 가한다. 평행으로, 분자량 마커를 하기 분량대로 로딩한다:
- 물 5 ㎕,
- 1 kb DNA 마커 5 ㎕,
- 로딩액 2 ㎕.
70 볼트에서 이동시킨다.
메스로 겔의 마커쪽을 절단하고, 사진촬영 및 자를 이용하여, 관심 있는 영역의 위치를 정한다; DNA 단편이 길므로, COSTAR의 SPIN X 칼럼을 사용하여 DNA를 정제하면 염색체 DNA의 절단을 피할 수 있을 것이다.
10) 정제: SPIN X 칼럼
SPIN X 칼럼에서 다양한 조각의 아가로스를 회수한 후, 10 mM TE 200 ㎕를 가한 후 스패튤라로 간다.
4℃에 보관할 수 있다. 그 다음, 5000 rpm에서 20분간 원심분리한다. 아가로스는 필터에 잔류하는 반면, 염색체 DNA는 튜브 바닥에서 발견될 것이다.
11) 클로로포름 추출
클로로포름으로 추출하면 효소 분해를 종결시키고 단백질 흔적들을 모두 제거할 수 있다.
분해 후, 염색체 DNA 800 ㎕를 회수한다.
클로로포름 800 ㎕를 가한다.
혼합물을 1000 rpm에서 1시간 회전시켜 원심분리한다.
염색체 DNA를 포함하는 수상, 즉, 상층을 회수한다.
8) 아세트산 나트륨에 의한 침전
- 아세트산 나트륨(3M, pH:5.2) 1/10 분량, 즉, 80 ㎕를 가한다.
- 이소프로판올 800 ㎕를 가한다.
- 이 혼합물을 영하 20℃에 1시간 이상 방치한다 (영하 20℃로 밤새 두어도 된다)
- 이 혼합물을 4℃ (냉실)에서 30분간 14000 rpm으로 원심분리한다.
- 진공 펌프로 상청액을 제거한다.
- 70% 에탄올 400 ㎕를 가하고, 혼합물을 4℃, 14000 rpm 에서 5분간 원심분리한다.
- 진공 펌프로 상청액을 제거하고 펠렛을 남겨 벤치에서 약 1시간 정도 그리고 진공상태로 2분간 건조한다.
- 펠렛을 TE(0.1X, 즉, 1 mM) 20 ㎕에 재현탁한다.
- 현탁액을 65℃에서 10분간 항온 배양한다.
- 현탁액을 4℃로 약 4시간 항온 배양하여 DNA가 재현탁이 잘 되도록 한다.
분자량 마커가 평행하게 위치한 1% 아가로스 미니겔에서 검정한다.
C)벡터 pSYX34에 포토랍두스 루미네센스 균주 TT01의 염색체 DNA 연결
염색체 DNA를 6 ㎕ 취한다.
pSYX34 2 ㎕를 가한다.
연결 완충액(LB) 2 ㎕를 가한다.
리가아제 2 ㎕를 가한다.
물 8 ㎕를 가한다 (총 부피: 20 ㎕)
평행하게, 염색체 DNA를 0.1X TE(1mM)로 치환하여 연결 대조군을 만든다.
회전시키고 16℃에서 밤새 방치한다.
울트라컴피턴트 XL10-골드 칸 세포(스트라타진)의 형질 전환
상기 단계에서 얻은 DNA 게놈 라이브러리를 제조자 권장 조건에 따라 울트라컴피턴트 XL10 골드 칸(Kanr) 세포에 통합하였다.
Sal I 제한 효소 분해에 의한 24 클론 삽입물의 분석 및 그 말단의 서열분석을 수행하여 만족스런 결과를 얻었다.
III)박테리아 벡터 pBeloBAC11(캘리포니아 기술 연구소)내 DNA 게놈 라이브러리 확립
BAC 라이브러리 구성
아가로스 조각내 DNA 부분 분해:
- 아가로스 조각들을 TE (1x) 용액에서 완만히 교반하면서 주위 온도로 15분간 3회 세척한다;
- 아가로스 조각들을 힌드 III 분해 완충액 (1x) (베링거 또는 바이오랩스)300 ㎕에서 주위 온도로 30분간 2회 평형시킨다.
- 분해 완충액을 제거하고, 힌드 III 20U를 함유하는 얼음-냉각 힌드 III 분해 완충액(아가로스 1조각 당 1 ml)을 제거한다.
