KR102019829B1 - 포토랍두스 템페라타 템프라타 유래 안트라퀴논 화합물을 포함하는 뿌리혹선충 방제용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포토랍두스 템페라타 템프라타 유래 살선충능을 갖는 안트라퀴논 화합물의 분리방법 및 이를 포함하는 살선충 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 포토랍두스 템페라타 템프라타의 배양액을 대상으로 크로마토그래피를 실시하여 살선충능이 우수한 안트라퀴논 화합물을 분리하는 방법 및 분리된 안트라퀴논 화합물을 포함하는 살선충 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 포토랍두스 템페라타 템프라타 유래 안트라퀴논 화합물은 우수한 살선충능을 가지므로, 친환경적이고, 효율적으로 선충을 방제할 수 있는 효과가 있다.

Description

포토랍두스 템페라타 템프라타 유래 안트라퀴논 화합물을 포함하는 뿌리혹선충 방제용 조성물 {Composition for Controlling Meloidogyne sp. Having Anthraquinone Compounds Derived from Photorhabdus temperata subsp temperata}
본 발명은 포토랍두스 템페라타 템프라타 유래 살선충능을 갖는 안트라퀴논 화합물의 분리방법 및 이를 포함하는 살선충 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 포토랍두스 템페라타 템프라타의 배양액을 대상으로 크로마토그래피를 실시하여 살선충능이 우수한 안트라퀴논 화합물을 분리하는 방법 및 분리된 안트라퀴논 화합물을 포함하는 살선충 조성물에 관한 것이다.
식물기생선충은 모든 흙 속에 존재하며 선충강에 속하는 작은 생물체로, 대부분 식물기생선충의 크기가 매우 작아 현미경상에서만 확인이 가능하다. 식물기생선충의 형태는 일반적으로 실 모양으로 가늘거나, 방추형의 모습으로 좌우 대칭형이며, 그 길이는 0.25 내지 0.45 ㎜로 매우 작으며, 몸에는 마디가 없고, 체표에는 주름을 가지고 있다. 체벽은 크게 표피, 진피 및 근육으로 구성되어 있으며, 중앙 신경계 및 식도 주위의 신경환으로 신경계를 구성하고 있다. 번식은 암컷 성충이 난을 낳는 것으로 하여, 자웅이체이나 동정생식을 통해 번식하기도 한다. 난에서 부화한 식물기생선충은 4단계의 유충기를 지난 후, 성충으로 성장하고 대략 1개월 정도 생존하는데 소화기관과 생식기관이 특징적으로 발달하며, 암컷의 경우 생존기간 동안 대략 50 내지 600개의 난을 낳는다. 상기 식물기생선충은 두부 입주위에 구침을 가지고 있고, 이를 이용하여 식물의 뿌리조직에 구침을 꼽아 구멍을 내고, 식물조직의 영양분을 흡수하거나 뿌리조직 내로 침입한다. 이러한 식물기생선충은 식물의 종자, 잎, 줄기, 뿌리 등 모든 부분에서 기생하며, 종에 따라 식물체의 외부에서 식물체를 가해하는 외부기생성, 식물조직 내부로 침입하여 가해하는 내부기생성 및 머리 부분만 식물체 내에 삽입하여 영양분을 섭취하는 반 내부 기생성 등 다양한 생활양식을 갖는다. 또한 내부 기생성선충은 이동하며 가해하는 이동성인 것과 한번 가해하기 시작하면 이동하지 않는 정착성인 것이 있다.
선충은 먹이에 따라 식세균성 선충, 식균성 선충, 부식성 선충, 포식성 선충, 식물기생성 선충 등으로 나뉘는데, 식물기생성 선충은 연작의 주요 원인 중의 하나이며 작물에 따라 심각한 피해를 유발한다. 식물기생성 선충에는 수천종이 있으며, 형태, 가해 양상 및 기주에 따라 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.), 시스트선충(Globodera spp.), 씨알선충(Anguina spp.), 줄기구근선충(Ditylenchus spp.), 아엽선충(Aphalenchoides spp.), 뿌리썩이선충(Pratylenchus spp.), 왜화선충(Tylenchorhychus spp.), 감귤선충(Rotylenchulus spp.) 등이 있다.
