CN110157622A - 一种用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法 - Google Patents

一种用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法。该方法从淡水水体中取样，经过增殖培养、分离、纯化、形态学与分子生物学鉴定，最终确定筛选得到的小球藻藻株的种名。采用本发明所述的方法，可以快速筛选得到适用于生物柴油生产的小球藻藻株，有利于实现小球藻规模化培养、推动生物柴油商业化生产。

Description

一种用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法
技术领域
本发明涉及小球藻培养技术领域，具体涉及一种用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法。
背景技术
微藻被认为是最有发展前景的生物柴油原料，与陆生植物相比，具有更高的光合作用效率，可以更有效地利用二氧化碳；与能源作物相比，具有更快的生长速率和更高的油脂产出效率，节约土地资源，生产生物柴油的成本更低。
小球藻是一种单细胞微藻，细胞呈球形或椭球形，直径2-10μm，以似亲孢子方式进行无性繁殖，生长速度快，光合效率高，分布广泛，主要生长于土壤、潮湿的岩石表面以及淡水中，对环境的适应能力较高，易于大规模培养。小球藻是目前研究最深入、最有吸引力的用于生产生物柴油的微藻藻种，是优质的生物柴油原料。单位面积小球藻油脂产出效率明显高于其他植物油料作物，与同等量的以油菜籽或大豆为原料的生物柴油相比，小球藻生物柴油所需的土地资源大约是前者的1/132-1/49。另外，微藻生物柴油是可再生、降低温室效应、对环境友好的生物质能，基本无毒、不含硫类、可生物降解，提取油脂后的微藻副产品可作为土壤肥料或用于乙醇提取。小球藻生长速率快、容易培养，所需的环境条件对基于土地资源的农业基本无影响，其大规模的培养不会对人类食物供应链产生重大影响。
产油小球藻的藻株选择应该综合考虑含油量、生长速度、对胁迫条件的可接受性、油脂的提取难度以及对生态环境可能的危害性等多方面因素。选取高品质的油藻藻株，对于小球藻规模化培养、实现生物柴油商业化生产至关重要。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法，经过增殖培养、分离、纯化、形态学与分子生物学鉴定，筛选得到适用于生物柴油生产的小球藻藻株，以促进小球藻的规模化培养。
本发明采用的技术方案是：一种用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤：
S1.采集水样，进行增殖培养：
S2.采用BG11固体培养板分离方法对采集的水样中的藻株进行分离；
S3.对分离后的藻株进行纯化培养，并对培养得到的微藻藻株进行编号，观察藻株形成的藻落的形状、颜色；
S4.将纯化培养得到的藻株在BG11培养基内培养至指数生长期，适当稀释后直接在光学显微镜下观察，记录藻细胞的形态特征；
S5.收集指数生长期藻细胞，用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以其作为模板，利用PCR技术扩增18SrDNA基因片段；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后测序，确定藻株的属名；
S6.基于测序得到的18SrDNA序列用软件MEGA4.0构建系统发育树，确定藻株的种名。
进一步地，步骤S1的具体方法如下：从淡水河流中采集水样，用纱布过滤掉所采集的水样中的肉眼可见的沙石和浮游生物，取一定体积的过滤后的水样，加入装有BG11液体培养基的三角瓶内，将三角瓶置于光照培养箱内，静置培养7天，培养温度为25±1℃，光照强度为2500LX左右，光照时间为24h，每天定时晃动4次。
进一步地，所述水样与培养基的体积比为1：2，水样的体积为25mL，培养基的体积为50mL。
进一步地，步骤S2中，所述BG11固体培养板的制作方法如下：在BG11液体培养基内加入1.5％的琼脂，加热溶解后，分装到三角烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌锅内灭菌，温度121℃，时间20-30min，待培养基冷却到50℃左右时，利用无菌操作将培养基倒入到灭菌的培养皿中，冷却后制成BG11固体培养板。
进一步地，步骤S2中所述分离的具体操作如下：在无菌条件下，取S1培养液摇匀后，用经过酒精灯灭菌的接种环蘸取藻样轻轻地在培养基平面上做第一次划线，划3-4条线，将培养皿旋转约80°，把接种环在酒精灯上灭菌后通过第一次划线区做第二次划线，用同样的方法做第三次、第四次划线。
进一步地，步骤S3中纯化培养的具体方法如下：BG11固体培养板经接种后，置于光照培养箱内培养，培养过程中观察藻株是否有杂菌污染，培养7天后用纤细的解剖针挑取未被污染的单藻落，接种于装有培养基的三角瓶中，置于光照培养箱内继续培养，每天定时摇动4次，观察培养液的颜色变化，待培养液颜色较绿时，吸取5mL藻液按1：10的接种比例进行扩大培养，并对培养得到的微藻藻株进行编号，观察藻株形成的藻落的形状、颜色。
进一步地，步骤S5中PCR反应体系为25ul，其中含正、反向引物(10umol/L)各0.5ul，模板DNA0.5ul，dNTP1ul，酶0.2ul；循环条件为：95℃预变性4min，94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，30个循环后；72℃延伸10min。