- 얼음에서 2시간 항온 배양한다.
- 아가로스 조각을 37℃ 수조로 옮기고 (아가로스 조각에 함유된 DNA에 따라) 10분 내지 30분간 항온 배양한다.
- 250 mM EDTA 용액(pH 8) 100 ㎕를 가하여 분해 반응을 종결시킨다.
크기 선택:
PFGE에 의해 부분 분해된 DNA를 CHEF DRIII 장치 (바이오-래드)를 이용하여 분리:
- 13℃, 트리스-아세테이트-EDTA 완충액 (1x)에 있는 1% LMP 아가로스 겔,
- 16시간 동안 매 3 내지 15초마다 6V/cm로 전위 역전시키고,
- 두 조각 이상의 아가로스와 마커를 로딩하고,
- 마커 및 한 레인 또는 일부 레인을 염색하여 부분 분해를 검정하고,
- 다양한 사이즈(즉, 20 내지 100 kb 및 150 내지 250 kb)의 밴드(비염색 부분)를 절단하고,
- 아가로스 밴드를 4℃ TE 용액에 저장할 수 있다.
벡터 제조:
- 염화세슘법을 이용해 pBeloBACII 분리;
- 힌드 III로 분해;
- CIP (필요한 경우서는 HK 포스파타제)로 탈인산화.
연결 및 형질 전환:
- DNA 함유 아가로스 뱅크를 60℃에서 10분간 용융시킨다;
- 용융된 아가로스/DNA 용액을 45℃, 15분간 평형시킨다;
- 겔라아제(에피센트리 테크놀로지)를 겔 밴드 100 ㎕당 1U의 비율로 가한다(분해 완충액을 가하지 않는데, 이 완충액은 연결시에 어떤 문제를 유발한다);
- 45℃, 1시간 동안 분해한다;
- pBeloBACII(2 ㎕), T4 리가아제(1:10으로 1 ㎕), 10x T4 완충액(5 ㎕) 및 DNA/아가로스 용액(42 ㎕)를 함유하는 용액 50 ㎕를 16℃에서 20시간 항온 배양하여 연결을 수행한;
- 연결 배지를 65℃로 15분간 가열한다;
- 공극 크기가 VS 0.025 mM인 미세공극막을 이용하여, 트리스-EDTA 완충액에 연결 배지를 투석한다
- 2.5 kV, 25 μF 및 200 Ω장치를 구비한 넓이 2 mm의 엘렉트로포레이션 큐벳을 이용하여, 연결 용액 1 또는 2 ㎕을 이. 콜라이 DH10B 세포(Gibco BRL)로 엘렉트로포레이션시킨다;
- 엘렉트로포레이션 후, 세포를 SOC 또는 NYZ 배지 600 ㎕에 재현탁시킨 후, 37℃에서 45분간 교반하면서 항온 배양한다;
- 각 세포 현탁액 10 ㎕ 및 100 ㎕을, 클로람페니콜(12.5 ㎍/㎕), X-겔(5-브로모-4-크로로-3-인돌릴-α-D-글루쿠론산; 50 ㎍/ml) 및 IPTG(이소프로필-α-D-티오갈락토피라노시드; 25 ㎍/ml)를 함유하는 LB 아가 배지에 둔다.
- 이렇게 얻은 접시를 밤새 항온 배양한다.
플라스미드 DNA 추출과 삽입물의 서열 분석
알칼리 용해법으로 24-웰 플레이트에서 플라스미드 DNA를 추출하였다;
클론 삽입물을, 각 벡터에 특이적인 올리고누클레오티드를 이용하는 PE 빅 다이 키트를 이용해, 제조자 권장 조건에 따라 서열 분석하였다.
열 순환기로 반응을 도입하여 하기 세 단계로 이루어진 35 순환을 시킨다:
- 96℃에서 10초간 변성,
- 50℃에서 10초간 하이브리드화,
- 56℃에서 4분간 연장.
그 다음 76% 에탄올로 주위 온도에서 20분간 침전시킨다.
이 플레이트를 다음으로 2200g에서 35분간 원심분리하고, 흡착지로 흘러보낸 후, 흡착지에서 거꾸로 하여 500g로 1분간 원심분리하여 에탄올의 흔적이 남지 않게 한다.
