CN107541466B - 一种释放芳香型气味的耐盐耐高温耐强光的小球藻及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株释放芳香型气味的的小球藻及其应用，该菌种从中国海南盐碱地区采集的盐卤水分离获得，代号为MEM‑A25，该菌种于2017年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2016793，分类命名为芳香小球藻(Chlorella aromata)。本发明所述小球藻新种Chlorella aromata MEM‑A25具有耐盐、耐高温、耐强光的特征，产生芳香型挥发性化合物苯并噻唑等，合成中性脂、不饱和脂肪酸、甾醇、色素、微藻蛋白、多糖等。本发明所述的小球藻新种可用来生产所述化合物，用于医药、农业或材料工程领域，也可以直接作为原料用于生产微生物制品，同时可以作为功能基因、代谢通路和功能模块来源用于作物改良。

Description

一种释放芳香型气味的耐盐耐高温耐强光的小球藻及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株释放芳香型气味的小球藻（Chlorella）属微藻新种。

背景技术

微藻是最有潜力实现现实意义上的光能整合生物制造的细胞工厂之一。温度和光强是影响微藻养殖的最主要的因素。春末至秋初季节，我国大部分地区，因太阳高度角较大，获得的太阳辐射过高。尤其是南方地区，平均光照强度高于500 μE·m^-2·s^-1，远远超过了微藻的光饱和点（如微拟球藻的最佳光照强度低于80 μE·m^-2·s^-1）。过量的光能被微藻吸收后，以热散失或以荧光的形式发射出来。强光还会对微藻造成伤害，进一步降低光合效率，即光抑制，并对光合机构造成光氧化破坏，产生光损伤。强光还往往导致微藻养殖体系温度迅速上升，进一步加重光抑制现象。强光导致太阳能整体利用效率低下，因此而引发的CO₂捕获效率的损失达到75%以上。

自然环境中广泛的存在着多样性极其丰富的微藻资源，这导致在微藻的培养过程中，极易受到杂藻入侵的威胁。例如，和富油微藻相比，入侵的杂藻常常具有更强的竞争力和更快的生长速率，短时间内即可在数量上超过目标藻种，成为养殖体系中的优势群落。由于杂藻和目标藻种的生物特性和物理特性具有很大的相似性，因此，杂藻污染成为微藻培养过程中最难控制的污染形式之一。而通过筛选高盐环境下可以生长的微藻，并应用于养殖体系，一定程度上可以消除淡水藻和普通海水藻的污染。

芳香物质是指具有芳香气味的、并在较低温度下能够挥发的物质的总称。早在五千年前的炎帝神农时代，人类对高等植物挥发出的香气已很重视，把这类具有特殊气味的物质用于祭祀、葬礼等仪式。后来发展逐渐用于食品、医药、装饰和化妆品等方面。日前，芳香物质主要是从高等植物的组织中提取，或化学合成具有芳香气味的有机化合物。而从高等植物的组织中提取原料成本较高，化学合成则可能存在一定的安全隐患。微藻本身具有特殊腥味。以微藻为原料开发的食品和保健品等产品，往往不易被部分消费群体接受。为提高产品的口服效果，需要特殊的“藻细胞破壁脱腥”技术工艺处理，并最终采用胶囊剂型，无法很好的保留其有效成分。因此，如何进一步扩大微藻种质来源，筛选并鉴定无腥微藻或特殊芳香的微藻新种成为业内的一个新兴热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一株强光、高温和高盐条件可以强劲生长且释放芳香型化合物的小球藻属新种，该海洋微藻具有被开发为特色微藻生物制品的潜能，有利于解决微藻工厂化养殖过程中的能量损失、杂藻污染等问题，同时在实现高端微藻产品的开发领域具有良好的应用前景。

本发明的其技术方案为：

本发明提供了一株芳香型耐盐耐高温耐强光小球藻新种，从我国海南盐碱地区采集的盐卤水样品中分离获得，代号为MEM-A25，该菌株于2016年12月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M2016793，分类命名为Chlorella sp. MEM-A25。

