BRPI0914933B1 - Polipeptídeo exibindo atividade de aspartato quinase (ak) que não é sujeito a inibição por produto final, polinucleotídeo codificando o mesmo, construto de dna recombinante,microrganismo transformado, produto alimentício, farelo ou farinha, bem como métodos de transformação de uma célula de planta, de produção de uma planta transformada e de aumento do teor de aminoácido livre total de uma planta. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍDEO EXIBINDO ATIVIDADE DE ASPARTATO QUINASE (AK) QUE NÃO É SUJEITO A INIBIÇÃO POR PRODUTO FINAL, POLINUCLEOTÍDEO CODIFICANDO O MESMO, CONSTRUTO DE DNA RECOMBINANTE, MICRORGANISMO TRANSFORMADO, PRODUTO ALIMENTÍCIO, FARELO OU FARINHA, BEM COMO MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO DE UMA CÉLULA DE PLANTA, DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSFORMADA E DE AUMENTO DO TEOR DE AMINOÁCIDO LIVRE TOTAL DE UMA PLANTA".

REFERÊNCIA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos Estados Unidos No 61/077.043, depositado em 30 de junho de 2008. INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

Uma listagem de sequência contendo o campo chamado MONS211WOsequêncialisting.txt, que é 35 KB (como medido na Microsoft Windows®) e criado em 9 de junho de 2009, compreende 23 sequências de nucleotídeo, e está aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo de biologia molecular de planta e engenharia genética de planta e moléculas de polinucleotídeo úteis para a expressão de gene em plantas. Especificamente, a presente invenção refere-se às modificações genéticas para sequências de gene que são úteis na produção de níveis aumentados de aminoácidos e plantas, para aplicações de comida e/ou alimento. A invenção também descreve os métodos de produzir e usar os referidos genes desregulados.

ANTECEDENTES

Os animais monogástricos, incluindo humanos, não podem sintetizar os aminoácidos essenciais (EAAs) que incluem: lisina (Lys), metionina (Met) e treonina (Thr). As plantas são a fonte primária de proteínas e amino-ácidos essenciais consumidos por humanos e gado. Entretanto, a composição de aminoácido de sementes de planta não é de modo ideal equilibrada para nutrição de gado e humano. Portanto, na indústria de gado, os EAAs sintetizados por micróbios ou sintéticos caros são rotineiramente adquiridos e usados como suplementos para dietas com base em grão e com base em planta para animais para aumentar seu crescimento e o valor nutricional de produtos derivados de gado. Similarmente, alimento humano é geralmente fortificado com suplementos de EAA para promover o crescimento e aumentar a saúde. Esta suplementação de comida e alimento resulta em custos substancialmente aumentados associados com estas dietas.

Em organismos capazes de sintetizar níveis apropriados de tre-onina, bem como os aminoácidos essenciais lisina (Lys) e metionina (Met), são sintetizadas através da série de reação da família de aspartato (Figura 1). Aspartato quinase (AK), a primeira enzima na série de reações, catalisa a fosforilação dependente de ATP de aspartato (Asp) para formar fosfato de β-aspartila. AK constitui a principal etapa reguladora controlando o fluxo meta-bólico através da série de reações biossintética e é submetida à inibição de produto final por Lys e/ou Thr. Esta inibição de produto final de enzimas bi-ossintéticas tal como AK resulta em níveis limitados de aminoácidos essenciais livres em células de planta e necessita suplementação com aminoácidos essenciais sintéticos durante o desenvolvimento de animais de gado e em dietas humanas. Uma necessidade, portanto, existe para estratégias para aumentar o teor de EAAs em plantas e sementes tal que eles estejam disponíveis para dietas de gado e ser humano. A presente invenção fornece uma abordagem alternativa para suplementação de alimento e comida pós-colheita por modificação genética de colheitas diferentes.

SUMÁRIO A presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10.

Em certos aspectos, é fornecida uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99.5% idêntica à sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10, onde o polipeptídeo exibe a atividade de aspartase quinase (AK) que não é submetida a inibição de produto final por lisina e/ou treonina. Um polinucleotídeo pode, em alguns casos, codificar um polipeptídeo tendo uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos relativos ao (wt) Xenorbabdus bovienii do tipo selvagem AK (isto é, codificado por SEQ ID NO: 6). Por e-xemplo, um polipeptídeo codificado pode compreender uma substituição em uma posição de aminoácido correspondendo à posição 257 e/ou 359 em X. bovienii AK. Em outro exemplo, um polipeptídeo codificado pode compreender uma deleção de aminoácidos correspondendo às posições 345-361 de wt X. bovienii AK.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um polinucle-otídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 5 ou complementos dos mesmos.

Em outra modalidade, é fornecido um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, onde a sequência de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que exibe atividade de aspartase quinase (AK) que não é submetida a inibição de produto final por lisina e/ou treonina.

Em outra modalidade, é fornecido um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que hibridiza sob condições de alta severidade para um complemento total de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, onde a sequência de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que exibe a atividade de aspartase quinase (AK) que não é submetida a inibição de produto final por lisina e/ou treonina.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado codificado por um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 5.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um polipeptídeo isolado codificado por um polinucleotídeo descrito aqui. Por exemplo, o polipeptídeo isolado é, em alguns aspectos, codificado por um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 5 onde o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um construto de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo descrito aqui, tal como um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um construto de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo descrito aqui, tal como um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10, onde o referido polinucleotídeo é operavelmente ligado a um promotor funcional em uma célula de planta. É um objetivo adicional desta invenção fornecer organismo ou célula transformada que compreende um polinucleotídeo descrito aqui, tal como um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10; e um organismo ou célula transformada que compreende o referido polinucleotídeo, onde o organismo é uma planta selecionada do grupo que consiste em algodão, trigo, cana-de-açúcar, beterraba, soja, arroz, canola, milho, sorgo, cevada, Brassica e Arabidopsis. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de produzir uma planta tendo uma propriedade melhorada como um alimento animal ou comida humana, onde o referido método compreende transformar uma planta com uma construção recombinante que compreende uma região de promotor funcional em uma célula de planta operavelmente presa a um polinucleotídeo que compreende codificar a sequência para um polipeptídeo associado com a referida propriedade, e desenvolver a referida planta transformada, onde o referido polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10. O referido polipeptídeo pode ser modificado para aumentar a produção de treonina, onde o referido polipeptídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10. O referido polipeptídeo pode ser útil para melhorar a germinação, onde o referido polipeptídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10. O referido polipep- tídeo pode também ser útil para fornecer biomassa aumentada ou crescimento de planta aumentado a uma planta, onde o referido polipeptídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10. Adicionalmente, o referido polipeptídeo pode ser útil para melhorar a produtividade da colheita ou composição de grão manipulando-se a taxa de crescimento da planta, onde o referido polipeptídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10. O referido polipeptídeo modificado pode também ser útil para aumentar o teor de nível de aminoácido livre de uma semente manipulando-se uma sequência de polipeptídeo, onde o referido polipeptídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10. O referido polipeptídeo pode ser útil para aumentar o crescimento e a germinação de semente por modificação da enzima asparta-to quinase, onde o referido polipeptídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10. E o referido polipeptídeo pode ser útil para a biomassa aumentada de broto por modificação da série de reação da família de aspartato, onde a referida modificação compreende a modificação do polipeptídeo de aspartato quinase tal que a sequência modificada seja selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10.

Em ainda uma outra modalidade, é fornecida uma parte de planta que compreende um polinucleotídeo descrito aqui. Por exemplo, a parte da planta pode ser uma folha da planta, um broto, uma raiz, um fruto ou ma semente. Em ainda um outro aspecto, é fornecido um produto feito de uma parte de planta que compreende uma sequência de ácido nucleico descrita aqui. Por exemplo, um farelo ou farinha que compreende um polinucleotídeo de acordo com a descrição é fornecido. Os produtos de planta descritos aqui podem ser também definidos como um produto alimentício tal como uma comida para ser humano ou alimento para animal.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo isolado descrito aqui, tal como um polipeptídeo de SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10. A presente invenção, portanto fornece uma planta transgênica com um polipeptídeo de AK modificado que compreende uma Sequência de aminoácido de AK que compreende pelo menos uma modificação relativa a um polipeptídeo de AK de planta do tipo selvagem, onde o referido polipeptídeo modificado compreende: a) uma enzima que catalisa a fosforilação dependente de ATP de aspartato para formar fosfato de beta-aspartila; e b) onde o referido polipeptídeo de AK modificado não é submetido à inibição de produção final por lisina e/ou treonina. A referida planta transgênica com um polipeptídeo de AK modificado pode ser selecionada do grupo que consiste em: Brassica napus, Arabidopsis thaliana, Glicina max, Zea mays, trigo, arroz, alfalfa, sorgo, cevada ou algodão.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica com um polipeptídeo de AK modificado que compreende uma sequência de aminoácido de AK que compreende pelo menos uma modificação relativa a um polipeptídeo de AK de planta do tipo selvagem, onde o referido polipeptídeo modificado compreende: a) uma enzima que catalisa a fosforilação dependente de ATP de aspartato para formar fosfato de beta-aspartila; e b) onde o referido polipeptídeo de AK modificado não é submetido à inibição de produção final por lisina e/ou treonina onde a referida pelo menos uma modificação pode compreender uma substituição de aminoácido. A modificação de aminoácido descrita acima pode ser uma substituição para uma não alanina para alanina ou uma substituição não conservativa. A referida substituição de aminoácido pode estar em uma posição selecionada do grupo que consiste em: a) uma posição correspondendo ao aminoácido 257; e b) uma posição correspondendo ao aminoácido 359. A referida planta transgênica com um polipeptídeo de AK modificado pode compreender pelo menos uma substituição de aminoácido. Alternativamente, a referida planta transgênica com um polipeptídeo de AK modificado pode compreender pelo menos duas substituições de aminoácido, cada substituição de aminoácido estando em uma posição independentemente selecionada do grupo que consiste em: a) uma posição correspondendo ao aminoácido 257; e b) uma posição correspondendo ao aminoácido 359. O referido polipeptídeo AK de planta transgênica pode ser derivado de Xenorhabdus bovienir, e uma ou mais das substituições de aminoácido podem ser substituição(s) não con-servativa ou elas podem ser substituições(s) de não alanina para alanina. No referido polipeptídeo de AK transgênico, a referida pelo menos uma modificação pode compreender a truncação do domínio regulador.

Em outra modalidade, o referido polipeptídeo de AK transgênico compreende SEQ ID NO: 8.

Em outra modalidade, o referido polipeptídeo de AK transgênico não ligará lisina lisina. A presente invenção, portanto fornece uma semente que compreende um polipeptídeo de AK modificado, que quando crescida fornece um nível aumentado de treonina quando comparado com a linha não transgênica da qual a planta modificada é derivada.

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo, descrito aqui, tal como um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10, que é um vetor de expressão que também compreende uma região promotora operavelmente ligada ao ácido nucleico recombinante. Adicionalmente, a presente invenção fornece um vetor que compreende um replicon e o ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 até SEQ ID NO: 10. O referido vetor de expressão compreende uma região promotora, onde a região promotora é operável em uma célula de planta. A referida região promotora pode compreender um promotor CaMV 35S, um promotor 7s-alfa’ (7Sa’) ou um promotor USP99. A referida região promotora é transcricionalmente ativa de um modo específico d tecido e/ou órgão.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica que compreende um transgene que codifica um polipeptídeo de AK transgênico, a referida planta transgênica expressando níveis mais elevados da treonina de aminoácido em seus tecidos. A referida planta transgênica pode também expressar níveis mais elevados de outros aminoácidos tais como urginina, asparagina, glutamina, serinametionina e lisina. A referi da planta transgênica pode ser uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece planta transgênica que compreende um transgene que codifica um polipeptídeo de AK transgênico, a referida planta transgênica expressando um nível mais elevado de um aminoácido em seus tecidos, onde o referido polipeptídeo de AK é uma enzima na série de reação da família de aspartato.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica que compreende um transgene que codifica um polipeptídeo de AK transgênico, a referida planta transgênica expressando um nível mais e-levado da treonina de aminoácido em seus tecidos onde a planta ou uma porção da mesma é usada como alimento.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece a planta transgênica que compreende um transgene que codifica um polipeptídeo de AK transgênico, a referida planta transgênica expressando um nível mais e-levado da treonina de aminoácido em seus tecidos onde a planta ou uma porção da mesma é usada como comida para humano.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica que compreende um transgene que codifica um polipeptídeo de AK transgênico, a referida planta transgênica expressando um nível mais e-levado da treonina de aminoácido em seus tecidos onde a substituição de aminoácido no polipeptídeo de AK transgênico é uma substituição de não alanina para alanina ou uma substituição de um aminoácido com um aminoácido opostamente carregado.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica que compreende um transgene que codifica um polipeptídeo de AK transgênico, a referida planta transgênica expressando um nível mais e-levado da treonina de aminoácido em seus tecidos onde pelo menos uma modificação no polipeptídeo de AK transgênico é dentro do motivo de EAA-EMA ou no motivo de ALTLDTTG.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica que compreende um transgene que codifica um polipeptídeo de AK transgênico, a referida planta transgênica expressando um nível mais e-levado da treonina de aminoácido em seus tecidos onde pelo menos uma das substituições de aminoácido no referido polipeptídeo de AK transgênico é uma substituição de não alanina para alanina ou uma substituição de um aminoácido com um aminoácido opostamente carregado.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica com um polipeptídeo de AK modificado que compreende uma sequência de aminoácido de AK que compreende pelo menos uma modificação relativa a um polipeptídeo de AK de planta do tipo selvagem, onde o referido polipeptídeo modificado compreende: a) uma enzima que catalisa a fosforilação dependente de ATP de aspartato para formar fosfato de beta-aspartila; e b) onde o referido polipeptídeo de AK modificado não é submetido à inibição de produção final por lisina e/ou treonina onde a referida pelo menos uma modificação pode compreender uma substituição de aminoácido; e onde cada das substituições de aminoácido é uma substituição de não alanina para alanina ou uma substituição de um aminoácido com um aminoácido opostamente carregado.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica com um polipeptídeo de AK modificado que compreende uma sequência de aminoácido de AK que compreende pelo menos uma modificação relativa a um polipeptídeo de AK de planta do tipo selvagem, onde o referido polipeptídeo modificado compreende: a) uma enzima que catalisa a fosforilação dependente de ATP de aspartato para formar fosfato de beta-aspartila; e b) onde o referido polipeptídeo de AK modificado não é submetido à inibição de produção final por lisina e/ou treonina onde a referida pelo menos uma modificação pode compreender uma substituição de aminoácido, a referida substituição de aminoácido estando em uma posição independentemente selecionada do grupo que consiste em: (a) uma posição correspondendo ao aminoácido 257; e (b) uma posição correspondendo ao aminoácido 359, onde a substituição de aminoácido na posição correspondendo ao aminoácido 257 é uma substituição de não alanina para alanina ou uma substituição não conservadora.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica com um polipeptídeo de AK modificado que compreende uma sequência de aminoácido de AK que compreende pelo menos uma modificação relativa a um polipeptídeo de AK de planta do tipo selvagem, onde o referido polipeptídeo modificado compreende: a) uma enzima que catalisa a fosforilação dependente de ATP de aspartato para formar fosfato de beta-aspartila; e b) onde o referido polipeptídeo de AK modificado não é submetido à inibição de produção final por lisina e/ou treonina onde a referida pelo menos uma modificação pode compreender uma substituição de aminoácido, a referida substituição de aminoácido estando em uma posição independentemente selecionada do grupo que consiste em: (a) uma posição correspondendo ao aminoácido 257; e (b) uma posição correspondendo ao aminoácido 359, onde a substituição de aminoácido na posição correspondendo ao aminoácido 359 é uma substituição de não alanina para alanina ou uma substituição não conservadora.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de produzir uma planta transgênica que compreende um transgene que codifica um polipeptídeo de AK transgênico, a referida planta transgênica expressando um nível mais elevado da treonina de aminoácido em seus tecidos, o referido método que compreende introduzir em uma planta um vetor que compreende o transgene codificando o polipeptídeo de AK transgênico.

