CN102076856B - 用于提高植物中的氨基酸含量的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

苏氨酸是一种用于人类和动物饲料工业的必需氨基酸，其中，其在饲料配给中的含量可以显著影响重要的肉类来源诸如猪和家禽的生产成本。苏氨酸以及必需氨基酸赖氨酸和甲硫氨酸都是通过天冬氨酸家族途径合成的。天冬氨酸激酶(AK)是该途径中的第一种酶，它催化天冬氨酸的ATP依赖的磷酸化以形成β-天冬氨酰磷酸。AK组成了控制通过该途径的代谢通量的主要调节步骤，并且经受Lys和/或Thr的终产物抑制。本发明提供了一种在开发大豆植物和种子的过程中通过反馈抗性AK酶的过度表达产生高游离苏氨酸含量转基因大豆的方法。这些修饰提供了一种方法，以加强植物氮代谢和作物的生长表现。

Description

用于提高植物中的氨基酸含量的组合物和方法

相关申请的引用

本申请要求2008年6月30日提交的美国临时申请第61/077,043号的优先权。

序列表的引入

包含于2009年6月9日创建的、大小为35KB(在MicrosoftWindows中统计)的、文件名为MONS211WOsequencelisting.txt的文件的序列表包括23个核苷酸序列，本文通过参考完整引入。

发明领域

本发明涉及植物分子生物学及用于在植物中基因表达的植物基因工程和多核苷酸分子的领域。具体来说，本发明涉及对于基因序列的遗传修饰，其用于在植物中产生含量提高的氨基酸，用于食物和/或饲料应用。本发明还公开了产生和使用所述去调节(deregulated)的基因的方法。

发明背景

包括人类的单胃动物不能合成必需氨基酸(EAA)，包括：赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)和苏氨酸(Thr)。植物是人类和家畜消费的蛋白质和必需氨基酸的主要来源。然而，植物种子的氨基酸组合物对于人类和家畜的营养不是最佳均衡的。因此，在畜牧产业，常规购买昂贵的合成或微生物合成的EAA，并用作动物的粮食基和植物基食物的补充，以提高它们的生长和家畜产生的产物的营养价值。同样，人类食物通常用EAA补充剂强化以促进生长和提高健康。这种食品和饲料的补充导致与这些食物有关的费用大幅增加。

在能够合成适量的苏氨酸以及必需氨基酸赖氨酸(Lys)和甲硫氨酸(Met)的生物体中，这些氨基酸通过天冬氨酸家族途径来合成(图1)。该途径中的第一种酶天冬氨酸激酶(AK)，催化天冬氨酸(Asp)的ATP依赖的磷酸化以形成β-天冬氨酰磷酸。AK组成了控制通过生物合成途径的代谢通量的主要调节步骤，并且经受Lys和/或Thr的终产物抑制。这种生物合成酶诸如AK的终产物抑制导致在植物细胞中游离必需氨基酸的含量有限，并且使得在开发家畜动物和人类食物过程中补充合成的必需氨基酸成为必然。因此，存在对于以下策略的需要：增加植物和种子中的EAA含量，使得它们可用于家畜和人类食物。

本发明通过对不同作物的遗传修饰提供了一种对于收获后食物和饲料补充的替代方法。

发明内容

本发明提供了一种包含编码选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：10的多肽的核酸序列的分离的多核苷酸。

在某些方面，提供了一种编码与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9或SEQ ID NO：10的多肽序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的多肽的多核苷酸序列，其中，多肽显示不受赖氨酸和/或苏氨酸的终产物抑制的天冬氨酸激酶(AK)活性。在某些情况下，多核苷酸可以编码相对于野生型(wt)伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii)AK(即，由SEQ ID NO：6编码)具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的多肽。例如，编码的多肽可以在相应于伯氏致病杆菌AK的第257和/或359位的氨基酸位置处包含取代。在另一个例子中，编码的多肽可以在相应于野生型伯氏致病杆菌AK的第345-361位处包含氨基酸缺失。

在一个实施方式中，本发明提供了一种包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5的核酸序列或其互补序列的分离的多核苷酸。

在进一步的实施方式中，提供了一种包含与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的核酸序列的多核苷酸，其中，该核酸序列编码显示不受赖氨酸和/或苏氨酸的终产物抑制的天冬氨酸激酶(AK)活性的多肽。

在另一实施方式中，提供了包含在高严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6的完全互补序列杂交的核酸序列的多核苷酸，其中，该核酸序列编码显示不受赖氨酸和/或苏氨酸的终产物抑制的天冬氨酸激酶(AK)活性的多肽。

在另一实施方式中，本发明提供了一种由SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：5的多核苷酸编码的分离的多肽。

在另一实施方式中，本发明提供了一种由本文公开的多核苷酸编码的分离的多肽。例如，在某些方面，分离的多肽由选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5的多核苷酸编码，其中，该多肽选自SEQ ID NO：7至SEQID NO：10。

在另一实施方式中，本发明提供了一种包含本文公开的多核苷酸的重组DNA构建体，诸如包含编码选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：10的多肽的核酸序列的多核苷酸。

在另一实施方式中，本发明提供了一种包含本文公开的多核苷酸的重组DNA构建体，诸如包含编码选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：10的多肽的核酸序列的多核苷酸，其中，所述多核苷酸可操作地连接至在植物细胞中具有功能的启动子。

本发明的一个另外的目标是提供包含本文公开的多核苷酸的转化的细胞或生物体，诸如包含编码选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：10的多肽的核酸序列的多核苷酸；和包含所述多核苷酸的转化的细胞或生物体，其中，该生物体是选自棉花、小麦、甘蔗、糖用甜菜(sugarbeet)、大豆、水稻、油菜(canola)、玉米、高粱、大麦、芸苔属植物(Brassica)和拟南芥的植物。在另一实施方式中，本发明提供了一种产生作为动物饲料或人类食品的具有改进的性质的植物的方法，其中，所述方法包括：用重组构建体转化植物，该重组构建体包括在植物细胞中具有功能的启动子区域，该启动子区域可操作地连接到包含与所述性质相关的多肽的编码序列的多核苷酸，以及培养所述转化的植物，其中，所述多肽选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：10。可以修饰所述多肽以提高苏氨酸的产生，其中，所述多肽包括选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：10的序列。所述多肽可以用于改进发芽，其中，所述多肽包括选自SEQ ID NO：7至SEQID NO：10的序列。所述多肽也可以用于为植物提供增加的生物质或增强的植物生长，其中，所述多肽包括选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：10的序列。此外，所述多肽可以用于通过操纵植物的生长速度来提高作物产率或改善谷物组成，其中，所述多肽包括选自SEQ ID NO：7至SEQ IDNO：10的序列。所述修饰的多肽也可以用于通过操纵多肽序列来增加种子的游离氨基酸的含量，其中，所述多肽包括选自SEQ ID NO：7至SEQID NO：10的序列。所述多肽可以用于通过天冬氨酸激酶的修饰来加强种子发芽和生长，其中，所述多肽包括选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：10的序列。所述多肽可以用于通过天冬氨酸家族途径的修饰来增加芽生物质，其中，所述修饰包括天冬氨酸激酶多肽的修饰使得修饰的序列选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：10。

在再进一步的实施方式中，提供了一种包含本文公开的多核苷酸的植物部分。例如，植物部分可能是植物的叶、芽、根、果实或种子。在还进一步的方面，提供了由包含本文公开的核酸序列的植物部分制成的产品。例如，提供了包含本文公开的多核苷酸的面粉(flour)或粗粉(meal)。本文所述的植物产品可以进一步定义为食品，诸如人类食品或动物饲料。

在另一实施方式中，本发明提供了编码本文公开的分离的多肽(诸如SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：10的多肽)的重组核酸。

因此，本发明提供了一种转基因植物，其具有修饰的AK多肽，该AK多肽包含相对于野生型植物AK多肽包含至少一个修饰的AK氨基酸序列，其中，所述修饰的多肽包括：a)一种催化天冬氨酸的ATP依赖的磷酸化以形成β-天冬氨酰磷酸的酶；和b)其中，所述修饰的AK多肽不受赖氨酸和/或苏氨酸的终产物抑制。具有修饰的AK多肽的所述转基因植物可以选自甘蓝型油菜(Brassica napus)、拟南芥、大豆、玉米、小麦、水稻、苜蓿、高粱、大麦或棉花。

在另一实施方式中，本发明提供了一种转基因植物，其具有修饰的AK多肽，该AK多肽包含相对于野生型植物AK多肽包含至少一个修饰的AK氨基酸序列，其中，所述修饰的多肽包括：a)一种催化天冬氨酸的ATP依赖的磷酸化以形成β-天冬氨酰磷酸的酶；和b)其中，所述修饰的AK多肽不受赖氨酸和/或苏氨酸的终产物抑制，其中，所述至少一个修饰可以包括氨基酸取代。上述的氨基酸修饰可以是非丙氨酸对丙氨酸的取代或者非保守取代。所述氨基酸取代可以在选自以下的位置：a)相应于氨基酸257的位置；和b)相应于氨基酸359的位置。所述具有修饰的AK多肽的转基因植物可以包括至少一个氨基酸取代。可选择地，所述具有修饰的AK多肽的转基因植物可以包括至少两个氨基酸取代，每个氨基酸取代位于独立地选自以下的位置：a)相应于氨基酸257的位置；和b)相应于氨基酸359的位置。所述转基因植物AK多肽可以源自伯氏致病杆菌；和一个或多个氨基酸取代可以是非保守取代，或它们可以是非丙氨酸对丙氨酸的取代。在所述转基因AK多肽中，所述至少一个修饰可以包括调节结构域的截短。

在另一实施方式中，所述转基因AK多肽包括SEQ ID NO：8。

在另一实施方式中，所述转基因AK多肽不会结合赖氨酸。

因此，本发明提供包含修饰的AK多肽的种子，其在培养时相比作为修饰植物的来源的非转基因系提供含量提高的苏氨酸。

在进一步的实施方式中，本发明提供了一种编码本文公开的多肽(诸如选自SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：10的多肽)的重组核酸，其是表达载体，还包含可操作地连接到该重组核酸的启动子区域。此外，本发明提供了一种载体，该载体包含复制子和编码选自SEQ ID NO：7至SEQID NO：10的多肽的重组核酸。所述表达载体包括启动子区域，其中，启动子区域在植物细胞中是可操作的。所述启动子区域可以包括CaMV35S启动子、7s-α’(7Sα’)启动子或USP99启动子。所述启动子区域具有组织和/或器官特异性方式的转录活性。

在另一实施方式中，本发明提供了一种包括编码转基因AK多肽的转基因的转基因植物，所述转基因植物在其组织中表达更高含量的氨基酸苏氨酸。所述转基因植物也可以表达更高含量的其它氨基酸诸如精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸。所述转基因植物可以是单子叶植物或双子叶植物。

在另一实施方式中，本发明提供了一种包括编码转基因AK多肽的转基因的转基因植物，所述转基因植物在其组织中表达更高含量的氨基酸，其中，所述AK多肽是天冬氨酸家族途径中的酶。

在另一实施方式中，本发明提供了一种包括编码转基因AK多肽的转基因的转基因植物，所述转基因植物在其组织中表达更高含量的氨基酸苏氨酸，其中，所述植物或其部分用作饲料。

在另一实施方式中，本发明提供了一种包括编码转基因AK多肽的转基因的转基因植物，所述转基因植物在其组织中表达更高含量的氨基酸苏氨酸，其中，所述植物或其部分用作人类食物。

在另一实施方式中，本发明提供了一种包括编码转基因AK多肽的转基因的转基因植物，所述转基因植物在其组织中表达更高含量的氨基酸苏氨酸，其中，转基因AK多肽中的氨基酸取代为非丙氨酸对丙氨酸的取代或用相反电荷的氨基酸取代氨基酸。

在另一实施方式中，本发明提供了一种包括编码转基因AK多肽的转基因的转基因植物，所述转基因植物在其组织中表达更高含量的氨基酸苏氨酸，其中，转基因AK多肽中的至少一个修饰在EAAEMA基序或ALTLDTTG基序中。

在另一实施方式中，本发明提供了一种包括编码转基因AK多肽的转基因的转基因植物，所述转基因植物在其组织中表达更高含量的氨基酸苏氨酸，其中，在所述转基因AK多肽中的至少一个氨基酸取代为非丙氨酸对丙氨酸的取代或用相反电荷的氨基酸取代氨基酸。

在另一实施方式中，本发明提供了一种转基因植物，其具有修饰的AK多肽，该AK多肽包含相对于野生型植物AK多肽包含至少一个修饰的AK氨基酸序列，其中，所述修饰的多肽包括：a)一种催化天冬氨酸的ATP依赖的磷酸化以形成β-天冬氨酰磷酸的酶；和b)其中，所述修饰的AK多肽不受赖氨酸和/或苏氨酸的终产物抑制，其中，所述至少一个修饰可以包括氨基酸取代；并且，其中，每个氨基酸修饰是非丙氨酸对丙氨酸的取代或用相反电荷的氨基酸取代氨基酸。

在另一实施方式中，本发明提供了一种转基因植物，其具有修饰的AK多肽，该AK多肽包含相对于野生型植物AK多肽包含至少一个修饰的AK氨基酸序列，其中，所述修饰的多肽包括：a)一种催化天冬氨酸的ATP依赖的磷酸化以形成β-天冬氨酰磷酸的酶；和b)其中，所述修饰的AK多肽不受赖氨酸和/或苏氨酸的终产物抑制，其中，所述至少一个修饰可以包括氨基酸取代，所述氨基酸取代在独立地选自以下的位置：a)相应于氨基酸257的位置；和b)相应于氨基酸359的位置，其中，在相应于氨基酸257的位置的氨基酸取代为非丙氨酸对丙氨酸的取代或者非保守取代。