所述小球藻新种形态及培养特征具体为：在F2培养基上25 ℃培养3周后，菌落呈现绿色半湿润凸起状；经显微观察该藻种细胞为圆形，无鞭毛结构。

所述小球藻新种的ITS rRNA基因序列如SEQIDNO.1所示。

所述小球藻新种的18S rRNA基因片段序列如SEQIDNO.2所示。

本发明还提供一种小球藻新种，所述小球藻藻株的18S rRNA基因与SEQIDNO.1所示核苷酸序列的相似性大于97%和/或ITS rRNA基因与SEQIDNO.2所示核苷酸序列的相似性大于97%。

本发明还提供一种小球藻新种，所述小球藻藻株的18S rRNA基因与SEQIDNO.1所示核苷酸序列的相似性大于100%和/或ITS rRNA基因与SEQIDNO.2所示核苷酸序列的相似性大于100%。

所述小球藻新种具有耐受强光照射的特点。

所述小球藻新种具有较为宽泛的温度耐受能力的特点。

所述小球藻新种具有耐受高盐的特点。

所述的小球藻新种在开发耐盐和/或耐高温和/或耐强光基因和/或代谢通路和/或功能模块中的应用。所述的耐盐和/或耐高温和/或耐强光基因和/或代谢通路和/或功能模块可用于作物改良。

所述小球藻新种能够产生芳香型挥发性化合物。

所述小球藻新种能够产生中性脂。

所述小球藻新种能够产生不饱和脂肪酸。

所述小球藻新种能够产生甾体类化合物。

所述小球藻新种菌种能够产生色素。

所述的芳香型挥发性化合物和/或中性脂和/或不饱和脂肪酸和/或甾体和/或色素，和该小球藻新种可用于医药领域。用作杀菌剂、杀霉剂等，用于抗寄生虫、抗结核病、抗风湿病和抗癌等。

所述的芳香型挥发性化合物和/或中性脂和/或不饱和脂肪酸和/或甾体和/或色素，和该小球藻新种可用于农业领域。用作抗农用真菌、杀虫、除草、植物生长调节等。

所述的芳香型挥发性化合物和/或中性脂和/或不饱和脂肪酸和/或甾体和/或色素，和该小球藻新种可用于材料工程领域。用作橡胶硫化促进剂、塑料染色剂、化妆品及太阳镜中的紫外吸收剂、液晶显示材料、电致发光材料以及荧光探针材料等。

本发明提供一种微藻生物制品，其含有权利要求上述的小球藻。

本发明的有益效果

本发明所述小球藻新种能够在强光下快速生长、高效固定二氧化碳并合成高值化合物，适合户外工业化大规模养殖。

本发明所述小球藻新种能够在高温下快速生长、高效固定二氧化碳并合成高值化合物，适合户外工业化大规模养殖。

本发明所述小球藻新种能够在低温下，以相对较高的生长速率生长、固定二氧化碳并合成高值化合物，适合户外工业化大规模养殖。

本发明所述小球藻新种能够在高盐条件下快速生长、高效固定二氧化碳并合成高值化合物，不易被杂藻污染，适合户外工业化大规模养殖。

本发明所述小球藻新种可以产生芳香型挥发性化合物，有利于微藻深加工产品的开发。

本发明所述小球藻新种产生的芳香型挥发性化合物包括苯并噻唑，其在食品、医药、农药、材料工程等领域有广泛的用途。

本发明所述小球藻新种产生的芳香型挥发性化合物包括苯并噻唑，GB 2760--1996规定为允许使用的食品用香料。

本发明所述小球藻新种产生的芳香型挥发性化合物包括苯并噻唑，医药上，它可以用作杀菌剂、杀霉剂等，还可以用于抗寄生虫、抗结核病、抗风湿病和抗癌等。

本发明所述小球藻新种产生的芳香型挥发性化合物包括苯并噻唑，农业上，它具有抗农用真菌、杀虫、除草、植物生长调节等活性。

本发明所述小球藻新种产生的芳香型挥发性化合物包括苯并噻唑，在材料工程领域，它可以用作橡胶硫化促进剂、塑料染色剂、化妆品及太阳镜中的紫外吸收剂、液晶显示材料、电致发光材料以及荧光探针材料等。