Em outra modalidade, é fornecido um método para produzir uma planta transformada que compreende, obter uma célula de planta que compreende uma sequência de polinucleotídeo da presente descrição e regenerar uma planta da sequência de polinucleotídeo.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de pelo menos um aminoácido quando comparado com uma linhagem de planta origem não modificada que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de treonina quando comparado a uma linhagem de planta origem não modificada que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma planta modificada tendo uma quantidade aumentada de treonina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada, onde a linhagem de planta modificada compreende um aumento de 2- a 100 vezes nos níveis de treonina no tecido de planta, que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de treonina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada, onde a linhagem de planta modificada compreende um aumento de 5 a 100 vezes nos níveis de treonina no tecido de planta, que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de treonina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada, onde a linhagem de planta modificada compreende um aumento de 100 vezes em níveis de treonina em tecido de planta, que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o teor de aminoácido livre total de uma planta ou progênie transformada da mesma, que compreende; transformar uma planta com um vetor de transformação de planta que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma aspartato quinase modificada, aumentar o teor de aminoácido livre da planta transformada comparado a um controle não transfor- mado.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o teor de aminoácido livre total de uma planta ou progênie transformada da mesma, que compreende; transformar uma planta com um vetor de transformação de planta que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma aspartato quinase modificada, aumentar o teor de aminoácido livre da planta transformada comparado a um controle não transformado, onde o vetor compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o teor de aminoácido livre total de uma planta ou progênie transformada da mesma, que compreende; transformar uma planta com um vetor de transformação de planta que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma aspartato quinase modificada, aumentar o teor de aminoácido livre da planta transformada comparado a um controle não transformado, onde o vetor compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o teor de aminoácido livre total de uma planta ou progênie transformada da mesma, que compreende; transformar uma planta com um vetor de transformação de planta que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma aspartato quinase modificada, aumentar o teor de aminoácido livre da planta transformada comparado a um controle não transformado, onde o vetor compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 3.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o teor de aminoácido livre total de uma planta ou progênie transformada da mesma, que compreende; transformar uma planta com um vetor de transformação de planta que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma aspartato quinase modificada, aumentar o teor de aminoácido livre da planta transformada comparada a um controle não transformado, onde o vetor compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 4.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o teor de aminoácido livre total de uma planta ou progênie transformada da mesma, que compreende; transformar uma planta com um vetor de transformação de planta que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma aspartato quinase modificada, aumentar o teor de aminoácido livre da planta transformada comparada a um controle não transformado onde a planta transformada ou progênie da mesma é selecionada do grupo que consiste em soja, canola, milho, sorgo ou algodão.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o teor de aminoácido livre total de uma planta ou progênie transformada da mesma, que compreende; transformar uma planta com um vetor de transformação de planta que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma aspartato quinase modificada, aumentar o teor de aminoácido livre da planta transformada comparada a um controle não transformado onde os aminoácidos são um ou mais aminoácidos essenciais.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o teor de aminoácido livre total de uma planta ou progênie transformada da mesma, que compreende; transformar uma planta com um vetor de transformação de planta que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma aspartato quinase modificada, aumentar o teor de aminoácido livre da planta transformada comparada a um controle não transformado onde o vetor também compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo reguladoras operavelmente ligadas .

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o teor de aminoácido livre total de uma planta ou progênie transformada da mesma, que compreende; transformar uma planta com um vetor de transformação de planta que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma aspartato quinase modificada, aumentar o teor de aminoácido livre da planta transformada comparada a um controle não transformado onde o vetor também compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo reguladoras operavelmente ligadas, onde a uma ou mais sequências de nucleotídeo reguladoras são selecionadas do grupo que consiste em promotores, terminadores, intensificadores de translação, sequências de nucleotídeo par replicação em uma célula hospedeira adequada, sequências de nucleotídeo para integração em um genoma, e combinações dos mesmos.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o teor de aminoácido livre total de uma planta ou progênie transformada da mesma, que compreende; transformar uma planta com um vetor de transformação de planta que compreende um polinucleotídeo isolado que codifica uma aspartato quinase modificada, aumentar o teor de aminoácido livre da planta transformada comparada a um controle não transformado onde a planta transformada, progênie da mesma, a semente da mesma, ou o óleo da mesma é usado indiretamente como comida ou alimento.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica tendo um construto de gene que compreende uma aspartato quinase modificada que aumentará a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio tal que a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio seja superexpressada na planta transgênica, e a planta transgênica exiba: i) taxa mais rápida de crescimento, ii) maior peso seco ou fresco em maturação, iii) maior fruto ou produto de semente, iv) maior teor de nitrogênio de planta total, v) maior teor de nitrogênio de semente ou fruto, vi) maior teor de aminoácido livre na planta inteira, vii) maior teor de aminoácido livre no fruto ou semente, viii) maior teor de proteína em semente ou fruto, ou ix) maior teor de proteína em um tecido vegetativo, do que uma planta progenitora que não contém o construto de gene.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica tendo um construto de gene que compreende uma aspartato quinase modificada que realçará a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio tal que a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio seja superexpressada na planta transgênica, e a planta transgênica exibe: i) taxa mais rápida de crescimento, ii) maior peso seco ou fresco na maturação, iii) maior fruto ou produto de semente, iv) maior teor de nitrogênio de planta to tal, v) maior teor de nitrogênio na semente ou fruto, vi) maior teor de aminoácido livre na planta inteira, vii) maior teor de aminoácido livre no fruto ou semente, viii) maior teor de proteína na semente ou fruto, ou ix) maior teor de proteína em um tecido vegetativo, do que uma planta progenitora que não contém o construto de gene, que também compreende um promotor de planta.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica tendo um construto de gene que compreende uma aspartato quinase modificada que aumentará a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio tal que a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio seja superexpressada na planta transgênica, e a planta transgênica exiba: i) taxa mais rápida de crescimento, ii) maior peso seco ou fresco na maturação, iii) maior fruto ou produto de semente, iv) maior teor de nitrogênio de planta total, v) maior teor de nitrogênio na semente ou fruto, vi) maior teor de aminoácido livre na planta inteira, vii) maior teor de aminoácido livre no fruto ou semente, viii) maior teor de proteína na semente ou fruto, ou ix) maior teor de proteína em um tecido vegetativo, do que uma planta progenitora que não contém a construção de gene, que também compreende um promotor de planta, onde o promotor de planta é promotor CaMV 35S.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica tendo um construto de gene que compreende uma aspartato quinase modificada que aumentará a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio tal que a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio seja superexpressada na planta transgênica, e a planta transgênica exiba: i) taxa mais rápida de crescimento, ii) maior peso seco ou fresco na maturação, iii) maior fruto ou produto de semente, iv) maior teor de nitrogênio de planta total, v) maior teor de nitrogênio na semente ou fruto, vi) maior teor de aminoácido livre na planta inteira, vii) maior teor de aminoácido livre no fruto ou semente, viii) maior teor de proteína na semente ou fruto, ou ix) maior teor de proteína em um tecido vegetativo, do que uma planta progenitora que não contém a construção de gene, que também compreende um promotor de planta, onde o promotor de planta é o promotor USP99.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica tendo um construto de gene que compreende uma aspartato quinase modificada que aumentará a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio tal que a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio seja superexpressada na planta transgênica, e a planta transgênica exiba: i) taxa mais rápida de crescimento, ii) maior peso seco ou fresco na maturação, iii) maior fruto ou produto de semente, iv) maior teor de nitrogênio de planta total, v) maior teor de nitrogênio na semente ou fruto, vi) maior teor de aminoácido livre na planta inteira, vii) maior teor de aminoácido livre no fruto ou semente, viii) maior teor de proteína na semente ou fruto, ou ix) maior teor de proteína em um tecido vegetativo, do que uma planta progenitora que não contém a construção de gene, que também compreende um promotor de planta, onde o promotor de planta é o promotor 7Sa’.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma semente de uma planta transgênica tendo um construto de gene que compreende uma aspartato quinase modificada que aumentará a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio tal que a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio seja superexpressada na planta transgênica, e a planta transgênica exiba: i) taxa mais rápida de crescimento, ii) maior peso seco ou fresco na maturação, iii) maior fruto ou produto de semente, iv) maior teor de nitrogênio de planta total, v) maior teor de nitrogênio na semente ou fruto, vi) maior teor de aminoácido livre na planta inteira, vii) maior teor de aminoácido livre no fruto ou semente, viii) maior teor de proteína na semente ou fruto, ou ix) maior teor de proteína em um tecido vegetativo, do que uma planta progenitora que não contém a construção de gene, que também compreende um promotor de planta, onde a semente contém o construto de gene transgênico.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um progênie, clone, linhagem de célula ou célula de uma planta transgênica tendo um construto de gene que compreende uma aspartato quinase modificada que aumentará a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio tal que a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio seja superexpressada na planta transgênica, e a planta transgênica exiba: i) taxa mais rápida de crescimento, ii) maior peso seco ou fresco na maturação, iii) maior fruto ou produto de semente, iv) maior teor de nitrogênio de planta total, v) maior teor de nitrogênio na semente ou fruto, vi) maior teor de aminoácido livre na planta inteira, vii) maior teor de aminoácido livre no fruto ou semente, viii) maior teor de proteína na semente ou fruto, ou ix) maior teor de proteína em um tecido vegetativo, do que uma planta progenitora que não contém a construção de gene, que também compreende um promotor de planta, onde o referido progênie, clone, linhagem de célula ou célula tenha o construto de gene transgênico.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece uma planta transgênica ou uma planta progenitora da mesma tendo um construto de gene que compreende uma aspartato quinase modificada que aumentará a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio tal que a enzima de metabolismo/assimilação de nitrogênio seja superexpressada na planta transgênica, e a planta transgênica exiba: i) taxa mais rápida de crescimento, ii) maior peso seco ou fresco na maturação, iii) maior fruto ou produto de semente, iv) maior teor de nitrogênio de planta total, v) maior teor de nitrogênio na semente ou fruto, vi) maior teor de aminoácido livre na planta inteira, vii) maior teor de aminoácido livre no fruto ou semente, viii) maior teor de proteína na semente ou fruto, ou ix) maior teor de proteína em um tecido vegetativo, do que uma planta progenitora que não contém a construção de gene, que também compreende um promotor de planta, onde as plantas transgênicas e progenitoras da mesma são selecionadas do grupo que consiste em Arabidopsis, milho, trigo, arroz, soja, ou Brassica.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de produzir uma planta transgênica tendo uma característica agronômica ou nutricional melhorada, cujo método compreende identificar uma planta transgênica super-expressando uma aspartato quinase modificada dentre as plantas transgênicas não tendo um construto de gene que compreende um gene que codifica uma asparatato quinase modificada.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de arginina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de arginina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada, onde a linhagem de planta modificada compreende um aumento de 2 vezes nos níveis de arginina em tecido de planta, que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de asparagina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de asparagina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada, onde a linhagem de planta modificada compreende um aumento de 2 a 6 vezes nos níveis de asparagina em tecido de planta, que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de glutamina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de uma glutamina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada, onde a linhagem de planta modificada compreende um aumento de 2 vezes nos níveis de glutamina em tecido de planta, que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de serina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de serina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada, onde a linhagem de planta modificada compreende um aumento de 10 a 30 vezes nos níveis de serina no tecido de planta, que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de metionina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de metionina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada, onde a linhagem de planta modificada compreende um aumento de 2 a 5 vezes nos níveis de metionina em tecido de planta, que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de lisina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir uma linhagem de planta modificada tendo uma quantidade aumentada de lisina quando comparada a uma linhagem de planta origem não modificada, onde a linhagem de planta modificada compreende um aumento de 2 vezes nos níveis de lisina no tecido de planta, que compreende as etapas de introduzir em uma planta uma alteração genética de uma sequência de DNA para uma enzima aspartato quinase.

As modalidades descritas no contexto de um método e/ou composição da invenção podem ser empregadas com respeito a qualquer outro método ou composição descrito em seus pedidos. Desse modo, uma modalidade que pertence a um método ou composição pode ser aplicada aos outros métodos e composições da invenção também.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Diagrama Esquemático da Série de Reações Biossinté-tica da Família de Aspartato.

Figura 2: Análise da truncação de Xenorhabdus bovienii aspartato quinase (AK).

Figura 3: pMON81662 Figura 4: pMON81658 Figura 5: pMON81689 Figura 6: pMON101817 Figura 7: pMON101818 Figura 8: pMON101819 Figura 9: pMON101820 Figura 10: pMON101821 Figura 11: pMON101822 Figura 12: Descrição gráfica de biomassa aumentada do broto em mudas transgênicas expressando sequências variantes de Xenorhabdus bovienii aspartato quinase.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 X. bovienii.AK.E257K DNA; corresponde a pMON10181. SEQ ID NO: 2 X. bov7en/i.AK.T359l DNA; corresponde a pMON101819 e pMON101820. SEQ ID NO: 3 X. dowen//.AK.T359l.nno DNA; corresponde a pMON101821 e pMON101822.

SEQ ID NO: 4 X. bov/en//.AK.E257K/T359l DNA SEQ ID NO: 5 X. bov/en/7.AK-AN-345 to 361 DNA; corresponde a pMON81689. SEQ ID NO: 6 X. bov/en/Y.AK.do tipo selvagem DNA; corresponde a pMON101817. SEQ ID NO: 7 X. bovienii.AK.E257K sequência de aminoácido. SEQ ID NO: 8 X. òov/en/l.AK.T359l sequência de aminoácido. SEQ ID NO: 9 X. bovíen7/.AK.E257K/T359l sequência de aminoácido. SEQ ID NO: 10 X. bovien7/.ΑΚ-ΔΝ-345 a 361 sequência de aminoácido. SEQ ID NO: 11 Iniciador dianteiro de PCR para isolar Xò.AK de DNA genômico. SEQ ID NO: 12 Iniciador reverso de PCR par isolar isolating Xb.AK de DNA genômico. SEQ ID NO: 13 Peptídeo de alvejamento de cloroplasto (CTP1). SEQ ID NO: 14 Iniciador de PCR dianteiro para isolar E. coli lysC. SEQ ID NO: 15 Iniciado de PCR reverso para isolar E. coli lysC. SEQ ID NO: 16 Realimentação insensível de E. coli (T352I) lysC DNA. SEQ ID NO: 17 Realimentação insensível de E. coli - (T352I) lysC sequência de aminoácido. SEQ ID NO: 18 XbAKXholRv Iniciador reverso. SEQ ID NO: 19XbAKNdelFr Iniciador dianteiro. SEQ ID NO: 20 XbAKE257KFr Iniciador dianteiro. SEQ ID NO: 21 XbAKE257KRv Iniciador reverso. SEQ ID NO: 22 XbAKT359IFr Iniciador dianteiro. SEQ ID NO: 23 XbAKT359IRv Iniciador reverso DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção fornece DNAs, vetores, células hospedeiras e plantas transgênicas isoladas os quais compreendem um ácido nucleico isolado que codifica um gene de aspartato quinase modificado capaz de fornecer níveis elevados de treonina e outros aminoácidos derivados de aspartato sob expressão na planta. Em uma modalidade, o ácido nucleico isolado codifica uma aspartato quinase modificada (AK). Em outras modalidades, o ácido nucleico isolado codifica uma aspartato quinase que é substancialmente resistente à inibição por lisina livre. A expressão da aspartato quinase modificada eleva o nível de treonina, por exemplo, treonina livre na semente, sobre o nível presente na planta e ausente em tal expressão.

Os métodos são também fornecidos para produzir plantas transgênicas tendo ácidos nucleicos associados com a atividade aumentada de aspartato quinase, e produzir células cultivadas, tecido de plantas, plantas, partes de planta e sementes que produzem níveis elevados de treonina. Tais plantas transgênicas podem sexualmente transmitir a capacidade de produzir níveis elevados de treonina a sua progênie. Também descritos são métodos para produzir DNAs isolados codificando a aspartato quinase modificada, e técnicas seleção de cultura de célula para selecionar novos genótipos que superproduzem treonina e/ou são resistentes a inibição de realimenta-ção por lisina. Por exemplo, para produzir linhagens de soja capazes e produzir níveis elevados de treonina, as células de soja transgênicas que contêm pelo menos um dos DNA isolados da presente invenção são preparadas e caracterizadas, em seguida regeneradas em plantas. Alguns dos DNA isolados são resistentes à inibição de crescimento por lisina. Os métodos forne- ciclos na presente invenção podem também ser usados para produzir níveis aumentados de treonina livre em plantas dicotiledôneas, tais como outros legumes, bem como em monocotiledôneas, tais como grão de cereais.

