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Abstract

一种真菌介导的微藻收获方法，其特征是包括以下步骤：(1)微藻的转接；（2）微藻的高密度培养；（3）能成球的真菌的孢子的培养；（4）添加新鲜孢子悬浮液到微藻培养基中；（5）真菌介导的大颗粒菌藻共生体形成；（6）用过滤方法收获大颗粒菌藻共生体。本发明是通过在即将收获的微藻培养基中引用能成球的真菌菌株并混合培养，从而达到真菌-微藻共生并成球的目的，最后通过简单的过滤方法即可收获真菌介导的大颗粒菌藻共生体。

Description

一种真菌介导的微藻收获的方法
技术领域
本发明属于可再生生物能源领域，特别涉及一种真菌介导微藻收获的新工艺。具体说来就是首先让微藻细胞在光合自养或异养条件下生长；然后在细胞生长的不同时期导入能成球的真菌孢子，并控制培养条件，最终形成大颗粒的菌藻球体，进而利用简单的过滤方法收获微藻并用于生物能源生产的过程。
背景技术
微藻是一种能进行光合作用的微生物。它可以利用污水中的小分子有机物和无机养分，吸收空气中大量的CO2，并合成脂肪，通过收集加工可提炼成生物柴油供汽车、火车作为动力燃料，进一步加工还可作为航空燃料，供飞机使用。微藻在生物燃料开发方面具有如下明显优势：一是微藻可以利用边际土地不与农田争地；二是微藻能在咸水、污水中生长，不仅可以节约大量淡水，而且还能净化污水；三是微藻生产潜力惊人，繁殖速度比高等植物快40倍。所以，微藻规模化养殖在温室气体减排、应对全球气候变暖，和低成本生产可再生生物质能源方面都有着很大的潜力。但是，迄今为止，利用微藻生产生物能源例如生物柴油仍然存在许多迄待解决的问题，其中一个关键问题是还缺乏微藻的低成本高效率收获技术。
由于微藻的细胞很小（直径约2-70 μm），到目前为止，尚未开发出一种高效且经济可行的微藻大规模收获技术。传统的微藻收获方法主要包括气浮、离心、添加絮凝剂沉降、滤膜过滤等，然而以上这些方法要么能耗过大，成本太高，要么不适用大规生产应用。因此急需开发一种高效且经济可行的微藻收获方法。阮榕生课题组首次以从环境中筛选的几十株真菌菌株为材料，率先开展了利用真菌介导微藻成球从而帮助微藻收获的研究。目前，通过建立高通量筛选模型，已经筛选出十几株能辅助微藻成球的真菌菌株并优化了菌藻共生成球的培养条件，大大提高微藻收获效率（到达100%）。该方法简单高效，成本低廉，大大降低了微藻收获成本，为微藻生物能源产业化迈出了坚实的一步。
发明内容
 本发明的目的在于开发一种真菌介导的微藻收获的新工艺。通过引入能成球的真菌孢子，形成真菌-微藻共生的大颗粒球体，从而从而开发一种新型简单高效、成本低廉的微藻收获方法。
所述真菌介导的真菌介导的微藻收获方法是以在生物反应器中高密度培养微藻细胞，然后在细胞生长的不同时期导入能成球的真菌的孢子并控制培养获得真菌介导的菌藻球体，进而利用简单的过滤方法收获微藻并用于生物能源生产的过程。
所述的一种真菌介导微藻收获的新工艺按照如下步骤进行：(1)微藻的转接；（2）微藻的高密度培养；（3）能成球的真菌的孢子的培养；（4）添加新鲜孢子悬浮液到微藻培养基中；（5）真菌介导的大颗粒菌藻共生体形成；（6）用过滤方法收获大颗粒菌藻共生体。
所述的微藻细胞包括但不限于小球藻属（chlorella sp.），筒柱藻属（cylindrotheca sp. ），硅藻（diatom），菱形藻（Nitzschia sp.），裂壶藻（ schizochytrium sp.），杜氏藻属(dunaliella)，栅藻(Scenedesmus sp.)，微绿球藻(Nannochloris sp.)，衣藻属(chlamydomonas sp.)，扁藻(Tetraselmis sp.)，空球藻属(Eudorina sp.)等。
所述的微藻培养基包括但不限于BG-11 培养基、F/2 培养基、walne 培养基、TAP 培养基以及其他任何经过修改的微藻培养基。
