PL186242B1 - Polinukleotyd kodujący zrekombinowane białko i zrekombinowane białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom - Google Patents

Abstract

1. Polinukleotyd funkcjonalnie zwiazany z heterologicznym promotorem, który koduje bialko o aktywnosci toksycznej przeciwko szkodliwym owadom, znamienny tym, ze czasteczka nukleotydowa kodujaca to bialko utrzymuje hybrydyzacje z komplementarna sekwencja kwasu nukleinowego, po hybrydyzacji w 25°C, w 0,45 M chlorku sodu i 0,045 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu, i przemyciu, przy czym se- kwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmujacej: SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:60, SEQ ID NO:36 i SEQ ID NO:46. 10. Komórka rosliny transgenicznej zawierajaca polinukleotyd i/lub w której zachodzi ekspresja polinu- kleotydu funkcjonalnie zwiazanego z heterologicznym promotorem, który koduje bialko o aktywnosci toksycz- nej przeciwko szkodliwym owadom, znamienna tym, ze czasteczka nukleotydowa kodujaca to bialko utrzy- muje hybrydyzacje z komplementarna sekwencja kwasu nukleinowego, po hybrydyzacji w 25°C, w 0,45 M chlorku sodu i 0,045 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu, i przemyciu, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmujacej: SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :60, SEQ ID NO:36 i SEQ ID NO:46. 11. Zrekombinowane bialko o aktywnosci toksycznej przeciwko szkodliwym owadom, znamienne tym, ze sekwencja nukleotydowa kodujaca to bialko utrzymuje hybrydyzacje z sekwencja kwasu nukleinowego po hybrydyzacji w 25°C, w 0.45 M chlorku sodu i 0,045 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu, i przemyciu, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmujacej: SEQ ID NO:33, SEQ ID N O :31, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO :60, SEQ IDNO:36 i SEQ ID NO:46. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd kodujący zrekombinowane białko, komórka rośliny transgenicznej zawierająca ten polinukleotyd i zrekombinowane białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom oraz zastosowanie jako środków owadobójczych.

Wiele owadów uważa się powszechnie za szkodniki przez właścicieli domów, osoby na piknikach, ogrodników, rolników i inne osoby, których inwestycje na produkty rolnicze są często niszczone lub obniżone w wyniku szkód w uprawach polnych spowodowanych przez owady. Szczególnie tam gdzie sezon wzrostu jest krótki, znaczne szkody spowodowane przez owady mogą oznaczać dla hodowców stratę wszelkich zysków i dramatyczne zmniejszenie zbiorów. Niedobory w dostawach określonych produktów rolnych powodują zwykle wyższe koszty dla producentów żywności, a następnie dla końcowych konsumentów roślin wykorzystywanych jako żywność i produktów otrzymywanych z tych roślin.

Zapobieganie szkodom powodowanym przez owady w uprawach i kwiatach, i usuwanie zagrożeń powodowanych przez szkodliwe owady polega zwykle na stosowaniu silnych organicznych środków do zwalczania szkodników i środków owadobójczych o szerokiej gamie toksyczności. Te produkty syntetyczne są ogólnie nie akceptowane przez społeczeństwo, ponieważ są zbyt niebezpieczne dla środowiska i dla osób wystawionych na ich działanie. Podobnie, w obszarach nierolniczych, właściciele domów woleliby, aby owady omijały ich domy lub posiłki na dworze bez konieczności zabijania owadów.

Szerokie stosowanie chemicznych środków owadobójczych ze względu na ochronę środowiska i ochronę zdrowia, spowodowało zastrzeżenia kierowane do rolników, firm produkujących środki owadobójcze, agencji rządowych, grup interesów publicznych i społeczeństwa w ogóle. Opracowanie mniej agresywnych strategii zwalczania szkodników jest wymuszane, zarówno przez wymagania dotyczące ochrony środowiska, jak i przez opracowywanie narzędzi biologicznych, które wykorzystuj ą mechanizmy zwalczania owadów. Biologiczne środki zwalczania owadów stanowią obiecującą alternatywę w stosunku do chemicznych środków owadobójczych.

Organizmy na każdym poziomie rozwoju ewolucyjnego same znalazły sposoby zwiększania swego powodzenia i możliwości przeżycia. Stosowanie biologicznych cząsteczek do obrony i ataku jest znane w całym świecie zwierzęcym i roślinnym. Ponadto, stosunkowo nowe narzędzia inżynierii genetycznej umożliwiają wprowadzenie zmian do biologicznych środków owadobójczych i dają konkretne rozwiązania szczegółowych problemów.

Jeden z takich środków, Bacillus thuringiensis (Bt) jest skutecznym środkiem owadobójczym i jest stosowany na dużą skalę. W rzeczywistości, środek owadobójczy z bakterii Bt jest białkiem, które ma ograniczoną toksyczność i może być stosowany na uprawach do spożycia dla ludzi nawet w dniu zbiorów tych upraw. Dla organizmów, na które toksyna Bt nie działa, jest ona ulegającym trawieniu, nietoksycznym białkiem.

Inną znaną klasę biologicznych środków owadobójczych stanowią niektóre rodzaje nicieni, znane jako nosiciele owadobójczych bakteryjnych symbiontów. Nicienie zawierające bakterie owadobójcze atakują larwy owadów. Następnie bakterie te zabijają larwy, a nicienie rozmnażają się w zwłokach larw. Potomstwo nicieni następnie wyjada zwłoki od środka.

186 242

Wytworzone przy tym potomstwo nicieni zawierające bakterie może następnie atakować kolejne larwy.

W przeszłości, nicienie owadobójcze rodzajów Steinernema i Heterorhabditis stosowano jako środki owadobójcze. Pomimo, że nicienie te są skutecznymi środkami owadobójczymi, lecz obecnie, ich wytwarzanie, przechowywanie i rozprowadzanie nicieni do zwalczania owadów jest trudne, drogie i niewydajne.

Oczywiście, każdy rodzaj nicienia jest gospodarzem szczególnego gatunku bakterii. W przypadku nicieni rodzaju Heterorhabditis symbiotyczną bakterią jest Photorhabdus luminescens.

Innym źródłem są kliniczne próbki pobierane z ran u ludzi. Te szczepy saprofityczne są zdeponowane w American Type Culture Collection (Rockville, MD) ATCC o nr 43948, 43949, 43950, 43951 i 43952, którą włącza się jako odnośnik.

Szczególną cechą Photorhabdus jest bioluminescencja. Rodzaj Photorhabdus jest określony taksonomicznie jako należący do rodziny Enterobacteriaceae, jakkolwiek ma on pewne cechy nietypowe dla tej rodziny. Szczepy tego rodzaju na przykład dają ujemny wynik przy redukcji azotanem, wytwarzają żółty i czerwony pigment i wykazują bioluminescencję. Ta ostatnia cecha jest poza tym nieznana u innych Enterobacteriaceae. Photorhabdus został ostatnio opisany jako rodzaj różniący się od Xenorhabdus (Boemare i in., 1993, Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 249-255). Zróżnicowanie to opiera się na badaniach hybrydyzacji DNA-DNA, na różnicach fenotypowych [na przykład obecności (Photorhabdus) lub na nieobecności (Xenorhabdus) katalazy i bioluminescencji] i rodzinach gospodarzy nicieni (Xenorhabdus; Steinermetidae, Photorhabdus; Heterorhabditidae). Porównawcze analizy komórkowych kwasów tłuszczowych (Janse i in. 1990, Lett. Appl. Microbiol 10 131-135; Suzuki in. 1990, J. Gen. Appl. Microbiol., 36, 393-401) potwierdzają wydzielenie Photorhabdus z Xenorhabdus. (Farmer, 1984 Bergey's Manual of Systemic Bnacteriol.,t.1, str. 510-511; Akhurst i Boemare 1988, J. Gen. Microbiol. 134, str. 1835-1845; Boemare i in., 1993 Int. J. Syst. Bacteriol. 43, str. 249-255, które włącza się jako odnośniki).

Obecnie, rodzaj bakteryjny Photorhabdus składa się z pojedynczego zdefiniowanego gatunku Photorhabdus luminescens (Szczep typu ATCC #29999, Poinar i in., 1977, Nematologica 23, 97-102). Różne spokrewnione szczepy opisano w literaturze (na przykład, Akhurst i in., 1988 J. Gen. Microbiol., 134, 1835-1845; Boemare i in. 1993 Int. J. Syst. Bacteriol. 43, str.249-255; Putz i in., 1990, Appl. Environ. Microbiol., 56, 181-186).

Wiadomo, że z Photorhabdus luminescens można wyodrębnić owadobójczą toksynę, która jest aktywna jedynie po wstrzyknięciu jej do larw owadów Lepidoptera i Coleoptera. Uniemożliwia to skuteczne wykorzystanie właściwości owadobójczych nicienia lub jego symbiontu bakteryjnego. Byłoby przydatne, bardziej praktyczne i mniej pracochłonne szerokie zastosowanie takiej toksyny owadobójczej, która zachowywałaby swoje właściwości biologiczne po jej dostarczeniu. Byłoby także bardzo pożądane odkrycie toksyn o aktywności doustnej wytwarzanych przez rodzaj, Photorhabdus. Wyodrębnienie i zastosowanie tych toksyn jest pożądane ze względu na ich wydajność. Do czasu odkryć dokonanych przez niniejszych zgłaszających, toksyny takie nie były wyodrębnione lub scharakteryzowane.

Rodzime toksyny są kompleksami białkowymi wytwarzanymi i wydzielanymi przez rosnące komórki bakterii rodzaju Photorhabdus, natomiast interesujące nas białka są wytwarzane przez gatunek Photorhabdus luminescens. Kompleksy białkowe o ciężarze cząsteczkowym około 1000 kDa mogą być rozdzielane na liczne białka składowe metodą analizy w żelu SDSPAGE. Toksyny nie wykazują aktywności hemolizyny, lipazy, fosfolipazy typu C lub nukleazy. Toksyny wykazują znaczną toksyczność po podawaniu ich przez ekspozycję różnym owadom.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest polinukleotyd funkcjonalnie związany z heterologicznym promotorem, który koduje białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom. Istotą wynalazku jest cząsteczka nukleotydowa kodująca to białko, która utrzymuje hybrydyzację z komplementarną sekwencją kwasu nukleinowego, po hybrydyzacji w 25°C, w 0.45 M chlorku sodu i 0,045 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu, i przemyciu, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy

186 242 obejmującej: SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:36 i SEQ ID NO:46.

Korzystnie przemywanie prowadzone jest w 0,9 M chlorku sodu i 0,09 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu w 65°C, albo w 0,0375 M chlorku sodu i 0,00375 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,2% dodecylosiarczanie sodu w 68°C.

W innym rozwiązaniu polinukleotyd jest zmodyfikowany tak, że zawiera kodon do ekspresji i produkcji białka w gospodarzu innym niż gospodarz naturalny.

Przedmiotem wynalazku jest również polinukleotyd funkcjonalnie związany z heterologicznym promotorem, który koduje białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom, przy czym polinukleotyd ten utrzymuje hybrydyzację z komplementarną sekwencją kwasu nukleinowego po hybrydyzacji w 25°C, w 0,45 M chlorku sodu i 0,045 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu, i przemyciu, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmującej: SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:36 i SEQ ID NO:46.

Przemywanie korzystnie prowadzone jest w 0,9 M chlorku sodu i 0,09 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu w65°C albo w 0,0375 M chlorku sodu i 0,00375 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,2% dodecylosiarczanie sodu w 68°C.

W korzystnym rozwiązaniu polinukleotyd zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:37 i SEQ ID NO:47.

Przedmiotem wynalazku jest również polinukleotyd kodujący białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom, który koduje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:37 i SEQ ID NO:47 i jest funkcjonalnie połączony z heterologicznym promotorem.

W innej odmianie przedmiotem wynalazku jest komórka rośliny transgenicznej zawierająca polinukleotyd i/lub, w której zachodzi ekspresja polinukleotydu funkcjonalnie związanego z heterologicznym promotorem, który koduje białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom, przy czym cząsteczka nukleotydową kodująca to białko utrzymuje hybrydyzację z komplementarną sekwencją kwasu nukleinowego, po hybrydyzacji w 25°C, w 0,45 M chlorku sodu i 0,045 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu, i przemyciu, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmującej: SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:36 i SEQ ID NO:46.

W kolejnej odmianie przedmiotem wynalazku jest zrekombinowane białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom. Sekwencja nukleotydową kodująca to białko utrzymuje hybrydyzację z sekwencją kwasu nukleinowego po hybrydyzacji w 25°C, w 0,45 M chlorku sodu i 0,045 M cytrynianie sodu, pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu, i przemyciu, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmującej: SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:36 i SEQ ID NO:46.

Korzystnie przemywanie prowadzone jest w 0,9 M chlorku sodu i 0,09 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1 % dodecylosiarczanie sodu w65°C albo w 0,0375 M chlorku sodu i 0,00375 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,2% dodecylosiarczanie sodu w 68°C.

Przedmiotem wynalazku jest również zrekombinowane białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom, które obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:37 i SEQ ID NO:47.

Przedmioty, zalety i cechy niniejszego wynalazku staną się oczywiste na podstawie poniższego opisu. Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia połączenie izolatów klonowanego DNA stosowanych jako część genów sekwencyjnych toksyny według niniejszego wynalazku; fig. 2 - jest mapą trzech plazmidów stosowanych w procesie sekwencjonowania; fig. 3 - jest mapą przedstawiającą współzależność kilku częściowych fragmentów DNA; fig. 4 - analizę homologiczną pomiędzy sekwencjami białek TcbAii i TcaBii fig. 5 - jest fenogramem szczepów Photorhabdus. Zależność dla szczepów Photorhabdus określono metodą rep-PCR; Górna oś na fig. 5 - określa procentowe podobieństwo szczepów opartych na zliczaniu produktów rep-PCR (to jest od 0,0 - brak podobieństwa, do 1,0 - 100 procentowe po6

186 242 dobieństwo). Liczby i litery przy prawej osi wskazują różne zbadane szczepy: 14=W-14, Hm=Hm, H9=H9, 7=WX-7, 1=WX-1, 2=WX-2, 88=HP88, NC-1=NC-1, 4=WX-4, 9=WX-9, 8=WX-8, 10=WX-10, WIR=WIR, 3=WX-3, 11=WX-11, 5=WX-5, 6=WX-6, 12=WX-12, x!4=WX-14, 15=WX-15, Hb=Hb, B2=B2, 48 do 52 = ATCC 43948 do ATCC 43952. Linie pionowe oddzielające linie poziome wskazują na stopień zależności (odczytywany na podstawie ekstrapolowanego przecięcia linii pionowej z górną osią) pomiędzy szczepami lub grupą szczepów, przy podstawie linii poziomych (na przykład, szczep W-14 jest w około 60 % podobny do szczepów H9 i Hm); fig. 6 przedstawia mapy genomowe szczepu W-14;

Przedmiotem wynalazków jest szczególna klasa owadobójczych toksyn białkowych rodzaju Photorhabdus, które mają doustną toksyczność przeciwko owadom. Photorhabdus można wyodrębniać z różnych źródeł. Jest możliwe, że mogą być inne źródła bakterii Photorhabdus, które wytwarzają toksyny owadobójcze. Takie źródła w środowisku mogą występować zarówno na ziemi jak i w wodzie.

W celu ustalenia, czy kolekcja szczepów ujawniona w niniejszym opisie zawiera szczepy Photorhabdus, scharakteryzowano te szczepy na podstawie rozpoznanych cech, które charakteryzują Photorhabdus i odróżniają je od innych gatunków Enterobacteriaceae i Xenorhabdus. Zbadano następujące cechy: negatywne barwienie Grama pałeczek, wielkość organizmu, pigmentacja kolonii, ciała inkluzyjne, obecność katalazy, zdolność do redukowania azotanu, bioluminescencja, pobieranie barwnika, hydroliza żelatyny, wzrost na selektywnych pożywkach, temperatura wzrostu, przeżycie w warunkach beztlenowych i ruchliwość. Analizę kwasów tłuszczowych zastosowano w celu potwierdzenia, że wszystkie niniejsze szczepy należą do jednego rodzaju Photorhabdus.

Liczne szczepy Photorhabdus zostały scharakteryzowane. Takie szczepy są wymienione w tabeli 18, w przykładach. Ponieważ obecnie w rodzaju Photorhabdus jest zdefiniowany tylko jeden gatunek (luminescens), to cechy gatunku Phi. luminescens użyto do scharakteryzowania szczepów w niniejszym opisie. Jak widać na fig. 5, szczepy te znacznie się różnią między sobą. Można przewidywać, że w przyszłości mogą także zostać zidentyfikowane inne gatunki Photorhabdus, które będą miały pewne cechy gatunku Phi. luminescens, a także pewne odróżniające właściwości, które obecnie są nie zdefiniowane jako cecha Photorhabdus luminescens. Jednakże przedmiotem niniejszego wynalazku jest dowolny gatunek lub szczepy Photorhabdus wytwarzające białka, które mają funkcyjną aktywność jako środki owadobójcze, niezależnie od innych ich cech i właściwości.

Ponadto, jako pokazano w niniejszym opisie, bakterie rodzaju Photorhabdus wytwarzają białka, które mają funkcyjną aktywność określoną w niniejszym opisie. Szczególnie interesujące są białka wytwarzane przez gatunek Photorhabdus luminescens. Wynalazki ujawnione w niniejszym opisie nie powinny być w żaden sposób ograniczone do szczepów w nim ujawnionych. Te szczepy ujawniają po raz pierwszy, że białka wytwarzane przez różne izolaty Photorhabdus są toksyczne przy działaniu na owady. Tak więc, wynalazki podane w niniejszym opisie odnoszą się do wymienionych szczepów i ich dowolnych mutantów, a także do dowolnych szczepów lub gatunków rodzaju Photorhabdus, które mają aktywność funkcyjną podaną w niniejszym opisie.

Kilka określeń stosowanych w niniejszym opisie ma szczególne znaczenie, a mianowicie:

„Aktywność funkcyjna” oznacza, że toksyny białka działają jako środki owadobójcze, przy czym białka te są albo aktywne doustnie, albo mają działanie toksyczne, albo mogą przerywać przyjmowanie pokarmu lub odstraszać od przyjmowania pokarmu, co ewentualnie może powodować śmierć owada. Gdy owad styka się ze skuteczną ilością toksyny dostarczanej w wyniku ekspresji przez transgeniczne rośliny, przygotowanej(ych) kompozycji białka, kompozycji białka do rozpylania, matrycy przynęty lub innego układu dostarczania, to powoduje zwykle śmierć owada, albo owady nie spożywają źródła, które powoduje, że toksyny są dostępne dla owadów.

Omawiane w niniejszym opisie toksyny białkowe są określane zwykle jako „środki owadobójcze”. Przez środki owadobójcze rozumie się w niniejszym opisie, że toksyny białkowe mają „funkcyjną aktywność” określoną powyżej i że są stosowane jako środki do zwalczania owadów.

186 242

Określenie „oligonukleotydy” oznacza makrocząsteczkę zawierającą krótki łańcuch nukleotydowy, albo RNA albo DNA. Taka długość powinna wynosić co najmniej 1 nukleotyd, ale zwykle występuje od około 10 do około 12 nukleotydów. Oznaczanie długości oligonukleotydu może być wykonane z łatwością przez fachowca i nie stanowi ograniczenia. Zatem, oligonukleotydy mogą być także mniejsze od 10 lub większe od 12.

Stosowane w niniejszym określenie „toksyczny” lub „toksyczność” oznacza, że toksyny wytwarzane przez Photorhabdus mają „funkcyjną aktywność” określoną powyżej.

Stosowane w niniejszym określenie „materiał genetyczny” obejmuje wszystkie geny, kwas nukleinowy, DNA i RNA.

Buliony fermentacyjne z wybranych szczepów podanych w tabeli 18 zastosowano do określenia wielkości produkcji toksyny owadobójczej przez rodzaj Photorhabdus i zakresu owadobójczego tych toksyn oraz do dostarczenia materiału źródłowego do oczyszczania kompleksów toksyn. Wykazano, że szczepy scharakteryzowane w niniejszym opisie wykazują doustną toksyczność przeciwko różnym rzędom owadów. Te rzędy owadów obejmują między innymi Coleoptera, Homoptera, Lepidoptera, Diptera, Acarina, Hymenoptera i Dictyoptera.

Podobnie jak w przypadku innych toksyn bakteryjnych, znaczna szybkość mutacji bakterii w populacji powoduje, że powstaje kolejno wiele spokrewnionych toksyn, nieznacznie różniących się pomiędzy sobą. Toksynami interesującymi według wynalazku są te, które podczas ekspozycji na różne owady wytwarzają kompleksy białkowe toksyczne, jak to podano w niniejszym opisie. Toksyny korzystnie są aktywne przeciwko Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Diptera, Hymenoptera, Dictyoptera i Acarina. Niniejsze wynalazki obejmują także toksyny białkowe homologiczne do toksyn białkowych wytwarzanych przez podane szczepy i dowolne ich pochodne, a także toksyny białkowe wytwarzane przez Photorhabdus. Te homologiczne toksyny mogą różnić się pod względem sekwencji, ale nie różnią się działaniem od toksyn opisanych w niniejszym opisie. Homologiczne toksyny są to kompleksy białkowe o ciężarze cząsteczkowym od 300 kDa do 2000 kDa i zawierające co najmniej dwie podjednostki, przy czym podjednostką jest białko, które może być takie samo lub różne od innej podjednostki. Zidentyfikowano i podano w przykładach różne podjednostki białka. Podjednostki białka zwykle mają masę cząsteczkową od 18 kDa do około 230 kDa; od około 160 kDa do około 230 kDa; od około 100 kDa do około 160 kDa; od około 80 kDa do około 100 kDa; i od około 50 kDa do około 80 kDa.

Stosowane określenie „toksyna Photorhabdus” oznacza dowolne białko wytworzone przez szczep mikroorganizmu Photorhabdus, który ma funkcyjną aktywność przeciwko owadom, przy czym toksyna Photorhabdus może być w postaci rozpylanej kompozycji, być wytwarzana przez roślinę transgeniczną, w postaci matrycy przynęty, może być dostarczana poprzez Baculovirus lub dostarczana poprzez dowolnego innego odpowiedniego gospodarza lub układ dostarczania.

Jak omówiono powyżej, niektóre szczepy Photorhabdus można wyizolować z nicieni. Niektóre nicienie, wydłużone cylindryczne pasożytnicze robaki typu Nematoda, rozwinęły zdolność wykorzystywania larw owadów jako korzystnego środowiska wzrostu. Larwy owadów stanowią źródło pokarmu rosnących nicieni i środowisko, w którym się one rozmnażają. Dramatycznym skutkiem inwazji larw przez pewne nicienie jest śmierć larw. Śmierć larw jest spowodowana przez obecność, w pewnych nicieniach, bakterii, które wytwarzają toksynę owadobójczą, hamującą wzrost larw i ich funkcję pokarmowe.

Jest interesujące, że jak się wydaje, każdy rodzaj nicienia pasożytującego na owadach jest gospodarzem określonego rodzaju bakterii dostosowanego do symbiotycznego wzrostu z tym nicieniem. W czasie, od kiedy zaczęto prowadzić te badania, wykonano przeklasyfikowanie rodzaju bakterii o nazwie Xenorhabdus na Xenorhabdus i Photorhabdus. Bakterie rodzaju Photorhabdus charakteryzują się tym, że są symbiontami nicieni Heterorhabditus, podczas gdy gatunki Xenorhabdus są symbiontami z gatunkami Steinernema. Ta zmiana w nomenklaturze jest przyjęta w niniejszym opisie, lecz nie powinna ona w żadnej mierze zmieniać przedmiotu opisanych tu wynalazków.

Białka i geny ujawnione w niniejszym opisie są nazywane zgodnie z wytycznymi opublikowanymi ostatnio w Journal of Bacteriology „Instructions to Authors”, str. i-xii (styczeń

186 242

1996), który włącza się jako odnośnik. Następujące białka i geny wyodrębniono ze szczepu W-14 Photorhabdus.

Nomenklatura białek/genów Kompleks toksyny (Te)

Nazwa białka	Nazwa genu	Sekwencja wg patentu ID#
Region genomowy tea
TcaA	tcaA	12
TcaA„i	tcaA	4
TcaB,	tcaB	3(19, 20)
TcaB„	tcaB	5
TcaC	tcaC	2
Region genomowy teb
TcbA	tcbA	16
TcbAi	tcbA	(probiałko)
TcbAii	tcbA	1(21,22, 23,24)
TcbA„i	tcbA	40
Region genomowy tcc
TccA	tccA	8
TccB	tccB	7
Region genomowy ted
TcdA	tcdA	(probiałko)
TcdAii	tcdA	13(38,39, 17, 18)
TcdAiii	tcdA	41(42, 43)
TcdB	tcdB	14

(sekwencja w nawiasie wskazuje wewnętrzną sekwencję aminokwasu otrzymaną przez trawienia trypsyną).

Podane powyżej sekwencje są zgrupowane według regionu genomowego. Gen tcbA ulegał ekspresji w E. coli jako dwa fragmenty białka TcbA i TcbAii jak to przedstawiono w przykładach. Może być korzystne uzyskanie cięcia proteolitycznego pewnych sekwencji w celu uzyskania większej aktywności toksyn w handlowych zastosowaniach transgenicznych.

Opisane w niniejszym opisie toksyny są wyjątkowe pod tym względem, że toksyny te mają funkcyjną aktywność, która stanowi klucz do opracowania strategii zwalczania owadów. Podczas opracowania strategii zwalczania owadów można opóźnić lub obejść proces degradacji białka przez wstrzykiwanie białka bezpośrednio do organizmu z pominięciem przewodu trawiennego. W takich przypadkach, białko podawane do organizmu zachowuje swą funkcję, dopóki nie ulegnie denaturacji, niespecyficznej degradacji lub eliminacji przez układ odpornościowy w wyższych organizmach. Wstrzykiwanie toksyny owadobójczej może mieć zastosowanie jedynie w laboratorium, a nawet tylko w przypadku dużych owadów, które można z łatwością nastrzykiwać. Stwierdzenie, że owadobójcze toksyny białkowe opisane w niniejszym wynalazku, mają toksyczną aktywność po ich podawaniu doustnym lub w wyniku kontaktu, umożliwia opracowanie planu zwalczania owadów opierającego się jedynie na wprowadzeniu toksyn białkowych do pokarmu owadów. Wynikiem takiego planu może być wytwarzanie przynęt owadzich.

Toksyny Photorhabdus mogą być podawane owadom w postaci oczyszczonej. Toksyny te mogą być podawane w ilościach od około 1 do około 100 mg/l bulionu. Ilość ta może się zmieniać w zależności od stanu kompozycji, stanu źródła szczepionki, sposobów wyodrębniania toksyny itp. Toksyny można podawać w postaci wydzieliny lub w postaci białka komórkowego z początkową ekspresją w heterologicznym gospodarzu prokariotycznym lub eukariotycznym. Gospodarzami, w których białka są produkowane, są zwykle bakterie. Gospodarzami eukariotycznymi mogą być między innymi rośliny, owady i drożdże. Alternatywnie, toksyny mogą być wytwarzane w bakteriach lub roślinach transgenicznych na polu lub w samym owadzie za pomocą wektora bakulowirusowego. Toksyny zwykle wprowadza się do owada przez dodanie jednej lub kilku toksyn do pokarmu owadów.

186 242

Całkowita śmiertelność odżywianych w ten sposób owadów jest przydatna, ale nie jest konieczna do uzyskania użytecznej toksyczności. Jeśli owady unikają toksyny lub zaprzestają przyjmowania pokarmu, to może to być użyteczne w pewnych zastosowaniach, nawet, jeśli efekty nie są letalne. Gdy, na przykład, pożądane są transgeniczne rośliny uprawne odporne na owady, to odmowa pobierania pokarmu przez owady na roślinach jest tak samo przydatna, jak letalna toksyczność względem owadów, ponieważ ostatecznym celem jest raczej ochrona roślin, a nie zabijanie owadów.

Istnieje wiele innych sposobów wprowadzania toksyn do pokarmu owadów. Można, na przykład, zanieczyścić źródło pokarmu larw za pomocą toksycznego białka przez spryskiwanie pokarmu roztworem białka, jak to ujawniono w niniejszym opisie. Alternatywnie, oczyszczone białko może być wprowadzone genetycznie do nieszkodliwego białka, które można następnie hodować w pożywce i albo wprowadzać do źródła pokarmu, albo pozostawić w glebie, tam gdzie jest pożądane wytępienie owadów. Białko można także wprowadzić genetycznie bezpośrednio do źródła pokarmu owadów. Głównym źródłem pokarmu wielu larw owadów jest materiał roślinny.

W wyniku wprowadzenia materiału genetycznego, który koduje właściwości owadobójcze toksyn Photorhabdus w genomie rośliny zjadanej przez danego owadziego szkodnika, dorosły owad lub larwy zginą po zjedzeniu rośliny którą żywiły. Liczne rośliny ^z rodzajów jednoliściennych i dwuliściennych były transformowane. Transgeniczne uprawy rolnicze, jak również owoce i warzywa mają handlowe zastosowanie. Takimi uprawami są, na przykład, kukurydza, ryż, soja, lucerna siewna, sorgo, pszenica, bawełna, orzeszki ziemne, pomidory, ziemniaki itp. Istnieje kilka technik wprowadzania obcego materiału genetycznego do komórek roślinnych i otrzymywania roślin, które trwale zachowują i prowadzą ekspresję wprowadzonego genu. Takie techniki obejmują przyspieszanie materiału genetycznego powleczonego na mikrocząstkach bezpośrednio do komórek'. Rośliny można transformować przy użyciu technologii Agrobacterium. Inną technologią transformacji jest technologia whiskersów¹. Do transformowania roślin zastosowano także technologię elektroporacji'^v. Oprócz licznych technologii transformowania roślin może także być różny rodzaj tkanki, który styka się z obcymi genami. Taką tkanką może być między innymi tkanka zarodkowa, tkanka przyranna typu I i II, kolanko podliścieniowe, tkanka twórcza itp. Prawie wszystkie tkanki roślinne mogą być transformowane podczas różnicowania przy użyciu odpowiednich technik znanych fachowcom.

Inną zmiennąjest wybór markera do selekcji. Wybór konkretnego markera zależy od fachowca, lecz można zastosować dowolny z następujących markerów do selekcji, razem z dowolnym innym genem nie wymienionym w niniejszym opisie, który może działać jako marker selekcyjny. Takimi markerami selekcyjnymi są między innymi gen kodujący fosfotransferazę aminoglikozydową transpozonu Tn5 (Aph II), który koduje odporność na antybiotyki kanamycynę, neomycynę i G418, jak również na te geny, które kodują odporność lub tolerancję na glifozat; na hydromycynę; metotreksat, fosfmotrycynę (bialofos); imidazolinony, sulfonylomoczniki i herbicydy triazolopirymidynowe, takie jak chlorosulfuron; bromoksynil, dalapon itp.

Oprócz markera selekcyjnego może być pożądane stosowanie genu reporterowego.

W pewnych przypadkach gen reporterowy może być stosowany bez markera selekcyjnego. Genami reporterowymi są geny, które zwykle nie występują lub nie ulegają ekspresji w przyjmującym organizmie lub tkance. Gen reporterowy zwykle koduje białko, które powoduje pewną zmianę fenotypową lub nadaje właściwość enzymatycznąv. Korzystnym genem reporterowym jest gen glukuronidazy (GUS).

Niezależnie od techniki transformacji korzystnie wprowadza się gen do wektora przenoszącego gen, który ulega ekspresji i otrzymuje się toksynę Photorhabdus w komórce rośliny w wyniku włączenia promotora roślinnego do wektora. Oprócz promotorów roślinnych, w celu uzyskania ekspresji obcych genów w komórkach roślin można stosować skutecznie promotory z różnych źródeł. Można stosować, na przykład, promotory pochodzenia bakteryjnego, takie jak promotor syntazy oktopinowej, promotor syntazy nopalinowej, promotor syntazy manopinowej; promotory pochodzenia wirusowego, takie jak wirus mozaiki kalafiorowej (35S i 19S) itp. Promotorami roślinnymi są między innymi mała podjednostka (ssu) karbok10

186 242 sylazy rybulozo-1,6-bisfosforanowej (RUPB), promotor beta-konglicyniny, promotor fazeoliny, promotor ADH, promotory szoku cieplnego i specyficzne promotory tkankowe. Promotory mogą także zawierać pewne elementy enhancera sekwencji, które mogą poprawiać wydajność transkrypcji.Typowymi enhancerami są między innymi Adh-intron 1 i Adh-intron 6. Można stosować promotory konstytutywne. Promotory konstytutywne kierują ciągłą ekspresją genów we wszystkich rodzajach komórek i w ciągu całego czasu (na przykład - aktyna, ubikwityna, CaMV 35S). Promotory specyficzne dla tkanki odpowiadają za ekspresję genów w specyficznych rodzajach komórek lub tkanek, takich jak liście lub nasiona (na przykład zeiny, oleozyny, napiny, ACP) i te promotory mogą być także stosowane. Promotory mogą być także aktywne podczas pewnego etapu rozwoju roślin, a także w tkankach i organach roślin. Jako przykłady takich promotorów można między innymi wymienić promotory specyficzne dla pyłku, specyficzne dla embrionu, specyficzne dla włókna bawełny, specyficzne dla korzeni, specyficzne dla endospermy nasion itp.

W pewnych warunkach może być pożądane stosowanie indukowalnego promotora. Indukowalny promotor odpowiada za ekspresję genów w odpowiedzi na specyficzny sygnał, taki jak bodziec fizyczny (geny szoku cieplnego); światło (karboksylaza RUPB); hormon (Em); metabolity i szok. Inne pożądane elementy transkrypcji i translacji, które działają w roślinach, mogą być także użyte. W technice znane są liczne wektory do przenoszenia genów specyficzne dla roślin.

Ponadto wiadomo, że aby uzyskać dużą ekspresję genów bakteryjnych w roślinach, korzystne jest poddanie genów bakteryjnych obróbce genetycznej, dzięki której dają one bardziej wydajną ekspresję w cytoplazmie roślin. Kukurydza jest rośliną, w przypadku której, w celu zwiększenia poziomu ekspresji toksyny w roślinie, korzystne jest poddanie obróbce genetycznej genu/genów bakteryjnych przed transformacją. Jednym z powodów takiego działania jest bardzo mała zawartość G+C w rodzimych genach bakteryjnych (i w konsekwencji przesunięcie w kierunku dużej zawartości A+T). Powoduje to generowanie sekwencji naśladujących lub powtarzających sekwencje kontroli genów w roślinach, o których wiadomo, że są bardzo bogate w A+T. Obecność pewnych bogatych w A+T sekwencji genu/genów w DNA wprowadzonych do roślin (na przykład sekwencje TATA znajdujące się zwykle w promotorach genów) może powodować odbiegającą od normy transkrypcję genu/genów. Z drugiej strony, obecność innych regulacyjnych sekwencji w transkrybowanym mRNA (na przykład sekwencji sygnału poliadenylacji - AAUAA) lub sekwencji komplementarnych do małych jądrowych RNA biorących udział w splicingu pre-mRNA) może powodować niestabilność RNA. Dlatego jednym z celów projektowania genu/genów bakteryjnych poddanych obróbce genetycznej, korzystniej określanych jako optymalizowane geny roślinne, jest generowanie sekwencji DNA o większej zawartości G+C i korzystnie zbliżonych do genów roślinnych kodujących enzymy metaboliczne. Innym celem projektowania optymalizowanych genów roślinnych jest generowanie sekwencji DNA, która nie tylko ma większą zawartość G+C, lecz modyfikacja zmian sekwencji powinna być tak wykonana, aby nie ograniczała translacji.

Przykładem rośliny o dużej zawartości G+C jest kukurydza. Poniższa tabela pokazuje, jak duża jest zawartość G+C w kukurydzy. Uważa się, że zawartość G+C w innych roślinach jest także duża, podobnie jak w kukurydzy.

Tabela 1

Kompilacja zawartości G+C regionów kodujących białko w genach kukurydzy

Klasa białka3	Zakres G+C, %	Średnia zawartość G+C b, %
1	2	3
Enzymy metaboliczne (40)	44,5-75,3	59,0 (8,0)
Białka zapasowe
Grupa I (23)	46.0-51,9	48,1 (1,3)
Grupa II (13)	60,4-74,3	67,5 (3,2)

186 242 ciąg dalszy tabeli 1

1	2	3
Grupa I + II (36)	46,0-74,3	55,1 (9,6) c
Białka strukturalne (18)	48,6-70,5	63,6 (6,7)
Białka regulacyjne (5)	57,2-68,9	62,0 (4,9)
Białka nie charakteryzowane (9)	41,5-70,3	64,3 (7,2)
Wszystkie białka (108)	44,4-75,3	60,8 (5,2)

^a Liczba genów w klasie podana w nawiasach ^b Odchylenia standardowe podane w nawiasach ^c Łączną średnią grupową pominięto w obliczaniu ogólnej średniej

Dla danych w tabeli 1, regiony kodujące genów uzyskano z wpisów w banku genów (komunikat 71), a składy zasad obliczono przy użyciu programu MacVector™ (IBI, New Haven, CT). W obliczeniach pominięto sekwencje intronowe. Sekwencje genów białka zapasowego grupy I i II rozróżniono na podstawie znacznej różnicy w składzie zasad.

Dzięki plastyczności wynikającej z nadmiarowości kodu genetycznego (to znaczy, że pewne aminokwasy odpowiadają więcej niż jednemu kodonowi), ewolucja genomów różnych organizmów lub klas organizmów spowodowała zróżnicowane wykorzystanie nadmiarowych kodonów. To „odchylenie kodonowe” ujawnia się w średnim składzie regionów kodujących białko. Na przykład, organizmy o stosunkowo małej zawartości G+C stosują kodony mające A lub T w trzeciej pozycji nadmiarowych kodonów, podczas gdy organizmy o większej zawartości G+C stosują kodony mające G lub C w trzeciej pozycji. Uważa się, że obecność „rzadziej występujących” kodonów w mRNA genu może zmniejszać bezwzględną szybkość translacji tego mRNA, zwłaszcza wtedy, gdy względna 'ilość naładowanego tRNA odpowiadającego rzadziej występującemu kodonowi jest mała. Z tego faktu wynika to, że zmniejszenie szybkości translacji przez poszczególne rzadziej występujące kodony powinno być co najmniej addytywne dla wielokrotnych rzadziej występujących kodonów. Z tego powodu, mRNA mające duże względne zawartości rzadziej występujących kodonów miałyby odpowiednio niskie szybkości translacji. Taka szybkość ujawniłaby się w syntezie małych ilości kodowanego białka.

