KR19980701244A - 포토랍두스로부터의 살충 단백질 독소(insecticidal protein toxins from photorhabdus) - Google Patents

포토랍두스로부터의 살충 단백질 독소(insecticidal protein toxins from photorhabdus)

Info

Publication number
KR19980701244A
KR19980701244A KR1019970704633A KR19970704633A KR19980701244A KR 19980701244 A KR19980701244 A KR 19980701244A KR 1019970704633 A KR1019970704633 A KR 1019970704633A KR 19970704633 A KR19970704633 A KR 19970704633A KR 19980701244 A KR19980701244 A KR 19980701244A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
protein
toxin
sequence
dna
Prior art date
Application number
KR1019970704633A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100354530B1 (ko
Inventor
제럴드 씨. 엔사인
데이빗 제이. 보웬
제임스 페텔
레이먼드 패틱
수 슈노버
리차드 에이취. 프렌치-콘스탄트
토마스 에이. 로쉐-로우
마이클 비. 블랙번
티모시 디. 헤이
도널드 제이. 멀로
그레고리 엘. 오르
진 엘. 로버츠
제임스 에이. 스트릭랜드
라이닝 구오
토드 에이. 사이체
Original Assignee
리차드 에이치. 리이저
위스콘신 앨럼나이 리써치 파운데이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리차드 에이치. 리이저, 위스콘신 앨럼나이 리써치 파운데이션 filed Critical 리차드 에이치. 리이저
Publication of KR19980701244A publication Critical patent/KR19980701244A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100354530B1 publication Critical patent/KR100354530B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/14—Plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G13/00—Protecting plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

포토랍두스(Photorhabdus) 속으로부터의 단백질은 노출시에 곤충에 유독하다. 포토랍두스 루미네센스(P.1uminescens)[이전에는 제노랍두스 루미네센스(Xenorhabdus luminescens)였음]는 포유동물의 임상 샘플에서 헤테로랍디티스(Heterorhabditis) 속의 곤충병원성 선충류의 박테리아 공생자로서 발견되었다. 이들 단백질 독소는 곤충 제어를 위해 곤충 유충의 먹이 및 식물에 적용되거나 또는 그 내부로 유전공학처리될 수 있다.