所述的能成球的真菌菌株包括，但不限于米根霉(Rhizopus Oryzae)，变色木耳(Anthracophyllum discolor)，糙皮侧耳(Pleurolus ostreatus)，羊肚菌(Morchella sp.)，产黄青霉( Penicillum chrysogenum)，双孢蘑菇(agaricus bisporus)，毛霉属(Mucorcircillenous)，深黄被孢霉(Mortierella isabellina)，海枣曲霉(Aspergillus phonecis)，里氏木霉(Trichoderma reesei)， 黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。
本发明中，所述菌藻共生体的培养包含了为自养培养或异养培养的方法。接种真菌孢子数为1×102 L-1至1×1010 L-1，pH范围为0.1-10，温度范围为4-45℃。异养培养基有机碳源浓度初始还原糖浓度范围为0.01-200 g.L-1。
本发明内容涉及的技术流程及方法步骤详细描述如下。
（1）微藻的转接。
从-70度冰箱取出冻存微藻藻株并用接种环刮取少许到固体斜面平板光照培养。
所述的自养培养条件如下：温度控制在20-45℃的范围内，以28℃为最佳；光照培养氮源如甘氨酸、酵母提取物等初始浓度介于1-15 g.L-1，优选4 g.L-1，通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50-300 L/h，优选80-120L/h；CO2浓度0.9-3%。培养过程中采用10-200μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于50-400小时，优选120-200小时。
所述的异养培养条件如下：有机碳源如葡萄糖浓度0.01-200 g.L-1，优选20 g.L-1；通入空气，通气量100-400 L/h，优选150-250L/h；培养过程中采用5-40μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于72-200小时，优选100-150小时。
（2）微藻的高密度培养。
将平板培养物接种至生物反应器培养，在异养培养基中高密度培养；生物反应装置包括摇瓶、通气瓶、光生物反应器、发酵罐和开放培养池。在上述适宜条件培养，直到细胞对数生长期，细胞密度达到（106-1010以上）。
所述的自养培养条件如下：温度控制在20-45℃的范围内，以28℃为最佳；光照培养氮源如甘氨酸、酵母提取物等初始浓度介于1-15 g.L-1，优选4 g.L-1，通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50-300 L/h，优选80-120L/h；CO2浓度0.9-3%。培养过程中采用10-200μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于50-400小时，优选120-200小时。
所述的异养培养条件如下：有机碳源如葡萄糖浓度0.01-200 g.L-1，优选20 g.L-1；通入空气，通气量100-400 L/h，优选150-250L/h；培养过程中采用5-40μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，以7.0为佳；总培养时间视细胞生长情况而定，一般介于72-200小时，优选100-150小时。 
（3）能成球的真菌的孢子的培养。
从-70度冰箱取出冻存真菌菌株并用接种环刮取少许到固体平板培养4-7天，然后用无菌水反复冲洗获得新鲜的真菌孢子。
（4）添加新鲜孢子悬浮液到微藻培养基中在微藻细胞培养到细胞对数生长期，细胞密度达到（106-1010以上），向微藻的培养基中添加一定数量的真菌孢子。以海枣曲霉（Aspergillus. Sp.）为例，添加1×102 L-1至1×1010 L-1的新鲜孢子到微藻的培养基中，优选1×104 L-1的真菌孢子浓度并以微藻异养的条件培养。为防止微藻与真菌共生成球的过程中引起的杂菌污染，所有操作均在无菌工作台中进行。
（5）真菌介导的大颗粒菌藻共生体形成。
优化培养条件，直至所有微藻与真菌形成大颗粒菌藻共生的球体。
（6）用简单的过滤方法收获大颗粒菌藻共生球体，并用于并用于生物能源生产。