식물기생선충에 의한 피해는 토양 내 선충의 서식밀도가 낮은 경우에는 경미하지만, 작물이 성장하면서 재배기간이 경과함에 따라 서식밀도가 높아지게 되면 기주식물은 치명적인 손상을 입고 고사하게 된다. 식물기생선충에 감염된 식물체는 병원균에 대한 저항력이 감소되어 병원균이 침입하였을 때 발병을 조장하거나 심화시키고, 일부 선충은 식물병원성 바이러스를 매개하기도 한다.
뿌리혹선충은 노지 및 시설 재배에 가장 큰 피해를 주는 해충 중 하나로써, 약 700여종의 식물이 기주로 알려져 있다. 그 종류로는 고구마뿌리혹선충(Meloidogyneincognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogynehapla), 자바뿌리혹선충(Meloidogynejavanica) 및 땅콩뿌리혹선충(Meloidogynearenaria) 등이 있으며, 주로 참외, 오이, 토마토, 딸기 고추 및 수박 등의 과채류와 인삼 등에 피해를 주는 가장 방제하기 어렵고 피해가 큰 해충이다.
이러한 선충의 방제법으로는 휴경법, 침수법, 윤작법, 유기질비료 증시법, 대항식물 재배법, 생물학적 방제법, 물리적 방제법, 화학적 방제법 등이 있는 것으로 알려졌으나, 대부분 농가에서 현실적으로 적용하기 힘든 방법이거나, 화학적 방제법의 경우 비선택적인 독성으로 인해 잔류 독성에 의한 토양 오염으로 생태계 파괴를 일으키는 문제점이 있다.
생물학적 방제법으로서 한국공개특허 제2007-0065938호에서는 정향으로부터 분리, 정제한 유제놀을 함유하는 뿌리혹선충방제 조성물을 개시하였고, 한국공개특허 제2009-02058889호에서는 유제놀(eugenol), 티몰(thymol), 카르바크롤(carvacrol) 또는 아네톨(t-anithole)을 유효성분으로 함유하는 식물 병원성 뿌리혹선충 방제용 조성물을 개시한 바 있으나, 더욱 우수한 살선충 효과를 갖는 살선충제의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 곤충병원성선충의 공생박테리아인 포토랍두스 템페라타 템프라타 균주의 배양액으로부터 살선충 활성물질을 분리할 경우, 보다 친환경적이면서 효과가 우수한 미생물 유래 살선충 조성물을 제조할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 미생물로부터 우수한 살선충능을 갖는 화합물을 분리하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 친환경적이고, 효과가 우수한 미생물 유래 살선충 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 포토랍두스 템페라타 템프라타 균주 배양액을 원심분리하여 부용(broth) 층과 균사체(mycelium cake) 층으로 분리하는 단계; (b) 상기 포토랍두스 템페라타 템프라타의 균사체(mycelium cake) 층을 극성과 비극성 용매 조건에 따라 분리하기 위해 헥산(hexane), 디에틸에테르(diethyl ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 물(water)로 용매분획을 실시하는 단계; (c) 수득된 헥산(hexane) 층의 정제를 위하여 클로로포름과 메탄올 전개용매를 이용하여 단계적 구배(step-wise gradient) 방식으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 실시하여 살선충 활성을 나타내는 분획물을 획득하는 단계; (d) 상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)을 통해 얻은 분획물중 살선충 활성이 높은 분획물을 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)시켜 분획하고, 살선충 활성이 높은 분획물을 획득하는 단계; 및 (e) 상기 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 분획한 분획물중 살선충 활성이 높은 분획물을 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하여, 1,3-디메톡시-8-히드록시-9,10-안트라퀴논(1,3-dimethoxy-8-hydroxy-9,10-anthraquinone)을 수득하는 단계를 포함하는 포토랍두스 템페라타 템프라타 유래 살선충능을 가지는 안트라퀴논 화합물의 분리방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 클로로포름과 메탄올 전개용매는 클로로포름:메탄올(50:1 ~ 1:1)인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 포토랍두스 템페라타 템프라타 유래 1,3-디메톡시-8-히드록시-9,10-안트라퀴논(1,3-dimethoxy-8-hydroxy-9,10-anthraquinone)을 포함하는 살선충 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 포토랍두스 템페라타 템프라타는 ECOWIN_104 (KACC 91741P)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 선충은 뿌리혹선충, 뿌리썩이선충, 나선선충 및 씨스터선충으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 포토랍두스 템페라타 템프라타 유래 안트라퀴논 화합물은 우수한 살선충능을 가지므로, 친환경적이고, 효율적으로 선충을 방제할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 포토랍두스 템페라타 템프라타 배양액으로부터 살선충능을 갖는 화합물(Eco-2)을 분리 및 정제하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 포토랍두스 템페라타 템프라타 균사체(mycelium cake) 층의 유기용매 분획물의 살선충 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 silica gel column chromatography 분획물의 살선충 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 HPLC 분리물의 살선충 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 Eco-2의 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 Eco-2의 ESI-Mass spectrum을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 Eco-2의 1H-NMR spectrum을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 Eco-2의 13C-NMR spectrum을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 Eco-2의 HMQC spectrum을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 Eco-2의 1H-1H COSY spectrum을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 Eco-2의 1H-1H COSY correlations을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 Eco-2의 HMBC spectrum을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 Eco-2의 HMBC correlations을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 Eco-2의 구조를 나타낸 것이다.