Description

포토랍두스로부터의 살충 단백질 독소
많은 곤충이 주택소유자, 소풍객, 정원사 및 농부, 및 종종 밭작물에 대한 곤충 피해의 결과로 파괴되거나 감소되는 농산물에 투자하는 다른 사람에게 광범위하게 해충으로 여겨진다. 특히, 재배철이 짧은 지역에서는, 상당한 곤충의 피해는 재배자에게 모든 이익의 손실을 의미하고 농작물 산출에서 극적인 감소를 의미할 수 있다. 특정 농산물의 공급이 부족하면, 반드시 식품 가공업자들이 더 높은 비용을 치르고, 따라서, 식품 식물 및 그러한 식물로부터 얻은 생산물의 궁극적인 소비자가 더 높은 비용을 치러야 한다.
농작물 및 화훼에 대한 곤충 피해를 방지하고 곤충 해충의 폐해를 제거하는 것은 전형적으로 광범위한 독성을 갖는 강한 유기 살해충제 및 살충제에 의존 해왔다. 이들 합성 제품은 환경과 그러한 약제에 노출되는 사람에게 너무 해로우므로 일반 대중에 의해 공격을 받게 되었다. 유사하게, 비경작 환경에서, 주택소유자는 그들의 가정 또는 실외 식사에서 곤충을 죽일 필요없이 곤충을 피하는 것에만 만족할 것이다.
화학 살충제의 광범위한 사용은 농부, 살총제를 생산하는 회사, 정부 기관, 공공 이익 단체 및 일반적인 대중에 대해 환경적 및 건강적 관심을 증가시켰다. 환경에 대한 사회적인 관심 및 곤충 관리의 메카니즘을 개발하는 생물학적 도구의 개발에 의해 덜 침해적인 곤충 관리 방법의 개발이 자극되었다. 생물학적 방제제가 화학 살충제에 대한 유망한 대체물을 제공한다.
각각의 진화 발전 단계에서 유기체는 그들의 자신의 성공 및 생존을 강화시키기 위한 수단을 발견하였다. 방어 및 공격의 도구로서의 생물학적 분자의 사용은 동물계 및 식물계 전체를 통하여 공지되어 있다. 또한, 유전 공학의 상대적으로 새로운 도구에 의해 생물학적 살충제를 변형하여 특정한 문제에 대한 특정한 해결을 성취할 수 있게 되었다.
그러한 약제 중 하나인 바실루스 터린기엔시스(Bt:Bacillus thuringiensis)는 유효한 살충제이고, 살충제로서 상업적으로 널리 사용된다. 실제로, Bt 박테리아의 살충제는 그러한 제한된 독성을 갖는 단백질이며, 추수일에도 사람의 식용 작물에 사용될 수 있다. 비표적의 유기체에 대해, Bt 독소는 소화가능한 비독성 단백질이다.
다른 공지된 종류의 생물학직 곤충 방제제는 살충 박테리아 공생자에 대해 전염의 벡터가 되는 것으로 공지된 선충류의 특정한 속이다. 살충 박테리아를 포함하는 선충류는 곤충의 유충을 공격한다. 이어서, 박테리아가 유충을 죽인다. 선충류는 유충의 시체에서 번식한다. 이어서, 선충류 후대는 내부로부터 시체를 먹는다.
이어서, 이렇게 생산된 박테리아 함유 선충류 후대는 부가의 유충을 공격한다. 과거에는, 스테인너네마(Steinemema)속 및 헤테로랍디티스(Heterorhabditis)속의 살충 선충류가 곤충 방제제로서 사용되었다. 명백하게, 이들 속의 선충류는 각각 특정 종의 박테리아를 숙주로 한다. 헤테로랍디티스 속의 선충류에서, 공생 박테리아는 포토랍두스 루미네센스이다.
이들 선총류가 곤충 방제제로서 유효하지만, 현재 곤충 방제용 선충류를 생산하고 유지하고 분포시키는 것은 어렵고, 고가이며 비효율적이다.
나비목 및 딱정벌레목 곤충의 유충에 주사되는 경우에만 활성을 갖는 포토랍두스 루미네센스로부터 살충제 독소를 단리할 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 이로인해, 선충류 및 그의 박테리아 공생자의 살충 특성을 효과적으로 개발할 수 없었다. 전달후에 그의 생물학적 특성을 보유할, 살충제 독소의 더 실용적이고, 덜 노동집약적인 광범위한 전달 방법이 유용할 것이다. 포토랍두스 속에 의해 생산된 경구 활성을 갖는 독소를 발견하는 것이 매우 요망되었다. 효능의 이유로 이들 독소의 단리 및 사용이 요망되었다. 본 출원인의 발명에 와서야, 이들 독소가 단리되고 특성화되었다.
발명의 요약
천연 독소는 포토랍두스 속의 성장하는 박테리아 세포에 의해 생산되고 분비되는 단백질 복합체이며, 관심있는 것은 포토랍두스 루미네센스 종에 의해 생산된 단백질이다. 약 1,000kDa의 분자 크기를 갖는 단백질 복합체를 SDS-PAGE 겔 분석에 의해 많은 성분 단백질로 분리할 수유기 독소는 헤몰리신, 리파제, 유형 C 포스포리파제 또는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다. 독소는 많은 곤충에 노출 투여시에 상당한 독성을 나타낸다.
본 발명은 쉽게 투여되는 살충 단백질 뿐만 아니라 이종계내에서의 독소의 발현을 제공한다. 본 발명은 또한 많은 목의 곤충에 대하여 작용 활성이고 유효한 살총제 독소를 전달하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 목적, 이점 및 특징은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 박테리아로부터 단리된 독소 및 독소의 살충제로서의 용도에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 독소를 위한 서열 유전자의 일부로서 사용된 한 쌍의 클론된 DNA 단리물의 도면이다.
도 2는 시퀀싱 방법에서 사용된 3개의 플라스미드의 지도이다.
도 3은 몇몇 부분 DNA 단편의 내부-관계롤 도시하는 지도이다.
도 4는 TcbAii 및 TcaBii 단백질들의 단백질 서열 사이의 상동성 분석의 도면이다.
도 5는 포토랍두스 균주의 페노그램(phenogram)이다. 포토랍두스 균주의 관계는 rep-PCR에 의해 정의된다. 도 5의 상부축은 rep-PCR 생성물의 스코어링(scoring)을 기준으로한 균주의 % 유사성을 측정한다(즉, 0.0 [유사성 없음] 내지 1.0[100% 유사성]). 오른쪽 축에서, 숫자 및 문자는 시험된 다양한 균주를 나타낸다:14=W-14, Hm=Hm, H9=H9, 7=WX-7, 1=WX-1, 2=WX-2, 88=HP88, NC-1=NC-1, 4=WX-4, 9=WX-9, 8=WX-8, 10=WX-10, WIR=WIR, 3=WX-3, 11=WX-11, 5=WX-5, 6=WX-6, 12=WX-12, 14=WX-14, 15=WX-15, Hb=Hb, B2=B2, 48 내지 52=ATCC 43948 내지 ATCC 43952. 수평선을 분리하는 수직선은 수평선의 염기에서 균주 또는 균주의 군 사이의 상관도(상부축과의 수직선의 외삽 교차점을 읽음)를 나타낸다(예를 들면, 균주 W-14는 균주 H9 및 Hm에 대해 약 60% 유사하다).
도 6은 W-14 균주의 게놈 지도의 도면이다.
본 발명은 곤충에 대해 경구 독성을 갖는 포토랍두스 속으로부터의 살충 단백질 독소의 독특한 종류의 발견에 관한 것이다. 포토랍두스의 독특한 특성은 그의 생물발광이다. 포토랍두스는 다양한 공급원으로부터 단리될 수 있다. 그러한 공급원 중 하나는 선충류, 더 특히 헤테로랍디티스 속의 선충류이다. 그러한 공급원 중 다른 하나는 상처로부터의 사람 임상 샘플이다(파머 등의 문헌[Farmer 등,1989, J.Clin,microbio1.27, pp 1594-16000]을 참조하시오). 이들 부패 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션[American Type Culture Collection(Rockville, MD)]에서 ATCC #43948,43949,43950,43951, 및 43952로서 기탁되어 있고, 본원에서 참고로 포함하였다. 다른 공급원이 살충제 독소를 생산하는 포토랍두스 박테리아를 포함할 수 있음이 가능하다. 환경내의 그러한 공급원은 육상 기제이거나 수 기제일 수 있다.
포토랍두스 속은 분류학적으로 엔데로박테리 아세(Enterobacteriaceae)과의 구성원으로서 정의지만, 이 과의 비전형적인 특정 특성을 갖는다. 예를 들면, 이 속의 균주는 질산염 환원 음성이고, 황색 및 적색 안료를 생산하며 생물발광성이다.
반면, 후자의 특성은 엔테로박테리아세 내에서는 공지되어 있지 않다. 포토랍두스 최근에 와서야 제노랍두스(Xenorhabdus)로부터 분리된 속으로서 설명되었다.(Boemare 등,1993,Int. J. Syst. Bacterio1.43,249-255). 이러한 구별은 DNA-DNA 하이브리드화 연구, 표현형의 차이(예를 들면, 카탈라제 및 생물발광의 존재(포토랍두스) 또는 부재(제노랍두스)), 및 선충류 숙주의 과(제노랍두스:스테이너네마티대(Steinemematidae), 포토랍두스:헤테로랍디티대(Heterofhabditidae))를 기준으로 한다. 세포질 지방산의 비교 분석(Janse 등,1990, Lett. App1.microbio1.10, 131-135:Suzuki 등,1990, J. Gen. App1.microbiol.,36,393-401)은 제노랍두스로부터 포토랍두스의 구별을 지지한다.
본원에 개시된 균주 컬렉션이 포토랍두스 균주로 이루어짐을 확정하기 위해, 균주를 포토랍두스를 정의하는 인식된 특성을 기준으로 특성화하고, 그를 다른 엔테로박테리아세 및 제노랍두스 종으로부터 구별하였다.(Farmer, 1984, Bergey's Manual of Systemic Bacteriology, Vo1.1, pp. 510-511;Akhurst 및 Boemere 1988, J.Gen.Microbiol.134, pp 1835-1845;Boemare 등, 1993, Int. J. Syst. Bacteriol. 43, pp 249-255, 본원에서 참고로 인용함). 연구된 특성은 하기와 같다:그람 염색 음성간균, 유기체 크기, 콜로니 색소형성, 봉입체, 카탈라제의 존재, 질산염 환원 능력, 생물발광, 염료 업테이크, 젤라틴 가수분해, 선택 배지 상의 성장, 성장 온도, 무기 조건하의 생존 및 운동성. 지방산 분석은 본원의 균주가 모두 하나의 포토랍두스 속에 속함을 확정하기 위해 사용되었다.
현재, 박테리아 포토랍두스 속은 하나의 정의된 종인 포트랍두스 루미네센스(ATCC 유형 균주 #29999, Poinar 등,1977, Nemato1ogica 23,97-102)로 이루어진다. 다양한 관련 균주가 문헌에 기재되어 있다(예를 들면, Akhurst 등, 1988, J.Gen.Microbio1., 134, 1835-1845;Boemare 등, 1993,Int. J. Syst. Bacteriol. 43 pp. 249-255;Putz 등,1990, Appl. Environ.Microbiol.,56,181-186). 본원에서 많은 포토랍두스 균주를 특성화하였다. 그러한 균주를 실시예에서 표 18에 나열하였다.
현재 포토랍두스 속에 한 종(루미네센스)만이 정의되었으므로, 본원에서 균주를 특성화하기 위해 루미네센스 종의 특성을 사용하였다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 이들 균주는 매우 다양하다. 미래에, 루미네센스 종의 일부 속성 뿐만 아니라, 포토랍두스 루미네센스의 특성으로 현재에는 정의되지 않은 일부 다른 특성을 갖는 다른 포토랍두스 종이 있을 수 있음을 예측할 수 있다. 그러나, 본원에서 본 발명의 범위는 다른 특성 및 특성화를 고려하지 않고, 곤충 방제제로서 작용 활성을 갖는 단백질을 생산하는 임의의 포토랍두스 종 또는 균주이다.
또한, 본원에서 증명된 바와 같이, 포토랍두스 속의 박테리아는 본원에서 정의된 작용 활성을 갖는 단백질을 생산한다. 포토랍두스 루미네센스 종에 의해 생산된 단백질에 특히 관심을 둔다. 본 발명은 본원에 개시된 균주로 제한되지 않아야 한다. 이들 균주는 처음으로 포토랍두스의 다양한 단리물에 의해 생산된 단백질이 곤충에 노출시에 유독함을 설명한다. 따라서, 본원에 열거된 균주 및 그의 임의의 뮤턴트 뿐만 아니라, 본원에 설명된 작용 활성을 갖는 포토랍두스 속의 임의의 균주 또는 종이 본원에서 설명된 본 발명에 포함된다.
본원에서 사용된 몇몇 용어는 하기와 같은 특정한 의미를 갖는다:
작용 활성은 본원에서 단백질 독소가 단백질이 경구적으로 활성인 곤충 방제제로서 작용하거나, 독성 효과를 갖거나, 음식 섭취를 방해하거나 중단시킬 수 있어, 곤충의 죽음을 유발시킬 수 있거나 유발시킬 수 없는 것을 의미한다. 곤충이 유전자전환 식물의 발현, 제형화된 단백질 조성물(들), 분무가능한 단백질 조성물(들), 미끼 매트릭스 또는 다른 전달계에 의해 전달된 독소의 유효량에 접촉하는 경우, 전형적으로 곤충의 죽음을 야기하거나, 곤충이 곤충에 대해 독소를 이용가능하게 하는 공급원을 섭취하지 못하게 한다.
용어 포토랍두스 독소는 곤충에 대해 작용 활성을 갖는 포토랍두스 미생물 균주에 의해 생산된 임의의 단백질을 의미하며, 포토랍두스 독소는 분무가능한 조성물로 제형화되거나, 유전자전환 식물에 의해 발현되거나, 미끼 매트릭스로서 제형화되거나, 바쿨로바이러스를 통해 전달되거나, 임의의 다른 이용가능한 숙주 또는 전달계에 의해 전달될 수 있다.
본원에서 논의된 단백질 독소는 전형적으로 살충제로서 지칭된다. 살충제는 본원에서 단백질 독소가 본원에서 더욱 설명될 바와 같은 작용 활성을 갖고 곤충 방제제로서 사용되는 것을 의미한다.
용어 올리고뉴클레오티드의 사용은 RNA 또는 DNA의 뉴클레오티드의 짧은 사슬로 이루어진 거대분자를 의미한다. 그러한 길이는 적어도 하나의 뉴클레오티드일 수 있지만, 전형적으로 약 10 내지 약 12개의 뉴클레오티드의 범위내에 있다. 올리고뉴클레오티드의 길이의 측정은 숙련인의 기술 범위내에 잘 알려져 있고, 본원에서 제한되지 않는다. 따라서, 을리고뉴클레오티드는 10개 미만이거나 12개 이상일 수 있다.
본원에서 용어 유독 또는 독성의 사용은 포토랍두스에 의해 생산된 독소가 본원에서 정의된 바와 같은 작용 활성을 갖는 것을 의미한다.
본원에서 용어 유전 물질의 사용은 모든 유전자, 핵산, DNA 및 RNA를 포함하는 것을 의미한다.
표 18에 기록된 선택된 균주로부터의 발효 브로쓰는 포토랍두스 종에 의한 살충제 독소 생산의 폭 및 이들 독소의 살충 스펙트럼을 측정하기 위해, 및 독소 복합체를 정제하기 위한 공급원 물질을 제공하기 위해 사용되었다. 본원에서 특성화된 균주는 다양한 곤충 목에 대해 경구 독성을 갖는 것으로 나타났다. 그러한 곤충목은 딱정벌레목(Coleoptera), 동시목(Homoptera), 나비목(Lepidoptera), 파리목(Diptera), 응애목(Acarhn), 벌목(Hymenoptera) 및 방시목(Dictyoptera)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
다른 박테리아 독소에서와 같이, 군집내에서의 박테리아의 돌연변이율로 인해, 서열에서 약간 상이한 많은 관련 독소가 존재한다. 본원에서 관심있는 독소는 본원에서 설명된 바와 같이 노출시에 다양한 곤충에 유독한 단백질 복합체를 생산하는 것이다. 바람직하게는, 독소는 나비목, 딱정벌레목, 동시목, 파리목, 벌목, 방시목 및 응애목에 대해 활성이다. 본 발명은 본원의 균주 및 그의 임의의 유도체 균주에 의해 생산된 단백질 독소에 상동성인 단백질 독소 뿐만 아니라, 포토랍두스에의해 생산된 임의의 단백질 독소를 포함하도록 의도된다. 이들 상동성 단백질은 서열에서는 다를 수 있지만, 작용에서는 본원에서 설명된 독소와 다르지 않다. 상동성 독소는 300kDa 내지 2,000kDa의 단백질 복합체를 포함하는 것을 의미하고, 적어도 2개의(2) 서브유닛으로 이루어지며, 서브유닛은 다른 서브유닛과 동일하거나동일하지 않은 펩티드이다. 다양한 단백질 서브유닛이 동정되었고, 본원에서 실시예에 교시되어 있다. 전형적으로, 단백질 서브유닛은 약 18kDa 내지 약 230kDa;약 160kDa 내지 약 230kDa; 약 100kDa 내지 약 160kDa; 약 80kDa 내지 약100kDa;및 약 50kDa 내지 약 80kDa이다.
전술된 바와 같이, 일부 포토랍두스 균주가 선충류로부터 단리될 수 있다. 일부 선충류, 즉, 선충문(Nematoda)의 긴 원통형 기생총은 유리한 성장 환경으로서 곤충 유충을 이용하는 능력을 진화시켰다. 곤충 유충은 선충류를 성장시키는 먹이원 및 번식하기 위한 환경을 제공한다. 특정한 선총류가 유충을 침입함에 따른 한극적인 효과가 유충의 죽음이다. 유충의 죽음은 특정한 선충류내의, 유충 성장을정지시키고 먹이섭취 활동을 억제하는 살충제 독소를 생산하는 박테리아의 존재에 의한 것이다.
흥미롭게, 곤충 기생 선충류의 각각의 속은 선충류와의 공생적 성장을 위해 독특하게 적응된 특정한 종의 박테리아를 숙주로 하는 것으로 나타난다. 이러한 연구가 시작된 사이에, 박테리아 제노랍두스 속의 명칭이 제노랍두스 및 포토랍두스로 재분류되었다. 포토랍두스 속의 박테리아는 헤테로랍디투스 선충류의 공생자로서 특성화되며, 제노랍두스 종은 스테인너네마 종의 공생자이다. 명칭에서의 이러한 변경을 본 명세서에서 반영하지만, 명칭에서의 변경이 어떠한 방식으로도 본원에 설명된 발명의 범위를 변화시키지 않아야 한다.
본원에 개시된 펩티드 및 유전자는 문헌[the Jounnl of Bacteriology Instructions to Authors p. i-xii(Jan. 1996)]에서 최근에 공개된 지침에 따라 명명된다. 하기 팹티드 및 유전자는 포토랍두스 균주 W-14로부터 단리되었다.
[표 1]
펩티드/유전자 명칭
상기 나열된 서열은 게놈 영역에 의해 분류된다. tcbA 유전자는 실시예에 설명된 바와 같이 두 개의 단백질 단편 TcbA 및 TcbAiii로서 이.콜리(E. coli)에서 발현된다. 상업적인 형질전환 적용을 위해 더 높은 활성의 독소를 얻기 위해 일부 서열의 단백분해적 절단(clippage)을 갖는 것이 유리할 수 있다.
본원에 설명된 독소는 독소가 작용 활성을 갖는 점에서 매우 독특하며, 이는 곤충 관리 방법을 개발하기 위한 핵심이다. 곤충 관리 방법을 개발하는데 있어서, 단백질을 소화관을 피하여 유기체에 직접 주사함으로써 단백질 분해 과정을 지연시키거나 회피할 수 있다. 그러한 경우, 유기체에 투여된 단백질은 변성되거나, 비특이적으로 분해되거나, 고등 유기체에서 면역계에 의해 제거되기 전까지 그의 기능을 보유할 것이다. 살충제 독소를 곤충에 주사하는 것은 단지 실험실에서 및 따라서, 쉽게 주사되는 큰 곤충에 대해서만 가능한 적용이다. 본원에 설명된 살충 단백질 독소가 경구 섭취 또는 독소과의 접촉 후에 그들의 유독 활성을 나타낸다는 관찰은 단백질 독소를 곤충의 먹이내로 혼입시키는 능력에만 전적으로 기초된 곤충 관리 계획의 개발을 허용한다. 그러한 계획은 곤충 미끼의 생산을 이끌 수 있다.
포토랍두스 독소는 정제된 형태로 곤충에 투여될 수 있다. 독소는 또한 약 1 내지 약 100mg/ℓ 브로쓰의 양으로 전달될 수 있다. 이는 제제 상태, 접종 공급원의 상태, 독소의 단리 기술 등에 의존하여 변할 수 있다. 독소는 이종 원핵세포 또는 진핵세포 숙주에서 원래 발현된 삼출 분비물 또는 세포내 단백질로서 투여될 수 있다. 박테리아는 전형적으로 단백질이 발현되는 숙주이다. 진핵세포 숙주는 식물, 곤충 및 효모를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 대안적으로, 독소는 박테리아 또는 들판의 유전자전환 식물에서 또는 바쿨로바이러스 벡터에 의해 곤충내에서 생산될 수 있다. 전형적으로, 독소는 하나 이상의 독소를 곤충의 먹이에 혼입시킴으로써 곤충에 도입될 것이다.
완전 치사량이 곤충에 섭취시키기 위해 유용하지만, 유용한 독성을 성취하기 위해서 요구되지는 않는다. 곤충이 독소를 회피하거나 먹이 섭취를 중단하면, 일부 적용에서는 효과가 거의 치사량에 가깝더라도, 그러한 회피가 유용할 것이다. 예를들면, 내충 유전자전환 작물 식물이 요망되는 경우, 궁극적인 목적은 곤충을 죽이는 것보다 식물의 보흐에 있으므로, 식물을 섭취하는 것에 대한 곤충의 거리낌이 곤충에 대한 치명적인 독성만큼 유용하다.
독소를 곤충의 먹이에 혼입할 수 있는 다른 많은 방법이 있다. 예로서, 본원에 개시된 바와 같이 단백질 용액을 먹이에 분무함으로써, 유충 먹이원을 독성 단백질로 혼합시킬 수 있다. 대안적으로, 정제된 단백질을 다른 무해한 박테리아내로 유전 공학적으로 처리한 다음, 배양물에서 성장시키고, 먹이원에 적용하거나 곤충 박멸이 요구되는 지역내 토양에 잔류시킬 수 있다. 또한, 단백질을 직접 곤충 먹이원내로 유전공학 처리할 수 있다. 예를 들면, 많은 곤충 유충의 주요 먹이원은 식물이다.
포토랍두스 독소의 살충 특성을 암호화하는 유전 물질을 특정 곤충 해충의 먹이가 되는 식물의 게놈내로 혼입시킴으로써, 성충 또는 유충이 먹이 식물을 소비한 후에 죽을 수 있다. 많은 수의 단자엽식물속 및 쌍자엽식물속이 형질전환되었다. 유전자전환 농작물 뿐만 아니라 열매 및 채소가 상업적으로 관심있다. 그러한 농작물은 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 해바라기, 알팔파, 사탕수수, 밀, 면, 땅콩, 토마토, 감자 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 외인성 유전 물질을 식물 세포내
에 도입시키기 위한 및 도입된 유전자를 안정하게 유지하고 발현하는 식물을 얻기 위한 몇몇 기술이 존재한다. 그러한 기술은 미립자에 피복된 유전 물질의 세포내로의 직접적인 도입 촉진을 포함한다(미국 특허 4,945,050(Cornell), 및 미국 특허 5,141,131(DowElanco)). 식물은 아그로박테리움 기술을 사용하여 형질전환될 수 있다[미국 특허 5,177,010(University of Toledo), 미국 특허 5,104,310(Texas AM), 유럽 특허 출원 0131624B1, 유럽 특허 출원 120516, 159418B1 및 176,112(Schilperoot), 미국 특허 5,149,745, 5,469,976, 5,646,763, 4,940,838, 및 4,693,976 (Schilperoot), 유럽 특허 출원 116718, 290799 및 320500 (모두MaxPlanck), 유럽 특허 출원 604662 및 627752(Japan Tobacco), 유럽 특허 출원 0267159 및 0292435, 및 미국 특허 5,231,019(모두 Ciba Geigy), 미국 특허 5,463,174 및 4,762,785(모두 Calgene), 및 미국 특허 5,004,863 및 5,159,135(모두 Agracetus)를 참조하시오. 다른 형질전환 기술은 휘스커스(whiskers) 기술을 포함한다[미국특허 5,302,523 및 5,464,765(모두 Zeneca)를 참조하시오]. 전기천공 기술이 또한 식물을 형질전환시키기 위해 사용되고 있다[국제 출원 공개 87/06614 (Boyce Thompson Institute), 미국 특허 5,472,869 및 5,384,253(모두 Dekalb), 국제 출원 공개 92/09696 및 93/21335(모두 PGS)를 참조하시오]. 이들 형질전환 특허 및 공개를 모두 본원에서 참고로 인용하였다. 식물울 형질전환시키기 위한 많은 기술에 덧붙여, 외인성 유전자와 접촉되는 조직 유형이 또한 다양할 수 있다. 그러한 조직은 배아 조직, 칼루스 조직 유형 I 및 II, 배축조직(hypocotyl), 분열조직 등을 포함할 것이지만 이에 한정되지는 않는다. 숙련인의 기술내의 적절한 기술을 사용하여 거의 모든 식물 조직이 탈분화 중에 형질전환될 수 있다.
다른 변수는 선택가능한 마커의 선택이다. 특정 마커에 대한 선호는 숙련인의 재량이지만, 임의의 하기 선택가능한 마커가 선택가능한 마커로서 작용할 수 있는 본원에 나열되지 않은 임의의 다른 유전자와 함께 사용될 수 있다. 그러한 선택가능한 마커는 항생제 카나마이신, 네오마이신 및 G418에 내성을 암호화하는 트랜스포존 Tn5의 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자(Aph II) 뿐만 아니라, 술포닐우레아 및 트리아졸로피리미딘 제초제(예를 들면, 클로로술푸론;브로목시닐, 달라폰 등)에 대한 내성 또는 내구성을 암호화하는 유전자를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
선택가능한 마커 외에, 리포터(repoIter) 유전자의 사용이 요구될 수 있다. 몇몇 경우, 선택가능한 마커없이 리포터 유전자를 사용할 수 있다. 리포터 유전자는 전형적으로 수용 유기체 또는 조직에 존재하거나 발현되지 않는 유전자이다. 리포터 유전자는 전형적으로 일부 표현형의 변화 또는 효소 특성을 제공하는 단백질을 암호화한다. 그러한 유전자의 예는 본원에 참고로 인용한 문헌[K. Weising 등, Ann. Rev. Genetics, 22, 421(1988)]에서 제공된다. 바람직한 리포터 유전자는 글루쿠로니다제(GUS) 유전자이다.
형질전환 기술에 상관없이, 유전자는 바람직하게는 벡터 식물 프로모터에 포함시킴으로써 식물 세포내에서 포토랍두스 독소를 발현시키기 위해 개조된 유전자전달 벡터내로 도입된다. 식물 프로모터 외에, 다양한 공급원으로부터의 프로모터가 외인성 유전자를 발현시키기 위해 식물 세포에서 효율적으로 사용될 수 있다.
예를 들면, 박테리아 기원의 프로모터(예를 들면, 옥토핀 신테이즈 프로모터, 노팔린신데이즈 프로모터, 만노핀 신테이즈 프로모터), 바이러스 기원의 프로모터(콜리플라워 모자이크 바이러스(35S 및 19S)) 등이 사용될 수 있다. 식물 프로모터는 리불로스-1,6-비스포스페이트(RUBP) 카르복실라제의 작은 서브유닛(ssu), 베타-콘글리시닌 프로모터, 파제올린 프로모터, ADH 프로모터, 열 속 프로모터 및 조직 특이성 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 프로모터는 또한 전사 효능을 개선시킬 수 있는 특정 인헨서 서열 요소를 포함할 수 있다. 전형적인 인헨서는 Adh-인트론 1 및 Adh-인트론 6을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 구성 프로
모터가 사용될 수 있다. 구성 프로모터는 모든 세포 유형에서 모든 시기에 연속적인 유전자 발현을 일으킨다(예를 들면, 액틴, 유비퀴틴, CaMV 35S). 조직 특이성 프로모터는 잎 또는 종자와 같은 특이 세포 또는 조직 유형에서 유전자 발현을 일으키고(예를 들면, 제인, 올레오신, 나핀, ACP), 이들 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 프로모터는 또한 식물 발육의 특정 단계 동안 활성이며 또한 석물 조직 및 기관에서 활성일 수 있다. 그러한 프로모터의 에는 화분 특이성, 배 특이성, 옥수수수염 특이성, 면 섬유 특이성, 뿌리 특이성, 종자 배유 특이성 프로모터 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
특정 환경 하에, 유도가능한 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 유도가능한 프로모터는 특이 신호에 대해 반응하는 유전자의 발현(예를 들면, 물리적 자극(열 쇽 유전자);광(RUBP 카르복실라제);호르몬(Em);대사물질;및 스트레스)을 일으킨다. 식물에서 작용하는 다른 바람직한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다. 많은 식물-특이성 유전자 전달 벡터가 당업계에 공지되어 있다.
그 외에, 식물 내에서 박테리아 유전자의 높은 발현을 수득하기 위해, 박테리아 유전자를 재공학처리하여 식물의 세포질내에서 더 효율적으로 발현할 수 있도록 하는 것이 바람직한 것으로 공지되어 있다. 옥수수가 식물내 독소의 발현 수준을 증가시키기 위해 형질전환에 앞서 박테리아 유전자(들)을 재공학처리하는 것이 바람직한 그러한 식물 중 하나이다. 재공학처리하는 한 가지 이유는 천연 박테리아 유전자(들)의 매우 낮은 G+C 함량(및 결과적으로 높은 A+T 함량으로의 편향) 때문이다. 이는 A+T가 매우 풍부한 것으로 공지된 식물 유전자 대조 서열을 의태하거나 복제하는 서열을 생산시킨다. 식물내로 도입된 유전자(들)의 DNA 내의 일부 A+T 풍부 서열의 존재(예를 들면, 유전자 프로모터에서 보통 발견되는 TATA 박스 영역)는 유전자(들)의 이상 전사를 일으킬 수 있다. 반면, 전사된 mRNA내에 존재하 다른 조절 서열의 존재(예를 들면, 폴리아데닐화 신호 서열(AAUAAA), 또는 예비-mRNA 스플라이싱에 관여하는 작은 핵 RNA에 상보적인 서열)는 RNA 불안정성을 이끌 수 있다. 따라서, 더 바람직하게 식물 최적화된 유전자(들)로 지칭되는, 재공학처리된 박테리아 유전자(들)의 디자인에서 한 목적은 더 높은 G+C 함량을 갖는 DNA 서열을 생산하는 것이며, 바람직하게는 대사성 효소를 코딩하는 식물 유전자의 것에 근접하는 것을 생산하는 것이다. 식물 최적화된 유전자(들)의 디자인에서 다른 목적은 더 높은 G+C 함량을 가질 뿐만 아니라, 서열 변화를 변경시킴으로써 번역이 저해되지 않도록 제조되어야 하는 DNA 서열을 생산하는 것이다.
높은 G+C 함량을 갖는 식물의 예는 옥수수이다. 하기 표 1은 옥수수내에서 G+C 함량의 높은 정도를 설명한다. 옥수수에서와 같이, 다른 식물내 G+C 함량이 또한 높을 것으로 생각된다.
표 1의 데이터에서, 유전자들의 코딩 영역은 겐뱅크(GenBank)(발매 71) 등록으로부터 발췌하고, 기초 조성물은 맥벡터(MacVectorTM) 프로그램(IBI, New Haven, CT)를 사용하여 계산하였다. 인트론 서열은 계산에서 무시된다. I군 및 II군 저장 단백질 유전자 서열은 기초 조성물에서 그들의 두드러진 차이에 의해 구별된다.
유전자 코드의 여분에 의해 제공되는 유연성으로 인해(즉, 몇몇 아미노산이 하나 이상의 코돈에 의해 지정됨), 상이한 유기체 또는 종류 또는 유기체의 진화는 여분의 코돈의 상이한 사용을 일으킨다. 이 코돈 바이어스은 단백질 코딩 영역의 평균 기초 조성물에서 반영된다. 예를 들면, 상대적으로 낮은 G+C 함량을 갖는 유기체는 여분의 코돈의 제 3 위치에서 A 또는 T를 갖는 코돈을 이용하는 반면, 더높은 G+C 함량을 갖는 유기체는 제 3 위치에서 G 또는 C를 갖는 코돈을 이용한다. 유전자의mRNA내에 마이너(minor) 코돈의 존재는 특히 마이너 코돈에 상응하는 하전된 tRNA의 상대적인 풍부성이 낮은 경우,mRNA의 완전한 번역율을 감소시킬 수 있는 것으로 생각된다. 이를 확장하면, 개별적인 마이너 코돈에 의한 번역율의 감소가 다중 마이너 코돈에 대해 적어도 부가적일 것이다. 따라서, 상대적으로 높은 함량의 마이너 코돈을 갖는mRNA는 상응하게 낮은 번역율을 가질 것이다. 이러한 번역율은 암호화된 단백질의 낮은 수준의 합성에 의해 반영될 것이다.
박테리아 유전자(들)을 재공학처리하기 위해, 식물의 코돈 바이어스를 측정한다. 코돈 바이어스는 식물이 그의 단백질을 암호화하기 위해 사용하는 통계적인 코돈 분포이다. 바이어스를 측정한 후, 관심있는 유전자(들) 내의 코돈의 빈도%를 측정한다. 식물에 의해 선호되는 제 1 코돈은 바람직한 코돈의 제 2 및 제 3의 선택과 함께 측정되어야 한다. 관심있는 단백질의 아미노산 서열은 역번역되어 생성된 핵산 서열이 천연 박테리아 유전자에서와 동일한 단백질을 암호화하지만, 생성된 핵산 서열이 원하는 식물의 바람직한 제 1 코돈에 상응하도록 한다. 새로운 서열을 변경에 의해 생성될 수 있는 제한 효소 자리에 대해 분석한다. 동정된 자리는 코돈을 제 2 또는 제 3 선택의 바람직한 코돈으로 교체함으로써 추가로 변경된다. 관심있는 유전자의 전사 또는 번역에 영향을 끼칠 수 있는 서열내의 다른 자리는 엑손:인트론 5' 또는 3' 결합, 플리 A 첨가 신호, 또는 RNA 폴리머라제 종결 신호이다. 서열은 추가로 분석되고 TA 또는 GC 더블렛(doublet)의 빈도를 감소시키기 위해 변경된다. 더블렛 외에, 약 4개 이상의 동일한 잔기를 갖는 G 또는 C 서열 블록이 서열의 전사에 영향을 끼칠 수 있다. 따라서, 이들 블록은 또한 제 1 또는 제 2 선택 등의 코돈을 다음 바람직한 선택의 코돈으로 교체함으로써 변경된다. 식물 최적화된 유전자(들)가 약 63%의 제 1 선택 코돈, 약 22% 내지 약 37%의 제 2 선택 코돈, 및 15% 내지 0%의 제 3 선택 코돈을 포함하는 것이 바람직하며, 총 %는 100%이다. 가장 바람직한 식물 최적화된 유전자(들)는 약 63%의 제 1 선택 코돈, 적어도 약 22%의 제 2 선택 코돈, 약 7.5%의 제 3 선택 코돈 및 약 7.5%의 제 4 선택코돈을 포함하며, 총 %는 l00%이다. 전술된 방법으로 당업계의 숙련인은 특정 식물에 의인성인 유전자(들)을 변경하여 유전자가 식물내에서 최적으로 발현되도록 할 수 있다. 방법은 본원에 참고로 인용한 1995년 10월 13일자로 출원된 계류중인 임시 출원 미국 특허 60/005,405호에서 추가로 설명된다.
따라서, 식물 최적화된 유전자(들)를 디자인하기 위해, 형질전환된 특정 식물을 위한 유전자 DNA 서열에 대해 수집뒨 코돈 바이어스 표로부터 확정된 비여분의 유전자 코드를 사용하여, 독소의 아미노산 서열을 DNA 서열로 역번역시킨다. 코돈사용에서 완전하게 상동성인, 생성된 DNA 서열은 더 높은 정도의 코돈 다양성 외에 또한 전략적으로 배치된 제한 효소 인식 자리 및 바람직한 염기 조성물을 갖고, 유전자의 전사 또는 생성물 mRNA의 번역을 방해할 수 있는 서열이 결여된 DNA서열을 확정하기 위해 추가로 변경된다.
박테리아 유전자가 색소체(plastid)내에서 발현되는 경우, 식물내에서 박테리아 유전자가 더 쉽게 발현될 수 있음이 이론화된다. 따라서, 식물 발현을 위해 유전자를 최적화시키지 않고, 식물내에서 박테리아 유전자를 발현시키고, 단백질의 높은 발현을 수득할 수 있다. 본원에서 참고로 인용한 미국 특허 제 4,762,785호, 제5,451,513호 및 제 5,545,817호를 참조하시오.
유전자전환 식물을 상업적으로 이용하는데 관한 문제점 중 하나는 내성 관리이다. 이는 특히 바실루스 터린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 독소에 있어서 그러하다. 많은 회사가 바실루스 터린기엔시스를 상업적으로 이용하며, Bt 독소가 내성이 되는 것에 대하여 많은 관심을 두고 있다. 곤충 내성 관리의 한 방법은 포토랍두스에 의해 생산된 독소를 Bt와 같은 독소, 식물 곤충 단백질(Ciba Geigy) 또는 다른 독소와 결합시키는 것이다. 결합물은 분무가능한 적용을 위해 제형화될 수 있거나, 분자 결합물이 될 수 있다. 식물은 곤충 독소를 생성하는 포토랍두스 유전자, 및 Bt와 같은 다른 곤충 독소 유전자로 형질전환될 수 있다.
유럽 특허 출원 0400246A1에서는 임의의 2개의 유전자일 수 있는, 식물내 2개의 Bt의 형질전환을 설명하였다. 하나 이상의 곤충 내성 유전자를 포함하는 유전자 전환 식물을 생산하기 위한 다른 방법은 각각의 식물이 곤충 내성 유전자를 포함하는 2개의 식물을 생산하는 것이다. 이들 식물은 하나 이상의 곤충 내성 유전자를 포함하는 식물을 생산하기 위해 전통적인 식물 교배 기술을 사용하여 역교배 될 수 있다.
식물 최적화된 유전자(들)를 포함하는 유전자전환 식물을 생산하는 것 외에, 박테리아 유전자(들)를 재공학처리하는 것이 요망될 수 있는 다른 전달계가 존재한다. 동일한 라인을 따라, 먹이원으로서 곤충을 유인하는 분자 및 독소의 살충 활성을 함꼐 융합시키는, 유전 공학처리되고 쉽게 단리된 단백질 독소를 표준의 잘 공지된 기술을 사용하여 박테리아 또는 진핵세포내에 공학처리되고 발현될 수 있다. 실험실에서의 정제 후에, 조립된(built-in) 미끼를 갖는 그러한 독성 약제를 표준 곤충 덫 하우징내에 포장할 수 있다.
다른 전달계는 바쿨로바이러스 벡터내로의 독소의 유전 물질의 혼입이다. 바쿨로바이러스는 바람직하게 포토랍두스 독소로 표적화되는 것을 포함하는 특정한 곤충 숙주를 감염시킨다. 포토랍두스 독소를 위한 발현 구조물을 포함하는 감염성 바쿨로바이러스를 곤충 만연 지역으로 도입하여, 감염된 곤충을 유독화시키거나 중독시킬 수 있다.
살충 특성의 전달에는 벡터가 거주할 숙주에 적합한 단백질 발현 벡터내로 통합된 포토랍두스 독소를 위한 코딩 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 필요로한다. 살충 특성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 수득하기 위한 한 방법은 독소의 아미노산 서열(이의 대부분이 하기에 설명됨)로부터 추정된 정보를 이용하여 포토랍두스로부터 독소를 생산하는 천연 유전 물질을 단리하는 것이다. 후술될 바와 같이, 독소 활성에 관여하는 단백질의 정제 방법을 또한 개시한다.
후기된 바와 같은 N-말단 아미노산 서열 데이터를 사용하여, 독소의 제 1 아미노산을 암호화하는 DNA 염기의 전부 또는 일부에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제작할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 방사성 표지화될 수 있고, 포토랍두 22스의 균주로부터 단리된 유전 물질로부터 제작된 케놈 유전자 라이브러리로부터 유전 물질을 단리하기 위해 분자 프로브로서 사용될 수 있다. 유전자 라이브러리는 플라스미드, 코스미드, 파지 또는 파지미드 벡터내에 클로닝될 수 있다. 라이브러리는 에스케리치아 콜리(Eschehchia coli)내로 형질전환될 수 있고, 독소에 대해 발생한 항체를 사용하여 형질전환된 세포에 의한 독소 생산에 대해 스크리닝되거나, 곤충 독성이 대해 직접 분석될 수 있다.
축퇴 유전 코드가 수개의 3-뉴클레오티드 조합의 임의의 것에 의해 아미노산이 DNA내에서 암호화될 수 있도록 하므로, 이러한 연구는 한벌의 올리고뉴클레오티드의 생산을 필요로 한다. 예를 들면, 아미노산 아르기닌은 핵산 트리플렛 CGA, CGC, CGG, CGT, AGA 및 AGG에 의해 암호화될 수 있다. 독소 유전자내에서 그러한 위치에서 어떠한 트리플렛이 사용되는지를 예측할 수 없으므로, 제시된 각각의 가능한 트리플렛을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제조하여야 한다. 단백질 서브유닛에 상응하는 하나 이상의 DNA 분자가 경구 독성을 성취하기 위해 필수적인 단백질 서브유닛의 전부를 회수하기 위한 총분한 수의 올리고뉴클레오티드 프로브를 제작하기 위해 필수적일 수 있다.
분자 생물학 분야의 숙련인에게 잘 공지된 몇몇 기술중 임의의 것을 사용하여 정제된 단백질의 아미노산 서열로부터, 독소의 생산을 책임지는 유전 물질을 쉽게 분리하여, 전체 또는 일부를 발현 벡터내로 클로닝시킬 수 있다. 전형적인 발현벡터는 DNA 플라스미드이지만, 코스미드, 파지미드 및 파지를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 전달 수단도 또한 계획될 수 있다. 플라스미드 복제를 위해 필요하거나 요구되는 특징, 예를 들면, 복제 기원 및 항생제 내성 또는 선택가능한 마커의 다른 형태, 예를 들면, 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 또는 비리도크로모겐스(viridochromogene)의 bar 유전자 외에, 단백질 발현 벡터는 일반적으로 관심있는 유전자의 전사 및 번역에 필요한 시스-작용서열을 혼입하는 발현 카셋트를 부가적으로 필요로한다. 원핵세포내의 발현을 위해 요구되는 시스-작용 서열은 진핵세포 및 식물에서 요구되는 것과 상이하다.
진핵세포 발현 카셋트는 관심있는 유전자에 대한 업스트림(5')의 전사 프로모터, 폴리-A 첨가 자리와 같은 전사 종결 영역 및 관심있는 유전자의 제 1 코돈의 업스트림의 리보솜 결합 자리를 필요로한다. 박테리아 세포에서, 벡터내로 포함될 수 있는 유용한 전사 프로모터는 T7 RNA 폴리머라제-결합 프로모터이다. 본원에서 전술된 바와 같은 프로모터는mRNA의 전사를 유효하게 진행시키는 것으로 공지되어 있다. 또한, 관심있는 유전자의 업스트림에서, 벡터는 단백질을 세포 표면과 같은 숙주 세포의 특정 부분에 공유적으로 결합시키는 것으로 공지된 신호 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
곤충 바이러스 또는 바쿨로바이러스는 특정한 곤충을 감염시켜 부작용을 끼치는 것으로 공지되어 있다. 곤충에 대한 바이러스의 영향은 느리며, 바이러스는 곤충의 먹이섭취를 중단시키지 않는다. 따라서, 바이러스는 곤충 해총 방제제로서 유용한 것으로 보이지 않는다. 포토랍두스 독소 유전자를 바쿨로바이러스 벡터내로 결합시키면, 바이러스의 치사율을 증가시키면서 독소의 전달의 유효한 방법을 제공할 수 있다. 그외에, 상이한 바쿨로바이러스가 상이한 곤충에 특이적이므로, 특히 해를 끼치는 곤충 해충을 선택적으로 표적으로하기 위해 특정 독소를 사용하는 것이 가능할 수 있다. 독소 유전자를 위해 특히 유용한 벡터는 핵 폴리헤드로시스 바이러스이다. 이 바이러스를 이용하는 전달 벡터는 이전에 기술되었고, 현재 곤충에 외부 유전자를 전달시키기 위한 선택 벡터이다. 바이러스-독소 유전자 재조합물은 경구 전달가능한 형태로 제작될 수 있다. 바쿨로바이러스는 일반적으로 곤충의 중장 장점막을 통하여 감염시킨다. 강한 바이러스의 코트 단백질 프로모터의 뒤에 삽입된 독소 유전자가 발현되어 감염된 곤충을 신속하게 죽일 것이다.
곤충 바이러스 또는 바쿨로바이러스 또는 본 발명의 단백질 독소를 위한 유전자 전환 식물 전달계 외에, 단백질은 바실루스 터린기엔시스 캡슐화 기술(예를 들면, 본원에서 모두 참고로 인용한 미국 특허 제 4,695,455호, 제 4,695,462호, 제4,861,595흐에서와 같지만 이에 한정되지는 않음)을 사용하여 캡슐화될 수 있다. 본 발명의 단백질 독소를 위한 다른 전달계는 미끼 매트릭스 내로의 단백질의 제제이며, 이어서, 이 제제를 지상 또는 지하 곤충 미끼 스테이션에서 사용할 수 있다. 그러한 기술의 예는 본원에서 참고로 인용한 PCT 특허 출원 WO 93/23998을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
전술된 바와 같이, 다른 숙주의 코돈 선호도가 포트랍두스와는 상이할 수 있으므로, 비천연 숙주에서 발현시키는 경우, 단백질을 암호화하는 서열을 변경하는 것이 필요할 수 있다. 그러한 경우, 코딩 서열에 대한 보충 변경을 하지 않는다면, 새로운 숙주내에서 번역은 매우 불충분할 수 있다. 부가적으로, 새로운 숙주의 단백질과의 억제 교차 반응성을 피하거나, 새로운 숙주내에서 단백질의 살충 특성을 개량하기 위해 아미노산 서열에 대한 변형이 요망될 수 있다. 유전적으로 변형된 독소 유전자는 예를 들면, 증강되거나 감소된 독성, 변환된 곤충 내성 개발, 변환된 안정성 또는 변형된 표적 종 특이성을 나타내는 독소를 암호화할 것이다.
독소를 암호화하는 포토랍두스 유전자 의에, 본 발명은 범위는 독소 단백질에 상동성인 아미노산 생중합체를 암호화하고, 곤충 종류에서 경구 섭취후에 포토랍두스 단백질의 독성 효과를 보유하는 관련 핵산 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 본 발명에서 사용된 독소는 유충을 죽이기 전에 먼저 유충의 먹이 섭취를 억제하는 것으로 보인다. 포토랍두스 독소의 핵산 서열 또는 그의 제어서열을 조작함으로써, 독소 유전자를 식물내에 배치시키는 유전 공학자는 예를 들면, 유충에 대한 완전한 독성을 제거하면서 먹이섭취-저해 활성을 유지시키기위해 그의 효력 또는 그의 작용 양식을 조정할 수 있다. 이러한 변화는 형질전환된 식물이 모든 표적 곤충을 생태계내에서 없애는 불필요한 극적인 효과를 갖지 않고도 추수때까지 생존할 수 있도록 한다. 독소를 암호화하는 유전자 또는 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 모든 그러한 변경은 본 발명의 범위내에 있는 것으로 계획된다.
핵산의 다른 계획된 변경은 그의 효능을 개선하기 위해 곤충 유충의 특정 부위로 독소를 전달시키는 표적 서열의 첨가를 포함한다.
균주 ATCC 55397, 43948, 43949, 43950, 43951 및 43952는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA)에 기탁되어 있다. W-14 천연 독소(ATCC 55397)에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열 데이터를 하기에 제시한다. 박테리아 숙주로부터의 독소에 대한 게놈 DNA의 단리를 또한 본 26원에서 예시한다.
표준 및 분자 생물학 기술은 본원에서 명세서에 후술하고 교시한다. 부가의 정보는 본원에 참고로 인용한 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F., 및 Maniatis, T.(1989),Molecular C1oning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press]에서 찾을 수 있다.
하기 약자를 실시예 전체에서 사용한다:Tris= 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄; SDS= 소듐 도데실 술페이트; EDTA= 에틸렌디아민테트라아세트산; IPTG=이소프로필티오-B-갈락토시드; X-gal=5-브로모-4-클로로-3-인도일-B-D-갈락토시드; CTAB=세틸트리메틸암모늄 브로마이드;kbp= 킬로염기 쌍; dATP, dCTP, dGTP, dTTP, I= 각각 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민 및 이노신의 2'-데옥시뉴클레오시드 5'-트리포스페이트;ATP= 아데노신 5'-트리포스페이트.
실시예 1
피. 루미네센스로부터의 독소의 정제 및 정제됨 독소의 경구 전달 후의 독성의 증명
본 발명의 살충 단백질 독소를 피. 루미네센스 균주 W-14, ATCC 기탁 번호 55397로부터 정제하였다. 피. 루미네센스의 원배양물을 1.5% 아가 중 2% 프로테오펩톤 #3(즉, PP3, Difco Laboratories, Detroit MI)를 포함하는 페트리 접시 상에 유지하고, 25℃에서 배양하고 매주 옮겼다. 박테리아의 제 1 형태의 콜로니를 1ℓ플라스크 중에서 0.5%의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(트윈 60(Tween 60), Sigma Chemical Company, St. Louis MO)가 보충된 200ml의 PP3 브로쓰내로 접종하였다. 브로쓰 배양물을 회전 진탕기 상에서 30℃에서 72시간 동안 성장시켰다. 트윈의 존재 또는 부재하에 성장된 배양물로부터 독소 단백질을 회수할 수 있지만;트윈이 부재하면 성장된 박테리아의 형태 및 박테리아에 의해 생산된 단백질의 프로파일에 영향을 끼칠 수 있다. 트윈의 부재하에, 적어도 하나의 동정된 독소 서브유닛의 분자량이 약 200kDa에서 약 185kDa로 이동하는 한, 변형이동(variant shift)이 발생한다.
72 시간 배양물을 10.000×g에서 30분 동안 원심분리하여 세포 및 파쇄물을 제거하였다. 살충 활성을 포함하는 상청액 분획을 기울어 따르고 적절한 용적의 1.0M K2HPO4를 첨가함으로써 50mM K2HPO4로 조정하였다. 수산화칼륨을 첨가함으로써 pH를 8.6으로 조정하였다. 이어서, 이 상청액 분획을 50mMk2HPO4로 평형화된 DEAE-세파셀(Sephacel)(Pharmacia LKB Biotechnology)와 혼합시켰다. 독성 활성이 DEAE 수지에 홉착되었다. 이어서, 이 혼합물을 2.6×40cm 컬럼에 따르고, 유출액이 280nm에서 정상(steady) 베이스라인 UV 흡수에 도달할때까지 실온에서 30ml/hr의 유동속도로 50mM K2HPO4로 세척하였다. 이어서, 컬럼을 유출액이 다시 정상 280nm 베이스라인에 도달할때까지 150mM KC1로 세척하였다. 최종적으로, 컬럼을 300mM KC1로 세척하고, 분획을 수집하였다.
독소를 포함하는 분획을 모으고, 0.2미크론 공극 막 필터를 사용하여 여과 멸균하였다. 이어서, 독소를 농축시키고, 4℃에서 100kDa의 분자량 컷오프를 갖는 초여과막(Centhprep 100, Amicon Division-W.R. Grace and Company)을 사용하여 100mM KPO4, PH 6.9로 평형화시켰다. 독소 농축물의 3ml 샘플을 2.6×95cm 세파크릴(Sephacry1) S-400 HR 겔 여과 컬럼(Phamncia LKB Biotechnology)의 상단에 적용하였다. 용출 완충액은 100mM KPO4, pH 6.9이었고, 이를 41℃에서 17ml/hr의 유동속도로 전개시 켰다. 용출물을 280nm에서 모니터링 하였다.
분획을 모으고, 독성 활성에 대하여 시험하였다. 크로마토그래피 분획의 독성을 만두카 섹스타(Manduca sexta) 유충을 사용하는 생물학적 분석으로 시험하였다. 분획을 곤충 먹이(매미나방 밀 배(germ) 먹이, ICN Biochemicals Division -ICN Biomedicals, Inc.) 상에 직접 적용하거나 5㎕의 샘플을 30게이지 바늘을 사용하여 4회 또는 5회령(instar)유충의 제 1 전각(proleg)을 통하여 인트라헤모셀릭(intrahemocelic) 주사에 의해 투여하였다. 처리군내의 각각의 유충의 무게를 24시간 간격으로 기록하였다. 처리된 곤충 먹이를 소비한 수일내에 곤충이 먹이섭취를 중단하고 죽거나, 분획을 주사한 후 24시간 내에 죽는다면 독성이 추정된다.
독성 분획을 모으고 센트리프렙(Centriprep)-100을 사용하여 농축시킨 다음, 100mM의 인산 칼륨, pH 6.9의 용출 완충액을 0.4m/ℓ분으로 전개하면서 7.5mm×60cm TSK-GEL G-4000 SW 겔 삼투 컬럼을 사용하여 HPLC에 의해 분석하였다. 이 분석으로 독소 단백길이 약 33.6분의 보유 시간으로 컬럼으로부터 용출된 하나의 날카로운 피크내에 포함되는 것을 밝혔다. 이 보유 시간은 1,000kDa의 추정된 분자량에 상응하였다. 추가의 정제를 위해 피크 분획을 모으고, 이 단백질을 포함하지 않는 분획을 폐기하였다. HPLC로부터 용출된 피크는 218 및 280nm에서 UV 광을 흡수하지만, 405nm에서는 흡수하지 않았다. 405nm에서의 흡수는 제노랍딘 항생제 화합물에 의한 것으로 나타났다.
모은 피크 분획을 비-변성 아가로즈겔(Metaphor Agarose, FMC BioProducts) 내에서 전기영동하면, 두 개의 단백질 복합체가 피크내에 존재함을 나타냈다. 50mM Tris-HC1(pH 7.0)에 완충된 피크 물질을 표준 완충 조건(양극 완충액 1M Tris-HCl(pH 8.3);음극 완충액 0.025M Tris, 0.192M 글라이신)하에 100mM Ths-HC1(pH 7.0)로 완충된 1.5% 아가로즈 스태킹 겔 및 200mM Tris-보레이트(pH8.3)으로 완충된 1.9% 아가로즈 용해 겔 상에서 분리하였다. 겔을 15℃에서 13mA의 불변 전류에서 페놀 레드 트랙킹 염료가 겔의 단부에 도달할때까지 전개시켰다. 두 개의 단백질 밴드가 쿠마지 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) 염색을 사용하여 아가로즈 겔에 가시화되었다.
느리게 이동하는 밴드를 단백질 밴드 1로 지칭하고, 빠르게 이동하는 밴드를 단백질 밴드 2로 지칭하였다. 두 개의 단백질 밴드는 대략 동일한 양으로 존재하였다. 겔의 비염색된 부분으로부터 두 개의 단백질 밴드를 정확하게 절제하기 위해, 쿠마지 염색된 아가로즈 겔을 가이드로서 사용하였다. 단백질 밴드를 포함하는 절제된 조각을 용매에 넣어 부드럽게하고, 소량의 멸균수를 첨가하였다. 대조군으로서, 단백질을 포함하지 않는 겔의 일부를 또한 절제하고, 단백질을 포함하는 겔조각에서와 동일한 방법으로 처리하였다. 단백질을 전기용출에 의해 100V(불변 전압)에서 겔 조각으로부터 2시간 동안 100mM Tris-보레이트(pH 8.3) 중으로 회수하였다. 대안적으로, 겔 조각에 동용적의 50mM Tris-HCl(pH 7.0)을 첨가함으로써 겔조각으로부터 단백질을 수동적으로 용출시킨 다음, 30℃에서 16시간 동안 배양시켰다. 이에 의해, 단백질이 겔로부터 완충액 중으로 분산되며, 이어서, 이를 모았다.
HPLC-정제된 독소(33.6분, 피크) 및 아가로즈 겔 정제된 독소를 사용하는 곤충 독성 시험의 결과는 추출물의 독성을 증명하였다. HPLC 정제된 단백질 1.5μg을 주사하는 경우, 24시간 내에 곤충이 죽었다. 수동 용출 또는 전기용출에 의해 아가로즈 겔로부터 회수된 단백길 밴드 1 및 단백질 밴드 2는 모두 주사하는 경우 곤충을 치사시켰다. 이들 샘플에 대해 추정된 단백질 농도는 50ng 미만/유형이었다. 단백질 밴드 1 또는 단백질 밴드 2가 주사된 유충군 사이의 무게 증가 및 치사율을 비교하면, 단백질 밴드 1이 주사 전달에 의해 더 독성임을 나타냈다.
HPLC-정제된 독소가 7.5μg/유충의 농도로 유충 먹이에 적용되는 경우, 이는 유충 무게 증가를 중단시켰다(24마리의 유충이 시험됨). 유충이 먹이 섭취를 시작하지만, 단지 매우 소량의 독소 처리된 먹이를 소비한 후에, 이들은 다서 독소에 의해 유도된 병리 증상을 나타내기 시작하고, 먹이 섭취를 중단한다. 유충의 배설물이 퇴색되기 시작했고, 대부분의 유충 설사 증상을 나타내었다. 수회의 5μg 독소 투여량을 7 내지 10일 기간에 걸쳐 먹이에 적용하는 경우, 상당한 곤충 치사가 발생하였다.
아가로즈-분리된 단백질 밴드 1은 200ng/유충의 투여량에서 유충의 무게 종가를 상당하게 억제하였다. 유사한 농도의 단백질 밴드 2를 섭취한 유충은 억제되지 않으며, 대조 유충과 동일한 비율로 무게가 증가하였다. 12마리의 유충에 용출된 단백질을 섭취시켰고, 45마리의 유충에 단백질-함유 아가로즈 조각을 섭취시켰다. 이들 2세트의 데이터는 단백질 밴드 1이 만두카 섹스타에 대해 경구적으로 독성임을 나타낸다. 본 시험에서, 단백질 밴드 2가 만두카 섹스타에 대해 독성이 아님이 명백하다.