그 다음, DNA 펠렛을:
- 포름아미드-EDTA-덱스트란 블루 용액에 넣고 96℃에서 2분간 변성시킨다. 플레이트를 즉시 얼음에 넣고, 한 분량이 PE-377 자동 서열분석기 아크릴아미드 겔로 로딩된다; 또는,
- 0.3 mM EDTA 용액에 넣어, 한 분량이 PE-377 자동 서열분석기로 자동적으로 로딩된다.
얻은 서열의 조립
PHRED-PHRAP 소프트웨어를 이용하여 DNA 게놈 서열을 콘티그로 조립하고 CONSED 소프트웨어를 이용하여 가시화하였다.
분석 및 주석
GMPTB 소프트웨어를 이용하여 자동적으로 우선 콘티그를 분석하고 주석하였다.
실시예 2: 관심 있는 유전자
포토랍두스 루미네센스 박테리아의 게놈에서 찾는 항생물질 및 톡신의 생합성에 관계하는 유전자의 존재로 유도된 다양한 특성들이 포토랍두스 루미네센스 생활 방식과 연관되고, 문헌(Forst 등, 1997; Hu 등, 1998, 등)에 보고되어 있다.
항생물질 생합성을 위한 오페론
펩티드 합성효소에 대한 연구(in silico연구)를 하였다. 이를 위해, 문헌(Stachelhaus & Marahiel, 1995, FEMS Microbiology Letters 125:3-14) 에 종래 기술된 바 있는 다양한 모티브를 먼저 프로브로 사용하여, 포토랍두스 루미네센스 게놈에서, 서열 상동성에 의해, 항생물질 생합성에 관계할 수도 있는 유전자들을 위치를 찾았다.
아데닐화 모듈
1 - LKAGGAYYVPID
2 - YSGTTGxPKGV
3 - GELCIGGxGxARGYL
4 - YxTGD
5 - VKIRGxRIELGEIE
티오에스테르 형성 모듈
6 - DNFYxRIELGEIE
N-메틸화 모듈
VLE/DxGxGxG
펩티드 연장 모듈
His-HHILxDGW
펩티드 라세미화 모듈 (임의)
His-HHILxDGW
A - AYxTExNDILLTAxG
B - EGHGRExIIE
C - RTVGWFTSMYPxxLD
D- FNYLGQFD
다양한 이 모듈중에서, 어떤 모듈은 우리가 BLASTP - 기본적인 지역 정렬 조사 도구 프로그램 (Altschul SF et al., 1990, J. Mol. Biol., 215:403-10) - 를 이용한 상동성 조사에 의해 이 모티브들 중 일부를 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자들을 확인할 수 있게 하였다.
항생물질 생합성에 관계하는 단백질을 코딩할 것으로 생각되는, 이렇게 확인된 유전자들을 목록화하여 [표 1]에 상세히 보였다.
슈도모나스 시린지의 syr E 유전자 또는 nos D 유전자에 상동성인 유전자에 특히 중점을 두었다.
참고 문헌
- Eric Guenzi, Giuliano Galli, Ingeborg Grgurina, Dennis C. Gross, and Guido Grandi, 1998. Characterization of the Syringomycin Synthetase Gene Cluster. A link between prokaryotic and eukaryotic peptide synthetases. J. Biol. Chem., 273:32857-32863.
- Bondi M, Messi P, Sabia C, Baccarani Contri M, Manicardi G., 1999. Antimicrobial properties and morphological characteristics of twoPhotorhabdus luminescensstrains. New Microbiol., 22:117-27.
톡신 생합성을 위한 오페론
항생물질 생합성을 위한 유전자에 관해서, 우리는 포토랍두스 루미네센스 게놈에서 서열 상동성에 의해 잠재적으로 톡신 단백질을 코딩하는 유전자를 찾으려 했다. 우리는 하기 기준들을 갖는 단백질을 코딩하는 많은 유전자들을 확인하였다.
곤충톡신 (Tc loci)
클로스트리듐 디피실 Tox A 유전자에 상동
호모리신
비브리오 콜레라 RTX 톡신에 상동성인 단백질을 잠재적으로 코딩하는 유전자
레지오넬라 뉴모필라의 tphA 및 icmF 유전자(Purcell M, Shuman HA, 1998. TheLegionella pneumophilaicmGCDJBF genes are required for killing of human macrophages. Infect Immun., 66:2245-55)에 상동성인 단백질을 잠재적으로 코딩하는 유전자.
[표 1]에 있는 이 유전자들에 대한 주석을 참조.