上述异养培养基配方为：K2HPO4·3H2O 0.04g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L， CaCl2·2H2O 0.036g/L， Citric acid 0.006g/L，Ferric ammonium citrate 0.006g/L，EDTA 0.001g/L，NaNO3 1.5g/L，Na2CO3 0.02g/L，A5微量元素液1.5ml/L，其中A5微量元素液组成：H3BO3 2.86g/L， MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.222g/L，NaMoO4·2H2O 0.39g/L，CuSO4·5H2O 0.079g/L 和CoCl2·6H2O 0.05g/L，并加入有机碳源至初始还原糖浓度为0.01-200g.L-1；优选范围在1-20 g.L-1。
本发明是通过在即将收获的微藻培养基中引用能成球的真菌菌株并混合培养，从而达到真菌-微藻共生并成球的目的（如图1-图8所示），最后通过简单的过滤方法即可收获真菌介导的大颗粒菌藻共生体并用于生物能源生产。
本发明的有益效果在于引入了真菌介导的菌藻共生成球机制。该工艺有效地控制了微藻收集的成本，满足了微藻生物柴油工业化应用的要求，是一条经济、高效地制微藻收获的新途径。
附图说明
图1 真菌-微藻共生机制模式图。
图2 成球真菌在固体斜面培养基上的生长状态图。
图3 成球真菌在固体平板培养基上的生长状态图。
图4 成球真菌液态培养成球状态图。
图5 液态培养基中微藻生长状态图。
图6 向微藻液态培养体系中接种成球真菌孢子前期菌藻共生状态图。
图7 真菌与微藻共生成球中期状态图。
图8 真菌与微藻完全共生成球状态图。
图9 真菌介导微藻收获并制备生物能源示意图。
具体实施方式
本发明将通过以下实例作进一步说明。
实施例1。
含油藻株—小球藻(Cholorella vulgaris) 本地筛选，其自养培养基配方如下。
上述自养培养基配方为：K2HPO4·3H2O 0.04g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L， CaCl2·2H2O 0.036g/L，柠檬酸 0.006g/L，柠檬酸铁铵 0.006g/L，EDTA 0.001g/L， NaNO3 1.5g/L，Na2CO3 0.02g/L，A5微量元素液1.5ml/L，其中A5微量元素液组成：H3BO3 2.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.222g/L，NaMoO4·2H2O 0.39g/L，CuSO4·5H2O 0.079g/L ，和 CoCl2·6H2O 0.05g/L。
异养培养基配方同上，并加入有机碳源至初始还原糖浓度为20 g.L-1 。
通过步骤1中所描述的方法，将生长在固体培养基上的小球藻强势单株群落接种至250 mL 摇瓶中摇床培养，温度控制在28℃±5℃；当细胞进入对数生长末期后，准备接种真菌孢子。
于-70℃冰箱中接种海枣曲霉（Aspergillus. Sp.）孢子到固体平板培养基中活化真菌菌株，然后用无菌水反复冲洗平板表面，获得每升含有1×106 L-1的新鲜海枣曲霉（Aspergillus. Sp.）孢子，在液体培养基中摇床培养生成大颗粒的小球藻(Cholorella vulgaris)- 海枣曲霉（Aspergillus. Sp）菌丝的菌藻共生球体（如图8所示）。
通过简单的过滤方法收获固定化的小球藻(Cholorella vulgaris)- 海枣曲霉（Aspergillus. Sp）菌丝的菌藻共生球体，并以猪粪废水过滤液作为培养基规模化扩大培养，连续收获的大颗粒菌藻共生体用于生物柴油的生产。猪粪废水过滤液得到净化处理。本发明应用效果如图9所示。
实施例2。
含油藻株—栅藻(Scenedesmus sp.) 本地筛选，其自养培养基配方如下。
上述自养培养基配方为：K2HPO4·3H2O 0.04g/L，MgSO4·7H2O 0.075g/L， CaCl2·2H2O 0.036g/L，柠檬酸 0.006g/L，柠檬酸铁铵 0.006g/L，EDTA 0.001g/L， NaNO3 1.5g/L，Na2CO3 0.02g/L，A5微量元素液1.5ml/L，其中A5微量元素液组成：H3BO3 2.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.222g/L，NaMoO4·2H2O 0.39g/L，CuSO4·5H2O 0.079g/L ，和 CoCl2·6H2O 0.05g/L。