W celu poddania obróbce genetycznej bakteryjnego genu/genów, oznaczono odchylenie kodonu rośliny. Odchylenie kodonu rośliny jest statystycznym rozkładem kodonów, które roślina stosuje do kodowania swych białek. Po oznaczeniu odchylenia, oznacza się procentową częstotliwość występowania kodonów w interesującym nas genie/genach. Powinny być oznaczone główne kodony wykorzystywane przez roślinę, a także drugi i trzeci wybór stosowanych kodonów. Sekwencja aminokwasowa danego białka jest poddawana odwrotnej translacji, dzięki czemu otrzymana sekwencja kwasu nukleinowego koduje takie samo białko, jak rodzimy gen bakteryjny, ale otrzymana sekwencja kwasu nukleinowego odpowiada głównym kodonom wykorzystywanym przez daną roślinę. Nową sekwencję analizuje się pod kątem miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych, które mogłyby być wytworzone w wyniku modyfikacji. Zidentyfikowane miejsca są dodatkowo modyfikowane przez zastąpienie kodonów za pomocą drugiego i trzeciego wyboru kodonów stosowanych przez roślinę. Innymi miejscami w sekwencji, które mogłyby wpływać na transkrypcję lub translację danego genu, są połączenia egzon:intron 5' lub 3', sygnały addycji poli A lub sygnały terminacji polimerazy RNA. Sekwencję analizuje się dalej i modyfikuje w celu zmniejszenia częstotliwości dubletów TA lub GC. Poza dubletami, sekwencje bloków G lub C, które mają więcej niż około 4 reszt, które są takie same, mogą wpływać na transkrypcję sekwencji. Z tego powodu, także te bloki są modyfikowane przez zastąpienie kodonów pierwszego lub drugiego wyboru itd. następnym wybranym kodonem. Jest korzystne, aby optymalizowane geny rośliny zawierały około 63 % kodonów (głównych) pierwszego wyboru, od około 22 % do około 37 % kodonów drugiego wyboru i od 15 % do 0 % kodonów trzeciego wyboru, przy czym całkowita zawartość wynosi 100 %. Najkorzystniejsze optymalizowane geny rośliny zawierają około 63 % kodonów pierwszego wyboru, co najmniej około 22 % kodonów drugiego wyboru, około 7,5 % kodo12

186 242 nów trzeciego wyboru i około 7,5 % kodonów czwartego wyboru, przy czym całkowita ich zawartość wynosi 100 %. Opisany powyżej sposób pozwala fachowcowi modyfikować gen/geny, obce dla danej rośliny, tak aby geny ulegały optymalnej ekspresji w roślinach^v\

Tak więc, w celu zaprojektowania zoptymalizowanych genu(ów) rośliny, sekwencję aminokwasową toksyn poddaje się odwrotnej translacji do sekwencji DNA, stosując nienadmiarowy kod genetyczny określony na podstawie tabeli odchylenia kodonu zestawionego dla sekwencji genu DNA danej rośliny poddawanej transformacji. Otrzymana sekwencja DNA, która jest całkowicie jednorodna pod względem stosowanych kodonów, jest dalej modyfikowana w celu określenia sekwencji DNA, która oprócz posiadania większego stopnia różnorodności kodonu, zawiera także strategicznie rozmieszczone miejsca rozpoznawania enzymu restrykcyjnego, pożądany skład zasad i nie ma takich sekwencji, które mogłyby przeszkadzać w transkrypcji lub translacji wytworzonego mRNA.

Przyjmuje się, że geny bakteryjne mogą ulegać łatwiej ekspresji w roślinach wtedy, gdy geny bakteryjne ulegają ekspresji w plastydach. Tak więc, może być wtedy możliwe uzyskanie ekspresji genów bakteryjnych w roślinach bez optymalizacji genów do ekspresji roślinnej i uzyskanie dużej ekspresji białka™.

Jednym z zagadnień związanych z handlowym wykorzystaniem roślin transgenicznych jest kierowanie ich odpornością. Dotyczy to szczególnie toksyn Bacillus thuringensis. Liczne firmy wykorzystują handlowo Bacillus thuringensis i duże zaniepokojenie wywołał fakt odporności na toksyny Bt. Jedna strategia opracowania kontrolowania odporności owadów polegałaby na połączeniu toksyn wytwarzanych przez Photorhabdus z toksynami, takimi jak Bt, wegetatywnymi białkami owadów (Ciba Geigy) lub z innymi toksynami. Te połączenia mogłyby być komponowane do natrysku lub mogłyby być mieszaninami cząsteczkowymi. Rośliny mogłyby być transformowane genami Photorhabdus, które wytwarzają toksyny owadobójcze i inne geny toksyn owadobójczych, takich jak Bt z innymi genami toksyn owadobójczych, takimi jak Bt.

Może być przeprowadzona transformacja 2 Bt w roślinie, którymi mogą być dowolne 2 genyV. Innym sposobem wytwarzania rośliny transgenicznej, która zawiera więcej niż jeden gen odporności na owady, byłoby wytworzenie dwóch roślin, przy czym każda z nich zawierałaby gen odporności na owady. Rośliny te mogłyby być skrzyżowane wzajemnie przy zastosowaniu tradycyjnych technik hodowli roślin w celu wytworzenia rośliny zawierającej więcej niż jeden gen odporny na owady.

Poza wytwarzaniem transformowanej rośliny zawierającej optymalizowane geny roślinne istnieją także inne układy dostarczania, w których mogłoby być pożądane poddanie obróbce genetycznej genu/genów bakteryjnych. Według takich samych zasad można wytworzyć, metodą obróbki genetycznej, łatwo izolowaną toksynę białkową przez fuzję cząsteczki atrakcyjnej dla owadów jako źródło pokarmu i toksyny o aktywności owadobójczej, ulegającej ekspresji w bakteriach lub w komórkach eukariotycznych przy użyciu standardowych znanych technik. Po oczyszczeniu w laboratorium taki czynnik toksyczny z „wbudowaną” przynętą mógłby być wprowadzany do standardowych pułapek na owady.

Inny schemat dostarczania polega na wprowadzeniu materiału genetycznego toksyn do wektora bakulowirusowego. Bakulowirusy zarażają poszczególnych gospodarzy owadzich, włącznie z gospodarzami będącymi celem toksyn Photorhabdus. Infekcyjny bakulowirus zwierający konstrukt ekspresyjny do ekspresji toksyn Photorhabdus, mógłby być wprowadzony na obszary zarażone owadami, aby w ten sposób zatruć lub wytruć zarażone owady.

Przenoszenie właściwości owadobójczych wymaga użycia sekwencji kwasów nukleinowych kodujących sekwencje aminokwasowe toksyn Photorhabdus włączone do wektora ekspresji białka odpowiedniego dla gospodarza, w którym będzie znajdował się wektor. Jeden ze sposobów uzyskania sekwencji kwasu nukleinowego kodującego białko o właściwościach owadobójczych polega na izolowaniu rodzimego materiału genetycznego, który wytwarza toksyny z Photorhabdus. stosując informację wyprowadzoną z sekwencji aminokwasowej toksyny, której duże części określono w tekście poniżej. Jak opisano poniżej, ujawniono także sposoby oczyszczania białek odpowiedzialnych za toksyczną aktywność.

186 242

Przy użyciu danych dotyczących sekwencji aminokwasowej końca N, takich, jak podane poniżej, można skonstruować oligonukleotydy komplementarne do wszystkich lub do części zasad DNA, które kodują pierwsze aminokwasy toksyny. Te oligonukleotydy mogą być znakowane radioaktywnie i zastosowane jako sondy cząsteczkowe w celu wyodrębnienia materiału genetycznego z banku genów genetycznej zbudowanej z materiału genetycznego wyodrębnionego ze szczepów Photorhabdus. Bank genów może być klonowany do wektorów plazmidowych, kosmidowych, fagowych lub fagemidowych. Bankiem może być transformowana Escherichia coli i przeszukiwana pod względem wytwarzania toksyn przez transformowane komórki przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko toksynie lub za pomocą bezpośrednich prób na toksyczność owadobójczą.

Takie podejście wymaga wytworzenia serii oligonukleotydów, ponieważ degeneracyjny kod genetyczny umożliwia kodowanie aminokwasu przez DNA przez dowolną z kilku kombinacji trzech nukleotydów. Aminokwas arginina może być, na przykład, kodowany tripletami kwasu nukleinowego CGA, CGC, CGG, CGT, AGA i AGG. Ponieważ nie można przewidzieć, który triplet jest zastosowany w genie toksyny w danych pozycjach, trzeba przygotować oligonukleotydy z każdym możliwym tripletem. Więcej niż jedna cząsteczka DNA odpowiadająca podjednostce białka może być potrzebna do skonstruowania wystarczającej liczby sond oligonukleotydowych w celu uzyskania wszystkich podjednostek białka potrzebnych do uzyskania doustnej toksyczności.

Z sekwencji aminokwasowej oczyszczonego białka, materiały genetyczne odpowiedzialne za wytwarzanie toksyn można z łatwością wyodrębnić i klonować, w całości lub częściowo, do wektora ekspresji stosując dowolny z kilku sposobów znanych fachowcom w dziedzinie biologii molekularnej. Typowym wektorem ekspresyjnym jest plazmid DNA, jakkolwiek można stosować także inne środki przenoszenia, takie jak między innymi kosmidy, fagemidy i fagi. Poza cechami wymaganymi lub pożądanymi do replikacji plazmidu, takimi jak początek replikacji i odporność na antybiotyki lub inną postać markera selekcyjnego, takiego jak gen bar Streptomyces hygroscopicus lub St. viridochromogenes, wektory ekspresji białka zwykle wymagają kasety ekspresyjnej, która zawiera sekwencje działające w pozycji cis, konieczne do transkrypcji i translacji interesującego genu. Działające w pozycji cis, wymagane do ekspresji w prokariotach sekwencje różnią się od sekwencji wymaganych w eukariotach i roślinach.

Eukariotyczna kaseta ekspresyjna wymaga promotora transkrypcyjnego w górę (5') od danego genu, transkrypcyjnego regionu terminacji, takiego jak miejsce addycji poli A i miejsca wiązania rybosomu w górę od kodonu pierwszego genu. W komórkach bakteryjnych, użytecznym promotorem transkrypcyjnym, który mógłby być wprowadzony do wektora, jest promotor wiążący polimerazę T7 RNa. Wiadomo, że promotory opisane powyżej skutecznie promują transkrypcję mRNA. Także w górę od danego genu. wektor może zawierać sekwencję nukleotydu kodującą sekwencję sygnałową, o której wiadomo, że kieruje kowalencyjnie związane białko do określonego przedziału komórek gospodarza, takich jak powierzchnia komórki.

Wiadomo, że wirusy owadów, czyli bakulowirusy, zarażają i wpływają niekorzystnie na pewne owady. Wpływ wirusów na owady jest powolny i wirusy nie zatrzymują przyjmowania pokarmu przez owady. Tak więc, wirusy nie są uważane za środki użyteczne do zwalczania owadów. Połączenie genów toksyn Photorhabdus z wektorem bakulowirusa może być skutecznym sposobem przenoszenia toksyn i zwiększenia śmiertelności wirusa. Ponadto, ponieważ różne bakulowirusy są specyficzne względem różnych owadów, to może być możliwe stosowanie szczególnej toksyny do selektywnego celowania na szczególne szkodniki. Szczególnie użytecznym wektorem dla genów toksyn jest wirus jądrowej polihedrozy. Wektory przenoszenia wykorzystujące ten wirus zostały opisane i są obecnie wektorami z wyboru do przenoszenia obcych genów do owadów. Rekombinantowy gen kodujący toksynę - wirus może być skonstruowany w postaci przenoszonej doustnie. Bakulowirusy normalnie zarażają owady będące ich ofiarami poprzez jelitową błonę śluzową jelita cienkiego. Gen toksyny wprowadzony do silnego promotora białka otoczki wirusowej uległaby ekspresji i powinien szybko uśmiercać zarażone owady.

186 242

Poza układem dostarczania toksyn białkowych według niniejszego wynalazku za pomocą wirusa owadów lub bakulowirusa lub transgenicznej rośliny, białka mogą być otoczkowane przy użyciu technologii otoczkowania za pomocą Bacillus thuringiensis*

Innym układem dostarczania toksyn białkowych według niniejszego wynalazku jest preparat białka w matrycy przynęty, który może być następnie użyty w nad ziemnych lub pod ziemnych pułapkach z przynętą dla owadów*.

Jak opisano powyżej, może się okazać konieczne modyfikowanie sekwencji kodującej białko, gdy ulega ono ekspresji w gospodarzu innym niż rodzimy, ponieważ preferencje kodonowe innych gospodarzy mogą różnić się od preferencji Photorhabdus. W takim przypadku translacja w nowym gospodarzu może być zupełnie niewydajna, o ile nie zostaną wykonane kompensujące modyfikacje sekwencji kodującej. Ponadto, mogą być pożądane modyfikacje sekwencji aminokwasowej, aby uniknąć hamującej krzyżowej reaktywności z białkami nowego gospodarza lub aby ulepszyć właściwości owadobójcze białka w nowym gospodarzu. Genetycznie modyfikowany gen może kodować toksynę, wykazującą, na przykład, zwiększoną lub zmniejszoną toksyczność, zmienioną odporność na owady, zmienioną trwałość lub modyfikowaną specyficzność względem gatunku docelowego.

Oprócz genów Photorhabdus kodujących toksyny, przedmiotem niniejszego wynalazku są pokrewne sekwencje kwasu nukleinowego, które kodują biopolimery aminokwasowe homologiczne z białkami toksyn i które zachowują po podawaniu doustnym działanie toksyczne białek Photorhabdus w gatunkach owadów.

Wydaje się, że toksyny stosowane według niniejszego wynalazku, na przykład, najpierw hamują przyjmowanie pokarmu przez larwy przed ich śmiercią. Przez manipulację sekwencją kwasów nukleinowych kodującą toksyny Photorhabdus lub przez kontrolę sekwencji metodą obróbki genetycznej można umieścić gen kodujący toksynę w roślinach i modulować jego siłę lub sposób działania, a więc, na przykład, utrzymywać aktywność hamowania przyjmowania pokarmu z jednoczesnym eliminowaniem bezwzględnej toksyczności względem larw. Taka zmiana może umożliwić przetrwanie transformowanej rośliny do zbiorów, bez wywierania na ekosystem zbytecznego dramatycznego efektu związanego z usunięciem wszystkich docelowych owadów. Wszystkie takie modyfikacje genu kodującego toksynę lub białka kodowanego przez gen wchodzą w zakres niniejszego wynalazku.

Inne ujawnione zmiany kwasu nukleinowego polegają na wprowadzaniu sekwencji docelowych w celu kierowania toksyny do określonych części larw owadów w celu poprawienia jej skuteczności.

Szczepy ATCC 55397, 43948, 43949, 43950, 43951 i 43952 złożono do depozytu w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA. Dane dotyczące sekwencji aminokwasów i nukleotydów dla rodzimej toksyny W-14 (ATCC 55397) przedstawiono poniżej. Podano także przykład wyodrębnienia genomowego dNa dla toksyn z gospodarzy bakteryjnych.

Następujące skróty zastosowano w przykładach: Tris = Tris(hydroksymetylo) aminometan; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy, IPTG = izopropylotio-B-galktozyd, X-gal = 5-bromo-4-chloro-3-indoilo-B-D-galaktozyd, CTAB = bromek cetylotrimetyloamoniowy; kbp = pary kilozasad; dATP, dCTP, dGTP, dTPP, I = 5'- trifosforany 2'-dezoksynukleozydu, odpowiednio, adeniny, cytozyny, guaniny, tyminy i inozyny; ATP = 5'-trifosforan adenozyny.

Przykład I. Oczyszczanie toksyny z P. luminescens i wykazywanie toksyczności po doustnym podawaniu toksyny

Owadobójczą toksynę białkową według mniejszego wynalazku oczyszczano z P. luminescens, szczep W-14, Numer dostępu ATCC 55397. Hodowle macierzyste P. luminescens przygotowywano na szalkach Petriego zawierających 2% peptonu proteozy nr 3 (to jest PP3, Difco Laboratories, Detroit, MI) w 1,5-proc. agarze, inkubowano w temperaturze 25°C i przenoszono co tydzień. Kolonie pierwotnej postaci bakterii szczepiono w 200 ml bulionu PP3 uzupełnionego 0,5 % monostearynianem sorbitu poli(tlenku etylenu) (Tween 60, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) w 1-litrowej kolbie. Hodowle bulionowe hodowano w ciągu 72 h w temperaturze 30°C na obrotowej wytrząsarce. Białka toksyny mogą być odzyskiwane z hodowli otrzymywanych w obecności lub przy braku Tween; jednakże brak Tween

186 242 może wpływać na formę hodowanych bakterii i profil białek wytwarzanych przez bakterie. Przy braku Tween występuje przesunięcie wariantowe, przy czym masa cząsteczkowa co najmniej jednej zidentyfikowanej podjednostki toksyny przesuwa się od około 200 kDa do około 185 kDa.

Po 72 h wirowano hodowle przy 10000 g wciągu 30 minut w celu usunięcia komórek i resztek. Frakcję nadsączu, która miała aktywność owadobójczą, zdekantowano i wprowadzono do 50 mM K.2HPO4 przez dodanie odpowiedniej objętości 1,0 Μ K2HPO4. Nastawiono pH 8,6 za pomocą wodorotlenku potasu. Tę frakcję nadsączu zmieszano następnie z DEAE-Sephacel (Pharmacia LKB Biotechnology), którą uprzednio zrównoważono za pomocą 50 mM R2HPO4. Frakcja o aktywności toksycznej była adsorbowana przez żywicę DEAE. Tę mieszaninę wprowadzono następnie do kolumny 2,6 x 40 cm i przemywano 50 mM K2HPO4 w temperaturze pokojowej przy szybkości przepływu 30 ml/h, tak długo, aż wyciek uzyskał stałą absorbancję UV przy linii podstawowej 280 nm. Następnie kolumnę przemywano 150 mM KCl, aż wyciek uzyskał ponownie stałą adsorbancję UV przy linii podstawowej 280 nm. W końcu przemyto kolumnę za pomocą 300 nM KCl i zebrano frakcje.

Frakcje zawierające toksynę zebrano i sterylizowano na sączku przy użyciu filtru membranowego o wielkości porów 0,2 mikrona. Następnie zatężono toksynę i równoważono do 100 nM KPO4, pH 6,9, stosując membranę do ultrafiltracji o odcięciu masy cząsteczkowej przy 100 kDa, w temperaturze 4°C (Centriprep 100, Amicon Division-W.R. Grace and Company). 3-ml próbkę koncentratu toksyny naniesiono od góry na kolumnę filtracyjną o wymiarach 2,6 x 95 cm z żelem Sephacryl S-400 HR (Pharmacia LKB Biotechnology). Jako bufor eluentu stosowano 100 mM KPO4 pH 6,9, który przepływał z szybkością 17 ml/h w temperaturze 4 °C. Wyciek monitorowano przy 280 nm.

Zebrano frakcje i zbadano ich aktywność toksyczną. Toksyczność frakcji chromatograficznych zbadano w próbie biologicznej przy użyciu larw Manduca sexta. Frakcje albo wprowadzano bezpośrednio do pokarmu owada (pokarm z zarodków pszenicy dla brudnicy nieparki, ICN Biochemicals Division - ICN Biomedicals, Inc.) lub podawano za pomocą zastrzyku wewnątrzkomórkowego 5 μΐ próbki przez pierwszą przednią nóżkę larwy w IV lub V stadium, przy użyciu igły 30. Notowano wagę każdej larwy w grupie w odstępach 24 h. Przyjmowano, że występuje toksyczność, jeśli owad zaprzestał przyjmowania pokarmu i ginął w ciągu kilku dni pobierania pokarmu poddanego obróbce lub, jeśli śmierć następowała w ciągu 24 h po zastrzyku frakcji.

Toksyczne frakcje gromadzono i zatężano przy użyciu Centriprep-100 i następnie analizowano metodą HPLC przy użyciu 7,5 mm x 60 cm kolumny do chromatografii żelowej TSK-GEL G-4000 SW za pomocą 100 mM fosforanu potasu, pH 6,9, przepływ buforu eluentu 0,4 ml/min. Ta analiza ujawniła, że białko toksyny jest zawarte w pojedynczym ostrym piku, wymywanym z kolumny przy czasie retencji około 33,6 minut. Czas retencji odpowiadał ocenionej masie cząsteczkowej 1000 kDa. Frakcję piku zebrano do dalszego oczyszczania, natomiast odrzucono frakcje nie zawierające tego białka. Wymywany pik z HPLC absorbuje światło UV przy 218 i 280 nm, lecz nie absorbuje go przy 405 nm. Wykazano, że absorbancja przy 405 nm jest cechą związków antybiotycznych Xenorhabdin.

Elektroforeza zebranych frakcji pików w nie denaturującym żelu agarozowym (Metaphor Agarose, FMC BioProducts) wykazała, że w piku znajdują się dwa kompleksy białkowe. Materiał piku, buforowany w 50 mM Tris-HCl, pH 7,0 rozdzielono na 1,5 % gromadzącym żelu agarozy buforowanym za pomocą 100 mM Tris-HCl przy pH 7,0 i na 1,9 % rozdzielającym żelu agarozy buforowanym za pomocą 200 mM Tris-boranu przy pH 8,3 w standardowych warunkach buforowania (bufor anodowy 1 M Tris-HCl, pH 8,3; bufor katodowy 0,025 M Tris, 0,192 M glicyna). Pracowano z żelami przy stałym prądzie 13 mA w temperaturze 15°C, aż wskaźnikowy barwnik czerwieni fenolowej doszedł do końca żelu. Przy użyciu wybarwienia błękitem jaskrawym Coomassie wykazano obecność 2 pasm białkowych.

Wolniej migrujące pasmo nazwano „pasmem 1 białka”, a szybciej migrujące pasmo nazwano „pasmem 2 białka”. Oba pasma białkowe występowały w przybliżeniu w takich samych ilościach. Wybarwione za pomocą barwnika Coomassie żele agarozowe stosowano jako wskaźnik do dokładnego wycięcia obu pasm białkowych z nie wybarwionych części żelu.

186 242

Wycięte części zawierające pasma białkowe macerowano i dodawano małą ilość sterylnej wody. Jako próbę kontrolną, wycinano także część żelu nie zawierającą białka i poddawano ją takiej samej obróbce, jak części żelu zawierające białko. Białko odzyskiwano z części żelu metodą elektroelucji do 100 mM Tris-boranu, pH 8,3, przy 100 V (napięcie stałe) w ciągu 2 h. Alternatywnie, białko wymywano pasywnie z części żelu przez dodawanie równej objętości 50 mM Tris-HCl, pH 7,0 do tej części żelu i następnie inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 16 h. Umożliwiło to dyfuzję białka z żelu do buforu, który następnie zbierano.

Wyniki prób toksyczności na owadach przy użyciu toksyny oczyszczonej metodą HPLC (pik 33,6 minut) i toksyny oczyszczonej na żelu agarozowym wykazały toksyczność obu ekstraktów. Zastrzyk 1,5 pg białka oczyszczonego na HPLC zabija wciągu 24 h. Oba pasma białka, pasmo 1 i pasmo 2, odzyskane z żelów agarozowych metodą pasywnego wymywania lub elektroelucji, powodowały śmierć po zastrzyku. Stężenie białka ocenione dla tych próbek było mniejsze od 50 ng/larwę. Porównanie przyrostu masy i śmiertelności grup larw, którym wstrzykiwano białko pasma 1 lub białko pasma 2 pokazało, że białko pasma 1 jest bardziej toksyczne w przypadku dostarczenia w zastrzyku.

Gdy do pokarmu larw wprowadzono toksynę oczyszczoną metodą HPLC o stężeniu 7,5 pgdarwę, powodowało to zatrrymanie prr\yostu masy 1 arw (Tatiano 24· larwy).Larwy zzczynają przyjmować pokarm, ale po zjedzeniu tylko małej części tego pokarmu zawierającego toksynę zaczynały wykazywać objawy chorobowe wywołane przez toksynę i przestawały przyjmować pokarm. Odchody larw traciły znbarwieoie i większość larw miała objawy biegunki. Wyraźna śmiertelność owadów występowała, gdy kilka 5 pg dawek toksyny wprowadzono do pokarmu w ciągu od 7 do 10 dni.

Pasmo 1 białka, wydzielone w agarozie, wyraźnie hamowało przyrost wagi larw przy dawce 200 ng/larwę. Larwy karmione podobnymi stężeniami białka pasma 2 nie wykazywały hrmownoia i przybierały na wadze z taką samą szybkością, jak larwy kontrolne. 12 larw karmiono białkiem wymywanym, a 45 larw karmiono częściami ngnroay zawierającymi białko. Te dwa zestawy danych wskazują, że białko pasma 1 było doustnie toksyczne dla Manduca sexta. W tym samym doświadczeniu okazało się, że białko pasma 2 nie było toksyczne dla Manduca sexta.

Dodatkowa analiza białek pasm 1 i 2 metodą SDS-PAGE w warunkach denaturujących wykazała, że każde pasmo składało się z kilku mniejszych poOjednostek białkowych. Białka uwidaczniano przez wybarwianie błękitem jaskrawym Coomassie, a następnie wybarwianiem aadtaoem srebra w celu osiągnięcia maksymalnej czułości.

Podjedodstke białkowe w obu pasmach były bardzo podobne. Białkowe pasmo 1 zawiera 8 poOjedoostek białka o 25,1, 56,2, 60,8, 65,6, 166, 171, 184 i 208 kDa. Białkowe pasmo 2 białka miało identyczny profil, z tą różnicą, że brak było białek o 25,1, 60,8 i 65,6 kDa. Białka o 56,2, 60,8, 65,6 i 184 kDa występowały w kompleksie białkowego pasma 1 w przybliżeniu w równych stężeniach i odpowiadają 80% lub więcej, w przeliczeniu na całkowitą zawartość białka w tym kompleksie.

Rodzimą toksynę oczyszczoną metodą HPLC scharakteryzowano dodatkowo, jak następuje. Toksyna była nie d0poroa na ogrzewanie i po ogrzewaniu wciągu 15 minut w temperaturze 60°C traciła zdolność zabijania lub hamowania wzrostu wagi po zastrzykach lub po karmieniu larw M. Sexta. Wykonano próby w celu wykrycia aktywności lipazy, fosfolipray typu C, nukleazy lub hemolizy czerwonych ciałek krwi przy użyciu oczyszczonej toksyny. Nie stwierdzono yystęodwnnin żadnej z tych aktywności. Wykonano także próby oznaczenia zakresu hamowania antyaiotyczoego, przy czym oczyszczona toksyna nie hnmdwnłn wzrostu bakterii Gram-ujemnych lub Gram-dodrtoich, drożdży lub włóknistych grzybów, co wskazywało, że substancja toksyczna nie jest antybiotykiem Xenorhabdin.

Rodzimą toksynę oczyszczoną metodą HPLC aaadano na jej zdolność uśmiercania owadów innych niż Manduca sexta. W tabeli 2 oddaoo owady uśmiercane w tym badaniu przez toksynę P. luminescens oczyszczoną metodą HPLC.

186 242

Tabela 2

Owady zabijane przez toksynę P. luminescens

Nazwa pospolita	Rząd	Rodzaj i gatunek	Sposób dostarczania
Zmierzchnica	Lepidoptera	Manduca sexta	doustnie i zastrzyk
Mączniak młynarek	Coleoptera	Tenebrio molitor	doustnie
Mrówka faraona	Hymenoptera	Monomorium pharaonis	doustnie
Prusak	Dictyoptera	Blattella germanica	doustnie i zastrzyk
Komar	Diptera	Aedes aegypti	doustnie

Przykład II. Przydatność owadobójcza

Scharakteryzowano dodatkowo przydatność i toksyczność Photorhabdus luminescens. Bulion hodowlany Photorhabdus luminescens wytworzono w sposób następujący. Pożywką produkcyjną był 2% Bacto Proteose Peptone® Nr 3 (PP3, Difco Laboratories, Detroit, Michigan) w dejonizowanej wodzie Milli-Q®. Kolby do hodowli wyjściowej zawierające 175 ml pożywki umieszczonej w 500-ml kolbie z trzema przegrodami z szyjką Delong, z zamknięciem Kaput, autoklawowano wciągu 20 minut w temperaturze 120°C (250°F). Kolby produkcyjne zawierały 500 ml w 2,8-litrowej kolbie z trzema przegrodami z szyjką Delong zamkniętą pianką silikonową Shin-etsu. Autoklawowano je wciągu 45 minut, 120°C (250°F). Hodowlę zalążków inkubowano w temperaturze 28°C przy 150 obr./min w obrotowym inkubatorze-wytrząsarce z amplitudą wytrząsania 5 cm (2 cale). Po 16 h wzrostu, 1% hodowlę do szczepienia umieszczono w kolbie produkcyjnej i pozostawiono na 24 h przed zbiorem. Wydaje się, że wytwarzanie toksyny odbywa się podczas fazy logarytmicznej wzrostu. Bulion mikrobowy przeniesiono do 1-litrowej butelki wirówkowej i osadzano biomasę komórkową (30 minut przy 2500 obr./min w temperaturze 4°C (R.C.F. = —1600) wirówka HG-4L Rotor RC3 Sorval, Dupont, Wilmington, Delaware). Pierwotny bulion chłodzono w temperaturze 4°C wciągu 8-16 h i powtórnie wirowano w ciągu, co najmniej 2 h (warunki jak powyżej) w celu dodatkowego sklarowania bulionu przez usunięcie domniemanego mukopolisacharydu, który wytrącał się podczas stania. (W alternatywnym sposobie przerobu połączono oba te etapy i zastosowano wirowanie klarujące w ciągu 16 h w warunkach podanych powyżej). Bulion ten przechowywano następnie w temperaturze 4°C przed użyciem do testowania biologicznego lub przed sączeniem.

Bulion hodowlany Photorhabdus i toksyna/toksyny białka oczyszczonego z tego i bulionu wykazywały aktywność (śmiertelność i/lub hamowanie wzrostu, ograniczone wychodzenie z poczwarek) w stosunku do wielu owadów. W szczególności stwierdzono aktywność w stosunku do takich owadów, jak: kukurydziana stonka korzeniowa (larwy i dorosły), stonka ziemniaczana i pędraki torfowe, które są przedstawicielami rzędu owadów Coleoptera. Innymi przedstawicielami Coleoptera są larwy sprężykowatych, słodyszek rzepakowiec, pchełki, chrząszcze i ryjkowcowate. Stwierdzono także aktywność w stosunku do skoczka, który jest przedstawicielem rzędu Homoptera. Innymi przedstawicielami Homoptera są skoczki roślinne, miodówka gruszowa, miodówka jabłoniowa, czerwcowate, mączlikowate i kraskowate, jak również liczne gatunki mszyc specyficzne dla gospodarza. Bulion i oczyszczone frakcje są także aktywne względem sówki buraczanej, mszycy kapuścianej, sówkowatych, motyla szkodnika tytoniu, omacnicy prosowianki, słonecznicy orężówki i owocówki jabłoniowej, które są przedstawicielami rzędu Lepidoptera. Innymi typowymi przedstawicielami tego rzędu są: mól, omacnica spichrzanka, zwijarki liści, rzepnik, słonecznica orężówka, koszówkowate, szkodnik drzew liściastych Malacosoma americana, wachlarzyk i oprzędnica jesienna. Stwierdzono także aktywność w stosunku do larw nasionnicowatych i larw komara, które są przedstawicielami rzędu Diptera. Innymi przedstawicielami rzędu Diptera są paciomica grochowianka, połyśnica marchwianka, śmietka kapuściana, śmietka cebulówka, koziułkowate, mucha domowa i różne gatunki komara. Stwierdzono aktywność

186 242 w stosunku do mrówki gmachówki i mrówki argentyńskiej, które są przedstawicielami rzędu obejmującego także mrówki Selenopsis geminata, mrówki domowe i małe czarne mrówki.

Bulion/frakcja jest przydatna do zmniejszania populacji owadów i była stosowana w sposobie hamowania populacji owadów. Sposób może obejmować stosowanie w miejscu występowania owadów skutecznej, dezaktywującej ilości środka aktywnego. Wyniki przedstawiono w tabeli 3.

Aktywność w stosunku do larw kukurydzianej stonki korzeniowej zbadano w następujący sposób. Sterylizowany na filtrze bulion hodowlany Photorhabdus, nie zawierający komórek lub oczyszczone metodą HPLC frakcje nakładano bezpośrednio na powierzchnię (~1,5 cm²) 0,25 ml sztucznego pokarmu w 30 pl porcjach po rozcieńczeniu w pożywce kontrolnej lub, odpowiednio, wlO mM buforze fosforanu sodu, pH 7,0. Szalki pokarmowe wysuszono w sterylnym powietrzu i dołki zakażano pojedynczym nowonarodzonym Diabrotica undecimpunctata howardi (południowa kukurydziana stonka korzeniowa, SCR), które wylęgły się ze sterylizowanych jaj, z SCR na II stadium i hodowanym na sztucznym pokarmie lub Diabrotica virgifera virgifera (zachodnia kukurydziana stonka korzeniowa, WCR) hodowanym na sadzonkach kukurydzy w Metromix®. Larwy II stadium ważono przed wprowadzeniem do pokarmu. Szalki zamykano szczelnie, umieszczano w nawilżonej komorze wzrostowej i utrzymywano w temperaturze 27°C w ciągu odpowiedniego okresu czasu (4 dni dla nowonarodzonych i dorosłych kukurydzianych stonek korzeniowych SCR, 2-5 dni dla larw WCR, 7-14 dni dla larw II stadium). Oznaczano śmiertelność i wagę, jak wskazano. Ogólnie w każdej próbie stosowano po 16 owadów. Kontrolne wartości śmiertelności były następujące: nowonarodzone larwy < 5 %, dojrzałe chrząszcze 5 %.

.Aktywność w stosunku do stonki ziemniaczanej zbadano w sposób następujący: bulion hodowlany Photorhabdus lub pożywkę kontrolną nakładano na powierzchnię (~2,0 cm²) 1,5 ml standardowego sztucznego pokarmu przechowywanego w dołkach 24-dołkowej szalki do hodowli tkankowej. Do każdego dołka wprowadzano 50 pl próbki i pozostawiano do wyschnięcia na powietrzu. Następnie na pokarmie umieszczano poszczególne larwy II stadium stonki ziemniaczanej (Leptinotarsa decemlineata, CPB) i oceniano śmiertelność po 4 dniach. W każdej próbie stosowano 10 larw. Kontrolna śmiertelność wynosiła 3,3 %.

Aktywność w stosunku do pędraków i chrząszczy popilii japońskiej badano, jak następuje. Z porażonych przez szkodniki trawników zbierano pędraki popilii japońskiej (Popillia japonica, stadium II - III ) i przechowywano w laboratorium w mieszaninie gleba/torf z dodatkiem płatków marchwi jako dodatkowego pokarmu. Pędraki torfowe zwabiano miejscowo do pułapek feromonowych i przechowywano w laboratorium w pojemnikach plastikowych z liśćmi klonowymi jako pokarmem. Po zastosowaniu nierozcieńczonego bulionu pożywki Photorhabdus lub kontrolnej pożywki sztucznego pokarmu kukurydzianej stonki korzeniowej (30 pl/1,54 cm2, chrząszcze) lub płatków marchwi (larwy), oba stadia umieszczano pojedynczo w dołku pokarmowym i obserwowano śmiertelność i przyjmowanie pokarmu. W obu przypadkach stwierdzono wyraźne zmniejszenie ilości przyjmowanego pokarmu i wytwarzania odchodów.

Aktywność w stosunku do larw komara zbadano w sposób następujący: próbę wykonano na 96-dołkowej szalce do mikromiareczkowania. Każdy dołek zawierał 200 pl wodnego roztworu (bulion pożywki Photorhabdus, pożywka kontrolna lub woda) i około 20 jednodniowych larw komara. Stosowano 6 dołków w każdej próbie. Wyniki odczytywano po 2 h od porażenia i nie zmieniały się w ciągu 3 dni obserwacji. Nie stwierdzono śmiertelności próbki kontrolnej.

Aktywność w stosunku do nasionnicowatych (muszki owocówki) badano w sposób następujący. Pożywkę dla Drosophila melanogaster przygotowano, stosując 50% suchej pożywki i 50% cieczy: wody, pożywki kontrolnej lub bulionu hodowlanego Photorhabdus. Wykonano to przez umieszczenie 8,0 ml suchej pożywki w każdej z trzech fiolek na jedną próbę i dodanie 8,0 ml odpowiedniej cieczy. Następnie do każdej fiolki wprowadzono 10 larw Drosophila melanogaster na późnym stadium. Probówki przechowywano na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej z fluorescencyjnym oświetleniem sufitowym. Po 3, 7 i 10 dniach próby zliczano poczwarki i dorosłe osobniki. Dodawanie bulionu hodowlanego Photorhabdus do pożywek pokarmowych dla larw nasionnicowatych powodowało niewielkie (17 %), lecz

186 242 znaczące, zmniejszenie 10-dniowego wychodzenia z poczwarki w porównaniu z pożywką wodną i z próbką kontrolną (3 % zmniejszenie).

Aktywność w stosunku do skoczka badano w sposób następujący. Próba wchłaniania przez skoczka (Macrosteles severini) była tak zaprojektowana, aby umożliwić wchłanianie substancji aktywnej bez żadnego innego zewnętrznego kontaktu. Pojemnik na roztwór substancji aktywnej/„pokarm” przygotowano przez wykonanie dwóch otworów w środku dna szalki Petriego o wymiarach 35 x 10 mm. Kwadrat o boku 5 cm (2 cali) z Parafilmu M® umieszczono na wierzchu szalki i przytrzymano pierścieniem w kształcie litery O. Następnie porażono kubek plastikowy o pojemności 1 uncji przy użyciu około 7 skoczków i pojemnik umieszczono na wierzchu kubka, Parafilmem ku dołowi. Następnie przez otwory wprowadzono badany roztwór do pojemnika. W próbach z zastosowaniem nie rozcieńczonego bulionu hodowlanego Photorhabdus dializowano bulion i ^pożywkę kontrolną względem wody, w celu zmniejszenia śmiertelności próbki kontrolnej. Śmiertelność określano drugiego dnia, gdy wystąpiła śmiertelność 26,5% próbki kontrolnej. W próbach z zastosowaniem oczyszczonych frakcji (200 mg białka/ml) stosowano końcowe stężenie 5% sacharozy we wszystkich próbkach, aby poprawić przeżywalność skoczków. Próbkę trzymano w inkubatorze w temperaturze 28°C, przy 70% wilgotności względnej, z okresem naświetlania 16/8. Oceniano śmiertelność próbki po 72 h. Kontrolna śmiertelność wynosiła 5,5 %.