在另一实施方式中，本发明提供了一种转基因植物，其具有修饰的AK多肽，该AK多肽包含相对于野生型植物AK多肽包含至少一个修饰的AK氨基酸序列，其中，所述修饰的多肽包括：a)一种催化天冬氨酸的ATP依赖的磷酸化以形成β-天冬氨酰磷酸的酶；和b)其中，所述修饰的AK多肽不受赖氨酸和/或苏氨酸的终产物抑制，其中，所述至少一个修饰可以包括氨基酸取代，所述氨基酸取代在独立地选自以下的位置：a)相应于氨基酸257的位置；和b)相应于氨基酸359的位置，其中，在相应于氨基酸359的位置的氨基酸取代为非丙氨酸对丙氨酸的取代或者非保守取代。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生包含编码转基因AK多肽的转基因的转基因植物的方法，所述转基因植物在其组织中表达更高含量的氨基酸苏氨酸，所述方法包括将包含编码转基因AK多肽的转基因的载体引入植物。

在另一实施方式中，提供了一种产生转化的植物的方法，包括获得包含本公开的多核苷酸序列的植物细胞和从该多核苷酸序列再生植物。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的至少一种氨基酸的改良的植物系的方法，包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的苏氨酸的改良的植物系的方法，包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的苏氨酸的改良的植物系的方法，其中，改良的植物系包括在植物组织中的苏氨酸含量方面2-100倍的增加，包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的苏氨酸的改良的植物系的方法，其中，改良的植物系包括在植物组织中的苏氨酸含量方面5-100倍的增加，包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的苏氨酸的改良的植物系的方法，其中，改良的植物系包括在植物组织中的苏氨酸含量方面100倍的增加，包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种提高植物或其转化的子代的总游离氨基酸含量的方法，包括：用包含编码修饰的天冬氨酸激酶的分离多核苷酸的植物转化载体转化植物，其相比未转化的对照增加转化的植物中的游离氨基酸含量。

在另一实施方式中，本发明提供了一种提高植物或其转化的子代的总游离氨基酸含量的方法，包括：用包含编码修饰的天冬氨酸激酶的分离多核苷酸的植物转化载体转化植物，其相比未转化的对照增加转化的植物中的游离氨基酸含量，其中，所述载体包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

在另一实施方式中，本发明提供了一种提高植物或其转化的子代的总游离氨基酸含量的方法，包括：用包含编码修饰的天冬氨酸激酶的分离多核苷酸的植物转化载体转化植物，其相比未转化的对照增加转化的植物中的游离氨基酸含量，其中，所述载体包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

在另一实施方式中，本发明提供了一种提高植物或其转化的子代的总游离氨基酸含量的方法，包括：用包含编码修饰的天冬氨酸激酶的分离多核苷酸的植物转化载体转化植物，其相比未转化的对照增加转化的植物中的游离氨基酸含量，其中，所述载体包括SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

在另一实施方式中，本发明提供了一种提高植物或其转化的子代的总游离氨基酸含量的方法，包括：用包含编码修饰的天冬氨酸激酶的分离多核苷酸的植物转化载体转化植物，其相比未转化的对照增加转化的植物中的游离氨基酸含量，其中，所述载体包括SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

在另一实施方式中，本发明提供了一种提高植物或其转化的子代的总游离氨基酸含量的方法，包括：用包含编码修饰的天冬氨酸激酶的分离多核苷酸的植物转化载体转化植物，其相比未转化的对照增加转化的植物中的游离氨基酸含量，其中，转化的植物或其子代选自大豆、油菜、玉米、高梁或棉花。

在另一实施方式中，本发明提供了一种提高植物或其转化的子代的总游离氨基酸含量的方法，包括：用包含编码修饰的天冬氨酸激酶的分离多核苷酸的植物转化载体转化植物，其相比未转化的对照增加转化的植物中的游离氨基酸含量，其中，所述氨基酸是一种或多种必需氨基酸。

在另一实施方式中，本发明提供了一种提高植物或其转化的子代的总游离氨基酸含量的方法，包括：用包含编码修饰的天冬氨酸激酶的分离多核苷酸的植物转化载体转化植物，其相比未转化的对照增加转化的植物中的游离氨基酸含量，其中，所述载体还包含一种或多种可操作地连接的调节核苷酸序列。

在另一实施方式中，本发明提供了一种提高植物或其转化的子代的总游离氨基酸含量的方法，包括：用包含编码修饰的天冬氨酸激酶的分离多核苷酸的植物转化载体转化植物，其相比未转化的对照增加转化的植物中的游离氨基酸含量，其中，所述载体还包含一种或多种可操作地连接的调节核苷酸序列，其中，所述一种或多种调节核苷酸序列选自启动子、终止子、翻译增强子、用于在合适的宿主细胞中复制的核苷酸序列、用于整合进入基因组的核苷酸序列及其组合。

在另一实施方式中，本发明提供了一种提高植物或其转化的子代的总游离氨基酸含量的方法，包括：用包含编码修饰的天冬氨酸激酶的分离多核苷酸的植物转化载体转化植物，其相比未转化的对照增加转化的植物中的游离氨基酸含量，其中，转化的植物、其子代、其种子或其油间接用作食物或饲料。

在另一实施方式中，本发明提供了一种具有包括修饰的天冬氨酸激酶的基因构建体的转基因植物，该修饰的天冬氨酸激酶增强氮同化/代谢酶，使得氮同化/代谢酶在转基因植物中过度表达，且该转基因植物相比不包含该基因构建体的祖先植物显示：i)更快的生长速度，ii)成熟时更大的鲜重或干重，iii)更高的果实或种子产量，iv)更高的总植物氮含量，v)更高的果实或种子的氮含量，vi)整个植物中更高的游离氨基酸含量，vii)果实或种子中更高的游离氨基酸含量，viii)种子或果实中更高的蛋白质含量，或ix)植物组织中更高的蛋白质含量。

在另一实施方式中，本发明提供了一种具有基因构建体的转基因植物，该基因构建体包含修饰的天冬氨酸激酶，该修饰的天冬氨酸激酶增强氮同化/代谢酶，使得氮同化/代谢酶在转基因植物中过度表达，且该转基因植物相比不包含该基因构建体的祖先植物显示：i)更快的生长速度，ii)成熟时更大的鲜重或干重，iii)更高的果实或种子产量，iv)更高的总植物氮含量，v)更高的果实或种子的氮含量，vi)整个植物中更高的游离氨基酸含量，vii)果实或种子中更高的游离氨基酸含量，viii)种子或果实中更高的蛋白质含量，或ix)植物组织中更高的蛋白质含量，该基因构建体还包含植物启动子。

在另一实施方式中，本发明提供了一种具有基因构建体的转基因植物，该基因构建体包含修饰的天冬氨酸激酶，该修饰的天冬氨酸激酶增强氮同化/代谢酶，使得氮同化/代谢酶在转基因植物中过度表达，且该转基因植物相比不包含该基因构建体的祖先植物显示：i)更快的生长速度，ii)成熟时更大的鲜重或干重，iii)更高的果实或种子产量，iv)更高的总植物氮含量，v)更高的果实或种子的氮含量，vi)整个植物中更高的游离氨基酸含量，vii)果实或种子中更高的游离氨基酸含量，viii)种子或果实中更高的蛋白质含量，或ix)植物组织中更高的蛋白质含量，该基因构建体还包含植物启动子，其中，该植物启动子是CaMV 35S启动子。

在另一实施方式中，本发明提供了一种具有基因构建体的转基因植物，该基因构建体包含修饰的天冬氨酸激酶，该修饰的天冬氨酸激酶增强氮同化/代谢酶，使得氮同化/代谢酶在转基因植物中过度表达，且该转基因植物相比不包含该基因构建体的祖先植物显示：i)更快的生长速度，ii)成熟时更大的鲜重或干重，iii)更高的果实或种子产量，iv)更高的总植物氮含量，v)更高的果实或种子的氮含量，vi)整个植物中更高的游离氨基酸含量，vii)果实或种子中更高的游离氨基酸含量，viii)种子或果实中更高的蛋白质含量，或ix)植物组织中更高的蛋白质含量，该基因构建体还包含植物启动子，其中，该植物启动子是USP99启动子。

在另一实施方式中，本发明提供了一种具有基因构建体的转基因植物，该基因构建体包含修饰的天冬氨酸激酶，该修饰的天冬氨酸激酶增强氮同化/代谢酶，使得氮同化/代谢酶在转基因植物中过度表达，且该转基因植物相比不包含该基因构建体的祖先植物显示：i)更快的生长速度，ii)成熟时更大的鲜重或干重，iii)更高的果实或种子产量，iv)更高的总植物氮含量，v)更高的果实或种子的氮含量，vi)整个植物中更高的游离氨基酸含量，vii)果实或种子中更高的游离氨基酸含量，viii)种子或果实中更高的蛋白质含量，或ix)植物组织中更高的蛋白质含量，该基因构建体还包含植物启动子，其中，该植物启动子是7S-α’启动子。

在另一实施方式中，本发明提供了来自具有基因构建体的转基因植物的种子，该基因构建体包含修饰的天冬氨酸激酶，该修饰的天冬氨酸激酶增强氮同化/代谢酶，使得氮同化/代谢酶在转基因植物中过度表达，且该转基因植物相比不包含该基因构建体的祖先植物显示：i)更快的生长速度，ii)成熟时更大的鲜重或干重，iii)更高的果实或种子产量，iv)更高的总植物氮含量，v)更高的果实或种子的氮含量，vi)整个植物中更高的游离氨基酸含量，vii)果实或种子中更高的游离氨基酸含量，viii)种子或果实中更高的蛋白质含量，或ix)植物组织中更高的蛋白质含量，该基因构建体还包含植物启动子，其中，所述种子包含所述转基因的基因构建体。

在另一实施方式中，本发明提供了具有基因构建体的转基因植物的子代、克隆、细胞系或细胞，该基因构建体包含修饰的天冬氨酸激酶，该修饰的天冬氨酸激酶增强氮同化/代谢酶，使得氮同化/代谢酶在转基因植物中过度表达，且该转基因植物相比不包含该基因构建体的祖先植物显示：i)更快的生长速度，ii)成熟时更大的鲜重或干重，iii)更高的果实或种子产量，iv)更高的总植物氮含量，v)更高的果实或种子的氮含量，vi)整个植物中更高的游离氨基酸含量，vii)果实或种子中更高的游离氨基酸含量，viii)种子或果实中更高的蛋白质含量，或ix)植物组织中更高的蛋白质含量，该基因构建体还包含植物启动子，其中，所述子代、克隆、细胞系或细胞包含所述转基因的基因构建体。

在另一实施方式中，本发明提供了具有基因构建体的转基因植物或其祖先植物，该基因构建体包含修饰的天冬氨酸激酶，该修饰的天冬氨酸激酶增强氮同化/代谢酶，使得氮同化/代谢酶在转基因植物中过度表达，且该转基因植物相比不包含该基因构建体的祖先植物显示：i)更快的生长速度，ii)成熟时更大的鲜重或干重，iii)更大的果实或种子产量，iv)更高的总植物氮含量，v)更高的果实或种子的氮含量，vi)整个植物中更高的游离氨基酸含量，vii)果实或种子中更高的游离氨基酸含量，viii)种子或果实中更高的蛋白质含量，或ix)植物组织中更高的蛋白质含量，该基因构建体还包含植物启动子，其中，所述转基因植物及其祖先植物选自拟南芥、玉米、小麦、水稻、大豆、芸苔属植物。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生具有改进的农艺或营养特征的转基因植物的方法，该方法包括从不具有包括编码修饰的天冬氨酸激酶的基因构建体的转基因植物中鉴定出过度表达修饰的天冬氨酸激酶的转基因植物。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的精氨酸的改良的植物系的方法，包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的精氨酸的改良的植物系的方法，其中，改良的植物系包括在植物组织中的精氨酸含量方面2倍的增加，该方法包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的天冬酰胺的改良的植物系的方法，包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的天冬酰胺的改良的植物系的方法，其中，改良的植物系包括在植物组织中的天冬酰胺含量方面2-6倍的增加，该方法包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的谷氨酰胺的改良的植物系的方法，包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的谷氨酰胺的改良的植物系的方法，其中，改良的植物系包括在植物组织中的谷氨酰胺含量方面2倍的增加，包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的丝氨酸的改良的植物系的方法，包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的丝氨酸的改良的植物系的方法，其中，改良的植物系包括在植物组织中的丝氨酸含量方面10-30倍的增加，该方法包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的甲硫氨酸的改良的植物系的方法，包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的甲硫氨酸的改良的植物系的方法，其中，改良的植物系包括在植物组织中的甲硫氨酸含量方面2-5倍的增加，该方法包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的赖氨酸的改良的植物系的方法，包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

在另一实施方式中，本发明提供了一种产生相比未改良的亲本植物系具有增加量的赖氨酸的改良的植物系的方法，其中，改良的植物系包括在植物组织中的赖氨酸含量方面2倍的增加，该方法包括向植物引入天冬氨酸激酶的DNA序列的遗传改变的步骤。

关于本申请中所述的任何其他方法或组合物，可以采用本发明的方法和/或组合物的上下文中讨论的实施方式。因此，有关一种方法或组合物的实施方式也可以应用于本发明的其他方法和组合物。