참고 문헌
- Ffrench-Constant R, Bowen D., 1999.Photorhabdus toxins: novel biological insecticides. Curr Opin Microbiol., 2:284-8. Review.
- Blackburn M, Golubeva E, Bowen D, Ffrench-Constant RH, 1998. A novel insecticidal toxin fromPhotorhabdus luminescens, toxins complex a (Tca), and its histopathological effects on the midgut of manduca sexta. Appl Environ Microbiol., 64:3036-41.
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- Bowen D, Rocheleau TA, Blackburn M, Andreev O, Golubeva E, Bhartia R, Ffrench-Constant RH, 1998. Insecticidal toxins from the bacteriumPhotorhabdus luminescens. Science., 280:2129-32.
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일반 참고 문헌
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2000년 5월 12일에 기탁번호 I-2478호로 CNCM(프랑스 국립 배양액 및 미생물 집합소)에 기탁된 포토랍두스 루미네센스 균주 TT01 BAC 라이브러리에 대한 과학적기재
포토랍두스 루미네센스 균주로부터 얻은 DNA 게놈 단편을 함유하는 에스케리키아 콜라이 10B™클론 (Clavin 등, j. Bacteriol. 170, 2796, 1988) 집합을 힌드 III 위치에서 벡터 pBeloBACIII (Kim 등, Genomics, 34, 213, 1996)내로 클로닝하였다. 삽입물 평균 크기는 60 kb이다.
데이타뱅크
주요 공중뱅크의 지역 수정본을 사용하였다. 사용한 단백질 뱅크는, Genepeptbank(Genbank 및 NCBI의 자동 해독) 같은, 이 뱅크의 비-리던던트 융합으로 이루어진다.
단백질 또는 핵산 데이타 뱅크와 서열간의 상동성 조사를 위해 BLAST 소프트웨어 패키지(Public domain, Altschul 등, 1990)를 사용하였다. 사용한 유의성 역치는 시험 영역의 길이 및 복잡성에 따라 다르고, 또 비교 뱅크(reference bank)의 크기에 따라 다르다. 이를 각 분석마다 조절하여 적용하였다.
본 발명에 따른 서열과 단백질 또는 핵산 데이뱅크간의 상동성 조사의 결과를 하기 [표 1] 및 [표 2]에 기재하였다.
[표 1]
포토랍두스 루미네센스 균주 TT01 게놈(41개의 콘티그(서열 1 내지 서열 41) 서열로 표현되는 게놈)의 각 누클레오티드 서열 단백질의 추정 기능 리스트("비-리던던트 단백질 데이타베이스-기재" 칼럼 및 톡신 또는 항생물질형 활성을 갖거나 이에 관계하는 것으로 선택된 서열들에 대한 "주석" 칼럼).
서열 42 내지 서열 3855의 단백질에 대한 핵산 서열은 각 콘티그 서열("콘티그" 칼럼)의 개시 위치("개시" 칼럼) 및 종결 위치("종결" 칼럼)에 의해 용이하게 확인할 수 있다.
[표 1]에 대한 설명:
서열 42 내지 서열 3855 단백질 서열과 연관된 추정 기능은 모두, 특히 BLASTP 소프트웨어(Altschul 등, 1990)를 이용한 상동성 조사를 통해 얻었다. 유의성 있는 동일성, 또는 이 기능들에 대표적인 다양한 모티브(cf. 실시예)를 특히 고려하였다. 가장 그럴듯한 기능(들)은 "상동성" 및 "주석" 칼럼에 기재되어 있다.
[표 2]
포토랍두스 루미네센스 균주 TT01 게놈 (여기서는 9개의 콘티그(서열 5826 내지 서열 5834) 서열로 표현되는 게놈)에 의해 코딩되는 단백질의 추정 기능 리스트("데이타뱅크 비교를 통해 얻은 기능"칼럼).
서열 5835 내지 서열 10784에 대한 핵산 서열은 각 콘티그 서열의 개시 위치("콘티그","개시(from)" 칼럼) 및 종결 위치("콘티그", "종결(to)" 칼럼)에 의해 용이하게 확인할 수 있다.
[표 2]에 대한 설명:
서열 5835 내지 서열 10784 단백질 서열과 연관된 추정 기능은 모두, 특히 BLASTP 소프트웨어(Altschul 등, 1990)를 이용한 상동성 조사를 통해 얻었다. 유의성 있는 동일성, 또는 이 기능들에 대표적인 다양한 모티브(cf. 실시예)를 특히고려하였다.