进一步地，步骤S5中用于扩增18SrRNA的引物为通用引物，序列为：
正向引物：5’-CCT GGT TGA TCC TGC CAG-3’
反向引物：5’-TTG ATC CTT CTG CAG GTT CA-3’
进一步地，步骤S5测序是指将电泳分离后所得的序列在Genbank数据库中做BLASTn。
进一步地，步骤S6的具体方法为：测序得到的18SrDNA序列用软件MEGA 4.0进行对位排列，比对中采用默认设置，比对后对结果进行手工调整，调整后约1.7kb的序列用软件MEGA4.0构建系统发育树。
本发明的效果在于：该方法可以从淡水水体中取样，经过增殖培养、分离纯化、形态学与分子生物学鉴定，筛选得到适用于生物柴油生产的小球藻藻株。有利于实现小球藻规模化培养、以及生物柴油商业化生产。
附图说明
图1是本发明一具体实施例中400倍光学显微镜下藻株的形态学观察，其中a为藻株FS-01，b为藻株FS-02，c为藻株藻株FS-03；
图2是本发明一具体实施例中藻株FS-01系统发育树；
图3是本发明一具体实施例中藻株FS-02系统发育树；
图4是本发明一具体实施例中藻株FS-03系统发育树；
图5是本发明的一具体实施例的方法流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步描述。
一种用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法，如图5所示，该筛选方法包括以下步骤：
(1)液体水样增殖培养
从汾河水体取水样，将所采集的水样经过纱布过滤掉肉眼可见的沙石和浮游生物。取水样25mL，按照1：2的比例加入装有50mLBG11液体培养基的三角瓶内，培养温度为25±1℃，置于光照培养箱内，光照强度为2500LX左右，光照时间为24h，静置培养7天，每天定时晃动4次。
(2)藻株的分离
采用固体培养基分离方法对采集的水样进行分离。在BG11液体培养基内加入1.5％的琼脂，加热溶解后，分装到三角烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌锅内灭菌，温度121℃，时间20-30min，待培养基冷却到50℃左右时，无菌操作倒入到灭菌的培养皿中，制成BG11固体培养板。
在无菌条件下，取(1)培养液摇匀后，用经过酒精灯灭菌的接种环蘸取藻样轻轻地在培养基平面上做第一次划线，划3-4条线，将培养皿旋转约80°，把接种环在酒精灯上灭菌后通过第一次划线区做第二次划线。用同样的方法做第三次、第四次划线。由于第一次划线接种环上的藻细胞比较多，在第一划区藻细胞可能密集不能分离开，但通过后面的划线可能分离出单独的藻类群落。
(3)藻株的纯化培养
BG11固体培养板经接种后，置于光照培养箱内培养，培养过程中观察藻株是否有杂菌污染，培养7天后培养基上会长出藻类群落。然后用纤细的解剖针挑取未被污染的单藻落，接种于50mLBG11培养基的100mL三角瓶中，置于光照培养箱内继续培养。每天定时摇动4次。待培养液颜色较绿时，吸取5mL藻液按1：10的接种比例进行扩大培养。
通过以上分离方法，得到三株微藻藻株，编号为FS-01、FS-02、FS-03，其中FS-01、FS-02藻株生长形成圆形藻落，呈深绿色、光滑、凸起。FS-03藻株未形成圆形藻落，藻落形态不规则。
(4)藻株形态学观察
将藻株在BG11培养基内培养至指数生长期，适当稀释后直接在显微镜下观察，藻细胞个体较大，可以直接在光学显微镜下观察。如图1所示，在400倍的光学显微镜下观察藻株FS-01、FS-02为球状，直径4-6um，藻株FS-03为菱形，均可清楚看清细胞核，可初步确定藻株FS-01、FS-02为小球藻。
(5)基因组DNA提取和18SrDNA序列分析
收集指数生长期藻细胞，用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以其作为模板用PCR扩增18SrDNA基因片段。
PCR反应体系为25ul，其中含正、反向引物(10umol/L)各0.5ul，模板DNA0.5ul，dNTP1ul，酶0.2ul。循环条件为：95℃预变性4min，94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，共30个循环后，72℃延伸10min。
用于扩增18SrRNA的引物为通用引物，序列为：
正向引物：5’-CCT GGT TGA TCC TGC CAG-3’
反向引物：5’-TTG ATC CTT CTG CAG GTT CA-3’
扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后用SanPrep柱式DNA凝胶回收试剂盒回收，结果获得了单一条带，将所得的序列在Genbank数据库中做BLASTn，结果发现藻株FS-01与Chlorella sp.属有很大的相似性，其Max indent为100％；藻株FS-02与Chlorella sp.属有很大的相似性，其Max indent为99％；藻株FS-03与Desmodesmus sp.属有很大的相似性，其Max indent为100％。
(6)用软件MEGA4.0构建系统发育树
测序得到的18SrDNA序列用MEGA4.0进行对位排列，比对中采用默认设置，比对后对结果进行手工调整。调整后约1.7kb的序列采用Mega4.0软件构建系统发育树，藻株FS-01的系统发育树如图2所示，结果显示小球藻属的物种聚为一大簇，小球藻FS-01与Chlorellavulgaris FR865683.1进化关系最为接近，序列相似度为99％；藻株FS-02的系统发育树如图3所示，FS-02与Chlorella sorokiniana KF673387.1进化关系最为接近，序列相似度为99％；藻株FS-03的系统发育树如图4所示，FS-03与Desmodesmus sp.AB917128.1进化关系最为接近，序列相似度为100％。