附图说明

图1：天冬氨酸家族生物合成途径的示意图

图2：伯氏致病杆菌天冬氨酸激酶(AK)的截短分析

图3：pMON81662

图4：pMON81658

图5：pMON81689

图6：pMON101817

图7：pMON101818

图8：pMON101819

图9：pMON101820

图10：pMON101821

图11：pMON101822

图12：表达伯氏致病杆菌天冬氨酸激酶变异序列的转基因幼苗中芽生物质提高的图形描述。

序列的简要说明

SEQ ID NO：1，伯氏致病杆菌AK.E257K DNA；对应于pMON101818

SEQ ID NO：2，伯氏致病杆菌AK.T359I DNA；对应于pMON101819和pMON101820

SEQ ID NO：3，伯氏致病杆菌AK.T359I.nno DNA；对应于pMON101821和pMON101822

SEQ ID NO：4，伯氏致病杆菌AK.E257K/T359I DNA

SEQ ID NO：5，伯氏致病杆菌AK-ΔN-345至361DNA；对应于pMON81689

SEQ ID NO：6，伯氏致病杆菌AK.野生型DNA；对应于pMON101817

SEQ ID NO：7，伯氏致病杆菌AK.E257K氨基酸序列

SEQ ID NO：8，伯氏致病杆菌AK.T359I氨基酸序列

SEQ ID NO：9，伯氏致病杆菌AK.E257K/T359I氨基酸序列

SEQ ID NO：10，伯氏致病杆菌AK-ΔN-345至361氨基酸序列

SEQ ID NO：11，用于从基因组DNA分离Xb.AK的正向PCR引物

SEQ ID NO：12，用于从基因组DNA分离Xb.AK的反向PCR引物

SEQ ID NO：13，叶绿体导向肽(CTP1)

SEQ ID NO：14，用于分离大肠杆菌lysC的正向PCR引物

SEQ ID NO：15，用于分离大肠杆菌lysC的反向PCR引物

SEQ ID NO：16，大肠杆菌反馈不敏感(T352I)lysC DNA

SEQ ID NO：17，大肠杆菌反馈不敏感(T352I)lysC氨基酸序列

SEQ ID NO：18，XbAKXhoIRv反向引物

SEQ ID NO：19，XbAKNdeIFr正向引物

SEQ ID NO：20，XbAKE257KFr正向引物

SEQ ID NO：21，XbAKE257KRv反向引物

SEQ ID NO：22，XbAKT359IFr正向引物

SEQ ID NO：23，XbAKT359IRv反向引物

发明详述

本发明提供了分离的DNA、载体、宿主细胞和转基因植物，它们包含编码修饰的天冬氨酸激酶基因的分离的核酸，该修饰的天冬氨酸激酶基因在植物中表达后能够提供高含量的苏氨酸和其他天冬氨酸衍生的氨基酸。在一个实施方式中，分离的核酸编码修饰的天冬氨酸激酶(AK)。在其他实施方式中，分离的核酸编码基本上耐受游离赖氨酸的抑制作用的天冬氨酸激酶。修饰的天冬氨酸激酶的表达提高苏氨酸含量，例如，种子中的游离苏氨酸，超过没有这种表达的植物中存在的含量。

也提供了产生具有与增加的天冬氨酸激酶活性相关的核酸的转基因植物的方法，和产生能够产生高含量的苏氨酸的培养的细胞、植物组织、植物、植物部分和种子的方法。这种转基因植物可以优选地向其子代性传递产生高含量苏氨酸的能力。还描述了用于产生编码修饰的天冬氨酸激酶的分离的DNA的方法，和用于选择新的过量产生苏氨酸和/或耐受赖氨酸反馈抑制的基因型的细胞培养选择技术。例如，为了产生能够产生高含量的苏氨酸的大豆系，制备和表征包含本发明的至少一个分离的DNA的转基因大豆细胞，然后再生为植物。某些分离的DNA耐受赖氨酸的生长抑制。本发明提供的方法也可以用于在双子叶植物诸如其他豆类、以及在单子叶植物诸如谷物中产生含量提高的游离苏氨酸。

在本公开的上下文中，使用许多术语。术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”在本文中可以替代使用。这些术语包括核苷酸序列等。多核苷酸可以是单链或双链RNA或DNA的聚合物，其任选地含有合成的、非天然或改变的核苷碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可以由cDNA、基因组DNA、合成DNA的一种或多种片段或其混合物组成。本发明的分离的多核苷酸可以包括源自SEQ ID NOs：1、2、3、4或5的1300个连续核苷酸中的至少一个。

术语“分离的”多核苷酸指基本上不含其他核酸序列(如通常在其天然存在环境中发现的伴随或与之相互作用的其他染色体和染色体外DNA和RNA)的多核苷酸。分离的多核苷酸可以从其自然存在的宿主细胞纯化。本领域技术人员已知的常规的核酸纯化方法可以用于获得分离的多核苷酸。该术语也包括重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

如本文所用，转化的植物、植物组织、植物部分或植物细胞中的苏氨酸的“改变的”含量为大于或小于在相应的未转化的植物、植物组织、植物部分或植物细胞中发现含量的含量。

关于本发明的DNA分子、序列或片段所用的短语“基本上由…组成”定义为是指该DNA分子、序列或片段的主要部分编码天冬氨酸激酶。除非另有说明，该DNA分子、序列或片段一般不编码除天冬氨酸激酶之外的蛋白质。

本文所用的术语“互补于”意思是，核酸链的序列可以与参考多核苷酸序列的全部或部分杂交。举例说明，核苷酸序列“TATAC”与参考序列5′-TATAC-3′具有100％的同一性，而与参考序列5′-GTATA-3′100％互补。

如本文所用，“外源性的”天冬氨酸激酶是由分离的DNA编码的天冬氨酸激酶，所述分离的DNA已被引入宿主细胞中，而且优选与在细胞中以天然(native)、未转化状态存在的任何DNA序列不相同。“内源性的”或“天然的”天冬氨酸激酶是在宿主细胞或生物体中天然存在的天冬氨酸激酶。

如本文所用，在植物细胞、植物组织、植物部分或植物中“增加的”、“高的”或“提高的”游离苏氨酸含量为在未转化的植物细胞、植物组织、植物部分或植物(即，其中基因组没有被外源性天冬氨酸激酶核酸或其结构域的存在改变)中发现的含量的大约2至100倍、优选大约5至100倍、更优选大约10至100倍的含量。例如，在转化的植物种子中的游离苏氨酸含量与未转基化的植物种子(“起始材料”)中的含量相比较。

编码天冬氨酸激酶的DNA分子和编码转运肽的DNA分子或标记/报告基因是“分离的”，因为它们都是取自其自然来源，不再存在于它们通常存在的细胞中。这些分离的DNA分子可能已经至少部分在体外制备或操作，例如，从它们通常被发现的细胞中分离、纯化和扩增。这些分离的DNA分子也可以是“重组的”，因为它们已经与外源DNA分子或片段相结合。例如，重组DNA可以是分离的DNA，其可操作地连接到外源启动子或对于宿主细胞为内源性的启动子。该术语包括那些经生化纯化基本上除去了污染核酸和其他细胞成分的核酸。该术语也包括重组核酸和化学合成的核酸。

如本文所用，“天然的”基因是指尚未在体外改变的基因，即尚未在体外突变的“野生型”基因。

术语“质体”指的是植物细胞器的类别，包括造粉体、叶绿体、有色体、造油体(elaioplast)、初始质体(eoplasts)、白色质体(etioplast)、白色体(leucoplast)和原质体(proplastid)。这些细胞器是自我复制的，并包含通常被称为“叶绿体基因组”的基因组、大小为大约120至大约217kb的环状DNA分子，根据植物种类而异，通常含有反向重复区域。

如本文所用，“多肽”是指氨基酸的连续链，除分别具有氨基和羧基而且不是通过肽键连接的N-端和C-端氨基酸之外，其氨基酸都是通过肽键连接在一起的。多肽可以具有任意长度，可以翻译后修饰，例如，糖基化或磷酸化。

术语“5′UTR”是指基因编码区上游或5′的DNA的非翻译区。

术语“3′UTR”是指基因编码区下游或3′的DNA的非翻译区。

术语“基本上同源”是指在序列上至少大约90％相同的两个序列，这是使用默认参数，由本文所述的BestFit程序(第10版；Genetics ComputerGroup，Inc.，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，WI)确定的。

序列同一性的百分比优选使用序列分析软件包(第10版；GeneticsComputer Group，Inc.，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，WI)的“Best Fit”或“Gap”程序来确定。“Gap”利用Needleman andWunsch(1970)算法来找出最大化匹配数和最小化缺口(gap)数的两个序列的比对(alignment)。

“BestFit”使用Smith and Waterman(Smith和Waterman，1981；Smith等人，1983)的局部同源性算法，进行两个序列之间相似性的最优片段的最佳比对，并插入缺口以最大化匹配数。最优选使用Best Fit程序和使用默认参数确定百分比同一性。如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子以这种方式连接于编码区，使得该编码区的转录受该启动子控制和调节。可操作地连接启动子与编码区的方法是本领域公知的。

如本文使用，术语“基本上相同”指的是编码同样或几乎同样的蛋白质或多肽的多核苷酸分子的比较。四字母遗传密码(A、G、C和T/U)包括三个字母的密码子，其指导t-RNA分子由mRNA模板将氨基酸组装成多肽。具有一个以上的可以编码同样的氨基酸的密码子被称为简并。简并密码子用来构建基本上相同的编码同样的多肽的多核苷酸分子，其中，这些多核苷酸分子具有以下的核苷酸序列：当沿其整个长度相比时，它们彼此至少85％相同，更优选彼此86％至90％相同，甚至更优选彼此91％至95％相同，或最优选彼此96％至99％相同。这些序列可能由于一个或多个碱基上的变化(包括具有截短或缺失的编码区)有所不同，但仍编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽。

用于本发明的“非天然多核苷酸”是根据本发明的方法设计的DNA序列，并被制备为分离的DNA分子，用于在宿主细胞中提供蛋白质表达的DNA构建体中，并用于克隆进入适当的构建体或本领域的技术人员已知的其他用途的目的。可以获得用于这些目的的计算机程序，包括但不限于序列分析软件包，Genetics Computer Group(GCG)，Inc.，University ofWisconsin Biotechnology Center，Madison，WI 53711的“BestFit”或“Gap”程序。可以通过本领域已知的一种或多种方法，包括但不限于重叠PCR和化学合成，制备非天然的多核苷酸。本发明的非天然的多核苷酸分子基本上与编码相同或几乎相同的蛋白质的其他多核苷酸相同。

术语“翻译”是指相应的基因产物的产生，即由mRNA产生肽、多肽或蛋白质。

如本文所用，术语“营养强化的”是指相比未转化的植物细胞、植物组织、植物部分或植物(即，其中基因组没有被外源性核酸的存在改变)中的同样氨基酸的含量，植物细胞中的特定氨基酸具有提高的、增加的、或高的含量。例如，在转化的植物种子中的游离苏氨酸的含量与未转化的植物种子(“起始材料”)中的含量相比较。

如本文所用，“表达”是指基因转录以产生相应的mRNA和该mRNA翻译以产生相应的基因产物(即肽、多肽或蛋白质)的过程。

“增强的表达”是指相比未转化的植物细胞、植物组织、植物部分或植物(即，其中基因组没有被外源性核酸的存在改变)中的同样氨基酸的含量，植物细胞中的特定氨基酸具有提高的、增加的、或高的含量。

如本文所用，“饲料”是指用于饲养动物的材料，包括但不限于草料、粗饲料(fodder)和浓缩物。

如本文所用，“食品”是指人类摄入的物质，且含有可代谢产生能量的营养物质。

如本文所用，术语“基因”是指染色体DNA、质粒DNA、cDNA、合成的DNA或编码肽、多肽、蛋白质或RNA分子的其他DNA。

宿主或宿主生物体包括细菌细胞、真菌、动物和动物细胞、植物和植物细胞或包括原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、苗、胚胎和花粉的任何植物部分或组织。

如本文所用，转化是指将核酸引入接受宿主。已经受上述定义的转化的细胞被认为是转化的细胞。已经受上述定义的转化的生物体被认为是转化的生物体。

如本文所用，转基因是指核酸分子的任何片段，其由技术人员插入细胞或其祖先内，并成为由该细胞发育的植物或动物的基因组的一部分。这种转基因可以包括对于转基因植物或动物部分或全部是外源性的(即，外来的)基因，或可以代表具有与植物或动物的内源性基因的同一性的基因。

如本文所用，“转基因”的含义是任何细胞，其包含由技术人员插入细胞或其祖先中并成为由该细胞发育的植物或动物的基因组的一部分的核酸分子。

“密码子简并性”是指在不影响编码的多肽的氨基酸序列的情况下，允许核苷酸序列变异的遗传密码的分歧。因此，本发明涉及包括编码本文提出的氨基酸序列的全部或大部分的核苷酸序列的任何核酸片段。熟练的技术人员在使用核苷酸密码子确定给定的氨基酸时熟悉特定的宿主细胞显示的“密码子偏差”。因此，当合成用于改善在宿主细胞中表达的核酸片段时，需要设计核酸片段，使得其密码子使用频率接近宿主细胞优选的密码子使用频率。

术语“质粒”是指环形双链(ds)DNA构建体，其用作克隆载体，并在许多细菌和某些真核生物中形成染色体外的自我复制的遗传元件。

导致在特定位置产生化学相当的氨基酸但不影响所编码的多肽的功能性质的核酸片段中的改变是本领域公知的。因此，疏水氨基酸丙氨酸的密码子可以被编码另一种较不疏水的残基诸如甘氨酸或更疏水的残基诸如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子取代。这是术语“非丙氨酸对丙氨酸的取代”或“非保守取代”的含义。