본 발명에서는 살선충 활성을 갖는 포토랍두스 템페라타 템프라타 균주의 배양액으로부터 살선충 활성물질을 분리할 경우, 보다 친환경적이면서 효과가 우수한 천연물 유래 살선충 조성물을 제조할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
본 발명에서는, 포토랍두스 템페라타 템프라타의 배양액의 헥산 분획층을 획득하고, 실리카겔 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 살선충 활성이 높은 안트라퀴논 화합물을 분리하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 포토랍두스 템페라타 템프라타의 배양액을 유기용매 분획, 실리카겔 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 순차적으로 수행하여 1,3-디메톡시-8-히드록시-9,10-안트라퀴논(1,3-dimethoxy-8-hydroxy-9,10-anthraquinone)를 분리하였고, 분리된 안트라퀴논 화합물이 우수한 살선충 활성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 포토랍두스 템페라타 템프라타 균주 배양액을 원심분리하여 부용(broth) 층과 균사체(mycelium cake) 층으로 분리하는 단계; (b) 상기 포토랍두스 템페라타 템프라타의 균사체(mycelium cake) 층을 극성과 비극성 용매 조건에 따라 분리하기 위해 헥산(hexane), 디에틸에테르(diethyl ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 물(water)로 용매분획을 실시하는 단계; (c) 수득된 헥산(hexane) 층의 정제를 위하여 클로로포름과 메탄올 전개용매를 이용하여 단계적 구배(step-wise gradient) 방식으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 실시하여 살선충 활성을 나타내는 분획물을 획득하는 단계; (d) 상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)을 통해 얻은 분획물중 살선충 활성이 높은 분획물을 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)시켜 분획하고, 살선충 활성이 높은 분획물을 획득하는 단계; 및 (e) 상기 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 분획한 분획물중 살선충 활성이 높은 분획물을 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하여, 1,3-디메톡시-8-히드록시-9,10-안트라퀴논(1,3-dimethoxy-8-hydroxy-9,10-anthraquinone)을 수득하는 단계를 포함하는 포토랍두스 템페라타 템프라타 유래 살선충능을 가지는 안트라퀴논 화합물의 분리방법에 관한 것이다.
상기 포토랍두스 템페라타 템프라타는 살선충 활성이 있는 안트라퀴논류를 대사산물로 갖는 균주라면 특별히 제한되지 않으나 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104 (KACC 91741P)인 것이 바람직하다. 상기 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104 (KACC 91741P)는 본 발명자가 감염태 곤충병원성 선충으로부터 분리하고, 9월 13일자로 농업유전자원센터에 기탁한 균주로써, 살선충 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104 (KACC 91741P) 배양액은 포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104 (KACC 91741P)를 배지에 키운 것으로써, 사용배지는 포토랍두스 템페라타 템프라타의 배양이 가능한 것이라면 특별히 제한되지 않고 이용할 수 있으며, Tryptic Soy Broth(TSB), YM, 5% YS, LB 배지 등 통상의 배지를 예시할 수 있다.