Aktywność w stosunku do mrówek argentyńskich badano w sposób następujący. 1,5-ml porcję 100 % bulionu hodowlanego Photorhabdus, pożywki kontrolnej lub wody pipetowano do 2,0-ml fiolek z przezroczystego szkła. Fiolki zamykano kawałkiem waty dentystycznej zwilżonej właściwym roztworem. Każdą fiolkę umieszczono w osobnej szalce Petriego, o wymiarach 60 x 16 mm, z od 8 do 12 dorosłymi mrówkami argentyńskimi (Linepithema humile). Każdą próbę powtarzano trzykrotnie. Szalki do oceny biologicznej trzymano na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej z górnym oświetleniem fluoroscencyjnym. Odczyty śmiertelności wykonywano po 5 dniach próby. Śmiertelność kontrolna wynosiła 24%.

Aktywność w stosunku do mrówki gmachówki badano w sposób następujący. Czarne robotnice mrówki gmachówki (Camponotus pennsylramcus) zbierano z drzew na posiadłości DowElanco w Indianapolis, IN. Próby z bulionem kultury Photorhabdus wykonywano w sposób następujący. Każdy pojemnik plastikowy do próby biologicznej (7 1/8” x 3) zawierał 15 robotnic, wstawkę papierową i 10 ml bulionu lub pożywki kontrolnej w naczyniu plastikowym. Za pomocą waty dostarczono mrówkom preparat przez otwór w pokrywie naczynia. Wszystkie preparaty zawierały 5% sacharozy. Próby biologiczne trzymano w ciemności w temperaturze pokojowej i oceniano po 19 dniach. Śmiertelność kontrolna wynosiła 9 %. W próbach z dostarczaniem oczyszczonych frakcji stosowano sztuczny pokarm mrówek zmieszany z badanym preparatem (oczyszczoną frakcją lub roztworem kontrolnym) w ilości 0,2 ml/2,0 g pokarmu w probówce plastikowej. Końcowe stężenie białka w oczyszczonej frakcji było mniejsze niż 10 pg/g pokarmu. 10 mrówek na jedną próbę, wodę, siedlisko i badany pokarm umieszczono w zamkniętych pojemnikach plastikowych i trzymano w ciemności w temperaturze 27°C w nawilżonym inkubatorze. Śmiertelność oceniano po 10 dniach. Nie stwierdzono śmiertelności kontrolnej.

Aktywność w stosunku do różnych larw motyli Lepidoptera badano w sposób następujący. Bulion hodowlany Photorhabdus lub oczyszczone frakcje nanoszono bezpośrednio na powierzchnię (~1,5 cm²) 0,25 ml standardowego sztucznego pokarmu w porcjach po 30 pl, z następnym rozcieńczaniem, odpowiednio, w pożywce kontrolnej lub w 10 mM buforze fosforanu sodu o pH 7,0. Szalki pokarmowe suszono w sterylnym przepływie powietrza i dołki porażano pojedynczymi, nowonarodzonymi larwami. Ze źródeł handlowych dostarczono jajeczka omacniny prosowianki (Ostrinia nubilalis) i słonecznicy orężówki (Helicoverpa zea) i wylęgano je, podczas gdy larwy sówki buraczanej (Spodoptera exigua), mszycy kapuścianej (Trichoplusia ni), motyla szkodnika tytoniu (Heliothis virescens), owocówki jabłkówki (Laspeyresia pomonella) i sówkowatych (Agrotis Ipsilon) dostarczano wewnętrznie. Po porażeniu larwami zamykano szalki z pokarmem, umieszczano je w nawilżonej komorze wzrostowej i trzymano w ciemności w temperaturze 27°C w ciągu właściwego okresu czasu. Oznaczenia śmiertelności i wagi wykonywano po 5-7 dniach dla bulionu pożywki Photorhabdus i po 4-7

186 242 dniach dla oczyszczonej frakcji. W każdym badaniu stosowano zwykle po 16 owadów na jedną próbę. Kontrolna śmiertelność była w zakresie od 4 do 12,5 % dla pożywki kontrolnej i poniżej 10 % dla buforu fosforanowego.

Tabela 3

Wpływ bulionu hodowlanego Photorhabdus luminescens (szczep W-14) i oczyszczonej frakcji toksyny na_śmiertelność i hamowanie wzrostu różnych rzędów/gatunków owadów

Rząd/gatunek owada	Bulion	Oczyszczona frakcja
% śmiert.	% G.I.	% śmiert.	% G.I.
Coleoptera Kukurydziana stonka korzeniowa Południowy/nowe larwy	100	na	100	na
Południowy/Ii stadium	na	38,5	nt	nt
Południowy/dorosły	45	nt	nt	nt
Zachodni/II stadium	na	35	nt	nt
Stonka ziemniaczana II stadium	93	a.f.	nt	nt
Pędrak torfowy	na	a.f.	nt	nt
Dorosły, III Stadium	na	a.f.	nt	nt
Diptera Nasionnicowate (wyjście	17	nt	nt	nt
dorosłego owada) Larwy komara	100	na	nt	nt
Homoptera Skoczek	96,5	na	100	na
Hymenoptera Mrówka argentyńska	75	na	nt	na
Mrówka gmachówka	71	na	100	na
Lepidoptera Sówka buraczana	12,5	36	18,75	41,4
Sówkowate	nt	nt	0	71,2
Mszyca kapuściana	nt	nt	21,9	66,8
Owocówka jabłkówka	nt	nt	6,25	45,9
Słonecznica orężówka	56,3	94,2	97,9	na
Omacnica prosowianka	96,7	98,4	100	na
Motyl, szkodnik tytoniu	13,5	52,5	19,4	85,6

śmiert. = śmiertelność, G.I. = hamowanie wzrostu, na = nie dotyczy, nt = nie badano, a.f. = brak aktywności pokarmowej

186 242

Przykład III. Użyteczność insektycydu podawanego doglebowo.

Wykazano, że hodowla Photorhabdus luminescens była aktywna wobec kukurydzianej stonki korzeniowej, gdy podawano ją bezpośrednio doglebowo lub do mieszanki glebowej (Metromix™). Aktywność wobec larw SCR i WCR w podłożu Metromix™ badano w sposób przedstawiony w tabeli 4. W przeprowadzonym teście używano siewek kukurydzy (United Agriseeds lini CL614), które kiełkowano na świetle na wilgotnej bibule filtracyjnej przez 6 dni. Gdy korzenie osiągnęły długość 3-6 cm pojedyncze sadzonki sadzono do 591 ml czystego plastikowego kubka zawierającego 50 g suchego podłoża Metromix™. Następnie dwadzieścia larw kukurydzianej stonki korzeniowej SCR lub WCR umieszczano bezpośrednio na korzeniach sadzonek, które przykrywano Metromixem™. Po zarażeniu sadzonki podlewano 50 ml rozcieńczonej pożywki. Po podlaniu kubki szczelnie zamykano i pozostawiano w temperaturze pokojowej w oświetlonym miejscu na 7 dni. Następnie celem całkowitego usunięcia Mctromixu™ sadzonki płukano, a następnie odcinano i ważono korzenie. Aktywność określano jako procent pozostałych korzeni określany w stosunku do roślin kontrolnych i jako stopień zniszczenia liści w wyniku żerowania. Zniszczenie liści szacowano przez ogląd i oceniano jako -, +,++ lub +++ przy czym - określa brak uszkodzeń, a +++ odpowiada rozległym uszkodzeniom.

Aktywność względem larw kukurydzianej stonki korzeniowej SCR w glebie badano w sposób opisany poniżej (tabela 5). Testy wykonywano stosując siewki kukurydzy (United Agnseeds lini CL614), które kiełkowano na świetle na wilgotnej bibule filtracyjnej przez 6 dni. Gdy korzenie osiągały 3-6 cm długości pojedynczą sadzonkę wysadzano do 591 ml czystego plastikowego kubka zawierającego 150 ml ziemi z pól Libanu, w której w poprzednim roku uprawiano kukurydzę. Ziemia nie była uprzednio traktowana insektycydem. Następnie dwadzieścia larw kukurydzianej stonki korzeniowej SCR umieszczano bezpośrednio na korzeniach, które przykrywano ziemią. Po zarażeniu szkodnikami siewki podlewano całkowitą objętością 50 ml rozcieńczonego podłoża. Po podlaniu niezamknięte kubki inkubowano w komorze o wysokiej względnej wilgotności (80%) w temp. 25°C (78°F). Następnie celem całkowitego usunięcia ziemi sadzonki płukano, a korzenie odcinano i ważono. Aktywność oznaczano jako procent pozostałych po infekcji korzeni liczony względem roślin kontrolnych i jako stopień uszkodzenia liści wywołany żerowaniem. Stopień zniszczenia szacowano wzrokowo i oceniano jako -, +, ++ lub +-H- przy czym - odpowiada brakowi uszkodzeń, a +++ odpowiada rozległym uszkodzeniom.

Tabela 4

Wpływ bulionu hodowlanego Photorhabdus luminescens (szczep W-14) na larwy korzeniowe po podlaniu po infekcji (Metromix™)

Traktowanie	Larwy	Uszkodzenia liści	Masa korzeni (w g)	%
Południowa kukurydziana stonka korzeniowa
woda	-	-	0,4916±0,023	100
Pożywka (2,0% v/v)	-	-	0,4416±0,029	100
Podłoże (6,25% v/v)	-	-	0,4641 ±0,081	100
woda	+	+++	0,1410±0,006	28,7
Pożywka (2,0% v/v)	+	+++-	0,1345±0,028	30,4
Podłoże (1,56% v/v)	+	-	0,4830±0,031	104
Zachodnia kukurydziana stonka korzeniowa
woda	-	-	0,4446±0,019	100
Podłoże (2,0% v/v)	-	-	0,4069±0,026	100
woda	+	-	0,2202±0,015	49
Podłoże (2,0% v/v)	+	-	0.3879±0,013	95

186 242

Tabela 5

Wpływ bulionu hodowlanego Photorhabdus luminescens (szczep W-14) na larwy robaka korzeniowego po infekcji i podlaniu (ziemia)

Traktowanie	Larwy	Zniszczenie liści	Masa korzeni (w g)	%
woda	-	-	0,2148±0,014	100
Podłoże (50% v/v)	-	-	0,2260±0,016	103
woda	+	+++	0,0916±0,009	43
Pożywka (50% v/v)	+	-	0,2428±0,032	113

W testach przeprowadzonych w sposób opisany poniżej obserwowano aktywność bulionu hodowlanego Photorhabdus luminescens (szczep W-14) dodawanego do Metromixu™ wobec pędraków torfowych (tabela 6). W przybliżeniu 50 g Metromixu™ dodawano do czystych plastikowych kubków o pojemności 591 ml. Metromix™ nasączano całkowitą objętością 50 ml 50% (v/v) rozcieńczenia pożywki z hodowli Photorhabdus. Rozcieńczenie nie oczyszczanej pożywki przeprowadzono wodą przy czym 50% roztwór otrzymano przez dodanie do 25 ml nieoczyszczonej pożywki 25 ml wody do całkowitej objętości 50 ml. Jako roztwór kontrolny stosowano 1% roztwór proteazowanego peptonu #3 (PP3), który jest 50% rozcieńczeniem normalnie stosowanego roztworu. Po podlaniu pięć pędraków torfowych umieszczano na powierzchni nasączonego Metromixu™. Zdrowe pędraki torfowe zakopywały się szybko w Metromixie™. Larwy, które nie zakopywały się w ciągu 1 godz. w podłożu usuwano i zastępowano świeżymi larwami. Kubki zamykano i umieszczano w inkubatorze o temperaturze 28°C w ciemności. Po siedmiu dniach larwy usuwano z Metromixu™ i obliczano ich śmiertelność. Aktywność oszacowywano jako procentową śmiertelność liczoną względem grupy kontrolnej.

Tabela 6

Wpływ bulionu hodowlanego Photorhabdus luminescens (szczep W-14) na pędraki torfowe przy podlewaniu przed zarażeniem (Metromix™)

Traktowanie	Śmiertelność*	Śmiertelność %
Woda	7/15	47
Roztwór kontrolny
(1,0% w/v)	12/19	63
Podłoże
(50% v/v)	17/20	85

*wyrażona jako stosunek larw martwych do żywych

Przykład IV. Stosowanie insektycydu przez podawanie dolistne.

Aktywność bulionu hodowlanego Photorhabdus przeciwko Pyrausta nubilis obserwowano gdy bulion nanoszono bezpośrednio na powierzchnię liści kukurydzy (tabela 7). W oznaczeniu tym podłoże z hodowli Photorhabdus rozcieńczono 100-krotnie pożywką hodowlaną i ręcznie nanoszono na powierzchnię odciętych liści w ilości ~6,0 pl/cm² powierzchni liścia. Liście po wysuszeniu na powietrzu cięto na kawałki o zbliżonej wielkości wynoszącej około 5x5 cm (2x2 cala). Liście zwijano, zabezpieczano papierowymi spinaczami i umieszczano na szklanym lejku shota którego dno pokryto 0,625 cm (0,25 calową) warstwa 2% agaru celem utrzymania wilgotności. Dwanaście larw Pyrausta nubilis umieszczano na zwiniętych liściach, po czym zamykano kubek. Po inkubacji trwającej 5 dni w ciemności przy temperaturze 27°C próbki badano z uwagi na zniszczenia spowodowane żerowaniem larw i liczbę larw, które przeżyły.

186 242

Tabela 7

Wpływ bulionu hodowlanego Photorhabdus luminescens (lioin W-14) na larwy Pyrausta nubilis aastosowaoegd przed zarażeniem na wycinki z liści kukurydzy

Traktowanie	Zniszczenie liści	Larwy, które przeżyły	Mnsa (mg)
Wodr	rozległe	55/120	0,42 mg
Podłoże kontrolne	rozległe	40/120	0,50 mg
Pożywka (1,0% v/v)	śladowe	3/120	0,15 mg

Aktywność bulionu hodowlanego względem gąsienic sówki (Heliothis virescens) wykazano stosując technikę zanurzonych liści. Z roślin bawełny obcinano świeże liście z których wycinakiem do korków o średnicy 18,5 mm wykrawano krążki. Poszczególne krążki indywidualnie zanurzano w pożywce kontrolnej (PP3) lub podłożu z hodowli Photorhabdus luminescens (linia W-14) które uprzednio dziesięciokrotnie z-tężono przy pomocy stożkowego systemu filtracyjnego Proflux M12 firmy Amicon (Beverly, MA) wyposażonego w filtr o odcięciu 10 kDa. Nadmiar płynu usuwano a na środku krążka umieszczano rozprostowany papierowy spinacz. Następnie spinacz zaklioowywnoo w plastiku w naczyniu ze szkła Szota o objętości 28,5 ml (1 uncji) zawierającym około 2,0 ml 1 % agaru. Wykonano to aby zawiesić krążek wycięty z liścia ponad agarem. Po wysuszeniu krążka wyciętego z liścia umieszczano na nim pojedynczą gąsienicę sówki i zamykano kubek. Następnie kubek umieszczano w plastikowym woreczku, który szczelnie zamykano po czym umieszczano na 5 dni w ciemności w temperaturze 27°C. Po upływie tego czasu pozostałe przy życiu larwy oraz niezjeOzdne liście ważono oraz określano stopień ich zniszczenia.

Tabela 8

Wpływ bulionu hodowlanego Photorhabdus luminescens (szczep W-14) na gąsienice sówki w oznaczeniu typu - namoczone liście bawełny

Traktowanie	Krążki liściowe	Końcowa mnsa lnrw (mg)
Liść kontrolny	55,7±1,3	np.*
Pożywka kontrolna	34,0±2,9	4,3±0,9
bulion hodowlany
Photorhabdus	54,3±1,4	0,0*’

* - nie po0awrod, ** - nie znaleziono żywych larw

Przykład V. Część A. Charakteryzowanie składników toksycznych polipeptydów.

W przeprowadzonym bndnoiu pdOjedoostki toksyny białkowej obecnej w paśmie wyizolowanym jak opisnod w przykładzie I rozdzielano w 7% żelu polinkrylrmidowym o stosunku 30:0,8 (nkrylnmid : biy-rkrylnmiO). Żel taki wykazywał zdolność lepszego rozdziału większych białek. Żel użyty w przykładzie I do oszacowania mas cząsteczkowych Pasma 1 i Pasma 2 był 18% żelem o stosunku 38:0,18 (akrylnmid: biy-nkrylnmid) co pozwalało o- zgrubny rozdział z uwagi na wielkość cząsteczek lecz mniejszą rozdzielczość skłnOników o większej masie cząsteczkowej.

W obecnej analizie wyodrębniono 10, r nie 8 pasm białkowych. Tnbela 9 pokazuje obliczoną masę cząsteczkową 10 wydzielonych pasm i bezpośrednio porównuje mnsę cząsteczkową dsaacdwmą dla tych pasm w tym oraz poprzednio opisanym doświadczeniu. Nie jest zaskakującym iż wykryto dodatkowe prsmn stosując odmienne warunki rozdziału jakie wykorzystano w tym przykładzie. Również należy się spodziewać różnic w wyznaczonych masach cząsteczkowych w poprzednim i obecnie opisywanym eksperymencie, gdyż związane są one z odmiennymi warunkami prowa0zdoej analizy. Oznaczenia wykonane w obecnie opisywanym doświadczeniu są bardziej 0dkłrdoe niż te otrzymane' w przykładzie I, gdyż są one efektem udoskonalenia warunków rozdziału. Jednakże dokonane szacunki oparte są na aorlizie

186 242

SDS PAGE która typowo nie charakteryzuje się analityczną dokładnością i szacowana wielkość peptydów może ulec w przyszłości zmianie w zależności od post-translacyjnych i współtranslacyjnych modyfikacji jakim mogą one ulegać.

Oznaczono sekwencje aminokwasowe dla N-końcowych części z pośród 10 rozdzielonych peptydów. W tabeli 9 zestawiono masy cząsteczkowe białek z oznaczoną dla nich sekwencją aminokwasową. W SEQ ID NO:2 szczegółowa analiza sugeruje, że prolina będąca 5 aminokwasem w rzeczywistości może być asparaginą (asn). W przypadku SEQ ID NO:3 dokładniejsza analiza sugeruje że aminokwasy w pozycji 13 i 14 oba są argininami (arg). W SEQ ID NO:4, dokładniejsza analiza sugeruje, że aminokwas w pozycji 6 może być alaniną (ala) lub seryną (ser). W SEQ ID NO:5, dokładniejsza analiza sugeruje że aminokwas w pozycji 3 może być kwasem asparaginowym (asp).

Tabela 9

Przykład 1

Oszacowanie	Nowe oszacowanie	Wyróżnienie sekwencji
208	200,2 kDa	SEQ ID NO:1
184	175,0 kDa	SEQ ID NO:2
65,6	68,1 kDa	SEQ ID NO:3
60,8	65,1 kDa	SEQ ID NO:4
56,2	58,3 kDa	SEQ ID NO:5
25,1	23,2 kDa	SEQ ID NO: 15

Nowe oszacowanie oparte jest na SDS-PAGE a nie sekwencji nukleotydowej genu. SDS- PAGE nie charakteryzuje się dokładnością analityczną.

Przykład V, Część B. Charakteryzowanie toksycznych składników peptydowych.

Otrzymano nową N-końcową sekwencję SEQ ID NO: 15 Ala Gln Asp Gly Asn Gln Asp Thr Phe Phe Ser Gly Asn Thr dzięki dalszemu sekwencjonowaniu N-końcowych rejonów peptydów wyizolowanych z oczyszczonej przez HPLC natywnej toksyny jak opisano to powyżej w części A przykładu V. Peptyd ten jest wynikiem ekspresji genu tcaA. Peptyd oznaczony jako TcaAi, rozpoczyna się w pozycji 254 i ciągnie do pozycji 491 gdzie rozpoczyna się peptyd TcaAjjj, SEQ ID NO:4. Wielkość peptydu oszacowana w oparciu o sekwencje genu wynosi 25 240 Da.

Przykład VI. Charakteryzowanie składników peptydowych toksyny.

W dalszych badaniach kompleks białkowy toksyny ponownie wyodrębniono z pożywki, w której hodowano Photorhabdus luminescens (po hodowli w podłożu bez Tween) przez wysałanie 10% - 80% siarczanem amonu, po czym prowadzono chromatografię jonowymienną (Mono Q), a następnie dwa kolejne sączenia molekularne.

Warunki w jakich prowadzono oczyszczanie peptydów były zgodne z zastosowanymi w przykładzie I. W czasie pierwszego sączenia molekularnego maksimum aktywności biologicznej obserwowano przy 100 ± 10 kDa. Opierając się na pomiarze białka określono, że frakcja ta była 20 - 50 razy mniej aktywna niż największy lub pierwotny pik aktywności związany z frakcją o wielkości 860 ±100 kDa (natywna). W trakcie izolacji stwierdzono również obecność mniejszego piku aktywności dla około 325 ± 50 kDa zawierający znaczącą ilość początkowego materiału biologicznego. Jest prawdą, że pik 325 kDa jest związany lub jest pochodną piku 860 kDa.

W analizie tej uzyskano również białko 56 kDa. N-końcowa sekwencja tego białka jest przedstawiona w sekwencji SEQ ID N0:6. Jest godnym odnotowania, że białko to wykazuje duże podobieństwo i jest konserwowane względem SEQ ID NO:5 na obszarze N-końca, co sugeruje, że oba one mogą być kodowane przez różnych przedstawicieli tej samej rodziny genów i że białkowe produkty ekspresji tych genów mogą być dostatecznie podobne do siebie by oba działały w kompleksie toksyny owadobójczej.

186 242

Drugie z dominujących białek o wielkości 185 kDa było zawsze obecne w ilości porównywalnej do białka 3 z tabeli 9 i być może jest tym samym białkiem lub jego fragmentem. N-końcową sekwencję tego 185 kDa białka przedstawiono jako SEQ ID NO:7.

Dodatkowe N-końcowe sekwencje aminokwasowe otrzymano również dla wyizolowanych białek. Żadna z określonych sekwencji aminokwasowych N-końców nie okazała się identyczną z białkami zidentyfikowanymi w tabeli 9 w otrzymanych preparatach były obecne odmienne białka. Jedno z tych białek miało masę cząsteczkową oszacowaną na 108 kDa i sekwencję aminokwasową N-końca przedstawioną jako SEQ ID NO:8. Kolejne takie białko miało masę cząsteczkową oszacowaną na 80 kDa i sekwencję aminokwasową N-końca przedstawionąjako SEQ ID nO:9.

Gdy analizowano pod względem wielkości białkowe składniki piku aktywności 325 kDa obserwowano pasma o wielkości 51, 31,28 i 22 kDa. Jak we wszystkich przypadkach w których masę cząsteczkową określano poprzez analizę ruchliwości elektroforetycznej, tak i w tym przypadku masa cząsteczkowa była obarczona błędem w wyniku stosowania buforów różniących się siłą jonową, różnic w natężeniu pola elektrycznego i tym podobnych różnic w warunkach elektroforezy. Każdy dysponujący podstawową wiedzą rozumie, że rzeczywistej masy cząsteczkowej nie można określić tą standardową metodą i każde z oznaczeń wykazuje odchylenie od wartości rzeczywistej. Przypuszczano, że białka tej wielkości są produktami degradacji większych białek (o wielkości wynoszącej w przybliżeniu 200 kDa), które obserwowano w większym pierwotnym kompleksie toksyny.

Ostatecznie szereg preparatyk zawierało białko o sekwencji aminokwasowej N-końca przedstawionej w SEQ ID NO: 10. Sekwencja ta wykazywała wysokie podobieństwo do znanych sekwencji białek chaperonin, pomocniczych białek o których funkcji wiadomym było, że biorą udział w składaniu większych kompleksów białkowych. Chociaż przesłanki nie mogą dowieść funkcji związanej ze składaniem względem białka zidentyfikowanego w SEQ ID NO: 10 to były one w zgodzie z istnieniem opisanego białkowego kompleksu toksyny do którego złożenia mogłoby być wymagane białko chaperoniny. Co więcej, chociaż takim białkom nie przypisuje się bezpośredniej aktywności toksyny to białko to może być ważnym dla określenia nadrzędnej struktury przestrzennej toksyny, a tym samym może wspomagać toksyczną aktywność lub stabilność kompleksu in vivo po podaniu doustnym.

Podjęto bardziej szczegółową analizę stabilności białkowego kompleksu toksyny wobec proteinazy K. Określono, że po 24 godzinnej inkubacji kompleksu wobec 10-krotnego molarnego nadmiaru proteinazy K jego aktywność ulega znaczącemu ograniczeniu (śmiertelność po podaniu doustnym spada do około 5%). Dane te potwierdzają białkowy charakter toksyny. Toksyczna aktywność nie przenikała przez błony dializacyjne ponownie potwierdzając, że natywny kompleks toksyny ma duże rozmiary.

Przykład VII. Wyizolowanie, charakteryzowanie i częściowe oznaczanie sekwencji aminokwasowej toksyny z Photorhabdus.

Wyizolowanie i ustalanie N-końcowej sekwencji aminokwasowej: w serii doświadczeń prowadzonych równolegle do przykładów V i VI przeprowadzano wysalanie siarczanem amonu białek Photorhabdus przez doprowadzanie bulionu hodowlanego Photorhabdus, zazwyczaj 2-3 litrów, do końcowego stężenia siarczanu amonu 10 lub 20% przez powolne dodawanie krystalicznego siarczanu amonu. Po mieszaniu przez 1 godzinę w temp. 4°C materiał odwirowywano przy 12000 x g przez 30 minut. Nadsącz doprowadzano krystalicznym siarczanem amonu do 80% stężenia, mieszano przez 1 godzinę w 4°C i wirowano przez 60 minut przy 12000 x g. Osad zawieszano w jednej dziesiątej objętości 10 mM Na₂PO4 pH 7,0 i dializowano przez noc w 4°C wobec buforu fosforanowego o takim samym stężeniu. Przed chromatografią jonowymienną otrzymany po dializie materiał wirowano przez 1 godzinę przy 12000 x g.

Kolumnę jonowymienną zawierającą HR 16/50 Q Sepharose (Pharmacia) równoważono 10 mM Na₂PO4, pH 7,0. Odwirowany i poddany dializie osad otrzymany przez wysolenie siarczanem amonu nanoszono na kolumnę z Q Sepharosą przy czym szybkość nanoszenia wynosiła 1,5 ml/min, płukano obficie buforem do równoważenia przy prędkości przepływu wynoszącej 3 ml/min, aż do momentu gdy absorbancja (OD przy 280 nm) wynosiła mniej niż

186 242

0,100. Następnie wymywano z kolumny przez 60 min gradientem NaCl w zakresie od 0 do

1,5 M przy prędkości przepływu wynoszącej 3 ml/min, lub gradientem schodkowym stosując roztwory NaCl o stężeniach 0,1, 0,4, i ostatecznie 1,0 M przy czym każdy z roztworów by nanoszony na kolumnę przez 60 minut. Frakcje połączono i zatężano stosując CentricepWO. Alternatywnie białka mogły być wymywane z kolumny 0,4M NaCl z pominięciem wymywania 0,1 M NaCl.

Dwu mililitrowe odważki zatężonego na Q Sepharose roztworu nanoszono przy prędkości przepływu 0,5 ml/min, na sito molekularne HR 16/50 Supharose 12 (Pharmacia) które zrównoważono 10 mM Na2PO4 pH 7,0. Kolumnę płukano tym samym buforem przez 240 min przy szybkości przepływu 0,5 ml/min, zbierając frakcje co 2 min. Materiał zebrany w objętości pustej zbierano i zatężano stosując Centriprep 100. Dwa mililitry roztworu zatężonego na złożu Supharose 12 nanoszono przy szybkości 0,5 ml/min, na kolumnę ze złożem do sączenia molekularnego HR 16/50 Sepharose 4B-CL (Pharmacia) zrównoważonego 10mM Na2PO4, pH 7,0. Kolumnę płukano tym samym buforem przez 240 min przy prędkości przepływu wynoszącej 0,5 ml/min, i zbierano próbki co 2 min.

Wymyta bogata w białka frakcja poddana była kolejnemu frakcjonowaniu w wyniku naniesienia jej na kolumnę ze złożem do filtracji, którym była żywica Sepharose CL-4B rozdzielająca białka w zakresie od ~ 30 kDa do 1000 kDa. Frakcja ta dawała dwa piki z których mniejszy wymywał się w objętości pustej (>1000 kDa), a większy wymywany był jako frakcja o masie cząsteczkowej około 860 kDa. Poszczególne próbki poddane sączeniu po upływie ponad tygodnia ujawniały stopniowo obecność trzeciego piku absorbancji, (odpowiadającego frakcji o masie cząsteczkowej około 325 kDa), którego udział w preparacie był znaczący, a który wydaje się, że powstawał z głównej frakcji w wyniku ograniczonej proteolizy. Oznaczenie biologiczne przeprowadzone dla tych trzech frakcji pokazało, że frakcja wypłukiwana w objętości zerowej nie wykazywała aktywności podczas gdy frakcja zawierająca kompleks toksyny o masie 860 kDa była wysoce aktywna, a frakcja 325 kDa była mniej aktywna lecz nadal całkiem silną. Analizy SDS-PAGE którym poddano oczyszczone na Sepharose CL-4B kompleksy toksyny z różnych frakcji będące produktami różnych procesów fermentacyjnych ujawniły dwa odmienne składy peptydowe oznaczone jako „P” i „S”. Frakcje te różniły się w sposób znaczący z uwagi na masy cząsteczkowe i stężenia tworzących je peptydów. Wzór „S” wytwarzany najczęściej, składa się z czterech peptydów o wysokiej masie cząsteczkowej (>150 kDa) podczas gdy wzór „P” składa się z trzech peptydów o wysokiej masie cząsteczkowej. Dodatkowo stwierdzono, że frakcja peptydowa „S” posiada 2-3 krotnic wyższą aktywność względem Pyrausta nubilis. Przesunięcie to może by związane ze zmianami w ekspresji białek związanymi z wiekiem inokulum i/lub innymi czynnikami związanymi z warunkami wzrostu i starszych wiekiem hodowli.

Miligramowe ilości białek kompleksu toksyny z poszczególnych pików dla których oznaczono wzory jako „P” lub „S” były przedmiotem preparatywnej techniki SDS-PAGE i przeniesienia w buforze Tris-glicyna (Seprabuff™) na filtr PVDF (ProBlott™, Applied Biosystems) przez 3-4 godziny. Bioty wysyłano celem oznaczenia składu aminokwasowego i analizy N-końcowej sekwencji aminokwasowej odpowiednio do Harvard MicroChem i Cambridge ProChem. Trzy peptydy o wzorze „S” miały unikalną N-końcową sekwencję aminokwasową w porównaniu do sekwencji zidentyfikowanych w poprzednim przykładzie. Peptyd o masie cząsteczkowej 201 kDa (TcdAi) ujawniony tu jako SEQ ID NO: 13 wykazywał 33% zgodność i 50% podobieństwo do sekwencji sEq ID NO:1 (TcbA_u) (tabela 10, w tabeli 10 pionowe linie oznaczają identyczne aminokwasy podczas gdy kropki oznaczają zachowanie substytucję konserwowanych aminokwasów). Kolejny peptyd o masie cząsteczkowej 197 kDa, SEQ ID NO:14 (TcdB) był w 42% identyczny i w 58% homologiczny z SEQ ID NO:2 (TcaC). Ostatecznie trzeci polipeptyd o masie cząsteczkowej 205 kDa oznaczono jako TcdAi. Dodatkowo ograniczona N-końcowa aminokwasowa sekwencja SEQ ID NO: 16 (TcbAl), peptydu o masie cząsteczkowej 235 kDa była homologiczna z sekwencją aminokwasowi SeQ ID NO: 12, opracowaną na podstawie sklonowanego genu (TcbA), SEQ ID NO:11, zawierająca wydedukowaną sekwencję aminokwasową odpowiadającą SEQ ID NO:1 (TcbAj,). Wskazuje to, że duży polipeptyd o masie cząsteczkowej wyższej niż 235 kDa był

186 242 w czasie fermentacji proteolitycznie przekształcany do peptydu o masie cząsteczkowej 201 kDa, prawdopodobnie prowadząc do aktywacji cząsteczki. W jeszcze innej sekwencji, która oryginalnie określona była jako SEQ ID NO:5 (TcaBii) w przykładzie V, powyżej okazała się zawierać raczej resztę kwasu asparaginowego (Asp) w pozycji trzeciej niż glicyny (Gly) i dwa dodatkowe aminokwasy Gly i Asp odpowiednio w pozycjach osiem i dziewięć. Dalej, uzyskano dwie kolejne sekwencje aminokwasowe SEQ ID NO:2 (TcaC) i SEQ ID NO:3 (TcaB). Wykonano oznaczenie densytometryczne próbek, które były identyczne z preparatami „S” wysłanymi dla analizy N-końca. Analiza ta wykazała, że białka 201 kDa i 197 kDa stanowią odpowiednio 7,0% i 7,2% wszystkich barwiących się błękitem Coomassie brillant białek obecnych w preparacie o wzorze „S” w ilościach podobnych do ilości innych wielu peptydów. Spekuluje się, że peptydy te mogą reprezentować homologi białek, analogicznie do tego co stwierdzono dla innych toksyn bakteryjnych takich jak toksyna Cry I Bt. Białka te wykazują homologie w zakresie 40-90% w obszarze swoich N-końcowych sekwencji aminokwasowych poprzedzających toksyczne fragmenty.

Wewnętrzne sekwencje aminokwasowe: dla ułatwienia klonowania genów kodujących peptydy toksyn, otrzymano wewnętrzne sekwencje aminokwasowe wybranych peptydów w następujący sposób. Miligramowe ilości frakcji piku 2A dla których określono czy mają wzór peptydowy „P” czy „S” poddano preparatywnej technice SDS-PAGE i przenoszono w buforze Tris-glicyna Se*prabuff™ na filtry PVDF (ProBlott™, Applied Biosystems) przez 3-4 godziny. Bioty wysyłano celem oznaczenia składu aminokwasowego i N-końcowej sekwencji aminokwasowej odpowiednio do Harvard MicroChem i Cambridge ProChem. Trzy peptydy określone jako TcbAii (zawierający SEQ ID NO:1), TcdAii, i TcaB (zawierający SEQ ID NO:31) były przedmiotem trawienia trypsyną przeprowadzonego przez Harvard MicroChem po którym prowadzono rozdział chromatograficzny HPLC celem rozdzielenia poszczególnych peptydów. Analizy N-końcowych sekwencji aminokwasowych dokonywano na wyselekcjonowanych fragmentach peptydu po traktowaniu trypsyną. Dla peptydu TcaBi sekwencjonowano dwa wewnętrzne peptydy, (peptyd 205 kDa) określony jako TcaB;-PT111 (SEQ ID NO:17) i TcaBj-PT79 (SEQ iD nO: 18). Dwa wewnętrzne peptydy zsekwencjonowane dla peptydu TcaBi (peptyd 68 kDa) ujawniony jako TcaBi-PTl 58 (SEQ ID NO:19 i TcaBj-PT108 (SEQ ID NO:20). Cztery wewnętrzne peptydy zsekwencjonowano dla peptydu TcbAii (peptyd 201 kDa) określonego jako TCBAII-PT103 (SEQ ID NO:21), TcbAii-PT56 (SEQ ID NO:22), TcbA„ -PT81(a) (SEQ ID NO:23) i TcbAjj -PT81(b) (SEQ ID NO:24).

Tabela 10

N-końcowe sekwencje aminokwasowe 201 kDa (33% identyczności i 50% podobieństwa do SEQ ID NO. 1) LIG YNNQF SG*A SEQIDNO:13

FIQGYSDLFG N-A SEQIDNO:2 197 kDa (42% identyczności i 58% podobieństwa SEQ ID NO.2) MQNSQTFSVGEL SEQIDNO.14 I I : I I : : I

MQDSPEVS I TTL SEQ ID NO.2

Przykład VIII. Konstrukcja biblioteki kosmidowej dla · genomowego DNA z Photorhabdus luminescens szczepu W-14 i jej przeszukiwanie celem wyizolowania genu kodującego peptydy tworzące preparat toksycznego białka.

Jako wstępnie wymagania do wytwarzania toksycznego dla owadów białka z Photorhabdus i do innych zastosowań koniecznym jest wyizolowanie i scharakteryzowanie genów kodujących te peptydy. Cele te zrealizowano równolegle. Jednym z podejść, opisanym

186 242 później, było uzyskanie przeciwciał monoklonalnych przeciw oczyszczonej toksynie, które z kolei można było użyć do izolacji klonów z biblioteki ekspresyjnej. Inne podejście, opisane w tym przykładzie, opierało się na wykorzystaniu danych uzyskanych dla N-końcowych i wewnętrznych sekwencji aminokwasowych i w oparciu o nie zaprojektowaniu oligonukleotydów celem użycia ich w reakcji amplifikacji PCR. Obie te metody mogą być użyte do identyfikacji klonów DNA przenoszących geny 'kodujące peptydy jak również umożliwić izolację odpowiedniego genu i określenie jego sekwencji nukleotydowej.

Wyizolowanie genomowego DNA: Photorhabdus luminescens szczep W-14 (ATCC numer 55397) hodowano na 2% agarze proteazowanego peptonu #3 (Difco Laboratories, Detroit, MI) sprawdzając zdolność do wytwarzania owadobójczej toksyny przez powtarzane testy biologiczne, przeprowadzane po przeszczepieniach w sposób opisany powyżej w przykładzie I. 50 ml hodowle prowadzono przez wytrząsanie podłoża składającego się z 2% proteazowanego peptonu #3 w 175 ml kolbach stożkowych w temp. 28°C przy 150 obrotach na min przez około 24 godziny. 15 ml porcje hodowli osadzano i zamrażano w oryginalnej pożywce w -20°C aż do momentu kiedy była potrzebna do izolacji DNA. Rozmrożoną hodowlę wirowano (700 x g, 30 min) i usuwano pływający pomarańczowy mukopolisacharyd. Pozostały materiał komórkowy wirowano (25,000 x g, 15 min) aby osadzić komórki bakteryjne oraz oddzielić i usunąć pożywkę.