변성 조건하에 SDS-PAGE에 의한 단백질 밴드 1 및 2의 추가의 분석은 각각의 밴드가 수개의 더 작은 단백질 서브유닛으로 이루어짐을 나타내었다. 단백질은 최대의 감도를 얻기 위해 쿠마지 브릴리언트 블루 염색에 이어 은 염색함으로써 가시화되었다.
두 개의 밴드내의 단백질 서브유닛은 매우 유사하였다. 단백질 밴드 1은 25.1, 56.2, 60.8, 65.6, 166, 171, 184 및 208kDa의 8개의 단백질 서브유닛을 포함하였다. 단백질 밴드 2는 25.1, 60.8 및 65.6kDa 단백질이 존재하지 않는 것을 제외하고는 동일한 프로파일을 가졌다. 56.2, 60.8, 65.6 및 184kDa 단백질은 단백질 밴드 1의 복합체내에 대략 동일한 농도로 존재하고, 복합체의 총 단백질 함량의 80% 이상을 나타내었다.
천연 HPLC-정제된 독소를 하기와 같이 추가로 특성화하였다. 독소는 열 불안정성이며, 60℃로 15분 동안 가열한 후에 엠. 섹스타 유충에 주사하거나 섭취시키는 경우 치사시키거나 무게 증가를 억제하는 그의 능력을 잃었다. 리파제, 유형 C 포스포리파제, 뉴클레아제 또는 적혈구 용혈 활성을 검출하기 위해 분석을 디자인하여, 정제된 독소로 수행하였다. 이들 활성 중 어느 것도 존재하지 않았다. 항생 지대 억제 분석을 또한 수행하였고, 정제된 독소는 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아, 효모 또는 필라멘트형 진균의 성장을 억제하지 못하였고, 이는 독성이 제노랍딘 항생제가 아님을 나타낸다.
천연 HPLC-정제된 독소를 만두카 섹스타 이외의 곤충을 치사시키는 능력에 대해 시험하였다. 표 2에 본 연구에서 HPLC-정제된 피. 루미네센스 독소에 의해 치사되는 곤충을 나열하였다.
실시예 2
살충제 이용성
포토랍두스 루미네센스의 이용성 및 독성을 추가로 특성화하였다. 포토랍두루메네센스(균주 W-14) 배양 브로쓰는 하기와 같이 생산하였다. 생산 배지는 Milli-Q(등록상표) 탈이온수 중의 2% 백토 프로테오스 펩톤(등록상표) #3(PP3, Difco Laboratories, Detroit, Michigan)이었다. 175ml의 배지로 이루어지는 종자배양물 플라스크를 카풋(Kaput)으로 덮인 데롱 목(Delong neck)이 달린 500ml의 트리배플드 플라스크에 담고, T=250。F에서 20분 동안 오토클레이브시켰다. 생산 플라스크는 신-에쭈(Shin-etsu) 실리콘 포움 마개로 덮인 데롱 목이 달린 500ml 트리배플드 플라스크에서 2.8ℓ 중 500ml로 이루어진다. 이들을 T=250˚F에서 45분 동안 오토클레이브시켰다. 종자 배양물을 2인치 작동 반경의 회전 진탕 배양기 내에서 150lpm에서 28℃에서 배양시켰다. 16시간 동안 성장시킨 후,1%의 종자 배양물을 생산 플라스크내에 놓고 회수하기 전 24시간 동안 성장시켰다. 독소의 생산은 로그상 성장동안 나타났다. 미생물 브로쓰를 1ℓ 원심분리병에 옮기고 세포 생물량을 펠릿화하였다(2500 RPM 4℃에서 30분[R.C.F=∼1600] HG-4L Rotor RC3 Sorval centrifuge, Dupont, Wilmington, Delaware). 제 1 브로쓰를 4℃에서 8 내지 16시간동안 냉각시키고, 적어도 2시간 동안 재원심분리시켜(상기 조건) 정치시에 침전되는 추정 무코폴리사카라이드를 제거함으로써 브로쓰를 추가로 정화시켰다. (대안적인 프로세싱 방법은 두 단계를 합하고, 상기와 동일한 조건하에 16시간의 정화 원심분리의 사용을 포함한다.) 이어서, 이 브로쓰를 생분석 또는 여과하기 전에 41℃에서 저장하였다.
포토랍두스 배양 브로쓰, 및 이 브로쓰로부터 정제된 단백질 독소(들)은 많은 곤충에 대하여 활성(치사 및(또는) 성장 억제, 감소된 성충 출현)을 나타냈다. 더 구체적으로, 활성은 딱정벌레목의 곤충의 구성원인 옥수수 뿌리벌레(유충 및 성충), 콜로라도 감자 딱정벌레, 및 잔디 땅벌레(turf grub)에 대하여 나타났다. 딱정벌레 목의 다른 구성원은 방아벌레(wireworm), 화분(pollen) 딱정벌레, 뜀벼룩 갑충(fleabeetle), 종자 딱정벌레 및 바구미를 포함한다. 활성은 또한 동시목의 구성원인 별매미총(aster leanlopper)에 대해서도 관찰되었다. 동시목의 다른 구성원은 멸구(planthopper), 배나무이(pys1la), 사과나무이(sucker), 개각충(scale insect), 화이트플라이(whiteflies) 및 침(spittle)별레 뿐만 아니라, 많은 숙주 특이성 진딧물 종을 포함한다. 브로쓰 및 정제된 분획은 또한 사탕무 행렬구더기(armyworm), 양배추 자벌레, 블랙 야도충(black cutworm), 회색담배나방, 유럽 곡물 천공충, 옥수수 귀벌레(earwonn) 및 코들링 나방(이들은 모두 나비목의 구성원임)에 대하여 활성이었다. 이 목의 다른 전형적인 구성원은 옷좀나방, 화랑곡나방(Indian mealmoth), 잎말이나방(leaf roller), 배추벌레, 목화다래 나방(cotton ballwonrm), 도롱이 벌레(bagworm), 이스턴 텐트 나방(Eastern tent caterpiller), 잔디 포충나방(sod webworm), 및 폴 행렬 구더기(fall armyworm)를 포함한다. 활성은 또한 파리목의 구성원인 과일파리 및 모기 유충에 대해서도 나타났다. 파리목의 다른 구성원은 완두 미지(midge), 당근 파리, 배추 뿌리 파리, 순무 뿌리 파리, 양파 파리, 크레인 파리, 집파리 및 다양한 모기 종을 포함한다. 또한 불개미, 오더러스(oderous) 집개미 및 작은 흑개미를 포함하는 목의 구성원인 카펜터 개미 및 아르헨티나 개미에 대해서도 활성이 나타났다.
브로쓰/분획은 곤충의 군집을 감소시키기 위해 유용하며, 곤충 군집을 억제하는 방법에서 사용되었다. 방법은 전술된 유효한 곤충 불활성화량의 활성제롤 곤충의 지역에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 결과를 표 3에 기록하였다.
옥수수 뿌리벌레 유총에 대한 활성을 하기와 같이 시험하였다. 포토랍두스 배양 브로쓰(여과 멸균됨, 세포 없음) 또는 정제된 HPLC 분획을 30㎕ 분취액내 인공 먹이의 0.25ml의 표면(∼1.5cm2)에 직접 적용하고, 각각 대조 배지 또는 10mM 인산나트륩 완충액(pH 7.0)으로 회석하였다. 먹이 평판을 멸균 유동 후드내에서 공기 건조시키고, 웰을 멸균된 알로부터 부화된 단일, 신생 디아브로티카 운데심푼크타타호워디(Diabrotica undecimpunctata howardi)(써든 옥수수 뿌리 벌레, SCR)로 채우고, 2회령 SCR을 인공 먹이에서 성장시키거나,2회령 디아브로티카 비르기페라 비르기페라(Diabrotica virgifera virgifera)(웨 스턴 옥수수 뿌리 벌레, WCR)을 메트로믹스(Metromix)(등록상표)에서 성장된 묘목 상에 재배하였다. 2회령 유충을 먹이를 첨가하기 전에 칭량하였다. 평판을 밀봉하고, 가습된 성장 체임버에 놓고, 27℃에서 적절한 기간(신생 및 성총 SCR에 대해 4일, AVCR 유충에 대해 2 내지 5일, 2회령 SCR에 대해 7 내지 14일). 치사율 및 무게 측정을 지시된 바와 같이 기록하였다. 일반적으로, 모든 연구에서 처리 당 16마리의 곤충을 사용하였다. 대조군 치사율은 하기와 같았다:신생 유충:5%, 성충 딱정벌레:5%.
콜로라도 감자 딱정벌레에 관한 활성은 다음과 같이 시험하였다. 포토랍두스 배양 브로쓰 또는 대조군 배지를 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰 중에 유지된 표준 인공 사료의 1.5ml의 표면(∼2.0cm2)에 가하였다. 각각의 웰은 50μl씩 처리되었고 방치하여 공기 건조시켰다. 이어서, 개별적인 2회령의 콜로라도 감자 딱정벌레(Leptinotarsa decemhneata, CPB) 유충을 상기 사료 상에 위치시키고 치사율을 4일 후에 기록하였다. 처리 당 10 개의 유총을 모든 경우의 연구에 사용하였다. 대조군의 사망률은 3.3%이었다.
일본 딱정벌레 굼벵이 및 딱정벌레에 대한 활성은 다음과 같이 시험하였다. 잔듸 굼벵이(Popilha japonica,2-3회령)을 침입받은 잔듸로부터 수집하여 추가의 사료로서 첨가된 당근 조각이 포함된 토양/토탄 중에 실험실에서 유지시켰다. 잔듸 딱정벌레들은 국부적으로 페로몬으로 분출시키고 사료로서 단풍나무 잎이 첨가된 플라스틱 용기 중에 실험실에서 유지시켰다. 무회석 포토랍두스 배양 브로쓰 또는 대조군 옥수수 배지를 뿌리벌레 인공 사료(30 ul/1.54cm2) 또는 당근 조각(유충)에 가한 후, 두 단계들을 단독으로 사료 웰 중에 위치시키고 임의의 치사율 및 섭취를 관찰하였다. 모두의 경우에 있어서 관찰된 섭취량(배설물 생산)에서 명백한 감소가 있었다.
모기 유충에 대한 활성은 다음과 같이 시험하였다. 분석은 96-웰 마이크로타 이터 플레이트에서 수행하였다. 각각의 웰은 수용액(포토랍두스 배양 브로쓰, 대조군 배지 또는 H2O) 200㎕ 및 대략 20 개씩, 1일령의 유층(애데스 애집티)을 포함하였다. 처리 당 6 개의 웰이 존재하였다. 결과는 침입 후 2 시간이 지나서 판독하였고 3일의 관찰 기간 동안 변화되지 않았다. 대조군 치사율은 관찰되지 않았다.
초파리에 대한 활성은 다음과 같이 수행하였다. 구매한 초파리(Drosophilia melanogester) 배지를 50% 건조 배지 및 물, 대조군 배지 또는 포토랍두스 배양 배지 중 어느 하나의 50% 용액을 사용하여 제조하였다. 이는 처리 당 3 개의 사육 바이알 각각 중에 건조 배지 8ml을 위치시키고, 적절한 용액 8ml을 첨가함으로써 성취되었다. 이어서 10회 후의 령의 초파리 구더기를 각 바이얼에 첨가하였다. 바이얼들은 형광 천장의 조명하에 실온에서 실험실 벤취 상에 유지시켰다. 새끼 또는 성체 계수는 노출 3,7 및 10일 후에 행하였다. 포토랍두스 배양 브로쓰의 초파리 구더기 사료 배지로의 혼입은 물 및 대조군 배지(3%) 감소에 비하여 10일째 성체 출현에 있어서 약간의(17%), 그러나 상당한 감소를 유발하였다.
별 매미충에 대한 활성은 다음과 같이 시험하였다. 별 매미충(Macroste1es severini)에 대한 섭취 분석은 다른 의부의 접촉이 없이 적극적인 섭취를 허용하도록 설계하였다. 적극적인/사료 용액에 대한 용기는 35×10mm 페트리 접시의 바닥부분의 중앙에 2 개의 구멍을 만듦으로써 제조하였다.2 인치 Parafilm M(등록상표) 스퀘어를 접시의 상부를 가로질러 위치시키고 0 링으로 닫았다. 이어서 1 온스 플라스틱 컵에 대략 7마리의 매미충을 섭취시키고 용기를 컵의 상부에, 파라필름을 하부에 위치시켰다. 이어서 시험 용액을 구멍을 통하여 용기에 첨가하였다. 무희석 포토랍두스 배양 브로쓰를 사용한 시험에 있어서, 브로쓰 및 대조군 배지를 물에 대하여 투석시켜 대조군 치사율을 감소시켰다. 치사율은 2 일째에 보고하였고 여기서 26.5%의 대조군 치사율이 나타났다. 정제된 분획(200mg 단백질/ml)을 사용한 시험에 있어서,5% 수크로오스의 최종 농도를 모든 처리에 사용하여 별 매미충의 생존능을 향상시켰다. 이 분석물은 배양기에서 16/8의 광조사 기간의 28℃, 70% RH로 유지시켰다. 분석물은 72 시간 생존능에 대하여 등급을 매겼다. 대조군 치사율은 5.5% 이었다.
아르헨티나 개미에 대한 활성은 다음과 같이 시험하였다.100% 포토랍두스 배양 브로쓰, 대조군 배지 또는 물의 1.5ml 분취량을 피펫팅하여 2.0ml 투명 유리 바이얼 내로 가하였다. 이 바이얼들을 적절한 처리에 의해 젖게한 목화 덴탈 윅(dental wick) 조각으로 틀어막았다. 각각의 바이얼을 8 내지 12 마리의 성체 아르헨티나 개미(Linepithenn humile)를 담은 별도의 60 x 16mm 페트리 접시 내에 위치시켰다. 처리 당 3회의 복제가 있었다. 생물학적 시험 플레이투는 형광 천장의 조명하에 실온에서 실험실 벤취 상에 유지시켰다. 치사율 판독은 노출후 5일만에 행하였다. 대조군 치사율은 24%이었다.
카펜터 개미에 대한 활성은 다음과 같이 시험하였다. 블랙 카펜터 일개미(Camponotus pennsylvanicus)를 인디아나주 인디아나폴리스의 DowElanco 소유의 나무에서 수집하였다. 포토랍두스 배양 브로쓰를 사용한 시험을 다음과 같이 수행하였다. 각각의 플라스틱 생물학적 시험 용기(7 1/8' x 3')는 플라스틱 단 유리 중에 15 마리의 일개미, 종이 피난처 및 브로쓰 또는 대조군 배지 10ml을 포함하였다. 목화 웍은 짧은 유리 덮게 중의 구멍을 통하여 개미에 대한 처리물에 전달되었다. 모든 처리물은 5% 수크로스를 포함하였다. 생물학적 시험물들은 실온의 암실에서 유지되었고 19 일 동안 채점되었다. 대조군 치사율은 9%이었다. 정제된 분획을 운반하는 분석물들은 플라스틱 시험관 중에 0.2ml 처리 12.0g 사료의 속도로 처리물(정제된 분획 또는 대조군 용액)과 혼합된 인공 개미 사료를 이용하였다. 정제 분획의 최종 단백질 농도는 10 μg/g 사료 미만이었다. 처리 당 10 마리의 개미, 물 공급원,피난처 및 처리된 사료를 밀봉 플라스틱 용기 내에 위치시키고 습기가 있는 배양기중의 27℃의 암실에서 유지시켰다. 치사율은 10일에 기록하였다. 대조군 치사율은 나타나지 않았다.
다양한 나비목 유충에 대한 시험은 다음과 같이 시험하였다. 포토랍두스 배양 브로쓰 또는 정제된 분획을 각각 대조군 배지 또는 10mM 인산나트륨 완충액, pH 7.0 중에 회석한 후 30㎕ 분취량 중의 표준 인공 사료 0.25ml의 표면(∼1.5cm2)의 표면에 직접적으로 가하였다. 사료 플레이트를 멸균 플로우 후드 중에서 공기건조시키고 웰들을 단독의 신생 유충으로 섭취시켰다. 유럽 옥수수 천공충(Ostrinia nublilalis) 및 옥수수 귀벌레(Helicoverpa zea) 알들을 상업적인 공급원으로부터 공급받아서 우리 중에서 부화시킨 반면, 사탕무 행렬구더기(Spodoptera exigua), 양배추 자벌레 (Thchoplusia ni), 회색담배나방(Heliothis virescens), 사과 나방(Laspeyresia pomonena) 및 블랙 야도충(Agrotis ipsilon) 유충은 내부적으로 공급받았다. 유충으로 침입시킨 후, 사료 플레이트들을 밀봉하고, 습기가 있는 성장 챔버중에 위치시켜서 적절한 기간 동안 27℃의 암실에서 유지시켰다. 치사율 및 중량 측정은 포토랍두스 배양 배지에 대해서 5-7 일에 기록하였고, 정제된 분획에 대해서 4-7일에 기록하였다. 일반적으로 처리당 16마리의 곤충이 모든 연구에서 사용되었다. 대조군 치사율은 대조군 배지에 대해서 4 - 12.5%의 범위이었고 인산염 완충액에 대해서는 10% 미만이었다.
실시예 3
토양 적용시 살충제 이용성
포토랍두스 루미네센스(균주 W-14) 배양 브로쓰는 토양 또는 토양 혼합물(메트로믹스(Metromix)(등록상표)에 직접 가하였을 때 옥수수 뿌리벌레에 대하여 활성인 것으로 나타났다. 메트로믹스(등록상표) 중의 신생 SCR 및 WCR에 대한 활성은 다음과 같이 시험하였다(표 4). 시험은 습윤 여과지 상의 빚 중에서 6 일간 발아시킨 옥수수 묘목(United Agriseeds brand CL614)를 사용하여 진행시켰다. 뿌리가 대략 3 - 6cm 길이이었을 때, 단일 인/묘목을 무수 메트로믹스(등록상표) 50g를 포함하는 투명 플라스틱 컵 591ml 중에 식묘하였다. 이어서 20 개의 신생 SCR 또는 WCR를 묘목의 뿌리 상에 직접 위치시키고 메트로믹스(등록상표)로 덮었다. 침습시, 묘목들을 희석 브로쓰 용액의 50ml 전체 부피로 적셨다. 적신 후, 컵들을 밀봉시키고 빚 중의 실온에서 7 일 동안 방치하였다. 그 후, 묘목들을 세척하여 메트로믹스(등록상표)를 제거하고 뿌리를 절단하여 중량을 재었다. 활성은 대조군 식물에 대하여 남아있는 옥수수 뿌리의 비율의 백분율 및 섭취에 의해 유도된 잎 손상으로서 평가하였다. 잎 손상은 육안으로 관찰하였고 -, +, ++, 또는 +++ 중의 하나로서 평가하였으며,-는 무손상을 나타내고, +++는 심한 손상을 나타낸다.
토양에서 신생 SCR에 대한 활성은 다음과 같이 시험하였다(표 5). 시험은 습윤 여과지 상의 빛 중에서 6 일간 발아시킨 옥수수 묘목(United Agriseeds brand CL614)를 사용하여 진행시켰다. 뿌리가 대략 3 - 6cm 길이이었을 때, 단일 인/묘목을 전년도에 옥수수를 식묘한 인디아나주 Lebanon의 들판으로부터의 토양 150g를 포함하는 투명 플라스틱 컵 591ml 중에 식묘하였다. 이 토양은 이전에 살충제로 처리하지 않았다. 이어서 20개의 신생 SCR을 묘목의 뿌리 상에 직접 위치시키고 토양으로 덮었다. 침습후, 묘목들을 희석 브로쓰 용액의 50ml 전체 부피로 적셨다. 적신 후, 밀봉되지 않은 컵들을 78。F에서 높은 상대습도(80%)의 챔버 중에서 배양시켰다. 그 후, 묘목들을 세척하여 모든 토양을 제거하고 뿌리를 절단하여 중량을 재었다. 활성은 대조군 식물에 대하여 남아있는 옥수수 뿌리의 비율의 백분율 및 섭취에 의해 유도된 잎 손상으로서 평가하였다. 잎 손상은 육안으로 관찰하였고 -, +, ++, 또는 +++ 중의 하나로서 평가하였으며, -는 무손상을 나타내고, +++는 심한 손상을 나타낸다.
포토랍두스 루미네센스(균주 W-14) 배양 브로쓰의 메트로믹스(등록상표)중의 제2령의 잔듸 굼벵이에 대한 활성은 다음과 같이 수행된 시험에서 관찰되었다(표 6). 대략 50g의 무수 메트로믹스(등록상표)를 투명 플라스틱 컵 591ml에 첨가하였다. 이어서, 이 메트로믹스(등록상표)를희석 포토랍두스 브로쓰 용액 50%(v/v)의 50ml의 전체 부피로 적셨다. 조 브로쓰의 희석은 물로 행하였고, 50ml 전체 부피에 대해 조 브로쓰 25ml을 25ml 첨가함으로써 50% 브로쓰를 제조하였다. 정상 배지 농도의 50% 희석인 프로테오스 펩톤 #3(pp3)의 1%(w/v) 용액을 브로쓰 대조군으로서 사용하였다. 적신 후, 5개의 제2령 잔듸 굼벵이 들을 습윤화된 메트로믹스(등록상표)의 상부에 위치시켰다. 건강한 잔듸 굼벵이 유충은 메트로믹스(등록상표) 속으로 신속하게 굴을 파고 은신하였다. 1시간 내에 은신하지 못한 유충들은 제거하고 신선한 유충으로 대체하였다. 컵을 밀봉시키고 28℃의 암실 배양기 중에 위치시켰다. 7일 후, 유충들을 메트로믹스(등록상표)로 부터 제거하고 치사율을 기록하였다. 활성은 대조군에 대한 사망율의 백분률로 평가하였다.
실시예 4
앞 적용시 살충제 이용성
유럽 옥수수 천공충에 대한 포토랍두스 브로쓰의 활성은 브로쓰를 옥수수 잎의 표면에 직접 적용했을 때 관찰하였다(표 7). 이들 분석에 있어서, 포토랍두스 브로쓰는 배양 배지로 100배 회석하고 잘라진 옥수수 잎의 표면에 잎 표면의 ∼ 6.0μl/cm2의 속도로 손수 가하였다. 잎들을 공기 건조시키고 대략 2 x 2 인치의 동일한 크기의 조각으로 절단하였다. 잎들을 말아서 종이 클립으로 묶고 1 온스 플라스틱 단 유리 중에 2%의 아가의 0.25 인치가 습기를 제공하도록 바닥 표면에 있게 위치시켰다. 이어서, 12 개의 신생 유럽 옥수수 천공충을 말린 잎 상에 위치시키고 컵을 밀봉하였다. 25℃의 암실에서 5일 동안 배양시킨 후, 시료들을 섭취 손상 및 회복된 유충에 대하여 기록하였다.
배양 브로쓰의 신생 회색담배나방(Heliothis virescens)에 대한 활성은 잎 침지 방법론을 사용하여 입증하었다. 프랑스 목화 잎을 식물로부터 잘라내어 잎 디스크를 18.5mm 코르크-끌로 절단하였다. 디스크를 개별적으로 대조군 배지(pp3) 또는 10kDa 필터를 가진 Amicon(매사추세츠주 Beverly 소재) Profluxm12 트랜스제니 탈 여과 시스템을 사용하여 대략 10배로 농축시킨 포토랍두스 루미네센스(균주 W-14) 배양 브로쓰 중에 침지시켰다. 과량의 용액을 제거하고 똑바로 편 종이 클립을 디스크의 중앙을 통해 위치시셨다. 이어서 종이 클립을 1% 아가 대략 2.0ml을 함유하는 플라스틱, 1.0 온스 단유리 내에 밀어 넣었다. 이는 아가 상에 잎 디스크를 매달리게 하는 역할을 하였다. 잎 디스크의 건조 후, 단일 신생 회색담배나방 유충을 디스크 상에 위치시키고 컵을 클램핑시켰다. 이어서 컵들을 플라스틱 백 중에 밀봉시키고 암화된 27℃ 배양기 중에서 5 일 동안 위치시켰다. 이때 잔여 유충 및 잎 재료들을 중량을 재어 잎 손상에 대한 척도로 설정하였다(표 8).
실시예 5, 파트 A
독소 펩티드 성분의 특성화
후속되는 분석에 있어서, 실시예 1에서 단리된 밴드의 독소 단백질 소단위들을 30:0.8(아크릴아미드:비스-아크릴아미드)의 비율의 7% SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 겔 상에 분해시켰다. 이 겔 매트릭스는 더 큰 단백질에 대한 더 양호한 해상을 촉진하였다. 실시예 1에서 밴드 1 및 밴드 2 소단위 분자량을 측정하는데 사용했던 겔 시스템은 38:0.8(아크릴아미드:비스-아크릴아미드)의 18% 겔이었고, 이는 넓은 범위의 크기 분리를 허용하였으나 고분자량 성분의 해상력은 낮았다.
이 분석에 있어서, 8개 보다는 10개의 단백질 밴드가 분해되었다. 표 9는 10개의 해상된 밴드의 이론적 분자량을 나타내고 이들 조건하에서 측정한 분자량을 선행 실시예의 것에 대하여 직접적으로 비교하였다. 추가의 밴드가 이 실시예에서 사용된 상이한 분리 조건하에서 검출되었다는 것은 놀라운 것이 아니다. 분자량에 대한 선행 및 신규 측정 사이의 편차는 또한 분석 조건에 있어서 차이에 따라 예견 될 수 있는 것이다. 본 실시예의 분석에 있어서 고분자량 측정물은 개선된 해상력의 결과로서 실시예 1에서의 것보다 더 정확한 것으로 사료된다. 그러나, 이들은 SDS PAGE 분석에 기초한 측정 결과이며 이는 전형적으로 분석 상 정확하지 않은 것이며 펩타이드의 추정을 초래하며 후- 및 동시-번역 수식에 기인하여 더욱 변경될 수 있다.
아미노산 서열들을 10개의 해상된 펩티드 중 5 개의 N-말단 부분에 대하여 결정하였다. 표 9는 단백질의 분자량 및 동정된 서열과 상관 관계가 있다. 서열 번호 2에 있어서, 특정 분석은 잔기 5의 프롤린이 아스파라긴(asp)일 수 있음을 암시한다. 서열 번호 3에 있어서, 특정 분석은 잔기 13 및 14의 아미노산 잔기가 모두 아르기닌(arg)일 수 있음을 암시한다. 서열 번호 4에 있어서, 특정 분석은 잔기 6의 아미노산 잔기가 알라닌(ala) 또는 세린(ser) 중 하나 일 수 있음을 암시한다. 서열 번호 5에 있어서, 특정 분석은 잔기 3의 아미노산 잔기가 아스파르탐산(asp)일 수 있음을 암시한다.
실시예 5, 파트 B
독소 펩티드 성분의 특성화
새로운 N-말단 서열, 서열 번호 15, Ah Gln Asp Gly Asn Gln Asp Thr Phe Phe Ser Gly Asn Thr은 상기 실시예 5, 파트 A에서 기술한 천연 HPLC 정제된 독소로부터 단리된 펩티드의 추가의 N-말단 서열화에 의해 얻었다. 이 팹티드는 tcaA 유전자로부터 유래된다. 이 펩티드 표지 TcaAii는 위치 254에서 시작하여 위치 491까지 펼쳐있고, 여기서 TcaAiii펩티드, 서열 번호 4가 시작된다. 유전자 서열에 기초한 펩티드의 추정 크기는 25,240 Da이다.
실시예 6
독소 펩티드 성분의 특성화
더욱 다른 분석에 있어서, 독소 단백질 복합체를 포토랍두스 루미네센스 성장 배지(Tween의 부재하에서 배양 후)로부터 10% - 80% 암모늄 설페이트 침전에 이어 이온 교환 크로마토그래피 단계(모노 Q) 및 두 분자 사이징 크로마토그래피 단계를 수행함으로써 단리하였다. 이들 조건들은 실시예 1에서 사용된 것과 유사하다. 처음의 분자 사이징 단계 동안, 두번째의 생물학적으로 할성인 피크는 약 100 ± 10kDa에서 발견되었다. 단백질 측정에 기초하여 이 단편은 더 큰 또는 처음의 약 860 ± 100kDa(천연)의 활성 피크 보다 20 - 50배 덜 활성이었다. 이 단리 실험 동안, 출발 생물학적 활성의 상당부를 함유하였던 약 325 ± 50kDa의 덜 활성인 피크 역시 해상되었다. 325kDa 피크는 860kDa 피크에 관련되거나 또는 이로부터 유도된 것으로 생각된다.
56kDa 단백질이 이 분석에서 해상되었다. 이 단백질의 N-말단 서열은 서열번호 6에 나타냈다. 이 단백질이 N-말단에서 서열 번호 5와 상당한 동일성 및 보존성을 나타내는 것이 주목할만 하며, 이는 이 둘이 유전자 집단의 상이한 원에 의해 암호화 될 수 있고 각 유전자에 의해 생성된 단백질은 이 둘이 살충의 독소 복합체로서 작용하기에 서로에 대해 충분히 유사함을 암시한다. 두번째, 두드러진 185kDa 단백질은 표 9로부터 단백질 3의 것에 비교할 만한 양으로 일관되게 존재하였으며 동일한 단백질 또는 단백질 단편일 것이다. 이 185kDa 단백질의 N-말단 서열은 서열 번호 7에 나타냈다.
추가의 N-말단 아미노산 서열 데이터는 또한 단리된 단백질들로부터 얻었다. 결정된 N-말단 서열의 어느 것도 표 9에서 동정된 단백질에 동일하게 나타나지 않았다. 기타의 단백질들이 단리된 제제물에 존재하였다. 하나의 그러한 단백길은 108kDa의 추정 분자량을 가졌고 서열 번호 8에 나타낸 바와 같은 N-말단 서열을 가졌다. 두번째의 그러한 단백질은 80kDa의 추정 분자량을 가졌고 서열 번호 9에 나타낸 바와 같은 N-말단 서열을 가졌다.
대략 325kDa 활성 피크에서 단백질 물질이 그기에 의해 분석되었을 때, 대략 51,31,28 및 22kDa의 밴드들이 관찰되었다. 분자량이 전기영동적 이동의 분석에 의해 결정된 모든 경우에서와 같이, 이들 분자량은 완충액 이온 강도 차이, 전기영동 전력 차이 등에 의해 야기되는 오류 효과를 받았다. 당업자는 결정적인 분자량값은 이들 표준 방법에 의해 결정될 수 없으며 각각은 편차를 갖게 될 것임을 이해할 것이다. 이들 크기의 단백질은 더욱 큰 초기의 독소 복합체에서 관찰된 보다 큰 단백질 종(대략 200kDa 크기의)의 분해 산물인 것으로 가정되었다.
마지막으로, 몇몇 제제는 서열 번호 10에 나타낸 N-말단 서열을 갖는 단백질을 포함하였다. 이 서열은 큰 단백질 복합체의 어셈블리에서 기능을 하는 것으로 알려진 보조 단백질인 카페로닌 단백질에 강하게 상동성이었다. 출원인은 서열 번호 10에서 동정된 단백질에 대한 그러한 어셈블리 기능을 규정할 수는 없지만, 그러한 카페로닌 단백질이 그의 어셈블리에서 수반될 수 있는 기술된 독소 단백질 복합체의 존재와 일치하였다. 더욱이, 그러한 단백질은 독성 활성을 갖는 것으로 직접적으로 제안될 수 없으나, 이 단백질은 단백질 독소의 전체의 구조적 성질을 결정하는데 중요할 수 있으며, 따라서 독성 활성 또는 경구 전달 후 복합체의 생체내 생존력에 기여할 것이다.
프로테이나제 K에 대한 단백질 독소 복합체의 안정성에 관한 후속 분석을 수행하였다. 10몰 과량의 프로테이나아제k의 존재 중에서 복합체를 24 시간 배양시킨후, 활성이 궁극적으로 제거되었다(경구 적용시 치사율이 약 5%까지 떨어졌다)는 것이 확인되었다. 이들 데이터는 독소의 단백질 분해 효소적 성질을 입증한다.
독성 활성은 투석 멤브레인에 의해서도 유지되었으며 이는 재차 큰 크기의
천연 독소 복합체를 확인한다.
실시예 7
포토랍두스 독소의 단리, 특성화 및 부분적인 아미노산 서열화 단리 및 N-말단 아미노산 서열화; 실시예 5 및 6에 비슷하게 행해진 셋트의 실험에 있어서, 포토랍두스 단백질의 암모늄 설페이트 침전은 포토랍두스 브로쓰, 전형적으로 2-3 리터를 암모늄 설페이트 결정을 서서히 첨가함으로써 10% 또는 20% 중 어느 하나의 최종 농도까지 조정함으로써 수행하었다. 4℃에서 1 시간 동안 교반시킨 후, 이 재료를 12,000 x g에서 60분 동안 원심분리시켰다. 상층액을 80% 암모늄 설페이트로 조정하고 41℃에서 1시간 동안 교반시킨 후, 12,000 x g에서 60분 동안 원심분리시켰다. 펠릿을 10mM Na2·PO4, pH 7.0의 1/10부피 중에 재현탁시키고 동일한 인산염 완층액에 대하여 4t에서 밤새 투석시켰다. 투석된 재료를 이온 교환 크로마토그래피에 앞서 12,000 x g에서 1시간 동안 원심분리시켰다.
HR 16/50 Sepharose(Pharmacia) 음이온 교환 컬럼을 10mNI Na2·PO4, pH 7.0으로 평형시켰다. 원심분리시키고, 투석시킨 암모늄 Sepharose 컬럼에 1.5ml/분의 속도로 가하고 광학적 밀도(O.D.280)이 0.100 미만에 도달할 때까지 평형 완층액으로 3.0ml/분의 속도로 활발하게 세척하였다. 다음에, 0 내지 0.5 M에 걸친 3ml분의 60분 NaCl 구배 또는 60분 동안 각각 0.1M, 0.4M 및 최종적으로 1.0 NaC1을 사용하는 일련의 단계 용출물올 컬럼에 가하였다. 분획들을 모으고 Centriprep 100을 사용하여 농축시켰다. 별법으로, 단백질은 0.l M NaCl을 사용한 사전 용출이 없이 단독의 0.4M에 의해 용출될 수도 있다.
농축된 Q Sepharose 시료의 2ml 분취량을 0.5ml/분의 속도로 10mM Na2 · PO4, pH 7.0으로 평형시킨 HR 16/50 Sepharose 12(Phamacia) 겔 투과 컬럼 상에 부하하였다. 이 컬럼을 동일한 완층액으로 240분 동안 0.5ml분의 속도로 세척하고 2분 시료를 회수하였다. 공 부피의 재료를 수집하고 Centriprep 100을 사용하여 농축시켰다. 농축된 Sepharose 12 시료의 2ml 분춰량을 0.5ml분의 속도로 10mM Na2·PO4, pH7.0으로 평형시킨 HR 16/50 Sepharose 4B-CL(Pharmacia) 겔 투과 컬럼 상에 부하하였다. 이 컬럼을 동일한 완층액으로 240분 동안 0.5ml/분의 속도로 세척하고 2분 시료를 회수하였다.
배제된 단백질 피크는 ∼30kDa 내지 1000kDa의 범위에서 단백질을 분리하는 Sepharose CL-4B 수지를 사용한 겔 투과 컬럼에 적용함으로써 2회째의 분획을 행하였다. 이 분획은 두 개의 피크로 분해되었는데; 공 부피(1000kDa)에서 부수적인 피크 및 약 860kDa의 곁보기 분자량으로 용출되는 주된 피크이었다. 일주일에 걸쳐서 후속 겔 투과된 시료들은 아마도 제한된 단백질 가수분해에 의한 주된피크로부터 형성된 것으로 보이는 세번째 피크(대략 325kDa)의 점진적인 출현을 나타냈다. 이들 3개의 피크에 대하여 수행한 생물학적 시험은 공 피크는 활성이 없는 반면, 860kDa 독소 복합체는 고도로 활성이었고, 325kDa 피크는 아주 강력하긴 하였지만 덜 활성이었음을 나타낸다. 상이한 발효 생산으로부터의 Sepharose CL-4B 독소 복합체 피크의 SDS PAGE 분석은 P 및 S로 표시된 두개의 뚜렸한 펩티드 패턴을 나타냈다. 두 패턴은 그들의 분자량 및 이들의 분획 중의 펩티드성분의 농도에 있어서 현저한 차이를 나타냈다. 가장 빈번하게 생성된 S 패턴은 452개의 고분자량 펩티드(150kDa)를 가진 반면, P 패턴은 3개의 고분자량 펩티드를 가졌다. 또한, S 펩티드 분획은 유럽 옥수수 천공층에 대하여 2-3배 더 높은 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이 이동은 접종물의 연령 및(또는) 오래된 배양물의 성장 변수에 기초한 다른 인자에 기인한 단백질 발현에 있어서 변이에 관련될 수 있다.
P 또는 S 펩티드 패턴으로 결정된 피크 독소 복합체 분획의 밀리그램 정량은 예비 SDS PAGE를 수행하였고, TRIS-글리신(PVDF 멤브레인(ProBlott(등록상표, Applied Biosystems)에 대한 Seprabuff(등록상표)으로 3-4시간 동안 트랜스블롯(transblot)시켰다. 블롯들을 각각 Harvard MicroChem 및 Cambridgen ProChem에 아미노산 분석 및 N-말단 아미노산 서열화를 위해 보냈다. S 패턴에서 3개의 펩티드는 이전의 실시예에서 동정된 서열에 비하여 유일한 N-말단 아미노산 서열을 가졌다. 후술하는 서열 번호 13에 나타낸 201kDa(TcdAｉi) 펩티드는　33% 아미노산 동일성을 공유하였고 서열 번호 1과는 50% 유사성을 나타냈다(TcbAｉｉ)(표 10, 표 10에서 세로선은 아미노산 동일성 및 콜론은 보존적인 아니노산　치환을 나타낸다). 서열 번호 14에 나타낸 197kDa의 두번째 펩티드(TcｄＢ)는 42%　동일성을 가졌고 서열 번호 2(TcaC)와는 58% 상동성을 나타냈다. 세번째 205kDa의 펩티드는 TcdＡｉｉ로 표시하였다. 또한,　235kDa 이상의 펩티드의 서열 번호 16의 제한된 N-말단 아미노산 서열(TcbA)는 서열 번호 1(Tcbii)에 대응하는 추정된 아미노산 서열을 포함하는 클로닝된 유전자(tcbA), 서열 번호 11로부터 추정된 아미노산 서열, 서열 번호 12와 상동성에 있어서 일치하였다. 이는 더 큰 235+kDa 펩티드가 발효 동안 20lkDa 펩티드(TcbAii)(서열 번호 1)로 단백질 가수분해적으로 가공되어 가능하게는 분자의 활성화를 초래함을 나타낸다. 또다른 서열에 있어서 상기 실시예 5에서 보고된 당초 서열 번호 5(TcaBii)로서 보고된 서열은 세번째 위치에서 글리신(Gly) 보다는 아스파르탐산 잔기(Asp) 및 각각 18 및 19 위치에서 두개의 추가의 아미노산 Gly 및 Asp를 함유하는 것으로 나타났다. 다른 두개의 기타서열, 서열 번호 2(TcaC) 및 서열 번호 3(TcaBi)에 있어서, 추가의 아미노산 서열이 얻어졌다. 밀도계 정량분석을 N-말단 분석을 위해 보내졌던 S 제제와 동일한 시료를 사용하여 수행하였다. 이 분석은 201kda 및 197kDa 펩티드가 S 패턴에서 전체 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 단백질의 각각 7.0% 및 7.2%를 나타냈고, 기타 풍부한 펩티드에 유사한 양으로 존재함을 보여주었다. 이들 펩티드들은 다양한 CryI Bt 독소 등의 기타 세균성 독소에서 발견되는 상황과 유사한 단백질 상동성을 나타낼 수 있는 것으로 고려된다. 이들 단백질은 독성 단편을 포함하여 N-말단 아미노산 서열에서 40-90% 까지 상동성이 다양하다.
내부 아미노산 서열화: 독소 펩티드 유전자의 클로닝을 촉진하기 위하여, 선택된 펩티드의 내부 아미노산 서열을 다음과 같이 얻었다. P 또는 S 펩티드 패턴으로 결정된 피크 2A 분획의 밀리그램 정량분석은 예비 SDS PAGE로 수행하였고, TRIS-글리신(PVDF 멤브레인(ProBlott(등록상표, Applied Biosystems)에 대한 Seprabuff(등록상표)으로 3-4 시간 동안 트랜스블롯(transblot)시켰다. 블롯들을 각각 Harvard MicroChem 및 Cambridge ProChem에 아미노산 분석 및 N-말단 아미노산 서열화를 위해 보냈다. TcbAii(서열 번호 1을 포함함), TcdAii및 TcaBi(서열번호 3을 포함함)으로서 언급된 3개의 펩티드들을 Harvard MicroChem에 의해 트립신 분해를 하고 이어서 HPLC 크로마토그래피를 시켜 개별 펩티드들을 분리하였다. N-말단 아미노산 분석은 선택된 트립신형 펩티드 단편 상에 수행하였다. 두개의 내부 팹티드들은 TcaBi-PT111(서열 번호 17) 및 TcaBi-PT79(서열 번호 18)로서 언급된 펩티드 TcaBi(205kDa 팹티드)에 대해서 서열화하였다. 두개의 내부 펩티드들은 TcaBi-PT158(서열 번호 19) 및 TcaBi-PTl08(서열 번호 20)으로서 언급된 펩티드 TcaBi(68kDa 펩티드)에 대해서 서열화하였다. 4개의 내부 펩티드들은 TCBAⅡ-PTl03(서열 번호 21), TcbAii-PT56(서열 번호 22), TcbAii-PT81(a)(서열번호 23) 및 TcbAii-PT81(b)(서열 번호 24)로서 언급된 펩티드 TcbAii(20lkDa 펩티드)에 대해서 서열화하였다.
실시예 8
포토랍두스 루미네센스(균주 W-14) 게놈 DNA의 코스미드 라이브러리 제작 및 독소 단백질 제제로 이루어진 펩티드를 암호화하는 유전자의 단리에 대한 그의 스크리닝
이형의 숙주에서 포토랍두스 곤충 독소 단백질의 생산 및 기타 용도를 위한 전제 조건으로서, 그러한 펩티드를 암호화하는 유전자를 단리하고 특성화하는 것이 필요하다. 이 목적인 동시에 추구된다. 후술하는 한 접근법은 정제된 독소에 대한 모노클로날 클론 또는 폴리클로날 항체의 사용하여 이것을 발현 라이브러리로부터 클론을 단리하는데 사용하는 것에 기초한다. 본 실시예에 기술된 다른 접근법은 N-말단 및 내부의 아미노산 서열 데이터를 사용하여 PCR 증폭에 사용하기 위한 축퇴 올리고뉴클레오티드를 설계하는 것에 기초를 두고 있다. 어느 방법이든 각각의 유전자의 단리 및 이들의 DNA 염기 서열의 결정을 허용하도록 펩티드-암호화 유전자를 함유하는 DNA 클론올 동정하는데 사용될 수 있다.
게놈 DNA 단리: 포토랍두스 루미네셴스 균주 W-14(ATCC 기탁 번호 55397)을 2% 프로테오스 펩톤 #3 아가(Difco Laboratories, 미시간주 디트로이트 소재) 상에 성장시키고, 상기 실시예 1에 기술한 방법을 사용하여 계대 후 반복 생물학적 시험에 의해 유지시켰다. 50ml 진탕 배양물이 2% 프로테오스 펩톤 #3 배지 중의 175ml 배플 플라스크 중에서 생성되었고, 28℃ 및 150rpm으로 대략 24 시간 동안 성장시켰다. 이 배양물 15ml을 펠릿화하고 이를 DNA 단리를 위해 해동시킬 때까지는 그의 배지 중에 -20℃에서 냉동시켰다. 해동된 배양물은 원심분리(700xg, 30분)시키고 부유 오랜지 뮤코폴리사카라이드 물질을 제거하였다. 잔류세포 물질을 원심분리시켜(25,000xg, 15분) 세균 세포를 팰릿화하고, 배지를 제거하여 버렸다.
게놈 DNA를 문헌[Current Protocols in Moleculat Biology, Ausubel et al. eds, John Wiley Sons, 1994의 섹션 2.4.1]에 기술된 CTAB 법(염 쇼크를 포함시키고 모든 부피를 10배 증가하도록 변형시킴)을 채용함으로써 단리하였다. 팰릿화된세균 세포들을 TE 완층액(10mM Ths-HC1, lmM EDTA, pH 8.0) 중에 10ml으로 최종 부피로 재현탁시키고, 이어서 5 M NaCl 12ml을 첨가하였다; 이 혼합물은 15,000 x g에서 20분 원심분리시켰다. 펠릿을 TE 5.7ml 중에서 재현탁시키고, 10% SDS 300ml 및 20mg/ml 프로테이나아제 K(Gibco BRL Products, Grand Island, NY;멸균 증류수 중) 60ml을 현탁액에 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 1시간동안 배양시키고; 이어서 대략 10 mg 라이소자임(Worlington Biochemical Corp., Freehold, NJ)를 첨가하였다. 추가의 45분 후, 5 M NaCL lml 및 CTAB/NaCl 용액(10% w/v CTAB, 0.7 M NaC1) 800ml을 첨가하였다. 이 제제는 65℃에서 10분 동안 배양시키고 이어서 부드럽게 교란시킨 다음 추가로 배양시키고 대략 20분 동안 교란시켜 세포 물질의 정화를 거들었다. 동일 부피의 클로로포름/이소아밀 알코올용액(24:1 v/v)을 첨가하고, 부드럽게 혼합시키고 원심분리시켰다. 동일 부피의 PCI(페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 용액(50:49:1 v/v, l M Tris-HCl, pH 8,0으로 평형시킴; Intermountain Scientific Corporation, Kaysville, UT)로 2회 추출 후, DNA를 이소프로판을 0.6 부피로 침전시켰다. DNA 침전물을 유리 막대로 가볍게 제거하여, 70% 에탄올로 2회 세척하고, 건조시키고, STE 완충액(10mM Ths-HC1 pH 8.0, 10mM NaCl, lmM EDTA) 2ml 중에 용해시켰다. 이 제제물은 260nm의 광학 밀도(즉,O.D260)에 의해 측정된 바 2.5mg/ml DNA를 함유하였다.
단리된 게놈 DNA의 분자량 크기 범위는 라이브러리 제작에 대한 적합성에 대하여 평가하였다. CHEF 겔 분석은 0.5 x TBE 완층액(44.5mM Ths-HCl pH 8.0, 44.5mM H3BO3, lmM EDTA)으로 만든 1.5% 아가로스(Seakem(등록상표) LE, FMC BioProducts, Rockland, ME) 겔 중에서 Pu1sewave 760 Switcher가 구비된 BioRad CHEF-DRⅡ 장치(Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, CA) 상에서 수행하였다. 진행 변수들은 초기 A시간, 3초; 최종 A 시간, 12초; 200 볼트; 진행 온도 4-18℃; 진행 시간, 16.5간이었다. 에치듐 브로마이드 염색 및 자의선 광하에 겔의 검사는 DNA가 길이에서 30-250kbp에 걸침을 나타냈다.
라이브러리의 제작: 부분적인 Sau3A 분해물을 이 포토랍두스 게놈 DNA 제제물로 제조하였다. 이 방법은 상기 Ausbe1의 섹션 3.1.3에 기초하였다. 변형은 거의 최적의 결과가 얻어질 때까지 다양한 조건 하에서 소규모 반응을 진행하는 것을 포함하였다. 변형된 조건을 사용하여 몇및의 확대 규모 반응을 진행시켰으며 결과들을 CHEF 겔 상에서 분석하고, 단지 최상의 확대 규모의 제제를 계속하여 수행하였다. 최적의 경우에 있어서, 포토랍두스 게놈 DNA 200μg을 2ml 전체 부피의 1 X NEB 4 완충액(제조원에 의해 10X로 공급됨) 중에서 Sau3A(New England Biolabs, NEB, Beverly, MA) 1.5 단위를 사용하여 37℃에서 15분 동안 배양시켰다. 반응을 PCI 2ml을 첨가하여 정지시키고 8000 x g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 상층액에 5 M NaCl 200μl 및 빙냉 에탄을 6ml을 첨가하였다. 이 제제를 -20℃에서 30분 동안 급냉시키고, 이어서 12,000 x g에서 15분 동안 원심분리시켰다. 상층액을 제거하고 침전물을 진공 중의 40℃에서 건조시킨 다음 STE 400μl 중에 재현탁시켰다. 분광광도케 분석은 투입 DNA의 약 40% 회수율을 나타냈다. 분해된 DNA를 CPMB(인용 문헌 참조)의 섹션 5.3.2에 따라 수크로스 구배 상에서 크기 분획화하였다. 10% 내지 40%(w/v) 선형 수크로오스 구배를 Ultra-Clear(등록상표) 튜브(Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) 중의 구배 마커를 사용하여 제조하고 DNA 시료를 상부에 위치시켰다. 원심분리(26,000rpm, 17 시간, Beckman SW41 로타, 20℃) 후, 분획둘(약 750μl)을 구배의 상부로부터 꺼내어 상기한 바의 CHEF 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 크기 범위 20-40kbp의 Sau3A를 포함하는 분획들을 선별하고 DNA를 상기 Ausbel의 섹션 5.3.3의 방법을 수정(모든 용액의 양을 대략 6.3배로 증가시킴)함으로써 침전시켰다. 철야 침전 후, DNA를 원심분리(17,000 x g, 15분)에 의해 회수하고, 건조시키고, TE 중에 재용해시키고,80μl의 최종 부피로 모은 다음, 3 M 쇼듐 아세테이트 8μl 및 에탄올 220μl을 첨가하여 재침전시켰다. 상기한 바와 같이 원심분리에 의해 회수한 펠릿을 TE 12μl 중에 재현탁시켰다. DNA의 농축물은 Hoefer TKO100 플루오로메터(Hoefer Scientific Instnlments, 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)에서 Hoechst 33258 염료(Polyscience, Inc., Warrington, PA) 형광분석기에 의해 결정하였다. 대략 2.5 μg의 크기 분획된 DNA가 회수되었다.
코스미드 pWE15 DNA(Stratagene, 캘리포니아주 라졸라 소재) 30μg을 제조원의 완층액(최종 부피 200μl, 37℃, 1시간) 중의 제한 효소 BamH l(NEB)100 단위를 사용하여 분해를 완료하였다. 반응물을 PCI 100μl로 추출하고 DNA를 3M 소듐 아세테이트 및 -20℃ 무수 에탄올 550μl을 첨가하여 수충으로부터 침전시켰다. -70℃에서 20분 후, DNA를 원심분리(17,000xg, 15분)에 의해 회수하고 진공하에 건조시키고, 10mM Ths-HCl, pH 8.0 180μl 중에 용해시켰다. 여기에 10 X CIP 완층액(10mM Tris-HCl, pH 8.3; 10mM ZnC12; 10mM MgC12) 20μl 및 1:4 희석 송아지 장 알칼린 포스파타아제(Boeringer Mannheim Corporation, Indianapohs, IN) 1μl∼(0.25 단위)을 첨가하였다. 37℃에서 30분 후, 다음을 첨가하였다: 0.5M EDTA 2μl pH 8.0, 10% SDS 10μl 20mg/ml 프로테이나아제(상기함) 0.5μl. 이어서, 55℃에서 30분 동안 배양시켰다. PCI 100μl 및 페늘(Intemountain Scientific Corporation, lM Tris-Hc1, pH 8.0으로 평형시킴) 100μl을 사용하여 추출한 후, 탈인산화된 DNA를 7.5 M 암모늄 아세테이트 72μl 및 -20℃ 에탄올 550μl을 첨가하여 침전시키고, 30분 동안 얼음 상에서 배양시키고 상기한 바와 같이 원심분리시켰다. 펠릿화된 DNA를 -20℃ 70% 에탄올 500μl 1회 세척하고, 진공 중에서 건조시키고 TE 완충액 20 중에 용해시켰다.
크기 분획화된 Sau3A 단편의 BamH1-분해 및 인산화된 pWE15 벡터에 대한 라이게이션은 Ausbe1 섹션 3.33의 프로토콜을 변형시킴으로써(즉, 제조원에 의해 공급된 미리 혼합한 10 X 라이게이션 완층액을 사용함) T4 리가아제를 사용하여 수행하였다. 라이게이션은 20μl의 전체 부피 중에 15℃에서 밤새 수행한 후 -20℃에 저장하였다.
DNA 약 1μl을 함유하는 코스미드 DNA 라이게이션 반응물 4μl을 상업상의 패키징 추출물(Gigapack(등록상표) III Gold Packaging Ectract, Stratagene)을 사용하여 제조원의 지시에 따라서 박테리오파아지 람다 내에 패키징시켰다. 패키징된 제조물을 사용할 때까지 4℃에 저장하였다. 패키징된 코스미드 제조물은 다음과 같이(Gigapack(등록상표) III Gold 프로토콜(Titering the cosmid Library)에 따라서 대장균 XL1 Blue MR 세포(Stratagene)을 감염시키는데 사용하였다. XL1 Blue MR 세포를 0.2%(w/v) 말토오스 및 10mM MgSO4를 함유하는 LB 배지(glL: 박토-트립톤, 10; 박토-이스트 엑스, 5; 박토-아카, 15, NaC1, 5(Difco Laboratohes, Detroit, MI) 중의 37℃에서 성장시켰다. 5시간 성장 후, 세포들을 700xg(15분)으로 펠릿화하고 10mM M9SO46ml 중에 재현탁시켰다. 배양 밀도는 10mM M6SO4를 사용하여 OD600=0.5까지 조정하였다. 패키징된 코스미드 라이브러리를 멸균 SM 배지(0.lM NaC1,10mM MgSO4, 50mM Ths-HC1 pH 7.5, 0.01% w/v 젤라틴)를 사용하여 l:10 또는 1:20으로 희석시키고 회석된 제제 25μl를 희석된 XLl Blue MR 세포 25μl과 혼합하였다. 이 혼합물을 25℃에서 30분 동안 진탕없이 배양시키고 이어서 LB 브로쓰 200μl을 첨가하고 배양을 간혹 가볍게 진탕시키 면서 대략 1 시간 동안 계속하였다. 이 배양물의 분취량(20-40μl)을 100mg/ml 앰피실린(즉, LB-Amp100)을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 뿌리고, 37℃에서 밤새 배양시켰다. 증폭이 없는 라이브러리를 저장하기 위하여, 단일 콜로니를 뽑아서 멸균 96-웰 마이크로웰 플레이트의 개별 웰 내로 접종하였으며, 각각의 웰은 75μl의 Terrific Broth(TB 배지: 12g/l 박토-트립톤, 24g/l 박토-이스트 엑스, 0.4% v/v 글리세롤, 17mMkH2PO4, 72mMk2HPO4) 및 100mg/ml 앰피실린(즉, TB-Amp100)을 함유하였으며, 진탕없이 37℃에서 밤새 배양시켰다. 96-웰 플레이트를 복제 플레이트 내로 복제한 후, 여과 멸균된 TB: 글리세롤(1:1, v/v:100 mg/ml 앰피실린을 포함하거나 또는 포함하지 않음)의 75μl/웰을 플레이트에 첨가한 후, 이를 100rpm, 37℃에서 재빨리 진탕시킨 후, 이어서 Parafilm(등록상표)(American National Can, Greenwich, CT)로 밀봉하고 -70℃ 냉동기 내에 위치시켜 저장하였다. 복제 플레이트를 마스터 플레이트에 동일하게 성장시키고 처리하였다. 총 40개의 그러한 마스터 플레이트(및 이들의 복제품)이 제조되었다.
방사성표지된 DNA 프로브를 사용한 라이브러리의 스크리닝: 방사성 동위원소로 표지된 프로브를 사용하여 프로브시키기 위한 콜로니 필터를 제조하기 위하여, 라이브러리의 96-웰 플레이트를 25℃에서 해동시켰다(실온에서 벤취 톱), 96 프롱(prong)을 가진 복제 플레이팅 도구를 사용하여 TB-Amp100dml 75μl/웰을 포함하는 새로운 96-웰 복제 플레이트를 접종시켰다. 복제 플레이트를 37℃에서 밤새(고정시킴) 성장시키고, 이어서 37℃에서 약 30분 동안 100rpm으로 진탕시켰다. 일부 단리물의 비정상에 기인하여 총 800개의 콜로니가 이들 복제 플레이트에서 나타났다. 복제 도구를 사용하여 생물 분석 플라스틱 접시(Nunc, 243 x 243 x 18mm; Curtin Mathison Scientific, Inc., Wood Dale, IL)중의 고체 LB-Amp100(100ml/접시)상에 위치된 Magna NT(MSI, Westboro, MA) 나일론 멤브레인(0.45 미크론, 220 x 250MM) 상에 96-웰 어레이의 복제 함침부를 접종시켰다. 이 콜로니들을 37℃에서 약 3시간 동안 멤브레인 상에서 성장시켰다.
양성 대조군 콜로니(GZ4 서열 삽입물을 함유하는 세균 콜로니, 이하 참조)들은 35mg/l 클로람페니콜을 보충한 LB 배지(즉, LB-Cam35) 상의 개별적인 Magna NT 멤브레인(Nunc, 0.45 미크론, 82mm원) 상에서 성장시키고, 라이브러리 콜로니 멤브레인 측면에 나란히 처리하였다. 멤브레인 상의 세균 콜로니들을 Genius(등록상표) 시스템 사용자 가이드 버젼 2.0(Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN)으로부터 취한 프로토콜에 따라 용해시키고 DNA를 변성시키고 중화시켰다. 멤브레인들을 0.5 N NaOH 및 1.5 M NaCl로 적신 여과지 상의 콜로니 측면에 15분 동안 위치시켜 변성시키고, lM Ths-HC1 pH 8.0, 1.5 M NaCl로 적신여과지 상에 15분 동안 중화시켰다. 자동 가교(crosslink)로 설정해 놓은 Stratagene UV Stratalinker를 사용하여 UV 가교를 시킨 후, 멤브레인들을 25℃에 사용할 때까지 저장하였다. 멤브레인들을 단일 96-웰 플레이트의 복제 함침부를 함유하는 스트립으로 다듬은 후, CPMB(문헌 참조)의 섹션 6.4.1의 방법에 의해 대 규모로 세척하고(3X SSC, 0.1%(w/v) SDS 중의 25℃에서 3시간에 이어서, 동일 용액 중에서 65℃에서 1시간), 이어서 하이브리드화 단계용 제제(20 X SSC =3M NaC1, 0.3M 소듐 시트레이트, pH 7.0) 중의 2 X SSC 중에서 헹구었다.
tcaC 유전자의 특정 게놈 단편의 증폭: 정제된 Tcac 펨티드 단편에 대해 결정된 N-말단 아미노산 서열(본 명세서에 서열 번호 2로서 기재함)에 기초하여, 축퇴 올리고뉴클레오티드의 풀(poo1 S4Psh)를 Applied Biosystem ABI394 DNA/RNA 합성기(Perkin Elmer, Foster City, CA) 상의 가닥 β-시아노에틸 화학에 의해 합성하였다. 이 올리고뉴클레오티드들을 55℃에서 8시간 동안 탈보호시키고, 물 중에 용해시키고, 분광광도계 측정에 의해 정량화하고, 희석하여 사용하였다. 이 풀은 TcaC 팹티드의 결정된 N-말단 아미노산 서열에 해당한다. 결정된 아미노산 서열 및 대응하는 축퇴 DNA 서열은 이하에 나타냈고, 여기서 A, C, G 및 T는 표준 DNA 염기이고, I는 이노신을 나타낸다.
또다른 세트의 축퇴 올리고뉴클레오티드를 합성하였으며(poo1 P2.3.5R), 서열 번호 17의 결정된 아미노산 서열에 대한 암호화 가닥의 상보체를 나타낸다:
이들 뉴클레오티드들은 풀리머라제 사슬 반응(PCT(등록상표, Roche Molecular System, Branchburg, NJ)에 사용하여 포토랍두스 균주 W-14로부터 제조된 게놈 DNA로부터의 특정 DNA 단편(상기 함)을 증폭시켰다. 대표적인 반응물(50μl)은 각 프라이머 풀 P2Psh 및 P2.3.5R 125pmo1, 게놈 주형 DNA 253ng, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 10pmo1, 1X GeneAmp(등록상표) PCR 완층액 및 AmpTaq(등록상표) 2.5 단위(이 모두는 Roche Molecular Systems로부터 시판됨; 10X GeneAmp(등록상표) 완층액은 100mM THs-HC1 pH 8.3, 500mMkC1, 0.01% w/v 젤라틴을 함유하였다). 증폭은 Perkin Elmer Cetus DNA Thernn1 Cycler(Perkin Elmer, Foster City, CA) 중에서 94℃(1.0분), 55℃(2.0분), 72℃(3.0분)의 35주기에 이어서 72℃에서 7.0분의 확장 기간을 사용하여 수행하였다. 증폭 절차는 TEA 완층액(40mM Tris-아세테이트, 2mM EDTA, pH 8.0) 중에서 2% w/v NuSieve(등록상표) 3:1 아가로스(FMC BioProducts)를 통한 전기영동에 의해 분석하였다. 추정 크기 250bp의 특정 생성물이 에치듐 브로마이드(0.5μg/ml) 염색 및 자외선 광 하의 검사에 의해 기타 증폭 생성물 중에서 관찰되었다.