本发明所述小球藻新种产生的中性脂类化合物，可用来制皂，制蜡等，其在食品、医药等领域有广泛的用途。

附图说明

图1是Chlorella sp. MEM-A25在F2固体培养基上的藻落照片。

图2是Chlorella sp. MEM-A25在F2液体培养基中培养的照片。

图3是Chlorella sp. MEM-A25显微图片。

图4是依据18S rRNA基因序列Chlorella sp. MEM-A25与相关藻株构建的系统发育树。

图5是Chlorella sp. MEM-A25与海洋微拟球藻Nannochloropsis oceanica在不同光强下（50 μE·m^-2·s^-1和200 μE·m^-2·s^-1）的生长速率对比。

图6是Chlorella sp. MEM-A25与海洋微拟球藻Nannochloropsis oceanica在不同温度下（15 ℃、25 ℃、28℃和35 ℃）的生长速率对比。

图7是Chlorella sp. MEM-A25与海洋微拟球藻Nannochloropsis oceanica在不同盐度下（18、35 、70和105 g/L）的生长速率对比。

图8是Chlorella sp. MEM-A25产生的芳香型挥发性化合物GC-MS分析。

图9是Chlorella sp. MEM-A25产生的脂类化合物GC-MS分析。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的方法作进一步详细地说明。

本发明涉及的海洋小球藻新种，从我国海南盐碱地区采集的盐卤水中分离获得，代号为MEM-A25，该菌株于2016年12月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2016793，分类命名为Chlorella sp. MEM-A25。

实施例1本发明所述海洋小球藻新种的分离

从海南盐碱地区采集盐卤水样品。取15 ml海水离心收集浓缩后，取50 μL涂布于F2固体培养基上[1 g/L NaNO₃、67 mg/L NaH₂PO₄·H₂O、3.65 mg/L FeCl₃·6H₂O、4.37 mg/LNa₂EDTA·2H₂O、微量元素（0.0196 mg/L CuSO₄·5H₂O、0.0126 mg/L NaMoO₄·2H₂O、0.044mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.01mg/L CoCl₂和0.36 mg/L MnCl₂·4H₂O）和维生素 (2.5 µg/L VB₁₂、2.5 µg/L biotin和0.5 µg/L thiamine HCl) ，pH值7.2；含100 μg/mL的氨苄青霉素、50 μg/mL卡那霉素]，25 ℃培养2周，挑取绿色克隆，划线纯化后得到藻株MEM-A25，经过表型与遗传特征进行分类鉴定，确定其为小球藻属（Chlorella）的新种，分类命名为Chlorellasp. MEM-A25。

实施例2本发明所述海洋小球藻新种的形态特征

将海洋蛋白核小球藻（Chlorella sp. MEM-A25）划线接种于F2平板上培养3周后，形成圆形，直径2-5 mm，不透明，半湿润，凸起的绿色藻落（如图1所示）。挑取该藻株接种于液体F2培养基培养2周后，形成绿色藻液（如图2所示）。显微观察结果显示该藻株的细胞呈球形，无鞭毛，能够运动，直径2-10 μm（如图3所示）。

实施例3本发明所述海洋小球藻新种的生理生化特性

海洋芳香小球藻Chlorella sp. MEM-A25能够在F2固体培养基上生长，能够耐受18-105 g/L的海盐，生长温度范围15-35℃，光照强度范围为10-500 μE·m^-2·s^-1。

实施例4 ITS rRNA基因及18S rRNA基因序列分析

提取藻株MEM-A25的基因组DNA，利用ITS rRNA基因通用引物ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’)和ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) 扩增ITS rRNA基因片段，利用18S rRNA基因通用引物18ScomF1 (5’- GCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATC-3’)和18ScomR1 (5’- CACCTACGGAAACCTTGTTACGGC-3’)扩增18S rRNA基因片段，进行测序，分别获得ITS rRNA基因及18S rRNA基因序列。