Genomowy DNA wyizolowano stosując zaadaptowaną metodę CTAB^X1 ( modyfikacje obejmowały szok osmotyczny i 10-krotne zwiększenie objętości wszystkich roztworów). Osadzone bakterie zawieszano w buforze TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) w końcowej objętości 10 ml, następnie dodawano 12 ml 5M NaCl; otrzymaną mieszaninę wirowano przez 20 min przy 15 000 x g. Otrzymany osad zawieszano w 5,7 ml TE następnie dodawano 300 ml 10% dodecylosiarczanu sodu i 60 ml proteinazy K o stężeniu 20 mg/ml (Gibco BRL Products, Grand Island, NY; w jałowej wodzie destylowanej). Mieszaninę tę inkubowano w 37°C przez 1 godzinę następnie dodawano około 10 mg lizozymu (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). Po kolejnych 45 min dodawano 1 ml 5 M NaCl i 800 ml roztworu CTAB/NaCl (10% w/v CTAB, 0,7 M NaCl). Następnie preparat inkubowano przez 10 min w 65°C po czym delikatnie go wymieszano i przez następne 20 min naprzemian preparat delikatnie mieszano i inkubowano doprowadzając do upłynnienia materiału komórkowego. Dodawano równą objętość mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy (24:1, v/v) dokładnie mieszano i wirowano. Po dwóch ekstrakcjach równymi objętościami PCI (fenol:chloroform:alkohol izoamylowy, 50:49:1, v/v/v; zrównoważony 1 M Tris-HCl, pH 8,0; Intermountain Scientific Corporation, Kaysville, UT), DNA wytrącano 0,6 objętością izopropanolu. Wytrącony DNA delikatnie wyjmowano przy pomocy szklanej bagietki, płukano 70% etanolem, suszono i rozpuszczano w 2 ml STE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA). Preparat ten zawiera

2,5 mg/ml DNA, co oznaczono przez densytometryczny pomiar przy 260 nm (OD260)·

Zakres wielkości wyizolowanych cząsteczek DNA oceniano z uwagi na użyteczność preparatu do konstrukcji biblioteki genów. Przeprowadzano analizę CHEF w 1,5% żelu agarozowym (Seakem® LE, FMC BioProducts, Rockland, ME) w buforze 0,5 X TBE (44,5 mM Tris-HCl pH 8,0, 44,5 mM H3BO4, 1 mM EDTA) w aparacie BioRad cHeF-DR stosując zasilacz Pulsewave 760 Switcher (Bio-Rad Laboratories, mc., Richmond, CA). Parametry rozdziału były następujące: początkowy czas A 3 sek końcowy czas A 12 sek; 200 volt; temperatura rozdziału 4-18°C; czas rozdziału 16,5 godz. Barwienie bromkiem etydyny i wizualizacja w zalecanym dla DNA świetle ultrafioletowym wykazała obecność cząsteczek DNA o wielkości 30-250 tyś. par zasad.

Konstrukcja biblioteki. Preparat genomowego DNA z Photorhabdus poddano niekompletnemu trawieniu Sau3A. Metoda opierała się na opisie z rozdziału 3.1.3 Ausubel (supra.). Adaptacje obejmowały przeprowadzenie reakcji na mniejszą skalę w różnych warunkach, aż do momentu gdy otrzymano niemal optymalny wynik. Przeprowadzono szereg reakcji na większą skalę, a ich wyniki analizowano w żelach przez elektroforezę CHEF i dalej posługiwano się tylko najlepszymi preparatami. W optymalnym przypadku użyto 200 pg genomowego DNA który inkubowano z 1,5 jednostką Sau3A 1 (New England Biolabs, „NEB”, Beverly, MA) przez 15 min w 37°C w całkowitej objętości 2 ml buforu IX NEB (dostarczonego przez

186 242 producenta jako 10 x stężony). Reakcję hamowano przez dodanie 2 ml PCI i wirowanie przy 8000 x g przez 10 min. Do nadsączu dodawano 200 pl 5 M NaCl i 6 ml lodowato zimnego etanolu. Osad schładzano przez 30 min w -20°C po czym wirowano przy 12,000 x g przez 15 min. Nadsącz usuwano, a osad suszono w piecu próżniowym w temperaturze 40°C po czym zawieszano go w 400 ml STE. Spektrofotometryczne oznaczenie wykazało, że odzyskiwano ponad 40% początkowego DNA. Strawiony DNA frakcjonowano wielkościowo w gradiencie sacharozowym zgodnie z rozdziałem 5.3.2 z CPMB. W probówkach Ultra-Clear™ (Beckman Instruments. Inc., Palo Alto, CA) przygotowano liniowy gradient sacharozowy w zakresie od 10% do 40% ze znacznikiem gradientu i nanoszono próbki DNA na jego powierzchnię. Po wirowaniu (26,000 obrotów na min 17 godz., rotor Beckman SW41, 20°C) , począwszy od najwyższego gradientu zbierano kolejne frakcje (750 pl) i analizowano je poprzez elektroforetyczny rozdział w żelu zgodnie z metodą CHEF (jak opisano wcześniej). Selekcjonowano frakcje zawierające fragmenty Sau3A o wielkościach w zakresie 20-40 tys. par zasad, otrzymany DNA wytrącano stosując modyfikację (objętość wszystkich roztworów zwiększono 6,3 razy) metody opisanej w rozdziale 5.3.3 z Ausubel. Po całonocnym wytrącaniu DNA zbierano przez wirowanie (17 000 x g, 15 min), suszono i ponownie zawieszano w TE łącząc do końcowej objętości 80 pl, ponownie wytrącano przez dodanie 8 ml 3 M octanu sodu i 220 pl etanolu. Osad zbierano przez wirowanie prowadzone w sposób opisany powyżej i ponownie zawieszano w 12 pl TE. Stężenie DNA określano przez barwienie Hoechst 33258 (Polysciences, Inc.,Warrington, PA) i pomiar fluorometryczny w fluorometrze Hoefer TKO100 (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, 25 CA). Odzyskiwano około 2,5 pg DNA rozdzielonego na frakcje pod względem wielkości.

Trzydzieści pg DNA kosmidu pWE15 (Stratagene, La Jolla, CA) strawiono całkowicie 100 jednostkami enzymu restrykcyjnego BamH1 (NEB) w buforze dostarczanym przez producenta (końcowa objętość 200 pl, 37°C, 1 godz.). Reakcję ekstrahowano 100 pl PCI, a DNA wytrącano z fazy wodnej przez dodanie 20 pl 3M octanu sodu i 550 pl etanolu absolutnego o temp -20°C. Po 20 min inkubacji w -70°C DNA zbierano przez wirowanie (17 000 x g, 15 min), suszono pod próżnią i zawieszano w 180 μ l 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Do próbek dodawano 20 pl 10X buforu CiP (100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 10 mM ZnCh; 10 mM MgCĘ), i 1 pl (0,25 jednostki) rozcieńczonej 1:4 cielęcej alkalicznej fosfatazy jelitowej (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN). Po 37 min inkubacji w 37°C dodawano następujące odczynniki: 2 pl 0,5 M EDTA, pH 8,0, 10 pl 10% dodecylosiarczan sodu; 0,5 pl proteinazy K o stężeniu 20 mg/ml (jak wyżej), następnie inkubowano w 55°C przez 30 min. Następnie prowadzono kolejne ekstrakcje 100 ml PCI i 100 ml fenolu. (Intermountain Scientific Corporation, zrównoważonego 1 M Tris-HCl, pH 8,0), zdefosforylowany DNA wytrącano przez dodanie 72 pl

7,5 M octanu amonu i 550 pl etanolu o temp -20°C, inkubowano 30 min w lodzie i wirowano w sposób opisany powyżej. Osadzony DNA płukano 500 pl 70% etanolu o temp -20°C, suszono pod próżnią i zawieszano w 20 ml buforu TE.

Ligację rozdzielonych frakcji pod względem wielkości fragmentów Sau3A 1 z trawionym BamH1-i zdefosforylowanym wektorem pWE15 przeprowadzono stosując ligazę T4 (NEB) wprowadzając modyfikacje (przykładowo stosowano uprzednio zmieszany 10X bufor do ligacji dostarczany przez producenta) do protokołu z rozdziału 3.33 z Ausubel. Ligację prowadzono przez noc w całkowitej objętości 20 ml w 15°C po czym przechowywano w -20°C.

Cztery pl mieszaniny ligacyjnej z kosmidowym DNA, zawierającej około 1 pg DNA wprowadzono do bakteriofaga lambda używając komercyjnie dostępnego ekstraktu do otoczkowania (Gigapack® III Gold Packaging Extract, Stratagene), postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Otoczkowany preparat przechowywano w 4°C aż do momentu użycia. Otoczkowany kosmidowy DNA używano do infekowania komórek Escherichia coli szczepu XL1 Blue MR (Stratagene) zgodnie z protokołami Gigapack® IIIGold („Titering the Cosmid Library”),w następujący sposób. Komórki XL1 Blue MR hodowano na pożywce LB (g/L: Bacto-tryptone, 10; Bacto-yeast extract, 5; Bacto-agar, 15; NaCl, 5; [Difco Laboratories, Detroit, MI]) zawierającej 0,2% (w/v) maltozy i 10mM MgSO4, w 37°C. Po 5 godzinach wzrostu komórki osadzano przy 700 x g (15 min) i zawieszano w 6 ml 10 mM MgSO4. Gęstość hodowli ustalano przez dodanie 10 mM MgSO4 do OD600= 0,5. Wprowadzona bibliote30

186 242 ka kosmidowa była rozcieńczana 1:10 lub 1:20 sterylną pożywką SM (0,1 M NaCl, 10 mM MgSO4 50mM Tris-HCl pH 7,5, 0,01% w/v żelatyna) i 25 ml rozcieńczonego preparatu mieszano z 25 ml rozcieńczonych komórek XL1 Blue MR. Mieszaninę inkubowano w 25°C przez 30 min (bez wytrząsania), następnie dodawano 200 ml pożywki LB kontynuowano inkubację przez około 1 godzinę od czasu do czasu delikatnie wstrząsając. Próbkę (20-40 ml) hodowli wysiano na szalkę z LB agarem zawierającym 100 mg/L ampicyliny (np. LB-Amp) i inkubowano ją w 37°C przez noc. Dla przechowywania biblioteki bez amplifikacji pojedyncze kolonie zawieszano i szczepiono nimi pojedyncze dołki w 96- dołkowej szalce immunologicznej; każdy dołek zawierała 75 ml Terrific (pożywka TR: 12 g/L Bacto-tryptone, 24 g/L Bacto-yeast extract, 0,4% v/v glicerol, 17 mM KH2PO4 72 mM KH2PO4 z uzupełnieniem ampicylina do stężenia 100 mg/l (TB-Ainpi,x)) i inkubowano (bez wytrząsania) przez noc w 37°C. Po zreplikowaniu 96-dołkowej szalki na szalkę pochodną której dołki wypełniono 75 ml/dołek wyjałowionej przez filtrowanie pożywki TB:glicerol (1:1, v/v; z lub bez ampicyliny o stężeniu 100 mg/l), szalkę krótko wytrząsano w 37°C przy 100 obr. na min zamykano Parafilmem® (American National Can, Greenwich, CT) i umieszczano w -70°C w lodówce dla przechowania. Z płytką kopią postępowano w identyczny sposób jak z płytką wyjściową. Łącznie przygotowano 40 szalek (i ich kopii).

Przeszukiwanie biblioteki radioaktywnymi sondami DNA: Celem przygotowania filtra z koloniami do hybrydyzacji z radioaktywnie wyznakowanymi sondami dziesięć 96dołkowych szalek przenoszono do 25°C (stół roboczy o temperaturze pokojowej). Do zaszczepienia nowej 96-dołkowej szalki, której dołki zawierały 75 ml/dołek TB-AmpD0 użyto replikatora z 96 końcówkami. Skopiowaną szalkę hodowano przez noc (bez wytrząsania) w 37°C, a następnie wytrząsano przez 30 min w 37°C przy 100 obr./min. Z uwagi na to, że niektóre izolaty nie rosły wszystkie szalki zawierały 800 kolonii. Do wykonania odzwierciedlenia 96-dołkowej szalki na filtry nylonowe Magna NT (MSI, Westboro, MA) (0,45 mikronowy 220 x 250 mm) umieszczone na stałym podłożu LB-Ampoo (100 ml/szalkę) wylanym na szalkę plastykową typu Bio-assay (Nunc, 243 x 243 x 18 mm; Curtin Mathison Scientific. Inc., Wood Dale, IL) posłużono się replikatorem. Kolonie hodowano na filtrach przez około 3 godz. przy 37°C.

Na oddzielnym filtrze nylonowym Magna NT (Nunc. 0,45 mikrona. 82 mm krążek) położonym na pożywce LB uzupełnionej chloramfenikolem do stężenia 35 mg/l (LB-Cam35) i poddanym obróbce równolegle do filtrów zawierających kolonie z biblioteki genów hodowano kolonie będące kontrolą pozytywną (klony bakteryjne przenoszące wstawkę będącą sekwencją GZ4, patrz poniżej). Kolonie bakterii na filtrze lizowano, a ich DNA denaturowano i zobojętniano zgodnie z protokołem zaczerpniętym z Genius™ System User's Guide wersja 2.0 (Boehringer Mannheim, Indianapolis. IN). W celu /denaturowania filtry umieszczano koloniami do góry na bibule filtracyjnej nasączonej 0,5 N NaOH z 1,5 M NaCl na 15 min, w celu zneutralizowania umieszczano je na bibule filtracyjnej nasączonej 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,5 M NaCl na 15 min. Po usieciowaniu z filtrem przy pomocy aparatu Scratagene UV Stratalinker filtry przechowywano w stanie suchym w 25°C aż do momentu użycia. Filtry cięto na paski, tak aby każdy z nich zawierał zduplikowane odzwierciedlenie pojedynczej 96dołkowej szalki, następnie płukano ekstensywnie zgodnie z metodą z rozdziału 6.4.1 z CPMB: 3 godziny przy 25 °C w 0,45 M chlorek sodu i 0,045 M cytrynian sodu pH 7,0 (3X SSC), 0,1% (w/v) dodecylosiarczan sodu, a następnie w tym samym roztworze przez 1 godzinę w 65°C, dalej płukano 2X SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M cytrynian sodu pH 7,0) przygotowując do procedury hybrydyzacji (20X SSC = 3 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu pH 7,0)

Amplifikacja specyficznych fragmentów genomowych zawierających gen TcaC.

W oparciu o N-końcowe sekwencje aminokwasowe określone dla oczyszczonych peptydów TcaC (ujawnionej tu jako SEQ ID NO:2), stosując standardową technologię β-cyjanoetylową na aparacie Applied BioSystem ABI394 dNa/RNA Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City, CA) zsyntetyzowano pulę zdegenerowanych oligonukleotydów (pula S4Psh). Oligonukleotydy odblokowywano przez 8 godzin w 55°C, rozpuszczano w wodzie, spektrofotometrycznie mierzono ich ilość i rozcieńczano do użycia. Pula ta odpowiadała ustalonej sekwencji aminokwasowej N-końca peptydu TcaC. Określoną aminokwasową sekwencję odpowiadającą zdegene186 242 rowanej sekwencji DNA poOsoo poniżej przy czym A,C,G i T ddpdwiaOnją standartowym nukleotydom, - I oznacz- inozynę.

Aminokwas Met Gln Asp Ser Pro Glu Val

S4Psh 5'ATG CA(A/G) GA(T/C) (T/A)(C/G)(T/A) CCI GA(A/G) GT3'

Kolejny zestaw zdegeoerowroych oligonukleotydów został zsyotetyzowaoy (pula P2.3.5R), tak że jest komplementarny do nici kodującej oznaczoną sekwencję -miodkwasową SEQ ID NO:17;

Aminokwas Al-	Phe Aso	Ile	Asp	Asp	Vnl
Kodony 5'GCN	AT(T/C) >A/(T/C/	AT(AA/C)	GA(A3G/	GA/T/C)	GT 3'
P2.3.5R 3OG(G/C/AA)AA(jGG)TA(A/A)	TA(A/A/G/	CT)A/G/	CTCA/G/	CA5'

OligonukledtyOów tych użyto j-ko starterów w polimer-zowej renkcji łańcuchowej (PCR®, Roche Molecular Systems, Brnnchburg, NJ) w celu znmplifikdwaoin specyficznych fragmentów DNA z genomowego DNA Photorhabdus szczepuW-14 (zobacz powyżej). Typowa reakcjn (50 pl) znwierała 125 pmdla każdej z pul starterów P2Psh i P2.3.SR, 253 ng matrycy będącej genomowym DNA, 10 omoli każdego z nukleotydów dATP, dCTP, dGTP, i dTTP, 1X bufor od PCR GeneAmp® i 2,5 jednostki polimernzy DNA AmpliTną® (wszystko z Roche Molecular Systems; 10X GeneAmp® bufor 100 mM Tris-HCl pH 8,3, 500 mM KCl 0,01% w/v żelatynę). Amplifikację prowa0zdOd w -pnracie Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer, Foscer City, CA) stosując 35 cykli o następującym przebiegu: 94°C (1,0 min), 55°C (2,0 min), 72°C (3,0 min), po których stosowano etap wydrążani- przez 7,0 min w 72°C. Produkty amplifikacji nnnlizownoo przez elektroforezę w 2% w/v NuSieve® 3:1 żelu -garozowym (FMC BioProducts) w buforze TAE (40 mM Tris-dctno, 2 mM EDTA, pH 8.0). Po wybarwieniu w bromku etyOyny (0,5 pg/ml) żel nonlizownoo w świetle ultrafioletowym obserwując pomiędzy innymi licznymi produktami amolifikacμ specyficzny produkt, którego wielkość dszncdwnnd na 250 par z-s-O.

Obsznr żelu znwiernjący produkt o wielkości około 250 par zas-0 wycinnno, - niewielki bloczek (o średnicy 0,5 mm) przenoszono i używano jako Onwcę matrycy dl- renkcji PCR (40 cykli). Reakcja (50 fil) znwierała te same komponenty jnk to dpisroo wyżej pozn genomowym DNA. Po amplifikacji końce fragmentów przeprowadzono w tępe końce i fosfdryldwnoo przez inkubację w 25°C przez 20 min z 1 jednostką polimer-zy T4 DNA (NEB), 1 nmol ATP i 2,15 jednostkami kinnzy T4 (Pharmacia Biotech iOc., Piscatawny, NJ). Czyszczono w żelu z agarozy GTG® (FMC) w buforze TEA. Wycionoo pnski żelu z-wier-jące fragmenty o pożądanej wielkości 250 p-r znsad i ekstrahowano DNA przy pomocy zestawu Qinex (Qiagen Inc., Chatsworth, CA).

Wyekstrahowane fragmenty DNA ligdwaod z wektorem plazmidowym pBC KS(+) (Strat-gene) całkowicie strawionym enzymem restrykcyjnym SmnI i wyekstr-how-nym w sposób podobny do opisanego powyżej dla DNA pWE15. Typowa renkcjn ligacji (16,3 ml) znwiernłn 100 ng strawionego DNa pBC KS(+), 70 ng fragmentu DNA o wielkości 250 par znsaO, 1 nmol [CoCN^^Ch i 3,9 jednostek Weiss- T4 DNA ligazy (Coll-bor-twe Biomedical Products, Bedford, MA), w 1X buforze do ligacji (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 10 mM MgCf; 10 mM Oitiotreitiol, 1mM spermidyna, 1mM ATP, 100mg/ml albuminy z surowicy wołu). Po ligacji ordwndzooej przez noc w 14°C jej produktami trnoyfdrmdwnno zamrożone kompetentne komórki Escherichia coli szczepu DH5a (Gibco BRL) zgodnie z zaleceniami dostawcy i wysiewano na szalkę LB-Cam35 zawierającą IPTG (119 pg/ml) i X-gnl (50 pg/ml). Wybierano pojedyncze bi-łe kolonie i izdlowrod plazmidowy DNA stosując zmodyfikowaną lizę alkaliczną połączoną z wytrącaniem PEG (protokół do zestawu PRISM™ Rendy Renction DyeDeoxy™ Terminator Cycle Seąuencmg; ABI/Perkm Elmer). Określono sekwencję nukleotydowąobu nici wbudowanego fragmentu DNA, używ-no startera T7 [pBC KS(+) nukleotyOy 601-623: TAAAACGACGGCCAGTGAGCGCG) i startera LacZ [pBC KS(+) nukleotydy 792-816: ATGACCATGATTACGCCAAGCGCGC) i protokół załączony do zestawu do sekweocjdoowanir PRISM™ (ABI/Perkm Elmer). Niewbudowaoe skoniugow-ne z barwnikiem

186 242 didezoksyrybonukleotydy usuwano przez przepuszczanie przez Centri-Sep 100 (Princeton Separations, Inc., Adelphia, NJ) zgodnie z zaleceniami producenta. Sekwencję dNa otrzymywano przez analizę próbek przy pomocy aparatu ABI Model 373A DNA Sequencer (ABI:/Perkin Elmer). Ustaloną sekwencję nukleotydową dwóch izolatów G24 i HB14 przedstawiono na fig. 1.

Sekwencje obrazują następujące właściwości: 1) nukleotydy 1-20 odpowiadają jednej z 64 możliwych sekwencji zdegenerowanych oligonukleotydów S4Psh, ii) sekwencja aminokwasów 1-3 i 6-12 dokładnie odpowiada sekwencji określonej dla N-końca TcaC (załączonej jako SEQ ID NO:2), iii) czwartym kodowanym aminokwasem jest raczej cysteina niż seryna. Różnica ta jest kodowana w obrębie degeneracji dla kodonu serynowego (patrz powyżej, iv) piątym aminokwasem jest prolina, odpowiadająca sekwencji N-końca TcaC przedstawionej jako SEQ ID NO:2, v) nukleotydy 257-276 kodują jedną ze 192 możliwych sekwencji zaprojektowanych dla zdegenerowanej puli, vi) terminacyjny kodon TGA pojawiający się jako nukleotydy 268-270 jest efektem komplementamości do zdegenerowanych oligonukleotydów z puli wbudowanych w odpowiednie miejsce i nie wykazuje skrócenia ramki odczytu dla analizowanego genu.

Znakowanie sondy specyficznej dla genu kodującego peptyd TcaC. Fragmenty DNA odpowiadające powyższym 276 nukleotydom amplifikowano (35 cykli) metodą PCR® w objętości 100 pl mieszaniny reakcyjnej z wykorzystaniem 100 pmoli każdego ze starterów P2Psh i P2.3.5R, 10 ng plazmidów GZ4 lub HB14 jako matryc, 20 nmol każdego z nukleotydów dATP, dCTP, dGTP, i dTTP, 5 jednostek polimerazy dNa AmpliTAq® i 1X stężonego buforu GeneAmp®, w tych samych warunkach termicznych, które opisano powyżej. Produkty amplifikacji ekstrahowano z 1% żelu z agarozy GTG® przy pomocy zestawu Qiaex i oznaczano fluorometrycznie.

Wyekstrahowane produkty amplifikacji uzyskane z matrycy plazmidu HB14 (w przybliżeniu 400ng) podzielono na pięć porcji i znakowano ³²P-dCTP posługując się High Prime Labeling Mix (Boehririger Mannheim) zgodnie z zaleceniami producenta. Niewbudowany izotop usuwano przez przepuszczanie próbek przez kolumny NucTrap® Próbę Purification Columns (Stratagene), zgodnie z instrukcjami dostawcy. Aktywność speecyficzną produktów znakowania radioaktywnego określano przez pomiar scyntylacji i wynosiła ona 3,1 1x10⁸ dpm/pg. Tak wyznakowany DNA użyto jako sondę do hybrydyzacji z przygotowanymi z biblioteki genomowej 800 koloniami.

Przeszukiwanie sondą specyficzną dla genu kodującego peptyd TcaC. Znakowaną sondę HB14 gotowano przez około 10 min, a następnie dodano ją do roztworu do „minimalnej hybrydyzacji* . Roztwór do „minimalnej hybrydyzacji” zawiera 10% w/v PEG (glikol polietylenowy o masie cząsteczkowej około 8000, 7% w/v dodecylosiarczan sodu; 0,9 M chlorek sodu i 0,09 M cytrynian sodu pH 7,0 (6X SSC), 10 mM sodowy bufor fosforanowy (przygotowany z 1M koncentratu zawierającego 95 g/l NaH2PO4· 1H₂O i 84,5 g/l Na₂HPO4 · 7H₂O), 5 mM EDTA, i 100 mg/ml zdenaturowanego DNA ze spermy łososia. Filtry blotowano, krótko suszono, a następnie bez wstępnej hybrydyzacji 5 pasków filtrów umieszczano każdy w jednym z dwóch plastikowych pudełek zawierających 75 ml roztworu do „minimalnej hybrydyzacji” i 2,6 ng/ml wyznakowanej radioaktywnie sondy HB14. Następnie inkubowano je przez noc przy powolnym wytrząsaniu (50 obr./min) w 60°C. Filtry płukano trzykrotnie przez około 10 min, za każdym razem, w 25°C w „roztworze do płukania dla hybrydyzacji minimalnej” (0,25X SSC, 0,2% dodecylosiarczan sodu), po których następowały dwa 30 min płukania w tym samym roztworze przy wolnym wytrząsaniu w temp. 60°C. Filtry umieszczone na papierze przykrywano folią polietylenową - Saran Wrap® (Dow Brands, Indianapolis, IN) i umieszczano w światłoszczelnej kasecie wyposażonej w dwa ekrany wzmacniające DuPont Cronex Lighting-Plus Cl (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) do autoradiografii naświetlając przez 4 godz. w -70°C wobec kliszy rentgenowskiej X-Omat (Kodak, Rochester, NY). Po wywołaniu (standardowa procedura fotograficzna), na obu kopiach pomiędzy wieloma słabymi sygnałami tła o niepowtarzalnej intensywności pojawiały się znaczące sygnały jednoznaczne na obu kopiach. Filtry ponownie płukano przez około 4 godziny w 68°C w „roztworze do płukania do hybrydyzacji minimalnej” i ponownie umieszczano w kasecie do całonocnego naświetlania

186 242 w -70°C wobec kliszy. Zidentyfikowano 12 prawdopodobnie pozytywnych klonów opierając się na silnych sygnałach obserwowanych przy koloniach z obu odwzorowań 96-dołkowych szalek. Nie obserwowano sygnału dla kolonii będących kontrolami negatywnymi (kolonie komórek XL1 Blue MR przenoszących pWE15), w przypadku kontroli pozytywnych (komórki DH5<a zawierające izolat GZ4 będący produktem PCR) który był poddany obróbce równolegle z próbkami eksperymentalnymi.

Dwanaście przypuszczalnie pozytywnie hybrydyzujących kolonii odzyskano z zamrożonych 96-dołkowych szalek tworzących bibliotekę hodowano je przez noc w 37°C na stałym podłożu LB-Ampi_Oo· Następnie szczepiono je maźnięciami (3/szalkę wraz z trzema kontrolami negatywnymi: komórki XL1 Blue MR zawierające wektor pWE15) na stałą pożywkę LBAmpioo. Do hybrydyzacji przygotowano dwa zestawy filtrów (Magna NT nylon, 0,45 mikrona). Pierwszy zestaw przygotowywano przez nakładanie filtrów bezpośrednio na bakterie wysiane maźnięciami na szalkę po czym filtry zdejmowano wraz z przyklejonymi do nich komórkami bakterii i obrabiano w sposób opisany poniżej. W drugim zestawie filtry układano na szalkach zawierających pożywkę LB-Ampioo i zaszczepiano komórkami przeniesionymi z szalek szczepionych maźnięciami. Bakterie hodowano przez noc w 37°C po czym filtry usuwano z szalek i poddawano dalszej obróbce.

Komórki bakterii na filtrach lizowano i DNA denaturowano układając filtr koloniami bakteryjnymi do góry na kropli (1,0 ml) 0,5 N NaOH umieszczonej na plastikowej szalce przez 3 min. Filtry suszono na papierowych ręcznikach, a następnie powtarzano czynność ze świeżym 0,5 N NaOH. Po podsuszeniu filtry zobojętniano przez umieszczenie ich na 1,0 ml kropli 1 M Tris-HCl pH 7,5 przez 3 min, suszono i ponownie zobojętniano świeżym buforem. Dalej wykonano dwa podobne przemycia (5 min każde) w kroplach 0,5 M Tris-HCl pH 7,5 z 1,5 M NaCl. Po wysuszeniu biotów DNA przyłączano do filtrów przez naświetlenie UV (jak wyżej) po czym filtry płukano (25°C, 100 obr./min) w 100 ml 0,45 M chlorek sodu i 0,045 M cytrynian sodu pH 7,0 (3X SSC) z 0,1% (w/v) (4 razy 30 min każde za każdym razem w świeżej porcji roztworu). Następnie umieszczano je w minimalnej objętości roztworu do wstępnej hybrydyzcji (0,9 M chlorek sodu i 0,09 M cytrynian sodu pH 7,0 (6X SSC) z 1% w/v fikolu 400 (Pharmacia), poliwinylopirolidonu (przybliżona masa cząsteczkowa 360 000, Sigma) i albuminy z bydlęcej surowicy frakcji V (Sigma) przez 2 godz. w 65°C i 50 obr./min. Roztwór do wstępnej hybrydyzcji usuwano i zastępowano go ³²P-znakowaną sodą HB14, którą zachowano z poprzedniej hybrydyzacji, w której sprawdzano przedstawicieli biblioteki i która była denaturowana w 95°C przez 5 min. Hybrydyzację prowadzono w 60°C przez 16 godz. przy 50 obr./min.

Po usunięciu roztworu z wyznakowaną sondą filtr płukano 3 razy w 25°C (50 obr./ min) w 0,45 M chlorek sodu i 0,045 M cytrynian sodu pH 7,0 (3X SSC) (około 150 ml dla każdego płukania). Następnie płukano przez 3 godz. w 68°C (50 obr./min) w 0,0375 M chlorek sodu i 0,00375 M cytrynian sodu pH 7,0 (0,25X SSC) z 0,2% dodecylosiarczan sodu (minimalny roztwór do płukania po hybrydyzacji) i eksponowane wobec filmu rentgenowskiego jak to opisano powyżej przez 1,5 godz. w25°C (bez ekranów wzmacniających). Ekspozycja ta ujawniła bardzo silne sygnały hybrydyzacyjne względem wyizolowanych kosmidów oznaczonych jako 22G12, 25A10, 26A5 i 26B10 i bardzo słaby sygnał dla kosmidu 8B10. Nie zaobserwowano sygnału w przypadku kolonii będących kontrolą negatywną (pWE 15), a bardzo silny sygnał był widoczny w przypadku komórek kontroli pozytywnej (DH5a przenoszące wydzielony przez PCR produkt GZ4), którą poddawano obróbce równolegle z próbkami eksperymentalnymi.

Amplifikacja specyficznego fragmentu genomowego genu tcaB.

W oparciu o N-końcową sekwencję aminokwasową oznaczoną dla oczyszczonej frakcji peptydu TcaB, (ujawniona tutaj jako SEQ ID NO:3) zsyntetyzowano pulę zdegenerowanych oligonukleotydów (pula P8F) w sposób opisany dla peptydu TcaC. Określona sekwencja aminokwasowa i odpowiadające jej zdegenerowane sekwencje DNA przedstawiono poniżej, gdzie A,C,G i T oznaczają standardowe nukleotydy w DNA, a I oznacza inozynę:

186 242

Aminokwas Leu Phe Thr Gln Thr Leu Lys Glu Ala Arg

P8F 5' TTT ACI CA(A/G) ACI (CT)TI AAA GAA GCI (A/C)G 3' (C/T)T1

Kolejny zestaw zdegenerowanych oligonukleotydów zsyntetyzowano (pula P8.108.3R), tak aby reprezentowały nić komplementarną do nici kodującej dla oznaczonej sekwencji aminokwasowej wewnętrznego peptydu TcaBj-FT108 (ujawniona tutaj jako SEQ ID NO:20): Aminokwas Met Tyr Tyr Ile Gln Ala Gln Gln kodony ATG TA(T/C) TA(T/C) ΑΉΤ/Ο/Λ) CA(A/G) GC((AC/G/T) CA(/AG) CA(A/G)

P8.108.3R 3' AT(A/G) AT(A/G) TA(A/GΛΓ( GT(T/C) CGI GTTT/CC GT5'

TAC

Oligonukleotydy te użyto jako startery dla PCR® z użyciem HotStart 50 Tubes™ (Molecular Bio-Produets, Inc., San Diego, CA) dla zamplifikowania specyficznego fragmentu DNA z DNA genomowego wyizolowanego ze szczepu W-14 Photorhabdus (patrz wyżej). Typowa reakcja (50 pl) zawierała (dolna warstwa) 25 pmoli każdej z pul starterów P8F i P8.108.3R i 2 nM każdego z nukleotydów dATP, dCTP, dGTP i dTTP w IX buforze GeneAmp® PCR i (górna warstwa) 230 ng matrycy będącej genomowym DNA 8 nmoli każdego z nukleotydów dATP, dCTP, dGTP i dTTP i 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaq® w IX GeneAmp® buforze do PCR.

W trakcie amplifikacji wykonano, 35 cykli tak jak opisano to dla peptydu TcaC. Produkty amplifikacji analizowano poprzez elektroforezę w 0,7% w/v agarozie SeaKem® LE (FMC) w buforze TEA. Obserwowano powstawanie specyficznego produktu o wielkości 1600 par zasad.

Połączono cztery takie reakcje, a zamplifikowany DNA ekstrahowano z 1,0% żelu SeaKem® LE przy pomocy zestawu Qiaex w sposób opisany dla peptydu TcaC. Wydzielony DNA był bezpośrednio używany jako matryca dla oznaczenia sekwencji (zestaw do oznaczania sekwencji PRISM™) przy wykorzystaniu pul starterów P8F i P8.108.3R. Każda z reakcji zawierała około 100 ng matrycowego DNA i 25 pmol każdej z pul starterów i była prowadzona zgodnie z typowym protokołem w sposób opisany dla peptydu TcaC. Analiza sekwencji otrzymanej przy użyciu starterów P8F ujawniła krótką sekwencję DNA (kodującą sekwencję aminokwasową):

GAT GCA TTG NTT GCT

Asp Ala Leu (Val) Ala która odpowiada części N-końcowej sekwencji peptydowej opisanej jako SEQ ID NO:3 (TcaBj).

Znakowanie sondy specyficznej dla genu kodującego peptyd TcaBj.

Około 50 ng oczyszczonego w żelu fragmentu DNA TcaBi znakowano ³2 P-dCTP w sposób opisany powyżej, a niewbudowane radioaktywne nukleotydy usuwano przepuszczając próbkę przez kolumnę NICK Column (Pharmacia). Radioaktywność specyficzną znakowanego DNA określono na 6 x 10⁹ dpm/pg. Tak wyznakowany DNA używano jako sondę w hybrydyzacji kolonijnej z filtrami przygotowanymi dla reprezentantów biblioteki genomowej które hybrydyzowały z sondą specyficzną dla peptydu TcaC.

Filtry zawierające 12 kolonii zidentyfikowanych w trakcie przeszukiwania biblioteki sondą specyficzną dla peptydu TcaC (patrz powyżej) odpłukiwano ze znaku specyficznego dla TcaCprzez dwukrotne 30 min gotowanie w 1 1 0,015 M chlorku sodu i 0,0015 M cytrynianie sodu pH 7,0 (0, 1X SSC) z 0,1 % dodecylosiarczan sodu. Usunięcie znakowania sprawdzano przez 6 godzinne naświetlanie kliszy. Następnie odpłukany filtr inkubowano w sondzie specyficznej dla peptydu TcaBj przygotowanej w wyżej opisany sposób. Znakowany DNA denaturowano przez 10 min gotowanie i dodawano do filtrów uprzednio inkubowanych przez 1 godzinę w 100 ml roztworu do „minimalnej hybrydyzacji” w 60°C. Po całonocnej hybrydyzacji prowadzonej w tej temperaturze usuwano sondę, a filtr płukano w następujący sposób (wszystko w 0,0,45 M chlorek sodu i 0,045 M cytrynian sodu pH 7,0 (3X SSC) z 0,1% dodecylosiarczan sodu): raz przez 5 min w 25°C, raz przez 1 godz. w 60aC w świeżym roztworze

186 242 raz przez 1 godz. w 63°C w świeżym roztworze. Po 1,5 godzinnym naświetlaniu kliszy rentgenowskiej prowadzonym wg. standardowej procedury obserwowano cztery silnie hybrydyzujące kolonie. Były to podobnie jak w przypadku sondy specyficznej dla TcaC izolaty 22G12, 25 A10, 26A5 i 26B10.

Ten sam roztwór sondy TcaBi rozcieńczano równą objętością (około 100 ml) roztworu do „minimalnej hybrydyzacji”, a następnie użyto do przeszukania filtrów zawierających 800 reprezentantów biblioteki genomowej. Po hybrydyzacji płukano i prowadzono naświetlanie kliszy rentgenowskiej w sposób opisany powyżej, silną hybrydyzację z tą sondą stwierdzono jedynie w przypadku czterech klonów kosmidowych 22G12, 25A10, 26A5 i 26B10.

Wyizolowanie subklonów zawierających geny kodujące peptydy TcaC i TcaB, i określenie ich sekwencji nukleotydowej.

Trzy hybrydyzujące pozytywnie kosmidy przenoszone przez szczep XL1 Blue MR hodowano z wytrząsaniem przez noc (200 obr. /min) w 30^a C w 100 ml TB- Ampioo· Następnie komórki zbierano przez wirowanie i sporządzano kosmidowy DNA używając komercyjnie dostępnego zestawu (BIGprep™, 5 Prime 3 Prime, Inc., Boulder, CO postępując zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Stosując tą procedurę z powodzeniem wyizolowano tylko jeden kosmid 26A5. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym EcoRl (NEB) i analizowaniu przez elektroforezę w żelu wykryto fragmenty o wielkości około 14, 10, 8 (wektor), 5, 3,3 2,9 i 1,5 tyś. par zasad. Druga próba wyizolowania kosmidowego DNA z tych samych trzech szczepów (8 ml hodowle; TB-Ampooi, 30°C metodą gotowanych minipreparatów^xui. Metodą tą z powodzeniem wyizolowano tylko jeden kosmid 25A10. Gdy strawiono enzymem restrykcyjnym EcoRI (NEB), a następnie analizowaniu techniką elektroforezy w żelu kosmid miał wzór fragmentów identyczny z wcześniej obserwowanym dla kosmidu 26A5.