No contexto desta descrição vários termos devem ser utilizados. Os termos "polinucleotídeo", "sequência de polinucleotídeo", e "sequência de ácido nucleico" são usados alternadamente aqui. Estes termos abrangem sequências de nucleotídeo e similares. Um polinucleotídeo pode ser um polímero de RNA ou DNA que é um filamento único ou duplo, que opcionalmente contém bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais, ou alteradas bases. Um polinucleotídeo na forma de um polímero de DNA pode ser compreendido de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico, DNA sintético, ou misturas dos mesmos. Um polinucleotídeo isolado da presente invenção pode incluir pelo menos um dos 1300 nucleotídeos contíguos derivados de SEQ ID NOs: 1,2, 3, 4 ou 5. O termo polinucleotídeo "isolado" refere-se a um polinucleotídeo que é substancialmente livre de outra sequência de ácidos nucleicos, tal como outro DNA e RNA cromossômico e extracromossômico, que normalmente acompanha ou interagem com ele quando encontrado em seu ambiente de ocorrência natural. Os polinucleotídeos isolados podem ser purificados de uma célula hospedeira na qual eles ocorrem naturalmente. Os métodos de purificação de ácido nucleico convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para obter polinucleotídeos isolados. O termo também abrange polinucleotídeos recombinantes e polinucleotídeo quimicamente sintetizados.

Como usado aqui, níveis "alterados" de treonina em uma planta transformada, tecido de planta, parte da planta ou célula de planta são níveis que são maiores ou menores do que os níveis encontrados na planta não transformada, tecido de planta, parte de planta ou célula de planta correspondente. A frase "consiste essencialmente em" como usada com respeito às moléculas de DNA presentes, sequências ou segmentos é definida para significar que uma porção maior da molécula, sequência ou segmento de DNA codifica uma aspartato quinase. A menos que de outro modo indicado, a molécula, sequência ou segmento de DNA geralmente não codifica as proteínas exceto uma aspartato quinase. O termo "complementar a" é usado aqui para significar que a sequência de uma cepa e ácido nucleico pôde hibridizar para todo, ou uma porção de uma sequência de polinucleotídeo de referência. Para ilustração, a sequência de nucleotídeo "TATAC" tem 100% de identidade com uma sequência e referência 5'-TATAC-3' porém é 100% complementar a uma sequência 5'-GTATA-3' de referência.

Como usado aqui, uma aspartato quinase "exógeno" é uma aspartato quinase que é codificado por um DNA isolado que foi introduzido em uma célula hospedeira, e que é preferivelmente não idêntico a qualquer sequência de DNA presente n célula em seu estado nativo, não transformado. Uma aspartato quinase "endógeno" ou "nativo" é uma aspartato quinase que está naturalmente presente em uma célula hospedeira ou organismo.

Como usado aqui, níveis "aumentado," "superior" ou "elevado" de treonina livre em uma célula de planta, tecido de planta, parte de planta ou planta são níveis que são cerca de 2 a 100 vezes, preferivelmente cerca de 5 a 100 vezes, e mais preferivelmente cerca de 10-100 vezes, os níveis encontrados em uma célula não transformada de planta, tecido de planta, parte de planta ou planta, isto é, um onde o genoma não foi alterado pela presença de um ácido nucleico de aspartato quinase exógeno ou domínio do mesmo. Por exemplo, os níveis de treonina livre em uma semente de planta transformada são comparados com aqueles em uma semente de planta não transformada ("o material de partida").

As moléculas de DNA que codificam uma aspartato quinase, e moléculas de DNA que codificam um peptídeo transitório ou gene marca-dor/repórter são "isoladas" pelo fato de que elas foram tomadas de sua fonte natural e não estão mais dentro da célula onde elas normalmente existem. Tais moléculas de DNA isolado podem ter sido pelo menos parcialmente preparadas ou manipuladas in vitro, por exemplo, isoladas de uma célula na qual elas são normalmente encontradas, purificadas, e amplificadas. Tais moléculas de DNA isolado também podem ser "recombinantes" pelo fato de que foram combinadas com moléculas de DNA exógenas ou segmentos. Por exemplo, um DNA recombinante pode ser um DNA isolado que é operavelmente ligado a um promotor exógeno, ou a um promotor que é endógeno à célula hospedeira. O termo abrange ácidos nucleicos que são bioquímicamente purificados para substancialmente remover os ácidos nucleicos con-taminantes e outros componentes celulares. O termo também abrange ácidos nucleicos recombinantes e ácidos nucleicos quimicamente sintetizados.

Como usado aqui, um gene "nativo" significa um gene que não foi carregado in vitro, isto é, um gene "do tipo selvagem" que não foi mutado in vitro. O termo "plastídio" refere-se à classe de organelas de célula de planta que incluem amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, elaioplastos, eoplastos, etioplastos, leucoplastos, e proplastídios. Estas organelas são-auto-replicantes, e contêm o que é comumente referido como um "genoma de cloroplasto", uma molécula de DNA circular que varia em tamanho de cerca de 120 a cerca de 217 kb, dependendo da espécie de planta, e que geralmente contém uma região de repetição invertida.

Como usado aqui, "polipeptídeo" significa uma cadeia contínua de aminoácidos os quais estão todos ligados juntos por ligações de peptí-deo, exceto para os aminoácidos de terminal de N e de terminal de C que têm grupos amino e carboxilato, respectivamente, e que não estão ligados em ligações de peptídeo. Os polipeptídeos podem ter qualquer comprimento e podem ser pós-translacionalmente modificados, por exemplo, por glicosila-ção ou fosforilação. O termo "5' UTR" refere-se à região não transladada de DNA a montante, ou 5', da região de codificação de um gene. O termo "3' UTR" refere-se à região não transladada de DNA a jusante, ou 3', da região de codificação de um gene. O termo "substancialmente homólogo" refere-se a duas sequências que são pelo menos cerca de 90% idênticas na sequência, quando medidas pelo programa BestFit descrito aqui (Versão 10; Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wl), usando parâmetros básicos. A porcentagem de identidade de sequência é preferivelmente determinada usando o programa "Best Fit" ou "Gap" do Pacote de Software de Análise de Sequência (Versão 10; Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wl). "Gap" utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências que maximizam vários pares e minimizam vários espaços. "BestFit" realiza um alinhamento ideal do melhor segmento de similaridade entre as duas sequências e inserções de espaços para maximizar vários pares usando o algoritmo de homologia local de Smith e Water-man (Smith e Waterman, 1981; Smith e outros, 1983). O percentual de identidade é mais preferivelmente determinado usando o programa Best Fit u-sando parâmetros básicos. Como usado aqui, o termo "de modo operatório ligado" significa que um promotor é conectado a uma região de codificação de um tal modo que a transcrição de tal região de codificação seja controlada e regulada por aquele promotor. Os meios para, de modo operatório, ligar um promotor a uma região de codificação são bem conhecidos na técnica. O termo "substancialmente idêntico" como usado aqui refere-se a uma comparação da molécula de polinucleotídeos que codifica a mesma ou quase a mesma proteína ou polipeptídeo. O código genético de quatro letras (A, G, C, e T/U) compreende três códons de letra que direcionam as moléculas de t-RNA para montar os aminoácidos em um polipeptídeo de um modelo de mRNA. Tendo mais do que um códon que pode codificar para o mesmo aminoácido é referido como degenerado. Os códons degenerados são usados para construir moléculas de polinucleotídeo substancialmente idênticas que codificam o mesmo polipeptídeo onde estas moléculas de polinucleotídeo têm uma sequência de nucleotídeos quando comparado ao longo de seu comprimento total no qual eles são pelo menos 85% idênticos a um outro, mais preferivelmente 86 a 90% idênticos a um outros, ainda mais preferivelmente 91 a 95% idênticos a um outro, ou mais preferivelmente 96 a 99% idênticos a um outro. Tais sequências podem diferir devido às altera ções em uma ou mais bases, incluindo uma região de codificação com uma truncação ou deleção, ainda assim codificando um polipeptídeo com atividade de aspartato quinase.

Um "polinucleotídeo não nativo" como usado na presente invenção é uma sequência de DNA designada de acordo com os métodos da presente invenção e criada como uma molécula de DNA isolado par uso em um construto de DNA que fornece expressão de uma proteína em células hospedeiras, e para os propósitos de clonar em construções apropriadas ou outros usos conhecidos por aqueles versados na técnica. Os programas de computador estão disponíveis para estes propósitos, incluindo, porém não limitado aos programas "BestFit" ou "Gap" do Pacote de Software de Análise de Sequência, Genetics Computer Group (GCG), Inc., University de Wiscon-sin Biotechnology Center, Madison, Wl 53711. O polinucleotídeo não nativo pode ser criado por um ou mais métodos conhecidos na técnica e inclui, porém não está limitado a, PCR de sobreposição e síntese química. Uma molécula de polinucleotídeo não nativa da presente invenção é substancialmente idêntica aos outros polinucleotídeos que codificam para a proteína idêntica ou quase idêntica. O termo "translação" refere-se à produção correspondendo ao produto de gene, isto é, um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína de um mRNA.

Como usado aqui, o termo "nutricionalmente intensificado" refere-se a um nível elevado, aumentado ou superior de um aminoácido particular em uma célula de planta quando comparado ao nível do mesmo aminoácido encontrado em uma célula de planta não transformada, tecido de planta, parte de planta ou planta, isto é, um onde o genoma não tenha sido alterado pela presença de um ácido nucleico exógeno. Por exemplo, os níveis de treonina livre em uma semente de planta transformada são comparados com aqueles em uma semente de planta não transformada ("o material de partida").

Como usado aqui, "expressão" é o processo da transcrição de um gene para produzir o mRNA correspondente e translação deste mRNA para produzir o produto de gene correspondente (isto é, um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína). "Expressão realçada" refere-se a um nível elevado, aumentado ou superior de um aminoácido particular em uma célula de planta quando comparado ao nível do mesmo aminoácido encontrado em uma célula de planta não transformada, tecido de planta, parte de planta ou planta, isto é, um onde o genoma não foi alterado pela presença de um ácido nucleico e-xógeno.

Como usado aqui, "alimento" refere-se aos materiais disponíveis para alimentar animais que incluem sem limitação pilhagem, forragem, e concentrados.

Como usado aqui, "Comida" refere-se às substâncias que são ingeridas por humanos e contêm nutrientes que podem ser metabolizados para produzir energia. O termo "gene", como usado aqui, refere-se ao DNA cromossô-mico, DNA de plasmídeo, cDNA, DNA sintético, ou outro DNA que codifique um peptídeo, polipeptídeo, proteína, ou molécula de RNA.

Um hospedeiro ou organismo de hospedeiro inclui células de bactérias, fungos, animais e células de animal, plantas e células de planta, ou qualquer parte de plantas ou tecidos incluindo protoplastos, caule, raízes, tubérculos, sementes, troncos, folhas, mudas, embriões, e pólen.

Transformação, como usado aqui, refere-se à introdução de ácido nucleico em um hospedeiro recipiente. Uma célula que tenha passado por transformação como definido acima é considerada ser uma célula transformada. Um organismo que tenha passado por transformação como definido acima é considerado ser um organismo transformado.

Transgene, como usado aqui, é qualquer parte de uma molécula de ácido nucleico que é inserida por artifício em uma célula, ou um antecessor da mesma, e se toma parte do genoma da planta ou animal que se desenvolve a partir da célula. Um tal transgene pode incluir um gene que é parcialmente ou totalmente exógeno (isto é, estrangeiro) à planta transgênica ou animal, ou pode representar um gene tendo identidade com um gene endógeno da planta ou animal. O significado de "transgênico", como usado aqui, é qualquer célula que inclua uma molécula de ácido nucleico que tenha sido inserida por artifício em uma célula, ou um antecessor da mesma, e que se torna parte do genoma da planta ou animal que se desenvolve a partir desta célula. "Degeneração de códon" refere-se à divergência no código genético permitindo a variação da sequência de nucleotídeo sem afetar a sequência de aminoácido de um polipeptídeo codificado. Consequentemente, a presente invenção refere-se a qualquer fragmento de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeo que codifica toda ou uma porção substancial das sequências de aminoácido apresentadas aqui. O técnico versado está bem ciente da "tendência do códon" exibida por uma célula hospedeira específica em uso de códons de nucleotídeo para especificar um determinado aminoácido. Portanto, ao sintetizar um fragmento de ácido nucleico para expressão melhorada em uma célula hospedeira, é desejável designar o fragmento de ácido nucleico tal que sua frequência de uso de códon se aproxime da frequência de uso de códon preferido da célula hospedeira. O termo "plasmídeo" refere-se a um construto de DNA de filamento duplo (ds) circular que é usada como um vetor de clonagem, e que forma um elemento genético autorreplicante extracromossômico em muitas bactérias e alguns eucariotas.

As alterações em um fragmento de ácido nucleico que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalente em um determinado sítio, porém não afetam as propriedades funcionais do polipeptídeo codificado, são bem conhecidas na técnica. Desse modo, um códon para a a-lanina de aminoácido, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um códon que codifica outro resíduo menos hidrofóbico, tal como glicina, ou um resíduo mais hidrofóbico, tal como valina, leucina, ou isoleucina. Isto é o que é pretendido ser entendido pelo termo "substituição de não alanina para alanina" ou "substituição não conservadora".

Similarmente, as alterações que resultam na substituição de um resíduo negativamente carregado por outro, tal como ácido aspártico para ácido glutâmico, ou um resíduo positivamente carregado por outro, tal como lisina para arginina podem também ser experimentadas para produzir um produto funcionalmente equivalente, e são referidas como "substituições conservadoras". As alterações de nucleotídeo que resultam nas alterações das porções de terminal de N e de terminal de C da molécula de polipeptídeo também não seriam esperadas alterar a atividade do polipeptídeo. Cada uma das modificações proposta está bem dentro da rotina de habilidade na técnica, como é determinação de retenção da atividade biológica dos produtos codificados.

Uma sequência de aminoácido variante ou modificada é uma na qual uma substituição, ou de não alanina para alanina, não conservadora, ou conservadora, alterou um ou mais aminoácidos na sequência. Ao fazer tais mudanças, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice de aminoácido hidropático em conferir função biológica interativa em uma proteína é geralmente entendida na técnica (Kyte e Doolit-tle, J. Mol. Biol., 157: 105-132, 1982). É aceito que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribua com a estrutura secundária da proteína resultante, que sucessivamente define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, substratos. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base em sua hidrofobicidade e características de carga. Essas são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5);metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutama-to/glutamina/aspartato/asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).

Sabe-se na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um escore ou índice hidropático similar e ainda resulta em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda obtém uma proteína biologicamente funcional. Ao fazer tais alterações, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão em ±2, é preferida, aqueles em ±1 são mais preferidos, e aqueles em ±0,5 são os mais preferidos.

Também é entendido na técnica que a substituição de outros aminoácidos pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade. A Patente Patente dos Estados Unidose No. 4.554.101 (Hopp) declara que a hidrofilicidade média local maior de uma proteína, quando administrada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com uma propriedade biológica da proteína. Os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos aos aminoácidos: arginina/lisina (+3,0); aspartato/glutamato (+3,0 ±1); serina (+0,3); asparagina/glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ±1); alanina/histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina/isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); e trip-tofano (-3,4). É entendido que um aminoácido pode ser substituído por outro aminoácido tendo um escore de hidrofilicidade similar e ainda resulta em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda obtém uma proteína biologicamente funcional. Ao fazer tais mudanças, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão em ±2 é preferida, aqueles em ±1 são mais preferidos, e aqueles em ±0,5 são os mais preferidos.