마지막 칼럼인 "서열과 상동성인"에서, "#N/A"라는 용어는 관심 있는 서열이 서열 42 내지 서열 3855에 대해 상동성인지가 확인되지 않았다는 것을 의미한다. 서열 42 내지 서열 3855 중에 관심 있는 서열에 대한 상동성 서열이 발견된 경우 이는 이 칼럼에서 그 서열 번호로 언급된다.
[표1]
[표2]
Claims (56)
- 서열 1 내지 서열 41 및 서열 5826 내지 서열 5834 로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 포토랍두스 루미네센스 게놈으로부터 유래한 분리된 누클레오티드 서열.
- 하기 a) 내지 e)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 포토랍두스 루미네센스 게놈으로부터 유래한 분리된 누클레오티드 서열.a) 서열 1 내지 41 또는 서열 5826 내지 서열 5834로부터 선택된 서열과 75% 이상의 동일성을 갖는 누클레오티드 서열;b) 서열 1 내지 41 또는 서열 5826 내지 서열 5834로부터 선택된 서열의 대표적 단편을 포함하는 누클레오티드 서열;c) 상기 a) 또는 b)에 정의된 서열에 상보적인 누클레오티드 서열;d) 상기 a), b) 또는 c)에 정의된 서열 중 하나에 상응하는 RNA 누클레오티드 서열;e) 상기 a), b), c) 또는 d)에 정의된 서열을 변형시킨 서열.
- 제2항에 있어서, 서열 1 내지 서열 41 또는 서열 5826 내지 서열 5834 중 하나의 서열에 포함되고 서열 42 내지 서열 3855 서열의 폴리펩티드 또는 서열 5835 내지 서열 10784에 의해 코딩되는 서열의 폴리펩티드로부터 선택된 폴리펩티드를코딩하는 것을 특징으로 하는 누클레오티드 서열.
- 제3항에 있어서,a) 서열 61, 서열 62, 서열 67, 서열 171, 서열 221, 서열 268, 서열 288, 서열 380, 서열 426, 서열 438, 서열 448, 서열 453, 서열 455, 서열 456, 서열 458, 서열 501, 서열 516, 서열 530, 서열 542, 서열 551, 서열 720, 서열 761, 서열 762, 서열 814, 서열 859, 서열 860, 서열 861, 서열 862, 서열 869, 서열 1079, 서열 1168, 서열 1174, 서열 1176, 서열 1413, 서열 1414, 서열 1415, 서열 1416, 서열 1417, 서열 1457, 서열 1651, 서열 1856, 서열 1869, 서열 2021, 서열 2080, 서열 2152, 서열 2162, 서열 2173, 서열 2251, 서열 2295, 서열 2306, 서열 2317, 서열 2328, 서열 2340, 서열 2342, 서열 2351, 서열 2500, 서열 3228, 서열 3230, 서열 3311, 서열 3317, 서열 3318, 서열 3319, 서열 3320, 서열 3322, 서열 3323, 서열 3326, 서열 3327, 서열 3328, 서열 3375, 서열 3376, 서열 3377, 서열 3378, 서열 3422, 서열 3489, 서열 3503, 서열 3609, 서열 3623, 서열 3624, 서열 3772, 서열 3783, 서열 3788 및 서열 3794 서열의 폴리펩티드로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하거나,b) [표 2]의 마지막 칼럼에 기재한 바와 같이, 상기 a)에서 정의한 서열과 상동성인 서열 5834 내지 서열 10784 로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 누클레오티드 서열.
- 하기 a) 내지 e)로부터 선택된 누클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 누클레오티드 서열.a) 제3항 또는 제4항에서 청구한 누클레오티드 서열;b) 제3항 또는 제4항에서 청구한 누클레오티드 서열과 75% 이상 동일성을 갖는 누클레오티드 서열;c) 상기 a) 또는 b)에서 정의한 서열에 상보적인 누클레오티드 서열 또는 이에 상응하는 RNA 누클레오티드 서열;d) 상기 a) 또는 c)에서 정의한 서열의 대표적 단편인 누클레오티드 서열; 및e) 상기 a) 또는 c)에서 정의한 서열을 변형시킨 서열.