类似地，导致一个带负电荷的残基取代另一个残基诸如天冬氨酸取代谷氨酸，或一个带正电荷的残基取代另一个残基诸如赖氨酸取代精氨酸的变化，也可以预计产生功能相当的产物，且被称为“保守取代”。导致多肽分子的N端和C端部分改变的核苷酸的变化，也不会被预期改变多肽活性。每个被提出的修饰在本领域的常规技术之内，确定编码产物的生物活性的保留也在本领域的常规技术之内。

变异或修饰的氨基酸序列是这样的：其中，非丙氨酸对丙氨酸的取代、非保守或保守的取代改变了序列中的一个或多个氨基酸。在进行这些变化时，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。氨基酸亲水指数在使蛋白质具有相互作用生物功能中的重要性一般可为本领域的技术人员所理解(Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.，157：105-132，1982)。可以认为，氨基酸的相对亲水特征对于产生的蛋白质的二级结构有贡献，其二级结构又限定了蛋白质与其他分子例如底物的相互作用。

根据其疏水性和电荷性质，每个氨基酸已被分配了亲水指数。这些是：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。

本领域内的技术人员已知，某些氨基酸可以被具有类似的亲水指数或得分的其他氨基酸取代，并仍然产生具有类似生物活性的蛋白质，即，仍然获得具有生物功能的蛋白质。在进行这样的变化时，优选其亲水指数在2之内的氨基酸的取代，更优选在1之内的氨基酸的取代，最优选在0.5之内的氨基酸的取代。

本领域内的技术人员也可以理解，可以根据亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利第4,554,101号(Hopp)记载，受其邻近的氨基酸的亲水性控制，蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学性质相关。下面的亲水性值已被分配给氨基酸：精氨酸/赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸/组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸/异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。

可以理解，一种氨基酸可以被另一种具有类似的亲水性得分的氨基酸取代，并仍然导致具有类似的生物学活性的蛋白质，即仍然获得具有生物功能的蛋白质。在进行这样的变化中，优选其亲水指数在2之内的氨基酸的取代，更优选在1之内的氨基酸的取代，最优选在0.5之内的氨基酸的取代。

如上所述，因此氨基酸取代是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种上述特征的示例性的取代是本领域的技术人员公知的，且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。如果这些变化使得蛋白质相对于作为构造它们的来源的未修饰多肽，具有改善的瘤胃抗性、增加的蛋白水解抗性或者同时具有改善的瘤胃抗性和增加的蛋白水解抗性，也可以使用预期不是有利的变化。

术语“杂交”一般指核酸分子通过互补碱基链配对连接的能力。当核酸分子在适当条件下接触(另外参见，下面的“高严格性条件”)时，这种杂交可能发生。

在杂交的上下文中的术语“高严格性条件”是本领域公知的(参见，例如，Sambrook等人，(1989)的0.47-9.51章节；及Sambrook和Russell，(2001)，本文通过参考引用)。例如，严格性条件如下：(1)使用低离子强度和高温用于清洗，例如，在50℃下，0.015M NaCl/0.0015M的柠檬酸钠(SSC)；0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，或(2)在杂交过程中采用变性剂诸如甲酰胺，例如，在42℃下，使用50％甲酰胺，其含有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5，以及750mM NaCl，75mM的柠檬酸钠。另一个例子是在42℃下，使用50％甲酰胺、5×SSC的(00.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt′s溶液，超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)和10％硫酸葡聚糖，在42℃下用0.2x SSC和0.1％SDS清洗。

术语“终产物抑制”指在合成途径的一个步骤中酶活性的下降，其是由该途径的最终产物的积累造成的。例如，AK酶的活性可以被赖氨酸和/或苏氨酸抑制，赖氨酸和/或苏氨酸是涉及AK的合成途径的最终产物。因此，在某些方面，本文所述的AK酶是不受赖氨酸和/或苏氨酸的终产物抑制的酶，这意味着最终产物诸如赖氨酸和苏氨酸具有下降的抑制AK活性的能力(相比野生型AK酶的抑制)。在某些情况下，不受赖氨酸或苏氨酸的终产物抑制的AK酶，显示降低的与赖氨酸和/或苏氨酸的结合。

“基因”是指一种核酸片段，其表达一种特定的蛋白质，包括编码序列之前的(5′非编码序列)和之后的(3′非编码序列)调节序列。“天然基因”是指在自然界中发现的具有其自身的调节序列的基因。“嵌合基因”是指非天然基因的任何基因，其包括未在自然界中一起发现的调节和编码序列。因此，嵌合基因可以包括来自不同的来源的调节序列和编码序列，或来自同一来源但以与在自然界中发现的不同的方式排列的调节序列和编码序列。“内源性基因”是指位于生物体的基因组中自然位置的天然基因。“外来的”基因是指不是在宿主生物体中正常发现、而是通过基因转移引入宿主生物体的基因。外来的基因可以包括插入非天然的生物体或嵌合基因的天然基因。“转基因”是通过转化程序已经被引入基因组的基因。

“编码序列”或“结构基因”是指编码特定的氨基酸序列或功能性RNA(诸如，例如，与核糖体结构相关的RNA或转移RNA(tRNA))的核苷酸序列。“调节序列”或“调节基因”是指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、之中或下游(3′非编码序列)并影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译引导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。

“启动子”指能够控制编码序列或功能RNA的表达的核苷酸序列。一般情况下，编码序列位于启动子序列的3′。启动子序列由近端和更远端上游元件组成，后面的元件通常被称为增强子。因此，“增强子”是一种核苷酸序列，其可以刺激启动子活性，且可以是启动子的先天元件或为了提高含量或启动子的组织特异性而插入的异源元件。启动子可以全部源自天然基因，或由源自自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，甚至包括合成的核苷酸片段。本领域的技术人员可以理解，不同的启动子可以在不同组织或细胞类型中，或在发育的不同阶段，或响应不同的环境条件，引导基因表达。导致核酸片段在大多数细胞类型中在大部分时间表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。用于植物细胞中的各类新启动子不断被发现；大量的例子可以在Okamuro and Goldberg，Biochemistry of Plants，15：1-82(1989)中发现。本领域的技术人员进一步认识到，调节序列的准确界限一般尚未完全确定，因此，位于编码序列上游(即5′)的各种长度的核酸片段可以具有相同的启动子活性。

生物质(biomass)是指活着的和最近死亡的生物材料，其可以用作燃料或用于工业生产。最常见的是，生物质是指生长用作生物燃料的植物物质，但它也包括用于产生纤维、化学品、食品和热的植物或动物物质。

本文所用的增强的活力/生物质是植物的生长特征，由此相比在野生型植物细胞、植物组织、植物部分或植物(即，其中基因组并没有因外源性核酸的存在而改变)中发现的植物材料的尺寸，在种子发芽后地面之上的植物材料具有升高、增加或更大的尺寸。例如，增强的活力可以由转基因植物比野生型植物更高、更茂盛、更多叶和具有更深绿色的植物部分证明。

终产物抑制是指在代谢途径中，由下游代谢物或产物对细胞代谢物或产物活性的调节。

术语“载体”是指设计用于在不同的宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有在外来的细胞中掺入和表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体可商购。适当的表达载体的选择在本领域的技术人员的能力之内。

复制子是从单一复制来源复制的DNA分子或RNA分子、或DNA或RNA的区域。

转录活性是指任何多核苷酸分子被转录成RNA分子的能力。已知如下的方法：以一种方式将构建体引入细胞，使得可转录的多核苷酸分子被转录为功能mRNA分子，该功能mRNA分子被翻译和因此被表达为蛋白质产物。这样的多核苷酸分子可以被理解为具有转录活性。

必需氨基酸是那些不能由生物体从头合成因而必须在饮食中提供的氨基酸。

游离氨基酸是那些没有结合到其他细胞成分(包括但不限于，蛋白质、细胞壁成分和细胞器)的氨基酸。

术语“可操作地连接”是指单一核酸片段上的两个或多个核酸片段的结合，使得一个的功能受另一个影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列在该启动子的转录控制之下)时，它可操作地连接至该编码序列。编码序列可以以有义或反义方向可操作地连接至调节序列。

本发明涉及用于获得产生含量升高的游离苏氨酸的植物的新的核酸和方法。过量产生是由于编码修饰的天冬氨酸激酶的核酸的引入和表达。

天然植物天冬氨酸激酶对于赖氨酸的反馈抑制一般都相当敏感。这种抑制构成了调节苏氨酸合成途径的关键机制。因此，活性更高、更有效或被赖氨酸抑制程度更小的天冬氨酸激酶可能会产生含量升高的苏氨酸。根据本发明，修饰的伯氏致病杆菌天冬氨酸激酶尤其可用于产生高含量的苏氨酸。

为了在植物或选定的宿主细胞中产生高含量的苏氨酸，分离选定的天冬氨酸激酶核酸，且可以在体外操作，以包括在植物细胞或其他细胞类型中进行基因表达所需要的调节信号。由于据报道植物中的苏氨酸生物合成途径存在于质体中，外源性的天冬氨酸激酶核酸或被引入质体中或通过添加编码氨基末端质体转运肽的核酸片段来修饰。这种质体转运肽可以引导天冬氨酸激酶基因产物进入质体。在某些情况下，天冬氨酸激酶可能已经包含质体转运序列，在这种情况下不需要添加。

为了改变苏氨酸的生物合成，编码天冬氨酸激酶活性的核酸必须被引入植物细胞或其他宿主细胞，并且直接或间接地鉴定这些转化的细胞。完整的天冬氨酸激酶或其有用的部分都可以使用。天冬氨酸激酶被稳定掺入植物细胞的基因组。控制天冬氨酸激酶表达的转录信号必须被植物细胞或其他宿主细胞识别，并且在其中是有功能的。也就是说，天冬氨酸激酶必须转录成信使RNA(mRNA)，且该mRNA在植物细胞核中必须是稳定的，且被完整地运送至细胞质用于翻译。天冬氨酸激酶mRNA必须具有适当的翻译信号，以被植物细胞核糖体识别和正确地翻译。多肽基因产物必须基本上避开细胞质中的蛋白水解攻击，被转运至正确的细胞区室(例如，质体)，并能够采取赋予酶活性的三维构象。天冬氨酸激酶必须进一步能够在苏氨酸及其衍生物的合成中发挥作用；也就是说，它必须位于催化生物合成的旁侧步骤的天然植物酶附近(大概在质体中)，以获得所需的底物和传递合适的产物。

即使所有这些条件得到满足，成功的苏氨酸的过量产生也不是可预测的事件。一些转基因的表达可能受附近染色体元件的负面影响。如果通过修饰获得高含量的苏氨酸以减少反馈抑制，可能还有其他的控制机制补偿天冬氨酸激酶步骤的降低的调控。可能有提高累积的氨基酸的分解率的机制。苏氨酸和相关氨基酸也必须以对于植物没有毒性的含量水平过量产生。最后，引入的性状必须稳定和可遗传，以允许商业开发和利用。

可以通过如Sambrook等人，(1989)；Sambrook和Russell，(2001)所述的标准方法鉴定和分离编码天冬氨酸激酶的核酸。例如，可以通过筛选由源自特定细胞型、细胞系、原代细胞或组织的核酸产生的DNA或cDNA文库鉴定编码天冬氨酸激酶或其结构域的DNA序列。此外，可以通过核酸扩增程序使用从这些物种的任何一种分离出的基因组DNA、mRNA或cDNA来分离天冬氨酸激酶核酸。

对于编码天冬氨酸激酶编码序列的全部或一部分的DNA片段的筛选可以通过以下方法来完成：从基因组或cDNA文库中筛选噬斑用于与来自其他生物体的天冬氨酸激酶基因的探针杂交，或从cDNA表达文库中筛选噬斑用于结合特异性识别天冬氨酸激酶的抗体。与来自其他生物体的天冬氨酸激酶探针杂交的DNA片段和/或携带与抗天冬氨酸激酶抗体具有免疫反应性的DNA片段的噬斑可以被亚克隆到载体中，并测序和/或用作探针，以鉴定编码需要的天冬氨酸激酶基因的全部或一部分的其他cDNA或基因组序列。

例如，可以通过随机寡核苷酸引发(oligo priming)或寡聚dT引发来制备cDNA文库。可以用天冬氨酸激酶特异性探针或抗体筛选含有DNA片段的噬斑。编码天冬氨酸激酶基因的一部分的DNA片段可以用来亚克隆和测序，并用作探针来鉴定基因组天冬氨酸激酶基因。编码细菌或植物天冬氨酸激酶基因的一部分的DNA片段可以通过确定与其他已知的天冬氨酸激酶基因的序列同源性或通过与天冬氨酸激酶特异性信使RNA的杂交来验证。一旦获得编码天冬氨酸激酶的5′、中间和3′端部分的cDNA片段，它们可以用作探针以鉴定和克隆来自基因组文库的天冬氨酸激酶基因的完整基因组拷贝。

天冬氨酸激酶基因的一个或多个基因组拷贝的部分可以被测序，且基因的5′端可以通过标准方法来鉴定，包括DNA序列与其他天冬氨酸激酶基因的同源性或通过RNAase保护分析，例如，如Sambrook等人，(1989)；(2001)所述。靶基因的3′和5′端也可以通过基因组序列数据库的计算机搜索使用已知的AS编码区来定位。一旦基因5′端的部分被鉴定，可以通过标准方法(包括使用在基因的5′端与DNA序列互补的寡核苷酸引物克隆或聚合酶链反应(PCR)合成)来获得天冬氨酸激酶基因的完整的拷贝。分离的天冬氨酸激酶基因的全长拷贝的存在可以通过杂交、部分序列分析或通过玉米天冬氨酸激酶酶的表达来进行验证。

