KR101246707B1 - 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주를 포함하는 뿌리혹선충 방제용 조성물 - Google Patents

포토랍두스 템프라타 템프라타 균주를 포함하는 뿌리혹선충 방제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안트라퀴논(Anthraquinone)류를 생산하는 포토랍두스 템프라타 템프라타(Photorhabdus temperata subsp . temperata) 균주 배양액을 포함하는 뿌리혹선충 방제용 조성물에 관한 것으로, 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주 배양액을 유효성분으로 함유하는 뿌리혹선충 방제용 조성물을 제공하는데 있다.

Description

포토랍두스 템프라타 템프라타 균주를 포함하는 뿌리혹선충 방제용 조성물{Nematocide Compound containing Photorhabdus temperata subsp. temperata}
본 발명은 안트라퀴논(Anthraquinone)류를 생산하는 포토랍두스 템프라타 템프라타(Photorhabdus temperata subsp . temperata) 균주를 포함하는 뿌리혹선충 방제용 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
전세계적으로 광범위하게 분포하여 농작물에 피해를 주는 식물기생선충은 식물의 지상부에 피해를 주거나 토양에 서식하면서 식물의 뿌리에 피해를 준다. 여러 식물기생선충 중에서 가장 방제가 어렵고 큰 피해를 주는 것이 뿌리혹선충이다.
특히, 국내에서는 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla) 등이 주로 작물에 피해를 주는 것으로 알려져 있다.
이러한 뿌리혹선충의 방제법으로는 재배적방제, 물리적방제 그리고 화학적 방제가 있다. 재배적 방제에는 담수, 휴경, 건토, 깊이갈이, 객토, 벼 윤작 재배, 저항성 품종 등이 있으며, 물리적 방제에는 열처리(스팀, 건열, 온탕침법), 태양열 소독 등이 사용되며 화학적 방제에는 포스치아제이트(선충탄) 등의 화학 약제를 살포하여 뿌리혹선충을 방제하고 있다.
그러나, 재배적 방제의 경우 지역조건 및 재배 작물에 따라 적용이 어렵거나 고비용이 소요되는 단점이 있으며, 저항성 품종은 특이 작물에 제한되어 실용성이 낮다. 그리고 화학약제의 경우 방제효과는 높으나 대부분 유기인제 및 카바메이트계로 토양 잔류 시 독성이 높고 환경오염뿐만 아니라 작물의 성장에 유익한 토양 내 유용미생물의 무분별한 살균작용에 의해 피해가 가중되고 토양을 점차 척박하게 하는 원인이 된다.
이에 따라, 화학방제제의 대안으로 뿌리혹선충 천적미생물, 생화학제 그리고 식물추출물을 이용한 생물학적 방제에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다.
현재까지 보고된 살선충 곰팡이 모나크로스포리움 타우마시움(Monacroporium thaumasium)은 실제 시설재배지에서 사용 효과가 극히 미흡하고 농가에 보급할 수 있는 실용화에도 매우 어려운 형편이다.
또한, 약용식물을 이용하여 살선충 효과를 기대한 연구도 진행된바 있으나 원료의 수급이 어려워 수입에 의존해야 하는 단점이 있다.
본 발명은 이러한 종래 뿌리혹선충 방제의 문제점을 해결하기 위해 개발된 것으로, 포토랍두스 템프라타 템프라타에서 생성되는 안트라퀴논이 함유한 배양물이 뿌리혹선충의 뿌리조직 내 감염태 억제 및 살충에 효과가 있음을 확인하고, 상기 포토랍두스 템프라타 템프라타가 생산하는 안트라퀴논 함유 배양물을 유효성분으로 함유하는 뿌리혹선충 방제용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은, 살선충 효과를 가지는 안트라퀴논을 생산하는 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주 배양물을 유효성분으로 함유하는 뿌리혹선충의 방제용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기에서, 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주 배양물은 살선충효과를 가지는 안트라퀴논을 함유한다.
그리고 상기 뿌리혹선충의 방제용 조성물은 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla)을 방제함을 특징으로 한다.
본 발명은 안트라퀴논을 생산하는 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주 배양액을 유효성분으로 하는 뿌리혹선충의 방제용 조성물로 기존 화학농약제제를 대체할 수 있는 우수한 생물제제이다. 또한, 토양의 농약 잔류에 대한 피해를 줄일 수 있는 효과뿐만 아니라 토착 균주가 생산하는 살선충 물질을 함유한 배양액을 사용함으로 친환경 농작물 재배에서 뿌리혹선충 피해를 경감시키는 효과도 있다.