- 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 청구한 누클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
- 제6항에 있어서,a) 서열 61, 서열 62, 서열 67, 서열 171, 서열 221, 서열 268, 서열 288, 서열 380, 서열 426, 서열 438, 서열 448, 서열 453, 서열 455, 서열 456, 서열 458, 서열 501, 서열 516, 서열 530, 서열 542, 서열 551, 서열 720, 서열 761, 서열 762, 서열 814, 서열 859, 서열 860, 서열 861, 서열 862, 서열 869, 서열 1079, 서열 1168, 서열 1174, 서열 1176, 서열 1413, 서열 1414,서열 1415, 서열 1416, 서열 1417, 서열 1457, 서열 1651, 서열 1856, 서열 1869, 서열 2021, 서열 2080, 서열 2152, 서열 2162, 서열 2173, 서열 2251, 서열 2295, 서열 2306, 서열 2317, 서열 2328, 서열 2340, 서열 2342, 서열 2351, 서열 2500, 서열 3228, 서열 3230, 서열 3311, 서열 3317, 서열 3318, 서열 3319, 서열 3320, 서열 3322, 서열 3323, 서열 3326, 서열 3327, 서열 3328, 서열 3375, 서열 3376, 서열 3377, 서열 3378, 서열 3422, 서열 3489, 서열 3503, 서열 3609, 서열 3623, 서열 3624, 서열 3772, 서열 3783, 서열 3788 및 서열 3794 서열의 폴리펩티드로부터 선택되는 것을 특징으로 하거나,b) [표 2]에 기재한 바와 같이, 상기 a)에서 정의한 서열에 상동성을 갖는 서열 5834 내지 서열 10784에 의해 코딩되는 폴리펩티드로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 하기 a) 내지 e)로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.a) 제6항 또는 제7항에서 청구한 폴리펩티드;b) 서열 42 내지 서열 3855 서열의 폴리펩티드 또는 서열 5835 내지 서열 10784 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 80% 이상의 동일성을 보이는 폴리펩티드;c) 서열 42 내지 서열 3855 서열의 폴리펩티드 또는 서열 5835 내지 서열 10784 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 5개 이상의 아미노산 단편;d) 서열 42 내지 서열 3855 서열의 폴리펩티드 또는 서열 5835 내지 서열 10784 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편;e) 서열 42 내지 서열 3855 서열의 폴리펩티드 또는 서열 5835 내지 서열 10784 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 상기 c) 또는 d)에서 정의한 폴리펩티드의 변형된 폴리펩티드.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 청구한 폴리펩티드를 코딩하는 누클레오티드 서열.
- 제2항 내지 제5항 및 제9항에 있어서, 톡신 및/또는 항생물질형 활성을 갖거나 이 톡신 및/또는 항생물질 생합성에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 누클레오티드 서열.
- 제6항 내지 제8항에 있어서, 톡신 및/또는 항생물질형 활성을 갖거나 이 톡신 및/또는 항생물질 생합성에 관계하는 포토랍두스 루미네센스 폴리펩티드 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
- 서열의 판독, 분석 및/또는 개발을 용이하게 하는 형식 및 속성이 있는 기록 매체에 기록되는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제5항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에서 청구한 누클레오티드 서열 또는 제6항 내지 제8항 및 제11항 중 어느 한항에서 청구한 폴리펩티드 서열.
- 제12항에 있어서, 기록 매체가 CD-ROM, 컴퓨터 디스크 또는 컴퓨터 서버인 것을 특징으로 하는 누클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열.
- 제12항 또는 제13항에서 청구한 누클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열이 기록되어 있는 것을 특징으로 하는 기록 매체.
- 포토랍두스 루미네센스 관련 균주의 유전자를 결정하는 누클레오티드 프라이머 또는 프로브를 선택하는데 사용되는, 제14항에서 청구한 기록 매체의 용도.
- 포토랍두스 루미네센스 관련 균주의 유전자 다형을 연구하는데 사용되는, 제14항에서 청구한 기록 매체의 용도.
- 다른 유전자의 연구, 특히, 다른 게놈으로부터 기원한 유전자의 자동 주석화를 위해 사용되는 제14항에서 청구한 기록 매체의 용도.
- 제1항 내지 제5항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에서 청구한 누클레오티드 서열로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 프라이머 또는 프로브로 사용될 수 있는 누클레오티드 서열.
- 제18항에 있어서, 방사능 화합물 또는 비방사능 화합물로 표지된 것을 특징으로 하는 누클레오티드 서열.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 공유 결합 또는 비-공유 결합 방식으로 지지체에 고정된 것을 특징으로 하는 누클레오티드 서열.