Como descrito acima, substituições de aminoácido são, portanto com base na similaridade relativa dos substituintes de cadeia lateral de aminoácido, por exemplo, sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho, e similares. As substituições exemplares que levam várias das características anteriores em consideração são bem conhecidas por aqueles de experiência na técnica e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina, e isoleucina. As alterações que não são esperadas serem vantajosas podem também ser usadas se estas resultaram em proteínas tendo resistência a rúmen melhorada, resistência aumentada à degradação proteolítica, ou ambas a resistência ao rúmen melhorada e resistência aumentada à degradação proteolítca, relativo ao polipeptídeo não modificado do qual elas são construídas. O termo "hibridização" refere-se geralmente a capacidade das moléculas de ácido nucleico se unir através de pareamento de filamento de base complementar. Tal hibridização pode ocorrer quando as moléculas de ácido nucleico são contatadas sob condições apropriadas (veja, também, "condições de alta severidade," abaixo). O termo "condições de alta severidade" no contexto de hibridiza-ção é bem conhecido pela técnica, (veja, por exemplo, as seções 0.47-9.51 de Sambrook e outros, (1989); e Sambrook e Russell, (2001), incorporados aqui por referência). Por exemplo, as condições severas são aquelas que (1) empregam baixa força iônica e temperatura elevada para lavagem, por e-xemplo, NaCI a 0,015 M/citrato de sódio a 0,0015 M (SSC); 0,1% de lauril sulfato de sódio (SDS) a 50°C, ou (2) empregam um agente de desnatura-ção tal como formamida durante a hibridização, por exemplo, 50% de for-mamida com 0,1% de albumina de soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de poli-vinilpirrolidona/tampão de fosfato de sódio a 50 mM em pH 6,5 com NaCI a 750 mM, citrato de sódio a 75 mM a 42°C. Outro exemplo é o uso de 50% de formamida, 5 x SSC (NaCI a 0,75 M, citrato de sódio a 0,075 M), fosfato de sódio a 50 mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 x solução de De-nhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), 0,1% de dodecil-sulfato de sódio (SDS), e 10% de sulfato de dextrana a 42°C, com lavagens em 42°C em 0,2 x SSC e 0,1% de SDS. O termo "inibição de produto final" refere-se à redução da atividade enzimática em uma etapa em uma série de reações sintética que é causada por acúmulo dos produtos finais da série de reações. Por exemplo, a atividade das enzimas AK pode ser inibida por lisina e/ou treonina que são os produtos finais em uma série de reações sintética envolvendo AK. Desse modo, em certos aspectos, as enzimas AK descritas aqui são enzimas que não são submetidas à inibição de produto final por lisina e/ou treonina, significando que os produtos finais tais como lisina e treonina têm uma capacidade reduzida de inibir a atividade de AK (quando comparado com a inibição de uma enzima wt AK). Em certos casos, as enzimas AK que não são submetida à inibição de produto final por lisina ou treonina exibem ligação reduzida a lisina e/ou treonina. "Gene" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências reguladoras precedentes (sequências de não codificação 5') e em seguida a (sequências de não codi-ficação3') a sequências de codificação. "Gene nativo" refere-se a um gene como encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. "Gene quimérico" refere-se a qualquer gene que não seja um gene nativo, que compreende sequências de codificação e reguladoras que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, porém dispostas de uma maneira diferente do que aquela encontrada na natureza. "Gene endógeno" refere-se a um gene nativo em seu local natural no genoma de um organismo. Um gene "estrangeiro" refere-se a um gene não normalmente encontrado no organismo do hospedeiro, porém que é introduzido no organismo do hospedeiro por transferência de gene. Os genes estrangeiros podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação. "Sequências de codificação" ou "gene estrutural" refere-se a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido específica ou um RNA funcional (tal como, por exemplo, RNAs associados com a estrutura de ribossoma ou um RNA de transferência (tRNA). "Sequências reguladoras" ou "genes reguladores" refere-se às sequências de nucleotídeo localizadas a montante (sequências de não codificação 5'), dentro, ou a jusante (sequências de não codificação 3') de uma sequência de codificação, e que influenciam a transcrição, estabilidade ou processamento de RNA, ou translação das sequências de codificação associadas. As sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências líderes de translação, íntrons, e sequências de reconhecimento de poliadenilação. "Promotor" refere-se a uma sequência de nucleotídeo capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. Em geral, a sequência de codificação está localizada 3' a uma sequência promotora. A sequência promotora consiste em elementos a montante pro- ximais e mais distais, os últimos elementos frequentemente referidos como intensificadores. Consequentemente, um "intensificador" é uma sequência de nucleotídeo, que pode estimular a atividade promotora e pode ser um e-lemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para realçar o nível ou especificidade de tecido de um promotor. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo, ou serem compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou ainda compreendem segmentos de nucleotídeo sintéticos. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em tecidos diferentes ou tipos de célula, ou em estágios diferentes de desenvolvimento, ou em resposta às diferentes condições ambientais. Os promotores que fazem com que um fragmento de ácido nucleico seja expresso na maioria dos tipos de célula na maioria das vezes são comumente referidos como "promotores constitutivos". Novos promotores de vários tipos úteis em células de planta estão sendo constantemente descobertos; numerosos exemplos podem ser encontrados na compilação por Okamuro e Goldberg, Biochemistry of Plants, 15:1-82 (1989). É também reconhecido na técnica que as ligações exatas de sequências reguladoras geralmente não foram completamente definidas, consequentemente, os fragmentos de ácido nucleico de comprimentos variantes que estão a montante de (isto é, 5' a) das sequências de codificação podem ter atividade promotora idêntica. A biomassa refere-se ao material biológico vivo e recentemente morto que pode ser usado como combustível ou para produção industrial. Mais comumente, a biomassa refere-se a um material de planta desenvolvido para uso como biocombustível, porém também inclui material de planta ou animal usado para a produção de fibras, substâncias químicas, comida e calor.

Vigor/biomassa intensificado, como usado aqui, é uma característica de desenvolvimento de uma planta por meio da qual há um tamanho elevado, aumentado ou maior de material de planta acima da terra após a germinação da semente quando comparado ao tamanho do material de planta encontrado em uma célula de planta do tipo selvagem, tecido de planta, parte de planta ou planta, isto é, um onde o genoma não foi alterado pela presença de um ácido nucleico exógeno. Por exemplo, vigor intensificado pode ser demonstrado em plantas transgênicas por partes de planta mais altas, mais cheias, mais folhosas e verde mais escuro do que aquelas de plantas do tipo selvagem.

Inibição de produto final é uma regulação da atividade de um produto ou metabólito celular por um metabólito ou produto a jusante em uma série de reações metabólica. O termo "vetor" refere-se a um construto de ácido nucleico designada para transferência entre diferentes células hospedeiras. Um "vetor de expressão" refere-se a um vetor que tem a capacidade de incorporar e expressar fragmentos de DNA heterólogo em uma célula estrangeira. Muitos vetores de expressão procarióticos e eucarióticos estão comercialmente disponíveis. A seleção de vetores de expressão apropriados está dentro do conhecimento daqueles tendo experiência na técnica.

Um replicon é uma molécula de DNA ou molécula de RNA, ou uma região de DNA ou RNA, que replica de uma única origem de replicação.

Transcricionalmente ativo refere-se à capacidade de qualquer molécula de polinucleotídeo ser transcrita em uma molécula de RNA. Os métodos são conhecidos para introduzir as construções em uma célula de tal maneira que a molécula de polinucleotídeo transcricionável seja transcrita em uma molécula de mRNA funcional que é transladada e portanto expressa como um produto de proteína. Uma tal molécula de polinucleotídeo seria entendida ser transcricionalmente ativa.

Os aminoácidos essenciais são aqueles aminoácidos que não podem ser sintetizados de novo pelo organismo e, portanto, devem ser fornecidos na dieta.

Aminoácidos livres são aqueles aminoácidos que não estão ligados a outros componentes da célula incluindo, porém não limitado a, proteínas, constituintes de parede celular, e organelas. O termo "operavelmente ligado" refere-se à associação de dois ou mais fragmentos de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico de modo que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado com as sequências de codificação quando é capaz de afetar a expressão daquelas sequências de codificação (isto é, que as sequências de codificação estão sob o controle transcricional do promotor). As sequências de codificação podem ser operavelmente ligadas às sequências reguladoras na orientação de sentido ou antissenso. A presente invenção refere-se a novos ácidos nucleicos e métodos para obter plantas que produzem níveis elevados de treonina livre. A superprodução resulta da introdução e expressão de um ácido nucleico que codifica uma aspartato quinase modificada.

Os aspartatos quinases de planta nativa são geralmente muito sensíveis à inibição de realimentação por lisina. Tal inibição constitui um mecanismo principal para regular a série de reações sintética de treonina. Portanto, uma aspartato quinase que é altamente ativo, mais eficiente ou que é inibido a um grau menor por lisina provavelmente produzirá níveis elevados de treonina. De acordo com a invenção, a aspartato quinase de Xeno-rhabdus bovienii modificado é particularmente útil para produzir níveis elevados de treonina.

Para gerar níveis elevados de treonina em uma planta ou uma célula hospedeira selecionada, o ácido nucleico de aspartato quinase selecionado é isolado e pode ser manipulado in vitro par incluir sinais reguladores requeridos para expressão de gene em células de planta ou outros tipos de célula. Por que a série de reações biossintética de treonina em plantas é reportada estar presente em plastídios, os ácidos nucleicos de aspartato quinase exógenos são ou introduzidos em plastídios ou são modificados adi-cionando-se um segmento de ácido nucleico que codifica um peptídeo transitório de plastídio de terminal de amino. Um tal peptídeo transitório de plas-tídio pode direcionar o produto de gente de aspartato quinase nos plastídios. Em alguns casos, a aspartato quinase pode já conter uma sequência de transporte de plastídio, caso no qual não há necessidade de adicionar uma.

Para alterar a biossíntese de treonina, o ácido nucleico que codi fica uma atividade de aspartato quinase deve ser introduzido em células de planta ou outras células hospedeiras e estas células transformadas identificadas, ou diretamente ou indiretamente. Uma aspartato quinase total ou uma porção útil do mesmo pode ser usado. A aspartato quinase é estavel-mente incorporada no genoma de célula de planta. Os sinais transcricionais de controle da expressão da aspartato quinase devem ser reconhecidos por e ser funcionai nas células de planta ou outras células hospedeiras. Isto é, a aspartato quinase deve ser transrita em um RNA mensageiro (mRNA), e o mRNA deve ser estável no núcleo de célula de planta e ser transportado intacto ao citoplasma para translação. O mRNA de aspartato quinase deve ter sinais translacionais apropriados a serem reconhecidos e apropriadamente transladados por ribossomas de célula de planta. O produto de gene de polipeptídeo deve substancialmente escapar do ataque proteolítico no citoplasma, ser transportado no compartimento celular correto (por exemplo, um plastídio) e ser capaz de assumir uma conformação tri-dimensional que irá conferir atividade enzimática. A aspartato quinase deve também ser capaz de funcionar na biossíntese de treonina e seus derivados; isto é, deve estar localizado próximo às enzimas de planta nativa catalisando as etapas de flanqueamento na biossíntese (presumivelmente em um plastídio) para obter os substratos requeridos e transmitir o produto apropriado.

Mesmo se todas estas condições forem satisfeitas, a superprodução bem sucedida de treonina não é um evento previsível. A expressão de alguns transgenes pode ser negativamente afetada por elementos cromos-sômicos próximos. Se o nível elevado de treonina é obtido por modificação para reduzir a inibição de realimentação, pode haver outros mecanismos de controle que compensam para a regulação reduzida na etapa de aspartato quinase. Pode haver mecanismos que aumentam a taxa de separação dos aminoácidos cumulados. A treonina e aminoácidos relacionados devem ser também superproduzidos em níveis que não sejam tóxicos para a planta. Finalmente, a marca introduzida deve ser estável e transmissível para permitir o uso e desenvolvimento comercial.

Os ácidos nucleicos que codificam uma aspartato quinase po dem ser identificados e isolados por métodos padrão, por exemplo, como descrito por Sambrook e outros, (1989); Sambrook e Russell, (2001). Por exemplo, uma sequência de DNA que codifica uma aspartato quinase ou um domínio do mesmo pode ser identificada avaliando-se uma biblioteca de DNA ou cDNA gerada de ácido nucleico derivado de um tipo de célula particular, linhagem de célula, células primárias, ou tecido. Além disso, os ácidos nucleicos de aspartato quinase podem ser isolados por procedimentos de amplificação de ácido nucleico usando DNA genômico, mRNA ou cDNA isolado de quaisquer destas espécies. A avaliação para os fragmentos de DNA que codificam toda ou uma porção da sequência que codifica uma aspartato quinase pode ser concluída avaliando-se placas de uma biblioteca genômica ou de cDNA para a hibridização para uma sonda de um gene de aspartato quinase de outros organismos ou avaliando-se as placas de uma biblioteca de expressão de cDNA para ligar aos anticorpos que especificamente reconhecem aspartato quinase. Os fragmentos de DNA que hibridizam para sondas de aspartato quinase de outros organismos e/ou placas que carregam os fragmentos de DNA que são imunorreativos com os anticorpos para aspartato quinase podem ser subclonados em um vetor e sequenciados e/ou usados como sondas para identificar outras sequências de cDNA ou genômicas que codificam toda ou uma porção do gene de aspartato quinase desejado.

Uma biblioteca de cDNA pode ser preparada, por exemplo, por preparação de oligoaleatória ou preparação de oligo dT. As placas contendo fragmentos de DNA podem ser avaliadas com sondas ou anticorpos específicos para aspartato quinase. Os fragmentos de DNA que codificam uma porção de um gene de aspartato quinase podem ser subclonados e sequenciados e usados como sondas para identificar um gene de aspartato quinase genômico. Os fragmentos de DNA que codifica uma porção de uma aspartato quinase bacteriana ou de planta podem ser verificados determinando-se a homologia de sequência com outros genes de aspartato quinase conhecidos ou por hibridização para RNA mensageiro específico de aspartato quinase. Uma vez que os fragmentos de cDNA que codificam as porções das extre midades 5', meio e 3' de uma aspartato quinase são obtidos, eles podem ser usados como sondas para identificar e clonar uma cópia genômica completa do gene de aspartato quinase de uma biblioteca genômica.

As porções da cópia ou cópias genômicas de um gene de aspartato quinase podem ser sequenciadas e a extremidade 5' do gene identificada por métodos padrão incluindo ou por homologia de sequência de DNA a outros genes de aspartato quinase ou por análise de proteção de RNAase, por exemplo, como descrito por Sambrook e outros, (1989); (2001). As extremidades de 3' e 5' do gene-alvo podem ser também localizadas por pesquisas de computador de banco de dados de sequência genômica usando regiões de codificação AS conhecidas. Uma vez que as porções da extremidade 5' do gene são identificadas, as cópias completas do gene de aspartato quinase podem ser obtidas por métodos padrão, incluindo a clonagem ou síntese de reação em cadeia de polimerase (PCR) usando os iniciadores de oligonucleotídeo complementares à sequência de DNA na extremidade 5' do gene. A presença de uma cópia de tamanho natural isolada do gene de aspartato quinase pode ser verificada por hibridização, análise de sequência parcial, ou por expressão de uma enzima de milho de aspartato quinase. A mutagênese direcionada ao sítio pode ser usada para gerar a substituição, deleções e inserções de aminoácidos em uma variedade de sítios. Os exemplos de mutações específicas feitas na região de codificação de aspartato quinase de Xenorhabdus bovienii incluem os seguintes: Em torno da posição 257 substituir Glu com Lys (veja, por exemplo, SEQ ID NOs: 1 e 4);

Em torno da posição 359 substituir Thr com lie (veja, por exemplo, SEQ ID NOs: 2, 3 e 4).

Modificações similares podem ser feitas em posições análogas de qualquer aspartato quinase alinhando-se a sequência de aminoácido da aspartato quinase a ser mutado com uma sequência de aminoácido de aspartato quinase de Xenorhabdus bovienii. Um exemplo de uma sequência de aminoácido de aspartato quinase de Xenorhabdus bovienii que pode ser u-sado para alinhamento é SEQ ID NO: 4.