대략 250bp 생성물을 함유하는 겔의 영역을 자르고, 작은 플러그(0.5mm 직경)을 제거하여 PCR 증폭(40 사이클)에 대한 주형을 공급하는데 사용하였다. 반응물(50μl)은 게놈 주형 DNA를 빼고는 상기와 동일한 성분을 함유하였다. 증폭 다음, 단편들의 말단올 평활말단이 되게 하고 25℃에서 20분 동안 T4 DNA 리가아제(NEB), lnmol ATP 및 T4 키나아제(Phanmacia Biotec Inc., Piscataway, NJ) 2.15 단위를 사용하여 배양시킴으로써 인산화시켰다.
DNA 단편들을 TEA 중의 1% GTG(등록상표) 아가로스(FMC)를 통해 전기영동시킴으로써 잔여 프라이머로부터 분리하였다. 곁보기 크기 250bp의 단편을 함유하는 겔 슬라이스를 자르고, DNA를 Qiaex 킷(Qiaex Inc., Chatsworth, CA)를 사용하여 추출하였다.
추출된 DNA 단편들을 제한 효소 Sma 1으로 분해를 완료한 후 상기 pWE15DNA에 대해 기술한 바와 유사한 방식으로 추출한 플라스미드 벡터 pBCkS(+)(Stratagene)에 라이게이션시켰다. 대표적인 라이게이션 반응물(16.3μl)은 1X 라이게이션 완충액(50mM Ths-HC1, pH 7.4; 10mM MgCl2; 10mM 디티오트레이톨; 1mM 스퍼미딘, lmM ATP; 100mg/ml 소 혈청 알부민) 중에 분해된 pBCkS(+) DNA 100ng, 250bp 단편 DNA 70ng, lnmo1[Co(NH3)6Cl, 및 T4 DNA 리가아제(Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) 3.9 Weiss 단위를 포함하였다. 14℃에서 밤새 배양시킨 후, 라이게이션된 생성물을 공급자의 지침에 따라서 얼린, 컴피턴트 대장균 DH5α 세포(Gibco BRL) 내로 형질전환시키고, IPTG l19μg/ml 및 X-ga1 50μg/ml을 함유하는 LB-Cam35플레이트 상에 위치시켰다. 독립적인 백색 콜로니들을 뽑아서 플라스미드 DNA를 변형된 알칼린-용해/PEG 침전법[PRISM(등록상표) Ready Reaction DyeDeoxy(등록상표) Terminator Cycle Sequencingkit Protocols; ABIPerkin Elmer]에 의하여 제조하였다. 삽입 DNA의 두 가닥의 뉴콜레오티트 서열을 T7 프라이머[pBCkS(+) 염기 601-623: TAAAACGACGGCCAGTGAGCGCG] 및 LacZ 프라이머 [pBCkS(+) 염기 792-816: ATGACCATGATTACGCCAAGCGC GC) 및 PRlSM(등록상표) 서열화 킷[ABI/Perkin Elmer]와 함께 제공된 프로토콜을 사용하여 결정하였다. 비혼입된 염료 종결인자 디데옥시리보뉴클레오티드들은 제조원의 지시에 따라 Centri-Sep 100컬럼(Princeton Separation, Inc., Adelphia, NJ)을 통해 통과시킴으로써 제거하였다. DNA 서열은 ABI 모델 373A DNA 서열화기(ABI/Ped(in Elmer) 상에 시료를 분석함으로써 얻었다. 두 단리물, GZ4 및 HB14의 DNA 서열은 도 1에 설명된 바와 같이 발견되었다.
이 서열은 다음의 특성들을 나타내었다: i) 염기 1-20은 S4Psh 축퇴 올리고 뉴클레오티드의 64개의 가능한 서열 중 하나를 나타내었고, ii) 아미노산 서열 1-3 및 6-12의 서열은 TcaC(서열 번호 2에 기술됨)의 N-말단의 것에 정확히 대응하였고, iii) 암호화된 네번째 아미노산은 세린 보다는 시스테인이었다. 이 차이는 세린코돈에 대한 축퇴 내에서 암호화된다(상기 참조), iv) 다섯번째 아미노산은 프롤린으로, 서열 번호 2에 주어진 TcaC N-말단 서열에 대응하고, v) 염기 257-276은 축퇴 풀 내로 디자인된 192 개의 가능한 서열 중 하나를 암호화하고, vi) 염기 268-270에서 도입된 TGA 종결 코돈은 대응하는 위치에서 뉴클레오티드 풀 내로 조립된 축퇴에 상보성의 결과이며, 대응 유전자에 대한 짧아진 해독 프레임을 제공하지 않는다. TcaC 펩티드 유전자-특이성 프로브의 표지화: 상기 276 염기에 대응하는 DNA 단편들을 P2Psh 및 P2.3.5R 프라이머 각각 100 pmol, 주형으로서 플라스미드 GZ4 또는 HB104 10 ng, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 20 pmo1, AmpliTaq(등록상표) DNA 폴리머라제 5 단위 및 1X 농도의 GeneAmp(등록상표)를 상기한 바와 동일한 온도 관리 하에서 PCR(등록상표)에 의해 100μl 반응 부피로 증폭시켰다(35주기). 증폭 생성물은 Qiaex 킷에 의해 1% GTG(등록상표) 아가로스 겔로부터 추출하고 형광계에 의해 정량화하였다.
플라스미드 HB14 주형(대략 400ng)으로부터 추출된 증폭 생성물을 5개의 분취량으로 나누고 High Prime Labeling Mix(Boehringer Mannheim)을 사용하여 제조원의 지시에 따라서32P-dCTP로 표지시켰다.
비혼입된 방사성 동위원소들은 제조원의 지시에 따라 NucTrap(등록상표) 프 로브 정제 컬럼(Stratagene)올 통해 통과시킴으로써 제거하였다. 표지된 DNA 생성물의 특이 활성은 액체 섬광계수에 의해 측정하여 3.11 x l08dpm/μg으로 나타났다. 이 표지된 DNA는 게놈 라이브러리의 800 원으로부터 제조된 멤브레인을 프로브시키는데 사용하였다.
TcaC-펩티드 유전자 특이성 프로브를 사용한 스크리닝: 방사성 표지된 HB14 프로브를 대략 10분 동안 비등시키고, 이어서 minimal hyb 용액에 첨가하였다.[주:mininnl hyb 방법은 CERES 프로토콜; Restriction Fragment Length Polymorphism Laboratory Manua1 버젼 4.0, 섹션 4-40 및 4-47; CERES/NPI, Salt Lake City, UT로부터 취한 것이다. NPI는 현존하지 않고, 그의 승계인이 Linkage Genetics로서 경영하고 있음. ''Minimal hyb 용액은 10% w/v PEG(폴리에틸렌글리콜), 분자량 대략 8000),7% w/v SDS; 0.6X SSC,10mM 인산 나트륨 완충액(95g/l NaH2PO4·lH2O, 및 84.5g/l Na2HPO4·7H2O, 5mM EDTA 및 100mg/ml 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 1M 원액으로부터의)을 함유한다. 멤브레인들을 신속하게 지압 건조시키고, 이어서 전하이브리드화 엾이 멤브레인의 5스트립을 ''mininnl hyb'' 75ml 및 방사성 표지된 HB4 프로브 2.6ng/ml을 함유하는 2개의 플라스틱 상자 각각에 위치시켰다. 이들을 60℃에서 서서히 진탕시키면서(50rpm) 밤새 배양시켰다. 필터를 각각 25℃에서 ''minimal hyb 용액(0.25X SSC, 0.2% SDS) 중에 대략 10 분동안 3회 세척하고, 이어서 동일 용액 중의 60℃에서 서서히 진당시키면서 30분 세척시켰다. 필터들을 차광 방사선그래픽 카셋트 중에서 Saran Wrap(등록상표)(Dow Brands, Indiamapolis, IN)으로 덮힌 종이 상에 위치시키고, 두개의 DuPont Cronex Lightening-P1us C1 인헨서(Signn Chemical Co., St. Louise, MO)를 가진 X-Omat X-선 필름(Kodak, Rochester, NY)에 -70℃에서 4시간 동안 노출시켰다. 현상시(표준 사진 공정), 중요한 신호들이 약하고, 더욱 불규칙적인 신호 중에서 두 복제물에 있어서 두드러졌다. 12개의 가능한 양성들이 복제96-웰 콜로니 함침부의 모두에서 강한 신호에 기인하여 확인되었다. 음성 대조군 멤브레인(pWE15를 함유하는 XLl Blue MR 세포)은 신호가 나타나지 않았고, 매우 강한 신호가 동시에 실험적인 시료를 소유하였던 양성 대조군 멤브레인(PCR 생성물의 GZ4 단리물을 함유하는 DH5α세포)에서 나타났다.
12개의 추정되는 하이브리드화-양성 콜로니들을 동결된 96-웰 라이브러리플레어트로부터 회복시켜서 LB-Amp100배지 중에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 이어서 이들을 고상 LB-Amp100상에 패치(patch)시켰다(3/플레이트, +3 음성 대조군: pWE15 벡터를 함유하는 XL Blue MR 세포). 두 세트의 멤브레인(Magna NT 나일론, 045 미크론)을 하이브리드화용으로 제조하였다. 처음의 세트는 필터를 패치 플레이트 상의 콜로니 상에 직접 위치시키고 이어서 이것을 부착 세균 세포와 함께 제거하고 아래와 같이 처리함으로써 제조하였다. 두번째 세트의 필터들은 LB-Amp100을 포함하는 플레이트 상에 위치시키고, 이어서 패치 플레이트로부터 필터 상으로 세포들을 이동시킴으로써 접종하였다. 37℃에서 밤새 성장시킨 후에, 필터들을 플레이트로부터 제거하여 처리하였다.
필터 상의 세균 세포들을 용해시키고 각 필터 콜로니-사이드-업(side-up)을 플라스틱 플레이트 중에서 0.5N NaOH의 풀(1.0ml 상에 3분 동안 위치시킴으로 써 변성시켰다. 필터들을 종이 타월 상에서 지압 건조시키고, 이 공정을 신선한 0.5N NaOH로 반복하였다. 지압 건조시킨 후, 필터들을 각각을 1M Ths-HC1 pH 7.5의 1.0ml 풀 상에 3분 동안 위치시킴으로써 중화시키고, 지압 건조시키고, 신선한 완충액으로 재생시켰다. 다음에 0.5M THs-HC1 pH 7.5 및 1.5M NaC1의 풀 상에 두 유사한 침지(각각 5분)을 후속적으로 수행하였다. 지압 건조 후, DNA를 상기한 바와 같이 자외선 가교시키고, 필터들을 3 X SSC 및 0.1%(w/v) SDS 약 100ml 중에 세척(25℃, 100rpm)하였다(4회, 매회 세척에 대해 새로운 용액으로 각각 30분). 이어서, 이들을 예비 하이브리드화 용액(6X SSC 및 Fico11 400(Phamaacia), 폴리비닐피롤리돈(평균 분자량 360,000; Sigma) 및 소혈청 알부민 단편 V;(Sigma) 각각 1% w/v)의 최소 부피 중에 65℃에서 2시간 동안 위치시켰다. 예비 하이브리드화용액을 제거하고 라이브러리 멤브레인의 이전 하이브리드화로부터 저장되었고, 95℃ 에서 5분 동안 변성시킨 HB10432P-표지된 프로브로 대체하였다. 하이브리드화는 60℃에서 16시간 동안 50rpm으로 진탕시키면서 수행하였다.
표지된 프로브 용액의 제거에 이어서, 멤브레인들을 3X SSC 중에서 25℃(50rpm, 15 분)에서 3회 세척하였다(매회 세척시 약 150ml). 이어서 이들을 0.25X SSC 및 0.2% SDS(minimal hyb 세척 용액) 중에서 68℃에서 3시간 동안(50rpm) 세척하고, 상기한 바와 같이 25℃에서 1.5시간 동안 X-선 필름에 노출시켰다. 이 노출은 코스미드 단리물 22G12, 25A10, 26A5 및 26B10에 대한 매우 강한 하이브리드화 신호를 나타냈고, 코스미드 단리물 8B10에 대한 매우 약한 신호를 나타냈다. 음성대조군(pWE15) 콜로니에서는 신호가 나타나지 않았고, 매우 강한 신흐가 동시에 실험적인 시료를 소유하였던 양성 대조군 멤브레인(PCR 생성물의 GZ4를 함유하는 DH5α 세포)에 나타났다.
tcaB 유전자의 특정 게놈 단편의 증폭: 정제된 TcaBi펩티드 단편에 대해 결정된 N-말단 아미노산 서열(본 명세서에 서열 번호 3로서 기재함)에 기초하여, 축퇴 을리고뉴클레오티드의 풀(poo1 P8F)를 팹티드 Tcac에 대해 기술한 바와 같이 합성하였다. 결정된 아미노산 서열 및 대응하는 축퇴 DNA 서열은 이하에 나타냈고, 여기서 A, C, G 및 T는 표준 DNA 염기 이고, I는 이노신을 나타낸다.
또다른 세트의 축퇴 올리고뉴클레오티드를 합성하였으며(poo1 P8.108.3R), TcaBi-PT108 내부 팹티드(서열 번호 20)의 결정된 아미노산 서열에 대한 암호화 가닥의 상보체를 나타낸다:
이들 올리고뉴클레오티드들은 HotStart 50 Tubes(등록상표)(Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 PCR(등록상표)용 프라이머로서 사하여 포토랍두스 균주 W-14로부터 제조된 게놈 DNA로부터의 특정 DNA 단편(상기 함)을 증폭시켰다. 대표적인 반응물(50μl)은(바닥층) 1X GeneAmp(등록상표) PCR 완충액 중의 각 프라이머 풀 P8F 및 P8.108.3R 25 pmo1, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 2 nmol을 함유하였고,(상부층) 1X GeneAmp(등록상표) PCR 완충액 중의 게놈 주형 DNA 230 ng, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 8nmo1, 및 AmpTaq(등록상표) DNA 폴리머라제 2.5 단위를 함유하였다. 증폭은 TCaC 펩티드에 대해 기술한 바와 같이 35주기로 수행하였다. 증폭 생성물은 TEA 완층액 중의 0.7% w/v SeaKem(등록상표)(FMC)를 통한 전기영동에 의해 분석하였다. 추정크기 1600bp의 특정 생성물이 관찰되었다.
4개의 그러한 반응물을 모으고, 증폭된 DNA를 상기 TcaC 펩티드에 대해 기술한 바와 같이 Qiaex 킷에 의해 1.0.% SeaKem(둥록상표) LE 아가로스(FMC)를 통해 전기영동시켰다. 추출된 DNA를 P8F 및 P8.108.3R 프라이머 풀을 사용하여 서열 결정용 주형[PRISM(등록상표) 서열화 캣으로 직접 사용하였다. 각각의 반응물은 약 100ng 주형 DNA 및 한 프라이머 풀 25pmol을 함유하였고, TcaC 펩티드에 대해 기술한 바와 같은 표준 프로토콜에 따라서 처리하였다. P8F 프라이머의 연장으로부터 유도된 서열의 분석은 서열 번호 3(TcaBi)의 N-말단 펩티드 서열의 일부에 대응하는 짧은 DNA 서열(및 암호화된 아미노산 서열)을 나타냈다:
TcaBi펩티드 유전자-특이성 프로브의 표지화:
겔-정제된 TcaBiDNA 단편 대략 50ng을 상기한 바와 같이32P-dCTP로 표지시키고, 비혼입된 방사성 동위원소들은 NICK 컬럼(등록상표)을 통해 통과시킴으로써 제거하였다. 표지된 DNA의 특이 활성은 6x109dpm/μg으로 측정되었다. 이 표지된 DNA는 TcaC-펩티드 특이성 프로브에 하이브리드화된 게놈 라이브러리의 원들로부터 제조된 콜로니 멤브레인을 프로브시키는데 사용하였다.
TcaC-프로브 라이브러리 스크린(상기 참조)에서 동정된 12개의 콜로니를 함유하는 멤브레인을 0.1X SSC 및 0.1% SDS 1ℓ 중에서 매회 대략 30분 동안 2회 비등시킴으로써 방사성 TcaC-특이성 표지의 스트리핑시켰다. 방사성 표지의 제거는 6시간 필름 노출시켜 체크하였다. 이어서 스트리핑된 멤브레인은 상기에서 제조한 TcaBi팹티드 특이성 프로브로 배양시켰다. 표지된 DNA를 10 분 동안 비등시킴으로써 변성시키고, 이어서 ''minimal hyb'' 용액 100ml 중에서 60℃, 1 시간 동안 배양시킨 필터에 첨가하였다. 이 온도에서 철야 하이브리드화시킨 후, 프로브 용액을 제거하고, 여액을 다음과 같이 세척하였다(모두 0.3X SSC 및 0.1% SDS 중에 서):25℃에서 5분 동안 1회, 새로운 용액 중에서 60℃에서 1시간 동안 1회, 및 새로운 용액 중에서 63℃에서 1시간 동안 1회. 표준 방법에 의해 1.5시간 동안 X-선 필름에 노출시킨 후,4 개의 강하게 하이브리드화되는 콜로니가 관찰되었다. 이들은 TcaC-특이성 프로브와 마찬가지로 단리물, 22G12, 25Al0, 26A5 및 26B10이었다.
상기 TcaBi프로브 용액을 동일 부피의 minimal hyb 용액(약 100ml)로 희석하고, 이어서 게놈 라이브러리의 800 원을 함유하는 멤브레인들을 스크리닝하는 데 사용하였다. 상기한 바와 같이 하이브리드화, 세척, 및 X-선 필름에의 노출 후, 단지 4개의 코스미드 클론 22G12, 25Al0, 26A5 및 26B10이 이 프로브에 강하게 하이브리드화되는 것으로 밝혀졌다.
TcaC 및 TcaBi펩티드를 암호화하는 유전자를 함유하는 섭클론의 단리 및 그의 DNA 염기 서열의 결정: 균주 XL1 Blue MR 중의 3개의 하이브리드화-양성 코스미드들을 TB-Amp100중에서 30℃에서 밤새 진탕(200rpm)시키면서 성장시켰다. 세포들을 원심분리에 의해 수확한 후, 코스미드 DNA를 제조원의 프로토콜에 따라서 상업적으로 입수 가능한 킷(BIGprep(등록상표), 5 PHme 3 Prime, Inc., Boulder, CO)를 사용하여 제조하였다. 단 하나의 코스미드, 26A5가 이 절차에 의해 성공적으로 단리되었다. 제한 효소 EcoR l(NEB)로 분해하고 전기영동에 의해 분석 했을 때, 대략적인 크기 14,10,8(벡터), 5, 3.3, 2.9 및 1.5kbp의 단편들이 검출되었다. 동일한 3개의 균주(8ml 배양물; TB-Amp100, 30℃)로부터 코스미드 DNA를 단리하려는 두번째 시도는 boiling miniprep 방법[Evans G. and G. Wahl., 1987, ''Cosmlid vectors for genomic walking and rapid restriction mapping. in Guide to Molecular Cloning Techniques. Meth. Enzymology, Vol. 152, S. Breger and A.kimmel, eds., pgs.604-610]을 이용하였다. 단 하나의 코스미드, 25A10이 이 방법에 의해 성공적으로 단리되었다. 제한 효소 EcoR l(NEB)로 분해하고 겔 전기영동에 의해 분석했을 때, 이 코스미드는 코스미드 26A5에서 이전에 나타났던 것과 동일한 단편화 패턴을 나타냈다.
26A5 코스미드 DNA의 0.15μg 시료를 공급자의 프로토콜에 따라 대장균 DH5α(Gibco BRL) 50ml을 형질전환시키는데 사용하였다. 그 균주의 단일 콜로니 단리물을 TB-Amp100, 4ml 중에 접종시키고 37℃에서 8시간 동안 성장시켰다. 클로람페니콜을 최종 농도 225μg/ml로 첨가하고 배양을 추가로 24시간 동안 계속한 후, 이어서 세포들을 원심분리에 의해 수확하고, -20℃에 동결시켰다. 26A5 코스미드 DNA의 단리는 표준 알칼린 라이시스 miniprep(Maniatis et al., 문헌 참조, p.382)을 모든 부피를 50% 증가시키고, 모든 단계에서 와동시키기 보다는 교반하거나 또는 가볍게 혼합시킴으로써 변형시킨 것이었다. DNA 펠릿을 70% 에탄올 중에 세척한 후, 이것을 25μg/ml 리보뉴클레아제(Boehringer Mannheim)을 포함한 TE 중에 용해시켰다.
GZ4-유도 및 TcaBi-프로브에 하이브리드화되는 EcoR1 단편의 동정: 25Al0 코스미드(XL1 Blue MR 세포) 대략 0.4μg 및 코스미드 26A5(클로람페니콜-중폭된 DH5 α 세포로부터의) 약 0.5μg을 각각 EcoR 1(NEB) 약 15 단위로 85분 동안 분해하고, 밤새 동결시키고, 이어서 65℃에서 5분 동안 가열시키고, 0.7% 아가로스겔 중에서 전기영동시켰다(Seakem(등록상표) LE, 1X TEA, 80 볼트, 90분). DNA를 상기한 바와 같이 에치듐 브로마이드로 염색시키고 자외선 광 하에 사진을 찍었다. 코스미드 25Al0의 EcoR 1 분해물은 완전히 분해된 것이었으나, 코스미드 26A5의 시료는 이들 조건 하에서 단지 부분적으로 분해되었다. DNA 단편을 함유하는 아가로스 켈을 탈퓨린화하고, 변성시키고 재생시킨 다음, 고염(20X SSC) 프로토콜을 사용하여 모두 Ausubel et al(CPMB, 문헌 참조)의 섹션 2.9에 기재된 바와 같이 Magna NT 나일론 멤브레인 상에 써든 블로팅시켰다. 이어서 전이된 DNA들은 상기한 바와 같이 나일론 멤브레인에 UV-가교시켰다.
플라스미드 단리물 GZ4의 삽입체에 대응하는 TcaC-팹티드 특이 DNA 단편을 상기한 바와 같은 100 m1 반응 용량 중에서 PCR에 의해 증폭하였다. 3회의 상기 반응으로부터의 증폭 생성물을 모아서 상기한 바와 같이 Qiaex 키트에 의해 1% GTG(등록상표) 아가로스 겔로부터 추출하고 형광계로 정량하였다. 겔 정제된 DNA 100ng을 상기한 바와 같이 High Prime Labeling Mix(뵈링거 만하임사 제)를 사용하여32p-dCTp로 6.34 x108dpm/μg의 특이 활성으로 표지하였다.
32P-표지된 GZ4 프로브를 10분 동안 비등시킨 후 ''최소 히브(minimal hyb) 완층액 1ng/m1에 첨가하고 분해된 코스미드 DNA 단편을 포함하는 써든 블롯 막을 첨가하고 50rpm에서 부드럽게 교반하면서 60℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이어서, 막을 25℃에서 각각 약 5분 동안 3회 세척한 후(최소 히브 세척 용액), 60℃에서 각각 30분 동안 2회 세척하였다. 블롯을 -70℃에서 약 30분 동안(인핸서 스크린과 함께) 필름에 노출시켰다. GZ4 프로브는 2개의 코스미드 26A5 및 25A10의 5.0kbp(외관상 크기) EcoR 1 단편에 강하게 하이브리드화하였다. 막을 0.1X SSC + 0.1% SDS 중에서 약 30분 동안 비등시켜 방사성을 제거하고 막에 노출시켜 방사성 표지를 조사하였다. 이어서, 상기 콜로니 막의 스크리닝에 사용된 최소 히브 완층액 중에서(변형) TcaBi프로브와 60℃에서 3.5시간 동안 하이브리드화시키고, 상기한 바와 같이 세척하고 2개의 인핸서 스크린과 함께 -70℃에서 40분 동안 필름에 노출시켰다. 2개의 코스미드를 사용할 때 TcaBi프로브는 약 5.0kbp EcoR 1 단편과 약하게 하이브리드화하고 약 2.9kbp의 단편과는 강하게 하이브리드화하였다.
(DH5α 세포로부터) 상기한 코스미드 26A5 DNA의 시료를 목적 밴드를 서브클로닝하기 위한 DNA 공급원으로서 사용하였다. 이 DNA 2.5μg을 총 용량 30μl 중에서 EcoR 1(NEB) 약 3단위로 1.5시간 동안 분해하여 부분 분해물을 얻어 겔 전기영동에 의해 확인하였다. pBCkS(+) DNA(Stratagene) 10μg을 총 용량 20μl 중의 EcoR 1 20 단위로 1.5시간 동안 분해하여 전체를 분해하고 전기영동에 의해 확인하였다. EcoR 1 분해 DNA 제제 두 개 모두를 물을 사용하여 50 μl로 희석하고 각각에 동량의 PCI를 첨가하여 현탁액을 부드럽게 혼합하고 마이크로 원심분리기로 회전시켜 수성 상등액을 수거하였다. 에탄올 150μl로 DNA를 침전 시키고 혼합물을 -20℃에서 철야 정치시켰다. 원심분리하고 건조시킨 후에 EcoR 1 분해 pBCkS(+)를 TE l00μl 중에 용해시키고 부분 분해된 26A5를 TE 20μl 중에 용해시켰다. DNA 회수를 형광계로 조사하였다.
별개의 반응에서, 약 60ng의 EcoR 1 분해 pBCkS(+) DNA를 부분 분해된 코스미드 26A5 DNA 약 180ng 또는 270ng과 라이게이션시켰다. 라이게이션은 T4 리가제 및 완충액(New England BioLabs)을 사용하여 15℃에서 용량 20μl 중에서 5시간 동안 수행하였다. 멸균 TE를 사용하여 100μl로 희석시킨 라이게이션 혼합물을 사용하여 제조자의 지시에 따라 냉동된 수용성 DH5α 세포(Gibco BRL)를 형질전환시켰다. 상이한 양(25 내지 200μ1)의 형질전환 세포를 1mM IPTG 및 50mg/1 X-gal을 갖는 새로 제조한 고상 LB-Cam35배지 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 약 20시간 배양한 후 약 3시간 동안 암실에서 냉각시켜 삽입체 선별을 위한 색상을 강화시켰다. 백색 콜로니를 동일한 조성의 패치 플레이트 상에 플레이팅하고 37℃에서 철야 배양하였다.
각각의 선별된 패치 플레이트의 2개의 콜로니 리프트를 다음과 같이 제조하였다. 백색 콜로니를 새로운 플레이트에 올린 후 거친 Magna NT 나일론막을 패치플레이트 상에 압축하고 막을 들어올려 라이브러리 콜로니 막에 대하여 상기한 변성, 중화 멎 UV 가교결합을 실시하였다. 티슈로 과량의 세포 파쇄물을 부드럽게 닦아내는 것을 포함하여 가교결합 콜로니 리프트를 격렬하게 세척하였다. ''최소 히브 프로토콜에 따라 한 세트를 상기한 GZ4(TcaC) 프로브 용액과 하이브리드화시키고 다른 한 세트는 상기한 TcaBi프로브 용액과 하이브리드화시킨 후 세척하고 라이브러리 콜로니 막에 대해서 기술한 바와 같이 필름에 노출시켰다.
GZ4 프로브하고만, GZ4와 TcaBi모두와, 또는 TcaBi 프로브하고만 하이브리드화 신호를 보이는 콜로니를 추가 연구를 위하여 선별하고 단일 콜로니의 단리를 위해 세포를 상기 IPTG 및 X-ga1을 갖는 LB-Cam35배지 상에 스트리킹하였다. 16개의 상이한 단리물로부터의 약 35개의 단일 콜로니를 액체 LB-Cam35배지에 넣고 37℃에서 철야 성장시키고 세포를 원심분리에 의해 수거하고 플라스미드 DNA를 문헌[Maniatis et al., op. cit. p.368]에 따라 표준 알칼리 용균 미니프렙에 의해 단리하였다. DNA 펠렛을 TE +25μg/ml 리보뉴클레아제 A 중에 용해시키고 형광계로 DNA 농도를 측정하였다. EcoR l 분해 패턴을 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 다음과 같은 단리물을 유용하게 사용하였다. 단리물 A17.2는 재라이게이션된 pBCkS(+)만을 포함하고(음성) 대조군으로 사용하였다. 단리물 D38.3 및 C44.1은 각각 pBCkS(+)에 삽입된 2.9kbp의 TcaBi-하이브리드화 EcoR 1 단편만을 포함한다. 각각 pDAB2000 및 pDAB2001로 명명된 이들 플라스미드는 도 2에 도시하였다.
단리물 A35.3은 pBCkS(+)에 삽입된 약 5kbp의 GZ4-하이브리드화 EcoR 1 단편만을 포함한다. 이 플라스미드는 pDAB2002(도 2 참조)로 명명되었다. 이 들 단리물은 DNA 서열 분석을 위한 주형을 제공하였다.
플라스미드 pDAB2000 및 pDAB2001을 상기 BIGprepTM키트를 사용하여 제조하였다. 배양물 30ml을 OD600가 될 때까지 TB-Cam35중에서 철야 성장시킨 후 플라스미드를 제조자의 지시에 따라 단리하였다. DNA 펠렛을 각각 TE 100μl에 재용해시키고 시료의 통합성을 EcoR 1 분해 및 겔 전기영동 분석법에 의해 조사하였다.
주형으로서 pDAB2000 DNA를 사용하는 하나의 레플리케이트와 주형으로서 pDAB2001 DNA를 사용하는 다른 하나의 레플리케이트를 사용하여 이중으로 서열 분석 반응을 실시하였다. 반응은 GZ4/HB14 DNA의 서열 분석에 대해 상기한 바와 같은 디데옥시 염료 터미네이터 싸이클 서열 분석법을 사용하여 실시하였다. 초기 서열 분석은 프라이머로서 상기 LacZ 및 T7 프라이머와, TcaBiPCR 증폭 생성물(TH1=ATTGCAGACTGCCAATCGCTTCGG, TH12=GAGAGTATCCAGACCGCGGATGATCTG)의 결정 서열을 기초로 한 프라이머를 사용하였다.
각각의 서열분석 결과의 배열 및 편집 후에 각각의 서열을 Perkin Elmer Applied Biosynthesis Division SeqEd 675 소프트웨어에 의해 번역한 염색체 데이터의 통합성에 따라 250 내지 350 염기로 절두하였다. 후속 서열 분석 단계는 새로운 프라이머에 적합한 서열을 선택하여 실시하였다. 몇가지의 예외를 제의하고, 프라이머(상기와 같이 합성됨)는 50% G+C 조성을 갖는 24염기의 길이를 가졌다. 이러한 방법에 의한 서열 분석은 약 2.9kbp EcoR 1 단편의 가닥 두 개 모두에 대해 실시되었다.
DNA 서열 분석을 위한 주형으로서 사용하기 위해 단리물 pDAB2002로부터 의 플라스미드 DNA를 BIGprepTM키트에 의해 제조하였다. 서열 분석 반응을 수행하고 상기한 바와 같이 분석하였다. 처음에, T3 프라이머(pBSkS(+) 염기 774-796: CGCGCAATTAACCCTCACTAAAG) 및 T7 프라이머(pBSkS(+)621-643: GCGCGTAATACGACTCACTATAG)를 사용하여 인접 벡터 서열로부터 서열 분석 반응물을 프라이밍하여 삽입체 DNA로 판독하었다. 다른 프라이머 세트(GZ4F: GTATCGATTACAACGCTGTCACTTCCC; TH13: GGGAAGTGACAGCGTTGTAATCGATAC; TH14: ATGTTGGGTGCGTCGGCTAATGGACATAAC; 및 LW1-204: GGGAAGTGACAGCGTTGTAATCGATAC)를 제조하여 서브클로닝된 TcaC-펩티드 PCR 생성물의 축퇴성(degenerate) 올리고뉴클레오티드-매개 서열 분석에 의해 미리 결정된 내부 서열로부터 프라이밍하였다. 서열 분석의 초기 라운드 동안에 생성된 데이터로부터 새로운 세트의 프라이머를 고안하여 ∼5kbp 단편의 전 길이를 프라이밍하기 위해 사용하였다. 총 55개의 올리고 프라이머를 사용하여 총 4832 bp의 연속 서열을 확인하였다.
pDAB2002의 EcoR 1 단편 삽입체의 DNA 서열을 pDAB2000/pDAB2001 단리물의 결정 서열의 일부와 합할 때 총 6005 bp의 연속 서열이 생성되었다(서열번호 25로서 표시됨). 긴 개방 해독 프레임을 대응하는 아미노산으로 번역할 때 서열은 메티오닌 잔기(번역 개시부) 바로 아래의 염기 19-75에 의해 코딩되는 TcaBiN-말단 펩티드(서열 번호 3으로 표시됨)를 분명하게 보였다. 상류는 잠재적인 리보좀 결합 부위(염기 1-9)이고 하류는 염기 166-228에서 TcaBi-PT158 내부 팹티드(서열 번호 19로 표시됨)가 코딩된다. 또한, 동일한 해독 프레임에서 하류의 염기 1738-1773에는 TcaBi-PT108 내부 펩티드(서열 번호 20으로 표시됨)를 코딩하는 서열이 존재한다. 또한, 동일한 해독 프레임에서 염기 1897-1923에서는 TcaBii-말단 펩티드(서열 번호 5)가 코딩되고 해독 프레임은 뉴클레오티드 3586-3588의 번역 종결 코돈까지 방해받지 않고 계속된다.
TcaBi-PT108을 코딩하는 서열의 말단과 TcaBii코딩 영역의 개시부 사이의 프레임 내(in-frame) 정지 코돈의 결여와 TcaBii코딩 영역의 바로 상류의 식별할 수 있는 리보좀 결합 부위의 결여는 펩티드 TcaBii및 TcaBi가 서열 번호 25의 염기쌍 16에서 시작하는 3567bp의 단일 개방 해독 프레임에 의해 코딩됨을 나타내고, 후-번역 분해에 의해 1189 아미노산(131,586 달톤; 서열 번호 26으로 표시됨)의 단일 1차 유전자 생성물로부터 유래할 가능성이 가장 크다. TcaBiiN-말단 펩티드 바로 앞의 아미노산이 펩티드 TcaBi의 C-말단 아미노산인 경우에 TcaBii(627개의 아미노산)의 예상 질량은 70,814 달톤(서열 번호 28로 표시됨)이고, SDS-PAGE에 의해 관찰된 크기(68kDa) 보다 다소 크다. 이 펩티드는 1881 염기쌍(서열 번호 27로 표시됨)의 연속 스트레치에 의해 코딩될 것이다. TcaBi의 천연 C-말단은 TcaBi-PT108의 C-말단에 보다 근접해 있는 것으로 생각된다. PTl08의 분자량(3.438kDa; 이 펩티드의 N-말단 아미노산 서열 분석 동안에 측정됨)을 통하여 30개의 아미노산의 크기를 예상할 수 있다. TcaBi코딩 영역의 C-말단(서열 번호 28의 604위치의 Glu)을 나타내기 위하여 이 펩티드의 크기를 사용하여 측정한 TCaBi의 유도 크기는 604개의 아미노산 또는 68,463 달톤인 것으로 측정되어 실험적관찰치와 보다 일치하였다.
1686 염기쌍(서열 번호 29로 표시됨)의 TcaBii펩티드 코딩 영역의 번역은 예상 질량이 60,789 달톤인 562 아미노산(서열 번호 30으로 표시됨)의 단백질을 생성시켜 관찰치 61kDa와 잘 일치하였다.
잠재적인 리보좀 결합 부위(염기 3633-3638)는 TcaB 3 개방 해독 프레임의 정지 코돈의 48 bp 상류에 존재하는 것으로 판명되었다. 염기 3645-3677에는 펩티드 TcaC(서열 번호 2)의 N-말단을 코딩하는 서열이 존재하는 것으로 판명되었다. 이 N-말단 팹티드에 의해 개시되는 개방 해독 프레임은 염기 6005까지 방해되지 않고 계속된다(2361 염기쌍, 서열 번호 31의 처음 2361 염기쌍으로 표시됨). 전체 TcaC 팹티드(외관상 크기 ∼165bp; ∼1500 아미노산)을 코딩하는 유전자(TcaC)는 약 4500bp를 포함할 것이다.
또한, 코스미드 26A5의 클로닝된 EcoR 1 단편을 포함하는 다른 단리물 E20.6을 앞에서 언급한 GZ4 및 TcaBi프로브와의 상동성에 의해 확인하였다. 이 균주에 포함된 플라스미드(pDAB32004, 도 2)의 DNA의 EcoR 1 분해물의 아가로스겔 분석은 추정 크기 2.9,5 및 3.3kbp의 삽입 단편을 보여주었다. 플라스미드 pDAB2002의 서열로부터 고안된 프라이머로부터 개시된 DNA 서열 분석은 pDAl32004의 3.3kbp EcoR 1 단편이 pDAl32002 내의 5kbp EcoR 1 단편에 인접하여 존재함을 보여주었다. pDAB2002에서 발견된 2361 염기쌍 개방 해독 프레임은 pDAB2004 내의 다른 2094 염기(서열 번호 31의 염기쌍 2362 내지 4458로 표시됨)로 방해받지 않고 계속된다. 주형으로서 모(母) 코스미드 26A5 DNA를 사용한 DNA 서열 분석을 통하여 개방 해독 프레임의 연속성을 확인하였다. 또한, 개방 해독 프레임(TcaC 서열 번호 31)은 4455개의 염기쌍을 포함하고, 1485개 아미노산의 단백질(TcaC)(서열 번호 32로 표시됨)을 코딩한다. 분자 크기의 계산치 166,214달톤은 TcaC 펩티드의 추정 크기(165kDa)과 일치하고, 유도된 아미노산 서열은TcaC N-말단 서열(서열 번호 2)에 개시된 서열과 정확하게 일치하였다.
축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머 풀을 고안하기 위해 사용된 서열 번호 17에 대응하는 아미노산 서열이 발견된 서열 내에 존재하지 않는 것은 초기 라이브러리 스크리닝에서 프로브로서 사용된 단리물 GZ4 및 HB14에서 발건된 PCR 생성물의 생성이 축퇴성 풀의 프라이머 중의 하나에 의해 역-가닥 프라이밍(reverse-strand priming)에 의해 우연하게 생성되었음을 나타낸다. 또한, 유도된 단백질 서열은 서열 번호 18에 표시된 내부 단편을 포함하지 않는다. 이들 서열은 플라스미드 pDAB2004가 TcaC 펩티드의 완전한 코딩 영역을 포함한다는 것을 보여준다.
실시예 9
포토랍두스 게놈 라이브러리에서의 TcbAii펩티드 코딩 유전자 스크리닝
본 실시예는 TcbAii펩티드 코딩 유전자를 포함하는 DNA 클론을 확인하는 데 사용되는 방법, 상기 유전자의 단리 및 그의 부분 DNA 염기 서열의 결정을 기술한다.
프라이머 및 PCR 반응
곤충 활성 제제의 TcbAii폴리펩티드는 ∼206kDa이다. 이 펩티드의 N-말단 아미노산 서열은 서열 번호 1에 표시되어 있다. 실시예 8에서 기술한 이 아미노산 서열의 일부를 코딩하기 위해 축퇴성 을리고뉴클레오티드 프라이머의 4개의 풀(전향 프라이머: TH-4, TH-5, TH-6 및 TH-7)을 합성하였고, 아래에 나타내었다.
또한, 내부 펩티드 제제(TcbAii-PT81)의 1차(a) 및 2차(b) 서열을 결정하고 서열 번호 23 및 서열 번호 24로서 각각 표시하였다. 축퇴성 올리고뉴클레오티드(역방향(reverse) 프라이머: TH-8, TH-9, TH-10 및 TH-11)의 4개의 풀을 유사하게 고안하고 서열 번호 23의 펩티드의 일부를 코딩하는 서열의 역방향 상보체를 코딩하기 의해 합성하였다.
상기 프라이머의 세트를 PCR 반응에 사용하여 실시예 6에서 제조한 게놈 포토랍두스 루미네센스 W-14 DNA로부터의 TcbAii코딩 유전자 단편을 증폭하였다. 모든 PCR 반응은 AmpliWaxTMgems 및 다른 Perkin Elmer 시약 및 프로토콜을 사용하여 핫 스타트(Hot Start) 기술로 실시하였다. 일반적으로, 총 용량 11μl의 MgC12, dNTP's,10X GeneAmp t18-1 PCR 완충액 Ⅱ 및 프라이머의 혼합물을 단일 왁스 비드를 포함하는 튜브에 첨가하였다(10X GeneAmp t18-2 PCR 완층액 n는 100mM Tris-HC1, pH 8.3; 및 500mMkC1로 구성됨). 튜브를 2분 동안 80℃로 가열하고 냉각시켰다. 왁스 밀봉의 상부에 10X GeneAmp PCR 완층액 II, DNA 주형 및 AmpliTaq DNA 중합효소를 포함하는 용액을 첨가하였다. 왁스 밀봉을 용융시키고 열 순환시켜 성분을 혼합한 후 최종 반응 조건(용량 50μl)은 10mM Ths-HC1, pH 8.3; 50mMkCl; 2.5mM MgCl2; 각각 200μM의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 1.25mM 단일 전향 프라이머 풀; 1.25μM 단일 역방향 프라이머 엄풀, AmpliTaq t18-3 DNA 폴리머라제 1.25 단위 및 주형 DNA 170ng이었다. 반응물을 실시예 8에서의 열 순환기 중에 놓고 하기 프로그램으로 운전시켰다.
축퇴성 프라이머 풀을 사용하여 3개의 상이한 어닐링 온도(55,60,65℃)에서 일련의 증폭을 실시하였다. 65℃에서 어닐링시킨 반응물은 아가로스 겔 전기영동 후에 가시적인 증폭 생성물을 보이지 않았다. 60℃에서 어닐링시키고 프라이머 TH-5+TH-10을 포함하는 반응물은 2.9kbp에 대응하는 이동성을 갖는 증폭 생성물을 생성하았다. 상기 조건에서 프라이머 TH-7+TH-10을 사용하면 보다 소량의 2.9kbp 생성물이 생성되었다. 반응물을 55℃에서 어닐링시킬 때 상기 프라이머쌍은 2.9kbp 생성물을 보다 많이 생성하였고 이 생성물은 또한 프라이머쌍 TH-5+TH-8 및 TH-5+TH-11에 의해서도 생성되었다. 추가의 매우 희미한 2.9kbp 밴드가 프라이머쌍 TH-7 + TH-8, TH-9, TH-10 또는 TH-11로부터의 중폭 생성물을 포함하는 레인에서 발건되었다.
클로닝 및 DNA 서열 결정을 위한 층분한 PCR 증폭 생성물을 얻기 위해서 프라이머 TH-5+TH-10를 사용하여 10개의 별개의 PCR 반응을 준비하고 55℃의 어닐링 온도에서 상기 조건을 사용하여 실시하였다. 모든 반응물을 모아서 상기한 바와 같이 아가로스겔로부터 Qiaex 추출에 의해 2.9kbp 생성물을 정제하였다.
TcbAh 내부 펩티드에 대해 결정한 또다른 서열을 서열 번호 21 및 서열 번호 22에 표시하였다. 상기한 바와 같이, 이 펩티드의 아미노산 서열의 일부를 코딩하는 서열의 역방향 상보체에 대응하도록 축퇴성 올리고뉴클레오티드(역방향 프라이머 TH-17 및 TH-18)를 제조하였다.
주형으로서 포토랍두스 루미네센스 W-14 DNA를 사용하고 5'-(전향) 프라이머로서 프라이머 TH-4, TH-5, TH-6 또는 TH-7을 사용한 증폭 실험에 축퇴성 올리고뉴클레오티드 TH-18 및 TH-17을 사용하였다. 이들 반응은 각각 약 4kbp 및 4.5kbp의 생성물을 증폭시켰다. 이들 DNA를 아가로스겔로부터 나일론 막에 옮겨 TH-5+TH-10 프라이머 쌍에 의해 증폭된 2.9kbp 생성물로부터 제조한32P-표지 프로브(상기한 바와 같은)와 하이브리드화시켰다. 4kbp 및 4.5kbp 증폭 생성물은 모두 2.9kbp 프로브와 강하게 하이브리드화하였다. 이러한 결과를 사용하여 도 3에 도시한 TcbAii내부 뎁티드 서열을 배열한 지도를 제조하였다. 프라이머 사이의 대략적인 거리는 도 3에서 뉴클레오티드로 표시하였다.
2.9kbp TcbAii코딩 단편의 DNA 서열
상기 제조된 정제 2.9kbp 단편 약 200ng을 에탄올을 사용하여 침전시키고 물 17m1에 용해시켰다. 이 용액의 1/2을 프라이머로서의 TH-5 풀 25pmol과 함께 서열 분석 주형으로서 사용하고 나머지 1/2은 TH-10 프라이밍을 위한 주형으로서 사용하였다. 서열 분석 반응은 실시예 8에 나타낸 바와 같이 실시하였다. TH-10 프라이머 풀을 사용한 경우에는 신뢰할 수 있는 서열이 생성되지 않았지만, TH-5 프라이머 풀을 사용한 반응은 아래와 같은 서열을 생성시켰다.
상기 서열을 기초로 하여 서열 분석 프라이머(TH-21, 5'-CCGGGCGACGTTTATCTAGG-3')를 역방향 상보체 염기 120-139로 고안하여 겔-정제된 2.9kbp TcbAii코딩 PCR 단편의 5' 단편(즉, TH-5 말단) 쪽으로 중합 반응을 개시하였다. 결정된 서열은 아래와 같고 TcbAii(서열 번호 1)의 생화학적으로 결정된 N-말단 펩티드 서열과 비교하였다.
TcbAii2.9kbp PCR 단편 서열 확인
(밑줄그은 아미노산 = 축퇴성 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩됨)
유도된 아미노산 서열과 생화학적으로 결정된 서열과의 상동성으로부터 2.9kbp PCR 단편이 TcbA 코딩 영역을 나타낸다는 것을 명백하게 알 수 있다. 이어서, 이 2.9kbp 단편을 하이브리드화 프로브로서 사용하여 TcbAii코딩 유전자를 포함하는 코스미드에 대해 실시예 8에서 제조된 포토랍두스 W-l4 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다.
포토랍두스 코스미드 라이브러리의 스크리닝
2.9kb 겔 정제된 PCR 단편을 실시예 8에서 기술한 바와 같이 뵈링거 만하임 High Prime 표지 키트를 사용하여32P로 표지하였다. 코스미드 라이브러리로부터 약 800개의 콜로니의 잔류물을 포함하는 필터를 실시예 8에서 상기한 바와 같이 스크리닝하고 양성 클론을 단리 콜로니를 위해 스트리킹하고 재스크리닝하였다. 3개의 클론(8Al1, 25G8 및 26D1)가 복수회의 스크리닝 및 특성화 단계를 통하여 양성 결과를 보였다. TcbAii특이 프로브는 실시예 8에서 확인된, tcaB 및 tcaC 유전자를 포함하는 4개의 코스미드 중 어느 것과도 하이브리드화하지 않았다. 코스미드 8Al1, 25G8 및 26D1으로부터의 DNA를 제한 효소 Bg1 2, EcoR 1 또는 Hind 3(단독으로 또는 서로 혼합하여)로 분해하고 단편을 아가로스겔 상에서 분리하고 실시예 8에서 기술한 바와 같이 나일론막으로 옮겼다. 막을 4.5kbp 단편(포토랍두스 게놈 DNA를 프라이머 TH-5+TH-17로 증폭하여 생성됨)으로부터 제조된32P-표지 프로브와 하이브리드화시켰다. 코스미드 DNA 8A11 및 26D1로부터 생성된 패턴은 동일한 막 상에 유사하게 절단된 게놈 DNA로 생성된 것과 동일하였다. 코스미드 8Al1 및 26D1은 게놈 TcbAii코딩 로커스를 정확하게 나타낸다는 결론을 얻었다. 그러나, 코스미드 25G8은 게놈 DNA 보다 약간 더 큰 하나의 Bgl 2 단편을 갖는다. 이것은 벡터 내에 존재하는 삽입체에 기인할 수 있다.
tcbA 코딩 유전자의 DNA 서열
코스미드 26D1의 막 하이브리드화 분석은 4.5kbp 프로브가 하나의 큰 EcoR 1 단편(9kbp보다 큼)에 하이브리드화한다는 것을 보여주었다. 이 단편을 겔 정제하여 실시예 8에서 기술한 바와 같이 pBCkS(+)의 EcoR 1 부위에 라이게이션시켜 플라스미드 pBC-S1/R1을 생성시켰다. 이 플라스미드의 삽입 DNA의 부분 DNA 서열을 실시예 8에서 기술한 과정을 사용하여 인접 벡터 서열로부터 프라이머 워킹(primer walking)에 의해 결정하였다. 미리 결정한 서열로부터 고안된 새로운 올리고뉴클레오티드를 신장시켜 다른 서열을 생성시켰다. 다른 방법으로 확인된 tcbA 유전자의 결정된 DNA 서열(실시예 12에서 기술하는 서열 번호 11로 표시됨)과 비교시에 완전한 상동성이 뉴클레오티드 1-272, 319-826, 2578-3036 및 3068-3540(총 염기 1712)에서 발견되었다. 두개의 방법을 사용하여 TcbAii팹티드를 코딩하는 DNA 단편을 확인할 수 있다.
tcbA 유전자의 유도된 아미노산 서열의 분석
서열 번호 11로 확인된 DNA 단편의 서열은 서열 번호 12로 표시된 유도된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩한다. 몇 개의 특징을 통하여 TcbAii단백질을 코딩하는 유전자의 정체를 확인할 수 있다. TcbAiiN-말단 펩티드(서열 번호 1; Phe Ile G1n Gly Tyr Ser Asp Leu Phe G1y Asn Arg Ala)는 아미노산 88-100으로서 코딩된다. TcbAii내부 펩티드 TcbAii-PT81(a)(서열 번호 23)는 아미노산 1065-1077로서 코딩 되 고 TcbAii-PT81(b)(서열 번호 24)는 아미노산 1571-1592로서 코딩된다. 또한, 내부 펩티드 TcbAii-PT56(서열 번호 22)는 아미노산 1474-1488로서 코딩되고 내부 펩티드 TcbAii-103(서열 번호 24)는 아미노산 1614-1639로서 코딩된다. 이 유전자는 포토랍두스 루미네센스 균주 W-14의 살충 단백질 제제로부터 TcbAii팹티드를 코딩하는 진정한 클론임이 분명하다.
펩티드 TcbAii로서 단리된 단백질은 보다 긴 펩티드의 분해로부터 유도된다. 이에 대한 증거는 TcbAiiN-말단 펩티드(서열 번호 1)를 코딩하는 뉴클레오티드가보다 긴 개방 해독 프레임(서열 번호 11)의 261개의 염기(87개의 N-말단-부근 아미노산을 코딩함) 뒤에 온다는 사실에 의해 제공된다. 이 해독 프레임은 큰 팹티드 TcbA의 N-말단 서열에 대응하고 서열 번호 16으로 표시된 아미노산 서열 Met Gln Asn Ser Leu을 코딩하는 뉴클레오티드로 시작한다. TcbA는 TcbAii의 전구체 단백질인 것으로 생각된다.
tcbA, tcaB 및 tcaC 유전자의 관계
tcbB 및 tcaC 유전자는 밀접하게 연관되어 있고 하나의 mRNA로서 전사될 수 있다(실시예 8). tcbA 유전자는, 각각의 게놈 라이브러리가 확인된 상이한 코스미드를 스크리닝하기 때문에 tcaB 및 tcaC 클러스터를 포함하는 것과 분명히 중복되지 않는 코스미드 상에 존재한다. 그러나, tcaB 및 tcaC 유전자와 tcbA 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 비교하면 실질적인 정도의 상동성이 존재함을 알수 있다. 아미노산 보존(Protein Alignment Mode of MacVectorTM서열 분석 소프트웨어, scoring matrix pam250, hash value=2; 미국 뉴욕주 로체스터 소재kodak Scientific Imaging Systems)은 도 4에 도시하였다. 도 4에서 각 패널의 스코어 라인에 상부 캐럿(^)은 상동성 또는 보존적 아미노산 변화를 나다내고 하부 캐럿(v)은 비상동성을 나타낸다.
이 분석은 TcbA 펩티드의 잔기 1739 내지 1894의 아미노산 서열이 TcaBi펩티드의 아미노산 441 내지 603(P8의 총 627 아미노산 중 162개; 서열 번호 28)와 상동성이 매우 높다. 또한, TcbA 아미노산 1932 내지 2459의 서열은 팹티드 TcaBii의 아미노산 12 내지 531(총 562개의 아미노산 중 520개; 서열 번호 30)와 상동성이 매우 높다. TcbA 펩티드(서열 번호 12)가 2505개의 아미노산을 포함한다는 것을 고려할 때 그의 C-말단부 근처에서 총 684개의 아미노산(27%)가 TCaBi또는 TcaBii펩티드에 상동성이고 이 상동부는 추정 TcaBi전구단백질(서열 번호 26)의 배열에 직선상으로 배열된다. TcbA 상동부 내의 상당한 갭은 TcaB 전구단백질의 TcaBi와 TcaBii부분 사이의 연결부에 대응한다. 분명한 것은, TcbA 및 TcaB 유전자 생성물은 진화상 관련되어 있고, 이것은 이들이 포토랍두스에서 및몇의 공통적인 기능(들)을 공유한다는 것을 시사한다.
실시예 10
포토랍두스 브로쓰에서 아연-메탄로프로테아제의 특성화; 프로테아제 억제, 분류 및 정제
프로테아제 억제 및 분류 분석: 프로테아제 분석은 기질로서 물에 용해시킨 FITC-카제인을 사용하여 실시하였다(최종 분석 농도 0.08%). 적합한 완충액 중에서 포토랍두스 브로쓰 25μl(총 반응 용량 150μl)로 25℃에서 1시간 동안 단백질 분해 반응을 실시하였다. 또한, 시료를 디티오트레이톨의 존재 하 또는 부재 하에 분석하였다. 배양한 후 동량의 12% 트리클로로아세트산을 첨가하여 분해되지 않은 단백질을 침전시켰다. 0.5시간 동안 침전시키고 원심분리한 후에 상등액 100μl를 96웰 마이크로타이터 플레이트 내에 넣고 동량의 4N NaOH를 첨가하여 용액의 pH를 조절하였다. 이어서, 각각 485 및 538nm의 여기 및 방출 파장에서 Fluoroskan Ⅱ 형광 플레이트 판독기를 사용하여 단백질 분해를 정량하었다. 프로데아제 활성을 pH5.0-10.0에 걸쳐서 0.5 단위씩 증가하여 시험하였다. 하기 완층액을 최종 농도 50mM에서 사용하였다: 아세트산나트륨(pH5.0-6.5), Tris-HC1(pH7.0-8.0), 및 bis-Tris 프로판(ph 8.5-10.0). 관찰된 프로테아제(들)의 클래스를 확인하기 위해서 조 브로쓰를 상이한 프로테아제 억제제(최종 농도 0.5 μg/μl)로 처리한 후 상기 기질을 사용하여 pH8.0에서 프로테아제 활성을 조사하였다. 사용된 프로테아제 억제제로는 E-64(L-트랜스-에폭시사키닐류실아미도[4-,-구아니디노]-부탄), 3,4-디클로로이소쿠마린, 류펩틴, 팹스타틴, 아마스타틴, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 1,10-페난트롤린을 들 수 있다.
특정 pH 범위에 걸쳐 실시한 프로테아제 분석은 ∼pH 8.0에서 최대 활성을 보이는 프로테아제(들)이 존재한다는 것을 보여주었다(표 16). DTT의 첨가는 프로테아제 활성에 아무런 영향을 주지 않았다. 이어서, 조 브로쓰를 상이한 프로테아제 억제제로 처리하였다(표 17). 상기한 억제제로 조 브로쓰를 처리하면 1,10-페난트롤린은 최종 농도 50μg으로 첨가할 경우 2mg/ml의 조 브로쓰 용액 100μl에서 IC50=5μg으로서 모든 프로테아제 활성을 완전히 억제한다는 것을 알 수 있었다. 이들 데이타는 포토랍두스 브로쓰에서 발견된 대부분의 풍부한 프로테아제(들)이 아연-메탈로프로테아제 클래스의 효소라는 것을 나타낸다.
투석된 10-80% 암모늄 술페이트 펠렛을 포토랍두스 독소에 대해 실시예 5에서 기술한 50mM Na2PO4, pH 7.0에서 평형화된 Q 세파로스 컬럼에 걸어 아연-메탈로프로테아제를 단리하였다. 강하게 세척한 후에 0 내지 0.5M NaC1 구배를 사용하여 독소 단백질을 용출시켰다. 대부분의 생물학적 활성 및 단백질을 0.15 내지 0.45 M NaCl로부터 용출시켰다. 그러나, 대부분의 단백질 분해 활성이 0.25-0.35M NaC1 분획에 존재하고 소량의 활성이 0.15-0.25 M NaCl 분획에 존재하는 것이 관찰되었다. 0.25-0.35 M NaCl 분획에 대한 SDS-PAGE 분석은 약 60kDa의 펩티드 주밴드를 보였다. 0.15-0.25 M NaC1 분획은 유사한 60kDa 밴드를 포함하였으나 보다 낮은 상대적인 단백질 농도를 가졌다. 이어서, 이 분획을 수퍼로스 12HR 16/50컬럼을 사용하여 겔 여과함으로써 SDS-PAGE 분석에 의한 우세한(총 염색된 단백질의 90% 이상) 58.5kDa 밴드를 포함하는, 57.5kDa에 이동하는 주피크를 얻었다. 상이한 프로데아제 억제제를 사용한 상기 분획에 대한 추가의 분석을 통하여 프로테아제가 아연-메탈로프로테아제임을 결정하였다. 발효 1일차에 포토랍두스 브로쓰에 존재하는 거의 모든 프로테아제 활성은 ∼58kDa 아연-메탈로프로테아제에 대응하였다.
아연-메탈로프로테아제(들)의 제2 단리에서 3일 동안 성장한 W-14 포토랍두스 브로쓰를 사용하고 문헌[Schmidt, T.M., Bleakley, B. and Nealson,k.M. 1988]에 기재된 바와 같이 젤라틴이 결합된 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 프로테아제 활성을 가시화하였다. SDS 전개 겔(5.5x8 cm)은, 물 중에 용해시에 최종 농도 0.1% 젤라틴(Biorad EIA 그레이드 시약; 미국 캘리포니아주 리치몬도 소재)가 혼입되는 12.5% 폴리아크릴아미드(아크릴아미드/비스-아크릴아미드의 40% 원액; 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical Co.)로 제조하였다. SDS-스태킹 겔(1.0x8cm)를 0.1% 젤라틴이 결합된 5% 폴리아크릴아미드를 사용하여 제조하였다. 일반적으로, 시험 단백질 2.5μg을 디티오트레이톨(DTT)이 없는 SDS-PAGE 로딩 완충액 0.03ml 중에 희석시키고 겔에 로딩하였다. 0℃ 및 8mA에서 SDS 전개 완층액(Laemmli, U.K. 1970. Nature 227, 680) 중에서 단백질을 전기영동시켰다. 전기영동이 종결된 후에 겔을 2.5%(v/v) 트리톤 X-100 중에서 2시간 동안 세척하였다. 이어서, 겔을 0.1M 글리신(pH 8.0) 중에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양한 후에 겔을 고정시키고 메탄올-아세트산-물(30:10:60, v/v/v; Sigma Chemical Co.) 중의 0.1% 아미도 블랙으로 철야 염색하였다. 단백질 분해 및 뒤이은 결합 젤라틴의 확산에 의해 아미도 블랙 염색된 어두운 배경에 대하여 밝은 영역으로서 단백질 분해 활성이 가시화되었다. 58, 41 및 38kDa에서 단백질 분해 활성에 의해 생성된 3개 이상의 특이 밴드가 관찰되었다.