- 제20항에 있어서, 고밀도 필터 또는 DNA 칩과 같은 지지체에 고정된 것을 특징으로 하는 누클레오티드 서열.
- 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열을 검출 및/또는 증폭하기 위한 누클레오티드 서열.
- 제21항에서 청구한 하나 이상의 누클레오티드 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩 또는 필터.
- 제23항에 있어서, 지지체 또는 칩에 고정된, 하나 이상의 식물 또는 동물 세포 또는 포토랍두스 루미네센스 이외의 다른 미생물의 누클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩 또는 필터.
- 제24항에 있어서, 상기 세포 또는 다른 미생물이, 포토랍두스 루미네센스, 포토랍두스 속 박테리아 및 포토랍두스 루미네센스 변종이 생산한 톡신 또는 항생물질에 감수성을 갖는 세포 또는 미생물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩 또는 필터.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에서 청구한 DNA 칩 또는 필터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 포토랍두스 루미네센스 유전자 발현을 검출 및/또는 정량하기 위한 키트 또는 세트.
- 제1항 내지 제5항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에서 청구한 누클레오티드 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 클로닝 및/또는 발현 벡터.
- 제27항에 있어서, 서열 3856 내지 서열 5825, 서열 5835 내지 서열 10784 또는 포토랍두스 루미네센스 게놈에서 유래한 그 단편으로 부터 선택된 누클레오티드 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 클로닝 및/또는 발현 벡터.
- 제27항 또는 제28항에서 청구한 벡터에 의해 형질 전환되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제29항에서 청구한 형질 전환 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 또는 인간을 제외한 동물.
- 제29항에서 청구한 형질 전환 세포를 폴리펩티드가 발현될 수 있는 조건에서 배양하고 이 재조합 폴리펩티드를 회수하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드 제조 방법.
- 제31항의 방법을 이용하여 얻을 수 있는 재조합 폴리펩티드.
- 폴리펩티드를 화학 합성하는 것을 특징으로 하는, 제6항 내지 제8항, 제11항 및 제32항에서 청구한 폴리펩티드 제조 방법.
- 제6항 내지 제8항, 제11항 및 제32항에서 청구한 폴리펩티드를 특이적으로 인식할 수 있는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체 또는 다클론 항체, 그 단편 또는 키메라 항체.
- 제34항에 있어서, 표지된 것을 특징으로 하는 항체.
- 하기 a) 및 b) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플에서 포토랍두스 루미네센스 종에 속하는 박테리아를 검출 및/또는 확인하는 방법.a) 생물학적 샘플을 제34항 또는 제35항에서 청구한 항체와 접촉시키는 단계;b) 형성되었을 항원-항체 복합체를 증명하는 단계.
- 포토랍두스 루미네센스 균주를 제34항 또는 제35항에서 청구한 항체와 접촉시키고 그 형성되었을 항원-항체 복합체를 검출하는 것을 특징으로 하는, 포토랍두스 루미네센스 유전자의 발현을 검출하는 방법.
- 하기 a) 내지 c)의 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제36항 또는 제37항에서 청구한 방법을 수행하기 위한 키트 또는 세트.a) 제34항 또는 제35항에서 청구한 항체;b) 필요한 경우, 면역 반응에 적합한 배지를 구성하는 시약;c) 필요한 경우, 면역 반응으로 생성된 항원-항체 복합체를 증명하는 시약
- 지지체, 특히 단백질 칩에 고정된 것을 특징으로 하는, 제6항 내지 제8항, 제11항 및 제32항에서 청구한 폴리펩티드 또는 제34항 또는 제35항에서 청구한 항체.
- 제6항 내지 제8항, 제11항 및 제32항에서 청구한 하나 이상의 폴리펩티드 또는 제34항 또는 제35항에서 청구한 하나 이상의 항체를 칩 지지체에 고정된 상태로 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
- 제40항에 있어서, 칩 지지체에 고정된 하나 이상의 식물 또는 동물 세포 또는 포토랍두스 루미네센스 이외의 다른 미생물의 폴리펩티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
- 제41항에 있어서, 세포 또는 다른 미생물이, 포토랍두스 루미네센스에 의해 생산되는 톡신 또는 항생물질에 감수성을 갖는 세포 또는 미생물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
- 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에서 청구한 단백질 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 포토랍두스 루미네센스 유전자 발현을 검출 및/또는 정량하기 위한 키트 또는 세트.