Em geral, a expressão de genes bacterianos em plantas pode geralmente resultar em acúmulo de proteína ineficiente. Isto pode ser atribuído ao uso subideal de códons de aminoácido na planta hospedeira, resultando na limitação de alguns dos tRNAs correspondendo aos códons raros do gene bacteriano, presença de sítios de processamento de mRNA críptico, ou devido à iniciação ineficiente da translação. O bloqueio principal para expressão de gene bacteriano eficiente em plantas parece estar no nível trans-lacional, como evidenciado por expressão de nível baixo de genes de cry1A(b) e cry1A(c) do tipo selvagem em tabaco, tomate e algodão (Perlak e outros, 1991). Um dos métodos eficientes para aperfeiçoar ou corrigir baixos níveis de expressão de proteína é modificar a sequência de DNA transgene de acordo com a preferência de uso de códon favorável do organismo do hospedeiro. Além disso, a modificação das regiões que são íntrons de planta semelhante ricos em A+T (Goodall e Filipowich, 1989) ou sequências de sinal de poliadenilação potencial e sítios de união de mRNA (Dean e outros, 1986) pode realçar a estabilidade do mRNA no organismo do hospedeiro.

As regiões de codificação de quaisquer das moléculas de DNA fornecida aqui podem também ser aperfeiçoadas para a expressão em um organismo selecionado, por exemplo, uma planta selecionada ou outro tipo de célula hospedeira. Um exemplo de uma molécula de DNA tendo uso de códon aperfeiçoado para uma planta selecionada é uma molécula de DNA de aspartato quinase de Xenorhabdus bovienii tendo SEQ ID NO: 3. Este DNA de aspartato quinase Xenorhabdus bovienii aperfeiçoado (SEQ ID NO: 3) tem 72,6% de identidade com SEQ ID NO: 2.

Uma vez que um ácido nucleico que codifica uma aspartato quinase é obtido e amplificado, I é operavelmente combinado com um promotor e, opcionalmente, com outros elementos para formar um transgene. A maioria dos gene tem regiões de sequência de DNA que são conhecidas como promotores e que regulam a expressão de gene. As regiões promotoras são tipicamente encontradas na sequência de DNA de flan-queamento a montante das sequências de codificação em ambas as células procarióticas e eucarióticas. Uma sequência promotora fornece regulação de transcrição da sequência de gene a jusante e tipicamente inclui de cerca de 50 a cerca de 2.000 pares de base de nucleotídeo. As sequências promotoras também contêm sequências reguladoras tais como sequências intensifi-cadoras que podem influenciar o nível de expressão de gene. Algumas sequências promotoras isoladas podem fornecer expressão de gene de genes heterólogos, isto é, um gene diferente do gene nativo ou homólogo. As sequências promotoras são também conhecidas por serem fortes ou fracas ou induzíveis. Um promotor forte fornece um nível elevado de expressão de gene, ao passo que um promotor fraco fornece um nível muito baixo de expressão de gene. Um promotor induzível é um promotor que fornece ligar e desligar a expressão de gene em resposta a um agente exogenamente adicionado ou a um estímulo ambiental ou de desenvolvimento. Os promotores podem também fornecer regulação específica de tecido ou de desenvolvimento. Uma sequência promotora isolada que é um promotor forte para genes heterólogos é vantajosa por que fornece um nível suficiente de expressão de gene para permitir fácil detecção e seleção de células transformadas e fornece um nível elevado de expressão de gene quando desejado. O promotor em um transgene da presente invenção pode fornecer expressão de aspartato quinase de uma sequência de DNA que codifica aspartato quinase. Preferivelmente, as sequências de codificação são expressas para resultar em um aumento nos níveis de treonina no tecido de plantas, por exemplo, nas sementes da planta. Em outra modalidade, as sequências de codificação são expressas para resultar em tolerância aumentada das células de planta à inibição de realimentação ou a inibição do crescimento por lisina ou para resultar em um aumento no teor de treonina total das células. O promotor pode também ser induzível, de modo que a expressão de gene possa ser ligada ou desligada por um agente exogenamente adicionado. Por exemplo, um promotor bacteriano tal como o promotor Ptac pode ser induzido aos níveis variantes de expressão de gene dependendo do nível de isotiopropilgalactosídeo adicionado às células bacterianas adicionadas às células bacterianas transformadas. Pode também ser preferível combinar o gene com um promotor que fornece expressão específica de te cido ou expressão de gene de maneira desenvolvida regulado e plantas. Muitos promotores úteis na prática da invenção estão disponíveis para aqueles de experiência na técnica.

Os promotores preferidos geralmente incluirão, porém não estarão limitados a, promotores que funcionam em bactérias, bacteriófagos, plastídios ou células de planta. Os promotores úteis incluem o promotor CaMV 35S (Odell e outros, 1985), o CaMV 19S (Lawton e outros, 1987), nos (Ebert e outros, 1987), Adh (Walker e outros, 1987), sacarose sintase (Yang e outros, 1990), α-tubulina, napina, actina (Wang e outros, 1992), cab (Sullivan e outros, 1989), promotor PEPCase (Hudspeth e outros, 1989), promotor de oleosina de milho L3, P-Zm.L3 (Patente dos Estados Unidos 6.433.252), promotor USP99 (Patente dos Estados Unidos 7.078.588), o promotor de 7S-alfa’-conglicinina (Beachy e outros, 1985), o promotor 7Sa’ (Patente dos Estados Unidos 6,825,398) ou aqueles associados com o complexo de gene R (Chandler e outros, 1989). Outros promotores úteis incluem os promotores SP6, T3, e T7 de bacteriófago.

Os promotores de plastídio também podem ser usados. A maioria dos genes de plastídio contém um promotor para o RNA polimerase codificado por plastídio de multi-subunidade (PEP) bem como o RNA polimerase codificado por núcleo de subunidade única. Uma sequência de consenso para os promotores de polimerase codificados por núcleo (NEP) e listagem de sequências promotoras específicas para vários genes de plastídio nativos podem ser encontradas em Hajdukiewicz e outros (1997), que está desse modo em sua totalidade incorporado por referência.

Os exemplos de promotores de plastídio que podem ser usados incluem o promotor de plastídio de RRN de Zea mays (ZMRRN). O promotor de ZMRRN pode conduzir a expressão de um gene quando o RNA polimerase de plastídio de Arabidopsis thaliana está presente. Os promotores similares que podem ser usado na presente invenção são os promotores de plastídio RRN Glicina max (SOYRRN) e plastídio RRN Nicotiana tabacum (NTRRN). Todos os três promotores podem ser reconhecidos pelo RNA polimerase de plastídio de Arabidopsis. As características gerais de promotores de RRN são descritas por Hajdukiewicz e outros e Patente dos Estados Unidos 6.218.145.

Além disso, os intensificadores de transcrição ou duplicações de intensificadores podem ser usados para aumentar a expressão de um promotor particular. Os exemplos de tais intensificadores incluem, porém não estão limitados a, elementos do promotor CaMV 35S e genes de octopina sintase (Last e outros, Patente dos Estados Unidos 5.290.924). Por exemplo, é contemplado que os vetores para uso de acordo com a presente invenção podem ser construídos para incluir o elemento intensificador ocs. Este elemento foi primeiro identificado como um intensificador palindrômico de 16 pb do gene de octopina sintase (ocs) de Agrobacteríum (Ellis e outros, 1987), e está presente em pelo menos 10 outros promotores (Bouchez e outros, 1989). É proposto que o uso de um elemento intensificador, tal como o elemento de ocs e particularmente múltiplas cópias do elemento, atuará para aumentar o nível de transcrição de promotores adjacentes quando aplicados o contexto de transformação de monocotilédone. Os promotores específicos de tecido incluindo, porém não limitado a, promotores de célula de raiz (Conkling e outros, 1990), e intensificadores específicos de tecido (Fromm e outros, 1989) são também contemplados serem particularmente úteis, uma vez que são promotores induzíveis tais como promotores induzíveis por ABA e inchação, e similares.

Uma vez que a sequência de DNA entre o sítio de iniciação de transcrição e o início das sequências de codificação, isto é, a sequência líder não transladada, pode influenciar a expressão de gene, alguém pode também desejar empregar uma sequência líder particular. Qualquer sequência líder disponível para alguém de experiência na técnica pode ser empregada. As sequências líderes preferidas direcionam níveis ideais de expressão do gene preso, por exemplo, aumentando-se ou mantendo-se a estabilidade do mRNA e/ou prevenindo-se a iniciação inapropriada de translação (Joshi, 1987). A escolha de tais sequências está na discrição daqueles de experiência na técnica. As sequências que são derivadas de genes que são altamente expressas em dicotiledôneas, e em soja em particular, são contempladas.

Em alguns casos, a expressão extremamente elevada de aspartato quinase não necessária. Por exemplo, usando os métodos da invenção tais níveis elevados de aspartato quinase podem ser gerados tal que a disponibilidade de substrato, exceto enzima, possa limitar os níveis de treonina gerados. Em tais casos, os níveis mais moderados ou regulados de expressão podem ser selecionados por alguém de experiência na técnica. Tal técnico versado pode facilmente modular ou regular os níveis de expressão, por exemplo, pelo uso de um promotor mais fraco ou pelo uso de um promotor de maneira desenvolvida regulado ou específico de tecido.

Os ácidos nucleicos que codificam a aspartato quinase de interesse podem também incluir um peptídeo transitório de plastídio para facilitar o transporte do polipeptídeo de aspartato quinase em plastídios, por exemplo, em cloroplastos. Um ácido nucleico que codifica o peptídeo transitório de plastídio selecionado (por exemplo, SEQ ID NO: 13) é geralmente ligado na estrutura com as sequências de codificação da aspartato quinase. Entretanto, o peptídeo transitório de plastídio pode se colocado na extremidade de terminal de N ou de terminal de C da aspartato quinase.

Os construtos também incluem o ácido nucleico de interesse (por exemplo, DNA que codifica uma aspartato quinase) junto com uma sequência de ácido nucleico que age como um sinal de terminação de transcrição e que permite a poliadenilação do mRNA resultante. Tais sinais de terminação de transcrição são colocados 3' ou a jusante da região de codificação de interesse. Os sinais de terminação de transcrição preferidos contemplados incluem o sinal de terminação de transcrição do gene de nopalina sin-tase de Agrobacterium tumefaciens (Bevan e outros, 1983), o terminador do gene de octopina sintase de Agrobacterium tumefaciens, o 3’-UTR do gene de glutelina 1 de Oryza sativa (Os-gt1; SEQ ID NO: 148), e a extremidade 3' dos genes que codificam o inibidor I ou II de protease de batata ou tomate, embora outros sinais de terminação de transcrição conhecidos por aqueles versados na técnica também sejam contemplados. Os elementos reguladores tais como ítron 1 adh (Callis e outros, 1987), íntron de sacarose sintase (Vasil e outros, 1989) ou elemento de ômega TMV (Gallie e outros, The Plant Cell, 1:301 (1989)) podem também ser incluídos onde desejado. Estas sequências reguladoras não transladadas 3' podem ser obtidas como descrito em An (1987) ou já estão presente nos plasmídeos disponíveis de fontes comerciais tais como Clontech, (Paio Alto, Califórnia). As sequências reguladoras não transladadas 3' podem ser operavelmente ligadas ao terminal 3 de um gene de aspartato quinase por métodos padrões. Outros tais elementos reguladores úteis na prática da invenção são conhecidos por aqueles de experiência na técnica.

Um construto de DNA pode compreender um primeiro cassete de expressão, compreendido de, em ligação operável, um promotor heteró-logo, uma molécula de DNA que codifica uma proteína de aspartato quinase modificada e um terminador transcricional. Este construto de DNA pode também compreender um segundo cassete de expressão em ligação operável, que compreende um promotor heterólogo, uma molécula de DNA que codifica uma segunda proteína e um terminador transcricional.

Os genes marcadores selecionáveis ou genes repórteres são também úteis na presente invenção. Tais genes podem transmitir um fenótipo distinto às células expressando o gene marcador e desse modo permite que tais células transformadas sejam distinguidas das células que não têm o marcador. Os genes marcadores selecionáveis conferem uma característica que alguém pode "selecionar" por meios químicos, isto é, até o uso de um agente seletivo (por exemplo, um herbicida, antibiótico ou similares). Os genes repórteres ou genes avaliáveis conferem uma característica que alguém pode identificar através de observação ou teste, isto é, por "avaliação" (por exemplo, o traço R-locus). Certamente, muitos exemplos de marcadores de gene adequados são conhecidos pela técnica e podem ser empregado na prática da presente invenção.

Os possíveis marcadores selecionáveis para uso junto com a presente invenção incluem, porém não estão limitados a, um gene neo (Po-trykus e outros, 1985) que codifica para existência de neomicia e pode ser selecionado para usar canamicina, G418, e similares; um gene bar que codifica para resistência a bialafose; um gene que codifica uma proteína de EPSP sintase alterada (Hinchee e outros, 1988) desse modo conferindo resistência ao glifosato; um gene de nitrilase tal como bxn de Klebsiella ozae-nae que confere resistência a bromoxinila (Stalker e outros, 1988); um gene de acetolactato sintase mutante (ALS) que confere resistência a imidazolino-na, sulfonilureia ou outras substâncias químicas de inibição de ALS (EP 154 204 (1985)); um gene de DHFR resistente a metotrexato (Thillet e outros, 1988); ou um gene de dalapon dealogenase que confere resistência ao herbicida dalapon. Onde um gene de EPSP sintase mutante é empregado, benefício adicional pode ser realizado através da incorporação de um peptídeo transitório de plastídio adequado (CTP).

Uma modalidade ilustrativa de um marcador de gene selecioná-vel capaz de ser usado nos sistemas para selecionar os transformantes é o gene que codifica a enzima fosfinotricina acetiltransferase, tal como o gene bar de Streptomyces hygroscopicus ou o gene pat de Streptomyces virídoc-hromogenes (Patente dos Estados Unidos 5.550.318, que está aqui incorporada por referência). A enzima fosfinotricina acetil transferase (PAT) inativa o ingrediente ativo no herbicida bialafos, fosfinotricina (PPT). PPT inibe glutamina sintetase, (Murakami e outros, 1986; Twell e outros, 1989) causando acúmulo rápido de amônia e morte celular.

Marcadores avaliáveis que podem ser usados incluem, porém não estão limitados a, um gene de β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para que vários substratos cromogênicos sejam conhecidos; um gene R-loco, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellaporta e outros, 1988); um gene de β-lactamase (Sutcliffe, 1978), que codifica uma enzima para que vários substratos cromogênicos sejam conhecidos (por e-xemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene xy/E (Zukowsky e outros, 1983) que codifica um catecol dioxigenase que pode converter ca-tecóis cromogênicos; um gene de α-amilase (Ikuta e outros, 1990); um gene de tirosinase (Katz e outros, 1983) que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina para DOPA e dopaquinona que sucessivamente condensa para formar a melanina de composto facilmente detectável; um gene de β-galacto- sidase, que codifica uma enzima para que haja substratos cromogênicos; um gene de luciferase (lux) (Ow e outros, 1986), que permite a detectação de bioluminescência; ou mesmo um gene de equorina (Prasher e outros, 1985), que pode ser empregado em detecção de bioluminescência sensível a cálcio, ou um gene de proteína fluorescente verde (Niedz e outros, 1995). A presença do gene lux em células transformadas pode ser detectada usando, por exemplo, película de raio X, contagem de cintilação, espectrofotometria fluorescente, câmaras de víduo de luz baixa, câmeras de fotocontagem, ou luminometria de multipoço. Também é considerado que este sistema possa ser desenvolvido para avaliação da população para bioluminescência, tal como em placas de cultura de tecido, ou mesmo para avaliação de planta inteira.

Adicionalmente, os transgenes podem ser construídos e empregados para fornecer alvejamento do produto de gene para um compartimento intracelular em células de planta ou no direcionamento de uma proteína para o ambiente extracelular. Isto geralmente será obtido unindo-se uma sequência de DNA que codifica uma sequência de peptídeo de trânsito ou sinal para as sequências de codificação de um gene particular. O peptídeo de trânsito, ou sinal resultante transportará a proteína para um destino particular intracelular, ou extracelular, respectivamente, e pode então ser pós-trans-lacionalmente removido. Os peptídeos de trânsito ou sinal agem facilitando-se o transporte de proteínas através de membranas intracelulares, por e-xemplo, vacúolo, vesícula, plastídio e membranas mitocondriais, ao passo que os peptídeos de sinal direcionam as proteínas através da membrana extracelular. Ao facilitar o transporte da proteína em compartimentos dentro ou fora da célula, estas sequências podem aumentar o acúmulo de produto de gene.