异养培养基配方同上，并加入有机碳源至初始还原糖浓度为22 g.L-1 。
通过步骤1中所描述的方法，将生长在固体培养基上的小球藻强势单株群落接种至250 mL 摇瓶中摇床培养，温度控制在28℃±5℃；当细胞进入对数生长末期后，准备接种真菌孢子。
于-70℃冰箱中接种里氏木霉(Trichoderma reesei)孢子到固体平板培养基中活化真菌菌株，然后用无菌水反复冲洗平板表面，获得每升含有1×106 L-1的新鲜里氏木霉(Trichoderma reesei)孢子，在液体培养基中摇床培养生成大颗粒的小球藻(Cholorella vulgaris)- 里氏木霉(Trichoderma reesei)菌丝的菌藻共生球体（如图8所示）。
通过简单的过滤方法收获固定化的栅藻(Scenedesmus sp.) - 里氏木霉(Trichoderma reesei)菌丝的菌藻共生球体，并以啤酒厂有机废水作为培养基规模化扩大培养，连续收获的大颗粒菌藻共生体用于生物柴油的生产。啤酒厂有机废水得到净化处理。本发明应用效果如图9所示。

Claims (10)

1.一种真菌介导的微藻收获方法，其特征是包括以下步骤：(1)微藻的转接；（2）微藻的高密度培养；（3）能成球的真菌的孢子的培养；（4）添加新鲜孢子悬浮液到微藻培养基中；（5）真菌介导的大颗粒菌藻共生体形成；（6）用过滤方法收获大颗粒菌藻共生体。
2.根据权利要求1 所述一种真菌介导的微藻收获方法，其特征是所述的微藻包括小球藻属、筒柱藻属、硅藻、菱形藻、裂壶藻、杜氏藻属、栅藻、微绿球藻、衣藻属、扁藻、空球藻属。
3.根据权利要求1 所述一种真菌介导的微藻收获方法，其特征是所述的微藻培养基包括BG-11培养基、F/2培养基、walne培养基、TAP培养基，以及其他任何经过修改的微藻培养基。
4.根据权利要求1 所述一种真菌介导的微藻收获方法，其特征在于，所述的能成球的真菌菌株包括米根霉、变色木耳、糙皮侧耳、羊肚菌、产黄青霉、双孢蘑菇、毛霉属、深黄被孢霉、海枣曲霉、里氏木霉、黄孢平革菌。
5.根据权利要求1 所述一种真菌介导的微藻收获方法，其特征是所述菌藻共生体的培养包含了为自养培养或异养培养的方法。
6.根据权利要求1所述一种真菌介导的微藻收获方法，其特征是所述接种所述能成球的真菌的孢子数为1×102 L-1至1×1010 L-1。
7.根据权利要求5所述一种真菌介导的微藻收获方法，其特征在于，所述的自养培养条件如下：温度控制在20-45℃的范围内，光照培养氮源甘氨酸或酵母提取物的初始浓度介于1-15 g.L-1，通入空气或空气与CO2的混合气体，通气量50-300 L/h，CO2浓度0.9-3%；培养过程中采用10-200μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间；总培养时间介于50-400小时。
8.根据权利要求7所述一种真菌介导的微藻收获方法，其特征在于，所述的自养培养条件如下：温度控制在28℃，光照培养氮源甘氨酸或酵母提取物的初始浓度为4 g.L-1，空气或空气与CO2的混合气体的通气量为80-120L/h，培养过程中pH值为7.0，总培养时间为120-200小时。
9.根据权利要求5所述一种真菌介导的微藻收获方法，其特征在于，所述的异养培养条件如下：有机碳源葡萄糖浓度0.01-200 g.L-1，通入空气，通气量100-400 L/h，培养过程中采用5-40μmol.m-2s-1的日光照射，pH值控制在5-9之间，总培养时间介于72-200小时。
10.根据权利要求9所述一种真菌介导的微藻收获方法，其特征在于，所述的异养培养条件如下：有机碳源葡萄糖浓度为20 g.L-1；通气量为150-250L/h，培养过程中pH值为7.0，总培养时间为100-150小时。
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