0,15 pg próbkę DNA kosmidu 26A5 użyto do transformacji 50 ml komórek E. coli szczepu DH5a (Gibco BRL) zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Pojedynczą kolonią izolowaną z tego szczepu zaszczepiano 4 ml pożywki TB-Ampioo i hodowano przez 8 godz. w 37°C. Dodawano chloramfenikol (detreomycyna) do końcowego stężenia 225 pg/ml i kontynuowano inkubację przez dalsze 24 godz, następnie komórki zbierano przez wirowanie i zamrażano w -20°C. Wyizolowanie DNA kosmidu 26A5 prowadzono przez standardową minipreparatykę lizy alkalicznej (Maniatis i wsp. opis cyt. str. 382) zmodyfikowaną przez zwiększenie wszystkich objętości o 50% i mieszanie na mieszadle magnetycznym lub delikatne mieszanie zamiast gwałtownego mieszania przy użyciu Vortexu, w każdym etapie. Po przemyciu osadu 70% etanolem rozpuszczono go w TE zawierającym 25 pg/ml rybonukleazy a (Boehringer Mannheim).

Wyizolowanie fragmentów EcoRI hybrydyzujących z sondami pochodną GZ4 i TcaBi. Około 0,4 pg kosmidu 25A10 (z komórek XL Blue MR) i około 0,5 pg kosmidu 26A5 (zamplifikowanych na chloramfenikolu komórek Di 15«) trawiono około 15 jednostkami EcoRI (NEB), zamrażano na noc, a następnie podgrzewano do 65°C przez pięć minut i rozdzielano elektroforetycznie w 0,7% żelu agarozowym (Seakem® LE, 1X TEA, 8Q wolt, 90 min). DNA barwiono bromkiem etydyny w sposób opisany wyżej i fotografowano w świetle ultrafioletowym. W przypadku próbki 25A10 trawienie EcoRl było kompletne lecz dla próbki kosmidu 26A5 w tych warunkach jedynie częściowe. Żel agarozowy zawierający fragmenty DNA poddano depurynacji, denaturacji i zobojętnieniu po którym próbki DNA przenoszono techniką Southerna na filtr nylonowy Magna NT stosując przepis z zastosowaniem wysokiego stężenia soli (20X SSC) jak opisano w rozdziale 2,9 Ausubel i wsp. (CPMB. opis cyt.). Przeniesiony DNA następnie, tak jak poprzednio, usieciowano z filtrem poprzez UV.

Specyficzny wobec peptydu TcaC fragment DNA odpowiadający wstawce wyizolowanego plazmidu GZ4 amplifikowano przez PCR® w objętości reakcji 100 ml w sposób uprzednio opisany. Produkty trzech reakcji amplifikacji łączono i ekstrahowano z 1% agarozowego żelu GTG® zestawem Qiaex, w sposób opisany powyżej, następnie oznaczano jego ilość fluorometrycznie. Oczyszczony w żelu DNA (100 ng) znakowano ³²P-dCTP używając High Prime Labeling Mix (Boehringer Mannheim) w sposób opisany powyżej do radioaktywności specyficznej 6.34 x 10⁸ dpm/pg.

186 242

Znakowaną P sondę GZ4 gotowano przez 10 min, a następnie dodawano ją do buforu do „hybrydyzacji minimalnej” (do stężenia 1ng/ml) do którego dodawano filtr, na który metodą Southema przeniesiono otrzymane w wyniku trawienia fragmenty kosmidowego DNA, a następnie inkubowano przez 4 godz. w 60°C z delikatnym wytrząsaniem przy 50 obr./min. Następnie filtr płukano 3 razy w 25°C za każdym razem przez około 5 min (roztwór hybrydyzacji minimalnej do płukania) po czym dwukrotnie za każdym razem przez 10 min w temp. 60°C. Błotem naświetlano kliszę (z ekranami wzmacniającymi) przez około 30 min. w -70°C. Sonda GZ4 hybrydyzowała silnie, zarówno w przypadku kosmidu 26A5 jak i 25A10, z fragmentem EcoRI o wielkości 5,0 tys. par zasad (wielkość jednoznaczna).

Filtry odmywano z radioaktywności przez gotowanie w 0,015 M chlorek sodu i 0,0015 M cytrynian sodu pH 7,0 (O,1X SSC) z 0,1% dodecylosiarczan sodu przez 30 min, a brak radioaktywności sprawdzano naświetlanie kliszy. Następnie hybrydyzowano w 60°C przez 3,5 godz. z (zdenaturowaną) sondą TcaBi w buforze do „minimalnej hybrydyzacji” wcześniej używanego do wyszukiwania na filtrze kolonii (wyżej) odpłukiwano w sposób opisany powyżej i naświetlano kliszę przez 40 min w -70°C stosując ekrany wzmacniające. W przypadku obu kosmidów sonda TcaBj hybrydyzowała słabo z fragmentem EcoRI o wielkości 5,0 tys. par zasad i mocno z fragmentem o wielkości około 2,9 tys. par zasad.

Wcześniej opisane próbki DNA kosmidu 26A5 (z komórek DI15a) użyto jako źródła DNA do subklonowania interesującego fragmentu. DNA (2,5 pg) trawiono około 3 jednostkami EcoRI (NEB) w całkowitej objętości 30 pl przez 1,5 godz. celem otrzymania częściowego trawienia, co potwierdzono przez elektroforezę w żelu. Dziesięć ng DNa pBC KS (+) (Stratagene) trawiono przez 1,5 godz. 20 jednostkami EcoRI w całkowitej objętości 20 pl co prowadziło do całkowitego strawienia co potwierdzano przez elektroforezę w żelu. Oba trawione EcoRI preparaty DNA rozcieńczano do 50 pl wodą, do każdego z nich dodano równą objętość PCI, zawiesinę delikatnie wymieszano żwirowano w mikrowirówce i zebrano wodną fazę nadsączu. DNA wytrącano 150 pL etanolu, a mieszaninę umieszczano w -20°C na noc. Po odwirowaniu i wysuszeniu strawiony EcoRI pBC KS (+) rozpuszczano w 100 pl TE, częściowo strawiony 26A5 rozpuszczano w 20 pl TE. Uzyskane DNA sprawdzano fluorometrycznie.

W niezależnych reakcjach w przybliżeniu 60 ng DNA pBC KS (+) trawionego EcoRI ligowano z około 180 ng lub 270 ng częściowo strawionego DNA kosmidu 26A5. Ligację prowadzono w 20 pl w 15°C przez 5 godzin używając T4 ligazy i buforu z New England BioLabs. Mieszaninę ligacyjną rozcieńczoną do 100 pl jałowym TE używano do transformacji zamrożonych kompetentnych komórek DH5a (Gibco BRL) zgodnie z instrukcją dostawcy. Różne ilości (25-200 pl) stransformowanych komórek wysiewano na świeżo przygotowane szalki ze stałym podłożem LB-Cam35 z 1 mM IPTG i 50 mg/1 X-gal. Szalki inkubowano w 37°C przez około 20 godzin, po czym schłodzono w ciemności na około 3 godziny w celu otrzymania intensywnego zabarwienia pozwalającego na selekcję. Wybierano białe kolonie przeszczepiając je maźnięciami na szalkę z takim samym podłożem i inkubowano przez noc w 37°C. ,

Dwie kolonie wybrano z każdej szalki selekcyjnej i postępowano z nimi jak niżej. Po przeszczepieniu białych kolonii na świeże szalki przyciskano okrągłe filtry nylonowe Magna NT do szalek z bakteriami wysianymi w postaci maźnięć, filtry podnoszono i poddawano denaturacji, zobojętnianiu i usieciowywaniu przez UV w sposób wyżej opisany dla kolonii filtrów z koloniami biblioteki. Usieciowane kolonie intensywnie płukano w tym również usuwano resztki ścian komórkowych bibułką. Jeden zestaw hybrydyzowano z roztworem sondy GZ4(TcaC), który opisano wcześniej, a drugi z roztworem sondy TcBi, zgodnie z protokołem dla „minimalnej hybrydyzacji”, po czym płukano i naświetlano kliszę jak opisano to dla filtrów z koloniami biblioteki.

Kolonie wykazujące hybrydyzację tylko z sondą GZ4 jak i z oboma sondami GZ4 i TcaBi lub tylko z sondą TcaBi selekcjonowano do dalszej pracy i komórki szczepiono celem wyselekcjonowania pojedynczych kolonii na podłoże LB-Cam35 z IPTG i X-gal jak uprzednio. W przybliżeniu 35 pojedynczych kolonii wybierano do płynnej pożywki LB-Cam35 i hodowano przez noc w 37°C; komórki zbierano przez wirowanie po czym izolowano z nich

186 242 plazmidowy DNA poprzez minipreparatykę lizy alkalicznej zgodnie z Maniatis i wsp. (opis. cyt. str. 368). Osadzony DNA rozpuszczano w TE + 25 pg/ml rybonukleazy

A i fluorometrycznie oznaczano stężenie DNA. Wzór trawienia EcoRI analizowano poprzez elektroforezę w żelu. Następujące izolaty zachowywano jako użyteczne. Izolat A17.2 zawiera wyłącznie religowany DNA pBC KS(+) i był użyteczny jako kontrola (negatywna). Izolaty D38.3 iC44.1 każdy zawierał jedynie fragment 2,9 tys. par zasad - hybrydyzujący EcoRI fragment wbudowany do pBC KS(+). Plazmidy te nazwane odpowiednio pDAB2000 i pDAB2001 zostały izilustrowaane na fig. 2.

Izolat A35.3 zawierał tylko fragment o przybliżonej wielkości 5 tyś par zasad, fragment EcoRI hybrydyzujący z GZ4 wbudowany do pBC KS(+). Plazmid ten nazwano pDAB2002 (również na fig.2). Izolaty te dostarczyły matryc do sekwencjonowania DNA. Plazmidy pDAB2000 i pDAB2001 oczyszczano używając jak poprzednio zestawu BIGprep™. Hodowle (30 ml) prowadzono przez noc w TB-Cam35 do wartości OD ponad 2, następnie plazmid izolowano zgodnie z zaleceniami producenta. Osady DNA ponownie rozpuszczano w 100 ml TE każdy i jednorodność próbek sprawdzano przez trawienie EcoRI i analizę elektroforetyczną w żelu.

Reakcje sekwencjonowania prowadzono w duplikatach przy czym jedną matrycę stanowił DNA pDAB2000, a drugą matrycę DNA pDAB2001. Reakcję prowadzono posługując się metodą sekwencjonowania przez cykliczne wbudowywanie znakowanych barwnikami didezoksynukleotydów w sposób opisany powyżej dla sekwencjonowania DNA GZ4/HB14. Początkowe sekwencjonowania wykorzystywały jako startery LacZ i T7 opisane powyżej, plus startery oparte na określonej sekwencji produktu ampliflkacji

TcaBj (TH 1 =ATTGCAGACTGCCAATCGCTTCGG,

TH 12 = GAGAGTATCCAGACCGCGGATGATCTG).

Po porównaniu i edycji każdego z wyników sekwencjonowania każdy z wyników był urwany pomiędzy 250 a 350 zasadą w zależności od kompletności danych chromatograficznych interpretowanych przez program Perkin Elmer Applied Biosystems Division SeqEd 675. Poszczególne „etapy” sekwencjonowania prowadzono przez wyselekcjonowywanie odpowiednich nowych starterów. Z kilkoma wyjątkami startery (syntetyzowane jak opisano powyżej) miały długość 24 nukleotydów i 50% zawartości par G+C. Sekwencjonowanie tą metodą prowadzono dla obu nici fragmentu EcoRI o przybliżonej długości 2,9 tyś par zasad.

Do dalszego sekwencjonowania jako matrycę do sekwencjonowania użyto DNA izolatu plazmidowego pDAB2002, przygotowywano zestawem BIGprep™. Reakcję sekwencjonowania przeprowadzano i analizowano jak opisano powyżej. Początkowo starter T3 (pBS SK (+) nukleotydy 774-796: CGCGCAATTAACCCTCACTAAAG) i starter T7 (pBS KS (+) nukleotydy 621-643: GCGCGTAATACGACTCACTATAG) używano do zapoczątkowywania reakcji sekwencjonowania z otaczających wstawkę sekwencji wektora i kierowaną do wewnątrz wrekombinowanego DNA. Kolejny zestaw starterów (GZ4F: GTATCGATTACAACGCTGTCACTTCCC;

TH13: GGGAAGTGACAGCGTTGTAATCGATAC;

TH 14 : ATGTTGGGTGCGTCGGCTAATGGACATAAC; i

LWI - 204: GGGAAGTGACAGCGTTGTAATCGATAC) przygotowano do rozpoczynania reakcji z wewnętrznych sekwencji, które zostały wcześniej określone poprzez sekwencjonowanie z wykorzystaniem zdegenerowanych oligonukleotydów subklonowanych produktów PCR dla peptydu TcaC. Z danych uzyskanych w trakcie początkowych przebiegów sekwencjonowania, zaprojektowany został nowy zestaw starterów użytych do przejścia (kroczenia po) całej długości wewnętrznego fragmentu o długości ~ 5 tyś. par zasad. Łącznie użyto jako starterów 55 oligonukleotydów co pozwoliło zidentyfikować łącznie całą liczącą 4832 zasad ciągłą sekwencję.

Gdy połączono sekwencje fragmentu EcoRI wbudowanego do pDAB2002 z częścią sekwencji określonej dla izolatów pDAB2000/pDAB2001 otrzymano ciągłą sekwencję o łącznej długości 6005 par zasad (ujawniona tutaj jako SEQ ID NO:25). Gdy długą otwartą ramkę odczytu przepisano na odpowiadającą im sekwencję aminokwasową sekwencja ta jasno pokazała, że N-końcowy peptyd (ujawniony tutaj jako SEQ ID NO:3), kodowany jest przez

186 242 nukleotydy 19-75 bezpośrednio następujące po metioninie (start translacji)). Wcześniej zlokalizowane jest potencjalne miejsce wiązania rybosomu (nukleotydy 1-9) a poniżej, nukleotydy 166-228 kodowany jest wewnętrzny peptyd TcaB - PTI 58 (ujawniony tutaj jako SEQ ID NO: 19). Poniżej w tej samej ramce odczytu, nukleotydy 1738-1773, występuje sekwencja kodująca wewnętrzny polipeptyd TcaBjj-PT108 (ujawniony tutaj jako SEQ ID NO:20). Również w tej samej ramce odczytu, nukleotydy 1897-1923 kodują N-końcowy polipeptyd TcaB,, (ujawniony tutaj jako SEQ ID NO:5), po czym otwarta ramka odczytu ciągnie się nieprzerwanie, aż do kodonu terminacji translacji przy nukleotydach 3586-3588.

Brak w ramce kodonów stop pomiędzy końcem sekwencji kodującej TcaBj-PT108 a startem rejonu kodującego TcaBii i brak wyróżnialnych miejsc wiązania rybosomów bezpośrednio przed rejonem kodującym TcaBii wskazują, że peptydy TcaBii i TcaBi są kodowane przez jedną otwartą ramkę odczytu złożoną z 3567 par zasad, zaczynającą się od nukleotydu 16 wSEQ ID NO:25 i najprawdopodobniej pochodzącą z jednego pierwotnego transkryptu zbudowanego z 1189 aminokwasów (131,586 daltonów, ujawniona tutaj jako SEQ ID NO:26) w wyniku po-translacyjnego cięcia. Jeśli aminokwas bezpośrednio poprzedzający N-końcowy polipeptyd TcaBii jest C-końcowym aminokwasem peptydu TcaB; to przewidywana masa TcaBii (627 aminokwasów) wynosi 70 814 daltonów (ujawniony tutaj SEQ ID NO:28), nieco więcej niż obserwowana wielkość w analizie SDS-PAGe (68 kDa). Peptyd ten będzie kodowany przez nieprzerwany ciąg 1881 par zasad (ujawniony tutaj jako SEQ ID NO:27). Uważa się, że natywny C-koniec TcaB; leży nieco bliżej do C-końca TcaBi-PT108. Masa cząsteczkowa PT108 [3 438 kDa; określona analizą sekwencji aminokwasowej tego peptydu] przewidywała jego wielkość na 30 aminokwasów. Posługując się wielkością tego peptydu do określenia C-końca regionu kodującego TcaBi (Glu w pozycji 604 w SEQ ID NO:28] otrzymano wielkość TcaB; wynoszącą 604 aminokwasy lub 68 463 daltony wysoce zgodnie z obserwacjami eksperymentalnymi.

Translacja rejonu o długości 1686 par zasad kodującego peptyd TcaBii (ujawniony tutaj jako SEQ ID NO:29) daje białko o 562 aminokwasach (ujawnione tutaj jako SEQ ID NO:30) z przewidywaną masą 60 789 daltonów w znacznej mierze zgoodną z obserwowaną masą 61 kDa.

Przypuszczalne miejsce wiązania rybosomu (zasady 3633-3638) znaleziono 48 par zasad przed kodonem stop dla otwartej ramki odczytu dla tcaB. Zasady 3645-3677 kodują Nkoniec peptydu TcaC (ujawniona jako SEQ ID NO.2). Otwarta ramka odczytu rozpoczynająca się tym N-końcowym peptydem ciągnie się nieprzerwanie do zasady 6005 (2361 par zasad, ujawniona tutaj jako pierwsze 2361 par zasad SEQ ID NO.31). Gen (tcaC) kodujący cały peptyd TcaC (przybliżona wielkość ~165 kDa; ~1500 aminokwasów) obejmowałaby około 4500 par zasad.

Kolejny izolat zawierający sklonowane fragmenty EcoRI z kosmidu 26A5, E20.6 był również zidentyfikowany przez jego homologię do wcześniej wspomnianych sond GZ4 i TcaBji Analiza w żelu agarozow^ym po trawieniu EcoRI DNA plazmidu przenoszonego przez ten szczep (pDAB2004, fig. 2), ujawniła wbudowane fragmenty o oszacowanej wielkości 2,9, 5 i 3,3 tyś. par zasad. Analiza sekwencji DNA zapoczątkowywana ze starterów zaprojektowanych w oparciu o sekwencję plazmidu pDAB2002 ujawniła, że 3,3 tyś par zasad fragmentu EcoRI pDAB2004 jest zlokalizowana w sąsiedztwie fragmentu EcoRI o wielkości 5 tyś. par zasad obecnego w pDAB200)2. Licząca 2361 par zasad otwarta ramka odczytu odkryta w pDAB2002 ciągnie się nieprzerwanie przez kolejnych 2094 zasad w pDAB2004 (ujawnione tutaj jako pary zasad 2362 do 4458 w SEQ ID nO:31). Analiza sekwencji DNA z użyciem jako matrycy DNA wyjściowego kosmidu 26A5 potwierdziła ciągłość otwartej ramki odczytu. Podsumowując otwarta ramka odczytu (TcaC SEQ ID NO:31) zawiera 4455 par zasad i koduje białko (TcaC) o 1485 aminokwasach (ujawnione tutaj jako SEQ ID NO:32). Obliczona masa cząsteczkowa 166,214 daltonów jest w zgodzie z oszacowaną wielkością peptydu TcaC (165 kDa), również otrzymana sekwencja aminokwasowa pasuje dokładnie do ujawnionej dla TcaC sekwencji N-końcowej (SEQ ID NO:2).

Brak wśród odkrytych sekwencji aminokwasowych sekwencji odpowiadającej SEQ ID NO: 17; użytej do projektowania zdegenerowanej puli oligonukleotydów na startery wykazuje że wytwarzanie produktów PCR® znalezionych w izolatach GZ4 i HB14, które zostały użyte

186 242 jak sondy w początkowym badaniu biblioteki były szczęśliwie wytworzone dzięki inicjowaniu przez jeden ze zdegenerowanych starterów syntezy komplementarnej nici w kierunku przeciwnym niż oczekiwano. Co więcej pochodna sekwencja białka nie zawiera wewnętrznego fragmentu ujawnionego tutaj jako SEQ ID NO: 18. Sekwencje te ujawniają, że plazmid pDAB2004 zawiera kompletny region kodujący peptyd TcaC.

Przykład IX

Przeszukiwanie biblioteki genów Photorhabdus w poszukiwaniu genów kodujących peptyd TcbAii.

Przykład ten opisuje metody wykorzystane do identyfikacji klonów DNA zawierających geny kodujące peptyd TcbAjj, izolację tego genu i częściowe określanie jego sekwencji DNA.

Startery i reakcje PCR.

Polipeptyd TcbAi wchodzący w skład aktywnego preparatu przeciw owadziego ma masę ok. 206 kDa. Sekwencja aminokwasowa N-końca tego peptydu jest załączona do opisu wynalazku jako SEQ ID NO 1. Zaprojektowano i zsyntezowano cztery pule zdegenerowanych starterów oligonukleotydowych (tzw. „zgodne startery”: TH-4, TH5, TH-6 i TH-7), odpowiadających części opisanej sekwencji aminokwasowej. Syntezę prowadzono metodami opisanymi w Przykładzie VIII, sekwencję zaprojektowanych starterów przedstawiono poniżej.

Tabela 11

Aminokwas	Phe	Ile	Gln	Gly	Tyr	Ser	Asp	Leu	Phe
TH-4	5'-TT(T/C)	ATI	CA(AG)	GGI	TA(T/C)	TCI	GA(T/C)	CTI	TT-3'
TH-5	5'-TT(T/C)	ATI	CA(AG)	GGI	TA(T/C)	AG(T/C)	GA(T/C)	CTI	TT-3'
TH-6	5'-TT(T/C)	ATI	CA(AG)	GGI	TA(T/C)	TCI	GA(T/C)	TT(A/G)	TT-3'
TH-7	5'-TT(T/C)	ATI	CA(AG)	GGI	TA(T/C)	AG(T/C)	GA(T/C)	TT(AG)	TT-3'

Dodatkowo określono pierwszorzędową („a”) i drugorzędową („b”) sekwencję wewnętrznych fragmentów peptydu (TcbAii - PT81), sekwencje te umieszczono w opisie wynalazku odpowiednio jako SeQ ID NO 23 i sEq ID NO 24. Podobnie zaprojektowano i zsyntetyzowano cztery pule zdegenerowanych oligonukleotydów (tzw. „Odwrotne startery”: TH-8, TH-9, TH-10 iTH-11), których sekwencje nukleotydowe są komplementarne w stosunku do sekwencji nukleotydowych kodujących fragment peptydu, opisany tu jako SEQ ID NO 23. Sekwencję aminokwasową oraz sekwencję nukleotydową zaprojektowanych starterów przestawia poniższa tabela.

Tabela 12

Amino- kwas	Thr	Tyi·	Leu	Thr	Ser	Phe	Glu	Gln	Val	Ala	Asn
TH-8	3'-TG]	AT(AG)	GAI	TGI	AGI	AA(A/G)	CT(T/C)	GT(T/C)	CAI	CGI	TT(G/A)-5'
TH-9	3'-TG]	AT(AG)	TT(AG)	TGI	AGI	AA(AG)	CT(T/C)	GT(T/C)	CAI	CGI	TT(G/A)-5'
TH-10	3'-TG]	AT(AG)	GAI	TGI	TC(G/A)	AA(A/G)	CT(T/C)	GT(T/C)	CAI	CGI	TT(G/A)-5'
TH-11	3'-TG]	AT(AG)	TT(AG)	TGI	TC(G/A)	AA(A/G)	CT(T/C)	GTIT(T/C)	CAI	CGI	TT(G/A)-5'

Zestawy tych starterów używano w reakcjach PCR®, mających na celu amplifikację fragmentów genu kodującego TcbAii pochodzącego z DNA genomowego Photorhabdus luminescens W-14, przygotowanego jak podano w Przykładzie VI. Wszystkie reakcje PCR przeprowadzano techniką „gorącego startu”, przy użyciu AmpliWax™ oraz innych odczynników i protokołów firmy Perkin Elmer. Standardowo, mieszaninę (objętość całkowita 11 pl) MgCl2, dNTP, 10 x bufor II GeneAmp® PCR i starterów dodawano do probówki zawierającej pojedynczą kulkę parafinową. (10 x bufor II GeneAmp® PCR składa się ze 100 mM Tris40

186 242

HCl, pH 8,3 i 500 mM KCl). Probówki podgrzewano do 80°C przez 2 min. i pozostawiono do schładzania. Po schłodzeniu, na wierzchnią warstwę parafiny nakładano roztwór zawierający 10 x bufor II GeneAmp PCR, matrycę DNA i polimerazę DNA AmpliTag®. Cykliczne zmiany temperatury powodowały stopienie warstwy parafiny i wymieszanie wszystkich składników mieszaniny, ostatecznie warunki reakcji były następujące (objętość 50 pl): 10 mM TrisHCl; pH 8,3; 50 mM KCl; 2,5 mM MgCL; 200 pM każdy z nukleotydów: dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 1,25 mM puli starterów zgodnych i 1,25 mM puli starterów odwrotnych; 1,25 jednostek polimerazy DNA AmpliTaq i 170 ng matrycy DNA; całkowita objętość 50 pl.

Mieszaniny reakcyjne umieszczono w urządzeniu do cyklicznych zmian temperatury (jak w przykładzie VIII) i przeprowadzono następujący program reakcji PCR:

Tabela 13

Temperatura	Czas	Ilość cykli
94 °C	2 minuty	1x
94°C	15 sekund
55-65°C	30 sekund	30x
72°C	1 minuta
72°C	7 minut	1x
15°C	Stały

Kolejne serie amplifikacji przeprowadzano używając pul zdegenerowanych starterów przy trzech różnych temp. połączenia starterów z matrycą (annealing) (55°C, 60°C, 65°C). W reakcjach, gdzie temp. annealingu wynosiła 65°C nie zaobserwowano, stosując elektroforezę w żelu agarozowym, powstawania jakichkolwiek produktów amplifikacji. W reakcjach, gdzie temp. annealingu wynosiła 60°C i użyto pul starterów TH-5 i TH-10 zaobserwowano powstawanie produktu amplifikacji 2,9 kpz. Mniejsza ilość produktu 2,9 kpz powstawała w mieszaninie reakcyjnej z udziałem starterów TH-7 i TH-10 w tych samych warunkach reakcji. Gdy temp. annealingu była równa 55°C, obecność w mieszaninie reakcyjnej tych samych par starterów prowadziła do powstania większej ilości produktu 2,9 kpz; ten sam produkt powstawał również w mieszaninach reakcyjnych, gdzie zastosowano pary starterów TH-5 i TH-8 oraz TH-5 i TH-11. Dodatkowo bardzo słabe pasma 2,9 kpz obserwowano gdy, podczas amplifikacji jako startery, zastosowano pary TH-7 z TH-8 lub TH-9, lub TH-10 lub TH-11.

Aby uzyskać ilość DNA wystarczającą do klonowania i sekwencjonowania przeprowadzono 10 odrębnych reakcji PCR, w których użyto starterów TH-5 i TH-10, warunki reakcji były takie jak opisano powyżej, temp. annealingu wynosiła 55°C. Wszystkie mieszaniny reakcyjne połączono, produkt 2,9 kpz wyizolowano z żelu agarozowego i oczyszczono zestawem Qiaex, metodą opisaną powyżej.

Dodatkowo określono sekwencje aminokwasowe wewnętrznych fragmentów peptydu TcbAi, przedstawione w opisie wynalazku jak SEQ ID NO 21 i SEQ ID NO 22. Jak opisano powyżej zaprojektowano i zsyntetyzowano pule zdegenerowanych nukleotydów (Odwrotne startery: tH-17 i TH-18), które są komplementarne w stosunku do sekwencji kodujących fragmentów sekwencji aminokwasowych tych peptydów.

186 242

Tabela 14

OO SEQ ID NO 21

Aminokwas	Met	Glu	Thr	Tln	Asn	Ile	Tln	Alu	Pro
CH-17	3'-ΑΝΑ	ACC/A	ATI	GTT/A	TCA/G	cni	TCC/A	TTC/A	TG-5'

Tabela 15

Od SEQ ID NO 22

Aminokwas	Asn	Pro	Ile	Asn	Ile	Asn	Chr	Gly	Ile	Asp
CH-18		agi	ATI	TT(T/T)	ani	AA3N/G)	agi	CCI	cni	AC3Ν/G/-5'

ZOegeoerownoe dligonukledtyOy GH-18 iTH-17 wykorzystano w trakcie amplifikncji, gdzie jako matrycy użyto DNA Photorhabdus luminescens W-14 i starterów GH-4, TH-5, TH6 lub TH-7 t -ako 5'. ^>^^^<οΟτΝ)( starterów. W wyniku tych re^al^cji oh-zym-noo proolukty o wielkości odpowiednio około 4 kpz i 4,5 kpz. Otrzymane w wyniku amplifikacji DNA przenoszono z żeli -g-rozowych na filtry nylonowe i hyarydyzownod z wyznakowaną ^P sondą (metoda jnk opisano powyżej) przygotowaną z 2,9 kpz produktu uzyskanego w wyniku reakcji amplifikacji z zastosowaniem pary starterów GH-5 i gH-10. Ob- produkty, zarówno 4 kpz, jrk i 4,5 kpz silnie hybrydyzow-ły z sondą 2,9 kpz. Wyniki otrzymane w tych doświadczeniach wykorzystano do konstrukcji mapy przedstawiającej sekwencję DNA wewnętrznego fragmentu peptydu TcbA„ mnpn jest przedstawiona na fig. 3. Przybliżone odległości między starterami są określone ilością nukleotydów na fig. 3.

Sekwencja 2,9 kpz fragmentów DNA kodującego TcbA,,.

Około 200 ng oczyszczonego fragmentu 2,9 kpz (uzyskanego jak dpiynoo powyżej) strącono etanolem i rozpuszczono w 17 pl wody. Połowa tego preparatu została użyta j-ko matryca do sekweocjdodwania, jako startery zastosowano pulę starterów TH-5, - druga połowa preparatu posłużył- j-ko matryca do reakcji yekweocjdodwroia, gdzie starterem był- TH-10. Reakcje sekwencjdndwnnia przeprowadzono jak opisano w przykładzie VIII. W reakcji z pulą starterów TH-10 nie uzyskano jakiejkolwiek wiarygodnej sekwencji, ale w renkcji z pulą starterów TH-5 otrzymano sekwencję podaną poniżej:

AATCGTGTTG atgcctatac CGNGCCGGGT TCGGTGG/tTT CGATGTCCTC a/ggaaaaag^ 61 ta/ang aggg antmgtccg tgaagaccaa aaatgaaaag aaaaaaaatt antcaatcac 121 CT AG AT A A AC GTCGCCCGGT TCAAGGNNGT IAANTAATTG GGCAGGAAAT Ί///!?!/'/GA

131 gannttccac cgttagttct cacaattagc tatagtaaaa g aaaattcga antannncm n

241 aganncaaac naaccangac gatggactcc cagcaaact atcacccnaa cagagaann n

301 cattaccaac ncgacaacan ncagatccaa aannccaccc ataaacgcan nccnaaactn 361 GGAGATTGG

Na podstawie tej sekwencji zaprojektowano starter sekwencyjny (TH-21, 5'ACAGAgGcCGTTTATCTAGA-3'), który miał odwrócić komplementarne zasady 120-139 i umożliwił zapoczątkowanie polimeryzacji w kierunku 5' (tj. TH-5 koniec) fragmentu 2,9 kpz oczyszczonego w żelu, kodującego TcbCj, (uzyskanego w wyniku PCR). Określona sekwencja startera jest przedstawiona poniżej i jest pdróworoa Oo uzyskanej w wyniku analizy biochemicznej sekwencji N-końca peptyOu TcbAjj, SEQ ID NO 1.

Potwierdzenie sekwencji 2,9 aoz fragmentu TcbC^,, uzyskanego w renkcji PCR.

(Podkreślone aminokwasy = aminokwasy kodowane przez zOegenerowane oukledtyOy/ SEQ ID TO 1 FIOGYSDLF G - - A

I I I I I I I I I I I

2,9 kpz sekw AC ATG CAG GGG ATT TGT GTC ATG TTT GGT AAT AGT GCT

MQGYSDLFGMRA

186 242

Z homologii pomiędzy przewidywaną sekwencją aminokwasową, a sekwencją określoną metodami biochemicznymi, pewne jest, że fragment 2,9 kpz, uzyskany w reakcji PCR odpowiada regionowi kodującemu TcbAj,. Ten 2,9 kpz fragment został użyty (jako sonda w reakcji hybrydyzacji) do przeszukania biblioteki genomowej Photorhabdus W-14, przygotowanej jak opisano w przykładzie VIII, w poszukiwaniu kosmidu zawierającego gen kodujący TcbAi,.

Przeszukiwanie biblioteki kosmidowej Photorhabdus.

Powstały w wyniku reakcji PCR fragment 2,9 kpz wyizolowano z żelu i wyznakowano ³²P używając zestawu do znakowania High Prime firmy Boehringer Mannheim, jak opisano w przykładzie VIII. Filtry, zawierające resztki około 800 kolonii (każdy) pochodzących z biblioteki kosmidowej przeszukiwano jak opisano w przykładzie VIII, klony pozytywne zostały poddane dokładnemu badaniu. W trakcie wielu etapów przeszukiwania i charakteryzacji 3 kolonie dawały wynik pozytywny (8A11, 25G8 i 26D1). Nigdy nie zaobserwowano jakiejkolwiek hybrydyzacji sondy specyficznej dla TcbAii z którymkolwiek spośród 4 kosmidów zidentyfikowanych w przykładzie VIII, które to kosmidy zawierają DNa kodujący geny tcaB i tcaC. dNa z kosmidów 8A11, 25G8 i 26D1 strawiono enzymami restrykcyjnymi Bgl2, EcoRI lub Hind3 (DNA trawiono każdym enzymem pojedynczo lub kombinacją enzymów). Fragmenty DNA powstałe w wyniku trawienia rozdzielono w żelu agarozowym, a następnie przeniesiono na błonę nylonową jak opisano w przykładzie VIII. Błonę tę następnie hybrydyzowano z 4,5 kpz fragmentem, wyznakowanym ^P (fragment 4,5 kpz uzyskano w wyniku amplifikacji genomowego DNA Photorhabdus przy użyciu starterów TH-5 i TH-17). Wyniki hybrydyzacji DNA kosmidów 8A11 i 26D1 były identyczne z wynikami hybrydyzacji tak samo trawionego DNA genomowego rozdzielonego w tym samym żelu i przeniesionego na taką samą błonę. Można zatem stwierdzić, że kosmidy 8A11 i 26D1 zawierają genomowe DNA, w obrębie którego znajduje się lokus kodujący TcbA_u. Warto odnotować, iż kosmid 25G8 daje w wyniku trawienia Bgl2 tylko jeden fragment, który jest nieznacznie większy niż fragment powstający w wyniku trawienia DNA genomowego, może to wynikać z orientacji wstawki w obrębie wektora.

Sekwencja DNA genu kodującego tcbA.

Analiza hybrydyzacyjna DNA kosmidu 26D1 z sondą 4,5 kpz, ujawniła, że sonda hybrydyzuje z jednym dużym fragmentem EcoRI (większym, niż 9 kpz). Fragment ten wyizolowano z żelu i zligowano z plazmidem pBC KS (+) w miejscu EcoRI, tak jak opisano w przykładzie VIII, uzyskano w ten sposób plazmid pBC-S1/R1. Określono część sekwencji fragmentu DNA zligowanego z plazmidem, zastosowano tu metodę tzw. „primer walking (spacerowanie startera)”, przy sekwencjonowaniu zastosowano metody opisane w przykładzie VIII. Sekwencjonowanie rozpoczęto używając jako starterów oligonukleotydów komplementarnych do sekwencji wektora znajdujących się bezpośrednio za miejscem EcoRI, w które wligowano wstawkę. W dalszych etapach sekwencjonowania jako startery używano oligonukleotydy zaprojektowane na podstawie sekwencji DNA określonej w poprzednim etapie sekwencjonowania. Po porównaniu sekwencji DNa uzyskanej tą metodą z sekwencją DNA genu tcbA ustaloną innymi metodami (umieszczoną w niniejszym opisie jako SEQ ID NO 11, jak opisano w przykładzie XII, poniżej), stwierdzono istnienie całkowitej homologii między tymi sekwencjami na odcinku od 1 do 272 nukleotydów, od 319 do 826 nukleotydów, od 2578 do 3036 nukleotydów oraz od 3068 do 3540 (całkowita liczba nukleotydów w porównywanych sekwencjach wyniosła 1712). Stwierdzono, że oba te sposoby mogą być użyte do zidentyfikowania fragmentów DNA kodujących peptyd TcbAii.

Analiza przewidywanej sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen tcbA.

Sekwencja fragmentu DNA opisanego jako SEQ ID NO 11 koduje białko, którego przewidywana sekwencja aminokwasowa jest zamieszczona w niniejszym opisie jako SEQ ID NO 12. Szereg właściwości umożliwia identyfikację tego genu jako genu kodującego białko TcbA,,. N-końcowy peptyd TebAjj (SEQ ID No 1; Phe Ile Gln Gly Tyr Ser Asp Leu Phe Gly Asn Arg Ala) jest kodowany jako aminokwasy od 88 do 100. Wewnętrzny fragment peptydu TcbAii czyli TcbAjj-PT81(a) (SEQ ID NO 23) koduje aminokwasy od 1571 do 1592. Co więcej wewnętrzny fragment TcbA„-PT56 (SEQ ID NO 22) koduje aminokwasy 1474-1488,

186 242 a fragment TcbAi,-PT103 (SEQ ID NO 24) koduje aminokwasy 1614-1639. Jest oczywiste, że gen ten jest z całą pewnością klonem kodującym peptyd TcbA,,, pochodzący z preparatyki owadobójczego białka szczepu W-14 Photorhabdus luminescens.

Białko wyizolowane jako peptyd TcbA,, powstaje na skutek cięcia dłuższego peptydu. Dowodów na to dostarcza stwierdzenie, że nukleotydy kodujące N-koniec peptydu TcbA,, (SEQ ID NO 1) są poprzedzone odcinkami 261 zasad (kodujących 87-mio aminokwasowy Nkoniec) wchodzących w obręb dłuższej otwartej ramki odczytu (SEQ ID NO 11). Ta ramka odczytu rozpoczyna się nukleotydami kodującymi sekwencję aminokwasowa (Met Gln Asn Ser Leu), która odpowiada sekwencji znajdującej się na N-końcu peptydu TcbA i jest umieszczona w niniejszym opisie jako SEQ ID NO 16. Uważamy, iż TcbA jest prekursorem białka TcbA,.

Pokrewieństwo genów tcbA, tcaB i tcaC.