Um exemplo particular de tal uso diz respeito a direção de uma aspartato quinase para uma organela particular, tal como o plastídio, exceto para o citoplasma. Isto é exemplificado pelo uso do peptídeo de trânsito de Arabidopsis SSU1A que confere alvejamento específico de plastídio de proteínas. Alternativamente, o transgene pode compreender uma sequência de DNA de codificação de peptídeo de trânsito de plastídio ou uma sequência de DNA codificando o peptídeo de trânsito rbcS (RuBISCO) operavelmente ligado entre um promotor e a sequência de DNA que codifica uma aspartato quinase (para uma revisão de peptídeo de alvejamento de plastídio, veja Heijne e outros (1989); Keegstra e outros (1989). Se o transgene tiver que ser introduzido em uma célula de planta, o transgene pode também conter sinais de poliadenilação e terminação transcricional de planta e sinais trans-lacionais ligados ao terminal 3' de um gene de aspartato quinase de planta.

Um peptídeo de trânsito de plastídio exógeno pode ser usado o qual não é codificado em um gene de aspartato quinase de planta nativo. Um peptídeo de trânsito de plastídio é tipicamente 40 a 70 aminoácidos em comprimento e funciona pós-translacionalmente para direcionar uma proteína para o plastídio. O peptídeo de trânsito é clivado ou durante ou justamente após introdução no plastídio para produzir a proteína madura. A cópia completa de um gene que codifica uma aspartato quinase de planta pode conter uma sequência de peptídeo de trânsito de plastídio. Neste caso, pode não ser necessário combinar uma sequência de peptídeo de trânsito de plastídio exogenamente obtida no transgene.

As sequências de codificação de peptídeo de trânsito de plastídio exógenas podem se obtidas de uma variedade de genes nucleares de planta, contanto que os produtos dos genes sejam expressos como pré-proteínas que compreendem um peptídeo de trânsito de terminal de amino e transportados em plastídio. Os exemplos de produtos de gene de planta conhecidos por incluir tais sequências de peptídeo de trânsito incluem, porém não estão limitados a, subunidade pequena de ribulose bifosfato carboxilase, proteína de ligação de clorodila a/b, proteínas ribossômicas de plastídio codificadas por genes nucleares, certas proteínas de choque térmico, enzimas biossintéticas de aminoácido tais como ácido de acetolactato sintase, 3-enolpiruvilfosfochiquimato sintase, diidrodipicolinato sintase, aspartato quinase e similares. Em alguns casos, uma proteína de transporte de plastídio já pode ser codificada no gene de aspartato quinase de interesse, em cujo caso pode não haver nenhuma necessidade de adicionar tais sequências de trânsito de plastídio. Alternativamente, o fragmento de DNA codificando para o peptídeo de trânsito pode ser quimicamente sintetizado ou completamente ou em parte das sequências conhecidas de peptídeos de trânsito tais como aqueles listados acima.

Independente da fonte do fragmento de DNA codificando para o peptídeo de trânsito deve-se incluir um códon de iniciação de translação, por exemplo, um códon ATG, e ser expresso como uma sequência de aminoácido que é reconhecida por e funcionará apropriadamente em plastídios da planta hospedeira. Atenção deve também ser dada à sequência de aminoácido na junção entre o peptídeo de trânsito e a enzima aspartato quinase onde ela é clivada para produzir a enzima madura. Certas sequências de aminoácido conservadas foram identificadas e podem servir como um guia. A fusão precisa das sequências de peptídeo de trânsito de codificação com as sequências de codificação de aspartato quinase pode requerer manipulação de uma ou ambas as sequências de DNA para introduzir, por exemplo, um sítio de restrição conveniente. Isto pode ser concluído por métodos incluindo mutagênese direcionada ao sítio, inserção de ligantes de oligonucleotí-deo quimicamente sintetizados, e similares. A fusão precisa dos ácidos nucleicos codificando a proteína de transporte de plastídio pode não ser necessária contanto que as sequências de codificação da proteína de transporte de plastídio estejam na estrutura com aquela do aspartato quinase. Por exemplo, peptidila ou aminoácidos adicionais podem geralmente ser incluídos sem adversamente afetar a expressão ou localização da proteína de interesse.

Uma vez obtido, a sequência de peptídeo de trânsito de plastídio pode ser apropriadamente ligada ao promotor e uma região de codificação de aspartato quinase em um transgene usando os métodos padrão. Um plasmídeo contendo um promotor funcional nas células de planta e tendo múltiplos sítios de clonagem a jusante podem ser construídos ou obtidos de fontes comerciais. A sequência peptídeo de trânsito de plastídio pode ser inserida a jusante do promotor usando enzimas de restrição. Uma região de codificação de aspartato quinase pode então ser translacionalmente fundida ou inserida imediatamente a jusante de e na estrutura com o terminal 3' da sequência de peptídeo de trânsito de plastídio. Portanto, o peptídeo de trânsito de plastídio é preferivelmente ligado ao terminal de amino do aspartato quinase. Uma vez formado, o transgene pode ser subclonado em outros plasmídeos ou vetores.

Além da transformação de planta nuclear, a presente invenção também se estende a transformação direta do genoma de plastídio das plantas. Assim, o alvejamento do produto de gene para um compartimento intracelular nas células de planta acredita-se também direcionar a liberação direta de um gene par o compartimento intracelular. A transformação direta de genoma de plastídio pode fornecer benefícios adicionais sobre a transformação nuclear. Por exemplo, a transformação direta de plastídio de aspartato quinase elimina a exigência de um plastídio alvejando o peptídeo e transporte pós-translacional e processamento da pré-proteína derivada dos transfor-mantes nucleares correspondentes. A transformação de plastídio de plantas foi descrita por Maliga (2002); Heifetz (2000); Bock (2001); e Daniell e outros (2002), e outras referências citadas e incorporadas desse modo nela.

Após a construção de um transgene contendo um gene de aspartato quinase, o cassete pode então ser introduzido em uma célula de planta. Dependendo do tipo de célula de planta, do nível de expressão de gene, e da atividade da enzima codificada pelo gene, a introdução de DNA que codifica uma aspartato quinase dentro da célula de planta pode levar à superprodução de treonina, conferir tolerância à lisina, e/ou de outro modo alterar o teor de treonina da célula e planta.

Um transgene que compreende um gene de aspartato quinase pode se subclonado em um vetor de expressão conhecido, e a expressão de AK pode ser detectada e/ou quantificada. Este método de avaliação é útil para identificar os transgenes que fornecem uma expressão de um gene de aspartato quinase, e expressão de uma aspartato quinase no plastídio de uma célula de planta transformada.

Os vetores de plasmídeo incluem sequências de DNA adicionais que fornecem fácil seleção, amplificação, e transformação do transgene em células procarióticas e eucarióticas, por exemplo, vetores derivados de pUC, vetores derivados de pSK, vetores derivados de pGEM, vetores derivados de pSP, ou vetores derivados de pBS. As sequências de DNA adicionais incluem origens de replicação para fornecer replicação autônoma do vetor, marcadores de gene selecionáveis, preferivelmente que codifica resistência ao antibiótico ou herbicida, sítios de clonagem múltiplos únicos fornecendo sítios múltiplos para inserir sequências de DNA ou genes codificados no transgene, e sequências que realçam a transformação de células procarióticas e eucarióticas.

Outro vetor que é útil para a expressão em ambas as células de planta e procarióticas é o plasmídio Ti binário (Schilperoort e outros, Patente dos Estados Unidos 4.940.838) como exemplificado pelo vetor pGA582. Este vetor de plasmídio Ti binário foi previamente caracterizado por An, cited supra. Este vetor Ti binário pode ser replicado em bactérias procarióticas tal como E. coli e Agrobacteríum. Os vetores de plasmídio de Agrobacteríum também podem ser usados para transferir o transgene para as células de planta. Os vetores Ti binários preferivelmente incluem as bordas direita e esquerda de DNA de nopalina T para fornecer transformação de célula de planta eficiente, um marcador de gene selecionável, sítios de clonagem múltipla únicos nas regiões de borda T, a replicação de co/E1 de origem e um replicon de ampla faixa de hospedeiro. Os vetores Ti binários que carregam um transgene da invenção podem ser usados para transformar ambas as células procarióticas e eucarióticas, porém é preferivelmente usado para transformar as células de planta. Veja, por exemplo, Glassman e outros, Patente dos Estados Unidos 5.258.300. O vetor de expressão pode então ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas por métodos disponíveis. Os métodos de transformação especialmente eficazes para monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluem, porém não estão limitados a, bombardeio de microprojétil de embriões imaturos (Patente dos Estados Unidos 5.990.390) ou células do calo embriogênico do Tipo II como descrito por Gordon-Kamm e outros (1990); Fromm e outros (1990); Walters e outros (1992), ou por eletroporação de ca los embriogênicos do Tipo I descritos por D'Halluin e outros (1992) ou por Krzyzek (Patente dos Estados Unidos 5.384.253). A transformação de células de planta por turbilhonamento com suíças de tungstênio revestidas de DNA (Coffee e outros, Patente dos Estados Unidos 5.302.523) e transformação por exposição de células aos lipossomas contendo DNA pode também ser usada. A seleção eficiente de uma variante superprodutora de treonina resistente a lisina desejada usando técnicas de cultura de tecido requer determinação cuidadosa de condições de seleção. Estas condições são otimizadas para permitir o crescimento e acúmulo de células superprodutoras de treonina resistentes à lisina na cultura ao mesmo tempo em que inibindo o crescimento do volume da população de célula. A situação é complicada pelo fato de que a vitalidade de células individuais em uma população pode ser altamente dependente da vitalidade de células adjacentes. A escolha de um protocolo de seleção é dependente das considerações descritas acima. Os protocolos brevemente descritos abaixo podem ser utilizados no procedimento de seleção. Por exemplo, para selecionar as células que são resistentes à inibição de crescimento por lisina, células finamente divididas em cultura de suspensão líquida podem ser expostas a níveis elevados de lisina durante períodos breves de tempo. As células sobreviventes são então permitidas recuperar e acumular e são em seguida re-expostas durante períodos subsequentemente mais longos de tempo. Alternativamente, as culturas de célula parcialmente diferenciadas organizadas são desenvolvidas e subcultivadas com exposição contínua aos níveis inicialmente baixos de lisina. As concentrações são em seguida gradualmente aumentadas durante vários intervalos de subcultura. Ao mesmo tempo em que estes protocolos podem ser utilizados em um procedimento de seleção, a presente invenção não está limitada a esses procedimentos.

Como descrito aqui acima, os genes que funcionam como marcadores de gene selecionáveis e genes repórteres podem ser operavelmente combinados com a sequência de DNA codificando o aspartato quinase, ou domínio do mesmo, em transgenes, vetores e plantas da presente invenção.

Adicionalmente, outras características agronômicas podem ser adicionadas aos transgenes, vetores e plantas da presente invenção. Tais características incluem, porém não estão limitadas a, tolerância ou resistência ao inseto; tolerância ou resistência à doença (viral, bacteriana, fúngica, nematódeo); resistência ou tolerância à tensão, como exemplificado por resistência ou tolerância a seca, calor, refrigeração, congelamento, umidade excessiva, tensão de sal, tensão oxidativa, produções aumentadas, teor de comida e preparação, aparência física, esterilidade masculina, secagem, sustentabilida-de, prolificidade, propriedades do amido, quantidade e qualidade de óleo, e similares. Alguém pode incorporar um ou mais genes conferindo tais características nas plantas da presente invenção.

As bactérias de Bacillus thuríngiensis (ou "Bt") incluem quase 20 subespécies conhecidas de bactérias que produzem polipeptídeos de endo-toxina que são tóxicos quando ingeridos por uma ampla variedade de espécies d insetos. A biologia e biologia molecular das proteínas de endotoxina (proteínas Bt) e genes correspondentes (genes Bt) foi revista por Whitely e outros (1986) e por Hofte e outros (1989). Os genes codificando para uma variedade de proteínas Bt foram clonados e sequenciados. Um segmento do polipeptídeo Bt é essencial para toxicidade para uma variedade de pestes de Lepidoptera e está contido aproximadamente nos primeiros 50% das moléculas de polipeptídeo Bt. Consequentemente, um polipeptídeo Bt truncado codificado por um gene Bt truncado em muitos casos manterá sua toxicidade para várias pestes de insetos Lepidoptera. Por exemplo, os polipeptídeos Bt de HD73 e HD1 foram mostrados serem tóxicos às larvas das pestes de inseto de Lepidoptera importantes de plantas nos U.S.A. tal como a broca do milho européia, lagartas e minhocas. Os genes codificando para os polipeptídeos Bt de HD1 e HD73 foram clonados e sequenciados por Geiser e outros (1986) e Adang e outros (1985), respectivamente, e podem ser clonados de cepas de HD1 e HD73 obtidas das coleções de cultura (por exemplo, Ba-cilíus Genetic Stock Center, Columbus, OH ou USDA Bt stock collection Peo-ria, IL) usando protocolos padrão. Os exemplos de genes e polipeptídeos Bt são descritos, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos 6.329.574; 6.303.364; 6.320.100; e 6.331.655. DNA codificando para novas toxinas Bt previamente não caracterizadas pode ser clonado do organismo de Bacillus hospedeiro usando protocolos que foram previamente usados para clonar os genes de Bt, e novas formas sintéticas de toxinas Bt podem também ser produzidas.

Um gene Bt útil na presente invenção pode incluir uma sequência de DNA 5' incluindo uma sequência de DNA que permitirá a iniciação da transcrição e translação de uma sequência Bt localizada a jusante em uma planta. O gene Bt pode também compreender uma sequência de DNA 3' que inclui uma sequência derivada da região de não codificação 3' de um gene que pode ser expresso na planta de interesse. O gene Bt também incluiría uma sequência de DNA codificando para um polipeptídeo Bt tóxico produzido por Bacillus thuringiensis ou porções tóxicas do mesmo ou tendo homo-logia de sequência de amino substancial. As sequências de codificação Bt podem incluir: (i) Sequências de DNA que codificam para proteínas inseticidas que têm homologia substancial para endotoxinas de Bt que são ativas contra pestes de insetos da planta de interesse, por exemplo, as sequências Bt de HD73 ou HD1; (ii) sequências codificando para os segmentos inseticidamente ativos do polipeptídeo de endotoxina Bt, por exemplo, polipeptídeos HD73 ou HD1 inseticidamente ativos truncados do terminal de carbóxi e/ou amino; e/ou (iii) uma sequência Bt truncada fundida na estrutura com uma sequência(s) que codifica para um polipeptídeo que fornece alguma vantagem adicional tal como: (a) genes que são selecionáveis, por exemplo, genes que conferem resistência aos antibióticos ou herbicidas, (b) genes repórteres cujos produtos são fáceis de detectar ou ensaiar, por exemplo, lucife-rase ou beta-glucuronidase; (c) sequências de DNA que codificam para as sequências de polipeptídeo que têm algum uso adicional na estabilização da proteína Bt contra a degradação ou realçam a eficácia da proteína Bt contra insetos, por exemplo, inibidores de protease; e (d) sequências que ajudam a direcionar a proteína Bt para um compartimento específico dentro ou fora da célula de planta, por exemplo, uma sequência de sinal.

Para obter síntese ideal de uma proteína Bt ou outras proteínas heterólogas na planta, pode também ser apropriado ajustar a sequência de DNA do gene codificando uma tal proteína para assemelhar-se mais aos genes que são eficazmente expressos na planta de interesse. Uma vez que o uso do códon de genes Bt pode ser dissimilar àquele usado por genes que são expressos na planta de interesse, a expressão de um gene Bt nas células de planta pode ser melhorada pela substituição de códons com aqueles que são mais eficientemente expressos em plantas, por exemplo, são usados mais frequentemente nas plantas de interesse (Veja, Murray e outros, 1989). Tal substituição de códons pode requerer a substituição de bases sem alterar a sequência de aminoácido do polipeptídeo Bt resultante. O polipeptídeo Bt pode ser idêntico na sequência ao gene bacteriano ou segmentos dos mesmos. As sequências de codificação Bt completas, ou seções das mesmas, contendo uma proporção mais elevada de códons preferidos do que o gene bacteriano original, podem ser sintetizadas usando protocolos de síntese química padrão, e introduzidas ou montadas no gene Bt usando protocolos padrão, tal como mutagênese direcionada ao sítio ou polimerização e ligação de DNA e similares.