本领域技术人员应该明白，本发明所述的方法和系统并不限于具体实施方式中所述的实施例，上面的具体描述只是为了解释本发明的目的，并非用于限制本发明。本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围，本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法，其特征在于：该筛选方法包括以下步骤：
S1.采集水样，进行增殖培养：
S2.采用BG11固体培养板分离方法对采集的水样中的藻株进行分离；
S3.对分离后的藻株进行纯化培养，并对培养得到的微藻藻株进行编号，观察藻株形成的藻落的形状、颜色；
S4.将纯化培养得到的藻株在BG11培养基内培养至指数生长期，适当稀释后直接在光学显微镜下观察，记录藻细胞的形态特征；
S5.收集指数生长期藻细胞，用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，以其作为模板，利用PCR技术扩增18SrDNA基因片段；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后测序，确定藻株的属名；
S6.基于测序得到的18SrDNA序列用软件MEGA4.0构建系统发育树，确定藻株的种名。
2.一种如权利要求1所述的用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法，其特征在于，步骤S1的具体方法如下：从淡水河流中采集水样，用纱布过滤掉所采集的水样中的肉眼可见的沙石和浮游生物，取一定体积的过滤后的水样，加入装有BG11液体培养基的三角瓶内，将三角瓶置于光照培养箱内，静置培养7天，培养温度为25±1℃，光照强度为2500LX左右，光照时间为24h，每天定时晃动4次。
3.一种如权利要求2所述的用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法，其特征在于，所述水样与培养基的体积比为1：2，水样的体积为25mL，培养基的体积为50mL。
4.一种如权利要求1所述的用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法，其特征在于，步骤S2中，所述BG11固体培养板的制作方法如下：在BG11液体培养基内加入1.5％的琼脂，加热溶解后，分装到三角烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌锅内灭菌，温度121℃，时间20-30min，待培养基冷却到50℃左右时，利用无菌操作将培养基倒入到灭菌的培养皿中，冷却后制成BG11固体培养板。
5.一种如权利要求1所述的用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法，其特征在于，步骤S2中所述分离的具体操作如下：在无菌条件下，取S1中的培养液摇匀后，用经过酒精灯灭菌的接种环蘸取藻样轻轻地在培养基平面上做第一次划线，划3-4条，将培养皿旋转约80o，把接种环在酒精灯上灭菌后通过第一次划线区做第二次划线，用同样的方法做第三次、第四次划线。
6.一种如权利要求1所述的用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法，其特征在于，步骤S3中纯化培养的具体方法如下：BG11固体培养板经接种后，置于光照培养箱内培养，培养过程中观察藻株是否有杂菌污染，培养7天后用纤细的解剖针挑取未被污染的单藻落，接种于装有培养基的三角瓶中，置于光照培养箱内继续培养，每天定时摇动4次，观察培养液的颜色变化，待培养液颜色较绿时，吸取5mL藻液按1：10的接种比例进行扩大培养，并对培养得到的微藻藻株进行编号，观察藻株形成的藻落的形状、颜色。
7.一种如权利要求1所述的用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法，其特征在于，步骤S5中PCR反应体系为25ul，其中含浓度为10umol/L的正、反向引物各0.5ul，模板DNA0.5ul，dNTP1ul，酶0.2ul；循环条件为：95℃预变性4min，94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。
8.一种如权利要求1所述的用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法，其特征在于，步骤S5中用于扩增18SrRNA的引物为通用引物，序列为：
正向引物：5’-CCT GGT TGA TCC TGC CAG-3’
反向引物：5’-TTG ATC CTT CTG CAG GTT CA-3’。
9.一种如权利要求1所述的用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法，其特征在于，步骤S5测序是指将电泳分离后所得的序列在Genbank数据库中做BLASTn。
10.一种如权利要求1所述的用于生物柴油生产的小球藻藻株的筛选方法，其特征在于，步骤S6的具体方法为：测序得到的18SrDNA序列用软件MEGA4.0进行对位排列，比对中采用默认设置，比对后对结果进行手工调整，调整后约1.7kb的序列用软件MEGA4.0构建系统发育树。
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