기질로서 물에 용해시킨 FITC-카제인을 사용하여 W-14 3일 배양 브로쓰 중에서의 상이한 프로테아제의 활성을 분석하였다(최종 분석 농도 0.02%). 단백질분해 실험은 총 용량 0.15ml로 상이한 단백질 분획을 사용하여 0.l M Tris-HC1(pH 8.0) 중에서 0 내지 0.5 시간 동안 37℃에서 실시하였다. 물에 용해시킨 등용량의 12% 트리클로로아세트산(TCA)를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 실온에서 0.25시간 동안 배양한 후 시료를 10,000xg에서 0.25 시간 동안 원심분리하고 분취액 0.10ml을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 넣었다. 이어서, 등용량의 2 N 수산화나트륨을 첨가하여 용액을 중화시킨 후 Fluoroskan Ⅱ 형광 플레이트 판독기를 사용하여 각각 485 및 538nm의 여기 및 방출 파장으로 정량하였다. 상이한 프로테아제 농도로 FITC-카제인을 사용하여 37℃에서 0-10분 동안 활성을 측정하였다. 활성의 단위는 1000 형광 단위/분을 생성시키는데 필요한 효소의 양으로 임의로 규정하고 특이 활성은 단위/mg 프로테아제로 규정하였다.
각각 100% 에탄올 및 물 중에 용해시킨 억제제의 원액과 함께 2개의 아연-메탈로프로테아제 억제제, 즉 1,10-페난트롤린 및 N-(a-람노피라노실옥시히드록시포스피닐)-Leu-Trp(포스포르아미돈)을 사용하여 억제 연구를 실시하였다. 원액 농도는 1,10-페난트롤린 및 포스포르아미돈에 대해 각각 일반적으로 10mg/m1 및 5mg/ml이었고, 최종 억제제 농도는 반응당 0.5 내지 1.0mg/m1이었다. 3일 W-14조 브로쓰를 모든 아연-메탈로프로테아제의 억제제인 1,10-페난트롤린으로 처리하면 모든 프로테아제 활성이 완전히 제거되었고, 써모리신(thermolysine) 유사 프로테아제의 억제제 [Weaver, L.H.,kester, W.R., and Matthews, B.W. 1977. J. Mo1. Bio1. 114, 119-132]인 포스포르아미돈으로 처리하면 프로테아제 활성이 ∼56% 감소하였다. 잔여 단백질 분해 활성은 추가의 포스포르아미돈으로 처리하여도 더 감소시킬 수 없을 것이다.
3일 W-14 포토랍두스 브로쓰의 프로테아제를 다음과 같이 정제하였다: Amicon M-12 여과 장치에 부착된 Amicon 나선형 한의여과 카트리지 Type S1Y100을 사용하여 브로쓰 4.0리터를 농축하였다. Amicon M-12 여과 장치에 부착된 Amicon 나선형 한외여과 카트리지 Type S1Yl00을 사용하여 크기가 100kDa 미만인 천연 단백질을 갖는 통과 물질 3.8 리터를 0.375 리터까지 농축하였다. 잔류 물질은 10 내지 100kDa의 단백질을 포함하였다. 이 물질을 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 중에 평형화시킨 Per Septive Biosystem(미국 매릴랜드주 프라밍턴소재) Poros(등록상표) 50HQ 강 음이온 교환 층전재로 층전된 Pharmacia HR16/10 컬럼 상에 로딩하였다. 단백질을 5ml/분의 유속으로 컬럼에 로딩한 후 A280=0.00이 될 때까지 완충액으로 결합하지 않은 단백질을 세척하였다. 이어서, 7.5 m1/분의 유속으로 40분 내에 0-1.0 M NaC1의 NaC1 구배를 사용하여 단백질을 용출시켰다. 분획에 대해 프로테아제 활성을 상기와 같이 분석하고 활성 분획을 모았다. 단백질 분해 활성을 보이는 분획을 50%(v/v) 10mM 인산나트륩 완충액(pH 7.0)으로 희석하고 10mM 인산나트륩 중에 평형화시킨 Phamncia HR 10/10 Mono Q 컬럼에 로딩하였다. A280=0.00이 될 때까지 완층액으로 컬럼을 세척한 후 2.0ml/분의 유속으로 1시간 동안 0-0.5 M NaCl의 NaCl 구배를 사용하여 단백질을 용출시켰다. 분획의 프로테아제 활성을 분석하였다. 포스포르아미돈 감수성 프로테아제 활성은 41/38kDa 프로테아제에 의한 것으로(하기 참조) 가장 높은 포스포르아미돈 감수성 프로테아제 활성을 갖는 분획을 모았다. 이 분획을 0.15-0.25M NaC1에서 용출되는 것으로 판명되었다. 포스포르아미돈 불감성 프로데아제 활성, 58kDa 프로테아제를 주로 포함하는 분획도 모았다. 이 분획은 0.25-0.35 M NaCl에서 용출되는 것으로 판명되었다. 이어서, 포스포르아미돈 감수성 프로테아제분획을 Millipore Ultrafree t26-1 -15 원심분리 여과 장치 Biomax-5K NMWL 막을 사용하여 최종 용량 0.75ml로 농축하였다. 이 물질을 0.5ml/분의 유속으로 10mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)/0.1 M NaC1 중에 평형화시킨 Pharnncia Sephadex G-50으로 층전된 Phanncia HR10/30 컬럼 상에 로딩하였다. 이어서, 최대 포스포르아미돈 감수성 프로테아제 활성을 갖는 분획을 모아서 Milhpore Ultrafree t26-2 -15 원심분리 여과 장치 Biomax-50K NMAVL 막을 사용하여 원심분리하였다. 상기와 같은 단백질 분해 활성 분석은 이 물질이 포스포르아미돈 감수성 프로테아제 활성만을 갖는다는 것을 나타내었다. 포스포르아미돈 불감성 프로테아제, 58kDa 단백질을 모은 후mMipore Ultrafree-15 원심분리 여과 장치 Biomax-50K NMWL 막 중에서 농축하고 Pharmacia Superdex-75 컬럼 상에서 추가로 분리하였다. 이 프로테아제를 포함하는 분획을 모았다.
정제 58 및 41/38kDa 프로테아제의 분석은 두 종류의 프로테아제가 1,10-페난트롤린으로 완전히 억제되지만 포스포르아미돈에는 41/38kDa 프로테아제만 억제 되었음을 보여주었다. 조 브로쓰에 대한 추가의 분석은 1일 W-14 프로쓰의 프로테아제 활성이 41/38kDa 프로테아제에 의해 전체 프로테아제 활성의 23%를 갖고 3일 W-14 브로쓰에서는 44%까지 증가한다는 것을 보여주었다.
단백질 순도를 조사하고 아미노 말단 서열을 얻기 위해서 미국 매사추세츠주 나티크 소재의 Integrated Separation Systems에서 시판하는 4-20% 구배 Mini P1us Sepra Gels를 사용하여 표준 SDS-PAGE 분석을 실시하였다. 아미노 말단 서열분석 되는 단백질을 정제 후에 PVDF막(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems사의 ProBlottTM막)에 블로팅하고 0.1% 아미도 블랙으로 가시화시키고 절개하여 서열분석을 위해 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재의 Cambridge Prochem에 보냈다.
3일된 W-14 브로쓰로부터의 58-(서열 번호 45) 및 41/38kDa(서열 번호 44) 프로테아제의 추정 아미노 말단 서열은 각각 DV-GSEKANEKLK(서열 번호 45) 및 DSGDDDWTNTDIHR(서열 번호 44)이었다.
41/38kDa 프로데아제의 서열 분석은 각각 추가의 아미노산이 단백질 분해에 의해 제거된 몇 개의 아미노 말단을 보여 주었다. 38 및 41kDa 폴리펩티드에 대한 1차, 2차, 3차 및 4차 서열의 조사는 상기 서열의 추정을 가능하게 하였고 이들 2개의 프로테아제가 상동성이라는 것을 보여주었다.
실시예 11a
TcbA 펩티드 코딩 유전자에 대한 포토랍두스 게놈 라이브러리의 항체를 사용한 스크리닝
상기 서열분석과 동시에 TcbAii펩티드(서열 번호 1)를 기초로 하여 적합한 프로빙 및 서열분석을 실시하였다. 이 서열 분석은 세균 배양 브로쓰를 제조하고 상기 실시예 1 및 2에서 기술한 독소를 정제하여 실시하였다.
게놈 DNA를 Grace의 곤층 조직 배양 배지에서 성장한 포토랍두스 루미네센스 균주 W-14로부터 단리하였다. 세균을 250m1 삼각 플라스크 중의 배양 배지 5m1 중에서 28℃ 및 250rpm에서 약 24시간 동안 성장시켰다. 배양 배지 100m1로 부터 세균 세포를 5000xg에서 10분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 버리고 세포 펠렛을 게놈 DNA 단리에 사용하였다.
게놈 DNA는 Ausube1의 상기 문헌 섹션 2.4.3에 기술된 CTAB 방법을 변형하여 사용하여 단리하였다. 이어서, 제목 Large Scale CsC1 prep of bacteial genomic DNA의 섹션을 단계 6을 통하여 실시하였다. 이 때, 추가의 클로로포름/이소아밀 알콜(24:1) 추출을 실시한 후 페놀/클로로포름/이소아밀(25:24:1) 추출 단계 및 최종적으로 클로로포름/이소아밀/알콜(24:1) 추출을 실시하였다. 0.6 용량의 이소프로판올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 굽은 유리 막대 끝에 감아서 70% 에탄올에 잠시 담가 최종적으로 세척하고 TE 완층액 3m1에 용해시켰다.
280/260nm에서의 광학 밀도에 의해 추정한 DNA 농도는 약 2mg/ml이었다.
상기 게놈 DNA를 사용하여 라이브러리를 제조하였다. 게놈 DNA 약 50μg을 Sau3A1으로 부분 분해하였다. 이어서, NaC1 밀도 구배 원심분리를 사용하여 부분 분해 DNA 단편을 크기 분별하였다. 아가로스 겔전기영동에 의해 측정한 평균 크기가 12kb 이상인 DNA 단편을 포함하는 분획을 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 Stratagene사의 플라스미드 BlueScript에 라이게이션시키고 이. 콜라이 DH5α 또는 DHBl0 균주를 형질전환시켰다.
이와 별도로, 단백질의 정제 분취액을 단백질에 대한 모노클로날 항체의 생성을 위해 미국 매디슨 소재의 위스콘신 대학교의 바이오테크놀로지 히브리도마 센터에 보냈다. 이 센터에 보낸 물질은 65℃에서 변성된 천연 밴드 1 및 2를 포함하는 HPLC 정제 분획으로 그 중 20μg을 4마리의 마우스에게 각각 주사하였다. 적합한 모노클로날 항체 생성 히브로도마 세포주를 비면역된 마우스의 비장 세포를 안정한 골수종 세포주와 융합시킨 후 회수하였다. 모노클로날 항체를 하이브리도마세포로부터 회수하였다.
이와 별개로, 천연 아가로스 겔 정제 밴드 1(실시예 1 참조) 단백질을 뉴질랜드 흰토끼를 면역시키는데 사용하여 폴리클로날 항체를 생성시켰다. 천연 아가로스겔로부터 밴드를 절개하고 겔 조각을 65℃로 가열하여 아가로스를 용융시키고 그 직후 보조제로 유화시켜 단백질을 제조하였다. 프로인트 완전 보조제를 사용하여 1차 면역시키고 프로인트 불완전 보조제를 사용하여 1달 간격으로 추가로 3회 주사하였다. 각각의 주사에 대해 단백질 50 내지 100μg을 포함하는 유화 밴드 1 약 0.2 ml을 토끼의 등에 다중 피하주사하여 전달하였다. 최종 주사 10일 후에 혈청을 얻고 3주 후에 다시 체혈을 실시하였다. 혈청 보층물을 56℃로 15분 동안 가열하여 불활성화시킨 후 -20℃에서 보관하였다.
이어서, 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 사용하여 에피토프에 의해 검출될 수 있는 항원의 발현에 대하여 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다. 양성 클론은 니트로셀룰로스 필터 콜로니 리프트 상에서 검출되었다. 양성 클론에 대한 면역블롯 분석을 실시하였다.
면역블롯 및 써든 분석에 의해 규명된 클론의 분석을 통하여 5개 클래스의 클론을 실험적으로 확인하였다.
제1클래스의 클론에는 TcbAii로 명명된 펩티드를 코딩하는 유전자가 존재하였다. 이 유전자 (TcbA)의 전체 DNA 서열을 얻고 서열 번호 11에 나타내었다.
이 서열이 서열 번호 1의 내부 서열을 코딩한다는 것의 확인은 서열 번호 11의 개방 해독 프레임에 의해 생성된 추정 아미노산 서열로부터 아미노산 번호 88에 서열번호 1의 존재에 의해 입증된다. 이것은 서열 번호 11에 의해 생성되는 추정 아미노산 서열인 서열 번호 12를 통하여 확인될 수 있다.
제2클래스의 독소 펩티드는 TcaBi, TcaIBii및 TcaC로서 언급한 세그먼트를 포함한다. 폴리클로날 항체를 사용하여 라이브러리를 스크리닝한 후에, 모두가 면역블롯 상에서 폴리클로날 항체와 교차 반응하고 또한 써든 블롯 상에서 DNA 상동성을 공유하는 것으로 밝혀진, 상이한 크기의 단백질을 생성하는 몇 개의 클론에 의해 상기 제2 클래스의 독소 유전자를 확인하였다. 서열 비교를 통하여 이들은 상기 TcaB 및 TcaC로 명명된 유전자 복합체에 속한다는 것을 알았다.
3개의 다른 클래스의 항체 독소 클론을 폴리클로날 스크린에서 단리하였다.
이들 클래스는 폴리클로날 항체와 교차반응하는 단백질을 생성하고 써든 블로팅에 의해 측정한 바 DNA 상동성을 공유하였다. 이들 클래스는 클래스 III, 클래스 IV 및 클래스 V로 명명되었다. 또한, 클래스 I, Ⅳ, III 및 Iv와 교차 반응하는 모노클로날 항체를 확인할 수 있었다. 이것은 상기 모든 클래스가 높은 단백질 상동성 영역을 갖는다는 것을 시시한다. 따라서, 피. 루미네센스 세포의 단백질 유전자는 진화상 관련된 일군의 유전자인 것으로 보인다.
피. 루미네센스에 포함된 독소 펩티드의 진화상 관련된 변이가 존재할 수도 있다는 개념을 확인하기 위해 관련 단백질의 존재 여부에 대해 피. 루미네센스의 다른 균주를 검사하기 위하여 2가지의 방법을 실시하였다. 이것은 게놈 DNA의 PCR 증폭 및 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 사용하는 면역 블롯 분석 모두에 의해 실시되었다.
이 결과는 관련 단백질이 피. 루미네센스 균주 WX-2, WX-3, WX-4, WX-5, WX-6, WX-7, WX-8, WX-11, WX-12, WX-15 및 WX-14에 의해 생성된다는 것을 나타낸다.
실시예 11b
클래스 Ⅲ 독소 클론-tcc의 서열 및 분석
실시예 11a에서 기술한 클래스 Ⅲ 이. 콜라이 클론에서 단리한 플라스미드에 대해 다른 DNA 서열분석을 실시하였다. 뉴클레오티드 서열은 상기 게놈 로커스에서 3개의 밀접하게 연관된 개방 해독 프레임인 것으로 밝혀졌다. 이 로커스는 tccA(서열 번호 56), tccB (서열 번호 58) 및 tccC (서열 번호 60) (도 6B)로 명명된 3개의 개방 해독 프레임을 갖는 tcc로 명명되었다.
tccA 개방 해독 프레임으로부터 추정된 아미노산은 105,459 Da의 단백질을 코딩하는 유전자를 나타낸다. 이 단백질의 처음 12개의 아미노산은 독소 복합체의 일부로서 앞에서 확인된 108kDa 단백질 (서열 번호 7)로부터 얻은 N-말단 서열과 일치한다.
tccB 개방 해독 프레임으로부터 추정된 아미노산은 175,716 Da의 단백질을 코딩하는 유전자를 나타낸다. 이 단백질은 TccB로 명명되었다. 이 단백질의 처음 11개의 아미노산은 추정 분자량이 185 kDa인 단백질(서열 번호 8)로부터 얻은 N-말단 서열과 일치한다.
tccC의 추정 아미노산 서열은 이 개방 해독 프레임이 111,694 Da의 단백질을 코딩하는 것을 나타내고 생성 단백질은 TccC로 명명되었다.
실시예 12
포토랍두스 균주의 특성화
본 명세서에서 개시되는 컬렉션이 포토랍두스 균주로 이루어졌음을 확립하기 위해서 본 발명의 균주를 포토랍두스에 특유하고 다른 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae) 및 제노랍두스 (Xenorhabdus) 종과 구별하게 하는, 식별되는 미생물학적 특징의 측면에서 평가하였다 [Fanner, J.J. 1984. Bergey's Manual of Systemic Bactedo1ogy, vo1 1. pp. 510-511. (ed. Kreig N.R. and Holt, J.G.).
Williams Wilkins, Baltimore.; Akhurst and Boemare, 1988, Boennre et al., 1993). 이러한 특유의 특징은 다음과 같다:그람 음성 간균 균주, 폭이 0.5-2μm이고 길이가 2-10μm인 유기체 크기, 적색/황색 콜로니 착색, 결정 봉입체의 존재, 카탈라제의 존재, 질산염 환원능 부재, 생체 발광성 존재, 성장 배지로부터 염료의 흡수능 보유, 프로테아제 생성능 양성, 성장 온도 범위 371C 미만, 혐기성 조건 하에 생존 및 활발한 운동성 보유(표 18). 참고용의 이. 콜라이, 제노랍두스 및 포
토랍두스 균주가 비교용으로 모든 시험에 포함되었다. 전체적인 결과는 엔테로박테리아세과 및 포토랍두스 속의 일부인 모든 균주와 일치하였다.
발광계를 사용하여 각 균주의 생체 발광을 확인하고 광 생성을 정량하고 상대적으로 측정하였다. 상대 발광 단위 측정을 위해 각 균주(세포 및 배지)의 브로쓰를 액체 배양물에 접종한 후 세 간격에서 (6, 12 및 24시간) 측정하여 배경 발광(비접종 배지 및 물)과 비교하였다. 상이한 브로쓰로부터의 발광을 측정하기 전에 시퍼(sipper) 세포를 사용하여 Gilford Systems (Oberlin,OH) 분광계 중에서 흡광도 (560nm)를 측정하여 세포 밀도를 확인하였다. 이어서, 발광도를 측정하기 전에 (광학 밀도를 1.0단위로 표준화하기 위해) 적합한 희석액을 제조하였다. 회석 브로쓰의 분취액을 큐벳에 넣고 (각각 300μl) Bio-Orbit 1251 발광계(Bio-Orbit Oy, Twiku, Finland)로 판독하였다. 각 시료에 대한 통합 시간은 45초이었다. 시료를 연속적으로 혼합하면서 (배플드 큐벳에서 회전시킴) 산소 가용성을 판독하였다. 양성 시험은 배경 발광(∼5-10 단위)의 5배 이상인 것으로 하여 정하였다. 또한, 콜로니 발광도는 암실에 유지시킨 후 사진 필름 오버레이를 사용하여 가시적으로 측정하였다. 각 균주의 그람 염색 특성은 시판되는 그람 염색 조절 슬라이드(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)와 함께 사용되는 그람 염색 키트(BBL, Cockeysville, MD)로 확인하였다. 이어서, Zeiss 현미경(Carl Zeiss, Genㄸuly) 100X 오일 침지 대물렌즈(10X 접안렌즈 및 2X 체 배율을 갖는)을 사용하여 현미경 평가를 실시하였다. 유기체 크기, 세포 내부 및 봉입체(로그상 성장 후)에 대한 각 균주의 현미경 검사는 오일 침지 및 상 대조 현미경을 갖는 습식 마운트 슬라이드 (1OX 접안렌즈 2X 체 배율, 40X 대물렌즈)를 사용하여 실시하였다 (Akhurst, R.J. and Boemare, N.E. 1990. Entonlopathogenic Nematodes in Biological Contro1 (ed. Gaugler, R. and Kaya, H.). pp. 75-90. CRC Press, Boca Raton, USA.; Baghdiguian S., Boyer-Giglio M.H., Thaler, J.O., Bonnot G., Boemare N. 1993.
Biol. Cel1 79, 177-185). 콜로니 착색은 제조자의 지시에 따라 제조된 Bacto 영양 아가 (Difco Laboratohes, Detroit, MI) 상에 접종한 후에 관찰하였다. 28℃에서 배양하였고 5-7일 후에 발생하였다. 효소 카탈라제의 존재를 시험하기 위해서 시험유기체의 콜로니를 영양 아가 플레이트로부터 작은 플러그 상에서 제거하고 유리시험관의 바닥에 넣었다. 가정용 과산화수소 용액 1m1을 부드럽게 시험관의 측면을 따라 첨가하였다. 기체(산소로 추정됨)의 기포가 즉시 또는 5초 내에 발생할때 양성 반응을 기록하였다. 비접종 영양 아가 및 과산화수소 용액의 대조군도 조사하였다. 질산염 환원을 시험하기 위해서 각 배양물을 Bacto 질산염 브로쓰(Difco Laboratohes, Detroit, MI) 10 m1에 접종하였다. 28℃에서 24시간 배양한 후에 술파닐산 2방울 및 알파-나프틸아민 시약 2방울(Difco Manual,10th edition,Difco Laboratohes, Detroit, MI, 1984 참조)을 첨가하여 아질산염 생성을 시험하였다. 특유의 분홍 또는 적색의 생성은 질산염으로부터 아질산염이 형성되었음을 나타낸다. 각 균주가 성장 배지로부터 염료를 흡수하는 능력은 염료 중성 레드를 포함하는 Bacto Mac Conkey 아가; 염료 브로모티몰 블루를 포함하는 Bacto Tergito1-7 아가 및 염료 에오신-Y를 포함하는 Bacto EMB 아가(Difco Laboratohes, Detroit, MI, 모두 제조자의 지시에 따라 제조함)를 사용하여 시험하였다. 상기 배지를 접종한 후 28℃에서 5일 동안 배양하여 염료 흡수를 기록하였다.
이들 배지 상에서의 성장은 엔테로박테리아세 과의 특징이다. 각 균주의 운동성은 제조자의 지시에 따라 제조한 Bacto Modlity Test Medium (Difco Laboratohes, Detroit, MI)의 용액을 사용하여 시험하였다. 버트-스탑(butt-stab) 접종은 각 균주를 사용하여 실시하고 운동성은 접종 라인으로부터 퍼지는 성장 확산 영역에 의해 현미경으로 판단하였다. 많은 경우에 운동성은 습식 마운트 슬라이드 하에 액체 배양물로부터 현미경으로 관찰하였다. 각 균주에 대한 생화학적 영양 평가를 BBL Enterotube II (Benton, Dickinson, Gennany)를 사용하여 실시하였다. 제조자 지시에 따르되, 배양은 28℃에서 5일 동안 실시하였다. 그 결과는 앞에서 인용한 포토랍두스에 대한 기록과 일치하였다. 프로테아제 생성은 Bacto 젤라틴(Difco Laboratohes, Detroit, MI) 플레이트를 제조자의 지시에 따라 제조하여 젤라틴의 가수분해를 관찰함으로써 시험하였다. 배양물을 접종하고 플레이트를 28℃에서 5일 동안 배양하였다. 상이한 온도에서의 성장을 평가하기 위해서 아가 플레이트 [탈이온수 중의 2% Bacto-Agar를 갖는 2% 프로테오스 펩톤 #3 (Difco, Detroit, MI)]을 통상의 접종물 공급원으로 스트리킹하였다. 플레이트를 t-1 막으로 밀봉하고 3주 이하 동안 20,28 및 37℃에서 배양하였다. 37℃에서 성장을 보이지 않는 플레이트는 1주 동안 28℃ 배양기에 이송한 후 세포 생존성을 보이지 않았다. 포토랍두스 균주에 대한 산소 요구량을 다음과 같이 시험하였다. 유체 티오글리콜레이트 브로쓰 배지(Difco, Detroit, MI)로 버트-스탑 접종을 실시하였다. 튜브를 실온에서 1주 동안 배양한 후 배양물에 대해 종류 및 성장 정도를 조사하였다. 인디케이터 레사주린은 배지 산화 수준 또는 호기성 생활 영역을 나타낸다(Difco Manual,10thedition, Difco Laboratodes, Detroit, MI). 시험된 포토랍두스 균주에 대해 얻은 성장 영역 결과는 통성 혐기성 미생물에 대한 결과와 일치하였다.
*A=그람 균주, B=결정 봉입체, C=생체 발광, D=세포 형태, E=운동성, F=질산염 환원, G=카탈라제의 존재, H=젤라틴 가수분해, I=염료 흡수, J=착색, K=EMB 아가 상에서의 성장, L=MacConkey 아가 상에서의 성장, M=Tergito1-7 아가 상에서의 성장, N=통성 혐기성균, O=20℃에서의 성장, P=28℃에서의 성장, Q=37℃에서의 성장, + - +/- = 특징의 양성 또는 음성, rd=간균, S=속 범위 내의 크기, RO=레드-오렌지 색, LR=담적색, R=적색,O=오렌지색, Y=황색, T=황갈색, LY=담황색, YT=담황갈색, 및 LO=담오렌지색.
세포 지방산 분석은 속 및 종 수준에서 세균의 특성을 파악하기 위한 식별수단이고 (Tornbene, T.G.1985. Lipid Analysis and the Relationship to Chemotaxonomy in Methods in Microbiology, Vo1 18, 209-234.; Goodfellow, M. and O'Donnell, A.G. 1993. Roots of Bacterial Systernatics in Handbook of New Bacterial Systematics (ed. Goodfellow, M. O'Donnell, A.G.) pp.3-54. London:Academic Press Ltd., 이들 참고문헌은 본 명세서에 참고로 포함됨), 본 발명의 컬렉션이 속 수준에서 관련되었음을 확인하기 위해 사용하였다. Microbial ID (MlDI, Newark, DE, USA) Microbial Identihcation System(MIS)를 사용하는 지방산 메틸 에스테르 분석(FAME)을 위해 배양물을 외부의 계약 실험실에 보냈다. MIS 시스템은 25 mm x 0.2 mm 5% 메틸페닐 실리콘 융합 실리카 모세관 컬럼을 갖는 Hewlett Packard HP5890A 기체 크로마토그래피로 구성된다. 수소를 운반 기체로 사용하고 화염-이온화 검출기가 자동화 샘플러, 인테그레이터 및 컴퓨터와 함께 기능한다. 컴퓨터는 시료의 지방산 메릴 에스테르를 미생물 지방산 라이브러리 및 공지의 지방산 검정 보정 혼합물과 비교한다. 계약 실험실에서 선별한 균주를 분석전에 트립티카제 대두 아가 상에서 28℃에서 24시간 동안 성장시켰다. 시료 추출은 표준 FAME 방법에 의해 계약 실험실에서 실시하였다. 포토랍두스 외의 다른 발광세균군에 대한 균주의 직접적인 확인은 엾었다. 1군의 단리물의 지방산 프로파일을 비교하는 클러스터 분석을 실시할 때 균주 지방산 프로파일은 속 수준에서 관련되었다.
본 발명의 컬렉션에서의 포토랍두스 균주의 진화적 다양성을 각 균주의 게놈 DNA를 사용하여 PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 매개 게놈 핑거프린팅의 분석에 의해 측정하였다. 이 기술은 다양한 세균 종의 게놈 전반에 존재하는 일군의 반복 DNA 서열을 기초로 한 것이다(Versalovic, J., Schneider, M., DE Bnhjn, F.J. and Lupski, J.R. 1994. Methods Mo1. Cell. Bio1., 5, 25-40.). 이들 서열 중 반복 유전자의 회문 서열 (REP), 장내 세균 반복 유전자내 공통 서열 (ERIC) 및 BOX 성분은 세균 게놈의 조직에 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 게놈 조직은 선별에 의해 형상화되는 것으로 생각되고 밀접하게 관련된 세균 균주의 게놈 내의 이들 성분의 상이한 분산은 이들 균주의 식별에 사용될 수 있다(예를 들면, Louws, F. J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and DE Bnhjn, F.J. 1994. App1. Environ. Micro. 60, 2286-2295.). Rep-PCR은 반복서열 사이에 존재하는 크기가 상이한 DNA 단편을 증폭하기 위해 상기 반복 서열에 상보성인 을리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한다. 생성물은 각 균주에 대한 DNA ''핑거프린트''를 확립하기 위해 전기영동에 의해 분리한다.
본 발명의 균주로부터 게놈 DNA를 단리하기 위해서 세포 펠렛을 최종 용량 10 m1이 되도록 TE 완충액(10mM This-HC1, lmM EDTA, pH 8.0) 중에 재현탁시키고 5M NaC1 12m1를 첨가하였다. 이 혼합물을 15,000×g에서 20분 동안 원심분리하였다. 생성 팰렛올 TE 5.7ml 및 10% SDS 300μl 중에 재현탁시키고 20mg/m1 프로테이나제 K 60μl (Gibco BRL 제품, Grand Island, NY)을 첨가하였다.
이 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 리소자임 약 10mg을 첨가하고 혼합물을 추가로 45분 동안 배양하였다. 5M NaC1 l m1 및 CTAIVNaC1 800 μl 용액(10% w/v CTB, 3,0.7M NaC1)을 첨가하고 혼합물을 65℃에서 10분 동안 배양하고, 부드럽게 진탕시킨 후 배양하고 추가로 20분 동안 진탕시켜 세포 물질의 클리어링을 도왔다. 동량의 클로로포름/이소아밀 알콜 용액(24:1, v/v)을 첨가하고 부드럽게 혼합한 후 원심분리하였다. 이어서, 동용량의 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(50:49:1)을 사용하여 2회 추출하였다. 게놈 DNA를 이소프로판올 0.6용량을 사용하여 침전시켰다. 침전된 DAN를 유리 막대기로 수거하여 70% 에탄올로 2회 세척하고 건조시켜 STE 2 ml (10 mM Ths-HC1 pH 8.0, 10 mM NaC1, 1mM EDTA) 중에 용해시켰다. 이어서, 260 nm에서의 광학 밀도에 의해 DNA를 정량하였다. 포토랍두스 게놈 DNA의 rep-PCR 분석을 실시하기 위해서 다음과 같은 프라이머를 사용하였다:REP1R-I; 5'-IIIICGICGICATCIGGC-3' 및 REP2-I; 5'-ICGICTTATCIGGCCTAC-3'. 다음과 같은 25μl 반응물을 사용하여 PCR을 실시하였다:7.75μ1 H2O,2.5μl 10X LA 완충액(PanVera Corp., Madison, WI), 16μl dNTP 믹스 (각각 2.5mM), 각각의 프라이머 1μ1 (50pMμ1), DMSO μ1, 게놈 DNA 1.5μl(농도 0.075-0.480μg/μ1) 및 0.25μ1 TaKaRa EX Taq(PanVera Corp., Madison, WI). Perkin Elmer DNA 열 순환기(Norwalk, CT) 중에서 다음과 같은 조건을 사용하여 pCR 증폭을 실시하였다:95℃/7분, 이어서 94℃/1분, 44℃/1분, 65℃/8분의 싸이클의 35회 반복, 이어서 65℃에서 15분. 순환 후에 반응물 25μ1를 6X 겔 로딩 완충액(물 중의 0.25% 브로모페놀 블루, 40% 수크로스) 5μl에 첨가하였다. 이어서, 15x20cm 1% 아가로스 겔을 각각의 반응액 8μ1를 사용하여 TBE 완충액 (0.09 M Tris-보레이트, 0.002 M EDTA) 중에서 전개시켰다. 겔을 45V에서 약 16시간 동안 전개시켰다. 이어서, 겔을 에티듐 브로마이드 20 μg/ml 중에서 1시간 동안 염색시키고 TBE 완충액 중에서 약 3시간 동안 탈염색시켰다. 겔의 폴라로이드 사진을 UV 조명 하에 인화하였다.
각 염색에 특이적인 크기에서의 밴드의 존재 여부를 사진으로부터 기록하고 수치 분류 소프트웨어 프로그램인 NTSYS-pc (Exeter Software, Setauket, NY)에 유사성 매트릭스로서 입력하였다· 동시에 분석되는 이·콜라이 균주 HBl01 및 잔토모나스 오리재 피브이. 오리재 (Xanthomonas oryzae pv.oryzae)의 대조군은 출판된 문헌에 따른 핑거프린트를 생성시켰다 (Versalovic, J,, Koeuth, T. and Lupski, J.R. 1991. Nucleic Acids Res. 19, 6823-6831; Vera Cru, C.M., Halda-Alija, L., Louws, F., Skinner, D.Z., George, M.L., Nelson, R.J., DE Bnhjn, F.J., Rice, C. and Leach, J.E. 1995. Int. Rice Res. Notes, 20, 23-24.; Vera Cruz, C.M., Ardales, E.Y., Skinner, D.Z., Talag, J., Nelson, R. J., Louws, F. J., Leung, H., Mew, T.W, and Leach, J.E.1996. Phytopathology). 이어서, NTSYS-pc 내의 일련의 프로그램; 매트릭스의 유사성 계수(Jaccard 계수를 사용)를 생성하기 위한 SIMQUAL (정량 데이터에 대한 유사성) 및 관련 균주를 한데 모으고 페노그램(phenogram)(도 5)으로 표현될 수 있는 SAHN(연속적인, 응집성의, 헤라키칼 (Heirarchical) 및 네스티드(Nested)) 클러스터링 [UPGMA (산술평균을 사용하는 비계량 페어-그룹(Unweighted Pair-Group) 방법을 사용) 방법을 사용하여 포토랍두스 균주로부터의 데이터를 분석하였다. COPH(코페네틱 (cophenetic) 값) 및 MXCOMP (매트릭스 비교) 프로그램을 사용하여 코페네틱값 매트릭스를 생성시켜 이것과 클러스터링의 기초가 되는 본래의 매트릭스 사이의 관계를 비교하였다. 클러스터 분석에 적합한 양호함의 척도인 (r=0.8-0.9가 매우 양호하게 적합함을 나타냄) 생성되는 정상화 만텔(Mantel) 통계치 (r)을 생성시켰다. 본 발명의 경우에 r은 0.919이었다. 따라서, 본 발명의 컬렉션은 포토랍두스 속의 대표적인 용이하게 석별가능한 균주의 다양한
군으로 이루어진 것이다.
실시예 13
다양한 포토랍두스 균주에 의해 생산되는 독소(들)의 살충 효용
카픗으로 덮여진 델롱 목을 가진 500ml 트리배플드 플라스크중의, 2% 프로테오스 펩톤 #3(PP3, 미시간주 디트로이트 소재의 디프코 래버러토리즈(Difco Laboratohes) 제조) 액체 배지 175m1에 일차 변종 서브클론을 접종하여, 다양한 포토랍두스 균주의 초기 종자 배양물을 제조하였다. 각종 배양을 위한 접종물은 오일이 덮여진 아가 사면 배양물 또는 플레이트 배양물로부터 유래되었다. 접종후, 상기 플라스크를 회전식 진탕기 상에서, 150rpm에서 16시간 동안 28℃에서 배양하였다. 이어서 상기 종자 배양물은 각 균주의 정해진 발효를 위한 균일한 접종원으로서 사용되었다. 또한, 로그 후상(post-1og) 종자 배양물을 멸균의 미네랄 오일로 덮고, 멸균의 자석 교반 막대를 장래의 재현탁을 위하여 첨가하며, 배양물을 암실, 실온에서 보관함으로써, 접종물을 독소 생산 상태로 장기간 보존하였다. 활발하게 성장하는 종자 배양물 1% (예를 들어, 신선 배양물 175 ml 당 1.75 ml)를 2% PP3 신선 배지에 첨가함으로써 생산 브로쓰를 접종하였다. 브로쓰는, 실리콘 포움마개로 밀폐된 500 m1 트리배플드 플라스크 (상기 참조) 또는 2800 m1 배플드 요철면 바닥 플라스크 (500 ml 용량)에서 생산하였다. 생산 플라스크를 상기 조건 하에서 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 브로쓰를 멸균의 1 L 폴리에틸렌 병내로 분배시켜 10℃에서 1시간 동안 2600×g에서 회전시킴으로써, 세포 및 파쇄물 펠렛으로부터 분리시켰다. 액체 브로쓰는 그 후 와트만(Whatman) GF/D(2.7μm 보유) 및 GF/B (1.0μm 보유) 유리 여과기를 통하여 진공 여과시켜 파쇄물을 제거하였다. 0.5μm 개방 도관 여과기를 사용, 접선 유출 극소 여과 장치 (매사추세츠주 노쓰보로 소재의 폴 필트론 (Pall Filtron) 제조)로 브로쓰를 보다 더 정화하였다.
필요시, 브로쓰를 냉각시켜(4℃까지) 2600×g에서 여러 시간 동안 원심분리시킴으로써 추가로 정화시킬 수 있다. 상기 과정 후, 0.2μm 니트로셀룰로스 막 여과기를 사용하여 브로쓰를 여과 살균시켰다. 무균 브로쓰는 그 후, 생물학적 분석, 생화학적 분석용으로 직접 사용되었거나 분자량 10000 컷오프 M12 한외여과 장치(매사추세츠주 베벌리 소재 아미콘(Amicon) 제조) 또는 분자량 10000의 구멍 크기를 갖는 원심 분리 농축기(매사추세츠주 베드포드 소재 밀리포어(Milhpore) 제조 및 매사추세츠주 노쓰보로 소재 폴 필트론 제조)를 사용하여 농축(15배까지)시켰다. 원심 분리 농축기의 경우, 브로쓰를 2000×g에서 약 2시간 동안 원심분리시켰다.
분자량 10000 투과액을, 상응하는 잔류물에 첨가하여 분자량 10000 초과 성분의 원하는 농축액을 수득하였다. 모래를 채운 히트 블록 (heat block)에서 10분간, 10℃에서 샘플을 가열함으로써, 처리되는 브로쓰 샘플을 가열 불활성화시켰다.
서로 다른 포토랍두스 균주로부터의 브로쓰(들) 및 독소 복합체(들)은 곤충집단을 감소시키는 데 유용하며, 기술된 활성물질을, 곤층 불활성화에 효과적인 양만큼 곤총 서식지에 사용하는 것으로 이루어지는 곤총 집단 억제 방법에 사용되었다.
상기와 같이 발효시킨 포토랍두스 균주의 선별군의 브로쓰로부터 관찰된 살층 활성의 범위의 증거는 표 19에 나타나 있다. 브로쓰 농도를 중가시키거나 다른 발효 방법을 사용함으로써 상기 균주에서 부가적인 살충 활성의 검출이 가능하다. 단백질과 관계된 활성과 일관되게, 시험된 모든 균주들의 살충 활성은 열에 불안정하였다
(상기 참고).
다양한 포토랍두스 균주로부터의 배양 브로쓰(들)은 곤충 수에 대하여 차별적인 살층 활성(치사율 및(또는) 성장 저해율, 성체 출현의 감소)을 나타낸다. 보다 구체적으로, 활성은 딱정벌레 (Coleoptera) 곤층 목의 일원인 옥수수 뿌리벌레 유충 및 목화 바구미 유충에 대하여 나타난다. 딱정벌레 목의 다른 일원으로는 방아벌레, 화분 딱정벌레, 뜀벼룩 갑충, 종자 갑충 및 콜로라도 감자 딱정벌레가 있다.
활성은 별 매미층 및 옥수수 멸구에 대해서도 관찰되는데, 이들은 동시목의 일원이다. 동시목의 다른 일원으로는 멸구, 배나무이, 사과나무이, 개각층, 화이트플라이, 침벌레 및 수많은 숙주 특이 진딧물 균주들이 있다. 브로쓰 및 정제된 독소 복합체(들)은 또한 나비목의 일원인 회색담배나방, 박각시나방 및 유럽 옥수수 천공충에 대해서도 활성을 갖는다. 상기 목의 다른 전형적인 일원으로는 사탕무 행렬구더기, 양배추 자벌레, 블랙 야도충, 옥수수 귀벌레, 사과 나방, 반대좀, 화랑곡나방, 잎말이 나방, 배추 벌레, 목화다래나방, 도롱이벌레, 이스턴 텐트 나방, 잔디 포층나방 및 폴행렬구더기가 있다. 활성은 파리목의 일원인 과일파리 및 모기 유층에 대해서도 나타난다. 파리목의 다른 일원으로는 완두콩 벌레, 당근 파리, 양배추 뿌리 파리, 순무 뿌리 파리, 양파 파리, 학파리 및 집파리와 다양한 모기 종들이 있다. 브로쓰(들) 및 독소 복합체(들)은 또한, 딸기 개미 진드기, 브로드 진드기, 감귤류 적색 진드기, 유럽형 적색 진드기, 배 녹빚 진드기 및 토마트 적갈색 진드기를 포함하는 응애목의 일원인 점박이 거미 진드기에 대해 활성을 나타낸다.
옥수수 뿌리벌레 유충에 대한 활성은 하기와 같이 시험되었다. 포토랍두스 배양 브로쓰(들)(0 내지 15배 농축, 여과 살균), 2% 프로테오스 펩톤 #3, 정제 독소 복합체(들)(0.23 mg/ml) 또는 pH 7.0의 10 mM 인산 나트륨 완충액을 인공 먹이의 표면 (약 1.5cm2)에 40μ1씩 직접 도포하였다[Rose, R.I. 및 McCabe, J. M.(1973).
J. Econ. Entomol. 66,(389-400) 참조]. 독소 복합체를 pH 7.0의 10 mM 인산 나트륨 완충액에 회석시켰다. 먹이 플레이트를 무균 플로우 후드에서 공기 건조시키고, 표면 살균된 알로부터 부화시킨 단일, 신생 디아브로티카 운데심푼크타타 흐와르디(Diabrotica undecimpunctata howardi) (써든 옥수수 뿌리벌레, SCR)로 웰을 만연시켰다. 상기 플레이트를 봉인하여 습윤 성장 챔버에 두고 적당한 기간 (3 내지 5일)동안 27℃에서 유지시켰다. 그 후 치사율 및 유충 무게 측정치를 기록하였다. 일반적으로, 모든 연구에서 처리당 16마리의 곤층이 사용되었다. 대조군 치사율은 일반적으로 5% 미만이었다.
목화 바구미(Anthomonas grandis)에 대한 활성은 하기와 같이 시험되었다.
농축(1 내지 10배) 포토랍두스 브로쓰, 대조군 배지(2% 프로테오스 펩톤 #3), 정제독소 복합체(들)(0.23 g/ml) 또는 pH 7.0의 10 mM 인산 나트륨 완충액을 0.35 g의 인공 먹이 (스톤빌 옐로우 나비목 (Stoneville Yenow lepidopteran) 먹이) 표면에 60μ1씩 도포시켜 건조시켰다. 12 내지 24시간 된 목화 바구미 유충 한마리를 먹이에 놓고, 웰을 봉인시켜 50% 상대 습도하 25℃에서 5일간 유지시켰다. 그 후, 치사율 및 유충 무게를 평가하였다. 대조군 치사율은 0 내지 13%였다.
모기 유충에 대한 활성은 하기와 같이 시험되었다. 분석은 96웰 마이크로 타이터 플레이트에서 행해졌다. 각 웰에는, 200μl의 수용액(10배 농축 포토랍두스 배양 브로쓰(들)), 대조군 배지 (2% 프로테오스 펩톤 #3), 10 mM 인산 나트륨 완충액, 독소 복합체(들)(0.23 mg/ml) 또는 물 및 약 20개의, 1일된 유충(Aedesaegypti)이 포함되었다. 처리당 6웰을 사용하였다. 결과는 만연시킨 후 3 내지 4일에 해석하였다. 대조군 치사율은 0 내지 20%이었다.
과일파리에 대한 활성은 하기와 같이 시험하였다. 구입한 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 배지는, 50% 건조 배지와, 물, 대조군 배지(2% 프로테오스 펩톤 #3),10배 농축 포토랍두스 배양 브로쓰(들), 정제 독소 복합체(들)(0.23mg/ml) 또는 pH 7.0의 10 mM 인산 나트륨 완충액 중 어느 하나의 50%액체를 사용하여 제조하였다. 이것은 처리당 각각 3개의 리어링 바이알(rearingvial)에 4.0 m1의 건조 배지를 넣고 4.0 m1의 적절한 액체를 첨가함으로써 성춰되었다. 그 후 각 25 m1 바이알에 10개의 후기 영 드로소필라 멜라노가스터 구더기를 첨가하였다. 상기 바이알을 형광등하, 상온에서 실험실 벤치상에 놓아 두었다. 노출 15일 후에, 새끼 또는 성충수를 계산하였다. 물 및 대조 배지와 비교해서 성충출현은 감소하였다(0 내지 16% 감소).
다른 외부 접촉없이 활성물을 섭취하도록 고안된 섭춰 분석으로, 별 매미충성충(Macrosteles severini) 및 옥수수 식물벌레 애벌레(Peregrinus maidis)에 대한 활성을 시험하였다. 활성물/먹이 용액의 저장기는 35 × 10 mm 페트리 디쉬의 바닥 중심에 2개의 홀을 뚫어 만든다. 정사각형의 2인치 파라필름 엠 (등록상표 Panfilm M)을 디쉬 상부를 가로질러 놓고 0 링으로 고정시킨다. 그 후, 1온즈 플라스틱 컵에 약 7마리의 메뚜기를 넣고, 파라필름이 아래에 오도록 저장기를 컵의 상부에 놓는다. 이어서, 시험 용액을 홀을 통하여 저장기에 첨가한다. 10배 농축 포트랍두스 배양 브로쓰(둘)를 사용하는 시험에서는, 브로쓰 및 대조군 배지(2% 프로테오스 펩톤 #3)를 pH 7.0의 10 mM 인산 나트륨 완충액에 대하여 투석시켰으며, 그 결과로서 생기는 용액에 자당(5%까지)을 첨가하여 대조 치사율을 감소시켰다.
정제 독소 복합체(들)(0.23mg/ml) 또는 pH 7.0의 10 mM 인산 나트륨 완충액을 또한 시험하였다. 치사율은 3일째에 기록한다. 분석물은 16/8의 광주기로 상대 습도 70%하 28℃에서 배양기 내에 보존하였다. 분석물은 72시간째에 치사율을 기록하였다. 대조군 치사율은 6% 미만이었다.
나비목 유충에 대한 활성은 하기와 같이 시험하였다. 농축(10배) 포토랍두스 배양 브로쓰(들), 대조군 배지(2% 프로테오스 펩톤 #3), 정제 독소 복합물(들)(0.23mg/ml) 또는 pH 7.0의 10mM 인산 나트륨 완충액을, 표준 인공 나비목 먹이(스톤빌 옐로우 먹이, 약 1.5 cm2) 표면에 40μl씩 직접적 도포시켰다. 먹이 플레이트를 무균 플로우 후드내에서 공기 건조시켰고, 각 웰을 신생 유충 1마리로 만연시켰다.
유럽 옥수수 천공충(0strinia nubilalis) 및 박각시나방 (Manduca sexta) 알을 구입하여 부화시켰고, 회색담배나방(Heliohis virescens) 유충은 내부적으로 공급하였다. 유층으로 만연시킨 후, 먹이 플레이트를 봉인하여 습윤 성장 챔버내에 두고 적절한 기간 동안 27℃ 암실에서 유지시켰다. 치사율 및 중량 측정은 5일째에 실시하였다. 일반적으로, 모든 연구에서 처리당 16마리의 곤충이 사용되었다. 대조군 배지의 대조군 치사율은 일반적으로 4 내지 12.5%였고, 인산 완총액의 대조군 치사율은 10% 미만이었다.
점박이 거미 진드기(Tetranychus urticae)에 대한 활성은 하기와 같이 측정되었다. 어린 호박 식물을 단일 자엽으로 다듬어 10배 농축 브로쓰(들), 대조군 배지 (2% 프로테오스 펩톤 #3), 정제 독소 복합체(들)(0.23mg/ml) 또는 pH 7.0의 10mM 인산 나트륨 완충액을 흘러내릴 정도로 분무시켰다. 건조 후, 식물을 거미 진드기의 혼합 집단으로 만연시키고 실험실 온도 및 습도에서 72시간동안 유지시켰다.
그 후, 대조군의 수준을 결정하기 위하여 살아있는 진드기의 수를 세었다.
실시예 14
비 W-14 포토랍두스 균주:정제, 특성화 및 활성 범위 정제
하기와 같은 실험 방법은 W-14의 정제를 위해 개발된 것과 유사하며, 생물학적 정량 (실시예 13 참조)에서 결정된 바와 같이 써든 옥수수 뿌리벌레 (SCR)에 대하여 가장 큰 활성을 갖는 분획만을 정제하는 것을 기초로 하여 확립되었다. 일반적으로, 실시예 13에 기술된 바와 같이, 여과시킨 4 내지 20 L의 브로쓰를 수취하여, 아미콘 M-12 여과 장치에 부착되어 있는 아미콘 나선형 한외여과 카트리지 타입 S1Yl00을 사용하여 농축시켰다. 잔류물에는 100 kDa을 초과하는 분자 크기로 이루어진 천연 단백질들을 함유하고 있었고, 투과액은 크기 100 kDa 미만의 천연단백질을 함유하고 있었다. SCR에 대한 활성의 대부분은 100 kDa 잔류물에 포함되어 있었다. 그 후, 잔류물은 10 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 7.0)으로 여과물의 A280이 0.100 미만이 될 때까지 계속해서 다이아필터링(diafiltering)시켰다. 다른 언급이 없는 한, 지금부터의 모든 처리는 10 mM 인산 나트륨 (pH 7.0)으로 한정된 완충액에서 수행하였다. 잔류물은 그 후, 약 0.20L의 최종 부피까지 농축시켜 날진필터웨어 (등록상표 Nalgene Filtenvare)의 0.45 mm 무균 여과 단위를 사용하여 여과시켰다. 여과된 물질을, 퍼셉티브 바이오시스템 스프린트 (등록상표 Per Septive Biosystem Sprint) HPLC 시스템을 사용하여 완충액으로 평형시킨 퍼셉티브 바이오시스템 포로스 (등록상표 PerSeptive Biosystem Poros) 50 HQ 강력 음이온 교환매트릭스로 충전시킨 파마시아(Pharmacia) HR16/10 컬럼에 분당 7.5m1로 로딩시켰다. 로딩후, A280이 0.100이 될 때까지, 컬럼을 완충액으로 세척하였다. 이어서 0.4M NaC1을 갖는 완충액을 사용하여 단백질을 분당 2.5 m1로 20분간 전체 용량 50 ml에 대해 컬럼으로부터 용출(elution)시켰다. 그 후 컬럼은 추가로 20분간 동일한 유출 속도로 1.0M NaCl을 갖는 완충액을 사용하여 세척시켰다(최종 용량 50ml). 0.4 M 및 1.0M NaC1로 용출시킨 단백질을 별개의 투석 백(등록상표 스펙트라/포(Spectra/Por) 막 MWCO:2000에 넣고, 12L 완충액에서 4℃에서 철야 투석시켰다. SCR에 대한 활성을 가지는 대부분은 0.4 M 분획에 포함되어 있었다. 세파로스(Sepharose) CL4B (파마시아 제품)로 선 충전시킨 파마시아 XK 26/100 컬럼에 0.4 M 분획 20 ml을, 분당 0.75 ml의 유출 속도를 사용하여 로딩시킴으로써 한층 더 정제시켰다. 분획들은 A280피크 프로파일을 기초로 하여 모아 밀리포아 울트라프리-15(등록상표 Mmipore Ultrafree-15) 원심 분리 여과 장치 바이오맥스-50K(Biomax-50K) NMWL 막을 사용하여 최종 용량 0.75 m1까지 농축시켰다. 단백질 농도는, 소과의 감마 글로불린을 표준물질로 하는 바이오라드 단백질 분석 키트(Biorad Protein Assay Kit)를 사용하여 결정하였다.
특성화
SCR 독소 복합체의 천연 분자량은 완충액에 있는 세파로스 CL4B로 선총전시킨 파마시아 HR 16/50을 사용하여 결정되었다. 그 후, 컬럼을 독소의 대략적인 천연 분자 크기를 계산하기 위하여 공지된 분자 크기의 단백질을 사용하여 캘리브레이션(calibration)시켰다. 표 20에 나타낸 것과 같이, 독소 복합체의 분자 크기는 균주 Hb 경우의 777kDa 내지 균주 WX-14 경우의 1900 kDa의 범위였다. 독소 복합체의 수율 또한 다양하였는데, 균주 AVX-12 경우의 리터 당 0.8 mg 내지 균주
Hb 경우의 리터당 7.0 mg을 생산하였다.
독소 복합체에서 발견되는 단백질을 SDS-PAGE 분석을 사용하여 개개의 폴리펩티드 크기를 조사하였다. 일반적으로, 각 균주로부터의 20 mg의 독소 복합체 단백질을 2-15% 폴리아크릴아미드 겔(인테그레이티드 세퍼레이션 시스템즈(Integration Separation Systems)) 상에 로딩시켜, 바이오라드 SDS-PAGE 완충액에서 20 mA로 전기 영동시켰다. 전기 영동 완료 후, 바이오라드 쿠마지 블루 R-250 (Coonnssie blue R-250, 메탄올:아세트산:물 (용량비 40:10:40) 혼합 용액에서 2%임)에서 철야 착색시켰다. 그 후 겔을 메탄올:아세트산:물 (용량비 40:10:40)에서 탈색시켰다. 이어서, 겔을 물로 15분간 헹구고 개인용 분자 역학 레이저 농도계 (등록상표 Molecular Dynamics Personal Laser Densitometer)를 사용하여 주사시켰다. 레인을 정량화하여 200 내지 45kDa 범위의 바이오라드 고분자량 표준물에 비교하여 분자 크기를 추정하였다. 각 균주로부터의 SCR 독소 복합체를 구성하는 개개의 폴리팹티드들의 크기를 표 21에 나타내었다. 개개의 폴리펩티드들의 크기는, 균주 WX-1 경우의 230 kDa 내지 균주 WX-7 경우의 16 kDa 범위였다.
균주 Hb를 제외한 모든 균주는 160 내지 230kDa, 100 내지 160 kDa 및 50 내지 80kDa의 독소 복합체를 포함하는 폴리펩티드를 가지고 있었다. 상기 데이타는, 독소 복합체가 펩티드 조성 및 성분 면에서 균주에 따라 다를 수 있지만, 모든 경우에 있어서 독소의 특성이 대형 올리고머 단백질 복합체로 이루어짐을 나타낸다.
표 21에 나타낸 바와 같이, 균주 Hm 및 H9으로부터 정제된 독소 복합체들을 균주 W-14로부터의 독소 복합체와 비교하여 각종 곤층둘에 대한 활성을 시험하였다. 분석은 실시예 13에 기술된 바와 같이 수행하였다. 세가지 모든 균주로부터의 독소 복합체는 담배 버드 웜, 유럽 옥수수 천공층, 써든 옥수수 뿌리 벌레 및 별매미충에 대하여 활성을 나타내었다. 또한, 균주 Hm 및 W-14로부터의 독소 복합체는 점박이 거미 진드기에 대한 활성을 나타내었다. 게다가, W-14로부터의 독소 복합체는 모기 유충에 대한 활성도 나타내었다. 상기 데이타는, 독소 복합체가 몇몇 곤충 종 사이에서 유사한 활성을 가지고 있는 반면, 다른 곤층 종에 대한 차별적인 활성을 또한 나타낼 수 있음을 뜻한다.
실시예 15
포토랍두스 단백질 독소 복합체의 하위 분획
포토랍두스 단백질 독소 복합체를 실시예 14에 기술된 바와 같이 단리시켰다. 다음, 독소 약 10mg을 pH 7.0의 20 mM Tris-HC1로 평형시킨 모노큐(MonoQ) 5/5 컬럼에 1ml/분의 유출 속도로 로딩시켰다. 280nm에서의 광학상의 농도가 기준선 흡광도로 되돌아갈 때까지 컬럼을 pH 7.0의 20mM Tris-HCl로 ,세척시켰다. 컬럼에 부착되어 있는 단백질은, pH 7.0의 20 mM Ths-HCl에 녹아 있는 0 내지 1.0 M 선형 농도 구배 NaCl을 사용,1ml/분의 속도로 30분간 용출시켰다.l m1의 분획을 모아 써든 옥수수 뿌리벌레(SCR) 생물학적 졍량을 실시하였다(실시예 13 참조). 활성 피크들은 SCR 생물학적 정량에서 각 분획을 차례로 희석시킴으로써 결정하였다. SCR에 대한 두 개의 활성 피크를 관찰하였는데 이들을 A(약 0.2 내지 0.3 M NaCl에서 용출시킴.) 및 B(0.3 내지 0.4 M NaC1에서 용출시킴)
로 명명하였다. 활성 피크 A 및 B를 개별적으로 모아 하기 3단계 처리를 하여 두피크를 한층 더 정제하였다.
고형(NH4)2SO4를 상기 단백질 분획에 첨가하여 최종 농도가 1.7 M이 되게 하였다. 그 후, 단백질을 pH 7의 50 mM 인산 칼륨 완충액에 녹아 있는 1.7 M(NH4)2SO4로 평형시킨 페닐-수퍼로스 (pheny1-Suprose) 5/5컬럼에 1ml/분으로 로딩시켰다. 컬럼에 부착되어 있는 단백질들은 1.7 M (NH4)2SO4, 0% 에틸렌 글리콜, pH 7.0의 50 mM 인산 나트륨 내지 25% 에틸렌 글리콜, pH 7.0의 25 mM 인산 나트륨((NH4)2SO4부재)의 선형 농도 구배로 0.5ml/분의 속도에서 용출시켰다. 분획
은, pH 7.0의 10 mM 인산 나트륨에 대하여 철야 투석시켰다. SCR에 대한 각 분획에서의 활성을 생물학적 정량으로 결정하었다.
가장 높은 활성을 가지는 분획을 모아 pH 7.0의 20 mM Tris-HC1로 평형시킨 모노큐 5/5 컬럼에 1ml/분으로 로딩시켰다. 컬럼에 부착되어 있는 단백질들은 pH 7.0의 20mM Tris-HCl에 녹아 있는,0 내지 1 M 선형 농도 구배의 NaC1로 1m/분의 속도에서 용출시켰다.
정제의 최종 단계를 위하여, 상기 가장 높은 활성을 나타내는 분획을 모아 두번째 페닐-수퍼로스 5/5 컬럼에 로딩시켰다. 고형 (NH4)2SO4를 최종 농도가 1.7M이 되게 첨가하였다. 그 후, 용액을 pH 7.0의 50 mM 인산 칼륨 완충액에 녹아 있는 1.7 M (NH4)2SO4로 평형시킨 컬럼상에 1ml/분으로 로딩시켰다. 컬럼에 부착되어 있는 단백질들은 1.7M(NH4)2SO4, pH 7.0의 50mN 인산 칼륨 내지 pH 7.0의 10 mM 인산 칼륨 선형 농도 구배로 0.5ml/분으로 용출시켰다. 분획들을 pH 7.0의 10mM 인산 나트륨 완충액에 대하여 철야 투석시켰다. SCR에 대한 각 분획에서의 활성은 생물학적 정량으로 결정하였다.
상기 3단계 처리로, 피크 A로부터 최종 정제된 단백질을 독소 A라 명명하였고, 피크 B로부터 최종 정제된 단백질을 독소 B라 명명하였다.