小球藻新种Chlorella sp. MEM-A25的ITS rRNA基因序列如SEQIDNO.1所示。将该ITS rRNA基因序列提交GenBank数据库进行多重序列比对，与已有效发表的藻株进行序列相似性分析，发现其与小球藻属的模式菌株Chlorella pyrenoidosa的序列相似性最高（96.0％）。小球藻新种Chlorella aromata MEM-A25的18S rRNA基因序列如SEQIDNO.2所示。将该18S rRNA基因序列提交GenBank数据库进行多重序列比对，与已有效发表的藻株进行序列相似性分析，发现其与小球藻属的模式菌株Chlorella vulgaris的序列相似性最高（98.0％）。根据著名微生物分类学家Stackebrandt等的理论，18S rRNA基因序列相似性小于98.7％的微生物应归于不同的种。藻株MEM-A25与小球藻属已有模式藻株的18S rRNA序列相似性在98.7％以下，结合其脂肪酸等代谢物组成与小球藻属的已知种具有较大差异，应为小球藻属的一个新种。

将藻株MEM-A25与小球藻属相关模式菌株的18S rRNA基因序列用ClustalW软件比对，然后采用邻接法构建系统进化树，结果如图4所示。从系统发育树可以看出，在小球藻属所有模式菌株组成的分类簇内，藻株MEM-A25位于一个独立的分支中。

综上所述，18S rRNA基因序列以及ITS rRNA基因的序列相似性比较及系统发育分析结果均显示藻株MEM-A25与小球藻属的相关模式菌株在遗传上具有较大的差异性，应为小球藻属的一个新种，将其命名为芳香蛋白核小球藻（Chlorella aromata）。

实施例5本发明所述小球藻新种光强耐受能力测定

将小球藻新种Chlorella sp. MEM-A25和微拟球藻Nannochloropsis oceanica接种于F2培养基中。25 ℃，分别在50和200 μE·m^-2·s^-1的光强下培养。用分光光度法测定藻液的OD₇₅₀值。通过测定，无论是在50 μE·m^-2·s^-1还是在200 μE·m^-2·s^-1，Chlorella sp.MEM-A25的生长速率明显高于Nannochloropsis oceanica（图5）。

实施例6本发明所述小球藻新种温度耐受能力测定

将小球藻新种Chlorella sp. MEM-A25和微拟球藻Nannochloropsis oceanica接种于F2培养基中。50 μE·m^-2·s^-1的光强下，分别在15、25、28和35 ℃培养。用分光光度法测定藻液的OD₇₅₀值。通过测定，在四种温度下，Chlorella sp. MEM-A25的生长速率显著高于Nannochloropsis oceanica。35 ℃时，Nannochloropsis oceanica因受到高温胁迫而死亡，而Chlorella sp. MEM-A25仍然可以以较慢的速率生长（图6）。

实施例7本发明所述小球藻新种盐度耐受能力测定

将小球藻新种Chlorella sp. MEM-A25和微拟球藻Nannochloropsis oceanica接种于不同盐度的F2培养基中（18、35、70和105 g/L海盐）。25℃，50 μE·m^-2·s^-1的光强下培养。用分光光度法测定藻液的OD₇₅₀值。通过测定，在四种盐度下，Chlorella sp. MEM-A25的生长速率显著高于Nannochloropsis oceanica。在18和70 g/L盐度下，Nannochloropsis oceanica的生长速率明显受到过低或者过高盐度抑制，而Chlorella sp. MEM-A25在这两种盐度下的生长速率和35 g/L盐度盐度下生长速率相当（图6）。在105 g/L盐度下，Nannochloropsis oceanica生长速率不到最佳盐度下（35 g/L）的50%，而Chlorella sp.MEM-A25仍然可以保持最佳盐度下生长速率的80%（图7）。

实施例8本发明所述小球藻新种产芳香型挥发性化合物能力测定

将小球藻新种Chlorella sp. MEM-A25接种于F2培养基中。25℃，50 μE·m^-2·s^-1的光强下培养至对数生长期（OD₇₅₀=2.0）。可以闻到芳香气味，收集后，采用GC-MS分析气体成分（图8）。化合物成分包括benzothiazole（苯并噻唑）、carbonimidodith等。