定点诱变可以用来在各个位点处产生氨基酸取代、缺失和插入。在伯氏致病杆菌天冬氨酸激酶编码区之内进行的具体突变的例子包括以下：

在大约257位，用Lys取代Glu(参见，例如SEQ ID NO：1和4)；

在大约359位，用Ile取代Thr(参见，例如SEQ ID NO：2、3和4)。

类似的修饰，可以通过待突变的天冬氨酸激酶的氨基酸序列与伯氏致病杆菌天冬氨酸激酶的氨基酸序列的比对在任何天冬氨酸激酶的类似位置进行。可以用于比对的伯氏致病杆菌天冬氨酸激酶氨基酸序列的一个例子是SEQ ID NO：4。

一般情况下，植物中的细菌基因的表达可能经常导致低效的蛋白质积累。这可以归因于宿主植物中并非最佳地使用氨基酸密码子，导致对应于细菌基因的稀有密码子的某些tRNA的限制，隐性mRNA加工位点的存在，或由于翻译的无效起动。对于植物中的高效细菌基因表达的主要阻断似乎处于翻译水平，这可以由烟草、番茄和棉花中的野生型cry1A(b)和cry1A(c)基因的低水平表达证明(Perlak等人，1991年)。一种优化或修正蛋白质的低水平表达的有效方法是按照宿主生物体的有利的密码子使用偏好对转基因DNA序列进行修饰。此外，作为富含A+T的类似植物内含子的区域(Goodall和Filipowich，1989)或潜在的聚腺苷酸化信号序列和mRNA剪接位点(Dean等人，1986)的修饰可能提高宿主生物体中的mRNA的稳定性。

本文提供的任何DNA分子的编码区也可以被优化，用于在选定的生物体，例如，选定的植物或其他宿主细胞类型中表达。具有用于选择的植物的优化密码子使用的DNA分子的一个例子是具有SEQ ID NO：3的伯氏致病杆菌天冬氨酸激酶DNA分子。这种优化的伯氏致病杆菌天冬氨酸激酶DNA(SEQ ID NO：3)具有与SEQ ID NO：2的72.6％的同一性。

一旦获得和扩增编码天冬氨酸激酶的核酸，它可操作地结合启动子，并且，任选地与其他元件结合以形成转基因。

大多数基因具有被称为启动子且调节基因表达的DNA序列区域。启动子区域通常出现在原核和真核细胞中的编码序列上游的侧翼DNA序列中。启动子序列提供对下游基因序列的转录的调节，通常包括大约50至大约2,000个核苷酸碱基对。启动子序列还含有调节序列诸如增强子序列，其可以影响的基因表达的水平。一些分离的启动子序列可以提供异源基因即不同于天然或同源基因的基因的基因表达。启动子序列也已知为强或弱或可诱导的。强启动子提供高水平的基因表达，而弱启动子提供很低水平的基因表达。可诱导的启动子是响应外源添加的试剂或环境或发育刺激物而提供基因表达的打开和关闭的启动子。启动子还可以提供组织特异性的和发育的调节。对于异源基因而言是强启动子的分离的启动子序列是有利的，因为它提供足够的基因表达水平，以使转化的细胞容易检测和选择，并在需要时提供高水平的基因表达。

本发明的转基因中的启动子可以提供由编码天冬氨酸激酶的DNA序列表达天冬氨酸激酶。优选地，表达该编码序列从而导致植物组织中(例如，植物种子内)苏氨酸含量增加。在另一实施方式中，表达该编码序列从而导致植物细胞对反馈抑制或对赖氨酸的生长抑制的耐受性增加，或导致细胞中的总苏氨酸含量增加。启动子也可以是可诱导的，使得基因表达可以通过外源添加的试剂打开或关闭。例如，根据向转化的细菌细胞中加入的异硫代丙基半乳糖苷的含量，细菌启动子诸如P_tac启动子可以被诱导至不同的基因表达水平。也可以优选地将基因与在植物中提供组织特异性表达或发育调节基因表达的启动子进行结合。本领域技术人员可以获得在实践本发明中有用的许多启动子。

优选的启动子通常包括但不限于在细菌、噬菌体、质体或植物细胞中发挥功能的启动子。有用的启动子包括CaMV 35S启动子(Odell等人，1985)、CaMV 19S(Lawton等人，1987)、nos(Ebert等人，1987)、Adh(Walker等人，1987)、蔗糖合酶(Yang等人，1990)、α微管蛋白、油菜籽蛋白(napin)、肌动蛋白(Wang等人，1992)、cab(Sullivan等人，1989)、PEPCase启动子(Hudspeth等人，1989)、玉米L3油质蛋白启动子、P-Zm.L3(美国专利6,433,252)、USP99启动子(美国专利7,078,588)、7S-α’-伴大豆球蛋白启动子(Beachy等人，1985)、7Sα’启动子(美国专利6,825,398)，或那些与R基因复合体有关的启动子(Chandler等人，1989)。其他有用的启动子包括噬菌体SP6、T3和T7启动子。

也可以使用质体启动子。大多数质体基因含有用于多亚基质体编码的RNA聚合酶(PEP)以及单亚基核编码的RNA聚合酶的启动子。核编码的聚合酶(NEP)启动子的共有序列和一些天然质体基因的特异性启动子序列的列表可以在Hajdukiewicz等人(1997)中找到，本文通过参考完整引入本文中。

可使用的质体启动子的例子包括玉米质体RRN(ZMRRN)启动子。当存在拟南芥质体RNA聚合酶时，ZMRRN启动子可以驱动基因表达。可以用于本发明的类似的启动子是大豆质体RRN(SOYRRN)和烟草质体RRN(NTRRN)启动子。所有这三种启动子可以被拟南芥质体RNA聚合酶识别。RRN启动子的一般特征由Hajdukiewicz等人和美国专利6,218,145描述。

此外，转录增强子或增强子的重复可以用于增加特定启动子的表达。这样的增强子的例子包括但不限于，来自CaMV 35S启动子和章鱼氨酸合酶基因的元件(Last等人，美国专利5,290,924)。例如，可以设想，可以构建用于本发明的载体以包括ocs增强子元件。该元件首次被鉴定为来自土壤杆菌的章鱼氨酸合酶(ocs)基因的16bp的回文增强子(Ellis等人，1987)，并存在于至少10个其他启动子中(Bouchez等人，1989)。可以提出：当应用于单子叶植物转化的上下文中时，使用增强子元件诸如ocs元件，尤其是元件的多份拷贝，会用来提高相邻启动子的转录水平。组织特异性启动子，包括但不限于根细胞启动子(Conkling等人，1990)以及组织特异性增强子(Fromm等人，1989)，也被预期特别有用，因为这些都是可诱导的启动子诸如ABA-和膨胀诱导的启动子等。

由于转录起始位点和编码序列起点之间的DNA序列，即非翻译前导序列，可以影响基因表达，人们也可以希望使用特定的前导序列。可以使用本领域技术人员可用的任何前导序列。例如，优选的前导序列通过增加或维持mRNA的稳定性和/或通过防止不合适的翻译启动，引导连接的基因的最佳表达水平(Joshi，1987)。这种序列的选择可以由本领域技术人员决定。可想到源自于在双子叶植物和特别是在大豆中高度表达的基因的序列。

在某些情况下，天冬氨酸激酶的极高的表达不是必需的。例如，使用本发明的方法，可以产生如此高水平的天冬氨酸激酶，使得底物而不是酶的可用性可能会限制产生的苏氨酸的含量。在这种情况下，可以由本领域技术人员选择更温和或调节的表达水平。这样的熟练的技术人员可以容易地调节或调控表达的水平，例如，通过使用弱启动子，或通过使用发育调节的或组织特异性的启动子。

编码感兴趣的天冬氨酸激酶的核酸也可以包括质体转运肽，以方便天冬氨酸激酶多肽转运到质体，例如转运到叶绿体。编码选择的质体转运肽的核酸(例如，SEQ ID NO：13)一般与天冬氨酸激酶编码序列在框架内连接。然而，质体转运肽可以被置于天冬氨酸激酶的N-末端或C-末端。

构建体还包括感兴趣的核酸(例如，编码天冬氨酸激酶的DNA)连同作为转录终止信号发挥作用并且允许产生的mRNA聚腺苷酸化的核酸序列。这种转录终止信号被置于感兴趣的编码区的3′或下游。虽然也考虑本领域技术人员已知的其他转录终止信号，设想的优选的转录终止信号包括来自根癌土壤杆菌的胭脂碱合酶基因的转录终止信号(Bevan等人，1983)、来自根癌土壤杆菌的章鱼氨酸合酶基因的终止子、水稻(Oryza sativa)谷蛋白1基因的3’-UTR(Os-gtl；SEQ ID NO：148)和来自土豆或西红柿的编码蛋白酶抑制剂I或II的基因的3′端。需要时，可以进一步包括调节元件，诸如Adh内含子1(Callis等人，1987)、蔗糖合酶内含子(Vasil等人，1989)或TMV omega元件(Gallie等人，The PlantCell，1：301(1989))。这些3′非翻译调节序列可以如An(1987)所述获得，或已存在于从诸如Clontech，(Palo Alto，California)的商业来源获得的质粒中。通过标准方法，3′非翻译调节序列可以可操作地连接到天冬氨酸激酶基因的3’末端。用于实践本发明的其他这样的调节元件是本领域技术人员已知的。

DNA构建体可以包括由异源启动子、编码修饰的天冬氨酸激酶蛋白质的DNA分子和转录终止子可操作地连接组成的第一表达盒。这种DNA构建体可以进一步包括可操作地连接的第二表达盒，包括异源启动子、编码第二蛋白质的DNA分子和转录终止子。

可选择的标记基因或报告基因也可用于本发明。这种基因可以赋予表达该标记基因的细胞独特的表型，从而使这种转化细胞区别于没有该标记的细胞。可选择的标记基因赋予一种性状，人们可以通过化学方法“选择”，即，通过使用选择试剂(例如，除草剂、抗生素等)“选择”该性状。报告基因或可筛选的基因赋予一种性状，人们可以通过观察或检测来鉴定，即，通过“筛选”(例如，R-基因座性状)来鉴定该性状。当然，适当的标记基因的许多例子是本领域公知的，且可以用于实践本发明。

用于本发明的可能的可选择的标记包括但不限于：neo基因(Potrykus等人，1985)，其编码新霉素抗性且可以使用卡那霉素、G418等选择；bar基因，其编码双丙氨膦抗性；编码改变的EPSP合酶蛋白质的基因(Hinchee等人，1988)，从而赋予草甘膦抗性；腈水解酶基因，诸如来自臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)的bxn，其赋予溴苯腈抗性(Stalker等人，1988)；突变型乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其赋予咪唑啉酮、磺脲类或其他ALS-抑制化学品抗性(EP 154 204(1985))；甲氨蝶呤抗性DHFR基因(Thillet等人，1988)；或茅草枯(dalapon)脱卤素酶基因，其赋予抗对除草剂茅草枯的抗性。当使用突变型EPSP合酶基因时，可以通过掺入合适的质体转运肽(CTP)来实现另外的好处。

能够在系统中用于选择转化体的可选择的标记基因的说明性实施方式为编码膦丝菌素乙酰转移酶的基因，诸如来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因，或来自绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的pat基因(美国专利5,550,318，本文通过参考引入本文)。膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)使除草剂双丙氨膦、膦丝菌素(PPT)中的活性成分失活。PPT抑制谷氨酰胺合成酶(Murakami等人，1986；Twell等人，1989)造成氨的迅速积累和细胞死亡。

可以采用的可筛选的标记包括但不限于，编码其各种发色底物已知的酶的β-葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)；R-基因座基因，其编码调节在植物组织中产生花青素色素(红色)的产物(Dellaporta等人，1988)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等人，1978)，其编码已知其各种发色底物的酶(例如，PADAC，一种发色头孢菌素)；xy1E基因(Zukowsky等人，1983)，其编码可以转化发色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikatu等人，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等人，1983)，其编码能够将酪氨酸氧化为多巴和多巴醌、其然后缩合形成容易检测的化合物—黑色素的酶；β-半乳糖苷酶基因，其编码具有多种发色底物的酶；萤光素酶(lux)基因(Ow等人，1986)，其允许生物发光检测；或甚至是水母发光蛋白基因(Prasher等人，1985)，其可以用于钙敏感的生物发光检测或绿色荧光蛋白基因(Niedz等人，1995)。可以使用以下方法来检测lux基因在转化细胞中的存在：例如，X射线片、闪烁计数、荧光光度法、低光摄像机、光子计数相机或多孔化学发光法。还设想：可开发该系统用于生物发光的群体筛选，诸如在组织培养板上或甚至用于完整植物的筛选。

此外，可以构建和采用转基因，以提供将基因产物靶向植物细胞的细胞内区室，或将蛋白质引导至细胞外的环境。这通常可以通过向特定基因的编码序列上连接编码转运肽序列或信号肽序列的DNA序列来实现。产生的转运肽或信号肽将蛋白质分别运送到特定的细胞内或细胞外的终点，然后可以翻译后去除。转运肽或信号肽通过促进蛋白质转运通过细胞内膜(例如液泡，泡囊，质体和线粒体膜)发挥作用，而信号肽引导蛋白质通过细胞外膜。通过促进蛋白质转运进入细胞内或细胞外的区室，这些序列可以增加基因产物的积累。