Geny tcaB i tcbA są blisko związane i mogą ulegać translacji w postaci pojedynczego mRNA (przykład VIII). Gen tcbA odnaleziono w obrębie kosmidów, które nie zawierały zespołu genów tcaB i tacC, mimo to porównanie sekwencji aminokwasowej kodowanej przez geny tcaB i tcaC z genem tcbA ujawnia istnienie znacznego stopnia homologii. Przeprowadzone badania mające na celu określenie stopnia konserwowania sekwencji aminokwasowej (Porównanie białek - Protein Alignment Mode w programie komputerowym MacVector™ Sequence Analysis, zapis matrycy (scoring matrix), pam250, wartość szumów = 2; Kodak Scientific Imaging Systems, Rochester, NY), wyniki przedstawia fig. 4. Na każdej linii zapisu fig. 4 znak (A) oznacza homologię lub konserwowanie danej reszty aminokwasowej, znak (Y) oznacza brak homologii.

Analiza ta wykazuje, że sekwencja aminokwasowa peptydu TcbA w obrębie reszt AA 1739 do 1894 jest wysoce homologiczna do sekwencji aminokwasowej peptydu TcaB, na odcinku od 441 do 603 reszt AA (162 spośród wszystkich 627 aminokwasów P8, SEQ ID NO 28). Dodatkowo, sekwencja aminokwasowa TcbA na odcinku od 1932 do 2459 AA jest wysoce homologiczna do sekwencji TcaB, na odcinku od 12 do 531 AA (520 spośród wszystkich 562 AA, SEQ ID NO 30). Biorąc pod uwagę fakt, iż peptyd TcbA (SeQ iD NO 12) składa się z 2505 aminokwasów, spośród których 684 aminokwasów (27%) znajdujących się na C-końcu tego peptydu wykazuje homologię do peptydów TcaB; i TcaB,, homologię te są ułożone współliniowo względem ustawienia domniemanego prepeptydu TcaB (SEQ iD NO 26). Duża przerwa w obrębie homologii TcbA pokrywa się z istniejącym miejscem połączenia między częściami TcaB, i TcaB, w obrębie prepeptydu TcaB. Oczywistym jest, że produkty genów TcbA i TcaB są ewolucyjnie spokrewnione i proponujemy hipotezę, iż spełniają one podobną(e) rolę(e) u Photorhabdus.

Przykład X

Charakterystyka metaloproteaz cynkowych znajdujących się w pożywce hodowlanej Photorhabdus: hamowanie aktywności proteaz, ich klasyfikacja i oczyszczanie.

Badania mające na celu klasyfikację oraz określenie hamowania aktywności proteaz prowadzono wykorzystując jako substrat FITC-kazeinę rozpuszczoną w wodzie (końcowe stężenie w próbie 0,08%). Reakcje proteolizy prowadzono przez 2godz., w temp. 25°C w odpowiednim buforze i z dodatkiem 25 pl podłoża hodowlanego Photorhabdus (końcowa objętość reakcji 150pl). Próbki badano w obecności i przy braku DTT. Po zakończeniu inkubacji do próbki dodawano równą objętość 12% kwasu trójchlorooctowego, aby wytrącić białka, które nie uległy strawieniu. Strącenie prowadzono przez 0,5 godz.. Następnie próbę wirowano, po żwirowaniu z probówki pobierano 100 pl suprenatantu i umieszczano go w szalce mikrotitracyjnej z 96 dołkami, pH roztworu ustalano dodając do próbki równą objętość 4 M NaOH. Następnie obliczano stopień proteolizy przeprowadzając pomiary przy długościach fal: 485 nm (wzbudzenie) i 538 (emisja), stosowano fluorometryczny czytnik płytkowy Fluoroskan II. Aktywność proteaz badano w zakresie pH 5,0 - 10,0 w odstępach co 0,5 jednostki. Używano następujących buforów (stężenie końcowe każdego z nich 50 mM): octan sodu (pH 5,0 -6,5); Tris - HCl (pH 7,0 - 8,0); i bis-Tris propan (pH 8,5 - 10,0). Aby zidentyfikować klasy proteaz obecnych w próbie, pożywkę hodowlaną, nie poddaną wcześniejszej obróbce (tzw. surową), poddawano działaniu szeregu różnych inhibitorów proteaz (stęż. końcowe każdego

186 242 z nich wynosiło 0,5 μg/μl), a następnie badano aktywność proteaz przy pH 8,0, wykorzystując wcześniej opisany substrat. Używane w tym doświadczeniu inhibitory proteaz obejmowały: E-64 (L-trans-eksposkysakcynyloleucyloamido[4-,-guanidyno]-butan), 3,4 dichloroizokumarynę, Leupeptynę, peptsteinę, amastatynę.

Badania na aktywność proteaz przeprowadzone w szerokiej skali pH ujawniły, iż w próbach obecne były proteazy o maksymalnej aktywności przy pH 8,0 (Tabela 16). Dodatek DTT nie miał jakiegokolwiek wpływu na aktywność proteaz. „Surowe” pożywki hodowlane poddano następnie działaniu różnych inhibitorów proteaz (Tabela 17). Wynik tego doświadczenia wskazywał, iż 1,10-fenantrolina powodowała całkowite zahamowanie aktywności wszystkich proteaz, kiedy jej końcowe stężenie wynosiło 50 (tg, IC50 = 5(tg w 100 μ 12 mg/ml roztworu „surowej” pożywki hodowlanej. Wyniki te wskazują, że najliczniej występujące w pożywce hodowlanej Photorhabdus proteazy należą do klasy enzymów określonej jako metaloproteazy cynkowe.

Tabela 16

Wpływ pH na aktywność proteaz badaną po jednodniowej hodowli Photorhabdus luminescens (szczep W-14)

PH	Jednostki fluorescencji* Aktywność#	Procent
5,0	3013 ±78	17
5,5	7994 ± 448	45
6,0	12965 ±483	74
5,5	14390± 1291	82
7,0	14386± 1287	82
7,5	14135± 198	80
8,0	17582 ±831	100
8,5	16183 ±953	92
9,0	16795 ± 760	96
9,5	16279±1022	93
10,0	15225 ±210	87

* Jednostki fluorescencji (Maksimum ok. 28 000, tło ok. 2200) # Procent aktywności w odniesieniu do aktywności maksymalnej przy pH 8,0.

Tabela 17

Wpływ różnych inhibitorów proteaz na aktywność proteaz przy pH 8,0 po jednodniowej hodowli Photorhabdus luminescens (szczep W-14)

Inhibitor	Właściwe jedn. fluorescencji3	Procent hamowaniab
1	2	3
Kontrola	13053	0
E-64	14259	0
1, 10fenantrolinac	15	99
3,4-dichloroizokumarynad	7956	39
Leupeptyn	13074	0
Pepstatync	13441	0

186 242 ciąg dalszy tabeli 17

1	2	3
Amastatyn	12474	4
Kontrola DMSO	12005	8
Kontrola metanolu	12125	7

a. Właściwe jednostki fluorescencji = jednostki fluorescencji - tło (2200 jedn.fluorescencji)

b. Procent hamowania w stosunku do aktywności proteazy przy pH 8,0

c. Inhibitory rozpuszczone w metanolu

d. Inhibitory rozpuszczone w DMSO

Wyizolowanie metaloproteaz cynkowych przeprowadzono nakładając osad uzyskany po strącaniu 10-80% siarczanem amonu, na kolumnę ze złożem Q Sepharose zrównoważoną 50 mM Na2PO4, pH 7,0, jak podano w Przykładzie V dla toksyny Photorhabdus (przed nałożeniem na kolumnę osad poddano dializie). Po intensywnym przemywaniu kolumny, białka toksyny wymywano stosując 0 - 0,5 M gradient NaCl. Większość aktywności biologicznej i białka uległo wymyciu we fakcjach 0,15 - 0,45 M NaCl, aczkolwiek, większość aktywności proteolitycznej było związane z frakcją 0,15 -0,25 M NaCl. Analiza SDS-PAGE frakcji 0,25 - 0,35 M NaCl wykazała istnienie głównego pasma odpowiadającego peptydowi o masie ok. 60 kDa. Frakcja 0,15 - 0,25 M NaCl zawierała to samo pasmo 60 kDa, jednak stężenie tego białka we frakcji było niższe. Następnie frakcję tę poddano filtracji wykorzystując kolumnę Superose 12 HR 16/50. W jej wyniku otrzymano główny sygnał dla białka o masie 57,5 kDa, który zawierał główny prążek (> 90% ogółu wyznakowanego białka) o masie 58,5 kDa, jak wykazała analiza SDS-PAGE. Dodatkowo badanie tej frakcji wykonane z użyciem różnych inhibitorów proteaz, prowadzone jak opisano powyżej, umożliwiło stwierdzenie, iż proteaza zawarta w tej frakcji jest metaloproteazą cynkową. Prawie cała aktywność proteazy obserwowana w jednodniowej pożywce hodowlanej Photorhabdus odpowiadała metaloproteazie cynkowej o masie ok. 58 kDa.

Przeprowadzono również izolację metaloproteaz cynkowych z trzydniowej pożywki hodowlanej Photorhabdus W-14, po izolacji aktywność tych proteaz analizowano wizualnie poprzez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym w obecności siarczanu dodecylu (SDSPAGE), żel ten zawiera! żelatynę; elektroforezę prowadzono zgodnie z opisem przedstawionym w Schmidt T.M., Bleakley B i Nealson K.M., 1988. Żele rozdzielające (5,5 x 8 cm) zawierały 12,5% poliakrylamidu (roztwór podstawowy 40% akrylamid/bis-akrylamid, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) do poliakrylamidu dodano żelatynę do stężenia końcowego 0,1%, całość rozpuszczono w wodzie. Żele zagęszczające (1,0 x 8 cm) zawierały 5% poliakrylamid z dodatkiem 0,1% żelatyny. Standardowo 2,5 pg białka, które poddawano elektroforezie rozpuszczono w 0,03 ml buforu SDS-PAGE, bez dodatku DTT i nanoszono na żel. Elektroforezę białek prowadzono w buforze dodecylosiarczanu sodu (Laemmli U.K., 1970, Nature 227, 680) w temp. 0°C, przy natężeniu prądu 8 mA. Po zakończeniu elektroforezy żel płukano przez 2 godziny w 2,5% (v/v) roztworze Tritonu X-100. Po zakończeniu płukania żel inkubowano w roztworze 0,1 M glicyny (pH 8,0) przez 1 godz. w temp. 37°C. Po inkubacji żele utrwalano i barwiono przez noc roztworem 0,1% czerni amidowej rozpuszczonej w mieszaninie metanol:kwas octowy:woda (30:10:60, v/v/v; Sigma Chemical Co.). Aktywność proteazy była widoczna jako świecące miejsca względem ciemnych, czerń amidowa wybarwia tło spowodowane proteolizą i następującą po niej dyfuzją wbudowanej żelatyny. Zaobserwowano co najmniej trzy oddzielne prążki, których pojawienie się jest związane z aktywnością proteolityczną, prążki te mają masę 58,41 i 38 kDa.

Pomiary aktywności różnych proteaz w trzydniowej pożywce hodowlanej szczepu W-14 przeprowadzono wykorzystując jako substrat kazeinę FlTC rozpuszczoną w wodzie (stęż. końcowe 0,02%). Doświadczenia związane badaniem aktywności proteolitycznej w różnych frakcjach białkowych przeprowadzono w 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) w temp. 37°C, przez 0 0,5 godz., objętość całkowita reakcji 0,15 ml. Reakcję kończono dodając do próby równą objętość 12% kwasu trój chlorooctowego (TCA), rozpuszczonego w wodzie. Po inkubacji prowadzonej w temp. pokojowej przez 0,25 godz., próbki wirowano 10 000 x g przez 0,25 godz.

186 242 i z mieszaniny reakcyjnej probioraio próbki po 0,110 im i umieszczzmo w szafie mikrotitracyjnee z 96 dołkami. Mieszaninę reakcyną neutralizowano dodając do niej równą objętość 2 M NaOH, a następnie mierzono fluorescencję używając płytkowego czytnika fluorometrycznego Fluoroskan II, wywołując wzbudzenie falą o długości 485 nm, a emisję 538 nm. Pomiary aktywności prowadzono używając kazeinę FITC i stosując różne stężenie proteazy w mieszaninie reakcyjnej, reakcję prowadzono w temp. 37°C przez 0-10 min. Jako jednostkę aktywności przyjęto ilość enzymu potrzebną do uzyskania 100 jednostek fluorescencji/min, a aktywność specyficzną, określano jako ilość jednostek/mg proteazy.

Badanie aktywności hamowania enzymów przeprowadzono używając dwa związki będące inhibitorami metaloproteaz cynkowych: 1,10 fenantrolinę i N-(aramnopiranozyloksyhydroksyfosfnyl)-Leu-Trp (fosforamidon), roztwory podstawowe tych inhibitorów były przygotowane odpowiednio w 100% etanolu i wodzie. Standardowe roztwory podstawowe to 10 mg/ml dla 1,10 fenantroliny i 5 mg/ml dla fosforamidonu, stęż. końcowe inhibitorów w próbie wynosiło 0,5 - 1,0 mg/ml. Dodanie do pożywki hodowlanej pochodzącej z trzydniowej hodowli W-14 1,10 fenantroliny, inhibitora wszystkich metaloproteaz cynkowych, prowadzi do całkowitego wyeliminowania jakiejkolwiek aktywności proteolitycznej. Podczas gdy dodanie fosforamidonu, inhibitora proteaz zbliżonych do termolizyn*^, prowadziło do obniżenia o ok. 56% aktywności proteolitycznej, pozostała aktywność proteolityczna nie ulegała obniżeniu nawet po dalszym podawaniu fosforamidonu.

Proteazy, pochodzące z pożywki hodowlanej, zebrano po 3 dniach hodowli Photorhabdus W-14, oczyszczono zgodnie z procedurą opisaną poniżej: 4,0 litry pożywki hodowlanej zagęszczono używając spiralnej wkładki ultrafiltracyjnej (spiral ultra filtration cartridge) Typ S1Y100 połączonej z urządzeniem filtrującym Amicon M-12. Przepływający materiał z białkami natywnymi o masie nie większej niż 100 kDa (3,8 litra) zagęszczono do objętości 0,375 l przy użyciu powyżej opisanego urządzenia. Uzyskany w ten sposób materiał zawierał białka o masie 10 - 100 kDa. Materiał ten wprowadzono na kolumnę HR 16/10 firmy Pharmacia, wypełnionej złożem Poros® 50 HQ firmy PerSeptive Biosystem (Framington, MA, USA), jest to złoże będące silnym wymieniaczem jonowym, zrównoważonym 10 mM buforem sodowo-fosforanowym (pH 7,0). Próbkę zawierającą białka wprowadzono na kolumnę z szybkością przepływu 5 ml/min., następnie aby usunąć białka, które nie związały się z kolumną przepłukiwano ją buforem (tym samym, który użyto do jej zrównoważenia), aż do momentu, gdy absorbancja otrzymanej frakcji przy λ, = 200 wynosiła 0.000.Następni e biaHa. które uległy związaniu z kolumną wymywano stosując gradient NaCl: 0 - 1,0 M NaCl przez 40 min i przy szybkości przepływu 7,5 ml/min. Uzyskane frakcje wypływu badano pod kątem aktywności proteaz, te w których zaobserwowano aktywność połączono razem. Połączone frakcje (aktywne proteolitycznie) rozcieńczono 50% (v/v) 10 mM buforem sodowofosforanowym (pH 7,0) i nałożono na kolumnę HR10/10 Mono Q, zrównoważoną 10 mM buforem fosforanu sodu. Po przemyciu kolumny tym samym buforem, aż do momentu, gdy absorpcja wypływu A280 = 0,00, białka wymywano stosując gradient NaCl: 0 - 0,5 M NaCl w ciągu 1 godz. z szybkością przepływu 2,0 ml/min. Otrzymane frakcje wypływające z kolumny badano pod kątem aktywności proteaz. Frakcje charakteryzujące się najwyższą aktywnością proteaz wrażliwych na fosforanidop połączono, wrażliwość na fosforamidon związana jest z obecnością frakcji proteaz 41-38 kDa. Stwierdzono, że frakcje te ulegają wymyciu przy zastosowaniu 0,14 - 0,25 M NaCl. Zebrano również i połączono frakcje charakteryzujące się aktywnością proteazy niewrażliwej na działanie fosforamidonu, jest to proteazą o masie 58 kDa. Stwierdzono, że frakcje te są wymywane przy zastosowaniu 0,25 - 0,35 M NaCl. Frakcje zawierające proteazę wrażliwą na fosforanidop zostały zagęszczone do objętości 0,75 ml przy użyciu filtra Biomax-5K NMW1 w urządzeniu do filtrowania wirówkowego Millipore Ultracfree-15. Tak zagęszczoną frakcję nałożono z szybkością 0,5 ml/min na kolumnę HR 10/30 firmy Pharmacia, która została wypełniona złożem Sephadex G-50 firmy Pharmacia i zrównoważona 10 mM buforem fosforanu sodu (pH 7,0)//0,1 M NaCl. Frakcje mające najwyższą aktywność proteazy wrażliwej na fosforamidon zebrano i żwirowano przy użyciu błony Biomax-5K NMW1 w urządzeniu do filtrowania wirówkowego Millipore Ultracfree-15. Analiza aktywności proteolitycznej wykazała, że frakcja ta charakteryzowała się

186 242 tylko aktywnością proteazy wrażliwej na fosforamidon.. Proteazę o masie 58 kDa uzyskano łącząc frakcje wykazujące aktywność proteaz na fosforamidon i zagęszczając je przy użyciu błony Biomax-5K NMW1 w urządzeniu do filtrowania wirówkowego Millipore Ultracfree-15, a następnie uzyskany w ten sposób materiał poddając rozdziałowi na kolumnie Superdex-75 firmy Pharmacia. Uzyskane z kolumny frakcje zawierające proteazę o masie 58 kDa połączono.

Analiza oczyszczonych proteaz o masie 58 i 41 - 38 kDa ujawniła, że aktywność obu typów proteaz ulegała całkowitemu zahamowaniu w obecności 1,10 fenantroliny, ale tylko frakcja 41-38 kDa ulegała zahamowaniu pod wpływem fosforamidonu. Dalsza analiza pożywki hodowlanej wykazał, że aktywność proteaz obecnych w tej pożywce po jednym dniu hodowli szczepu W-14 stanowi 23% aktywności proteaz 41-38, i wrasta do 44% w pożywce hodowlanej po 3 dniach hodowli W-14.

Przeprowadzono standardową analizę SDS-PAGE aby ustalić czystość białek i określić sekwencję N-końca. Doświadczenie przeprowadzono wykorzystując 4-20% gradient MiniPlus SeprGel firmy Integrated Separation System (Natic, MA, USA). Białka, które miały zostać poddane analizie sekwencji N-końca przeniesiono po oczyszczeniu na błonę PVDF, infra. (ProBlott Membranes; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), wybarwiono przy użyciu 0,1% czerni amidowej, fragmenty błony zawierające białka wycięto i przesłano do zsekwencjonowania do Cambridge Prochem, Cambridge, MA, USA.

Sekwencje N-końca proteazy 58 kDa (SEQ ID NO 45) oraz proteazy 41-38 kDa (SEQ ID NO 44) były następujące: SEQ ID NO 45: DV-GSEKANEKLK i SEQ ID NO 44: DSGDDDKVTNTDIHR. Wszystkie proteazy pochodziły z trzydniowej pożywki hodowlanej.

Sekwencjonowanie proteazy 41-38 kDa ujawniło istnienie szeregu różnych N-końców, każdy z nich miał usunięty na drodze proteolizy aminokwas znajdujący się na N-końcu. Badanie pierwszo-, drugo-, trzecio- i czwartorzędowej struktury polipeptydów 38 i 41 kDa umożliwiło uzyskanie sekwencji przedstawionej powyżej i ujawniło homologię tych dwu proteaz.

Przykład XI, Część A

Przeszukiwanie biblioteki genomowej Photorhabdus z użyciem przeciwciał przeciw genom kodującym peptyd TcbA.

Równolegle z sekwencjonowaniem opisanym powyżej, przeprowadzono odpowiednie wykonywanie sond i sekwencjonowanie oparte na peptydzie TcbAi, (SEQ ID NO 1). Sekwencjonowanie to przeprowadzono przygotowując bakteryjne pożywki hodowlane i oczyszczając znajdującą się w nich toksynę, tak jak opisano w przykładach I i II.

DNA genomowe wyizolowano ze szczepu W-14 Photorhabdus luminescens hodowanego na pożywce Grace'a do hodowli kultur tkankowych. Bakterie hodowano w 5 ml pożywki hodowlanej w 250 ml erlenmayerce w temp. 28°C przez ok. 24 godziny, stosując wstrząsanie 250 obr/min. Komórki bakterii pochodzących ze 100 ml pożywki hodowlanej żwirowano 5000 x g przez 10 min. Supematant odrzucono, a osad komórek bakteryjnych użyto do izolacji DNA genomowego.

DNA genomowe wyizolowano stosując zmodyfikowaną metodę CTAB opisaną w rozdziale 2.4.3 Ausubel (supra.). Izolację prowadzono zgodnie z metodą opisaną w rozdziale pt. „Large Scalę CsCl prep of bacterial genomie DNA” (Preparatyka bakteryjnego genomowego DNA metodą CsCl na dużą skalę), aż do punktu 6. Na tym etapie izolacji przeprowadzono dodatkową ekstrakcję mieszaniną chloroform:alkohol izoamylowy (24:1), następnie ekstrakcję mieszaniną fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1) i jeszcze raz ekstrakcję mieszaniną chloroform:alkohol izoamylowy (25:2). DNA strącono dodając 0,6 objętości izopropanolu. Strącony DNA nawinięto na koniec szklanej pałeczki, przeniesiono na krótko do 70% etanolu (ostatnie płukanie) i zawieszono w 3 ml buforu TE. Stężenie DNA w roztworze oznaczono mierząc gęstość optyczną roztworu przy długości fali 260/280 nm, wynosiło ono ok. 2 mg/ml.

Wykorzystując tak uzyskane DNA genomowy, skonstruowano bibliotekę genomową. Ok. 50 pg DNA genomowego zostało poddane częściowemu trawieniu przy użyciu enzymu Sau 3AI. Uzyskane w wyniku tego trawienia fragmenty DNA poddano wirowaniu w gradiencie gęstości NaCl. Frakcje zawierające fragmenty DNA o przeciętnej wielkości 12 kpz, lub większe zligowano z plazmidem BluScript, Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA (wielkość fragmentów DNA w danej frakcji sprawdzono elektroforetycznie w żelu agarozowym).

186 242

Tak otrzymane plazmidy z wligowanym DNA genomowym transformowano do komórek E. coli szczepów DH5a lub DHB10. Równolegle uzyskano przeciwciała. Oczyszczone próbki białek przysłano do biotechnologicznego centrum hybrydom w University of Wisconsin, Madison, USA. Posłużyły one do produkcji przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko tym białkom. Przesłane próbki zawierały frakcje z prążkami 1 i 2, oczyszczone metodą HPLC, które zostały zdenaturowane w temp. 65°C i których porcję, po 20 pg wstrzyknięto czterem myszom. Stabilne linie komórkowe hybryd produkujących przeciwciała monoklonalne uzyskano po fuzji komórek trzustki pochodzącym z nieimmunizowanych myszy ze stabilną linią komórek szpiczaka. Przeciwciała monoklonalne uzyskiwano z powstałych hybryd.

Równolegle uzyskano przeciwciała poliklonalne immunizując króliki rasy New Zeland przy użyciu białka z prążka 1 (patrz Przykład I) wyizolowanego z żelu agarozowego, krótko ogrzewając agarozę do temp. 65°C i natychmiast uzyskaną tak agarozę mieszając z adjuwantem. Do pierwszych immunizacji używano pełnego adjuwanta Freunda, do następnych 3 dodatkowych wstrzyknięć następujących co miesiąc użyto niepełnego adjuwanta Freunda. Każde podanie białka przeprowadzono następująco: królikowi w okolicę karku podskórnie wstrzykiwano ok. 0,2 ml zemulgowanego prążka 1, zawierającego około 50 do 100 ng białka. Po 10 dniach od ostatniego zastrzyku pobierano surowicę królika, dodatkowe skrawienie przeprowadzano jeszcze przez 3 tygodnie, w odstępach tygodniowych. Surowicę inaktywowano ogrzewając przez 15 min. w temp. 56°C, a następnie przechowując w temp. -20°C.

Tak uzyskane przeciwciała monoklonalne i poliklonalne zostały następnie użyte do przeszukania biblioteki genomowej pod kątem ekspresji antygenów, które mogą być wykryte przez epitopy. Klony dające reakcję pozytywną były wykrywane na filtrach nitrocelulozowych zawierających resztki kolonii. Analizę tych klonów przeprowadzono metodą immunoblotingu.

Analiza klonów przeprowadzona metodą immunoblotingu i biotu Southema doprowadziła do wstępnej identyfikacji 5 klas klonów.

Pierwsza klasa klonów zawierała gen kodujący peptyd oznaczony tu jako TcbA,,. Uzyskano pełną sekwencję DNA tego genu (TcbA). Jest ona opisana jako SEQ ID NO 11. Potwierdzenie, że sekwencja ta (SEQ ID NO 11) koduje w swym obrębie sekwencję oznaczoną jako SEQ ID NO 1 uzyskano wykazując obecność SEQ Id NO 1 od aminokwasu nr 88 w obrębie opisanej sekwencji aminokwasowej stworzonej przez otwartą ramkę odczytu SEQ ID NO. 11. Może być to potwierdzone w odniesieniu do SEQ ID NO 12, która jest opisaną sekwencją aminokwasową stworzoną przez SEQ ID NO 11.

Druga klasa toksycznych peptydów zawiera fragmenty opisane powyżej jako TcaB„ TcaBii i TcaC. Po przeszukaniu biblioteki genomowej przy wykorzystaniu surowicy poliklonalnej, tę drugą klasę genów toksyn zidentyfikowano jako szereg klonów, które produkowały białka o różnych masach cząsteczkowych, jednak wszystkie te białka ulegały reakcji krzyżowej z przeciwciałem poliklonalnym, dodatkowo stwierdzono, stosując błot Southema, że między klonami tymi istnieje duża homologia DNA. Porównanie sekwencji ujawniło, że należały one do kompleksu genomowego opisanego powyżej jako TcaB i TcaC.

Stosując przeciwciała poliklonalne wyizolowano również trzy inne klasy klonów reagujące z przeciwciałami przeciwko toksynom. Klasy te produkowały białka, które ulegały reakcji krzyżowej z przeciwciałem poliklonalnym i również wykazywały homologię DNA, co określono metodą biotu Southema. Klasy te oznaczono jako klasa III, klasa IV i klasa V. Możliwym było również zidentyfikowanie przeciwciał monoklonalnych, które ulegały reakcji krzyżowej z klasą I, II, III, IV, co sugeruje, że istnieją regiony silnej homologii pomiędzy białkami tych klas. Tak więc wydaje się, że geny kodujące białka wydzielane pozakomórkowo przez P.luminescens reprezentują rodzinę genów, które są ze sobą ewolucyjnie spokrewnione. Podążąją^c tym tropem, mogą istnieć ewolucyjnie pokrewne zmiany w obrębie toksycznych peptydów tego organizmu. W celu zbadania innych szczepów P.luminescens pod kątem obecności „pokrewnych” białek zastosowano dwa różne podejścia. Przeprowadzono badanie na drodze amplifikacji metodą PCR DNA genomowego, jak i immunoblotingiem z wykorzystaniem przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych. Uzyskane wyniki wskazują, iż pokrewne białka są produkowane u następujących szczepów P. luminescens: WX-2, WX-3, WX-5, WX-6, WX-7. WX8, WX-11, WX-12, WX-15 i W-14. '

186 242

Przykład XI, Część B

Sekwencja i analiza toksyn klonów klasy III - tcc

Plazmidy wyizolowane z klasy ΙΠ klonów E. coli i jak opisano w przykładzie XI, część A, poddano sekwencjonowaniu. Sekwencja nukleotydowa wykazała istnienie w tym locus genomowym trzech blisko związanych otwartych ramek odczytu. Locus ten określono jako tcc, zawiera on 3 ORF (otwarte ramki odczytu) określone jako tccA, SEQ ID NO 56; tccB, SEQ ID NO 58 i tccC, SEQ ID NO 60 (fig. óB). Sekwencja aminokwasowa określona na podstawie ORF tccA wskazuje, że gen ten koduje białko o masie 105.459 Da. Białko to określono jako TccA. Pierwsze 12 aminokwasów tego białka odpowiada sekwencji N-końca uzyskanej dla białka 108 kDa, SEQ ID NO 7, wcześniej opisanego jako część kompleksu toksycznego.

Sekwencja aminokwasowa określona na podstawie ORF tccB wskazuje, że gen ten koduje białko o masie 175 716 Da. Białko to określono jako TccB. Pierwsze 11 aminokwasów tego białka odpowiada sekwencji N-końca opisanej dla białka o masie cząsteczkowej 185 kDa, SEQ ID NO 8.

Sekwencja aminokwasowa tccC wskazuje, że ta otwarta ramka odczytu koduje białko o masie 111.694 Da, białko to określono jako TccC.

Przykład XII

Charakterystyka szczepów Photorhabdus

Aby potwierdzić, iż kolekcja szczepów opisana w niniejszym zgłoszeniu jest kolekcją szczepów Photorhabdus zbadano szereg cech mikrobiologicznych tych szczepów; cech które są charakterystyczne dla Photorhabdus i odróżniające je od Enterobacteriaceae i Xenorhabdus syp?. Charakterystyka Photorhabdus jest następująca: są to pałeczki nie barwiące się odczynnikiem Grama pojedyncza komórka ma rozmiary 0,5 - 2 pm szerokości i 2-10 pm długości, tworzą kolonie o barwie czerwonej lub żółtej; w komórkach obserwuje się występowanie krystalicznych ciałek inkluzyjnych, zawierają katalazę, są niezdolne do redukcji azotanów, wykazują bioluminescencję, pobierają barwnik z podłoża hodowlanego, wytwarzają proteazy, zakres temperatur w których obserwuje się wzrost jest poniżej 37°C, są zdolne do przeżycia w warunkach beztlenowych; komórki mają zdolność ruchu. Właściwości te podsumowano i przedstawiono w tabeli 18. We wszystkich prowadzonych badaniach jako kontroli używano szczepów Photorhabdus, Xenorhabdus i E. coli. Wyniki testów pozwoliły na stwierdzenie, że wszystkie badane szczepy należały do rodziny Enterobacteriaceae i rodzaju Photorhabdus.

Aby zbadać bioluminescencję każdego szczepu i określić względnie, i ilościowo produkcję światła przeprowadzono pomiary z użyciem luminometru. W doświadczeniu, w którym określono względną produkcję światła, mierzono ilość jednostek światła emitowanych przez hodowlę szczepu (zawierającą zarówno pożywkę hodowlaną jak i komórki bakterii), pomiary prowadzono w 6, 12 i 24 godzinie hodowli (licząc od momentu założenia hodowli płynnej) wyniki porównywano z luminescencją tła (pożywka hodowlana nie zaszczepiona bakteriami i woda). Przed przeprowadzeniem pomiarów emisji światła w każdej z badanych hodowli, określano gęstość hodowli, pomiary prowadzono mierząc absorbancję światła przy długości fali 560 nm używając spektrofotometru Gilford Systems (Oberlin, OH, USA) używając naczynia przepływowego (sipper celi). Po określeniu zagęszczenia komórek bakteryjnych w hodowli przed przystąpieniem do pomiarów luminescencji każdą hodowlę rozcieńczano tak, aby jej gęstość optyczna = 1,0. Następnie z rozcieńczonej hodowli pobierano próbki i umieszczano w kuwetach (po 300 pl), pomiar przeprowadzano przez 45 sek używając luminatora Bio-Orbit 1251 (Bio-Orbit Oy, Twiku, Finland). Podczas pomiaru próbki przez cały czas mieszano zapewniając im w ten sposób ciągłe natlenienie. Za wynik pozytywny tego doświadczenia uważano sytuację gdy luminescencją badanej hodowli była większażrówna od pięciokrotnej wartości luminescencji tła (luminescencją tła 5 - 10 jednostek). Dodatkowo luminescencję kolonii bakteryjnych mierzono używając warstwy klisz fotograficznych. Barwienie każdego szczepu metodą Grama przeprowadzono używając handlowo dostępnych zestawów do znakowania (BBL, Cockeysville, MD, USA), porównując wyniki z obrazami kontrolnymi (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). Badania mikroskopowe prowadzono używając mikroskopu Zeissa (Carl Zeiss, Niemcy), stosowano powiększenie 100 x i obiektywy wymagające oleju immersyjnego (10 x powiększenie okularu i 2 x powiększenie mikroskopu).

186 242

Dokładne badania mikroskopowe komórek każdego szczepu mające na celu ustalenie ich rozmiarów, ich kształtu i występowania ciałek inkluzyjnych przeprowadzono używając preparatów kropli wiszącej (10 x powiększenie okularu i 2 x powiększenie mikroskopu i 40 x powiększenie obiektywu) z użyciem oleju immersyjnego i mikroskopu kontrastu fazowego zaopatrzonego w mikrometr™ w temp. 28°C. Test na obecność katalazy przeprowadzono następująco: kolonię badanego szczepu pobierano małą szpatułką, z powierzchni agaru odżywczego, na której rosły i umieszczano w szklanej probówce, następnie po ściance probówki delikatnie nalewano 1 ml wody utlenionej. Jeżeli kolonia produkowała katalazę, natychmiast lub w ciągu 5 sek. od dodania wody utlenionej obserwowano pojawianie się dużej ilości pęcherzyków gazu (najprawdopodobniej tlen). Jako kontrolę przeprowadzono ten sam test używając agaru odżywczego, na którym nie prowadzono hodowli mikroorganizmów i wody utlenionej. Test na redukcję azotanów: 10 ml pożywki Bacto Nitrate Broth (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), zaszczepiono próbką badanego szczepu. Hodowlę prowadzono przez 24 godziny w temp. 28°C, powstawanie azotynów badano dodając do probówki 2 krople kwasu sulfanilowego i 2 krople alfa-naftylaminy (Difco Manual wyd. X, Difco Laboratories, Detroit MI, USA, 1984). Powstające zabarwienie hodowli na kolor różowy lub czerwony świadczy o powstawaniu azotynów z azotanów. Zdolność każdego szczepu do pobierania barwnika z podłoża hodowlanego badano prowadząc hodowle na następujących podłożach: Bacto agar MacConke/a zawierający czerwień obojętną; Bacto Tergitol-7 agar zawierający błękit bromotymolowy i Bacto EMb Agar zawierający eozynę-Y (agar pochodził z Difco Laboratories, Detroit, MI i przygotowywany był zgodnie z poleceniami producenta). Po zaszczepieniu podłóż hodowlę prowadzono przez 5 dni w temp. 28°C, po tym czasie badano pobieranie barwników. Wzrost na tych podłożach jest cechą charakterystyczną gatunków należących do rodziny Enterobacteriaceae. Ruchliwość komórek każdego szczepu badano wykorzystując pożywkę Bacto Motility Test (Difco Laboratories, Detroit, MI) przygotowywaną zgodnie z poleceniami producenta. Podłoże zaszczepiano nanosząc punktowo niewielkie inokulum badanego szczepu, zdolność do ruchu komórek tego szczepu oceniano makroskopowo, mierząc rozwój strefy wzrostu pochodzącej od miejsca zaszczepienia. W wielu przypadkach zdolność do ruchu komórek badano również mikroskopowo, przygotowując z hodowli płynnej mokry preparat kropli wiszącej. Wymagania pokarmowe każdego szczepu zbadano używając BBL, Enterotube II (Benton, Dickinson, Niemcy). Doświadczenie prowadzono według instrukcji podanej przez producenta, wyjątkiem były zastosowane warunki inkubacji: 28°C, 5 dni. Otrzymane wyniki były całkowicie zgodne z wcześniej publikowanymi danymi uzyskiwanymi dla Photorhabdus. Wydzielanie proteazy sprawdzano określano na postawie hydrolizy żelatyny, zastosowano jako podłoże żelatynę Bacto (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), które przygotowywano zgodnie z zaleceniami producenta. Hodowlę prowadzono przez 5 dni, w temp. 28°C. Aby zbadać wzrost szczepów w różnych temperaturach szalki agarowe (2% pepton albumozy #3 z dodatkiem 2% Bacto-Agaru (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) w wodzie dejonizowanej), zaszczepiono inokulum. Szalki uszczelniono taśmą Nesco® i inkubowano w temp. 20, 28 i 37°C przez 3 tygodnie. Szalki, na których nie obserwowano wzrostu w temp. 37°C przenoszono do temp. 28°C i hodowano przez tydzień, jednak komórki pobrane z tych szalek nie wykazywały jakiejkolwiek zdolności do ruchu. Wymagania tlenowe szczepów Photorhabdus badano zaszczepiając inokulum płynną pożywkę hodowlaną zawierającą tioglikolan (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez tydzień, po upływie tego czasu określono typ i szybkość wzrostu. W hodowlach zastosowano jako wskaźnik resazurin (Difco Manual, Wydanie X, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), który informuje o poziomie natlenienia pożywki hodowlanej lub występowaniu stref aerobowych (Difco Manual, Wydanie X, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Wielkości stref wzrostu uzyskane dla poszczególnych szczepów Photorhabdus były podobne do wielkości stref wzrostu charakterystycznych dla fakultatywnych anaerobów.

186 242

Tabela 18

Cechy taksonomiczne szczepów Photorhabdus Zbadane cechy

Szczep

A

B

c

D

E

F

G

H

I

J

K

L

M

N

0

P

Q

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

W-14

- +

+

+

rd S

4-

+

+

+

o

4-

+

+

4-

+

+

2

WX-1

+

+

rd S

+

+

+

4-

o

+

+

4-

+

+

+

2

WX-2.