实施例9本发明所述欧文氏菌新种产中性脂能力测定

将小球藻新种Chlorella sp. MEM-A25接种于F2培养基中。25℃，50 μE·m^-2·s^-1的光强下培养至对数生长期（OD₇₅₀=2.0）。收集细胞后，真空冷冻干燥，提取总脂后GC-MS分析脂肪酸组成。同时对总脂进行TLC分析，刮取中性脂（TAG）后GC-MS分析脂肪酸组成（图9）。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 海南大学

<120> 一种释放芳香型气味的耐盐耐高温耐强光的小球藻及其应用

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 437

<212> DNA

<213> 芳香蛋白核小球藻ITS rRNA基因序列

<400> 1

aattgggatc ttgcctgagc tcaggtcgaa gtgtgaggag tggggggggg gagggaggcc 60

ggggtaccgg cctcccaacc tccacccccg ggtgggcctc cagcagagcc gccctcgggc 120

aagggggggc ggggtgcaag cggtgaggac cgccagccta ccaagccatt gccctgcgaa 180

cgggggcagt gctcaagcct ctgcacttca gcagacccgg gcggacccgc cccggggggg 240

ggggggcgag ggggggcgac cgggggtgcc agttccgctc cgaccacaga gtgggggggg 300

cgaggggggt gagccgacgc tgaggcaaac atgcctttgg ccgaagccgc gggcgcaatt 360

tgcgttcaaa gattcgatgg ttcacggaat tctgcaattc acactacgta tcgaatttcg 420

ctgcgttctt catcgat 437

<210> 2

<211> 1025

<212> DNA

<213> 芳香蛋白核小球藻18S rRNA基因序列

<400> 2

cagtcctagt tactgcttta tactgtgaac tgcgaatggc tcattaaatc agttatagtt 60

tatttgatgg taccttacta ccggataacc gtagtaattc tagagctaat acgtgcgtaa 120

accccgactc ctggaagggg cgtatttatt agatttaagg ccgacccggc tctgccggtc 180

tcgcggtgaa tcatgataac ttcacgaatc gcatggcctt gtgccggcga tgtttcattc 240

aaatttctgc cctatcaact ttcgatggta ggatagaggc ctaccatggt ggtaacgggt 300

gacggaggat tagggttcga ttccggagag ggagcctgag aaacggctac cacatccaag 360

gaaggcagca ggcgcgcaaa ttacccaatc ctgacacagg gaggtagtga caataaataa 420

caataccggg ccttttcagg tctggtaatt ggaatgagta caatctaaac cccttaacga 480

ggatcaattg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccaatagcgt 540

atatttaagt tgctgcagtt aaaaagctcg tagttggatt tcgggcgggg cctgccggtc 600

cgccgtttcg gtgtgcactg gccgggcccg ccttgttgcc ggggacgggc tcctgggctt 660

cactgtccgg gactcggagt cggcgctgtt actttgagta aattagagtg ttcaaagcag 720

gcctacgctc tgaatacatt agcatggaat aacacgatag gactctggcc tatcctgttg 780

gtctgtagga ccggagtaat gattaagagg gacagtcggg ggcattcgta tttcattgtc 840

agaggtgaaa ttcttggatt tatgaaagac gaactactgc gaaagcattt gccaaggatg 900

ttttcattaa tcaagaacga aagttggggg ctcgaagacg attagatacc gtcctagtct 960

caaccataaa cgatgccgac tagggatcgg cggatgtttt cttcgatgac tccgccggca 1020

cctat 1025

Claims (3)

1.一种释放芳香型气味的耐盐耐高温耐强光的小球藻，分类命名为芳香蛋白核小球藻(Chlorella aromata)，于2017年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M2016793。

2.权利要求1所述的小球藻在开发耐盐、耐高温、耐强光基因、代谢通路中的应用。

3.一种微藻生物制品，其含有权利要求1所述的小球藻。