- 제1항 내지 제5항, 제9항, 제10항 및 제19항 중 어느 한 항에서 청구한 누클레오티드 서열을 사용하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플에서 포토랍두스 루미네센스 종에 속하는 박테리아를 검출 및/또는 확인하기 위한 키트 또는 세트.
- 제44항에 있어서, 하기 a) 내지 c) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.a) 필요한 경우, 분석용 생물학적 샘플에서 DNA를 분리하는 단계 또는 생물학적 샘플의 RNA에서 cDNA를 얻는 단계;b) 제18항 또는 제19항에서 청구한 하나 이상의 프라이머를 이용하여 포토랍두스 루미네센스 종에 속하는 박테리아의 DNA를 특이적으로 증폭시키는 단계;c) 증폭 생성물을 증명하는 단계
- 하기 a) 내지 c) 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 포토랍두스 루미네센스 종에 속하는 박테리아를 검출 및/또는 확인하기 위한 키트 또는 세트.a) 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에서 청구한 누클레오티드 프로브 및/또는 프라이머;b) 필요한 경우, 하이브리드화 반응 수행에 필요한 시약;c) 필요한 경우, DNA 증폭 반응에 필요한 시약
- 포토랍두스 루미네센스가 생산하는 하나 이상의 톡신 또는 항생물질에 대한 저항성 또는 감수성의 변형이 요구되는, 식물 또는 동물 세포 또는 포토랍두스 루미네센스 이외의 다른 미생물에서 유전자의 발현을 조정, 조절, 유도 또는 억제할 수 있는 무기 또는 유기 화합물을 선택하는데 사용되는, 제1항 내지 제5항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에서 청구한 누클레오티드 서열의 용도, 제6항 내지 제8항, 제11항 및 제32항에서 청구한 폴리펩티드의 용도, 제34항 또는 제35항에서 청구한 항체의 용도 및/또는 제29항에서 청구한 세포의 용도.
- 하기 a) 내지 d) 에서 선택된 화합물을 포함하는 조성물.a) 제1항 내지 제5항, 제9항 및 제10항에서 청구한 누클레오티드 서열;b) 제6항 내지 제8항, 제11항 및 제32항에서 청구한 폴리펩티드;c) 제27항 또는 제28항에서 청구한 벡터; 및d) 제34항 또는 제35항에서 청구한 항체
- 제48항에 있어서, 필요한 경우 약제학적으로 허용되는 운반체와 배합된 약제학적 조성물.
- 제48항에 있어서, 생물학적 살충용 조성물.
- 톡신 또는 항생물질 제조를 위한, 제29항에서 청구한 세포의 용도 또는 제27항 또는 제28항에서 청구한 벡터의 용도.
- 포토랍두스 속 박테리아의 게놈 라이브러리.
- 제52항에 있어서, DNA 라이브러리가 플라스미드로 클로닝되는 것을 특징으로 하는 포토랍두스 속 박테리아의 DNA 게놈 라이브러리.
- 제52항 또는 제53항에 있어서, 박테리아가 포토랍두스 루미네센스 또는 포토랍두스 루미네센스 균주 TT01인 것을 특징으로 하는 DNA 게놈 라이브러리.
- 제52항 또는 제53항에 있어서, 2000년 5월 12일에 기탁번호 I-2478로 CNCM(프랑스 국립 배양액 및 미생물 집합소)에 기탁된 것을 특징으로 하는 라이브러리.
- 하기 a) 및 b) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다른 박테리아 종, 특히 병원성 박테리아 종에는 존재하지 않는 하나 이상의 포토랍두스 루미네센스 누클레오티드 서열을 확인하기 위한, 및/또는 포토랍두스 루미네센스 게놈에는 존재하지 않는 포토랍두스 루미네센스 이외의 다른 종, 특히 병원성 박테리아의 하나 이상의 게놈 누클레오티드 서열을 확인하기 위한 방법.a) 제1항 내지 제5항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에서 청구한 포토랍두스 루미네센스 누클레오티드 서열 또는 제54항 또는 제55항에서 청구한 게놈 라이브러리에 포함된 누클레오티드 서열을 다른 박테리아 종 게놈 서열과 정렬시키는 단계; 및b) 이 정렬로 얻은 데이타를 처리하여 한 게놈 또는 다른 한 게놈에만 존재하는 서열을 분리 및 확인하는 단계
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