Os inibidores de protease podem também fornecer resistência ao inseto. Por exemplo, uso de um gene inibidor de protease II, pinll, de tomate ou batata pode ser útil. Também vantajoso é o uso de um gene pinll em combinação com um gene de toxina Bt. Outros genes que codificam os inibidores do sistema digestivo dos insetos, ou aqueles que codificam enzimas ou co-fatores que facilitam a produção de inibidores, podem também ser úteis. Este grupo inclui os inibidores de orizacistatina e amilase tais como aqueles de trigo e cevada.

Os genes codificando lecitinas podem conferir propriedades inseticidas adicionais ou alternativas. (Murdock e outros, 1990; Czapla e Lang, 1990. Os genes de lecitina contemplados para serem úteis incluem, por e-xemplo, cevada e aglutinina de gérmen de trigo (WGA) e lecitinas de arroz. (Gatehouse e outros, 1984).

Os genes controlando a produção de grandes e pequenos poli-peptídeos ativos contra insetos quando introduzidos nas pestes de insetos tais como peptídeos líticos, hormônios de peptídeo e toxinas e venenos, podem também ser úteis. Por exemplo, a expressão de hormônio juvenil este-rase, direcionada para pestes de insetos específicas, pode também resultar em atividade inseticida, ou talvez causar cessação de metamorfose. (Ham-mock e outros, 1990).

As plantas transgênicas expressando os genes codificando enzimas que afetam a integridade da cutícula do inseto podem também ser ú-teis. Tais genes incluem aqueles codificando, por exemplo, quitinase, prote-ases, lipases e também genes para a produção de nicomicina. Os genes que codificam para atividades que afetam a muda de insetos, tais como aqueles afetando a produção de ecdisteroide UDP-glicosil transferase, podem também ser úteis.

Os genes que codificam para enzimas que facilitam a produção de compostos que reduzem a qualidade nutricional da planta para pestes de inseto, podem também ser úteis. Pode ser possível, por exemplo, conferir atividade inseticida a uma planta alterando-se sua composição de esterol. Outras modalidades da presente invenção dizem respeito às plantas transgênicas com atividade de lipoxigenase realçada. A introdução de genes que podem regular a produção de maisi-na, e genes envolvidos na produção de dhurrina em sorgo, é também contemplada ser de uso na facilitação da resistência a minhoca e lagarta, respectivamente.

Outros genes codificando as proteínas caracterizadas como tendo atividade inseticida potencial podem também ser usados. Tais genes incluem, por exemplo, o inibidor de tripsina de ervilha de vaca (CpTI; Hilder e outros, 1987) que pode ser usado como um repressivo de lagarta; genes que codificam avermectina (Campbell, 1989; Ikeda e outros, 1987) que pode provar ser útil como um repressivo de lagarta de milho; genes de proteína de inativação de ribossoma; e genes que regulam as estruturas da planta. As plantas transgênicas incluindo genes de anticorpo anti-inseto e genes que codificam para enzimas que podem converter um inseticida não tóxico (pró-inseticida) aplicado no exterior da planta em um inseticida dentro da planta são também contempladas.

As seleções são realizadas até que as células ou tecidos sejam recuperados os quais são observados estarem crescendo bem na presença de níveis normalmente inibidores de uma lisina. Estas "linhagens" de célula são subcultivadas várias vezes adicionais na presença de níveis anormalmente elevados de lisina para remover as células não resistentes, e em seguida caracterizadas. A quantidade de resistência que foi obtida é determinada comparando-se o crescimento destas linhagens de célula com o crescimento de células não selecionadas ou tecido na presença de várias concentrações de lisina. A estabilidade da resistência traço das células cultivadas pode ser avaliada simplesmente desenvolvendo-se as linhagens de célula selecionadas na ausência de lisina durante vários períodos de tempo e em seguida analisando-se o crescimento após re-exposição do tecido à lisina. As linhagens de célula resistentes podem também ser avaliadas usando estudos químicos in vitro para verificar que o sítio de ação da treonina é alterado para uma forma que é menos sensível a inibição por lisina. A expressão transitória de um gene de aspartato quinase pode ser detectada e quantificada nas células transformadas. A expressão de gene pode ser quantificada por análise de RT-PCR, uma mancha do oeste quantitativa usando anticorpos específicos para o aspartato quinase clonado ou detectando-se a atividade de enzima na presença de níveis elevados de lisina. O tecido e local subcelular do aspartato quinase clonado pode ser determinado por métodos de manchamento imunoquímico usando anticorpos específicos para a aspartato quinase clonada ou fracionamento subcelular e análises bioquímicas e/ou imunológicas subsequentes. A sensibilidade da aspartato quinase clonada aos agentes também pode ser avaliada. Os transgenes fornecendo expressão de uma aspartato quinase ou aspartato quinase tolerante a inibição por lisina podem então ser usados para transformar células de tecido de planta de monocotilédone e/ou dicotiledônea e regenerar as plantas e sementes transformadas. As células transformadas podem ser selecionadas detectando-se a presença de um marcador de gene selecionável ou um gene repórter, por exemplo, detectando-se um marcador de resistência herbicida selecionável. A expressão transitória de um gene de aspartato quinase pode ser detectada nos calos embriogênicos transgênicos usando anticorpos específicos para a aspartato quinase clonada, ou por análise de RT-PCR.

Os calos embriogênicos transformados, tecido meristemático, embriões, discos de folha, e similares podem ser usados para gerar plantas transgênicas que exibem herança estável do gene de aspartato quinase transformado. As linhagens de célula de planta exibindo níveis satisfatórios de tolerância à níveis elevados de lisina são colocados através de protocolo de regeneração de planta para obter plantas e sementes maduras expressando as características de tolerância por métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, veja, Patente dos Estados Unidos 5.990.390 e 5.489.520; e Laursen e outros, (1994)). O protocolo de regeneração de planta permite o desenvolvimento de embriões somáticos e o crescimento subsequente de raízes e brotos. Para determinar que a característica de tolerância seja expressa em órgãos diferenciados da planta, e não somente na cultura de célula não diferenciada, plantas regeneradas podem ser ensaiadas quanto aos níveis de treonina presentes em várias porções da planta relativa às plantas regeneradas, não transformadas. As plantas e sementes transgênicas podem ser geradas de células e tecidos transformados mostrando uma alteração no teor de treonina ou na resistência à inibição de realimentação por lisina usando métodos padrão. É especialmente preferido que o teor de treonina das folhas ou sementes seja aumentado. Uma alteração na atividade específica da enzima na presença de quantidades inibidoras de lisina pode ser detectada medindo-se a atividade de enzima nas células transformadas como descrito por Widholm (1972). Uma alteração no teor de treonina total pode também ser examinada por métodos padrões como descrito por Jones e outros (1981).

As plantas maduras são então obtidas de linhagens de célula que são conhecidas por expressar o traço. Se possível, as plantas regeneradas são autopolinadas. Além disso, o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado com as plantas crescidas de semente de linhagens inatas a- gronomicamente importantes. Em alguns casos, o pólen de plantas destas linhagens inatas é usado para polinizar as plantas regeneradas. O traço é geneticamente caracterizado avaliando-se a segregação do traço na primeira e última progênie da geração. A herança e expressão em plantas de traços selecionados em cultura de tecido são de importância particular se os traços tiverem que ser comercialmente úteis. O valor comercial de sojas, cereais e outras plantas de superprodução de treonina é maior se diferentes combinações híbridas estiverem disponíveis para venda. O fazendeiro tipicamente produz mais do que um tipo de híbrido com base em tais diferenças como maturidade, sustentabili-dade ou outros traços agronômicos. Adicionalmente, os híbridos adaptados a uma parte do campo não são adaptados a outra parte por causa das diferenças em tais traço como maturidade, doença, e resistência ao inseto. Por causa disto, é necessário reproduzir a superprodução de treonina em um grande número de linhagens inatas parentais de modo que muitas combinações de híbrido posam ser produzidas.

Um processo de conversão (retrocruzamento) é realizado cruzando-se a linhagem superprodutora original com as linhagens de elite normais e cruzando-se a progênie de volta com a origem normal. Subsequente ao retrocruzamento, as novas linhagens superprodutoras e as combinações apropriadas de linhagens que produzem bons híbridos comerciais são avaliadas quanto a superprodução bem como uma batería de importantes traços agronômicos. As linhagens superprodutoras e híbridos são produzidos os quais são fiéis ao tipo dos híbridos e linhagens normais originais. Isto requer avaliação sob uma faixa de condições ambientais onde as linhagens ou híbridos geralmente serão comercialmente desenvolvidos. Para a produção de soja com alto teor de treonina, pode ser necessário que ambas as origens da semente híbrida sejam homozigotas para o caráter de teor elevado de treonina. As linhagens parentais de híbridos que desempenham satisfatoriamente são aumentadas e usadas para a produção de híbrido usando práticas padrão de produção de semente híbrida.

As plantas transgênicas produzidas aqui são esperadas serem úteis para uma variedade de propósitos comerciais e de pesquisa. As plantas transgênicas podem ser criadas para uso em agricultura tradicional por possuir traços benéficos para o consumidor do grão colhido da planta (por exemplo, teor nutritivo melhorado em comida para ser humano ou alimento animal). Em tais usos, as plantas são geralmente crescidas para o uso de seu grão em comidas para seres humanos e animais. Entretanto, outras partes das plantas, incluindo caules, cascas, partes vegetativas, e similares, podem também ter utilidade, incluindo o uso como parte de silagem animal, alimento de fermentação, biocatálise, ou para propósitos ornamentais.

As plantas transgênicas também podem encontrar uso na fabricação comercial de proteínas ou outras moléculas, onde a molécula de interesse é extraída ou purificada de partes de planta, semente, e similares. As células ou tecido das plantas também podem ser cultivados, desenvolvidos in vitro, ou fermentados para fabricar tais moléculas.

As plantas transgênicas podem também ser usadas em programas de reprodução comercial, ou podem ser cruzadas ou reproduzidas com plantas de espécies de colheita relacionadas. As melhoras codificadas pelo DNA recombinante podem ser transferidas, por exemplo, de células de soja para células de outras espécies, por exemplo, por fusão de protoplasto. EXEMPLOS

Os seguintes exemplos também ilustram a invenção e não são pretendidos serem limitantes da mesma. Deve ser apreciado por aqueles de experiência na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção, e desse modo podem ser considerados constituir os modos preferidos para sua prática. Entretanto, aqueles de experiência na técnica devem, considerando a presente descrição, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obtém um resultado igual ou similar sem afastar-se do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que estejam ambos quimicamente e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui ao mesmo tempo em que resultados iguais ou similares seriam obtidos. Todos tais substitutos e modificações similares evidentes para aqueles versados na técnica são are considerados estarem dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações anexas.

Exemplo 1: Isolamento e Clonagem de Gene de Aspartato Quinase As sequências de codificação de tamanho natural do gene de aspartato quinase do tipo selvagem foram isoladas por amplificação de PCR de 30ng de DNA genômico de Xenorhabdus bovienii usando iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12. PCR foi realizado em um volume total de 50pL de mistura de reação usando o kit de PCR Expand® High Fidelity (Boehringer Mannheim, Alemanha). As condições de PCR foram como segue: um ciclo de 4 min a 95°C; 26 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min de recozimento a 56°C e 2 min de extensão a 72°C; um ciclo de 7 min a 72°C. Os produtos resultantes foram digeridos com enzimas de restrição a-propriadas (Ndel e Xhol), purificados por gel, ligados nos sítios correspondentes de pET30a (Novagen), produzindo o plasmídeo pMON81662 (figura 3; XbAK) para a expressão da proteína recombinante. A integridade da sequência de gene foi confirmada por análise de sequência de DNA.

Exemplo 2: Identificação de Novos Genes de Aspartato Quinase Codificando Variantes com Propriedades Enzimáticas Desejáveis Este exemplo descreve a identificação de genes AK que codificam enzimas com propriedades enzimáticas desejáveis, isto é, insensibilidade à inibição de produto final por aminoácidos da família de aspartato e propriedades cinéticas favoráveis. Para caracterizar as variantes AK, os sistemas de expressão recombinantes e ensaios de enzima AK foram estabelecidos usando os produtos de gene de E. coli lysC recombinante e E. coli T352I lysC (SEQ ID NO: 17) como controles. O produto de gene de E. coli lysC é conhecido por ser sensível a inibição de realimentação por Lys, ao passo que o produto de gene de E. coli T352I lysC é conhecido por ser sensível à lisina. A expressão em plantas do produto de gene de E. coli T352I lysC tendo atividade de aspartato quinase resultou em um aumento de 6-7% no teor de treonina da semente (Karchi, e outros, The Plant J. 3:721-727 (1993);

Galili, e outros, Pedido de Patente Europeu No. 0485970). O gene lysC foi clonado por amplificação de PCR usando DNA genômico de E. coli como modelo e iniciadores de PCR SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15. Subsequentemente, os genes lysC de E. coli e genes AK de Xenorhabdus bovienii foram submetidos a mutagênese direcionada ao sítio e clonados para produção de proteína recombinante e/ou para transformação na soja. A mutagênese direcionada ao sítio foi realizada para produzir as variantes únicas E257K e T359I bem como a variante dupla E257K/T359I do gene Ak de Xenorhabdus bovienii usando os seguintes iniciadores e condições: Iniciadores usados para mutagênese com base em PCR XbAKXholRv (SEQ ID NO: 18) XbAKNdelFr (SEQ ID NO: 19) XbAKE257KFr (SEQ ID NO: 20) XbAKE257KRv (SEQ ID NO: 21) XbAKT359IFr (SEQ ID NO: 22) XbAKT359IRv (SEQ ID NO: 23) As reações de PCR foram realizadas em um volume total de 50 pl usando pMON81662 como um modelo. 1. Para XbAK E257K, a) Parte terminal de N (com iniciadores XbAKNdelFr e XbA-KE257KRv). Produto esperado797 pb. b) Parte terminal de C (com iniciadores XbAKXholRv e XbA-KE257KFr). Produto esperado624 pb. 2. Para T359I, a) Parte terminal de N (com iniciadores XbAKNdelFr e XbAKT359IRv). Produto esperado 1071 pb. b) Parte terminal de C (com iniciadores XbAKXholRv e XbAKT359IFr). Produto esperado 320 pb A mistura de reação por 100 μΙ conteve: 83 μΙ de água, 3 μΙ de dNTPs a 10 mM, 10 μΙ de tampão 10X ThermoPol (NEB, para Vent), 2 μΙ de DMSO, 1 μΙ de modelo de plasmídeo, 1 μΐ de iniciador dianteiro a 100 μΜ, 1 μΙ de iniciador reverso a 100 μΜ, ~1 μΙ de Vent DNA polimerase. Mistura alternativa usou kit AccuPrimeTM Pfx DNA polimerase (Invitrogen). O volume de reação total foi 50 μΙ. Um circulador térmico PTC- 200 Peltier foi ajustado para o seguinte ciclo do programa: 2 min a 94°C 24 ciclos de [30 s a 94°C, 30 s a 50°C, 90 s a 72°C] 5 min a 72 °C 50 μΙ de cada produto de PCR foi purificado por gel em um gel de 1,2% de agarose-TAE. As faixas de produto purificado foram cortadas do gel e combinadas como segue: a. Para E257K, as faixas 1a e 1b as reações acima foram combinadas. b. Para T359I, as faixas 2a e 2b das reações acima foram combinadas.

Os DNAs combinados foram eluídos do gel e recuperados em ~35 μΙ de EB.

Uma segunda rodada de reações d PCR foi configurada como segue: 5 μΙ de mistura 1+2 ou 3+4 1,5 μΙ de dNTPs a 10 mM 5 μΙ de tampão 10X ThermoPol 1 μΙ de DMSO ~0,5 μΙ de Vent + 40 μΙ de água Os ciclos de cozimento e extensão foram realizados sem quaisquer iniciadores adicionados de acordo com o seguinte ciclo do programa: 2 min a 94°C 5 ciclos de [30 seg. a 94°C, 30 seg. a 50°C, 75 seg. a 72°C] 2 min a 72°C PCR foi interrompido brevemente para adicionar 1,5 μΙ de XbAKXholRv e XbAKNdelFr. A reação foi reiniciada usando um programa levemente modificado: 2 min a 94°C 24 ciclos de [30 seg. a 94°C, 30 seg. a 50°C, 90 seg. a 72°C] 5 min a 72°C

Os produtos de PCR foram em seguida digeridos com Ndel e Xhol e clonados em um vetor pET30a (Novagen). Os plasmídeos foram i-dentificados por análise de restrição de sítio e confirmados para a mutação desejada por sequenciamento de DNA. Os plasmídeos foram em seguida transformados em E. coli BL21(DE3) para a produção de proteínas AK alvejadas por His de terminal de N. Uma lista de vetores contendo diferentes sequências AK e controles gerados como parte dos esforços de caracterização bioquímica de AK são listados na Tabela 1.