상기 포토랍두스 템페라타 템프라타의 최적 배양을 위해서는 본 발명자가 개발한 ecowin-1 배지(멸균증류수 1 L, 대두유 5.0~50 g, 난황분 2.5~25 g, 콜레스테롤 0.01~10 g, 레시틴 0.1~10 g, 전지분유 1~20 g, 염화나트륨 1.0~50 g, 제1인산칼륨 1.0~50 g 및 효모 추출물 1.0~50 g)를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 용매분획은 포토랍두스 템페라타 템프라타의 균사체(mycelium cake) 층을 극성과 비극성 용매 조건에 따라 분리하기 위한 것으로서, 헥산(hexane), 디에틸에테르(diethyl ether), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 및 물(water)로 순차적으로 분획하는 것이 바람직하다.
상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography) 수행 시 전개용매는 클로로포름과 메탄올을 사용할 수 있는데, 클로로포름:메탄올의 비율이 50:1 ~ 1:1이 되도록 단계적 구배(step-wise gradient) 방식으로 제공하는 것이 바람직하다. 예를들면 클로로포름:메탄올의 비율을 50:1, 20:1, 10:1, 5:1 및 1:1로 단계적으로 조절하면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시할 수 있다.
본 발명에서는 보다 살선충 활성이 높은 분획물을 획득하기 위하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)을 통해 얻은 분획물을 대상으로 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 수행할 수 있는데, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 수행시 이동상은 100% 메탄올을 사용하는 것이 바람직하며, Sephadex LH-20 column을 이용할 수 있다.
끝으로, high performance liquid chromatography (HPLC) 수행 시 이동상은 메탄올과 물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 70% 메탄올을 이용할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 포토랍두스 템페라타 템프라타 유래 안트라퀴논 화합물을 포함하는 살선충 조성물에 관한 것이다.
상기 안트라퀴논 화합물은 1,3-디메톡시-8-히드록시-9,10-안트라퀴논(1,3-dimethoxy-8-hydroxy-9,10-anthraquinone)으로서, 앞서 설명한 분리방법에 의하여 분리될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 선충은 뿌리혹선충, 뿌리썩이선충, 나선선충, 씨스터선충 등을 예시할 수 있고, 뿌리혹선충으로서, 당근뿌리혹선충, 고구마뿌리혹선충, 자바뿌리혹선충, 땅콩뿌리혹선충 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 살선충 조성물에서, 활성성분인 안트라퀴논 화합물의 함량은 살선충제의 제형, 살포 방법에 따라 적절하게 조절할 수 있으나, 0.01 내지 40중량%가 바람직하다. 활성 성분의 함량이 0.01 중량% 미만인 경우에는 살선충 효과가 미미하며, 40중량%면 충분한 살선충 효과를 얻을 수 있으므로, 더 이상 과량을 사용할 필요는 없다.
본 발명의 살선충 조성물은 상기 활성 성분 이외에 용도 및 목적에 따라 부형제를 혼합하여 살선충제 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 분말제, 과립제, 습윤성 분말, 유동성 제제, 유화 농축액, 마이크로캡슐, 오일성 제제, 에어로졸, 가열 훈증제, 혼탁제, 비가열 훈증제 등과 같은 다양한 제제의 형태를 갖도록 제조할 수 있다.
상기 부형제로는 액체 또는 고체 담체(희석제), 전착제, 유화제, 보습제, 분산제, 점착제, 붕해제 등과 같이 당해 분야에 널리 알려진 것을 사용할 수 있다. 상기 액체 담체의 예로는 톨루엔, 크실렌 등과 같은 방향족 탄화 수소, 부탄올, 옥탄올, 글리콜 등과 같은 알콜, 아세톤 등의 케톤, 디메틸포름아미드과 같은 아미드, 디메틸설폭사이드 등과 같은 설폭사이드, 메틸나프타렌, 시클로헥산온, 동물유, 식물유, 지방산, 지방산 에스테르, 등유, 경유 등의 석유 분획 또는 물을 들 수 있다.
상기 고체 담체의 예로는 점토, 카올린, 활석, 규조토, 실리카, 탄산 칼슘, 몬트로밀로나이트, 벤토나이트, 장석, 석영, 알루미나, 톱밥 등을 들 수 있다.