도 1은 본 발명의 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주 배양과정을 나타내는 도면
도 2는 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주로부터 안트라퀴논은 분리하는 과정을 나타내는 도면
도 3은 본 발명의 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주의 염기서열을 나타내는 도면
이하 본 발명의 실시예를 도면을 참조하여 살펴본다.
[실시 예1] 곤충병원성 선충( Heterorhaduitis bacteriophora )에서의 포토랍 두스 템프라타 템프라타 ( Photorhabdus temperata subsp . temperata ) 균주 분리
곤충병원성선충(Heterorhaduitis bacteriophora)은 경상남도 진주시 국립경상대학교에서 분양하였다. 이 선충 감염태(500마리 이상)를 300ppm 스트렙토마이신이 포함된 0.06% NaOCl 용액에서 30분간 표면소독한 후 균질기를 이용 선충 전체를 마쇄하였다. 이렇게 마쇄한 선충을 다음의 표 1의 배지(MacConkey agar 배지)를 사용하여 배양하여 형광을 발하는 밝은 핑크색의 세균을 분리하였다. 이들 세균을 표 2의 NBTA 배지에 올려놓은 후 콜로니를 둘러싸는 흰색띠를 형성하는 녹색 콜로니를 다시 분리하였다.
Figure 112012061814782-pat00001
Figure 112012061814782-pat00002
[실시 예2] 포토랍두스 템프라타 템프라타( Photorhabdus temperata subsp . temperata ) 균주의 배양 및 안트라퀴논의 순수 분리
(1) 포토랍두스 템프라타 템프라타의 배양
안트라퀴논을 생산하기 위한 기본배지 조성은 식용유, 난황분, 콜레스테롤, 라드(Lard), 레시틴(Lecithin), 전지분유, NaCl, 제 1인산 칼륨, 효모추출물(Yeast extract)등을 사용하는 것이 바람직하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1에서 분리된 흰색띠를 형성하는 녹색 콜로니인 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주[도 1 왼쪽]를 증류수 20mL에 현탁하여 씨드(seed)를 준비한다. 그리고 삼각플라스크(1L)에 배양액 500mL를 넣고 121℃, 15 min 동안 멸균하여 무균작업대에서 식힌 다음, 상기에서 준비한 균주 현탁액을 삼각플라스크에 접종한 후 셰이킹 인큐베이터(Shaking incubator)에서 25℃, 250rpm으로 4일간 배양[도 1 오른쪽]하였다.
(2) 배양된 배양액에서의 안트라퀴논 순수 분리
포토랍두스 템프라타 템프라타 균주 배양액에서 색소(안트라퀴논)를 분리하기 위한 조건은 도 2와 같다. 먼저 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주의 배양액에서 색소를 분리하기 위하여 (1)배양액 1L에 (2)차가운 이소프로판올을 1배량으로 첨가한 후 (3)10분간 강하게 교반하였다. (4)그 후 초음파로 1시간 처리하여 미생물을 모두 파쇄하였다. (5)또한 미생물이 완전히 파쇄된 배양액은 원심분리기를 이용하여 10,000xg, 30분의 조건으로 원심분리하고, (6)다시 상등액을 GF/F(Whatmann, Φ47mm)로 여과하여 잔여물을 완전히 제거하였다.
(7)여과된 상등액에 대하여 부피비로 1배량의 페트롤리움 에테르(petroleum ehter)를 첨가한 후 (8)2시간 강하게 교반하고, (9)상등액 부피비의 1배량의 증류수를 가하여 (10)(11)12시간 동안 층분리가 되도록 가만히 놓아두었다. (12)페트롤리움 에테르 층에 (13)건조된 소디움 설페이트(Sodium sulfate)를 첨가하여 20분간 가만히 놓아두었다. (14)그 후 와트만 페이퍼(Whatmann paper No. 5)를 이용하여 여과하고 (15)페트롤리움 에테르 층에 에바포레이터(Evaporator)를 이용하여 용매를 증발시켰다.
용매가 증발되고 남은 잔여물에서 로딩 샘플(Loading sample)을 만들기 위해 (16)실리카겔(Silica gel)을 첨가하고, (17)이 로딩 샘플을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography)에 (18)페트롤리움 에테르와 아세톤(Acetone)을 각각 8:2의 비율로 넣은 분리 용매(Elution solvent)를 이용하여 (19)분획한다. 