+

+

rd s

4-

+

+

0

4-

+

4-

+

+

+

2

WX-3

-

-1-

+

rd

+

-

4-

+

+

YT

4-

+

+

+

_ +

+

-

Γ

WX-4

-

4-

+

rd

+

-

4-

+

+

YT

+

+

+

+

+

+

-

s

WX-5

-

+

+

rd

+

-

+

+

+

LO

+

+

+

+

+

+

-

Γ

WX-6

-

+

+

rd

+

-

+

+

+

LY

+

+

+

+

-

-

-

-

s

WX-7

4-

+

rd S

4-

+

+

+

R

+

+

+

+

+

+

-

WX-8

-

+

+

rd

+

-

+

+

+

0

+

+

+

+

+

+

-

S~

WX-9

+

4-

rd

+

-

+

+

YT

+

+

+

+

+

+

-

—

S

WX-10

-

+

+

rd

+

-

+

+

4-

Ro

+

+

+

+

+

+

-

Ś~

WX-11

-

+

+

rd

-i-

-

+

+

4-

Ro

+

+

+

+

+

+

-

s

WX-12

-

+

+

rd S

4-

+

+

4“

O

+

4-

+

+

4-

+

-

WX-14

+

+

rd

+

-

4-

+

+

LR

-i-

4-

4-

4-

+

-

—

-

ś~

WX-15

4-

4-

rd

+

-

-t-

+

+

LR

-t-

+

4-

+

+

+

-

—

ś~

H9

-

4-

+

rd S

4-

+

-r

+

LY

+

+

+

+

4-

+

Hb

+

+

rd

+

-

4-

+

+

YT

+

+

4-

+

+

+

-

—

s

Hm

-

+

+

rd s

4-

+

+

4-

TY

+

+

+

4-

+

+

-

HP88

-

+

+

rd Ś”

+

-

-l·

4-

+

LY

+

+

+

-h

4-

+

-

NC-1

+

+

rd s

+

-

+

+

+

O

+

4-

+

4-

+

4-

186 242 ciąg dalszy tabeli 18

W30 rd

S

YT

WIR

B2

43948

43949

43950 rd rd

S~ rd

S~ rd

S rd s

RO

43951

43952 rd rd

A = barwienie metodą Grama, B = krystaliczne ciałka inkluzyjne, C = bioluminescencja, D = kształt komórki, E = zdolność komórek do ruchu, F = redukcja azotanów, G = produkcja katalazy, H = hydroliza żelatyny, I = pobieranie barwnika, J = kolor kolonii, K = wzrost na agarze EMB, L = wzrost na agarze MacConkeya, M = wzrost na agarze Tergitol-7, N = fakultatywny anaerob, O = wzrost w temp. 20°C, P = wzrost w temp. 28°C, Q = wzrost w temp. 37°C, f +/- = pozytywny lub negatywny wynik testu, rd = pałeczki, s = wielkość komórek mieści się w granicach charakterystycznych dla tego rodzaju, RO = czerwono-pomarańczowa, LR = lekko czerwona, R = czerwona, O = pomarańczowa, Y = żółta, T = brunatna, LY = jasno żółta, YT = żółto-brunatna i LO = jasno pomarańczowa.

Przy charakterystyce bakterii na poziomie rodzajów i gatunków ważną rolę odgrywa analiza komórkowych kwasów tłuszczowych”¹¹, która przyczyniła się do potwierdzenia, że posiadana przez nas kolekcja szczepów należy do tego samego rodzaju. Kultury badanych szczepów przesłano do innego, kontraktowego laboratorium w celu przeprowadzenia analizy estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME), przy użyciu Microbial ID (MIDI, Newark, DE, USA), Systemu Identyfikacji Mikroorganizmów (Microbial Identification System MIS). System MIS składa się z chromatografu gazowego Hewlett Packard HP5890A posiadającego kolumnę kapilarną, o wymiarach 25 mm x 0,2 mm, wypełnioną 5% metylofentylo silikonem stopionym z krzemionką. Jako gaz nośnikowy stosowany jest wodór i detektor jonizacji płomieniowej w połączeniu z podajnikiem automatycznym, integratorem i komputerem. Komputer porównuje estry metylowe kwasów tłuszczowych w badanej próbce z biblioteką bakteryjnych kwasów tłuszczowych i z mieszaniną kalibracy’ną znanych kwasów tłuszczowych. Zgodnie z zaleceniami laboratorium prowadzącego badania, szczepy przygotowywane do analizy hodowano przez 24 godz. w temp. 28°C na agarze z tryptykazą sojową. Próbki do badania przygotowało laboratorium, w którym wykonywano analizę standardową metodą FAME. Wcześniej przeprowadzona charakterystyka badanych szczepów metodami bezpośrednimi wykluczyła przynależność tych szczepów do jakiejkolwiek innej grupy bakterii luminescencyjnych, poza Photorhabdus. Przeprowadzenie badań, w trakcie których porównano profile kwasów tłuszczowych pochodzących z grupy izolatów, umożliwiło stwierdzenie, że bakterie należały do tej samej rodziny.

Różnorodność ewolucyjną szczepów Photorhabdus należących do naszej kolekcji określono badając „fingerprinting” DNA genomowego z każdego szczepu przeprowadzając analizę metodą PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy). Technika ta opiera się na występowaniu w genomie różnych szczepów bakteryjnych rodzin powtarzających się sekwencji DNA™. Uważa się, że trzy z tych sekwencji: repetytywne palindromowe sekwencje pozagenowe (re186 242 petitive extagenic palindromic seqence - REP), enterobakteryjne repetytywne sekwencje zgodności wewnątrzgenowej (enterobacterial repetitive intergenic consensul - ERIC) i elementy BOX odgrywają ważną rolą w organi/.acjj genomu bakteryjnego. Uważa się również, że organizacja jest kształtowana przez selekcję i rozproszenie tych elementów w obrębie genomu i cecha ta może być wykorzystywana do identyfikacji blisko spokrewnionych szczepów bakteryjnych (np. Louws F.J., Fulbright D.W., Stephens C.T. i De Bruijn F.J., 1994, Appl. Emdron. Micro. 60, 2286-2295). Rep-PCR wykorzystując startery oligonukleotydowe komplementarne do tych sekwencji repetytywnych umożliwia namnożenie fragmentów DNA leżących pomiędzy nimi i mających różną wielkość. Powstające w wyniku reakcji PCR produkty są rozdzielane za pomocą elektroforezy, aby ustalić „fingerprint” (odcisk palca) dNa, charakterystyczny dla każdego szczepu.

Aby otrzymać genomowy DNA z badanych szczepów należy: osad komórek zawiesić w buforze TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) do objętości końcowej 10 ml i dodać 12 ml 5 M NaCl. Mieszaninę tę należy żwirować 20 min., 15 000 x g. Uzyskany pelet należy zawiesić w 5,7 ml TE i dodać 300 pl 10% dodecylosiarczanu sodu oraz 60 fal proteinazy K o stęż. 20 pg/ml (Gibco BRL Products, Grand Island, NY, USA). Mieszaninę tę należy inkubować w temp. 37°C, przez 1 godz., a następnie dodać ok. 10 mg lizozymu i kontynuować inkubację przez dodatkowe 45 min. Po upływie tego czasu do mieszaniny należy dodać 1 ml 5 M NaCl i 800 pl roztworu NaCl/CTAB (10% w/v CTAB; 0,7 M NaCl), całość inkubować przez 10 min. w temp. 65°C, delikatnie zamieszać, inkubację prowadzić jeszcze przez 20 min., mieszając (aby ułatwić uwolnienie materiału komórkowego). Następnie należy dodać równą objętość mieszaniny chloroform/alkoholizoamylowy (24:1, v/v), delikatnie zamieszać i żwirować. Po żwirowaniu należy przeprowadzić dwie ekstrakcje z równą objętością mieszaniny fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (50:49:1). DNA genomowy należy strącić używając 0,6 obj. izopropanolu, strącony DNA należy nawinąć na pałeczkę szklaną, przemyć dwukrotnie 70% etanolem, wysuszyć i rozpuścić w 2 ml STE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM NaCl, 1 mM EDTA).Ilość DNA ocenia się mierząc gęstość optyczną roztworu przy długości fali 260 nm. Aby przeprowadzić analizę rep-PCR genomowego DNa Photorhabdus użyto następujące startery: REP1R-I; 5'-IIIICGICGICATCIGGC-3' i REP2-I; 5'-ICGICTTATCIGGCCTAC-3'. Reakcję PCR prowadzono w 25 pl objętości końcowej: 7,75 pl H2O; 2,5 pl buforu 10 x LA (PanVera Corp., Madison, WI, USA); 16 pl mieszaniny dNTP (2,5 mM każdy nukleotyd); 1 pl każdego startera o stęż. 50 pM/pl; 1 pl DMOO; 1 i5 pl NAA genomowego (stężenia o0 0,07- 0,480 pg/pl) i 0,25 pl TaKaRa EX Taq (PanVera Corp., Madison, WI, USA). Reakcje PCR prowadzono w aparacie Perkin Elmer DNA Thermal Cycler (Norwalk, CT, USA), w następujących warunkach: 95°C/7 min., następnie 35 cykli: 94°C/1 min., 44°C/1 min., 65°C/8 min., zakończone 15 min. w temp. 65°C. Po zakończeniu reakcji do 25 pl mieszaniny reakcyjnej dodawano 5 pl 6 x stężonego buforu do nanoszenia próbek na żel (gel loading buffer; 0,25% błękit bromofenalowy; 40% w/v sacharozy w wodzie). Przygotowano 1 % żel agarozowy o wymiarach 15 x 20 cm i przeprowadzono elektroforezę w buforze TBE (0,09 M Tris-boran; 0,002 M EDTA), nanosząc na żel 8 pl każdej mieszaniny reakcyjnej. Elektroforezę prowadzono ok. 16 godz. przy napięciu 45 V. Żele barwiono bromkiem etydyny (20 pg/ml) przez 1 godzinę i odbarwiano w buforze TBE przez ok. 3 godz. Zdjęcia żeli wykonywano aparatem Polaroid po oświetleniu ich światłem UV.

Obecność lub brak prążków charakterystycznych dla każdego szczepu zapisywano z fotografii i wprowadzano jako matryce podobieństwa w programie komputerowym używanym do taksonomii numerycznej NTSYS-pc (Exeter Software, Setauker, NY). Równolegle, również tą metodą uzyskano ”fingerpring” DNA szczepów kontrolnych E. coli szczep HB101 i Xanthomonas oryzae pv. oryzae, który był zgodny z danymi literaturowymi^¹. Dane uzyskane ze szczepów Photorhabdus zostały następnie poddane analizie w programach komputerowych: NTSYS-pc; SIMQUAL (Similarity for Qualitative Data), aby uzyskać macierz współczynników podobieństwa (używając współczynnika Jaccarda) i grupowania (z wykorzystaniem UPGMA - Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Averages) SAHN (Sequential, Agglomeratiye, Hierarchical and Nested), które grupują szczepy pokrewne i mogą być przedstawione w postaci fenogramu (fig. 5). Programy COPH (cophenetic values)

186 242 i MXCOMP (mrtrix comparition) wykorzystano do uzyskani- matrycy wartości kofeoetyczne i porównania korelacji pomiędzy tą matrycą a matrycą, na ktiórej oparte było grupowanie. Metodą znormalizowanej statystyki Mnntela uzyskano wartość (r), która jest miarą dopasowania Oo analizy grupowej (r=0,8 - 0,9 oznacza bardzo dobre Odoaydwaoie). W naszym przypadku r = 0,919. Dlatego też nasza kolekcja skł-Oa się z różnorodnej grupy łatwo rozróżnialnych szczepów, które należą do rodzaju Photorhabdus.

Przykład XIII

Owadobójcze zastosowanie toksyn produkowanych przez różne szczepy Photorhabdus

Początkowe kultury „wyjściowe” różnych szczepów Photorhabdus są wytwarzane przez zaszczepianie 175 ml dwuprocentowegd podłoża Proteose Peptone #3 (PP3) (Laboratoria Difco, Detroit, MI) podstawowymi szczepnmi subk^nu w 500 ml ^przegrodowej kolbie wraz z szyjką Delong z zamknięciem Kaput. Inokulum do każdej hodowli wyjściowej otrzymano z pokrytej warstwą oleju hodowli nr skosie agarowym lub z hodowli na sznlknch. Po anszczeoieoiu kolby inkubowano 16 godzin w temperaturze 28°C w wytrząsarce z prędkością 150 obrotów na minutę. Te hodowle wyjściowe są następnie używane jsko uniwersalne źródła szczepów do fermentacji d-nego szczepu. Dodatkowo hodowle wyjściowe w fazie odldgarytmicznej pokryto sterylną naftą, dodano sterylne mieszadło magnetyczne w celu ponownego zawieszenia komórek, i przechowywano w ciemności w temperaturze pokojowej, znpewninjąc w ten sposób długoterminowe zabezpieczenie inokulum w stanie nie naruszającym toksyn. Wyprodukowane buliony są z-szczepi-ne przez dodanie 1% aktywnie rozrastającej się hodowli wyjściowych Oo 2% świeżej pożywki PP3 (np. 1,75 ml nn 175 ml świeżej pożywki). Produkcja bulionów odbywa się również w 500 ml trójdzielnych kolbrch (jw) lub w 2800 ml kolbach przedzielonych i z wypukłym dnem (500 ml sztuka) z zamknięciem z pi-nki silikonowej. Kolby produkcyjne inkubowano przez 24 0o 48 godzin w wyżej opisanych warunkach. Po zakończeniu inkubacji buliony są rozlewane do sterylnych jednolitrowych butelek z polietylenu, wirowane 2600 x g przez 1 godzinę przy 10°C i deknotowane aby oddzielić osad zawierający resztki komórkowe i komórki. Płynny bulion jest następnie filtrowany przez filtry szklane Whatman GF/D (zatrzymywanie 2,7 μΜ) i TF/B (zatrzymywanie 1,0 μΜ) usuwające resztki komórkowe. Dalsze oczyszczanie bulionu osiąga się przy pomocy mikrofiltrującego urządzenia o tangeosdidnlnym przepływie (Pall Filtrom, Tdrthborough. MA) używając filtra otyartd-kanrłdwego 0,5 μΜ. Jeśli zachodzi potrzeba, dodatkowe oczyszczanie może być wykonane przez schłodzenie roztworu (Oo 4°C) i odwirowywanie przez kilka godzin przy 2600 x g. Zgodnie z tą procedurą roztwór jest sterylizowany przy użyciu filtra 0,2 μΜ z nitrocelulozowym filtrem. Sterylne buliony następnie wykorzystano bezpośrednio do prób biologicznych, analiz biochemicznych lub aatężrnd (Oo 15 razy) przy pomocy urządzenia 0o ultrafiltrrcji odcinającego frakcję o masie cząsteczkowej 10 000, M12 (Cmieon, Beverly ΜΝ) lub zatężarki wirówkowej (Milliopre, Bedford, MC i Pall Filtron, Northborough, MA) o wielkości por przepuszczających cząsteczki o masie cząsteczkowej 10 000. W przypadku zatężarki wirówkowej bulion wirow-no przy 2000 x g w przybliżeniu przez 2 godziny. Przesącz o masie cząsteczkowej 10.000 dodano do odpowiedniej zatrzymanej frakcji, aby osiągnąć pożądane stężenie składników powyżej masy cząsteczkowej 10.000. Dezaktywacja po0 wpływem ciepła odbywa się przez podgrzewanie próbek w temperaturze 100°C przez 10 min. w wypełnionych piaskiem blokach.

Bulioo3y) i kompleks(y) toksyn z różnych szczepów Photorhabdus są używane do redukowani- populacji owadów i są stosowane w metodzie powstrzymywania populacji owadów, co obejmuje stosowanie w miejscu występowania owadr skutecznej ilości unieszkodliwiającej owady, określanej jako aktywna. Wykazanie zakresu działania own0oaójezrgo obserwowanego przy użyciu bulionów wybranych grup szczepów Photorhabdus poddanych fermentacji tak jak to zostało opisane wyżej, jest przedstawione w tabeli nr 19. Istnieje możliwość, że mogą zostać wykryte dodatkowe Oziałania owadobójcze tych szczepów w wyniku zwiększenia stężenia bulionu lub przez wykorzystanie innych metod fermentacji. Biorąc pod uwagę fakt, że aktywność owadobójcza roztworu jest związana z białkiem, to aktywność dwn0obójczn wszystkich badanych szczepów jest zależna o0 temperatury (p-trz wyżej).

186 242

Bulion(y) hodowlany^) z różnych szczepów Photorhabdus wykazują zróżnicowany poziom działania owadobójczego (śmiertelność i/lub hamowanie wzrostu, obniżenie pojawiania się dorosłych osobników). Szczególnie obserwowana jest aktywność przeciw larwom kukurydzianej stonki korzeniowej (Diabrotica sp.) i larwom kwieciaka bawełnowca z rzędu Coleoptera. Inni przedstawiciele tego rzędu to larwy sprężykowatych, słodyszek rzepakowiec, pchełka, Bruchidae i stonka ziemniaczana. Zaobserwowano również działanie na skoczka (Macrosteles fascifrons) i żywiący się zbożem Megamelus spp., które należą do rzędu Homoptera. Inni przedstawiciele tego rzędu to skoczki, miodówka gruszowa żółta, miodówka jabłoniowa, owady czerwcowate, mączliwowate, kraskowate (Cercopidae) jak również wiele gatunków mszyc. Buliony i kompleksy oczyszczanych toksyn działają też na szkodnika tytoniu (Heliothis virescens) zmierzchnicy i omacnicy prosowianki (Ostrinia nubilalis), które są przedstawicielami rzędu Lepidoptera.. Innymi typowymi przedstawicielami tego rzędu są szkodnik buraka (Spodoptera exiqua), kapusty (Trichoplusia ni), (Agrotis ipsilon), Heliothis zea, owocówka jabłkówka, mól, zadamica spiżamiapka (Plodia interpunctella), Pyralidae, gąsienice żywiące się kapustą, szkodnika bawełny (Helicoverpa armigera), Thyndopteryx ephemeraeformis. Liszka (Nalacosoma sp.), wachlarzyk (Parapediasia tetrrella) i Spodoptera frugiperda. Zauważalne jest również działanie przeciw owocówkom i larwom komara, które zalicza się do rzędu Diptera. Ini przedstawiciele Diptera to paciomica grochowianka, połyśnica marchwiowa, Delia radicum, mszyca (Delia floralis), śmietka cebulówka, koziułkowate i mucha domowa oraz różne gatunki komarów. Buliony i kompleksy z oczyszczanych toksyn działają też na przędziorka chmielowca Tetranychus urticae, który jest przedstawicielem rzędu Acarina, do którego poza tym należy: Tetranychus turkestani, Polyphagotarsonemus latus, Panonychus citri, Panonychus ulmi, rdza gruszkowa (Epitnmerus pyri i Aculops lycopersici).

Działanie przeciw larwie kukurydzianej stonki korzeniowej (Diabrotica sp.) zostało przetestowane w następujący sposób. Bulion/y) hodowlany(e) zawierający(e) kultury Photorhabdus (0-15 razy zatężone, sterylizowane przez filtrowanie), 2% Proteose Peptone # 3, oczyszczony kompleks (oksyn [0,23 mg/ml] lub 10 mM fosforan sodu, pH 7,0, nanoszono bezpośrednio na powierzchnię (około 1,5 cm² sztucznej pożywki™, 40 pl porcje. Kompleks toksyn został rozcieńczony w 10 mM fosforanem sodu, pH 7,0. Szalki z pożywką pozostawiono do osuszenia na powietrzu w sterylnej komorze, a dołki zakażono pojedynczym, nowo narodzonym osobnikiem Diabrotica undecimpunctata howardi (południowa kukurydziana stonka korzeniowa - South cora rootworm, SCR), wylęgłym ze sterylizowanych jaj. Szalki szczelnie zamknięto, umieszczono w nawilżanej komorze inkubacyjnej i pozostawione do wzrostu w temperaturze 27°C na okres około 3-5 dni. Następnie mierzono masę larw i ich śmiertelność. Ogółem w czasie badań przy każdej próbie użyto 16 owadów. Śmiertelność w kontroli wyniosła mniej niż 5%.

Działanie przeciw kwieciakowi bawełnowcowi (Anthomonas grandis) zostało sprawdzone jak następuje, stężony (1-10 razy) buliony hodowlane Photorhabdus, pożywkę kontrolną (2% Proteose Peptone # 3), oczyszczony kompleks(y) toksyn(y) [0,23 mg/ml] lub 10 mM fosforanu sodu, pH 7,0, nanoszono na powierzchnię 0,35 g sztucznej pożywki w 60 pl porcjach (pożywka dla motyli Stopeville Yellow) i pozostawiono do wyschnięcia. Pojedyncza larwa kwieciaka bawełniaka w wieku 12-24 godzin została umieszczona na pożywce, dołki szczelnie zamknięto i utrzymywano .w temperaturze 25°C, 50% RH, przez 5 dni. Następnie mierzono masę i śmiertelność larw. Śmiertelność w kontroli była w zakresie 0-13%.

Sprawdzenie działania przeciw larwom komara przebiegało następująco. Próbę przeprowadzono w 96-dołkowej szalce nikrotitracyjpej, która zawierała 200 pl wodnego roztworu (W-krotnie stężony^) buliomjy) hodowlny(e) Photorhabdus, 2% Proteose Peptone #3, oczyszczony(e) kompleks(y) toksyn^) [0,23 mg/ml] lub H2O, 10 mM fosforanu sodu i w przybliżeniu 20 jednodniowych dojrzałych larw (Aedes aegypti). Stosowano 6 dołków na każdą próbę. Wyniki były odczytywane po 3-4 dniach. Śmiertelność w kontroli utrzymała się na poziomie 0-20%.

Działanie przeciw muszkom owocówkom było testowane następująco. Zakupioną pożywkę dla Drosophila melanogaster przygotowano używając 50% suchej pożywki i 50% płynu w tym wody, pożywki kontrolnej (2% Proteoze Peptone #3), zatężonej 10 razy bulio56

186 242 nu(ów) hodowlanego(ych) Photorhabdus), oczyszczonego(nych) kompleksu(ów) toksyn(y) [0,23 mg/ml] lub 10 mM fosforanu sodu, pH 7,0. Przeprowadzono to przez umieszczenie 4,0 ml suchej pożywki w każdej z trzech fiolkach hodowlanych na każdą próbę oraz dodano 4,0 ml właściwego płynu. Dziesięć larw instar Drosophila melanogaster dodano następnie do każdej 25 ml fiolki. Fiolki były przechowywane w laboratorium na stole laboratoryjnym, w temperaturze pokojowej pod sufitowym światłem jarzeniowym. Zliczenie kokonów lub dojrzałych osobników prowadzono po 15 dniach. Pojawianie się osobników dorosłych w porównaniu do pożywki kontrolnej i wody (obniżenie 0-16%).

Zbadanie działania wobec dorosłego skoczka (Macrosteles fascifrons) i nimfy skoczka zbożowego (Peregrinus maidis) było przeprowadzone tak, aby umożliwić pobieranie substancji czynnej, bez innego rodzaju kontaktu zewnętrznego. Zbiornik na roztwór substancji czynnej, „pożywienie” jest wykonany przez zrobienie dwóch otworów po środku dolnej części szalki Petriego o wymiarach 35 x 10 mm. Kwadrat 5 cm (2 cale) Parafilmu M®, umieszczono na wierzchu szalki i zabezpieczono pierścieniem uszczelniającym typu „O”. Następnie plastikowy kubek o poj. 30 ml (1 uncja) zakażono, około 7 skoczkami, a zbiornik umieszczono na górze kubka, Parafilmem do dołu. Następnie przez otwory w zbiorniku wlano roztwór. Do testów użyto 10-krotnie stężony(e) bulion(y) hodowlany(e) Photorhabdus, bulion i pożywkę hodowlaną (2% Proteose Peptone #3), dializowane w 10 mM fosforanu sodu, pH 7,0 i do uzyskanego roztworu dodano sacharozę (do stęż. 5%), aby obniżyć śmiertelność w kontroli. Badano również oczyszczony(e) kompleks(y) toksyn [0,23 mg/ml] lub 10 mM fosforanu sodu, pH 7,0. Śmiertelność określano 3 dnia. Próbę prowadzono w inkubatorze przy temperaturze 28°C, 70% RH przy okresie światła 16/8. Testy zmierzono pod kontem śmiertelności w ciągu 72 godzin. Śmiertelność w kontroli wyniosła mniej niż 6%.

Działanie przeciw larwom Lapidopteran zostało sprawdzone w następujący sposób. Stężony(e) (10 razy) bulion(y) hodowlany(e) Photorhabdus, 2% Proteose Peptone #3, oczyszczony kompleks(y) toksyn(y) [0,23 mg/ml] lub 10 mM fosforanu sodu, pH 7,0 zostało zastosowane bezpośrednio na powierzchnię (-1,5 cm²) standardowej pożywki dla motyli (Stoneville Yellow) w 40 pl porcjach. Szalki z pożywką zostały następnie pozostawione do wyschnięcia w powietrzu w sterylnej komorze. Do każdego dołka włożono pojedynczą larwę omacnicy prosowianki (Ostrinia nubilalis) i jaja zmierzchnicy (Manduca sexta). Te jaja zostały pozyskane ze źródeł komercyjnych i wylęgły się na miejscu, podobnie jak larwy szkodnika tytoniu (Heliothis virescens), które pochodziły z własnej hodowli. Po wprowadzeniu larw szalki z pożywką zostały szczelnie zamknięte, umieszczone w komorze inkubacyjnej z nawilżaniem i pozostawione w temperaturze 27°C przez odpowiedni czas. Następnie piątego dnia zmierzono masę i śmiertelność larw. Ogółem w badaniach używano po 16 owadów w każdej próbie. Śmiertelność w kontroli wahała się 4-12,5 % dla pożywki kontrolnej i była mniejsza niż 10% dla buforu fosforanowego.

Działanie przeciw przędziorkowi chmielowcowi Tetranychus urticea zostało zbadane następująco. Młode, rośliny dyni przycięto pozostawiając pojedynczy liścień i spryskano do spłynięcia 10 krotnie stężonym bulionem hodowlanym, pożywką kontrolną (2% Proteose Peptone #3), oczyszczanym kompleksem toksyn [0,23 mg/ml] lub 10 mM fosforanem sodu, pH 7,0. Po wysuszeniu rośliny zakażono różnymi roztoczami tworzącymi pajęczyny i przechowano w temperaturze i wilgotności, jaka panowała w laboratorium przez 72 godziny. Następnie policzono żywe roztocza, aby ustalić poziomy kontrolne.

Tabela 19

Spektrum działania owadobójczego bulionów z różnych szczepów Photorhabdus

Szczep Photorhabdus	Wrażliwe gatunki owadów
1	2
WX-1	3**,4, 5, 6, 7, 8
WX-2	2,4
WX-3	1.4
WX-4	14

186 242 ciąg dalszy tabeli 19

1	2
WX-5	4
WX-6	4
WX-7	3,4, 5, 6, 7,8
WX-8	12,4
WX-9	12,4
WX-10	4
WX-11	12,4
WX-12	2,4, 5, 6, 7,8
WX-14	12,4
WX-15	12,4
W30	3,4, 5,8
NC-1	12, 3,4, 5, 6, 7,8, 9
WIR	2, 3,5, 6,7, 8
HP88	13,4, 5, 7, 8
Hb	3,4, 5,7,8
Hm	1,2, 3, 4, 5,7,8
H9	12, 3,4, 5,6, 7,8
W-14	1,2, 3,4, 5,6, 7,8, 10
ATCC43948	4
ATCC43949	4
ATCC43950	4
ATCC43951	4
ATCC43952	4

* = > 25% śmiertelności i/lub wzrostu zahamowania względem grupy kontrolnej ** = 1; Heliothis virescens, 2; Ostrinia nubilalis, 3; zmierzchnica, 4; południowa kukurydziana stonka korzeniowa, 5; kwieciak bawełniak, 6; komar, 7; muszka owocówka, 8; Macrosteles fascifrons, 9; Macrosteles fascifrons, 10; Tetranychus urticea..

Przykład XIV

Szczepy Photorhabdus inne niż W-14

Oczyszczanie, charakteryzacja i spektrum działania.

Oczyszczanie

Ten protokół jest podobny do protokołu stworzonego na potrzeby oczyszczania W-14 i został opracowany w oparciu o oczyszczanie frakcji, które mają największzą skuteczność wobec południowej kukurydzianej stonki korzeniowej (SCR) jak to zostało dowiedzione w próbach biologicznych (patrz przykład XIII). Typowo otrzymywano 4-20 1, który bulionu przefiltrowano, jak jest to opisane w przykładzie XIII i zatężono przy użyciu naboju spiralnego ultra filtrującego typu Amicon Type S1Y100 podłączonego do urządzenia filtrującego Amicon M-12. Część zatrzymana obejmowała naturalne białka składające się z cząsteczek o wielkości powyżej 100 kDa, podczas gdy materiał przesączu obejmował naturalne białka o wielkości poniżej 100 kDa· Zasadnicza aktywność przeciwko kukurydzianej stonki korze58

186 242 niowej SCR występowała w części zatrzymanej ro wielkości 100 kDa. Część zatrzymaną następnie diafiltrowano z 10 mM fosforanu sodu (pH 7,0) do momentu, gdy przesącz wykazywał wartość A₂80 < 0,100. Jeśli nie określono inaczej, wszystkie procedury od tej chwili były przeprowadzane w buforze jak zdefiniowano dla 10 mM fosforanu sodu (pH 7,0). Część zatrzymaną następnie zatężono do około 0,20 1 i przefiltrowano używając jednostki do filtrowania sterylizującego 0,45 mm Nalgene Filterware. Przefiltrowany materiał wprowadzono przy 7,5 ml/min na kolumnę Pharmacia HR 1 (6/10, wypełnioną silnie anionowymicnnym podłożem PerSeptive Biosystem Poros® 50 HQ, zrównoważonym buforem używając układu do HPLC PerSeptive Biosystem Sprint®. Po wprowadzeniu materiału, kolumnę przemyto buforem do uzyskania wartości A₂80 < 0,100. Białka następnie wymywano z kolumny przy 2,5 ml/min używając buforu z 0,4 NaCl przez 20 min do końcowej ilości 50 ml. Kolumnę następnie przemyto buforem z 1,0 M NaCl o tej samej szybkości przepływu przez kolejne 20 min (końcowa objętość 50 ml). Białka wymywane przy 0,4 M i 1,0 M NaCl następnie umieszczono w dwu osobnych woreczkach do dializy (Spectra/ Por® Membrane MWCO:2,000) i pozostawiono do dializy przez noc w temperaturze 4°C w 12 1 buforu. Zasadnicza aktywność przeciwko kukurydzianej stonce korzeniowej SCR odpowiada frakcji 0,4 M. Frakcję 0,4 M następnie oczyszczono naniesienie 20 ml na kolumnę Pharmacia XK 26/100, wypełnioną Sepharose CL4B (Pharmacia) przy szybkości przepływu 0,75 ml/min. Frakcje zostały połączono w oparciu o krzywą pików A280 i zatężono do końcowej wartości 0,75 ml używając urządzenia do filtrowania wirówkowego Millipore Ultrafree®-15, filtr Biomax-50K NMWL. Stężenia białka określono przy użyciu zestawu Biorad Protein Assay Kit z bydlęcą gamma globuliną jako odnośnikiem.

Charakteryzacja

Naturalna masa cząsteczkowa kompleksu toksyny przeciwko kukurydzianej stonce korzeniowej (SCR) została określona przy użyciu kolumny Pharmacia HR 16/50 z wcześniej wprowadzoną Sepharose CL 4B w buforze. Kolumnę następnie kalibrowano przy użyciu białek o znanych wielkościach cząsteczek, umożliwiając policzenie przybliżonej naturalnej cząsteczek toksyn. Jak pokazano w tabeli 20 wielkość cząsteczek z kompleksu toksyn jest w zakresie od 777 kDa dla szczepu Hb do 1,900 kDa dla szczepu WX-14. Wydajność produkcji kompleksu toksyn jest również zmienna, szczep WX-12 produkował 0,8 mg/l a szczep Hb, 7,0 mg/l.

Białka znalezione w kompleksie toksyn były badane pod kątem poszczególnych wielkości polipeptydów przy użyciu analiz SDS-PAGE. Typowo, 20 mg białka z kompleksu toksyn z każdego szczepu wprowadzono do 2-15% żelu poliakrylamidowego (Intergeted Sepatarion Systems) i poddano elektroforezie przy 20mA w buforze SDS-PAGE, Biorad. Po zakończeniu elektroforezy, żele barwiono przez noc w błękicie Coomassie R-250, Biorad (0,2% w metanol:kwas octowy:woda; 40:10:40 v/v/v). Następnie żele odbarwiano w metanolu, kwasie octowym: wodzie; 40:10:40 (v/v/v). Po czym przepłukano wodą przez 15 min. i skanowane przy użyciu densytometru Milecular Dynamics Personal Laser Densitometer®. Ścieżki oznaczano ilościowo i masy cząsteczkowe obliczano w porównaniu do wzorców mas cząsteczkowych Biorad, w zakresie od 200 do 45 kDa.

Wielkości poszczególnych polipeptydów znajdujących się w różnych odmianach kompleksu toksyn przeciwko kukurydzianej stonce (SCR) przedstawiono w tabeli 21. Wielkości poszczególnych polipeptydów wynoszą od 230 kDa dla szczepu WX-1 do 16 kDa dla szczepu WX-7. Każdy szczep, z wyjątkiem Hb, miał polipeptydy obejmujące kompleks toksyn w przedziałach od 160 do 230 kDa, od 100 do 160 kDa i od 50-80 kDa. Te dane wskazują na fakt, że kompleks toksyn może różnić się składem peptydowym i składnikami w zależności od szczepu. Jednak we wszystkich przypadkach właściwości toksyny wydają się związane z dużym, oligomerycznym kompleksem białkowym.

186 242

Tabela 20

Charakteryzacja kompleksu toksyn, z szczepów Photorhabdus innych niż W-14

Szczep	Przybliżona natywna masa cząsteczkowa molekuł3	Wydajność Frakcja aktywna (mg/l)b
H9	972 000	1,8
Hb	777 000	7,0
Hm	1,400 000	1,1
HP88	813 000	2,5
NCl	1 092 000	3,3
WIR	979 000	1,0
WX-1	973 000	0,8
WX-2	951 000	2,2
WX-7	1 000 000	1,5
WX-12	898,000	0,4
WX-14	1 900 000	1,9
W-14	860 000	7,5

^a naturalna masa cząsteczkowa oznaczona przy użyciu kolumny Pharmacia HR 16/50 z Sepharose CL4B ^b Ilość kompleksu toksyn w bulionie hodowlanym.

Spektrum działania

Jak przedstawiono w tabeli 21, kompleksy toksyn oczyszczone z szczepów Hm i H9 były badane pod kontem aktywności wobec różnych owadów w porównaniu z kompleksem toksyn ze szczepu W-14. Próbki zostały dobrane tak jak opisano w przykładzie XIII. Kompleks toksyn ze wszystkich trzech szczepów wykazujących aktywność przeciwko ćmie Heliothis virescens, omacnicy prosowianki Ostrinia nubilalis, południowej kukurydzianej stonki korzeniowej (Diabrotica undecimpunctata-howardi) i Macrosteles fascifrons. Dodatkowo kompleks toksyn ze szczepów Hm i W-14 również wykazujący aktywność przeciwko Tetranychus urticae. Ponadto kompleks z W-14 był aktywny przeciwko larwom komara. Te dane dowodzą, że kompleks toksyn, mający pewne podobieństwa pomiędzy pewnymi rzędami owadów, mogą również wykazywać różne aktywności przeciwko innym rzędom insektów.

Tabela 21

Przybliżone wielkości (w kDa) peptydów w oczyszczonych kompleksach toksyn innych Photorhabdus niż z W-14

H9	Hb	Hm	HP-88	NC-1	WIR	WX-1	WX-2	WX-7	WX-12	WX-14	W-14
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
180	150	170	170	180	170	230	200	200	180	210	190
170	140	140	160	170	160	190	170	180	160	180	180
160	139	100	140	140	120	170	150	110	140	160	170
140	130	81	130	110	110	160	120	87	139	120	160
120	120	72	129	44	89	110	110	75	130	110	150
98	100	68	110	16	79	98	82	43	110	100	130
87	98	49	100		74	76	64	33	92	95	120

186 242 ciąg dalszy tabeli 21

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
84	88	46	86		62	58	37	28	87	80	110
79	81	30	81		51	53	30	26	80	69	93
72	75	22	77		40	41		23	73	49	90
68	69	20	73		39	35		22	59	41	77
60	60	19	60		37	31		21	56	33	69
57	57		58		33	28		19	51		65
52	54		45		30	24		18	37		63
46	49		39		28	22		16	33		60
40	44		35		27				32		51
37	39				25				26		45
	37				23						40
	35										39
											29

Tabela 22

Zaobserwowane spektrum działania owadobójczego oczyszczanego kompleksu toksyn ze szczepów Photorhabdus

Szczepy Photorbabdus	Wrażliwe* gatunki owadów
kompleks toksyn Hm	1**,2, 3, 5, 6, 7,8
kompleks toksyn H9	12, 3,6, 7,8
kompleks toksyn W-14	12, 3,4, 5, 6, 7, 8

- 25% śmiertelności lub wzrost zahamowania ** = 1; ćma Heliothis virescens, 2; omacnica prosowianka Ostrinia nubilalis, 3; południowa kukurydziana stonka korzeniowa (Diabrotica undecimpunctata-howardi), 4; komar, 5; Tetranychus urticae, 6; Macrosteles fascifrons, 7; muszka owocówka, 8; Anthonomous grandis grandis (kwieciak bawełnowiec).

Przykład XV.

Subfrakcjanowanie białka w kompleksie toksyn Photorhabdus

Białkowy kompleks toksyn Photorhabdus wyizolowano jak opisano w przykładzie XIV. Następnie 10 mg toksyny nanoszono na kolumnę Mono Q 5/5 zrównoważoną 20 mM TrisHCl, pH 7,0 przy szybkości przepływu na poziomie 1 ml/min. Kolumnę przemyto 20 mM Tris-HCl, pH 7,0 aż gęstość optyczna 280 nm wróciła do linii zerowej absorbancji. Białka związane z kolumną wymyto gradientem liniowym 0-1,0 M NaCl w 20 mM Tris-HCl, pH 7,0 przy 1 ml/min przez 30 min. 1 ml frakcji zebrano i poddano oznaczeniu biologicznemu na południowej kukurydzianej stonce korzeniowej (SCR) (patrz przykład XIII). Najwyższe aktywności zostały oznaczone przez serię rozcieńczeń każdej frakcji w oznaczeniach biologicznych wobec południowej kukurydzianej stonki korzeniowej (SCR). Zaobserwowano dwa piki aktywności wobec kukurydzianej stonki korzeniowej (SCR) i nazwano je A (wymywanie przy około 0,2-0,3 M NaCl) i B (wymywanie przy około 0,3-0,4 M NaCl) Piki aktywności A i B zebrano oddzielnie i oba następnie oczyszczono stosując trzystopniową procedurę opisaną powyżej.