这种用途的特定的例子涉及将天冬氨酸激酶引向特定的细胞器诸如质体，而不是细胞质。这通过使用赋予蛋白质质体特异性定向的拟南芥SSU1A转运肽来例证。可选择地，转基因可以包括编码质体转运肽的DNA序列或编码可操作地连接到启动子和编码天冬氨酸激酶的DNA序列之间的rbcS(RuBISCO)转运肽的DNA序列(质体靶向肽的综述，参见Heijne等人(1989)；Keegstra等人(1989))。如果转基因将要被引入植物细胞，转基因也可以包含植物转录终止信号和聚腺苷酸化信号及连接到植物天冬氨酸激酶基因的3′端的翻译信号。

可以使用未在天然植物天冬氨酸激酶基因之内编码的外源性的质体转运肽。质体转运肽长度通常为40至70个氨基酸，且翻译后发挥功能以将蛋白质引导至质体。转运肽在进入质体过程中或恰好在之后裂解以产生成熟的蛋白质。编码植物天冬氨酸激酶的基因的完整拷贝可以包含质体转运肽序列。在这种情况下，可能不需要将外源性获得的质体转运肽序列结合到转基因中。

外源性的质体转运肽编码序列可以从多种植物核基因获得，只要该基因的产物表达为包含氨基端转运肽的前蛋白质并转运进入质体。已知包括这种转运肽序列的植物基因产物的例子包括但不限于，核酮糖二磷酸羧化酶的小亚基、叶绿素a/b结合蛋白、核基因编码的质体核糖体蛋白质、某些热激蛋白、氨基酸生物合成酶诸如乙酰乳酸合酶、3-烯醇丙酮酰磷酸莽草酸合酶、二氢吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸激酶等。在某些情况下，质体转运蛋白可能已经在感兴趣的天冬氨酸激酶基因之内编码，在这种情况下，可能不需要加入这种质体转运序列。可选择地，编码转运肽的DNA片段可能被全部或部分地从已知的转运肽序列(诸如上述所列的)化学合成。

不管编码转运肽的DNA片段的来源如何，它应该包括翻译起始密码子，例如，ATG密码子，并被表达为一种被宿主植物的质体识别并在其中适当地发挥功能的氨基酸序列。还应当注意转运肽和天冬氨酸激酶之间的连接处的氨基酸序列，其中，其裂解产生成熟的酶。某些保守的氨基酸序列已被鉴定，且可以作为指导。转运肽编码序列与天冬氨酸激酶编码序列的精确的融合可能需要操作一个或两个DNA序列，以引入例如方便的限制酶切位点。这可以通过包括定点诱变、插入化学合成寡核苷酸连接体等的方法来完成。

只要质体转运蛋白的编码序列与天冬氨酸激酶的编码序列在读框内，编码质体转运蛋白的核酸的精确融合可能不是必需的。例如，通常可以包括另外的肽基或氨基酸，而不会不利地影响感兴趣的蛋白质的表达或定位。

一旦获得，就可以使用标准方法，将质体转运肽序列适当地连接至启动子和转基因中的天冬氨酸激酶编码区。可以构建或从商业来源获得含有在植物细胞中具有功能的启动子并在下游具有多克隆位点的质粒。可以使用限制性内切酶在启动子的下游插入质体转运肽序列。天冬氨酸激酶编码区然后可以与质体转运肽序列的3′端翻译地融合或符合读框地插入其直接下游。因此，质体转运肽优选连接至天冬氨酸激酶的氨基端。一旦形成，转基因可以被亚克隆到其他质粒或载体中。

除了核植物转化，本发明还扩展到植物质体基因组的直接转化。因此，也可以通过将基因直接递送至细胞内区室来实现将基因产物靶向植物细胞内的细胞内区室。质体基因组的直接转化可以提供优于核转化的另外的益处。例如，天冬氨酸激酶的直接质体转化消除了对于质体靶向肽和翻译后转运和加工相应的核转化体产生的前蛋白的需要。植物的质体转化已在本文引用并并入本文的Maliga(2002)、Heifetz(2000)、Bock(2001)和Daniell等人(2002)以及其他参考文献中描述。

在构建含有天冬氨酸激酶基因的转基因之后，可以将盒引入植物细胞。根据植物细胞的类型、基因表达水平以及由基因编码的酶的活性，将编码天冬氨酸激酶的DNA引入植物细胞可以导致苏氨酸的过量产生，赋予赖氨酸耐受性和/或以其他方式改变植物细胞中的苏氨酸含量。

包含天冬氨酸激酶基因的转基因可以被亚克隆到已知的表达载体中，且AK表达可以被检测和/或定量分析。这种筛选方法可用于鉴定提供天冬氨酸激酶基因表达和转化的植物细胞的质体中天冬氨酸激酶的表达的转基因。

质粒载体包含另外的DNA序列，该另外的DNA序列提供原核和真核细胞中的转基因的方便的选择、扩增和转化，例如，pUC衍生的载体、pSK衍生的载体、pGEM衍生的载体、pSP衍生的载体或pBS-衍生的载体。该另外的DNA序列包括复制起点，其提供载体的自主复制；可选择的标记基因，其优选编码抗生素或除草剂抗性；独特的多克隆位点，其提供插入转基因中编码的DNA序列或基因的多个位点；和增强对原核和真核细胞的转化的序列。

用于在植物和原核细胞中表达的另一个载体是双元Ti质粒(Schilperoort等人，美国专利4,940,838)，如载体pGA582。这种双元Ti质粒载体以前已经由上文引用的An表征。这种双元Ti载体可以在原核细菌诸如大肠杆菌和土壤杆菌中复制。土壤杆菌质粒载体也可以用于将转基因转移到植物细胞中。双元Ti载体优选地包含提供有效植物细胞转化的胭脂碱T DNA右和左边界、可选择的标记基因、T边界区域的独特的多克隆位点、colE1复制起点和宽宿主范围复制子。携带本发明的转基因的双元Ti载体可以用于转化原核和真核细胞，但优选用于转化植物细胞。例如，参见，Glassman等人，美国专利5,258,300。

表达载体然后可以通过可用的方法被引入原核或真核细胞。对于单子叶植物和双子叶植物尤其有效的转化方法包括但不限于未成熟胚的微粒轰击(美国专利5,990,390)或Gordon-Kamm等人(1990)、Fromm等人(1990)、Walters等人(1992)所述的II型胚性愈伤组织细胞的微粒轰击；或D′Halluin等人(1992)或Krzyzek(美国专利5,384,253)所述的I型胚性愈伤组织的电穿孔。也可以使用通过与DNA涂覆的钨晶须一起涡旋对植物细胞的转化(Coffee等人，美国专利5,302,523)和通过细胞暴露于含DNA的脂质体的转化。

使用组织培养技术高效选择需要的赖氨酸抗性、过量产生苏氨酸的变体需要仔细确定选择条件。优化这些条件，以使得赖氨酸抗性、过量产生苏氨酸的细胞在培养中生长和积累，同时抑制细胞群体的生长。群体中的各个细胞的活力可能高度依赖于邻近细胞的活力这一事实使得情况复杂化。

选择方案的选择是基于上述的考虑。下面简述的方案可以在选择程序中使用。例如，为了选择耐受赖氨酸的生长抑制的细胞，在液体悬浮培养中的细分的细胞可以暴露于高含量的赖氨酸持续短暂的时间。然后使得存活的细胞恢复和积累，并且随后再暴露较长的时间。可选择地，使组织的部分分化的细胞培养物生长，并通过连续暴露于初始低含量赖氨酸进行传代培养。然后在几个传代培养间隔之间逐渐增加浓度。虽然这些方案可以在选择程序中使用，但本发明不限于这些程序。

如本文以上所述，作为可选择的标记基因和报告基因起作用的基因可以与本发明的转基因、载体和植物中的编码天冬氨酸激酶或其结构域的DNA序列可操作地结合。此外，其他农艺性状可以被添加到本发明的转基因、载体和植物中。这些性状包括但不限于，昆虫抗性或耐受性；疾病抗性或耐受性(病毒、细菌、真菌、线虫)；应激抗性或耐受性，例子为对于干旱、炎热、低温、冷冻、过多水分、盐分应激、氧化应激的抗性或耐受性、提高的产量、食品含量和组成、物理外观、雄性不育性、脱水(dry down)、直立性、繁殖力、淀粉性质、油的数量和质量等。人们可以向本发明的植物加入赋予这些性状的一种或多种基因。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(或“Bt”)细菌包括近20种已知的细菌亚种，它们产生当被多种昆虫物种摄入时具有毒性的内毒素多肽。内毒素蛋白(Bt蛋白)和相应基因(Bt基因)的生物学和分子生物学已被Whitely等人(1986)和Hofte等人(1989)综述。编码多种Bt蛋白质的基因已被克隆和测序。Bt多肽的片段对于对多种鳞翅目害虫的毒性是必要的，且包含在Bt多肽分子的大约前50％中。因此，由截短的Bt基因编码的截短Bt多肽在许多情况下保留其对大量鳞翅目昆虫害虫的毒性。例如，HD73和HD1 Bt多肽已被证明对于美国重要的鳞翅目植物害虫如欧洲玉米螟虫、切根虫(cutworm)和穗虫(earworm)的幼虫有毒。编码HD1和HD73Bt多肽的基因已分别被Geiser等人(1986)和Adang等人(1985)克隆和测序，并使用标准方案由从培养物保藏中心(例如，Bacillus Genetic Stock Center，Columbus，OH或USDA Bt stock collectionPeoria，IL)获得的HD1和HD73株系克隆。例如，在美国专利66,329,574、6,303,364、6,320,100和6,331,655中描述了Bt基因和多肽的例子。

使用先前用来克隆Bt基因的方案，编码新的、以前未表征的Bt毒素的DNA可以从宿主芽孢杆菌生物体克隆，也可以产生新合成形式的Bt毒素。

用于本发明的Bt基因可以包括5′DNA序列，该5′DNA序列包含允许启动位于下游的Bt序列在植物中转录和翻译的DNA序列。Bt基因还可以包括3′DNA序列，该3′DNA序列包含源自可以在感兴趣的植物中表达的基因的3′非编码区的序列。Bt基因还包括编码由苏云金芽孢杆菌产生的毒性Bt多肽或其毒性部分或与其具有基本氨基酸序列同源性的DNA序列。Bt编码序列可以包括：(i)编码与Bt内毒素具有基本同源性的杀虫蛋白的DNA序列，该Bt内毒素对于感兴趣的植物的害虫具有活性，例如，HD73或HD1 Bt序列；(ii)编码Bt内毒素多肽的杀虫活性片段的序列，例如，从羧基和/或氨基末端截短的杀虫活性HD73或HD1多肽；和/或(iii)与编码提供一些另外优势的多肽的序列符合读框地融合的截短Bt序列，该另外优势例如是：(a)可选择的基因，例如，赋予抗生素或除草剂抗性的基因；(b)易于检测或测定其产物的报告基因，例如萤光素酶和β-葡萄糖醛酸酶；(c)编码在稳定Bt蛋白质防止降解方面具有某些另外用途或增强Bt蛋白抗昆虫效果的多肽序列(例如，蛋白酶抑制剂)的DNA序列；和(d)帮助将Bt蛋白引导至植物细胞内部或外部的特定区室的序列，例如，信号序列。

为了在植物中获得Bt蛋白质或其他异源性蛋白质的最佳合成，也可以适当地调节编码该蛋白质的基因的DNA序列以更类似于在感兴趣的植物中有效表达的基因。由于Bt基因的密码子选择可能与在感兴趣的植物中表达的基因使用的密码子选择不同，植物细胞中Bt基因的表达可以通过将密码子替换为在植物中更有效表达的基因，例如，在感兴趣的植物中更常用的基因来改善(参见，Murray等人，1989)。这种密码子替换可能需要碱基取代，而不改变产生的Bt多肽的氨基酸序列。Bt多肽在序列上可以与细菌基因或其片段相同。比原始细菌基因包含更高比例的优选密码子的完整Bt编码序列或其片段可以使用标准的化学合成方案合成，并使用标准方案引入或组装到Bt基因中，诸如定点诱变或DNA聚合和连接等。

蛋白酶抑制剂也可以提供昆虫抗性。例如，来自番茄或土豆的蛋白酶抑制剂II基因pinII可能是有用的。使用pinII基因与Bt毒素基因的组合也是有利的。编码昆虫消化系统的抑制剂的其他基因或编码促进抑制剂产生的酶或辅因子的那些基因也可能是有用的。这一组包括水稻巯基蛋白酶抑制剂(oryzacystatin)和淀粉酶抑制剂诸如小麦和大麦的淀粉酶抑制剂。

编码凝集素的基因可以赋予另外的或可选择的杀虫剂性质(Murdock等人，1990；Czapla和Lang，1990)。考虑有用的凝集素基因包括，例如，大麦和麦芽凝集素(WGA)和水稻凝集素(Gatehouse等人，1984)。

控制当被引入害虫时对昆虫有活性的大或小多肽(诸如溶解肽、肽类激素和毒素、毒液)的产生的基因也可能是有用的。例如，针对特定害虫的保幼激素酯酶的表达还可能导致杀虫活性，或者可能导致变态(metamorphosis)的停止(Hammock等人，1990)。

表达编码影响昆虫角质层完整性的酶的基因的转基因植物也可能是有用的。这些基因包括那些编码例如几丁质酶、蛋白酶、脂肪酶的基因，还有产生尼可霉素(nikkomycin)的基因。编码影响昆虫蜕皮的活性的基因，如那些影响蜕皮类固醇UDP-葡萄糖基转移酶产生的基因，也可能是有用的。