상기 전착제의 예로는 폴리옥시에틸렌 노닐 페니 에테르, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 등을 들 수 있고, 상기 유화제 또는 분산제의 예로는 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 예를 들어 고급 알콜 나트륨 설페이트, 스테아릴트리메틸암모늄 클로라이드, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 라우릴 베타인, 트리톤(Triton)-X-100 등의 트리톤계 등을 들 수 있다.
상기 보습제의 예로는 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르 디알킬설로석시네이트 등을 들 수 있고, 상기 점착제의 예로는 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐 알콜을 들 수 있고, 상기 붕해제로는 리그닌설폰산나트륨, 라우릴황산나트륨을 예시할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 살선충 활성 실험
실험에 사용된 공시선충은 Meloidogyne spp. (경상북도 성주군 참외농가의 감염된 뿌리로부터 난 부화)로써 (주)에코윈에서 토마토를 이용하여 증식시켜 실험에 사용하였다.
난 부화된 뿌리혹선충이 1 ml 당 100마리가 되게 희석하여 1.5 ml 튜브에 1 ml을 넣고 시료 농도별로 접종하였고, 시료와 뿌리혹선충을 혼합한 튜브는 실내 암실(23℃ ± 2℃)에 보관하면서 24시간 후 튜브를 흔들어 고루 섞이게 한 다음 실체 현미경에서 살아있는 선충의 수를 조사하였다. 선충의 생사 유무는 움직임이 없고, 일자 형태로 뻗어 있는 선충 중 핀으로 건드려 반응이 없는 것을 죽은 것으로 판정하였고, 대조구는 물을 이용하였다.
실시예 2: 포토랍두스 템페라타 템프라타 유래 안트라퀴논 화합물 분리
2-1: 포토랍두스 템페라타 템프라타의 용매분획
포토랍두스 템페라타 템프라타 ECOWIN_104 (KACC 91741P)를 ECOWIN-1 배지(증류수 1 L에 대하여 대두유 10 g, 난항분 2.5 g, 콜레스테롤 0.025 g, 레시틴 0.5 g, 전지분유 10 g, NaCl 5 g, 제1인산칼륨 2.5 g, 효소추출물 3 g)에서 배양한 다음, 균배양액(3 L)을 centrifugation (4000 rpm, 10 min)하여 부용(broth) 층과 균사체(mycelium cake) 층으로 분리하였다.
균사체(mycelium cake) 층을 극성과 비극성 용매 조건에 따라 분리하기 위해 water 600 ml에 현탁하여 헥산(hexane) 3 L를 이용하여 헥산(hexane) 층과 물(water) 층으로 나누고, 물(water) 층은 다시 디에틸에테르(diethyl ether) 3 L와 에틸아세테이트(ethyl acetate) 3 L로 각각 순차적으로 분획하여 추출하였다.
다음으로, 분리된 헥산 층, 디에틸에테르 층, 에틸아세테이트 층 및 물 층의 살선충 활성을 실시예 1의 방법으로 확인하고, 그 결과를 표 1 및 도 2에 나타내었다.
처리구 Mortality(%) 표준편차
H1 : Hexane 50ppm 69.32 8.04
H2 : Hexane 100ppm 80.00 7.07
H3 : Hexane 250ppm 97.62 3.37
Et1 : Diethylether 50ppm 68.46 5.31
Et2 : Diethylether 100ppm 70.57 3.04
Et3 : Diethylether 250ppm 80.36 7.58
EA1 : EtoAC 50ppm 54.17 1.18
EA2 : EtoAC 100ppm 66.78 3.94
EA3 : EtoAC 250ppm 69.71 10.20
W1 : Water 50ppm 54.41 6.24
W2 : Water 100ppm 59.38 30.94
W3 : Water 250ppm 66.93 3.73
CON: Control 7.39 3.01
표 1 및 도2에 나타난 바와 같이, 헥산(hexane) 층(50~250ppm)의 살선충 활성이 가장 우수한 것으로 나타났다.