그리고 위에서 행한 것처럼 반복적으로 (20)소디움 설페이트(Sodium sulfate)를 첨가하여 20분간 가만히 놓아두고 (21)와트만 페이퍼(Whatmann paper No. 5)를 이용하여 여과하고, (22)그 여과액을 에바포레이터(Evaporator)를 이용하여 용매를 증발시켰다. (23)마지막으로 에탄올(Ethanol)에 용해시켜 (24)분취 실리카겔 박층크로마토그래피(prep. TLC, preparative thin layer chromatography)에 (25)페트롤리움 에테르와 아세톤(Acetone)과 메탄올(Methanol)을 각각 5:3:2의 비율로 넣은 분리 용매(Elution solvent)를 이용하여 (26)알에프 값(Rf value)이 0.82인 선명한 연분홍색을 가진 물질을 찾고, (27)다시 에이치피엘씨(HPLC, high performance liquid chromatography)에 (28)아세톤(Acetone)과 메탄올(Methanol)을 각각 8:2의 비율로 넣은 분리 용매(Elution solvent)를 이용하여 (29)안트라퀴논을 순수 분리하였다.
[실시 예3 ] 분리된 안트라퀴논의 뿌리혹선충에 대한 방제 효과 검정
(1) 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla)에 대한 안트라퀴논의 유충 치사 효과
상기 실시예 2에서 추출하여 얻은 안트라퀴논을 이용하여 고구마뿌리혹선충, 땅콩뿌리혹선충, 당근뿌리혹선충의 유충(J2)에 대한 치사율을 조사하였으며, 상기 치사율은 페트리디쉬 실내 검정법으로 검정하였다.
실험군으로는 실시예 2에서 분리된 안트라퀴논의 농도를 1% - 5% 농도로 물에 희석하여 처리하였으며, 대조군으로는 아바맥틴(Avermectin 5% EC: 0.025%)을 사용하였고, 비교구는 멸균된 증류수(distilled water)를 처리하였다.
그 결과, 본 발명에서 분리된 안트라퀴논은 표 3과 같이 뿌리혹선충에 뛰어난 치사효과가 있었다.
Figure 112012061814782-pat00003
[실시 예4] 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주의 염기서열 결정
상기 실시 예2에서 사용된 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주의 계통학적 위치를 확인하기 위하여 하기와 같은 16S rRNA를 PCR로 증폭하여 염기서열을 결정하였다.
16S rRNA의 염기서열 결정에는 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystems)를 이용하여 Cycle sequencing을 행한 후 ABI PRISM 310 Genetic Analyaer(Applied Biosystemo)로 염기서열을 결정하였다. 상기 실험을 통하여 얻은 16S rRNA 염기서열의 상동성은 DDBJ/NCBI/RDP/GeneBank database의 BLAST program을 이용하여 조사하였다. 각 염기서열의 정렬(alignment)은 Clustal X algorithm을 이용하여 정렬하였고, 계통도의 작성은 근린 결합법에 의거하여 계통학적 위치를 확인하였다. 상기 균주는 16S rRNA 유전자를 통한 염기서열을 분석한 결과 Photorhabdus temperata subsp . temperata 와 100% 상동성[도 3]을 나타내었다.
상기한 바와 같은 뿌리혹선충 방제용 조성물은 일반적인 선충방제용 제형형태인 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 파우더 중에서 선택되는 제형을 갖는다.

Claims (5)

  1. 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주 배양액을 유효성분으로 함유하는 뿌리혹선충 방제용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 균주 배양액은 안트라퀴논(Anthraquinone)류의 물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충 방제용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 뿌리혹선충 방제용 조성물의 총중량에 대하여 안트라퀴논이 1-5중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충 방제용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 뿌리혹선충 방제용 조성물은 일반적인 선충방제용 제형형태인 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 파우더 중에서 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충 방제용 조성물.
  5. 제 1항 내지 4항의 어느 하나의 항에 있어서, 상기 뿌리혹선충은 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla) 인 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충 방제용 조성물.
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