编码促进产生减少植物对于害虫的营养质量的化合物的酶的基因也可能是有用的。例如，可以通过改变其固醇组成赋予植物杀虫活性。本发明的进一步的实施方式涉及具有增强的脂氧合酶活性的转基因植物。

可以调节玉米可凝性球蛋白(maysin)产生的基因和涉及在高粱中产生蜀黍氰甙(dhurrin)的基因的引入，也考虑用于促进分别对穗虫和根虫的抗性。

也可以使用其它编码特征在于具有潜在杀虫活性的蛋白质的基因。这些基因包括，例如，可以用作根虫抑制剂的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI；Hilder等人，1987)；编码除虫菌素的基因(Campbell，1989；Ikeda等人，1987)，其可以证明用作玉米根虫抑制剂；核糖体失活蛋白基因；以及调控植物结构的基因。也考虑转基因植物，其包括抗昆虫抗体基因和编码可以转化应用于植物外部的无毒杀虫剂(前杀虫剂)成为植物内的杀虫剂的酶的基因。

进行选择，直到回收观察到在正常抑制含量的赖氨酸的存在下生长良好的细胞或组织。这些细胞“系”在异常高含量的赖氨酸的存在下再传代培养几次，以除去非抗性细胞，然后表征。通过在各种浓度赖氨酸存在下比较这些细胞系的生长与非选择的细胞或组织的生长，确定已经获得的抗性的量。可以通过在缺乏赖氨酸的情况下简单培养选定的细胞系持续不同时间，然后分析在组织重新暴露于赖氨酸之后的生长，来评价培养的细胞的抗性性状的稳定性。也可以使用体外化学研究评价抗性细胞系，以验证苏氨酸的作用位点被改变为对于赖氨酸的抑制作用较不敏感的形式。

可以在转化细胞中检测和定量天冬氨酸激酶基因的瞬时表达。可以通过RT-PCR分析，一种使用克隆的天冬氨酸激酶的特异性抗体的定量蛋白质印迹分析，或通过在高含量的赖氨酸的存在下检测酶活性，来定量基因表达。可以通过使用克隆的天冬氨酸激酶的特异性抗体的免疫化学染色方法，或亚细胞分离和随后的生化和/或免疫分析，来确定克隆的天冬氨酸激酶的组织和亚细胞位置。也可以评估克隆的天冬氨酸激酶对于药物的敏感性。然后可以利用提供天冬氨酸激酶或耐受赖氨酸抑制的天冬氨酸激酶的表达的转基因转化单子叶植物和/或双子叶植物组织细胞以及再生转化的植物和种子。可以通过检测可选择的标记基因或报告基因的存在，例如通过检测可选择的除草剂抗性标记，来选择转化的细胞。使用克隆的天冬氨酸激酶的特异性抗体，或通过RT-PCR分析，可以检测转基因胚性愈伤组织中天冬氨酸激酶基因的瞬时表达。

转化的胚性愈伤组织、分生组织、胚、叶盘等然后可以用来产生显示出转化的天冬氨酸激酶基因的稳定遗传性的转基因植物。通过本领域公知的方法(例如，参见美国专利5,990,390和5,489,520；和Laursen等人，(1994))，使显示出令人满意的高含量赖氨酸耐受水平的植物细胞系通过植物再生方案，以获得表达耐受性性状的成熟植物和种子。植物再生方案允许体细胞胚的发育和根与芽随后的生长。为了确定耐受性状在植物的分化器官中表达，而不是仅仅在未分化的细胞培养中表达，可以相对于再生的非转化植物分析再生植物的各个植物部分中存在的苏氨酸含量。使用标准的方法，可以由显示苏氨酸含量改变的或赖氨酸反馈抑制抗性改变的转化的细胞和组织产生转基因植物和种子。特别优选的是，叶或种子的苏氨酸含量增加。如Widholm(1972)所述，在抑制量的赖氨酸的存在下，酶的比活性的变化可以通过测量转化细胞中的酶活性来检测。总苏氨酸含量的变化也可以通过Jones等人(1981)所述的标准方法来检测。

然后从已知表达所述性状的细胞系获得成熟的植物。如果可能的话，再生的植物进行自花授粉。此外，从再生植物获得的花粉与农艺学上重要的近交系的种子生长的植物杂交。在某些情况下，来自这些近交系的植物的花粉用于对再生植物授粉。这种性状通过评估第一代和后一代子代中该性状的分离来遗传学表征。如果在组织培养中选择的性状在商业上是有用的，该性状在植物中的遗传性和表达是特别重要的。

如果不同杂种组合用于销售，过量产生苏氨酸的大豆、谷物和其他植物的商业价值是最大的。农民通常基于如成熟度、直立性或其他农艺性状的差异培养超过一种的杂种。此外，由于如成熟度、疾病抗性和抗虫性等性状的差异，适于一个国家的一部分地区的杂种不适应该国家的另一部分地区。正因为如此，必需将苏氨酸过量产生培育到大量的亲本近交系中，使得可以产生许多杂种组合。

通过原始过量产生系与正常优良品系杂交以及子代与正常亲本回交，进行转化过程(回交)。回交之后，对新的过量产生系和产生良好的商业杂种的品系的适当组合进行以下方面的评估：过量产生以及一组重要农艺性状。产生过量产生系和杂种，它们符合原始正常系和杂种类型。这需要在一系列环境条件下的评价，其中，品系或杂种一般可以商业化培养。为了产生高苏氨酸大豆，可能需要杂种种子的两个亲本对于高苏氨酸特征为纯合的。使用标准的杂种种子的产生惯例，增加表现令人满意的杂种的亲本系，并用于杂种的产生。

本发明产生的转基因植物预计将用于各种商业和科研目的。可以产生用于传统农业的转基因植物，以具备对于从植物收获的粮食的消费者有利的性状(例如，人类食品或动物饲料中的改善的营养成分含量)。在这样的应用中，一般培养植物用于在人类或动物食品中使用其谷粒。但是，植物的其他部分，包括秸秆、稻壳、生殖部分等，也可以具有以下用途：包括作为动物饲料、发酵饲料、生物催化的部分或装饰用途。

转基因植物也可以在蛋白质或其他分子的商业制备中具有用途，其中，感兴趣的分子从植物部分、种子等中提取或提纯。也可以培养、体外生长或发酵来自植物的细胞或组织，以生产这种分子。

转基因植物也可以用于商业育种计划，或可以杂交或培育为相关作物品种的植物。可以转移重组DNA编码的改进，例如，从大豆细胞转移至其他物种的细胞，例如，通过原生质体融合进行转移。

实施例

下面的实施例进一步说明本发明，而不是为了限制本发明。本领域的技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实施中作用良好的技术，因此可以被视为构成其实践的优选模式。但是，根据本公开内容，本领域的技术人员应该理解，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，对公开的具体实施例可以进行许多改变，并仍然能够获得相同的或类似的结果。更具体地说，在化学和生理学上都相关的某些试剂显然可以取代本文描述的试剂，而能够获得相同或类似的结果。所有这些本领域技术人员明白的类似的取代和修饰，都被视为在由附加的权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念之内。

实施例1：天冬氨酸激酶基因的分离和克隆

使用寡核苷酸引物SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，通过PCR扩增从30ng的伯氏致病杆菌基因组DNA分离野生型天冬氨酸激酶基因的全长编码序列。使用Expand^TM高保真PCR试剂盒(Boehringer Mannheim，Germany)，在50μl总体积的反应混合物中进行PCR。PCR条件如下：在95℃下4分钟的1个循环；在95℃下1分钟、在56℃下退火1分钟、和在72℃下延伸2分钟的26个循环；在72℃下7分钟的1个循环。产生的产物用适当的限制性内切酶(NdeI和XhoI)消化，凝胶纯化，并连接到pET30a(Novagen)中的相应的位点，产生用于表达重组蛋白的质粒pMON81662(图3；XbAK)。通过DNA序列分析确认基因序列的完整性。

实施例2：编码具有理想的酶学性质的变体的新型天冬氨酸激酶基因的鉴定

本实施例说明编码具有理想的酶学性质(即对天冬氨酸家族氨基酸的终产物抑制不敏感和良好的动力学性质)的酶的AK基因的鉴定。为了表征AK变体，使用重组大肠杆菌lysC和大肠杆菌T352I lysC(SEQID NO：17)基因产物作为对照，建立重组表达系统和AK酶分析。已知大肠杆菌lysC基因产物对Lys的反馈抑制敏感，而已知大肠杆菌T352IlysC基因产物对赖氨酸不敏感。具有天冬氨酸激酶活性的大肠杆菌T352I lysC基因产物在植物中的表达，导致种子中的苏氨酸含量提高6-7％(Karchi，等人，THE PLANT J.3：721-727(1993)；Galili，等人，欧洲专利申请第0485970号)。通过PCR扩增、使用大肠杆菌基因组DNA作为模板和PCR引物SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15，克隆lysC基因。随后，对大肠杆菌lysC和伯氏致病杆菌AK基因进行定点诱变，并被克隆用于重组蛋白产生和/或用于转化入大豆。

进行定点诱变以产生伯氏致病杆菌AK基因的E257K和T359I单变体以及E257K/T359I双变体，使用下列引物和条件：

用于基于PCR的诱变的引物：

XbAKXhoIRv(SEQ ID NO：18)

XbAKNdeIFr(SEQ ID NO：19)

XbAKE257KFr(SEQ ID NO：20)

XbAKE257KRv(SEQ ID NO：21)

XbAKT359IFr(SEQ ID NO：22)

XbAKT359IRv(SEQ ID NO：23)

使用pMON81662作为模板，在50μl的总体积中进行PCR反应。

1.对于XbAK E257K

a)N-端片段(使用引物XbAKNdeIFr和XbAKE257KRv)。预期产物为797bp。

b)C-端片段(使用引物XbAKXhoIRv和XbAKE257KFr)。预期产物为624bp。

2.对于T359I

a)N-端片段(使用引物XbAKNdeIFr和XbAKT359IRv)。预期产物为1071bp。

b)C-端片段(使用引物XbAKXhoIRv和XbAKT359IFr)。预期产物为320bp。

每100μl反应混合物包含：83μl的水、3μl 10mM的dNTPs、10μl10X ThermoPol缓冲液(NEB，用于Vent)、2μl的DMSO、1μl的质粒模板、1μl 100μM的正向引物、1μl的100μM的反向引物、～1μl Vent DNA聚合酶。可选择的混合物使用AccuPrimeTM Pfx DNA聚合酶试剂盒(Invitrogen)。

总反应体积为50μl。PTC-200 Peltier热循环仪设置为以下的程序循环：

94℃下，2分钟

24个循环[在94℃下30秒，在50℃下30秒，在72℃下90秒]

在72℃下5分钟。

用1.2％琼脂糖-TAE凝胶凝胶纯化各50μl的每种PCR产物。从凝胶上切下纯化的产物带，并如下合并：

a.对于E257K，合并来自上述反应的带1a和1b。

b.对于T359I，合并来自上述反应的带2a和2b。

从凝胶上洗脱合并的DNA，并回收到～35μl的EB中。

第二轮PCR反应设置如下：

5μl的混合物1+2或3+4

1.5μl的10mM dNTP

5μl的10X ThermoPol缓冲液

1μl的DMSO

～0.5μl Vent

+40μl的水

根据以下程序循环，不加入任何引物，运行退火和延伸循环：

在94℃下2分钟

5个循环[在94℃下30秒，在50℃下30秒，在72℃下75秒]

在72℃下2分钟。

暂时中断PCR以加入1.5μl的XbAKXhoIRv和XbAKNdeIFr。使用稍微修改的程序，重新启动反应：

在94℃下2分钟

24个循环[在94℃下30秒，在50℃下30秒，在72℃下90秒]

在72℃下5分钟。

然后用NdeI和XhoI消化PCR产物，并克隆进入pET30a(Novagen)载体。通过位点限制分析鉴定质粒，并通过DNA测序证实其携带所需的突变。该质粒然后被转化入大肠杆菌BL21(DE3)，用于产生N-末端His-标记的AK蛋白。含有作为生化表征努力的一部分产生的不同AK序列和对照的载体列表在表1中列出。

天冬氨酸激酶变体的表征

表征这些伯氏致病杆菌天冬氨酸激酶基因变体的酶学性质，并与以前研究的大肠杆菌lysC突变等位基因(SEQ ID NO：16；图4；pMON81658)进行比较。为了表征AK变体，使用重组大肠杆菌lysC基因产物，建立重组表达系统和AK酶分析。

含有AK或所需的突变体的嵌合质粒被转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB(Luria-Bertani)培养基中选择转化子。为了诱导基因表达，在100毫升补充有氨苄青霉素或卡那霉素的液体LB中培养选自单菌落的转化子至大约0.6A₆₀₀和0.4mM。加入异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Gold Biotechnologies，St.Louis，MO)，接着在21℃和220rpm振摇下孵育15小时。通过30分钟7,000x g离心收获细胞，并用pH 7.4的20mM Tris-HCl、150mM NaCl清洗一次。清洗的细胞沉淀被重新悬浮于50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4，缓冲液A)中，该缓冲液含有2mM MgCl₂、50mM NaCl、100单位的benzonase(Novagen，San Diego，CA)和没有EDTA的蛋白酶抑制剂混合物片(1片/10mL)(Boehringer Mannheim，Germany)。通过三次通过以20,000psi运行的冷冻的弗氏细胞压碎器(French press cell，SLM-AmincoSpectronic Instruments)破碎细胞。使用超离心机在4℃下以100,000x g离心该裂解液1小时。根据供应商的说明书，将得到的上清液加到镍+次氮基三乙酸(Ni+NTA)琼脂糖柱(His结合树脂，Qiagen)上并进行色谱分离。用3倍柱床体积的含有20mM咪唑的缓冲液A清洗柱，接着用300mM咪唑洗脱。合并N-末端His-标记的GS2的酶活性部分，相对于不含benzonase的缓冲液A透析，并在-80℃下、15％甘油溶液中储存用于动力学研究。通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE判断，酶制剂的纯度超过95％。