2-2: 헥산 층으로부터 활성물질 탐색
포토랍두스 템페라타 템프라타 배양액의 헥산(hexane) 층으로부터 살선충 활성물질을 탐색하기 위하여 silica gel column chromatography를 실시하였다. 고정상으로 silica gel (silica gel, 70-230 mesh, Merck)을 사용하였고 이동상은 메탄올(methanol; MeOH)과 클로로포름 (chloroform; CHCl3)을 이용하여 CHCl3:MeOH = 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1의 비율로 step-wise gradient 방식으로 실시하였다.
다음으로, 용출된 분획물(A ~ E)의 살선충 활성을 실시예 1의 방법으로 실시하고, 그 결과를 표 2 및 도3에 나타내었다.
처리구 Mortality(%) 표준편차
A1 - 1:1 25ppm 55.17 29.26
A2 - 1:1 50ppm 63.45 2.19
A3 - 1:1 100ppm 66.80 18.03
A4 - 1:1 250ppm 76.32 6.11
B1 - 5:1 25ppm 67.92 7.66
B2 - 5:1 50ppm 68.50 4.95
B3 - 5:1 100ppm 73.50 17.27
B4 - 5:1 250ppm 85.48 2.09
C1 - 10:1 25ppm 56.74 12.89
C2 - 10:1 50ppm 57.98 7.57
C3 - 10:1 100ppm 58.33 11.79
C4 - 10:1 250ppm 60.14 5.86
D1 - 20:1 25ppm 50.66 3.22
D2 - 20:1 50ppm 53.14 0.28
D3 - 20:1 100ppm 56.83 0.44
D4 - 20:1 250ppm 67.20 5.99
E1 - 50:1 25ppm 53.33 18.86
E2 - 50:1 50ppm 60.00 14.14
E3 - 50:1 100ppm 69.05 3.37
E4 - 50:1 250ppm 79.02 20.83
CON - Control 8.19 10.17
표 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, CHCl3:MeOH = 5:1 분획물(B1~4) 및 CHCl3:MeOH = 50:1 분획물(E1~4)이 살선충 활성이 우수하였으며, 이중 수율이 보다 높은 CHCl3:MeOH = 50:1 분획물(E1~4)을 이후 실험에 사용하였다.
2-3: Silica-gel column chromatography 분획물로부터 활성물질 탐색
실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 얻은 분획물로부터 살선충 활성물질을 탐색하기 위하여 size exclusion gel인 sephadex LH-20 column chromatography (100% MeOH)을 실시하여 활성 분획물 (11~50 fraction)를 분리하였다.
2-4: Sephadex LH-20 column chromatography 분획물로부터 활성물질 탐색
Sephadex LH-20 column chromatography을 통해 얻은 분획물을 high performance liquid chromatography (HPLC)를 실시하여 최종적으로 살선충 활성을 갖는 물질을 분리하였다. 다음으로, HPLC 분획물(A, B, C)의 살선충 활성을 실시예 1의 방법으로 실시하고, 그 결과를 표 3 및 도 4에 나타내었다.
처리구 처리농도 Mortality(%) 표준편차
A 100ppm 33.85 0.74
B 100ppm 76.92 10.88
C 100ppm 54.17 5.89
D - DMSO 100ppm 6.25 0.00
CON - 무처리 - 2.94 4.16
표 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, HPLC 분획물중 B의 살선충 활성이 가장 우수하였으며, 분리한 물질이 단일물질인지 확인하기 위해 HPLC를 통해 확인한 결과, ODS column (φ4.6 mm × 250 mm)을 이용하여 70% MeOH로 전개하였을 때, 약 24분경에 활성물질의 peak (B)를 확인할 수 있었다. 이를 통해 분리된 물질이 단일물질임을 알 수 있었으며 이를 Eco-2이라 명명하였다.
실시예 3: 활성물질 동정
3-1: ESI-Mass spectrum 분자량 측정
Eco-2의 분자량과 분자식을 확인하기 위해 질량분석(ESI-Mass spectrum)을 positive mode에서 측정한 결과, 도 6에 도시된 바와 같이 [M+H]+가 m/z 285.2에서 관찰되었으며, 이를 통해 분자량이 284이고, 화학식이 C16H12O5임을 알 수 있었다.