독소 A 및 독소 B의 특성화 및 아미노산 서열 결정 SDS-PAGE에서, 독소 A 및 독소 B는 모두 192 kDa (각각 A1 및 B1으로 명명) 및 58 kDa (각각 A2 및 B2로 명명)인 두 개의 주요 펩티드 (전체 쿠마지 착색 단백질의 90%)를 포함하였다. 독소 A 및 독소 B는 모두 천연 PAGE 상에서는 1개의 주요 밴드만을 나타내었는데, 이는 A1 및 A2가 한 단백질 복합체의 서브유닛이며, B1 및 B2는 한 단백질 복합체의 서브유닛이라는 것을 나타낸다. 또한, 독소 A 및 독소 B 모두의 천연 분자량은 겔 여과 크로마토그래피에 의해 860 kDa으로 결정되었다. A1 대 A2의 상대 몰 농도는 SDS-PAGE 겔의 농도계 분석으로 결정한 바, 1 대 1 등량인 것으로 판단되었다. 유사하게, B1 및 B2 펩티드는 동일 몰 농도로 존재하였다.
독소 A 및 독소 B를 10% SDS-PAGE에서 전기 영동시켰으며, PVDF 막으로 이동시켜 블로팅시켰다. 아미노산 분석 및 N-말단 아미노산 서열 결정을 위하여, 블롯을 하바드 마이크로겜 (Harvard MicroChem) 및 캠브리지 프로겜(Cambridge ProChem)으로 각각 보냈다. B1의 N-말단 아미노 서열은 서열 번호 1인 tcbA 유전자의 TcbAii영역(서열 번호 12,87 내지 99 위치)와 동일하다는 것이 밝혀졌다. 펩티드 B2의 N-말단 특이 서열이 획득되었다(서열 번호:40). 펩티드 B2의 N-말단 아미노산 서열은 tcbA 유전자로부터 추정된 아미노산 서열의 TcbAii영역(서열 번호:12,1935 내지 1945 위치)와 동일하였다. 그러므로, B 독소는 동일 유전자 생성물인 TcbA로부터 유래된 것으로 관찰된 두 종의 펩티드 TcbAh 및 TcbAii를 주로 포함하고 있다.
A2의 N-말단 서열(서열 번호:41)은 TcbAiii펩티드 및 다른 펩티드와 비교시 특유하다. A2 펩티드는 TcdAiii로 나타내었다(실시예 17 참조). 서열 번호 6은 서열 번호 40 및 41의 혼합 아미노산 서열로 밝혀졌다.
펩티드 A1 및 A2에 대하여 내부 아미노산 서열 결정을 또한 실시하였다.
내부 아미노산 서열 결정을 위하여 10μg의 독소 A를 10% SDS-PAGE에서 전기영동시키고 PVDF 막에 이동시켜 블로팅시켰다. 블롯을 아미도 블랙으로 착색시킨 후, 각각 TcdAiii및 TcdAiii로 나타낸 펩티드 A1 및 A2를 블롯으로부터 오려내어 하바드 마이크로겜 및 캠브리지 프로겜으로 보냈다. 펩티드를 트립신으로 분해시킨 후 HPLC 크로마토그래피를 실시하여, 개개의 펩티드를 분리시켰다. 선택된 트립신처리 펩티드 단편에 대해 N-말단 아미노산 분석을 수행하였다. 팹티드 A1의 두 가지 내부 아미노산 서열 (TcdAii-PK71, 서열 번호:38 및 TcdAii-PK44, 서열 번호:39)은 tcbA 유전자 (서열 번호:12) TcbAii영역의 추정 아미노산 서열과 현저한 상동성를 가지고 있음이 판명되었다. 유사하게, 펩티드 A2의 N-말단 서열 (서열 번호:41) 및 두 가지 내부 서열 (TcdAiii-PK57, 서열 번호:42 및 TcdAiii-PK20, 서열번호:43)은 또한 tcbA 유전자 (서열 번호:12) TcbAiii영역의 추정 아미노산 서열과의 현저한 상동성를 보였다.
상기 결과들을 요약해 보면, 독소 복합체는 SCR에 대하여 독소 A 및 독소 B의 두 가지 이상의 활성 단백질 독소 복합체들을 가지고 있다. 독소 A 및 독소 B는 천연 분자량 및 서브유닛 분자량에 있어서 유사하지만, 그들 펩티드의 조성은 다르다. 독소 A는 펩티드 TcdAiii및 TcdAiii를 주요 펩티드로서 포함하고 있으며, 독소 B는 펩티드 TcbAii및 TcdAiii를 주요 펩티드로서 포함하고 있다.
TcbA 펩티드의 분해 및 활성화 독소 B 복합체에서 펩티드 TcbAii및 TcbAiii는 단일 유전자 생성물인 TcbA로부터 유래한다(실시예 15). TcbA 펩티드가 TcbAii및 TcbAiii로 프로세싱되는 것은 아마도 포토랍두스 단백질 분해효소(들), 가장 가능성 있게는, 실시예 10에서 기술한 메탈로프로테아제의 작용에 의한 것으로 추정된다. 몇및 경우에서, 포토랍두스 W-14 브로쓰가 프로세싱되었을 때 팹티드 TcbAii및 TcbAiii뿐만 아니라 TcbA 펩티드도 독소 B 복합체에서 주요 성분으로 존재한다는 것을 알았다. W-14 브로쓰의 독소 복합체 분획으로부터 펩티드 TcbA를 모으기 위해, 독소 B 복합체의 정제에서 기술된 것과 (실시예 15) 동일한 방법을 사용하였다. 최종 정제 물질을 4-20% 농도구배 SDS-PAGE에서 분석하였으며, 주요 펩티드는 농도계로 정량하였다. TcbA, TcbAii및 TcbAiii는 각각 전체 단백질의 58%,36% 및 6%이었다. 상기 펩티드들의 본질은 SDS-PAGE에서의 각각의 분자 크기와 단일특이 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 상기 분획의 천연 분자량은 860 kDa으로 결정되었다.
상기 정제 물질에,38 kDa 및 58 kDa인 정제 W-14 포토랍두스 메탈로프로테아제로 처리하고 (실시예 10) 대조군 효소로서 트립신 (미주리주 소재, 시그마(Sigma))을 처리함으로써 TcbA의 분해를 평가하였다. 표준 반응물에는, 전체 용량 100μ1 중에 상기 정제 분획 17.5μg, 1.5 단위 프로테아제, 및 pH 8.0의 0.1M Tris 완충액이 포함되어 있다. 대조군 반응에서는 프로테아제가 없다. 반응 혼합물을 37℃에서 90분간 방치하였다. 반응 종결시에 20μl를 취하였으며, 4-20% 농도구배 SDS-PAGE에서의 전기 영동 분석을 위하여 SDS-PAGE 샘플 완충액으로 즉시 끓였다. 38 kDa 및 58 kDa 프로테아제 처리 모두에서, 펩티드 TcbAii및 TcbAiii의 양은 약 3배 증가한 반면, TcbA 펩티드의 양은 비례적으로 감소하였음이 SDS-PAGE로부터 결정되었다(표 23). 선택된 펩티드의 상대적인 감소 및 증가는 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 또한, 분해된 물질을 겔 여과시켜 본 결과, 상기 복합체의 천연 분자 크기가 변화하지 않았음을 알 수 있었다. 트립신 처리시, 펩티드 TcbA 및 TcbAii가 작은 펩티드들로 비특이적으로 분해되었다. 이는, 38kDa 및 58kDa 포토랍두스 프로테아제가 펩티드 TcbA를 펩티드 TcbAii및 TcbAiii로 특이적으로 프로세싱시킬 수 있음을 나타내는 것이었다. 남아있는 80μ1 반응 혼합물의 프로테아제 처리 및 비처리 대조군을 pH 7.0의 10 mM 인산 나트륨 완충액으로 연속적으로 희석하여 SCR 생물학적 정량으로 분석하였다. 여러 희석물에서의 활성을 비교함으로써 38 kDa 프로테아제 처리시 SCR 살충 활성이 약 3 내지 4배 증가되었음이 나타났다. 또한, 프로테아제 처리에서, 남아있는 곤충들의 성장 저해율은
대조군 보다 심각하였다(표 23).
실시예 17
TcdAii펩티드를 코딩하고 있는 유전자 라이브러리의 스크리닝 서열 번호 17(내부 펩티드 TcdAii-PTl1l N-말단 서열) 및 서열 번호 18(내부 펩티드 TcdAii-PT79 N-말단 서열)에서 기술된, TcdAii펩티드를 코딩하는 유전자의 클로닝 및 특성화가 완료되었다. 서열 번호 17(표 24) 및 서열 번호 18(표 25)의, 아미노산 서열을 코딩하도록 설계된 두 가지 풀의 축퇴성 올리고뉴클레오티드 및 그러한 서열의 역방향 상보체들을 실시예 8에 기술된 바와 같이 합성하였다.
올리고뉴클레오티드들의 DNA 서열을 하기에 나타내었다.
모든 전향/역방향 조합에서, 전향 프라이머로서 P2.3.6CB 또는 P2.3.5 및 역방향 프라이머로서 P2.79.R.1 또는 P2.79RCB를 사용하고, 주형으로서 포토랍두스 W-14 게놈 DNA를 사용, 본질적으로 실시예 8에 기술된 바와 같이, 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하였다. 다른 반응 세트에서는, 모든 전향/역방향 조합에서, 전향 프라이머로서 프라이머 P2.79.2 또는 P2.79.3을 사용하였고, 역방향 프라이머로서 P2.3.5R, P2.3.5RI, 및 P2.3R.CB를 사용하였다. 전향 프라이머로서 P2.3.6.CB, 역방향 프라이머로서 P2.79.R.1 또는 P2.79R.CB를 포함하는 반응에서만 2500 염기쌍의 추정
크기(아가로스 겔 상의 이동성)를 가지는 비유사 증폭 생성물이 관찰되었다. 상기 증폭 생성물을 수득하기 위해 사용된 프라이머의 서열은, 펩티드 단편 TcdAii-PT111이 펩티드 단편 TcdAii-PT79의 아미노-인접부위에 있음을 나타낸다.
2500 bp PCR 생성물은 제조업자의 지시에 따라 플라스미드 벡터 pCRTMⅡ(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로젠(Invitrogen) 제조)에 라이게이션시켰고, 두가지 단리물(HS24 및 HS27)의 삽입체 단편의 DNA 서열은 제조자가 제시한 상기 프라이머 및 서열 분석 방법을 사용하여 결정하였다. 두가지 단리물 모두의 서열은 동일하였다. 신규 프라이머는 결정된 서열을 기초로 하여 합성시켰고, 전체 2557 염기의 삽입체(서열 번호 36)의 서열을 수득하기 위한 추가 서열 분석 반응을 프라이밍하기 위해 상기 신규 프라이머를 사용하였다. 서열 번호 36에 의해 코딩되는 펩티드의 부분 해독으로 서열 번호 37에 공개된 845 아미노산 서열을 얻는다. TcdAii펩티드 단편의 상기 부위의 단백질 상동성 분석에는, 단백질 TcbA(서열 번호 12)의 542 내지 1390 잔기에 대해 상당한 아미노산 상동성(68% 유사성, 53% 동일성)가 나타난다. 따라서, 서열 번호 36에 부분적으로 나타낸 유전자는 TcbA 단백질과 유사하지만 동일하지는 않은 아미노산 서열을 나타내고, TcbA 단백질과 유사하지만 동일하지는 않은 생물학적 활성을 가지고 있다는 것이 명백하다.
다른 경우에서는, 서열 번호 9(내부 펩티드 TcdAii-PK44 서열) 및 서열 번호 41(TcdAiii58 kDa N-말단 펩티드 서열)에 기술되어 있는 펩티드 TcdAii-PK44 및 TcdAiii58 kDa N-말단 펩티드를 코딩하는 유전자가 단리되었다. 서열 번호 39(표 27) 및 서열 ID 번호 41 (표 26)에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하기 위하여 설계된, 두 가지 풀의 축퇴성 올리고뉴클레오티드 및 그 서열의 역방향 상보체를 실시예 8 및 그들의 DNA 서열에 기술되어 있는 것과 같이 합성하였다.
모든 전향/역방향 조합에서, 전향 프라이머로서 Al.44.1 또는 A1.44.2 및 역방향 프라이머로서 A2.3R 또는 A2.4R을 사용하고, 주형으로서 포토랍두스 W-14 게놈 DNA를 사용하여, 본질적으로 실시예 8에 기술된 바와 같이 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하였다. 다른 반응 세트에서는, 모든 전향/역방향 조합에서, 전향 프라이머로서 프라이머 A2.1 또는 A2.2를 사용하었고, 역방향 프라이머로서 A1.44.1R 및 Al.44.2R을 사용하였다. 전향 프라이머로서 Al.44.1 또는 Al.44.2, 역방향 프라이머로서 A2.3R을 포함하는 반응에서만 1400 염기쌍의 추정 크기 (아가로스 겔 상의 이동성)를 가지는 비유사 증폭 생성물이 관찰되었다. 상기 증폭 생성물을 수득하기 위해 사용된 프라이머의 서열은 펩티드 단편 TcdAio-PK4가 TcdAiii의 58 kDa 팹티드 단편의 아미노-인접부위에 있음을 나타낸다.
1400 bp PCR 생성물은 제조자의 지시에 따라 플라스미드 벡터 pCRTMⅡ 라이게이션시켰다. 네가지 단리물의 삽입체 단편의 DNA 서열은, 제조자가 제시한 프라이머와 유사한 서열의 프라이머 및 상기 서열 분석 방법을 사용하여 결정하였다.
모든 단리물들의 핵산 서열은 예상했던 바와 같이 축퇴 프라이머 서열에 상응하는 부위에서 달랐으나, 상기 데이타로부터 추정된 아미노산 서열은 상기 결정된 펩티드의 실제 아미노산 서열과 동일하였다(서열 번호 41 및 39).
실시예 8에 기술된 바와 같이, 상기 제조된 DNA (서열 번호 36)로 이루어진 식별용 동위원소로 표지된 프로브를 사용하여, W-14 게놈 코스미드 라이브러리의 스크리닝을 실시하여 5개의 하이브리드화 코스미드 단리물, 즉 17D9, 20B10, 21D2, 27Bl0, 및 26D1을 동정하였다. 상기 코스미드들은, 서열 번호 11 또는 서열 번호 25에 기술된 바와 같은 유전자에 대응하는 프로브로 이전에 동정되었던 코스미드들과는 다른 것들이었다. 제한 효소 분석 및 DNA 블롯 하이브리드화를 실시하여 서열 번호 36의 DNA를 포함하는 부위인, 약 3.7,3.7, 및 1.l kbp의 크기를 갖는 3개의 EcoRI 단편를 동정하였다. 본 실시예에서 제조된, 동위 원소 표지된 1.4 kbp DNA 단편를 프로브로 사용하여 W-14 게놈 코스미드 라이브러리를 스크리닝하여, 동일한 5개의 코스미드(17D9, 20Bl0, 21D2, 27Bl0, 및 26Dl)를 동정하였다. EcoR1으로 분해된 코스미드 DNA에 대한 DNA 블롯 하이브리드화는 또한, 2.5 kbp TcdAii유전자 프로브에서 보여지는 것과 같이 EcoRI 단편의 동일 서브세트에 대한 하이브리드화를 나타내었는데, 이는 두 단편 모두가 게놈 DNA 상에 코딩되어 있음을 나타내는 것이다.
클로닝된 EcoRI 단편의 DNA 서열 결정으로 2516 아미노산 (서열 번호 47)의 282.9 kDa 단백질을 코딩하는 7551 염기쌍 (서열 번호 46)의 비단속 해독 프레임이 밝혀졌다. 상기 단백질의 아미노산 서열 분석으로, 펩티드 TcdAii의 예상되었던 모든 내부 단편 (서열 번호 17,18,37,38 및 39)와 TcdAiii펩티드 N-말단 (서열 번호 41) 및 모든 TcdAiii내부 펩티드 (서열 번호 42 및 43)가 밝혀졌다. TcdAii및 TcdAiii로 단리 및 동정된 펩티드는 서열 번호 46으로 나타낸, tcdA로 표시된 개방해독 프레임의 각각의 생성물이다. 또한, 서열 번호 47은, 89 위치에서 출발하여 약 201 kDa 크기 펩티드의 N-말단 서열인 서열 번호 13에 개시된 서열을 예시하는데, 이는 서열 번호 46으로부터 생성된 초기 단백질이 앞에서 밝힌 서열 번호 12에서와 유사한 방식으로 프로세싱됨을 나타낸다. 또한, 상기 단백질은 더한층 분해되어 서열 번호 48에 의해 코딩되고 서열 번호 49 (TcdAii팹티드)로서 개시된 209.2 kDa 크기의 생성물과, 서열 번호 50에 의해 코딩되고 서열 번호 51 (TcdAiii펩티드)로서 개시된 63.6 kDa 크기의 생성물을 생기게 한다. 따라서, 서열 번호 47로 개시된 282.9 kDa 크기의 전길이 단백질로 예시되는 바와 같이, 서열 번호 46의 생성물로부터 유래되는 독소 A (실시예 15)로 동정되는 살충 활성은 프로세싱되어 서열 번호 49 및 51로 개시된 펩티드를 생산하는 것으로 생각된다. 독소 B(실시예 15)로 동정되는 살충 활성은, 서열 번호 12로 개시된 280.6kDa 단백질로 예시되는 서열 번호 1l의 생성물로부터 유래하는 것으로 생각된다. 상기 단백질은 단백질 가수 분해에 의해 프로세싱되어, 서열 번호 52에 의해 코딩되는, 서열 번호 53으로 개시된 207.6kDa 펩티드와, 서열 번호 54에 의해 코딩되는, 서열 번호 40 및 서열 번호 55로 개시된 N-말단 서열을 가지고 있는 62.9 kDa 펩티드를 생산한다.
서열 번호 12로 개시된 단백질과 서열 번호 47로 개시된 단백질의 아미노산서열을 비교해 보면, 69% 유사성 및 54% 동일성을 나타낸다. 상기 고도의 진화론적인 관계는 상기 펩티드들의 전체 아미노산 서열을 통하여 일률적이지는 않지만, 단백질의 카르복시-말단 끝으로 갈수록 그 정도가 더 커지는데, 이는 서열 번호 55(서열 번호 47로부터 유래)과 서열 번호 55(서열 번호 12로부터 유래)로 개시된 펩티드들이 76% 유사성 및 64% 동일성을 가지고 있기 때문이다.
실시예 18
포토랍두스(균주 W-14) 브로쓰의 분무 사용에 의한, 유럽 옥수수 천공충에 의해 야기된 옥수수 식물 잎 손상의 제어
곤충 유충에 의해 야기되는 식물 손상을 감소시키는 포토랍두스 독소(들)의 능력을, 포토랍두스 브로쓰로 처리한 옥수수 식물상에 만연시킨 유럽 옥수수 천공충(Osthnia nubilalis)에 의해 야기된 잎 손상을 측정함으로써 증명하였다. 포토랍두스 균주 W-14로부터의 발효 브로쓰를 만들어 실시예 13에 기술된 바와 같이 한의여과(1000MW 구멍 크기)를 사용하여 약 10배 농축시켰다. 그 결과 생성된 농축 브로쓰를 0.2미크론 니트로셀룰로스 막 여과기를 사용하여 여과 살균시켰다. 유사하게 만들어진, 접종시키지 않은 2% 프로테오스 펩톤 #3 샘플을 대조군 목적으로 사용하였다. 옥수수 식물 (다우엘카노 (DowElcano) 독점 번식 계열)은, 온실 내 흙을 사용하지 않는 혼합물을 포함하는 화분에서 종자로부터 식물 단계 7 또는 8까지 성장시켰다(낮 27℃, 밤 22℃, 약 50%의 상대 습도, 낮길이 14시간, 필요시 물/비료 공급). 시험 식물들은, 낮 온도 약 22℃, 밤 온도 약 18℃, 인공 조명 무 및 부분 차광, 약 50%의 상대 습도 및 필요시 물/비료 공급하는 온실에서, 랜덤한 완전 차단설계 (3 렙/처리, 6 식물/처리)로 준비하였다. 처리 (접종시키지 않은 배지 및 농축 포토랍두스 브로쓰)는 주사기 분무기를 사용하여 나선부 위 (약 6인치)로부터 직접적으로 2.0 ml을 적용하고, 추가로 2.0 ml을 나선부 위 약 30cm (약 1 걸음)에서 원형 이동으로 도포시켰다. 또한, 식물의 한 집단은 아무 처리도 하지 않았다. 처리물이 마른 후 (약 30분),12개의 신생 유럽 옥수수 천공충 유충 (알은 구매원으로부터 구입하여 부화시켰음)을 나선부에 직접적으로 적용하였다. 1주일 후, 변형된 구트리 스케일 (Guthrie Scale)을 사용하여 잎에 대한 손상을 기록하였고 [Koziel, N. G., Beland, G. L., Bovvam, C., Carozzi, N. B., Crenshaw, R., Crossland, L., Dawson, J., Desai, N., Hill, M., Kadwell, S., Launis, K., Lewis, K., Maddox, D., McPherson, K., Meghji, M.Z., Merlin, E., Rhodes, R., Warren, G.W, Wright, M. 및 Evola, S. V., 1993, Bio/Techno1ogy,11,194-195 참조], 그 기록을 통계적으로 비교하였다 (T-시험 (LSD) p0.05 및 투키의 연구원화 범위 (Tukey's Studentized Range (HSD) 시험 p0.1). 결과는 표 28에 예시되어 있다. 참고로, 스코어 1은 손상이 없음을 나타내며, 스코어 2는 바늘구멍이 엾이 펴지지 않은 잎 위에 미세한 윈도 페인 (window pain 손상을 나타내고, 스코어 5는 길다란 손상의 잎 관통 및(또는) 3개 이상의 잎에 명확한 중앙 엽맥 섭식 (손상 1인치)을 나타낸다. 상기 데이타는 브로쓰 또는 다른 단백질 포함 분획이 분무 가능 제제로 전달되거나 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 유전자 또는 그의 유도체가 트랜스제닉 식물 또는 세균을 통하여 전달될 때, 특정 해충에 대한 방어력을 제공할 수 있음을 나타낸다.
실시예 19
대장균에서의 발현을 위한 유전자들의 유전 공학 구조물의 유약
일련의 플라스미드들을 포토랍두스 W-14의 tcbA 유전자를 대장균에서 발현시키기 위하여 제작하였다. 플라스미드의 목록은 표 29에 나타내었다. 각 구조물의 간단한 설명 및 획득된 대장균 발현 데이타의 요약도 나타내었다.
pDAB634의 제작
TcbAd 프로브에 하이브리드화하는 큰 EcRⅠ 단편가 실시예 9에 기술되어 있다. 상기 단편를 pBC(캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진(Stratagene) 제조 내로 서브클로닝시켰다. 서열 분석을 해 보면 상기 단편가 8816 염기쌍이라는 것이 나타난다. 상기 단편은 571 위치에서 개시 ATG를, 8086 위치에서 종결 TAA를 가지고 있는 tcbA 유전자를 코딩한다. 그러므로 상기 단편은, ATG의 상류에 570 염기쌍의 포토랍두스 DNA 및 TAA의 하류에 730 염기쌍을 가지고 있다.
플라스미드 pAcGP67B/tcbA의 제작
5' 프라이머(S1Ac51)인 5' TTT AAA CCA TGG GAA ACT CAT TAT CAA GCA CTA TC 3' 및 3' 프라이머(S1Ac31)인 5' TTT AAA GCG GCC GCT TAA CGG ATG GTA TAA CGA ATA TG 3'을 사용하여 tcbA 유전자를 PCR로 증폭시켰다. 물 57.5ml, 10X LA 완충액 10ml, dNTPa 16ml(각각이 2.5mM인 원액), 10pmoles/ml로 각 프라이머 20ml, W-14tcbA 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pDAB634를 300ng, TaKaRa LA Taq 폴리머라제 1m1의 반응 조건에서 판베라 (PanVera, 위스콘신주 메디슨 소재)로부터 구입한 TaKaRa LA PCR 키트를 사용하여 PCR을 수행하였다. 싸이클링 조건은 98℃/20초, 68℃/5분, 72℃/10분의 30회 싸이클이었다. 약 7526bp로 예상되는 PCR 생성물을 TBE 완충액(100mM Tds,90 mM 붕산 (Boric acid),1 mM EDTA)를 사용한 0.8% 아가로스 겔에 서 단리시켜 퀴아젠 (Qiagen, 캘리포니아주 챗스워쓰 소재)으로부터 구입한 Qiacx II 키트를 사용하여 정제하였다. 정제된 tcbA 유젼자를 Nco I 및 Not I으로 잘라 배큘로바이러스 이동 벡터인 pAcGP67B (갤리포니아주 산 디에고 소재의 파밍젠(PharMingen) 제조) 내로 라이게이션시키고, 이를 사용하여 DH5α 대장균을 형질전환시켰다. 그 후 tcbA 유전자를 pAcGP67B로부터 잘라내어 pET27b로 옮겨 플라스미드 pDAB3635를 만들었다. tcbA 유전자 내의 미스센스 돌연 변이는 pDA133635에서 복구되었다. 복구된 tcbA 유전자는 서열 번호 11에 나타낸 서열로부터 212에서의 AG 변환은 아스파라긴 71을 세린 71로 변화시키고 229에서의 GA 변환은 알라닌 77을 트레오닌 77로 변화시키는 두 가지 변화를 포함하고 있다. 상기 변화 모
두는 제안된 TcbAiiN-말단의 상류에서 일어난다.
pET15-tcbA의 제작
pDAl3635의 tcbA 코딩 부위를 벡터 pET15b로 옮겼다. 이는 숏건(shotgun) 라이게이션법을 사용하여 실시하였으며, DNA는 제한 효소 Nco I 및 XhoI으로 분해하였다. 그 결과 생성되는 재조합형을 pET15-tcbA라 명명하였다.
대장균에서의 플라스미드 pET15-tcbA로부터의 TcbA 발현
대장균에서의 tcbA의 발현은 Studier 등에 의해 종래에 기술된 방법을 변형시킴으로써 성취되었다(Studier, F.W., Rosenberg, A., Dunn, J., 및 Dubendorff, J.,(1990)Use of T7 RNA polymerase to direct expression of c1oned genes.
Methods Enzymo1.,185:60-89). 수용성 대장균 세포 균주 BL21(DE3)를 플라스미드 pET15-tcbA로 형질전환시켜 100 μg/m1의 암피실린 및 40 mM의 포도당을 함유하는 LB 아가상에 도말하였다. 형질전환시킨 세포들은, 수백개의 단리된 콜로니/플레이트의 밀도가 되도록 도말하였다. 37℃에서 철야 방치한 후 세포를 플레이트로부터 긁어 모아 100 μ/m1의 암피실린을 포함하는 LB 브로쓰에 현탁시켰다. 일반적인 배양 용량은 200 내지 250 m1이었다. 시간 0에서, 배양물 밀도 (OD600)는 실험에 따라 0.05 내지 0.15였다. 배양물은 세 종류의 온도 (22℃,30℃ 또는 37℃) 중 어느 하나의 온도에서 0.15 내지 0.5의 밀도가 획득될 때까지 흔들어 주었고, 상기 밀도가 획득되었을 때에 1 mM 이소프로필티오-β-갈락토시드 (IPTG)로 유도시켰다. 배양균은 지정된 온도에서 4 내지 5시간 동안 배양시킨 후 처리를 할 때까지(12 내지 72 시간) 4℃로 옮겨서 방치하였다.
대장균에서 발현시킨 플라스미드 pET15-tcbA로부터의 TcbA의 정제 및 특성화
TcbA 펩티드를 발현하는 대장균 배양물을 하기와 같이 처리하였다. 17000×g에서 원심분리하여 세포를 수확하였으며 배지를 따라 별도의 용기에 모아 두었다.
배지는 M12 (매사추세츠주 베벌리 소재의 아미콘 (Amicon) 제조) 여과 시스템 및 100 kD 분자 크기 컷 오프 여과기를 사용하여 약 8× 농축시켰다. 농축시킨 배지를 음이온 교환 컬럼상에 로딩시켰으며, 부착된 단백질을 1.0 M NaC1로 용출시켰다. 1.0 M NaC1 용출 피크는 써든 옥수수 뿌리 벌레 (SCR) 유총에 대하여 살충효과를 야기하는 것으로 밝혀졌다(표 30), 1.0 M NaC1 분획을 pH 7.0의 10 mM 인산 나트륨 완충액에 대하여 투석시켜 농축시켰으며, 세파로스 CL-4B (뉴저지주 피스카타웨이 소재의 파마시아 제조) 상에서 겔 여과시켰다. 천연 W-14 독소 복합체의 추정 분자량 (약 900 kDa)에 대응하는 CL-4B 용출 프로파일의 영역을 모아 농축시켰으며 유충에 대하여 생물학적 정량을 실시하였다. 모아진 900 kDa 분획은 천연 W-14 독소 복합체에 의해 야기되는 것과 유사한 징후를 갖는 살충 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다 (하기 표 30 참조). 이 분획은 프로테이나제 K 및 열처리에 민감하였고, 두 경우 모두에서 활성이 소멸되거나 감소하였는데, 이는 활성이 사실상 단백질성에 의한 것이라는 증거를 제공한다. 또한, 활성 분획은 항-TcbAiii모노클로날 항체로 시험시, 면역블롯 분석에서 TcbA 및 TcbAiii펩티드에 대해 면역학적 양성 여부를 시험하였다 (표 30).
세포 팰렛을 pH 7.0의 10mM 인산 나트륨 완충액에 재현탁시켰으며 등록상표 Bio-Neb 세포 네불라이저 (nebulizer, 인디아나주 테라 호트 소재의 글라스-콜 인크.(Glas-Co1 Inc.) 제조)에 통과시켜 용균시켰다. 펠렛을 DNase로 처리하여 DNA를 제거하였으며,17000×g에서 원심분리하여 세포 상등액과 세포 팰렛을 분리시켰다. 상등액 분획을 따라내어 0.2 미크론 여과기를 통하여 여과시켜 큰 입자를 제거하였으며, 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하였다. 부착된 단백질을 1.0M NaCl로 용출시켜 투석시켰으며, 50000 달톤의 분자 크기 컷 오프를 가지는 등록상표 바이오맥스 농축기 (매사추세츠주 베드포드 소재의 밀리포아 코포레이션 제조)를 사용하여 농축시켰다. 농축된 분획은 세파로스 CL-4B 비드로 된 매트릭스를 사용하여 겔 여과 크로마토그래피를 실시하였다. 상기 방식으로 제조된 물질의 생물학적 정량 데이타는 표 30에 예시되어 있으며, TcbA 세포 상등액으로 나타내었다.
많은 양의 물질을 다루는 다른 방법에서, 세포 팰렛을 pH 7.0의 10 mM 인산나트륨 완충액에 재현탁시켰으며, 콘테스 글래스 캄파니 (Kontes Glass Company, 뉴저지주 바인랜드 소재)의 40 ml 조직 분쇄기를 사용하여 완전히 균질화시켰다.
세포 파쇄물은 25000 × g에서 원심분리하여 팰렛화하였고, 세포 상등액을 따라내어 0.2 미크론 여과기를 통과시켰으며, 다공성 HQ 50 비드로 충전시킨 파마시아 10/10 컬럼을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하였다. 부착된 단백질은 0.0 내지 1.0 M의 NaCl 농도구배를 실시하여 용출시켰다. TcbA 단백질을 포함하는 분획을 조합시켜 50 kDa 농축기를 사용하여 농축시켰으며, 파마시아 CL-4B 비드로된 매트릭스를 사용하는 겔 여과 크로마토그래피를 실시하였다. 약 900 kDa의 분자 크기를 가지는 TcbA 을리고머를 포함하는 분획을 모았으며, 상기 분획올 pH 7.3의 20mM Tris 완충액으로 평형시킨 파마시아 모노 Q 10/10 컬럼을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하였다. 재조합 TcbA 단백질을 용출시키기 위하여 0.0 내지 1.0 M 선형 농도 구배의 NaC1이 사용되었다. 재조합 TcbA는 천연 TcbA 을리고머가 모노 Q 10/10 컬럼으로부터 용출되는 것과 동일한 몰 농도인 약 0.3 내지 0.4 M NaCl 염 농도에서 컬럼으로부터 용출되었다. 재조합 TcbA 분획은 표 30에서의 실험과 유사한 생물학적 정량 실험에서 SCR 치사를 유도하는 것으로 밝혀졌다.
서열 리스트
(1) 일반 정보
(i) 출원인:엔사인, 제랄드씨.
보웬, 데이빗 제이.페텔, 제임스
패틱, 레이먼드 슈노버, 수
프렌치 -콘스탄트, 리차드오르, 그레고리 엘.
멀로, 도널드 제이.로버츠, 진 엘.
로셀로, 토마스 에이 블랙번, 마이클 비.헤이, 티모시 디.
스트릭랜드, 제임스 에이.
(ii) 발명의 명칭:포토랍두스(Photorhabdus)로부터의 살충 단백질 독소
(iii) 서열수:61
(ⅳ) 서신 주소:
(A) 수신인:쿠아를리스 앤드 브래디
(B) 거리:사우쓰 핀크니 스트리트
(C) 도시:메디슨
(D) 주:위스콘신주
(E) 국명:미국
(F) 우편번호:53703
(v) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 유형:플로피 디스크
(B) 컴퓨터:IBM PC 호환성
(C) 운영 체제:PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어:PatentIn 발매 #1.0, 버전 #1.30
(vi) 현재 출원 데이타:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(ⅶ) 우선 출원 데이타:
(A) 출원 번호:US 08/063,615
(B) 출원일:1993. 5.18.
(vii) 우선 출원 데이타:
(A) 출원 번호:US 08/395,497
(B) 출원일:1995. 2.28.
(ⅶ) 우선 출원 데이타:
(A) 출원 번호:US 60/007,255
(B) 출원일:1995.11. 6.
(ⅶ) 우선 출원 데이타:
(A) 출원 번호:US 08/608,423
(B) 출원일:1996. 2.28.
(ⅶ) 우선 출원 데이타:
(A) 출원 번호:US 08/705,484
(B) 출원일:1996. 8.28.
(ⅷ) 대리인/대리회사 정보:
(A) 성명:세아이, 니콜라스 제이
(B) 등록 번호:27386
(C) 참조/보관 번호:960296.93804
(ⅸ) 전자통신 정보:
(A) 전화:608-251-5000
(B) 팩스:608-251-9166
(2) 서열 동정 번호 1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열특성:
(A) 길이:11 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(ⅸ) 서열 정의:서열 동정 번호 1:
Phe Ile Cln Gly Tyr Ser Asp Leu Phe Gly Asn
1 5 10
(2) 서열 동정 번호 2에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:12 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(xⅰ) 서열 정의:서열 동정 번호 2:
Met Gln Asp Ser Prㅇ Glu Val Ser Ile Thr Thr Trp
1 5 10
(2) 서열 동정 번호 3에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:19 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 3:
Ser Glu Ser Leu Phe Thr Gln Thr Leu Lys glu ala Arg Arg Asp Ala
1 5 10 15
Leu Val Ala
(2) 서열 동정 번호 4에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:14 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 4:
Ala Ser Pro Leu Ser Thr Ser Glu Leu Thr Ser Lys Leu Asn
1 5 10
(2) 서열 동정 번호 5에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:9 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 5:
Ala Gly Asp Thr Ala Asn Ile Gly Asp
1 5
(2) 서열 동정 번호 6에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:15 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 6:
Leu Gly Gly Ala Ala Thr Leu Leu Asp Leu Leu Leu Pro Gln Ile
1 5 10 15
(2) 서열 동정 번호 7에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:11 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 7:
Met Leu Ser Thr Met Glu Lys Gln Leu Asn Glu
1 5 10
(2) 서열 동정 번호 8에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:9 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 8:
Met Asn Leu Ala Ser Pro Leu Ile Ser
1 5
(2) 서열 동정 번호 9에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:16 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 9:
Met Ile Asn Leu Asp Ile Asn Glu Gln Asn Lys Ile Met Val Val Ser
1 5 10 15
(2) 서열 동정 번호 10에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:20 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 10:
(2) 서열 동정 번호 11에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:7515 염기쌍
(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(iii) 특징:
(A) 명칭/키:CDS
(B) 위치:l..7515
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 11:
(2) 서열 동정 번호 12에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:2505 아미노산
(B) 유형:아미노산
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 12:
(2) 서열 동정 번호 13에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:12 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:펩티드
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 13:
(2) 서열 동정 번호 14에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:12 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:펩티드
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 14:
(2) 서열 동정 번호 15에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:9 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:펩티드
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 15:
(2) 서열 동정 번호 16에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:5 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:펩티드
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 16:
(2) 서열 동정 번호 17에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:10 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:펩티드
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 17:
(2) 서열 동정 번호 l8에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:16 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:펩티드
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 18:
(2) 서열 동정 번호 19에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:21 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 븐쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:펩티드
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 19:
(2) 서열 동정 번호 20에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:12 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:펩티드
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 20:
(2) 서열 동정 번호 21에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:26 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:펩티드
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 21:
(2) 서열 동정 번호 22에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:15 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:펩티드
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 22:
(2) 서열 동정 번호 23에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:13 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:펩티드
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 23:
(2) 서열 동정 번호 24에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:22 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:펩티드
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 24:
2) 서열 동정 번호 25에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:6005 염기쌍
(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(iv) 특징:
(A) 명칭/키:RBS
(B) 위치:1..9
(iv) 특징:
(A) 명칭/키:CDS
(B) 위치:16..3585
(D) 기타 정보:/생성물= ''P8''
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 25:
(2) 서열 동정 번호 26에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:1190 아미노산
(B) 유형:아미노산
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 26:
(2) 서열 동정 번호 27에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:1881 염기쌍
(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(iv) 특징:
(A) 명칭/키:CDS
(B) 위치:1..1881
(D) 기타 정보:/생성물= ''P8''
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 27:
(2) 서열 동정 번호 28에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:627 아미노산
(B) 유형:아미노산
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 28:
(2) 서열 동정 번호 29에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:1689 염기쌍
(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(iv) 특징:
(A) 명칭/키:CDS
(B) 위치:1..1689
(D) 기타 정보:/생성물= ''S8''
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 29:
(2) 서열 동정 번호 30에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:563 아미노산
(B) 유형:아미노산
(D) 형태:선형
(xi) 서열 정의:서열 동정 번호 30:
(2) 서열 동정 번호 3l에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:4458 염기쌍
(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(iv) 특징:
(A) 명칭/키:CDS
(B) 위치:1..4458
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 31:
(2) 서열 동정 번호 32에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:1486 아미노산
(B) 유형:아미노산
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 32:
(2) 서열 동정 번호 33에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:3288 염기쌍
(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 33:
(2) 서열 동정 번호 34에 대한 정보:4
(i) 서열특성:
(A) 길이:1095 아미노산
(B) 유형:아미노산
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 34:
특징 정의
254 내지 267 서열 동정 번호 15
254 내지 492 TcaAii 펩티드
2) 서열 동정 번호 35에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:603 아미노산
(B) 유형:아미노산
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 35:
(2) 서열 동정 번호 36에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:2557 염기쌍
(B) 유형:핵산
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 36:
(2) 서열 동정 번호 37에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:845 아미노산
(B) 유형:아미노산
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질 (일부)
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 37:
(2) 서열 동정 번호 38에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:16 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 38:
(2) 서열 동정 번호 39에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:20 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 39:
(2) 서열 동정 번호 40에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:11 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 40:
(2) 서열 동정 번호 41에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:14 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 41:
(2) 서열 동정 번호 42에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:19 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 42:
(2) 서열 동정 번호 43에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:11 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 43:
(2) 서열 동정 번호 44에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:16 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 44:
(2) 서열 동정 번호 45에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:13 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(v) 단편 유형:N-말단
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 45:
(2) 서열 동정 번호 46에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:7551 염기쌍
(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 46 (tcdA):
(2) 서열 동정 번호 47에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:2516 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 47 (TcdA):
특징정의
펩티드 1 내지 2516TcdA 단백질
펩티드 89 내지 1937 TcdAii펩티드
단편 89 내지 100S2 N-말단(서열 동정 번호 13)
단편 284 내지 299 (서열 동정 번호 38)
단편 554 내지 563(서열 동정 번호 17)
단편 1080 내지 1092(서열 동정 번호 23;12/13)
단편 1385 내지 1400(서열 동정 번호 18)
단편 1478 내지 1497(서열 동정 번호 39)
단편 1620 내지 1642(서열 동정 번호 21;19/23)
단편 1938 내지 1948(서열 동정 번호 41)
펩티드 1938 내지 2516TcdAiii펩티드
단편 2237 내지 2345(서열 동정 번호 42)
단편 2398 내지 2408(서열 동정 번호 43)
(2) 서열 동정 번호 48에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:5547 염기쌍
(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 48 (tcdAii 코딩 영역):
(2) 서열 동정 번호 49에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:1849 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 49 (TcdAii):
특징정의
펩티드 l 내지 1849TcdAii 펩티드
단편 1 내지 12S2 N-말단(서열 동정 번호 13)
단편 196 내지 211(서열 동정 번호 38)
단편 466 내지 475(서열 동정 번호 17)
단편 993 내지 1004(서열 동정 번호23;12/13)
단편 1297 내지 1312(서열 동정 번호 18)
단편 1390 내지 1409(서열 동정 번호 39)
단편 1532 내지 1554(서열 동정 번호 21;19/23)
(2) 서열 동정 번호 50에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:1740 염기쌍
(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 50 (TcdAiii 코딩 영역):
(2) 서열 동정 번호 51에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:579 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 븐쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 51 (TcdAiii):
(2) 서열 동정 번호 52에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:5532 염기쌍(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 52 (tcdAiii 코딩 영역):
(2) 서열 동정 번호 53에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:1844 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 53 (TcbAii):
특징 정의
펩티드 1 내지 1844 TcbAii 펩티드
단편 1 내지 11 (서열 동정 번호 1)
단편 978 내지 990 (서열 동정 번호 23)
단편 1387 내지 1401 (서열 동정 번호 22)
단편 1484 내지 1505 (서열 동정 번호 24)
단편 1527 내지 1552 (서열 동정 번호 21)
(2) 서열 동정 번호 54에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:1722 염기쌍
(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 54 (TcbAiii 코딩 영역):
(2) 서열 동정 번호 55에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:573 아미노산
(B) 유형:아미노산
(C) 본쇄:단쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 55 (TcbAiii):
(2) 서열 동정 번호 56에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:2898 염기쌍
(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 56 (tccA):
(2) 서열 동정 번호 57에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:965 아미노산
(B) 유형:아미노산
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 57 (TccA 펩티드):
특징정의
1 내지 10 서열 동정 번호 8
(2) 서열 동정 번호 58에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:4698 염기쌍
(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 58 (tccB):
(2) 서열 동정 번호 59에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:1665 아미노산
(B) 유형:아미노산
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 59 (TccB 펩티드):
특징정의
1 내지 11 서열 동정 번호 7
(2) 서열 동정 번호 60에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:3132 염기쌍
(B) 유형:핵산
(C) 본쇄:이본쇄
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:DNA (게놈)
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 60 (tccC):
(2) 서열 동정 번호 61에 대한 정보:
(i) 서열특성:
(A) 길이:1043 아미노산
(B) 유형:아미노산
(D) 형태:선형
(ii) 분자 유형:단백질
(x i) 서열 정의:서열 동정 번호 61 (TccC 펩티드):