酶测定和动力学研究

异羟肟酸比色法.分析混合物(最终体积，0.8毫升)包含100pH 8.0的Tris-HCl、40mM pH 8.0的羟胺-氢氧化钾、25mM pH8.0的ATP-KOH、20mM MgCl₂、L-天冬氨酸和150mM KCl。通过加入AK酶启动该反应，并在37℃下进行15-30分钟。通过加入400μL酸化的三氯化铁(0.37MFeCl₃、20％TCA和0.72M HCl)终止该反应，接着以微量离心机的最高速度离心。通过在505nm比色测定所形成的天冬氨酰-异羟肟酸。根据L-天冬氨酰-异羟肟酸或ε_505nm的标准曲线计算生物合成活性。

偶联分析方法.在30℃下使用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶，该分析结合了ATP向ADP的转化与NADH氧化。在340nm，动力学监测NADH的氧化。(参见，Wampler DE，Westhead EW.(1968)，B_IOCHEMISTRY 7：1661-1670)

动力学.通过测量100μL含有0至25mM的多种底物浓度的反应混合物中的产物形成，确定动力学参数。每个分析都包括对照。使用米氏方程结合Grafit 5.0软件(Erithacus software Ltd.，Horley，UK)中的曲线拟合选项，从产物的形成速率计算K_m、V_max和K_cat的值(表2)。

表1用于在大肠杆菌中表达的天冬氨酸激酶载体

构建13种含有天冬氨酸激酶(AK)序列的大肠杆菌表达载体，用于对动力学性质、诱变和反馈抑制以及抗体产生进行研究。

表2.纯化的伯氏致病杆菌天冬氨酸激酶的动力学性质

实施例3：含有反馈不敏感天冬氨酸激酶编码序列的大豆转化载体的构建和向大豆植物内的转化

构建6种含有伯氏致病杆菌AK基因的野生型和突变型等位基因的大豆转化载体(在表3中列出)，并将这些载体转化入大豆。

表3.含有天冬氨酸激酶编码序列的大豆转化载体

pMON号	编码区
		pMON101817	CTP1-伯氏致病杆菌AK
pMON101818	CTP1-伯氏致病杆菌AK E257K
		pMON101819	CTP1-伯氏致病杆菌AK T359I
pMON101820	CTP1-伯氏致病杆菌AK T359I
		pMON101821	CTP1-伯氏致病杆菌AK T359I-非天然
pMON101822	CTP1-伯氏致病杆菌AK T359I-非天然

在细菌蛋白质的N-末端掺入CTP1的编码序列(SEQ ID NO：13)，以将该蛋白质靶向至发育的种子中的质体。在大豆和拟南芥原生质体中评估作为GFP融合蛋白的大肠杆菌和拟南芥蛋白的靶向，其结果在美国专利申请公布US2008/050506A1中有描述。一般情况下，具有叶绿体靶向序列的构建体有效地靶向叶绿体。

从发芽的A3525种子的胚上切除大豆分生组织。在与携带选自表3的载体的根癌土壤杆菌株ABI共培养后，分生组织被置于含有分别抑制非转化植物细胞和过量土壤杆菌生长的草甘膦和抗生素的选择培养基上。

温室中，以随机区组设计，在填充有以1.0mS施用了Peter’s Pete Lite15-16-17液体肥料的Metro Mix 350土壤基质的8英寸盆中培养植物。产生成熟的种子，并分析游离氨基酸含量。包括对照，以建立基线游离氨基酸含量，即相应的负等值线和非转基因对照。

实施例4：大豆植物的转基因天冬氨酸激酶变体和野生型群体中的R1种子游离氨基酸含量的确定

本实施例说明用于确定含有来自伯氏致病杆菌的野生型和反馈抗性天冬氨酸激酶基因的转基因事件的R1种子中游离氨基酸含量的方法。将来自每个R₀植物的种子膨涨(bulk)，将25个种子磨碎，并如下所述分析总的游离氨基酸。这些研究的结果报告于如下表4中。

一般情况下，磨碎种子样品，用5％(v/v)的三氯乙酸(TCA)提取游离氨基酸，提取物经邻苯二甲醛(OPA)衍生以形成所有游离氨基酸(除了脯氨酸和半胱氨酸)的荧光衍生物。通过反相高压液相色谱(HPLC)分离氨基酸衍生物，并使用荧光检测器定量测量。对于18种氨基酸中的每种，检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为5和10ppm。

具体来说，使用Mega-Grinder磨碎25个种子样品成为细的均匀粉末。称重大约30±5mg的每个磨碎的样品，并置于Matrix Screen Mates一次性试管架的每个管孔(每架96x 1.4ml试管)中。向每个样品加入1.0ml的5％TCA；紧密盖上管孔，并置于涡旋混合器上30分钟。样品在4℃下孵育过夜，以确保完全提取。第二天，样品在涡旋混合器上混合30分钟。然后以3000rpm离心样品20分钟，将大约400.0μl的上清液转移到800μl的96孔过滤(unifilter)板，并过滤到Eppendorf离心机中的1ml 96孔母盘中。来自母盘的大约100μl样品被转移到350μl的96孔子盘。母盘被存储于-80℃冰箱中。子盘被放置在HPLC的自动采样器中以进行分析。在每10个进样后，分析检验标准，以确保HPLC运行正常。

通过反相高压液相色谱法，用装配有Kromasil(Xpertek，)C₁₈保护柱(3x15mm，5μm)的Zorbax Eclipse XDB-C₁₈柱(4.6x75mm，3.5μm，Agilent)分离氨基酸。柱区室维持于40±0.8℃。二元流动相系统包括含有0.001％叠氮钠的40mM NaH₂PO₄(pH 7.8)作为溶剂A和乙腈∶甲醇∶水(45∶45∶10v/v)作为溶剂B。所有溶剂均为HPLC级。

12分钟的HPLC运行使用2mL/分钟的流动相流速，初始的95∶5的溶剂A与溶剂B的比例保持1分钟，接着在9.80分钟线性增加溶剂B至35％，然后在12分钟增加至100％。通过在柱负载前使样品暴露于OPA的注射程序，将氨基酸柱前衍生为其OPA衍生物。产生的氨基酸加合物通过荧光检测器(340nm激发，450nm发射)检测。半胱氨酸和脯氨酸没有被包括在这种氨基酸筛选中。在每10个进样后，分析检验标准，以确保HPLC运行正常。

表4.含有反馈抗性AK基因的转基因大豆R1种子群体中的总游离氨基酸(FAA)含量增加最多达3倍。

^*使用Tukey-Kramer HSD(JMP 6.0，SAS Institute)计算显著性，且后跟同样字母的平均值彼此没有显著性差异。

所有包含伯氏致病杆菌天冬氨酸激酶的种子表达的反馈抗性形式的4个构建体在游离苏氨酸方面显示大幅增加，来自多个构建体的事件远远超过A3525对照种子中的31ppm水平(表5)。根据上述方法，将每个R₀植物的种子膨涨，磨碎25个种子，并分析总游离苏氨酸(ppm)。

表5.相比野生型种子群体，转基因大豆种子群体中的R1种子苏氨酸含量提高最多100倍。

^*使用Tukey-Kramer HSD(JMP 6.0，SAS Institute)计算显著性，且后跟同样字母的平均值彼此没有显著性差异。

也观察其他天冬氨酸衍生的氨基酸的变化。转基因事件的这些变化包括丝氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸和异亮氨酸的显著增加，此外还有天冬氨酸的下降(表6)。

实施例5：大豆植物的转基因天冬氨酸激酶变体和野生型群体中的芽生物质的测定

在温室中培育来自pMON101817、pMON101818、pMON101819、pMON101820、pMON101822的4个事件的各30个R1种子和90个野生型A3525种子，直到V1。计数来自每个事件的发芽种子的总数，并与野生型总发芽种子相比计算发芽率。集中和称重来自每个事件的20个芽和野生型10天地上幼苗。

在种植后第7和14天，对高苏氨酸和丝氨酸种子获得的转基因植物和野生型植物进行摄影记录。每个事件和野生型种子的丝氨酸和苏氨酸含量报告于表7。表达伯氏致病杆菌修饰AK基因的幼苗显示芽生物质大幅增加。图12的图显示每个芽的平均鲜重(克)。

表7.用于种植的伯氏致病杆菌AK突变事件和野生型种子

序号	构建体	事件	Ser	Thr
					63010441157	pMON101817	GM_A166611	86	68
63010440460	pMON101817	GM_A166589	36	63
					63010441006	pMON101817	GM_A166590	62	51
63010440939	pMON101817	GM_A166599	29	51
63010440559	pMON101818	GM_A166622	2496	2887
					63010441094	pMON101818	GM_A166631	2925	2389
63010440674	pMON101818	GM_A166615	2034	2083
					63010441208	pMON101818	GM_A166641	54	50
					63010440838	pMON101819	GM_A167979	2764	2999
63010440953	pMON101819	GM_A167968	3261	2464
					63010440814	pMON101819	GM_A167984	2671	2255
63010440991	pMON101819	GM_A167991	52	55

63010440686	pMON101820	GM_A167466	3120	3112
					63010440636	pMON101820	GM_A167452	2705	2976
63010440864	pMON101820	GM_A167461	2844	2664
					63010441347	pMON101820	GM_A167464	28	35
					63010441119	pMON101822	GM_A166658	2419	3106
63010441385	pMON101822	GM_A166659	2446	2751
					63010441272	pMON101822	GM_A166646	2286	2199
63010440383	pMON101822	GM_A166657	222	89
60052672132	对照	1471	128	31
					60052716946	对照	1478	81	30
60052672029	对照	1471	86	28
					60052716960	对照	1478	74	27
60052716958	对照	1478	74	27
					60052716972	对照	1478	84	27

从给出的实施例可以看出，本发明因此提供了用于提高大豆植物中游离苏氨酸和其他天冬氨酸衍生氨基酸的表达的分离的反馈不敏感天冬氨酸激酶基因。本发明还提供了一种通过鉴定可以在发育的大豆种子中过度表达的反馈抗性AK酶来产生高游离苏氨酸的大豆种子的方法。此外，本发明提供了一种增强植物氮代谢和作物的生长表现的方法。

已经说明和阐述了本发明的原理，本领域技术人员应该明白：本发明可以在不背离这些原则的情况下，在安排和细节上进行改变。我们要求保护所附权利要求的精神和范围之内的所有改变。本说明书引用的所有专利文件通过参考引入本文中，仿佛各个通过参考特别和单独地引入本文。

Claims (19)

1.一种多核苷酸，其序列如选自以下的核酸序列所示：

(a)与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的序列所示核酸序列相同的核酸序列；和

(b)编码与SEQ ID NO：7相同的多肽的核酸序列，或者编码相对于野生型伯氏致病杆菌AK(SEQ ID NO：6)在相应于氨基酸257或359的位置处包含至少一个氨基酸取代的显示不受赖氨酸和/或苏氨酸的终产物抑制的天冬氨酸激酶(AK)活性的多肽的核酸序列，所述氨基酸取代为E257K和/或T359I。

2.根据权利要求1的多核苷酸，其中，所述核酸序列与SEQ ID NO：1相同。

3.根据权利要求1的多核苷酸，其中，所述核酸序列编码与SEQ IDNO：1编码的多肽相同的多肽。

4.根据权利要求1的多核苷酸，其中，所述核酸序列编码相对于野生型伯氏致病杆菌AK(SEQ ID NO：6)在相应于氨基酸257和359的位置处包含氨基酸取代的多肽。

5.根据权利要求1的多核苷酸，其中，所述核酸序列编码选自SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的多肽。

6.一种多核苷酸，其序列如编码选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的多肽的核酸序列所示。

7.由权利要求1-6中的任一项所述的多核苷酸编码的多肽。

8.一种包含权利要求1-6中的任一项所述的多核苷酸的重组DNA构建体。

9.根据权利要求8的重组DNA构建体，其中，所述多核苷酸可操作地连接到在植物细胞中具有功能的启动子。

10.根据权利要求9的重组DNA构建体，其中，所述启动子为CaMV35S启动子、7Sα'启动子或USP99启动子。

11.根据权利要求9的重组DNA构建体，其中，所述启动子为组织和/或器官特异性的启动子。

12.根据权利要求9的重组DNA构建体，其中，所述启动子为种子特异性的启动子。

13.一种包含权利要求1-6中的任一项所述的多核苷酸的食品。

14.根据权利要求13的食品，进一步定义为人类食品。

15.根据权利要求13的食品，进一步定义为动物饲料。

16.一种包含权利要求1-6中的任一项所述的多核苷酸的面粉或粗粉。

17.一种转化植物细胞的方法，包括将权利要求1-6中的任一项所述的多核苷酸分子引入植物细胞。

18.一种产生转化植物的方法，包括：

a)获得包含权利要求1-6中的任一项所述的多核苷酸分子的植物细胞；和

b)从所述细胞再生植物。

19.一种提高植物的总游离氨基酸含量的方法，包括：用包含编码不受赖氨酸和/或苏氨酸的终产物抑制的修饰天冬氨酸激酶的多核苷酸的植物转化载体转化植物，从而相比未转化的对照植物提高转化的植物中的游离氨基酸含量，其中，所述多核苷酸为权利要求1-6中的任一项所述的多核苷酸。