3-2: 1 H-NMR 및 13 C-NMR 분석
Eco-2의 구조결정을 위해 1H-NMR spectrum 및 13C-NMR spectrum을 분석한 결과, 도 7 및 도 8에 에 도시된 바와 같이 Eco-2는 12개의 proton과 16개의 carbon이 존재함을 알 수 있었다. 1H-NMR spectrum(도 7)을 통해 6.79~7.75 ppm 사이에서 5개의 aromatic proton이 관찰되었고, 4.03 ppm과 3.9 8ppm에서 2개의 methoxy proton이 관찰되었다. 또한, 13C-NMR spectrum(도 8)을 통해 104.0~187.8 ppm 사이에 6개의 aromatic carbon과 56.0 ppm과 56.6 ppm에서 2개의 methoxy carbon이 관찰되어 1H-NMR과 개연성이 있다는 것을 알 수 있었다. 1H-NMR과 13C-NMR spectrum 분석을 통해 proton과 carbon의 chemical shift를 확인하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
Position dC (ppm) dH (ppm) Position dC (ppm) dH (ppm)
1 163.1 - 8 162.4 -
2 104.7 6.79 (d) 8a 116.8 -
3 165.5 - 9 187.8 -
4 104.0 7.48 (d) 9a 115.3 -
4a 137.7 - 10 182.8 -
5 118.8 7.75 (d) 10a 132.6 -
6 135.4 7.58 (t) 1-O-CH3 56.7 4.03 (s)
7 124.9 7.27 (d) 3-O-CH3 56.1 3.98 (s)
3-3: HMQC 및 HMBC spectrum 분석
Eco-2의 proton과 carbon의 연결고리를 확인하기 위하여 HMQC spectrum (도 9)을 측정한 결과, H-2 (dH 6.79)와 C-2 (dC 104.7), H-4 (dH 7.48)와 C-4 (dC 104.0), H-5 (dH 7.75)와 C-5 (dC 118.8), H-6 (dH 7.58)와 C-6 (dC 135.4), H-7 (dH 7.27)와 C-7 (dC 124.9)의 연결을 확인하였다. 또한 H1-H1 COSY spectrum(도 10)을 통해 H1-H1 간의 cross peak를 확인한 결과, 7.48 ppm (H-4)과 6.79 ppm (H-2), 7.58 ppm (H-6)과 7.27 ppm (H-7), 7.75 ppm (H-5)의 연결고리를 확인할 수 있었다(도 11).
마지막으로, proton으로부터 2, 3, 4 bond에 있는 carbon의 위치를 확인하기 위해 HMBC spectrum (도 12)을 측정한 결과, H-2 (dH 6.79)로부터 C-1 (dC 163.1), C-3 (dC 165.5), C-4 (dC 104.0), C-9a (dC 115.3), H-4 (dH 7.48)로부터 C-2 (dC 104.7), C-9a (dC 115.3), C-10 (dC 182.8), H-5 (dH 7.75)로부터 C-7 (dC 124.9), C-8a (ddC 116.8), C-10 (dC 182.8), H-6 (dH 7.58)로부터 C-8 (dC 162.4), C-10a (dC 132.6), H-7 (dH 7.27)로부터 C-5 (dC 118.8), C-8a (dC 116.8), 1-O-Me로부터 C-1 (dC 163.1), 3-O-Me로부터 C-3 (dC 165.5)으로의 long range coupling이 관찰되었고, 이는 2개의 methoxy group을 갖는 dimethoxyanthraquinone 구조임을 확인할 수 있었다(도 13).
3-4: 화학식 구조 동정
1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, 1H-1H COSY 및 HMBC spectrum의 분석을 통해서 구조를 assign해 본 결과, 최종 분리된 Eco-2의 화학구조는 1,3-dimethoxy-8-hydroxy-9,10-anthraquinone으로 동정되었다(도 14).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (3)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 포토랍두스 템페라타 템프라타 유래 1,3-디메톡시-8-히드록시-9,10-안트라퀴논(1,3-dimethoxy-8-hydroxy-9,10- anthraquinone)을 포함하는 뿌리혹선충 방제용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112019076832303-pat00015

  2. 제1항에 있어서, 상기 포토랍두스 템페라타 템프라타는 ECOWIN_104 (KACC 91741P)인 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충 방제용 조성물.
  3. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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