Claims (64)

  1. 곤충에 대하여 작용 활성을 갗는 포토랍두스(Photorhabdus) 단백질 독소의 유효량을 포함하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 포토랍두스 독소가 포토랍두스의 정제된 배양물, 유전자전환 식물, 바쿨로바이러스, 또는 이종 미생물 숙주에 의해 생산되는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 포토랍두스 독소가 포토랍두스 루미네센스(P.luminescens)의 정제된 배양물에 의해 생산되는 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서, 독소가 ATCC 55397로 지정된 포토랍두스 루미네센스 균주의 정제된 배양물로부터 생산되는 조성물.
  5. 제 2 항에 있어서, 독소가 W-14로 지정된 포토랍두스 루미네센스 균주의 정제된 배양물에 의해 생산되는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 독소가 WX-1, WX-2, WX-3, WX-4, WX-5, WX-6, WX-7, WX-8, WX9, WX-10, WX-11, WX-12, WX-14, WX-15, H9, Hb, Hm, HP88, NC-1, W30, WIR, ATCC# 43948, ATCC# 43949, ATCC# 43950, ATCC# 43951 또는 ATCC# 43952로 지정된 포토랍두스 균주의 정제된 배양물에 의해 생산되는 조성물.
  7. 제 2 항에 있어서, 독소가 WX-1, WX-2, WX-3, WX-4, WX-5, WX-6, WX-7, WX-8, WX9, WX-10, WX-11, WX-12, WX-14, WX-15, H9, Hb, Hm, HP88, NC-1, W30, WIR, ATCC# 43948, ATCC# 43949, ATCC# 43950, ATCC# 43951 또는 ATCC# 43952로 지정된 포토랍두스 균주의 정제된 배양물로부터 생산되는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 독소가 서열 번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 조성물.
  9. 제 6 항에 있어서, 조성물이 포토랍두스의 정제된 배양물들로부터 생산된 하나 이상의 독소의 혼합물인 조성물.
  10. 제 1 항 또는 6 항에 있어서, 곤충이 나비목(Lepidoptera), 딱정벌레목(Coleoptera), 벌목(Hymenoptera), 파리목(Diptera), 방시목(Dictyoptera), 응애목(Acahna) 또는 동시목(Homoptera)인 조성물.
  11. 제 1 항 또는 6 항에 있어서, 곤층종이 딱정벌레목에 속하며, 써든 옥수수 뿌리벌레, 웨스턴 옥수수 뿌리벌레, 콜로라도 감자 딱정벌레, 밀웜, 볼 바구미 또는 잔디 땅벌레인 조성물.
  12. 제 1 항 또는 6 항에 있어서, 곤충종이 나비목에 속하며, 사탕무 행렬구더기, 블랙 야도층, 양배추 자벌레, 코들링 나방, 옥수수 귀벌레, 유럽 옥수수 천공층, 박각시나방 또는 회색담배나방인 조성물.
  13. 제 1 항 또는 6 항에 있어서, 독소가 분무가능한 살층제로서 제형화되는 조성물.
  14. 제 1 항 또는 6 항에 있어서, 독소가 미끼 매트릭스로서 제형화되고 지상 또는 지하 미끼 스테이션에 전달되는 조성물.
  15. 포토랍두스 속의 정제된 박테리아 배양물에 의해 생산된, 곤충에 대해 작용활성을 갖는 단백질 독소의 유효량을 곤층에 경구적으로 전달하는 것을 포함하는 곤충 방제 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 박테리아가 포토랍두스 루미네센스의 정제된 배양물인 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 독소가 ATCC 55397로 지정된 포토랍두스 루미네센스 균주의 졍제된 배양물로부터 생산되는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 독소가 W-14로 지정된 포토랍두스 루미네센스 균주의 정제된 배양물로부터 생산되는 방법.
  19. 제 15 항에 있어서, 독소가 WX-1, WX-2, WX-3, WX-4, WX-5, WX-6, WX-7, WX-8, WX9, WX-10, WX-11, WX-12, WX-14, WX-15, H9, Hb, Hm, HP88, NC-1, W30, WIR, ATCC# 43948, ATCC# 43949, ATCC# 43950, ATCC# 43951 또는 ATCC# 43952로 지정된 포토랍두스 균주의 정제된 배양물로부터 생산되는 방법.
  20. 제 15 항에 있어서, 독소가 WX-1, WX-2, WX-3, WX-4, WX-5, WX-6, WX-7, WX-8, WX9, WX-10, WX-11, WX-12, WX-14, WX-15, H9, Hb, Hm, HP88, NC-1, W30, WIR, ATCC# 43948, ATCC# 43949, ATCC# 43950, ATCC# 43951 또는 ATCC# 43952로 지정된 포토랍두스 루미네센스 균주의 정제된 배양물로부터 생산되는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 하나 이상의 독소의 혼합물이 포토랍두스의 정제된 배양물로부터 생산되고 상기 독소가 곤층에 경구적으로 전달되는 방법.
  22. 제 15 항에 있어서, 독소가 독소를 암호화하는 유전자로 형질전환된 원핵세포 숙주에 의해 생산되는 방법.
  23. 제 15 항에 있어서, 독소가 독소를 암호화하는 유전자로 형질전환된 진핵세포 숙주에 의해 생산되는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 진핵세포 숙주가 바쿨로바이러스인 방법.
  25. 제 15 항 또는 19 항에 있어서, 곤충이 나비목, 딱정벌레목, 벌목, 파리목, 방시목, 응애목 또는 동시목인 조성물.
  26. 제 15 항 또는 19 항에 있어서, 곤충종이 딱정벌레목에 속하며, 써든 옥수수 뿌리벌레, 웨스턴 옥수수 뿌리벌레, 콜로라도 감자 딱정벌레, 밀웜, 볼 바구미 또는 잔디 땅벌레인 방법.
  27. 제 15 항 또는 19 항에 있어서, 곤충종이 나비목에 속하며, 사탕무 행렬구더기, 블랙 야도층, 양배추 자벌레, 코들링 나방, 옥수수 귀벌레, 유럽 옥수수 천공층, 박각시나방 또는 회색담배나방인 방법.
  28. 제 15 항 또는 19 항에 있어서, 독소가 분무가능한 살충제로서 제형화되는 방법.
  29. 제 15 항 또는 19 항에 있어서, 독소가 미끼 매트릭스로서 제형화되고 지상 또는 지하 미끼 스테이션에 전달되는 방법.
  30. 포토랍두스 또는 포토랍두스 루미네센스로부터 유전 물질올 분리하기 위해 사용되는, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42 및 서열 번호 43으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열의 DNA 코딩 영역의 적어도 일부에 상응하는 적어도 하나의 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드 분자를 제작하는 단계를 포함하는 단백질 서브유닛을 코딩하는 유전자의 분리 방법.
  31. 5' 에서 3' 프로모터, 단백질을 암호화하는 DNA 서열 및 전사 터미네이터를 갖는 키메릭 DNA 구조물을 제작한 다음 키메릭 DNA 구조물을 숙주내로 전달하는 것을 포함하는, 포토랍두스 속의 정제된 박테리아 배양물에 의해 생산되는 단백질을 원핵세포 또는 진핵세포 숙주내에서 단백질이 곤층에 대해 작용 활성을 갖도록 유효량으로 발현시키는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 단백질이 딱정벌레목, 나비목, 파리목, 동시목, 벌목, 방시목 및 응애목으로 이루어진 군 중에서 선택된 곤층에 대해 작용 활성을 갖는 방법.
  33. 제 31 항에 있어서, DNA 서열에 의해 암호화되는 단백질이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42 및 서열 번호 43으로 이루어진 군 중에서 선택된 N-말단 아미노산 서열을 갖는 방법.
  34. 제 31 항에 있어서, DNA 서열에 의해 암호화된 단백질이 서열 번호 12, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59 및 서열 번호 61로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  35. 숙주내에서 활성인 5' 에서 3' 전사 프로모터;곤충에 대해 작용 활성을 갖는 포토랍두스 단백질을 암호화하는 DNA 서열;및 전사 터미네이터를 포함하는, 원핵 세포 또는 진핵세포 숙주내 발현에 적합한 키메릭 DNA 구조물.
  36. 제 35 항에 있어서, DNA 서열에 의해 암호화되는 단백질이 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40,서열 번호 41, 서열 번호 42 및 서열 번호 43으로 이루어진 군 중에서 선택된 N-말단 아미노산 서열을 갖는 키메릭 DNA 구조물.
  37. 제 35 항에 있어서, DNA 서열에 의해 암호화된 단백질이 서열 번호 12, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 35,서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호57, 서열 번호 59 및 서열 번호 61로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 키메릭 DNA 구조물.
  38. 제 35 항에 있어서, 포토랍두스 루미네센스 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 서열 번호 11, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열번호 56, 서열 번호 58 및 서열 번호 60으로 이루어진 군 중에서 선택되는 키메릭 DNA 구조물.
  39. 제 35 항에 있어서, 숙주가 바쿨로바이러스인 키메릭 DNA 구조물.
  40. 포토랍두스 속의 박테리아에 의해 생산되고 곤충에 대해 작용 활성을 갖는 단백질의 유효량을 암호화할 수 있는 DNA 분자를 포함하는, 단리되고 실질적으로 정제된 제제.
  41. 제 40 항에 있어서, 박테리아가 포토랍두스 루미네센스인 제제.
  42. 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42 및 서열 번호 43으로 이루어진 군 중에서 선택된 N-말단 아미노산 서열을 갖는, 포토랍두스 또는 포토랍두스 루미네센스에 의해 생산된 단백질을 포함하는 정제된 제제.
  43. 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42 및 서열 번호 43으로 이루어진 군 중에서 선택된 N-말단 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하는 정제된 단백질 제제.
  44. 서열 번호 12, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59 및 서열 번호 61로 이루어진 군 중에서 선택된 단백질을 포함하는 정제된 단백질 제제.
  45. 그의 천연 숙주로부터 단리된, 서열 번호 11, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58 및 서열 번호 60으로 이루어진 군 중에서 선택된 DNA 서열을 포함하는 정제된 DNA 제제.
  46. 약 18 kDa 내지 약 230 kDa;약 160 kDa 내지 약 230 kDa;약 100 kDa 내지 약 160 kDa; 약 80 kDa 내지 약 100 kDa;또는 약 50 kDa 내지 약 80 kDa의 대략적인 분자량을 갖는 적어도 하나의 서브유닛을 갖는 포토랍두스 루미네센스 단백질을 포함하는 정제된 단백질 제제.
  47. 약 280 kDa의 대략적인 분자량을 갖는 적어도 하나의 서브유닛을 갖는 포토랍두스 루미네센스 단백질을 포함하는 정제된 단백질 제제.
  48. ATCC 55397을 포함하는 실질적으로 순수한 미생물 배양물.
  49. 제 48 항에 있어서, 배양물이 곤충에 대해 작용 활성을 갖는 단백질 독소를 생산하는 ATCC 55397의 유도체인 배양물.
  50. H9를 포함하는 실질적으로 순수한 미생물 배양물.
  51. Hb를 포함하는 실질적으로 순수한 미생물 배양물.
  52. Hm을 포함하는 실질적으로 순수한 미생물 배양물.
  53. HP88을 포함하는 실질적으로 순수한 미생물 배양물.
  54. NC-1를 포함하는 실질적으로 순수한 미생물 배양물.
  55. W30을 포함하는 실질적으로 순수한 미생물 배양물.
  56. WIR을 포함하는 실질적으로 순수한 미생물 배양물.
  57. 곤충에 대해 작용 활성을 갖는 포토랍두스 단백질의 유효량을 발현하는 능력을 식물에 부여하는 키메릭 인공 유전자 구조물을 그의 게놈내에 포함하는 유전자 전환 식물.
  58. 제 57 항에 있어서, 식물이 미립자 상에 피복된 유전 물질의 세포내로의 직접적인 도입촉진, 아그로박테리아(Agrobacteria) 기술, 휘스커스 기술 또는 전기천공기술을 사용하여 형질전환되는 유전자전환 식물.
  59. 제 57 항에 있어서, 선택가능한 마커가 카나마이신, 네오마이신, 글리포세이트, 히그로마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신(비알로포스), 클로로술푸론, 브로목시닐, 달라폰 등으로 이루어진 군 중에서 선택되는 유전자전환 식물.
  60. 제 57 항에 있어서, 프로모터가 옥토핀 신테이즈, 노팔린 신테이즈, 만노핀 신테이즈, 35S, 19S, 리불로스-1,6-비스포스페이트(RUBP) 카르복실라제의 작은 서브 유닛(ssu), 베타-콘글리시닌, 파제을린, 알코올 데하이드로게나제(ADH), 열 쇽크, 유비퀴틴, 제인, 올레오신, 나핀 또는 아실 캐리어 단백질(ACP)로 이루어진 군 중에서 선택되는 유전자전환 식물.
  61. 제 57 항에 있어서, 유전자전환 식물을 제조하는데 배아 조직, 칼루스 조직 유형 I 또는 Ⅱ, 배축조직, 분열조직 또는 탈분화중의 식물 조직이 사용된 유전자전환 식물.
  62. 제 57 항에 있어서, 키메릭 유전자가 곤충에 대해 작용 활성을 갖는 포토랍두스 단백질을 암호화하는 DNA 서열이고, 유전자의 적어도 하나의 코돈이 식물에 바람직한 코돈으로 변형된 유전자전환 식물.
  63. 곤충에, 그것이 섭취하는 유전자전환 식물에 의해 생산된 단백질 독소의 유효량을 경구적으로 전달하는 것을 포함하는 곤충 방제 방법.
  64. 포토랍두스 속의 정제된 박테리아 배양물로부터의 정제된 DNA 서열을 포함하는 물질의 조성물.
KR1019970704633A 1995-11-06 1996-11-06 포토랍두스로부터의살충단백질독소 KR100354530B1 (ko)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US725595P 1995-11-06 1995-11-06
US60/007,255 1995-11-06
US60842396A 1996-02-28 1996-02-28
US08/608,423 1996-02-28
US8/608,423 1996-02-28
US08/705,484 1996-08-28
US8/705,484 1996-08-28
US70548496A 1996-08-29 1996-08-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR19980701244A true KR19980701244A (ko) 1998-05-15
KR100354530B1 KR100354530B1 (ko) 2003-01-06