Caracterização das Variantes da Aspartato Quinase As propriedades enzimáticas destas variantes de gene de Xeno-rhabdus bovienii aspartato quinase foram caracterizadas e comparadas a um alelo mutante lysC DE E. coli anteriormente estudado (SEQ ID NO: 16; Figura 4; pMON81658). Para caracterizar variantes AK, sistemas de expressão recombinante e ensaios de enzima AK foram estabelecidos usando o produto de gene lysC de E. coli lysC.

Os plasmídeos quiméricos contendo AK ou os mutantes desejados foram transformados em células BL21 de E. coli (DE3) e os transforman-tes foram selecionados em meio LB (Luria-Bertani) contendo canamicina (50 pg/mL). Para indução de expressão de gene, os transformantes selecionados de colônias simples foram desenvolvidos em 100 mL de LB líquido suplementado com ampicilina ou canamicina para aproximadamente 0,6 A6oo> θ 0,4 mM. Isopropil-P-tiogalactopiranosida (IPTG) (Gold Biotechnologies, St. Louis, MO) foi adicionada, seguida por 15 horas de incubação a 21 °C e agitação a 220 rpm. As células foram colhidas por centrifugação por 30 minutos a 7,000 x g e lavadas uma vez com 20 mM de Tris-HCI, 150 mM de NaCI, pH 7,4. Os péletes celulares lavados foram ressuspensos em tampão de K-fosfato a 50 mM (pH 7,4, Tampão A) contendo MgCI2 a 2 mM, NaCI a 50 mM, 100 unidades de benzonase (Novagen, San Diego, CA) e comprimidos de coquetel inibidor de protease inhibitor sem EDTA (1 comprimido/10 mL) (Boehringer Mannheim, Alemanha). As células foram rompidas em três passagens por meio de uma célula de prensa French geladal (SLM-Aminco Spectronic Instruments), operando a 1.406,13 kg/cm2. O lisado foi centrifugado por uma ultra-centrífuga durante 1 hora a 100,000 x g, a 4°C. O sobre-nadante resultante foi aplicado à coluna de agarose de níquel+-ácido nitrilo-triacético (Ni+NTA) (His-Bind resin, Qiagen) e cromatografado de acordo com as instruções do fornecedor. A coluna foi lavada com 3 volumes de leito de Tampão A contendo 20 mM de imidiazol seguido por eluição com 300 mM de imidazol. As frações enzimaticamente ativas do GS2 rotulada por His de terminal N foram reunidas, dialisadas junto ao Tampão A sem benzonase, e armazenadas em solução de glicerol a 15% a -80°C para uso em estudos cinéticos. A preparação de enzima foi mais de 95% pura quando julgada por SDS-PAGE manchada com Azul de Coomassie.

Ensaios de Enzima e Estudos Cinéticos Método de hidroxamato colorimétrico. A mistura de ensaio (volume final, 0,8 mL) continha 100 Tris-HCI, pH 8,0, 40 mM de hidroxilami-na-KOH, pH 8,0, 25 mM de ATP-KOH, pH 8,0, MgCE a 20 mM, ácido L-aspártico, e KCI a 150 mM. A reação foi iniciada pela adição de enzima AK, e realizada a 37°C durante 15 a 30 minutos. A reação foi terminada pela adição de 400 pL de cloreto férrico acidificado (FeCI3 a 0,37 M, 20% de TCA, e HCI a 0,72 M) e seguida pela centrifugação na velocidade máxima de micro-centrífuga. A aspartila-hidroxamato formada foi determinada colorimetrica-mente a 505 nm. A atividade biossintética foi calculada com base nas curvas padrões de L-aspartila-hidroxamato ou esosnm- Um método de ensaio acoplado. O ensaio acopla a conversão de ATP em ADP à oxidação de NADH usando piruvato cinasse e lactato de-sidrogenase a 30°C. A oxidação de NADH foi monitorada cineticamente a 340 nm. (Veja Wampler DE, Westhead EW. (1968), Biochemistry 7: 1661-1670.) Cinéticos. Os parâmetros cinéticos foram determinados medindo-se a formação de produto em 100 pL de misturas de reação contendo várias concentrações de substrato variando de 0 a 25 mM. Os controles foram incluídos durante todo o ensaio. Os valores para Km, Vmax, e Kcat foram calculados a partir da taxa da formação de produto usando as equações Michae-lis-Menten em conjunto com as opções de ajuste de curva no software Grafit 5.0 (Erithacus software Ltd., Horley, UK) (Tabela 2).

Tabela 1. Vetores de aspartato quinase para expressão em E. coli.

Treze vetores de expressão de E. coli alojando sequências de aspartato quinase (AK) foram construídas para estudos em propriedades cinéticas, mutagênese e inibição de regeneração bem como produção de anticorpo.

Tabela 2. Propriedades cinéticas para a X. bovienii aspartato quinase purificada Exemplo 3: Construção de Vetores de Transformação de Soja Contendo Sequência de Codificação de Aspartato Quinase Insensível à Regeneração e Transformação em Plantas de Soja.

Seis vetores de transformação foram construídos, contendo ale-los tipo selvagem e mutantes dos genes X. bovienii AK (listados na tabela 3), e estes vetores foram transformados em soja.

Tabela 3. Vetores de Transformação de Soja Contendo Sequências de Codificação de Aspartato Quinase A sequência de codificação para CTP1 (SEQ ID NO: 13) foi incorporada na terminação N das proteínas bacterianas a fim de alvejar a proteína para os plastídeos em sementes em desenvolvimento. O alvejamento de proteínas de E. coli e Arabidopsis como fusões de GFP foi avaliado em protoplastos de soja e Arabidopsis e os resultados são descritos na publicação de patente dos Estados Unidos US2008/050506A1. Em geral, as construções com sequências de alvejamento de cloroplasto foram eficientemente alvejadas para cloroplastos.

Tecidos de meristema de soja foram excisados dos embriões de semente de A3525 germinadas. Após cocultura com a cepa ABI de Agrobac- teríum tumefaciens strain transportando um vetor escolhido da tabela 3, os meristemas foram colocados em meio de seleção contendo glifosato e antibióticos para inibir o crescimento de células de planta não transformadas e exxesso de Agrobacterium, respectivamente.

As plantas foram desenvolvidas de um projeto de bloco rando-mizado em uma estufa em potes de 20,32 cm carregados com meio de terra Metro Mix 350 com fertilizante líquido Peter’s Pete Lite 15-16-17 aplicado em uma taxa de 1,0mS. A semente madura foi produzida e analisada quanto ao teor de aminoácido livre. Os controles foram incluídos para estabelecer os níveis de aminoácido livre de referência, isto é, as correspondentes isolinha-gens negativas e os controles não transgênicos.

Exemplo 4: Determinação dos Níveis de Aminoácido Livre de Semente de R1 em Populações Variantes e Tipo Selvagem Transgênicas de Plantas de Soja.

Este exemplo descreve métodos usados para determinar os níveis de aminoácido livre em semente de R1 de eventos transgênicos contendo os genes de aspartato quinase selvagens e resistentes à regeneração de Xenorhabdus bovienii. Semente de cada planta Ro foi avolumada e 25 sementes foram moídas e analisadas quando ao total de aminoácidos livres como abaixo descrito. Os resultados daqueles estudos são reportados abaixo na tabela 4.

Em geral, amostras de semente foram moídas, os aminoácidos livres foram extraídos com 5% (v/v) de ácido tricloroacético (TCA) e os extratos forma derivados com oftaldialdeído (OPA) para formar derivados fluorescentes de todos os aminoácidos livres exceto prolina e cisteína. Os derivados de aminoácido foram separados por cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa (HPLC) e medidos quantitativamente usando um detector de fluorescência. O limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) são 5 e 10 ppm para cada dos 18 aminoácidos, respectivamente.

Especificamente, amostras de 25 sementes foram moídas usando um Mega-Moinho em um pó homogêneo fino. Aproximadamente 30±5 mg de cada amostra moída foram pesados e colocados em cada cavidade do tubo de uma prateleira de tubo Matrix Screen Mates Disposable (tubos de 96 x 1,4 ml por prateleira). 1,0 ml de 5% de TCA foi adicionado a cada amostra; e os poços do tubo foram tampadas firmemente e colocadas em um misturador Centrífugo durante 30 minutos. As amostras foram incubadas durante a noite a 4°C para garantir a completa extração. No dia seguinte, as amostras foram misturadas em um misturador Centrífugo durante 30 minutos. As amostras foram em seguida centrifugadas durante 20 minutos a 3000 rpm e aproximadamente 400,0 μΙ do líquido sobrenadante foram transferidos para dentro de uma placa Unifilter de 96 poços de 800 μΙ e filtrados para dentro de uma placa mãe de 96 cavidades de 1 ml em uma centrífuga Eppendorf. Aproximadamente, 100 pl da amostra da placa mãe foram transferidos para dentro de uma placa filha de 96 cavidades de 350 μΙ. A placa mãe foi armazenada em um congelador a -80°C. A placa filha foi posicionada em um autoamostrador de HPLC para análise. Um padrão de checagem foi analisado após cada injeção de 10 amostras para garantir que a HPLC estava funcionando adequadamente.

Os aminoácidos foram separados por cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa em uma coluna Zorbax Eclipse XDB-Ci8 (4,6 x 75 mm, 3,5 pm, Agilent) equipada com uma coluna protetora Kromasil (Xper-tek,) Cis (3x15 mm, 5 pm). O compartimento da coluna foi estabelecido manter 40 ± 0.8°C. O sistema de fase móvel binário incluiu 40 mM de NaH2PO4 (pH 7,8) com 0,001% de azida de sódio como o solvente A, e ace-tonitrila:metanol:H2O (45:45:10 v/v) como o solvente B. Todos os solventes foram de grau HPLC. O ciclo de HPLC de 12 minutos usou uma taxa de fluxo de fase móvel de 2mL/min com uma relação de solvente inicial A para solvente B de 95:5 mantida durante 1 minuto seguido por um aumento linear em solvente B a 35% a 9,80 min, em seguida 100% em 12 minutos. A derivatização de pré-coluna de aminoácidos para seus derivados OPA foi realizada por um programa de injeção que expõe a amostra a OPA exatamente antes da carga da coluna. Os aduzidos de aminoácido resultantes foram detectados por um detector de fluorescência (excitação 340 nm, emissão 450 nm). Cisteína e prolina não foram incluídas nesta avaliação de aminoácido. Um padrão de checagem foi analisado após cada injeção de 10 amostras para assegurar que a HPLC estava funcionando adequadamente.

Tabela 4. Os níveis de aminoácido livre (FAA) foram aumentados em até 3 vezes em populações de semente R1 de soja transgênica contendo genes AK resistentes à regeneração. *A significância foi calculada usando Tukey-Kramer HSD (JMP 6.0, SAS Ins-titute) e as médias seguidas pelas mesmas letras não foram significantemen-te diferentes umas das outras.

Todos os construtos contendo as formas resistentes à regeneração expressas na semente da X. bovienii aspartato quinase mostraram aumentos substanciais na treonina livre, com eventos de múltiplas construções excedendo bem o nível de 31 ppm na semente de controle A3525 (Tabela 5). A semente de cada planta Ro foi avolumada e 25 sementes foram moídas e analisadas quanto à treonina total livre (ppm) de acordo com os métodos acima descritos.

Tabela 5. Níveis de treonina na semente de R1 foram aumentados ate 100 vezes em populações de semente de soja transgênica em comparação àqueles de populações de semente do tipo selvagem. * A significância foi calculada usando Tukey-Kramer HSD (JMP 6.0, SAS Ins-titute) e as médias seguidas pelas mesmas letras são significantemente dife- rentes uma da outra.

Alterações foram também observadas em outros aminoácidos derivados de aspartato. Estas alterações em eventos transgênicos incluíram aumentos significantes em serina, metionina, glicina, e isoleucina, além de uma diminuição em aspartato (Tabela 6).

Tabela 6. Perfis de aminoácido livre (FAA) em populações de semente de soja transgênica R1 (Dados representam o ppm médio calculado de todos os eventos em uma construção).

Tabela 6. Continuação Exemplo 5: Determinação de Biomassa de Muda em Populações Transgênicas de Aspartato Quinase Variantes e do tipo selvagem de Plantas de Soja Trinta sementes R1 de cada dos 4 eventos de pMON101817, pMON101818, pMON101819, pMON101820, pMON101822, e sementes A3525 90 do tipo selvagem foram desenvolvidas em uma estufa até V1. O número total de sementes germinadas de cada Evento foi contado e a taxa de germinação foi calculada em comparação com as sementes germinadas totais do tipo selvagem. Vinte mudas de cada Evento e mudas acima da terra no dia 10 do tipo selvagem foram agrupadas e pesadas.

Um registro fotográfico foi mantido de plantas transgênicas de sementes de treonina e serina elevadas e plantas do tipo selvagem em 7 e 14 dias após o plantio. Os níveis de serina e treonina para cada semente do Evento e do tipo selvagem são reportados na Tabela 7. As mudas expressando os genes AK modificados por Xenorhabdus bovienii mostraram biomassa de broto substancialmente aumentadas. O peso fresco médio por broto (em gramas) é fornecido no gráfico na figura 12.

Tabela 7. Eventos de mutante de AK de Xenorhabdus bovienii e sementes do tipo selvagem para plantação_ A partir dos exemplos dados, a presente invenção desse modo fornece genes de aspartato quinase insensíveis à realimentação isolados os quais são úteis para aumentar a expressão de treonina livre e outros aminoácidos derivados de aspartato em plantas de soja. A presente invenção também fornece um método para produzir semente de soja altamente livre de treonina através da identificação de enzimas AK resistentes a realimentação que podem ser superexpressas no desenvolvimento de semente de soja. A-dicionalmente, a presente invenção fornece um método para realçar o metabolismo de nitrogênio da planta e desempenho de crescimento da colheita.

Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser evidente para pessoas versada na técnica que a invenção pode ser modificada na disposição e detalhe sem afastar-se de tais princípios. Reivindicaram-se todas as modificações que estão dentro do espírito e escopo das reivindicações anexas. Todos os documentos de patente citados neste relatório são incorporados aqui por referência na mesma medida como se cada indivíduo fosse especificamente e individualmente indicado ser incorporado por referência.

REIVINDICAÇÕES

Claims (16)

1. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 ou 3, em que a sequência codifica um polipeptídeo exibindo atividade de aspartato quinase (AK) que não é sujeito a inibição por produto final por lisina e/ou treonina

2. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO: 8.

3. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende SEQ ID NO: 8.

4. Construto de DNA recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

5. Construto de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo está operativamente ligado a um promotor funcional em uma célula de planta.

6. Construto de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor CaMV 35S, um promotor 7Sa' ou um promotor USP99.

7. Construto de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor específico de tecido e/ou órgão.

8. Construto de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor específico de semente.

9. Microrganismo transformado, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2.

10. Produto alimentício, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2.

11. Produto alimentício de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é um produto alimentício humano.

12. Produto alimentício de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é um alimento animal.

13. Farelo ou farinha, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 2.

14. Método de transformação de uma célula de planta, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir na célula de planta uma molécula de polinucleotídeo como definida na reivindicação 1 ou 2.

15. Método de produção de uma planta transformada, caracterizado pelo fato de que compreende: a) obter uma célula de planta que compreende uma molécula de polinucleotídeo como definida na reivindicação 1 ou 2; e b) regenerar uma planta da referida célula.

16. Método de aumento do teor de aminoácido livre total de uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende; transformar uma planta com um vetor de transformação de planta que compreende um polinucleotí-deo de SEQ ID NO: 2 ou 3, desse modo aumentando o teor de aminoácido livre da planta transformada comparada a uma planta de controle não transformada.