Family

ID=27358315

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019970704633A KR100354530B1 (ko) 1995-11-06 1996-11-06 포토랍두스로부터의살충단백질독소

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0797659A4 (ko)
JP (2) JP3482214B2 (ko)
KR (1) KR100354530B1 (ko)
AU (1) AU729228B2 (ko)
BR (1) BR9606889A (ko)
CA (1) CA2209659C (ko)
HU (1) HUP9900768A3 (ko)
IL (1) IL121243A (ko)
MX (1) MX9705101A (ko)
PL (1) PL186242B1 (ko)
RO (1) RO121280B1 (ko)
SK (1) SK93197A3 (ko)
WO (1) WO1997017432A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101246707B1 (ko) * 2012-08-01 2013-03-25 ㈜엠알이노베이션 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주를 포함하는 뿌리혹선충 방제용 조성물

Families Citing this family (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9618083D0 (en) * 1996-08-29 1996-10-09 Mini Agriculture & Fisheries Pesticidal agents
EP0915909B1 (en) * 1997-05-05 2007-06-13 Dow AgroSciences LLC Insecticidal protein toxins from xenorhabdus
AU7974198A (en) * 1997-06-20 1999-01-04 Mycogen Corporation Method to identify pesticidal microbes
AUPO808897A0 (en) * 1997-07-17 1997-08-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Toxin genes from the bacteria xenorhabdus nematophilus and photohabdus luminescens
US6281413B1 (en) 1998-02-20 2001-08-28 Syngenta Participations Ag Insecticidal toxins from Photorhabdus luminescens and nucleic acid sequences coding therefor
JP2002504336A (ja) * 1998-02-20 2002-02-12 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト フォトラブドゥスからの殺昆虫性毒素
US6174860B1 (en) 1999-04-16 2001-01-16 Novartis Ag Insecticidal toxins and nucleic acid sequences coding therefor
GB9901499D0 (en) * 1999-01-22 1999-03-17 Horticulture Res Int Biological control
AUPP911399A0 (en) * 1999-03-10 1999-04-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Plants and feed baits for controlling damage
EP1069134A1 (en) * 1999-07-15 2001-01-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Photorhabdus luminescens strains
WO2001016305A2 (en) * 1999-09-02 2001-03-08 Agresearch Limited Nucleotide sequences encoding an insectidal protein complex from serratia
FR2803592A1 (fr) 2000-01-06 2001-07-13 Aventis Cropscience Sa Nouveaux derives de l'acide 3-hydroxypicolinique, leur procede de preparation et compositions fongicides les contenant.
US8440880B2 (en) 2000-06-30 2013-05-14 Monsanto Technology Llc Xenorhabdus sp. genome sequences and uses thereof
FR2815969B1 (fr) 2000-10-30 2004-12-10 Aventis Cropscience Sa Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique
JP2005536198A (ja) 2002-06-28 2005-12-02 ダウ アグロサイエンス リミテッド ライアビリティー カンパニー ペニバチルス種から得られる殺虫活性タンパク質およびポリヌクレオチド
WO2004067750A2 (en) 2003-01-21 2004-08-12 Dow Agrosciences Llc Xenorhabdus tc proteins and genes for pest control
AR043328A1 (es) 2003-01-21 2005-07-27 Dow Agrosciences Llc Metodo para la inhibicion de insectos
US7319142B1 (en) 2004-08-31 2008-01-15 Monsanto Technology Llc Nucleotide and amino acid sequences from Xenorhabdus and uses thereof
MX2010001980A (es) * 2007-08-31 2010-03-11 Basf Plant Science Gmbh Genes para el control de patogenos y metodos de uso en plantas.
TW201142029A (en) 2009-11-24 2011-12-01 Univ Leuven Kath Banana promoters
BR112012015690A2 (pt) 2009-12-23 2015-08-25 Bayer Intelectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inibidores de hppd.
EA201290559A1 (ru) 2009-12-23 2013-01-30 Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх Растения, устойчивые к гербицидам - ингибиторам hppd
MX2012007358A (es) 2009-12-23 2012-11-06 Bayer Ip Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd.
AU2010334818B2 (en) 2009-12-23 2015-07-09 Bayer Intellectual Property Gmbh Plants tolerant to HPPD inhibitor herbicides
AR079882A1 (es) 2009-12-23 2012-02-29 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
AU2011212538B2 (en) 2010-02-02 2014-12-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Soybean transformation using HPPD inhibitors as selection agents
US20120088719A1 (en) 2010-09-20 2012-04-12 Jerald Coleman Ensign Mosquitocidal Xenorhabdus, Lipopeptide And Methods
EP2669373B1 (en) 2010-11-10 2016-06-01 Bayer CropScience AG HPPD variants and methods of use
UA111193C2 (uk) 2011-03-25 2016-04-11 Баєр Інтеллекчуел Проперті Гмбх Застосування n-(тетразол-4-іл)- або n-(триазол-3-іл)арилкарбоксамідів або їх солей для контролю небажаних рослин на площах трансгенних культур, що толерантні до гербіцидів, що є інгібіторами hppd
AU2012234448A1 (en) 2011-03-25 2013-10-17 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of N-(1,2,5-Oxadiazol-3-yl)benzamides for controlling unwanted plants in areas of transgenic crop plants being tolerant to HPPD inhibitor herbicides
UA119532C2 (uk) 2012-09-14 2019-07-10 Байєр Кропсайєнс Лп Варіант hppd та спосіб його застосування
US10221429B2 (en) 2013-03-07 2019-03-05 Bayer Cropscience Lp Toxin genes and methods for their use
CA2942171C (en) 2014-03-11 2023-05-09 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
MX2018003044A (es) 2015-09-11 2018-04-11 Bayer Cropscience Ag Variantes de hppd y metodos de uso.
CA3043493A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Axmi669 and axmi991 toxin genes and methods for their use
CN110225974B (zh) 2016-12-22 2024-03-29 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 使用cry14来控制线虫害虫
BR112019014727A2 (pt) 2017-01-18 2020-04-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico, vector, célula, planta, semente, polipeptídeo, composição, métodos para o controle de uma população de pragas, para matar uma praga, para produzir um polipeptídeo, para proteger uma planta e para aumentar o rendimento em uma planta, uso do ácido nucleico e produto de base
US11286498B2 (en) 2017-01-18 2022-03-29 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Use of BP005 for the control of plant pathogens
WO2018165091A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
BR112020008096A2 (pt) 2017-10-24 2020-11-03 Basf Se método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
US11279944B2 (en) 2017-10-24 2022-03-22 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Of herbicide tolerance to 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) inhibitors by down-regulation of HPPD expression in soybean
CN114341116A (zh) 2019-07-22 2022-04-12 拜耳公司 5-氨基取代的吡唑和三唑作为杀虫剂
US20220264880A1 (en) 2019-07-23 2022-08-25 Bayer Aktiengesellschaft Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides
KR20220038403A (ko) 2019-07-23 2022-03-28 바이엘 악티엔게젤샤프트 살충제로서의 신규 헤테로아릴-트리아졸 화합물
EP3701796A1 (en) 2019-08-08 2020-09-02 Bayer AG Active compound combinations
US20220403410A1 (en) 2019-09-26 2022-12-22 Bayer Aktiengesellschaft Rnai-mediated pest control
CA3156302A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Bayer Aktiengesellschaft COMBINATIONS OF ACTIVE COMPOUNDS INCLUDING FATTY ACIDS
UY38911A (es) 2019-10-09 2021-05-31 Bayer Ag Compuestos de heteroarilo-triazol como pesticidas, formulaciones, usos y métodos de uso de los mismos
WO2021069569A1 (en) 2019-10-09 2021-04-15 Bayer Aktiengesellschaft Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides
KR20220098170A (ko) 2019-11-07 2022-07-11 바이엘 악티엔게젤샤프트 동물 해충 방제를 위한 치환된 술포닐 아미드
WO2021097162A1 (en) 2019-11-13 2021-05-20 Bayer Cropscience Lp Beneficial combinations with paenibacillus
TW202134226A (zh) 2019-11-18 2021-09-16 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物
WO2021099271A1 (en) 2019-11-18 2021-05-27 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations comprising fatty acids
TW202136248A (zh) 2019-11-25 2021-10-01 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物
EP4097125A1 (en) 2020-01-31 2022-12-07 Pairwise Plants Services, Inc. Suppression of shade avoidance response in plants
US20230148601A1 (en) 2020-02-18 2023-05-18 Bayer Aktiengesellschaft Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides
EP3708565A1 (en) 2020-03-04 2020-09-16 Bayer AG Pyrimidinyloxyphenylamidines and the use thereof as fungicides
US20230212600A1 (en) 2020-04-16 2023-07-06 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
WO2021209490A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Bayer Aktiengesellschaft Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides
JP2023522350A (ja) 2020-04-21 2023-05-30 バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト 有害生物防除剤としての２－（ヘタ）アリール－置換縮合ヘテロ環誘導体
TW202208347A (zh) 2020-05-06 2022-03-01 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物
EP4146628A1 (en) 2020-05-06 2023-03-15 Bayer Aktiengesellschaft Pyridine (thio)amides as fungicidal compounds
US20230180756A1 (en) 2020-05-12 2023-06-15 Bayer Aktiengesellschaft Triazine and pyrimidine (thio)amides as fungicidal compounds
BR112022023550A2 (pt) 2020-05-19 2023-01-03 Bayer Cropscience Ag (tio)amidas azabicíclicas como compostos fungicidas
CA3185017A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
WO2021245087A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Bayer Aktiengesellschaft Heterocyclyl pyrimidines and triazines as novel fungicides
MX2022015625A (es) 2020-06-10 2023-01-11 Bayer Ag Heterociclos sustituidos con azabiciclilo como nuevos fungicidas.
AR122661A1 (es) 2020-06-17 2022-09-28 Pairwise Plants Services Inc Métodos para el control del tamaño del meristemo para la mejora de cultivos
EP4168404A1 (en) 2020-06-18 2023-04-26 Bayer Aktiengesellschaft 3-(pyridazin-4-yl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine derivatives as fungicides for crop protection
CA3187291A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 Bayer Aktiengesellschaft Composition for use in agriculture
UY39275A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos
WO2021255089A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,3,4-oxadiazole pyrimidines and 1,3,4-oxadiazole pyridines as fungicides
UY39276A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones.
WO2021255091A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,3,4-oxadiazoles and their derivatives as fungicides
EP3929189A1 (en) 2020-06-25 2021-12-29 Bayer Animal Health GmbH Novel heteroaryl-substituted pyrazine derivatives as pesticides
KR20230039665A (ko) 2020-07-02 2023-03-21 바이엘 악티엔게젤샤프트 해충 방제제로서의 헤테로사이클 유도체
WO2022033991A1 (de) 2020-08-13 2022-02-17 Bayer Aktiengesellschaft 5-amino substituierte triazole als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022053453A1 (de) 2020-09-09 2022-03-17 Bayer Aktiengesellschaft Azolcarboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022058327A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Bayer Aktiengesellschaft Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents
EP3974414A1 (de) 2020-09-25 2022-03-30 Bayer AG 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel
EP3915971A1 (en) 2020-12-16 2021-12-01 Bayer Aktiengesellschaft Phenyl-s(o)n-phenylamidines and the use thereof as fungicides
CA3205419A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft Use of dhodh inhibitor for controlling resistant phytopathogenic fungi in crops
WO2022129196A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
WO2022129190A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
WO2022129188A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides
EP4036083A1 (de) 2021-02-02 2022-08-03 Bayer Aktiengesellschaft 5-oxy substituierte hetereozyklen, als schädlingsbekämpfungsmittel
CA3210785A1 (en) 2021-02-11 2022-08-18 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying cytokinin oxidase levels in plants
WO2022182834A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture in plants
BR112023019400A2 (pt) 2021-03-30 2023-12-05 Bayer Ag 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida
BR112023019788A2 (pt) 2021-03-30 2023-11-07 Bayer Ag 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida
US20240254121A1 (en) 2021-05-06 2024-08-01 Bayer Aktiengesellschaft Alkylamide substituted, annulated imidazoles and use thereof as insecticides
US20240294533A1 (en) 2021-05-12 2024-09-05 Bayer Aktiengesellschaft 2-(het)aryl-substituted condensed heterocycle derivatives as pest control agents
EP4355083A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of growth regulating factor family transcription factors in soybean
UY39827A (es) 2021-06-24 2023-01-31 Pairwise Plants Services Inc Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento
CN117794358A (zh) 2021-07-01 2024-03-29 成对植物服务股份有限公司 用于增强根系发育的方法和组合物
WO2023019188A1 (en) 2021-08-12 2023-02-16 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
KR20240039209A (ko) 2021-08-13 2024-03-26 바이엘 악티엔게젤샤프트 활성 화합물 조합물 및 이를 포함하는 살진균제 조성물
AR126798A1 (es) 2021-08-17 2023-11-15 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para modificar genes de histidina quinasa receptores de citoquinina en plantas
IL310966A (en) 2021-08-25 2024-04-01 Bayer Ag Pyrazyl-triazole as pesticidal compounds
CA3230167A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement
AR126938A1 (es) 2021-09-02 2023-11-29 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento
EP4144739A1 (de) 2021-09-02 2023-03-08 Bayer Aktiengesellschaft Anellierte pyrazole als schädlingsbekämpfungsmittel
AU2022352997A1 (en) 2021-09-21 2024-04-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for reducing pod shatter in canola
CN118434850A (zh) 2021-10-04 2024-08-02 成对植物服务股份有限公司 用于改善小花能育性和种子产量的方法
CN118302434A (zh) 2021-10-07 2024-07-05 成对植物服务股份有限公司 用于改善小花育性和种子产量的方法
WO2023078915A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Bayer Aktiengesellschaft Bis(hetero)aryl thioether (thio)amides as fungicidal compounds
WO2023099445A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Bayer Aktiengesellschaft Bis(hetero)aryl thioether oxadiazines as fungicidal compounds
AR127904A1 (es) 2021-12-09 2024-03-06 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas
AR128372A1 (es) 2022-01-31 2024-04-24 Pairwise Plants Services Inc Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas
WO2023148028A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests
WO2023148030A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests in corn
WO2023148036A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests in soybean
WO2023148035A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests in rice
WO2023148031A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests in cotton
WO2023148029A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests in cereals
US20240327858A1 (en) 2022-03-02 2024-10-03 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
WO2023192838A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Pairwise Plants Services, Inc. Early flowering rosaceae plants with improved characteristics
WO2023196886A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight
WO2023205714A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
US20230348922A1 (en) 2022-05-02 2023-11-02 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance
WO2023213626A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Bayer Aktiengesellschaft Use of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine for controlling unwanted microorganisms
WO2023213670A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Bayer Aktiengesellschaft Crystalline forms of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine
US20230416767A1 (en) 2022-05-05 2023-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits
AR129709A1 (es) 2022-06-27 2024-09-18 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para modificar el escape a la sombra en plantas
AR129749A1 (es) 2022-06-29 2024-09-25 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para controlar el tamaño del meristemo para el mejoramiento de cultivos
WO2024006792A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
US20240043857A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
US20240060081A1 (en) 2022-08-11 2024-02-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024054880A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield characteristics in plants
WO2024068520A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024068517A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024068519A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024068518A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-heteroaryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
EP4295688A1 (en) 2022-09-28 2023-12-27 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combination
EP4385326A1 (en) 2022-12-15 2024-06-19 Kimitec Biogorup Biopesticide composition and method for controlling and treating broad spectrum of pests and diseases in plants
WO2024137438A2 (en) 2022-12-19 2024-06-27 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Insect toxin genes and methods for their use
KR20240100589A (ko) * 2022-12-22 2024-07-02 주식회사 남보 포토랍두스 시네리아 nb-yg4-3 균주, 이를 포함하는 방제용 조성물 및 이를 이용한 방제 방법
US20240279673A1 (en) 2023-02-16 2024-08-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
US20240294933A1 (en) 2023-03-02 2024-09-05 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
WO2024186950A1 (en) 2023-03-09 2024-09-12 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid signaling pathway genes for improving yield traits in plants

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1986001509A1 (en) * 1984-09-05 1986-03-13 Biotechnology Australia Pty. Ltd. Xenocoumacins
US5254799A (en) * 1985-01-18 1993-10-19 Plant Genetic Systems N.V. Transformation vectors allowing expression of Bacillus thuringiensis endotoxins in plants
US5039523A (en) * 1988-10-27 1991-08-13 Mycogen Corporation Novel Bacillus thuringiensis isolate denoted B.t. PS81F, active against lepidopteran pests, and a gene encoding a lepidopteran-active toxin
AU675335B2 (en) * 1993-06-25 1997-01-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Toxin gene from xenorhabdus nematophilus
WO1995003695A1 (en) * 1993-07-27 1995-02-09 Agro-Biotech Corporation Novel fungicidal properties of metabolites, culture broth, stilbene derivatives and indole derivatives produced by the bacteria xenorhabdus and photorhabdus spp.
GB9618083D0 (en) * 1996-08-29 1996-10-09 Mini Agriculture & Fisheries Pesticidal agents

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101246707B1 (ko) * 2012-08-01 2013-03-25 ㈜엠알이노베이션 포토랍두스 템프라타 템프라타 균주를 포함하는 뿌리혹선충 방제용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
PL321212A1 (en) 1997-11-24
WO1997017432A1 (en) 1997-05-15
JP3657593B2 (ja) 2005-06-08
JP2002509424A (ja) 2002-03-26
JP3482214B2 (ja) 2003-12-22
SK93197A3 (en) 1998-05-06
PL186242B1 (pl) 2003-12-31
CA2209659C (en) 2008-01-15
AU1050997A (en) 1997-05-29
HUP9900768A3 (en) 2002-10-28
RO121280B1 (ro) 2007-02-28
EP0797659A1 (en) 1997-10-01
IL121243A (en) 2010-05-31
BR9606889A (pt) 1997-10-28
AU729228B2 (en) 2001-01-25
KR100354530B1 (ko) 2003-01-06
HUP9900768A2 (hu) 1999-06-28
EP0797659A4 (en) 1998-11-11
IL121243A0 (en) 1998-01-04
JP2004089189A (ja) 2004-03-25
CA2209659A1 (en) 1997-05-15
MX9705101A (es) 1997-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100354530B1 (ko) 포토랍두스로부터의살충단백질독소
US6379946B1 (en) Insecticidal protein toxins from Xenorhabdus
KR20000037116A (ko) 포토랍두스 유래의 살충 단백질 독소
KR20010082543A (ko) Ｄｎａ 재편성을 이용한 내병충성 유전자의 최적화 방법
EA020327B1 (ru) Гены токсинов и способы их применения
RU2608500C2 (ru) Комбинированное применение vip3ab и cry1ab для регулирования устойчивых насекомых
US7605228B2 (en) Insecticidal toxin complex fusion proteins
US7569748B2 (en) Nucleic acid encoding an insecticidal protein toxin from photorhabdus
US6528484B1 (en) Insecticidal protein toxins from Photorhabdus
CN110035662B (zh) 二元杀虫cry毒素
ES2348509T5 (es) Nuevas proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis
CA2551126A1 (en) Toxin complex proteins and genes from xenorhabdus bovienii
US7566818B2 (en) Second TC complex from xenorhabdus
AU9712501A (en) Insecticidal protein toxins from photorhabdus
KR19990071962A (ko) 살충 효소
MXPA99001288A (en) Insecticidal protein toxins from xenorhabdus

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20090618

Year of fee payment: 8

LAPS Lapse due to unpaid annual fee