Stały (NH4)2SO4 dodano do powyższej frakcji białka do końcowego stężenia 1,7 M. Białka nanoszono na kolumnę fenylo-Superose 5/5 zrównoważoną 1,7 M (NH-ibSCO w 50 mM roztworu buforowego fosforanu potasu, pH 7 przy 1 ml/min. Białka związane z kolumną wymyto przy gradiencie liniowym wynoszącym 1,7 M (NH4)SO4, 0% glikol etylenowy, 50 mM

186 242 fosforanu potasu, pH 7,0 do 25% glikolu etylenowego, 25 mM fosforan potasu, pH 7,0 (bez (NH^SO-ł) przy 0,5 ml/min. Frakcje dializowano przez noc w 10 mM roztworze fosforanu sodu, pH 7,0. Aktywność każdej frakcji wobec kukurydzianej stonki korzeniowej (SCR) oznaczono biologicznie. Najbardziej aktywne frakcje zostały połączone i naniesione na kolumnę Mono Q 5/5, zrównoważoną 20 mM Tris-HCl, pH 7,0 przy 1 ml/min. Białka związane z kolumną wymyto przy gradiencie liniowym 0-10 M NaCl w 20 mM Tris-HCl, pH 7,0.

W ostatnim etapie oczyszczania powyższe najbardziej aktywne frakcje (oznaczone w oznaczeniu na SCR) zostały zebrane i podane na kolumnę fenylo-Suserose 5/5. Dodano stały (NHąhSOzi, uzyskując końcowe stężenie 1,7 M. Roztwór następnie naniesiono na kolumnę zrównoważoną 1,7 M (NFLthSCh w 50 mM roztworze buforowego fosforanu potasu, pH 7 przy 1 ml/min. Białka związane z kolumną wymyto gradientem liniowym od 1,7 M (NHąfrSCU, 50 mM roztwór fosforanu potasu, pH 7,0 do 10 mM fosforanu potasu, pH 7,0 przy 0,5 ml/min. Frakcje dializowano przez noc 10 mM roztworem fosforanu sodu, pH 7,0. Aktywność każdej frakcji wobec kukurydzianej stonki korzeniowej (SCR) mierzono oznaczeniem biologicznym.

Ostatecznie oczyszczone powyższą trzystopniową procedurą białko z piku A zostało nazwane toksyną A i oczyszczone białko z piku B zostało nazwane toksyną B. Charakteryzacja i sekwencjonowanie aminokwasów toksyny A i toksyny B. W analizie SDS-PAGE stwierdzono, że obie toksyny A i B obejmują dwa zasadnicze peptydy (90% całego białka wybarwionego Coomassie): 192 kDa (nazwany odpowiednio Al i BI) i 58 kDa (odpowiednio nazwany A2 i B2). Obie toksyny A i B ujawniają tylko jedno główne pasmo w analizie natywnej PAGE, wskazując że Al i A2 sąpodjednostkami jednego kompleksu białkowego i BI i B2 sąpodjednostkami jednego kompleksu białkowego. Ponadto, określono metodą żelowej chromatografii filtrującej, że naturalna masa cząsteczkowa obu toksyn A i B wynosi 860 kDa. Względne stężenia molowe Al do A2 oceniono, że wynoszą 1 do 1 równoważnika jak określono stosując analizę densytometryczną żelu SDS-PAGE. Podobnie, peptydy BI i B2 byty obecne w tym samym stężeniu molowym.

Toksyny A i B były poddane elektroforezie w 10% SDS-PAGE i przeniesiono na filtr PVDF. Bioty przesłano do analizy aminokwasowej i sekwencjonowania aminokwasów Nkońca do Harward MicroChem i do Cambridge ProChem. Stwierdzono, że sekwencja aminokwasów na N-końcu BI jest identyczna z SEQ ID NO: 1, obszar TcbAjj; genu tcbA (SEQ ID NO: 12, pozycje od 87do 99). Wyjątkowa sekwencja N-końca została znaleziona w peptydzie B2 (SEQ ID NO:40). N-końcowa sekwencja aminokwasowa peptydu B2 była identyczna z obszarem TcbAjjj uzyskanej sekwencji aminokwasowej na podstawie genu tcbA (SEQ ID NO: 12, pozycje od 1935 do 1945). Zatem, toksyna B zawierała przeważnie dwa peptydy TcbAjj i TcbA,,,, które jak zaobserwowano można otrzymać z tego samego produktu genu, TcbA.

N-końcowa sekwencja aminokwasowa A2 (SEQ ID NO:41) była niepowtarzalna w porównaniu do peptydu TcbAjjj i innych peptydów. Peptyd A2 oznaczono jako TcdAjjj (patrz przykład XVII). Wyznaczono, że SEQ ID NO:6 jest mieszaniną sekwencji aminokwasowych SEQ ID NO:40 i 41.

Peptydy Al i A2 następnie poddano wewnętrznemu sekwencjonowaniu aminokwasów. Do sekwencjonowania wewnętrznych aminokwasów, 10 μg toksyny A poddano elektroforezie w 10% SDS-PAGE i przeniesione na filtr PVDF. Po wybarwieniu czernią amidową peptydy Al i A2 oznaczone odpowiednio TcdAjj i TcdAjjj wycięto z filtrów i wysłano do Harward MicroChem i do Cambridge ProChem. Peptydy poddano trawieniu trypsyną, a następnie chromatografii HPLC aby wydzielić poszczególne peptydy. Analizę N-końcowych aminokwasów przeprowadzono na wybranych fragmentach peptydów po trawieniu trypsyną. Stwierdzono, że dwie wewnętrzne sekwencje peptydu Al (TcdAjj-PK.71, SEQ ID NO:38 i TcdA„-PK44, SEQ ID NO:39) mają znaczące homologie z wyznaczonymi na podstawie DNA sekwencjami regionu TcbA,, genu tcbA (SEQ ID NO: 12). Podobnie N-końcowa sekwencja SEQ ID NO:41 i dwie wewnętrzne sekwencje peptydu A2 (TcdAj,j-PK57, SEQ ID NO:42 i TcdAj„-PK20, SEQ ID NO: 43) również wykazują homologie z wyznaczonymi na podstawie DNA sekwencjami regionu TcbAj.j genu tcbA (SEQ ID NO: 12),

Podsumowując powyższe wyniki, kompleks toksyn ma co najmniej dwa aktywne kompleksy białek przeciw SCR; toksyna A i toksyna B mają podobne masy cząsteczkowe całko62

186 242 wite i od0jr0odstek, jednakże ich skład peptyOowy jest różny. Toksyna C zawiera jako główne peptydy TcdAii i TcOAiii, a toksyna B zawiera j-ko główne peptydy TcbCii i tcbAjii.

Przykład XVI.

Trawienie i aktywacja peptydu TcbA

W kompleksie toksyny B peptydy TcbCii i TcbCiii pochodzą z pojedynczego produktu genu TcbC (przykład XV). Obróbka peptydu TcbA prowadząca do uzyskania TcbCii i TcbA,,, jest z-ioicjownon przypuszczalnie przez działanie proteo-a3y) Photorhabdus, r najbardziej prawdopodobnie przez metaróprotazy opisane w przykładzie X. W niektórych przypadkach znobserwdwroo, że podczas procesu otrzymywania bulionu Photorhabdus W-14, peptyd TeaG był obecny w kompleksie toksyny B jako główny jej składnik, oprócz peptydów TcbCii i TcbA,,,. Identyczne procedury opisane w przypadku oczyszczania kompleksu toksyny B (przykład XV) są stosowane do wzbogacenia w peptyd TcbA z frakcji kompleksu toksyn w bulionie W- 14. Ostatecznie oczyszczony materiał aoalizownnd w analizie SDS-PCTE o gradiencie 4-20%, a główne peptydy ozonezaoo denyytometryczoie. Ustalono, że TcbA, TcbAii i TcbCiii zawierają odpowiednio 58%, 36% i 6% całego białka. Tożsamość tych orotydów potwierdzono przez ich odpowiednie wielkości cząstek oznaczone metodą SDS-PCTE i analizy Western błot przy użyciu monospecyficzoych przeciwciał. Masa cząsteczkowa naturalnych tej frakcji wynosiła 860 kDa.

Gięcie TcbA oszacowano przez poddanie działaniu powyższego oczyszczonego materiału z oczyszczonymi metnldprotenznmi 38 kDa i 58 kDa z Photorhabdus W-14 (przykład X) oraz trypsynie jako enzymowi kontrolnemu (Sigma, MO). Standardowa renkcjn obejmowała 17,5 pg poww^i^^ziz oezyszczooej Τι^Ι-οΙΚ 1 ,5 j βάοο^Ι^ proteazy y 0 ,1 M baf(fdl TTri pH 8,0 w całkowitej objętości 100 μg. W reakcji kontrolnej prote-zy zostały pominięte. Mieszaniny reakcyjne inkubow-no przez 90 min przy 37°C. Po0 koniec reakcji pobrano 20 μg i gotowano wraz z buforem Oo próbek SDS-PAGE w celu przeprowadzenia natychmiastowej analizy elektroforetycznej w gradiencie 4-20% SDS-PCTE. Określono na podstawie SDS-PCGE, że przy obu protenanch 38 kDa i 58 kDa ilość peptydów AcbG,i i TeaCiii wzrosła 3-krotnie, po0czas gdy ilość TcbC proporcjonalnie spadła (tabela 23). Względne zmniejszenie i zwiększenie ilości wybranych orotydów potwierdzono przez analizy blotingu Westema. Ponadto, filtracja w żelu trawionego materiału pokraaOn, że naturalna masa cząsteczkowa kompleksu jest taka srmn. Po Ozinłrniu trypsyną peptydy TcbA i TcbCii uległy niespecyficznemu trawieniu na małe peptydy. Ao świadczy o tym, że proterzy 38 kDa i 58 kDa Photorhabdus mogą w specyficzny sposób powodować powstanie peptydów TcbAii i TcbAin z TcbT. Kontrole poddane działaniu i nie poddane działaniu proteazy pozostałych 80 μg mieszaniny reakcyjnej poddano kolejnym rozcieńczeniem w 10 mM roztworze fosforanu sodu, pH 7,0 i annliaowaoo oaoacanjąe biologicznie wobec SAR. Przez porówn-nie aktywności kolejnych rozcieńczeń określono, że w przypadku prote-zy 38 kDa aktywność owadobójcza wobec kukurydzianej stonki korzeniowej (SCR) wzrosła około 3-4 razy. Zahamowanie wzrostu tych owadów również było wyższe niż w grupie kontrolnej (tabela 23).

Tabela 23

Przekształcenie i aktywacja peptydu CcbT w peptydy CcbA,, i CcbA,·,, przez działanie protenzą

	Kontrola	Oziałanie proteazy 38 kDa
S0 (% całkowitej ilości białka)	58	18
S1 (%całkowitej ilości białka)	36	64
S9 (%cnłkowitej ilości białka)	6	18
LD50 Olg białka)	2,1	0,52
masa SAR (mg/owada)*	0,2	0,1

oznaczenie zahamowania wzrostu przez mierzenie średniej masy owadów żywych po 5 dniach odżywiania badana próbą

186 242

Przykład XVII

Przeszukiwanie biblioteki genu kodującego peptyd TcdA,j

Przeprowadzono klonowanie i charakterystykę genu kodującego peptyd TcdA„, opisanego jako SEQ ID NO: 17 (sekwencja N-końcowa peptydu wewnętrznego TcdAii-PT1 11) i SEQ ID NO: 18 (sekwencja N-końcowa peptydu wewnętrznego TcbA„-PT79). Zsyntetyzowano dwa zestawy zdegenerowanych oligonukleotydów zaprojektowanych, aby kodowały sekwencje aminokwasowe SEQ ID NO: 17 (tabela 24) i SEQ ID NO: 18 (tabela 25) i przeciwnie skierowane nici komplementarne tych sekwencji, jak opisano w przykładzie VIII. Sekwencje DNA oligonukleotydów podano niżej:

Tabela 24

Zdegenerowany oligonukleotyd dla SEQ ID NO: 17

P2-PT111	1	2	3	4	5	6	7	8
aminokwas	Ala	Phe	Asn	Ile	Asp	Asp	Val	Ser
kodony	5'GCN	TT(T/C)	AA(T/C)	AT(T/C/A)	GA(T/C)	GA(T/C)	GTN 3'
P2.3.6.CB	5' GC(A/C/G/T)	TT(T/C)	AAT	ATT	GAT	GAT	GT 3'
P2.2.3.5	5' GC(A/C/G/T)	TT(T/C)	AA(T/C)	AT(T/C/A)	GA(T/C)	GAT(T/C)	GT 3'
P2.3.5R	5 AC	(G/A)TC	(G/A)TC	(T/G/A)AT	(G/A)TT	(G/A)AA	(A/C/G/T)GC 3'
P2.3.5RI	5' ACI	TCI	TCI	ATI	TTI	AAI	GC 3'
P2.3R.CB	5'CAG	(AG)CT	(A/C)AC	ATC	ATC	AAT	ATT	AAA 3'

Tabela 25

Zdegenerowapy oligonukleotyd dla SEQ ID NO: 18

P2-PT79

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Aminokwas

Phe

Ile

Val

Tyr

Thr

Ser

Leu

Gly

Val

Asn

Pro

Asn

Asn

Kodony

5'TTY

ATH

GTN

TAY

ACN

6

6

GGN

GTN

AAY

CCN

AAY

AAY 3'

P2.79.2

5'TTY

ATY

GTK

TAT

ACY

TCI

ytr

GGY

GTK

AAT

CCR

AAT

AAT 3'

P2.79.3

5'TTY

ATT

GTK

TAT

ACY

AGY

ytr

GGY

GTK

AAT

CCR

AAT

AAT 3'

P2.79.R1

5'TTY

ATT

YGG

ATT

MAC

RCC

yar

RCT

RGT

ATA

MAC

AAT

AAA 3'

P2.79R.CB

5'TTY

ATT

YGG

ATT

MAC

ACC

cag

RCT

GGT

ATA

MAC

AAT

AAA 3'

zgodnie z kodem IUPAC-IUB nukleotydów, Y = C, lub T,' H = A, ' C lub T, N = A, C, G lub T,K = G lub T, R = A lub G, i M = A lub C

Łańcuchowe reakcje polimerazy (PCR) zasadniczo przedstawiono w przykładzie VIII używając jako zgodnych starterów P2.3.6.CB lub P2.3.5, oraz odwrotnych starterów P2.79.R.1 lub P2.79R.CB we wszystkich zgodnie z kierunkiem transkrypcji i w kierunku przeciwnym kombinacjach stosując DNA Photorhabdus W-14 jako matrycy. W innym zestawie reakcji startery P2.79.2 lub P2.79.3 zostały użyte jako zgodne z kierunkiem, aP2.3.5R, P2.3.5RI i P2.3R.CB jako przeciwne do kierunku we wszystkich kombinacjach zgodnie z kierunkiem i przeciwnie. Tylko w reakcjach zawierających P2.3.6.CB jako zgodne startery w połączeniu z P2.79.R.1 lub P2.79R.CB jako startery odwrotne, obserwowano nieprzypadkowo zanplifikowapy produkt o przybliżonej wielkości 2500 par zasad (ruchliwość w żelach agarowych). Kolejność starterów użytych do uzyskania tego produktu amplifikacji wskazuje, że fragment peptydu TcdA„-PT111 leży amino·) proksynalpie w stosunku do fragmentu TcdA,j-PT79.

Produkty PCR o 2500 parach zasad wligowano do wektora plazmidowego pCR™II (kwitrogem San Diego, CA) zgodnie z instrukcją, a sekwencje DNA między końcami wprowadzonych fragmentów dwóch izolatorów (HS24 i HS27) określono używając startery wska64

186 242 zanych przez producenta i metody sekwencjonowania opisane wcześniej. Sekwencje obydwu izolatorów były jednakowe. Nowe startery syntetyzowano na w oparciu o wyznaczoną sekwencję i użyto do zapoczątkowania dodatkowych reakcji sekwencjonowania, aby otrzymać ogółem 2557 zasad insertu [SEQ ID NO:36]. Translacja częściowego peptydu kodowanego przez SEQ ID NO: 36 prowadził do 845 aminokwasowej sekwencji ujawnionej jako SEQ ID NO:37. Analiza homologii białek tej części fragmentu peptydu TcdA wykazuje zasadniczą homologię aminokwasową (68% podobieństwa, 53% identyczności) do reszt od 542 do 1390 białka TcbA [SEQ ID NO: 12]. Jest więc oczywiste, że gen przedstawiony częściowo przez SEQ ID NO:36 wytwarza białko podobne, ale nie identyczne z białkiem TcbA, które prawdopodobnie ma podobne, ale nie identyczne właściwości biologiczne jak białko TcbA.

W innym przypadku, wyizolowano gen kodujący peptydy TcdTji-PK44 i N-końcowy peptyd 58 kDa TcdA^ opisano jako SEQ ID NO:9 (wewnętrzna sekwencja peptydu TcdA„PK44) i SEQ ID NO:41 (sekwencja N-końcowego peptydu TedA^ 58 kDa). Zsyntetyzowano dwa zestawy zdegenerowanych oligonukleotydów przeznaczonych do kodowania sekwencji aminokwasowych oznaczonych jako SEQ ID NO:39 (tabela 27) i SEQ ID NO:41 (tabela 26) oraz przeciwne komplementy tych sekwencji, jak opisano w przykładzie VIII i ich sekwencje DNA.

Tabela 26

Zdegenerowane oligonukleotydy dla SEQ ID NO:41

Kodon#

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Aminokwas

Leu

Agr

Ser

Ala

Asn

Thr

Leu

Thr

Asp

Leu

Phe

Leu

Pro

Gln

A2.1

5' YTR

OGY

AGY

GCI

AAT

ACY

YTR

ACY

GAT

YTR

TTT

YTR

OCR

CA 3'

A2.2

GCI

AAT

ACI

YTR

ACI

GAY

YTR

TTY

YTR

OCI

CA 3'

A2.3.R

5'TG

YGG

YAR

AAA

YAR

RTC

RGT

YAR

RGT

RTT

IGC

RCT

ROG 3'

A2.4.R

5 TG

IGG

CAG

AAA

CAG

RTC

IGT

CAG

IGT

ATT

IGC 3'

Tabela 27

Zdegenerowane oligonukleotydy dal SEQ ID NO: 39

Aminokwas #	(8)	(9)	(10)	(11)	(12)	(13)	(14)	(15)	(16)
kodon #	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Aminokwas	Gly	Pro	Val	Glu	Ile	Asn	Thr	Ala	Ile
A1.44.1	5'GGY	CCR	GTK	GAA	ATT	AAT	ACC	GCI	AT 3'
A1.44.1R	5 ATI	GCG	GTA	TTA	ATT	TCM	ACY	GGR	CC 3'
A1.44.2	5'GGI	CCI	GTI	GAR	ATY	AAY	ACI	GCI	AT 3'
A1.44.2R	5 ATI	GCI	GTR	TTR	ATY	TCI	ACI 1	GGI	CC 3'

Łańcuchowe reakcje polimerazy (PCR) zasadniczo przedstawiono w przykładzie VIII używając jako zgodnych starterów A 1.44.1 lub A1.44.2 oraz odwrotnych starterów A2.3R lub A2.4R we wszystkich zgodnie z kierunkiem transkrypcji i w kierunku przeciwnym kombinacjach stosując DNA Photorhabdus W-14 jako matrycy. W innym zestawie reakcji startery A2.1 lub A2.2 zostały użyte jako zgodne z kierunkiem, a A1.44.1R i A1.44.2R ji&o przeciwne do kierunku we wszystkich kombinacjach zgodnie z kierunkiem i przeciwnie. Tylko w reakcjach zawierających A 1.44.1 lub A 1.44.2 jako zgodne startery w połączeniu z A2.3R jako startery odwrotne, obserwowano nieprzypadkowo zamplifikowany produkt o przybliżonej wielkości 1400 par zasad (ruchliwość w żelach agarowych). Kolejność starterów użytych do uzyskania tego produktu amplifikacji wskazuje, że fragment peptydu TcdAi-PK44 leży amino proksymalnie w stosunku do fragmentu 58 kDa TcdA,,,.

186 242

Produkty PCR o 1400 parach zasad wligowano do wektora plazmidowego pCR™II (Invitrogen, San Diego, CA) zgodnie z instrukcją, a sekwencje DNA między końcami wprowadzonych fragmentów czterech izolatorów określono używając startery wskazanych przez producenta i metody sekwencjonowania opisane wcześniej. Sekwencje wszystkich izolatorów różniły się zgodnie z przewidywaniami, w rejonach odpowiadających sekwencjom zdegenerowanych starterów, lecz sekwencje aminokwasowe wyznaczone na podstawie tych danych były takie same jak rzeczywiste, wcześniej określone, sekwencje aminokwasowe peptydów , (SEQ ID NO:41 i 39).

W wyniku przeszukiwania kosmidowej biblioteki genomowej W-14 jak opisano w przykładzie VIII przy pomocy znakowanej radioaktywnie sondy zawierającej DNA otrzymane powyżej (SEQ iD NO:36) wykryto pięć hybrydyzujących kosmidowych izolatorów nazwanych 17D9, 20B10, 21D2, 27B10 i 26D1. Kosmidy te różniły się od uprzednio zidentyfikowanych za pomocą sond odpowiadających genom opisanym jako SEQ iD NO: 11 lub SEQ ID NO:25. Analiza enzymami restrykcyjnymi i analiza biotów hybrydyzacji DNA wykazała trzy fragmenty EcoRI o przybliżonych wielkościach 3,7, 3,7 i 1,1 tys. par zasad, które obejmowały region zawierający DNA SEQ ID NO:36. W wyniku przeszukiwania kosmidowej biblioteki genomowej W-14 przy użyciu jako sondy znakowanego radioaktywnie 1,4 tys. par zasad fragmentu DNA otrzymanego w tym przykładzie zidentyfikowano pięć takich samych kosmidów (17D9, 20B10, 21D2, 27B10 i 26d1). Bioty hybrydyzacji DnA z DNA kosmidowym trawionym EcoRI pokazują hybrydyzację z tą samą podgrupą fragmentów EcoRI jak obserwowano przy sondzie genu TcdA,,, 2,5 tys. par zasad wskazujących, że oba fragmenty są kodowane przez genomowy DNA.

Określenie sekwencji DNA sklonowanych fragmentów EcoRI pokazało nieprzerwaną ramkę odczytu o 7551 par zasad (SEQ ID NO:46), kodującą białko 282,9 kDa zawierające 2516 aminokwasów (SEQ ID NO:46). Analiza sekwencji aminokwasowej tego białka wykazała wszystkie oczekiwane wewnętrzne fragmenty peptydów TcdAii (SEQ ID NO: 17, 18, 37, 38, 39) i peptyd N-końcowy TcdA^ (SEQ ID NO:41) i wszystkie peptydy wewnętrzne TcdA„, (SEQ ID NO:42 i 43). Peptydy wyizolowane i określone jako TcdA,j i TcdAii są produktem otwartej ramki odczytu, nazwanej tcdA określonej jako SEQ ID NO:46. Następnie SEQ ID NO:47 pokazuje, zaczynając od pozycji 89 sekwencję ujawnioną jako SEQ ID NO: 13, która jest sekwencją N-końcową peptydu o wielkości około 201 kDa, co wskazuje że białko początkowe otrzymywane z SEQ iD NO: 46 jest poddane obróbce w ten sam sposób co opisane wyżej przy sEq ID NO: 12. Dodatkowo białko jest następnie cięte, aby wytworzyć produkt o wielkości 209,2 kDa, kodowany przez SEQ ID NO: 48 i przedstawiony jako SEQ ID NO: 49 (peptyd TcdA„) i produkt o wielkości 63,5 kDa kodowany przez SEQ ID NO:50 i przedstawiony jako SEQ ID NO:51 (białko TcdAi,). Sądzi się więc, że działanie owadobójcze zidentyfikowane jako toksyna A (przykład XV) otrzymywane z produktów SEQ ID NO:46, jakim jest przykładowo białko o pełnej długości 282,9 kDa określone jako SEQ ID NO: 47 jest poddane dalszej obróbce do wytworzenia peptydów określonych jako SEQ ID NO: 49 i 51. Sądzi się więc, że działanie owadobójcze zidentyfikowane jako toksyna B (przykład XV) otrzymywane z produktów SEQ ID NO:11, jakim jest przykładowo białko o pełnej długości 280,6 kDa określone jako SEQ ID NO: 12. To białko jest poddane obróbce proteolitycznej w celu wytworzenia peptydu 207,6 kDa określonego jako SEQ ID NO: 53, który jest kodowany przez SEQ ID NO: 52 i peptydu 62,9 kDa mającego sekwencję N-końcową określoną jako SEQ ID NO: 40, a następnie określoną jako SEQ ID NO:55, która jest kodowana przez SEQ ID NO: 54.

Porównywanie sekwencji aminokwasowych białek określonych jako SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO:47 wykazało, że wykazują one 69% podobieństwa i 54% identyczności. Tak duży stopień pokrewieństwa ewolucyjnego, nie jest jednakowy w obrębie całej sekwencji aminokwasowej tego białka, ale jest wyższy w kierunku końca tego białka, zakończonego grupą karboksylową, gdyż peptydy ujawnione jako SEQ ID NO:51 (otrzymana z SEQ ID NO:47) i SEQ ID NO:55 (z SEQ ID NO: 12) mają 76% podobieństwa i 64% identyczności.

186 242

Przykł-0 XVIII

Kontrola omacnicy prosowi-nki (Ostrinia nubilalis) o0powie0yi-loej za niszczenie liści kukurydzianych prowr0aoo- przez rozpylenie bulionu zawierającego Photorhabdus (d0mison W-14).

Zdolność toks^y) z Photorhabdus do zmniejszenia zniszczenia roślin spowodowanego przez larwy owadów została zademonstrowana przez zmierzenie zniszczenia liścia przez omacnicę prosowi-nkę (Ostrinia nubilalis) umieszczoną na kukurydzy i poddaną działaniu bulionu Photorhabdus. Bulion fermentacyjny szczepu W-14 Photorhabdus wyprodukowano i zatężono około 10krotnie przez ultra filtrowanie (rozmiar por do masy cząst. 10,030) jrk opisano w przykładzie X///. Otrzymany zatężony bulion hodowlany został sterylizowano przez filtrację przy użyciu filtrów z nitrocelulozową membraną 0,2 mikrona. Podobnie przygotowaną próbkę nieyzezeoiooej pożywki 2% Proteose Peptone #3 użyto jako kontroli. Rośliny kukurydzy 3DowElrned zastrzeżona wsobna linia) wyhodowano z nasion do 7 lub 8 stadium wegetacyjnego w pojemnikach zawierających mieszankę bezglebową w szklarni (w dzień 27°C; nocą 22°C, około 50% RH, 54-go0zinoy dzień, podlewana/nawożona zgodnie z potrzebami). Rośliny testowe ułożono w losowo dobranych pełnych blokowych układach (3 pdwtórzrnis/trsktowsnie, 6 rdślin/trnktownoie) w szklarni o temperaturze około 22°C w dzień; nocą 18°C, bez sztucznego oświetlenia i z częściowym zacienieniem, przy około 50% RH podlewanie, nawożenie zgodnie z potrzebami. Pd0dnwnnie działaniu (pożywki oieszczepidne i zatężony bulion hodowlany Photorhabdus) rozpylono, rozpylaczem strzykawkowym, nnooszdnd 2,0 ml bezpośrednio (z około 15 cm (6 cali)) na okółek i dodatkowe 2,0 ml okrężnym ruchem z wysokości około 25 cm (1 stopy) nad okółkiem. Dodatkowo w jednej grupie roślin nie przeprowadzono tego oprysku. Po wyschnięciu oprysków (przez około 30 min.), dwanaście świeżo wylęgłych larw omacnicy prosowi-nki (Ostrinia nubilalis) (jaja pozyskane ze źródeł komercyjnych i wylęgłe w hodowli) nanoszono bezpośrednio na okółek. Po upływie tygodni- zmierzono straty liści u roślin przy użyciu zmodyfikowanej skali Tuthrie'a^XXI, a wyniki porównano statystycznie (test C (LSD) P<0,05 i ytudeotyzowanych rang Tukey'n (HSD) Test P < 0,1). Wyniki przedstawiono w tabeli nr 28. W odniesieniu do oznaczeń liczbowych, wynik 1 wskazuje na brak uszkodzeń, wynik 2 wskazuje na drobne uszkodzenia typu „szyba dkiroon” na nie zwiniętym liściu bez uszkodzenie żyłek, r wynik 5 wskazuje nr przedziurawienie liścia z wydłużonymi uszkodzeniami i/lub uszkodzenia środkowego nerwu liścia na co najmniej trzech liściach (uszkodzenia < 2,5 cm). Te dane dowodzą że bulion hodowlany lub inne frakcje zawierające białka mogą zapewnić ochronę przeciw poszczególnym owadom, gdy zostaną dostarczone w postaci preparatu do rozpylania lub kiedy gen lub jego pochodne, kodujące białko lub jego część, są dostarczane przez roślinę transgeoiczoą lub mikroorganizm.

Tabela 28

Wpływ bulionu hodowlanego Photorhabdus nn uszkodzenia liści kukurydzy powodowane przez omacnicę prosowi-nkę (Ostrinia nubilalis)

Traktowanie	Przeciętne wyniki Tuthrie'a
Brak traktowania	5.02-
Aieyzearpidoa pożywka	5.15-
bulion hodowlany Photorhabdus	2.24b

Średnie o różnych literach różnią się statystycznie (p < 0,05 lub p < 0,1)

Przykład XIX

Inżynieria genetyczna genów w celu uzyskania ekspresji w E. coli

Podsumowanie konstrukcji.

W celu uzyskania ekspresji genu tcbA Photorhabdus W-14 w Escherichia coli skonstrudwaod serie plrzmidów. Lista plaami0ów jest pokazana w tabeli nr 29. Załączono krótki opis krżOej konstrukcji jak i podsumowanie pozyskanych danych o ekspresji w E. coli.

186 242

Tabela 29

Wyrażenie plazmid dla genu tcbA

Plazmid	Gen	Wektor/selekcja	Przedział
pDAB634	tcbA	pBC/Chl	W ewnątrzkomórkowo
pAcGP67B/tcbA	tcbA	PAcGP67B/Amp	Wydzielanie, Baculovirus
pDAB635	tcbA	pET27b/Kan	Okołopazmatycznie
pET15 - tcbA	tcbA	pET15 - tcbA	Wewnątrzkomórkowe»

Skróty: Kan = Kanamycyna, Chi = chloramfenikol, Amp = ampicylina

Konstrukcja pDAB634

W przykładzie IX opisano duży fragment EcoRI, który hybrydyzuje z sondą TcbA, Ten fragment subklonowano z pBC (Stratagene, La Jolla, CA). Analiza sekwencji wykazała, że ten fragment składa się z 8816 par zasad. Fragment obejmuje gen tcbA wraz z początkowym ATG w pozycji 571 i końcowym TAA w pozycji 8086. Ten fragment przenosi zatem 730 par zasad DNa z Photorhabdus powyżej ATG i 730 pary zasad poniżej TAA.

Konstrukcja plazmidu pAcGP67B/tcbA

Gen tcbA amplifikowano metodą PCR stosując następujące startery:

starter 5' (SIAc51) 5' TTT AAA CCA TGG GAA ACT CAT TAT CAA GCA CTA TC

3' i starter 3' (S1Ac31) 5' TTT AAA GCG GCC GCT TAA CGG ATG GTA TAA CGA ATA TG 3'. PCR wykonano stosując zestaw TaKaRa LA PCR z PanVera (Madison, Wisconsin) w następującej reakcji: 57,5 ml wody, 10 ml 10 x bufor LA, 16 ml dNTPs (2,5 mM każdy roztwór wyjściowy), 20 ml każdego startera o stęż 10 pmoli/ml, 300 ng plazmidu pDAB634 zawierającego gen tcbA W-14 i 1 ml polimerazy Taq TaKaRa LA. Warunki cyklicznych zmian były następujące 98°C/20 sek., 68°C/5 min, 72°C/10 min. przez 30 cykli. Produkt PCR o spodziewanej wielkości 7526 par zasad wyizolowano z 0,8% żelu agarowego w buforze TBE (100 mM Tris, 90 mM kwasu borowego, 1 mM EDTA) i oczyszczono stosując zestaw Qiagen II z Qiagen (Chatsworth, Kalifornia). Oczyszczony gen tcbA trawiono Ncol i Notl i wligowany do baculowirusowego wektora transferowego pAcGP67B (PharMingen (San Diego, Kalifornia) i transformowano nim DH5a E. coli. Gen tcbA został następnie wycięto z pAcGP67B i przeniesiono do pET27b aby utworzyć plazmid pDAB635. Mutacja sensu w genie tcbA została naprawiona w pDAB635.

Naprawiony gen tcbA zawierał dwie zmiany w stosunku do sekwencji pokazanej w SEQ ID NO:11, A>G w pozycji 212 zmieniająca resztę asparaginy 71w seryny 71 i G>A w 229 zmieniająca resztę alaniny 77 w treoniny 77. Obie zmiany nastąpiły w górę od omawianego N-końca TcbAjj.

Konstrukcja pET15-tcbA

Kodujący rejon pDAB635 genu tcbA przeniesiono do wektora pET15b. Zostało to dokonane przy użyciu ligacji wielokierunkowej, DNA pocięto enzymami restrykcyjnymi Ncol i Xhol. Uzyskany produkt rekombinacji nazwano pET15-tcbA.

Ekspresja z plazmidu pET15-tcbA, TcbA w E. coli.

Ekspresję tcbA w E. coli uzyskano przez modyfikację znanej metody. Kompetentne komórki E. coli szczep BL21(DE3) transformowano pET15-tcbA i wysiano na pożywce agarowej LB zawierającej 100 pg/ml ampicyliny i 40 mM glukozy. Transformowane komórki wysiano do gęstości kilkuset oddzielnych kolonii na szalkę. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C komórki zebrano z szalek i zawieszono w pożywce LB zawierającej 100 pg/ml ampicyliny. Typowe objętości hodowli to 200-500 ml. W czasie zero gęstość hodowli (OD600) wynosiła od 0,05-0,15 zależnie od eksperymentu. Hodowle wytrząsano w jednej z trzech temperatur (22°C, 30°C, 37°C) aż do osiągnięcia gęstości 0,15-0,5 kiedy to podano im 1 mM izopropylotio-P-galaktozę (IPTG). Hodowle inkubowano w określonej temperaturze przez 4-5 godzin, a następnie przeniesiono do 4°C do momentu dalszej obróbki (12-72 godz.)

Oczyszczanie i charakteryzacja TcbA ulegającego ekspresji w E. coli z plazmidu pET15-tcbA.

186 242

Hodowle E. coli prowadzące ekspresję peptydu TcbA poddano następującej obróbce. Komórki zbierano przez wirowanie w 17,000 x g i pożywkę zdekantowano, i zachowano w osobnym pojemniku.

Pożywkę zatężono około 8-krotnie przy użyciu systemu filtrującego M12 (Amicon, Beverly Ma) i filtra zatrzymującego cząsteczki o masie cząsteczkowej 100 kDa. Tak zatężoną pożywkę wprowadzono na kolumnę anionowymienną i związane białka wymyto 1,0 M NaCl. Stwierdzono, że pik wymywania 1,0 NaCl powoduje śmiertelność larw europejskiej kukurydzianej stonki korzeniowej (SCR) (tabela 30). Frakcję 1,0 M NaCl zdializowano przez 10 mM buforowym fosforanem sodu pH 7,0 i poddano filtracji w żelu Sepharose CL-4B (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Obszar wymycia CL-4B odpowiada obliczonej masie cząsteczkowej (około 900 kDa) jako naturalnej dla kompleksu toksyn W-14, który zebrano i zatężono, i przetestowano na larwach. Stwierdzono, że zebrana frakcja 900 kDa ma działanie owadobójcze (patrz tabela 30) podobne do tego jakie powoduje kompleks W-14. Frakcję tę poddano działaniu proteinazy K i obróbce cieplnej, w obu przypadkach aktywność była zniesiona lub obniżona, co świadczy o tym, że ta aktywność ma charakter białkopodobny. Dodatkowo ta aktywna frakcja była immunologicznie pozytywna względem białek TcbA i TcbAu; w analizie immunologicznego przeniesienia na filtr z przeciwciałem monoklonalnym anty-TcbAui (tabela 30).

Tabela 30

Wyniki immunologiczne i Poznaczenia kukurydzianej stonki korzeniowej SCR

Frakcja	Działanie przeciwko SCR	Test immunologiczny	Naturalna wielkość
% śmiertelności	% zahamowania wzrostu	wykryte białka	wielkość oszacowana CL-4B
1,0 M Pożywka TcbA	+++	+++	TbcA
Wymiana jonowa	+++	+++	TcbA, TcbA,,,	~900 kDa
Pożywka CL-4B TcbA	+++	+++	NT
Pożywka CL-4B TcbA + proteinaza K	++	-	NT
Pożywka CL-4B TcbA + obróbka cieplna	-
Sup. komórk. CL-4B TcbA	-	+++	NT	~900 kDa

PK = działanie proteinazy K przez 2 godz.; ciepło = 100°C przez 10 min. ND = nie wykryty; NT = nie badany. System oceniania śmiertelności i zahamowania wzrostu w porównaniu z próbkami kontrolnymi; 5-24% = 25-49% = „+ +”, 50-100% = „+ + +”.

Osad komórek ponownie zawieszono w 10 mM buforze fosforanu sodu, pH 7,0, i poddano lizie przez przepuszczanie przez nebulizer komórkowy Bio-Neb™ (Glass-Col Inc., Terra Haute, IN). Osady poddano działaniu DNAzy, aby usunąć DNA i wirowano przy 17,000 x g aby oddzielić osad komórkowy od supematantu komórkowego. Frakcję supematantu zdekantowano i przefiltrowano przez filtr 0,2 mikrona aby usunąć większe cząsteczki, i poddano chromatografii anionowymiennej. Związane białka wymyto 1,0 M NaCl, zdializawana i zatężono przy użyciu koncentratorów Biomax™ (Dillipare Corp, Bedford, MA) z zatrzymaniem cząsteczek o masie cząsteczkowej 50,000 daltonów. Zatężoną frakcję poddano żelowej filtrującej chromatografii przy użyciu podłoża perełkowego Sepharose CL-4B. Dane z oznaczenia biologicz186 242 nego otrzymanego w ten sposób materiału przedstawiono w tabeli nr 30 i określono jako „Sup. komórk. CL-4B TcbA”.

W innym sposobie, w przypadku posługiwania się dużymi ilościami materiału, osady komórkowe ponownie zawieszano w 10 mM buforze fosforanu sodu, pH = 7,0 i całkowicie homogenizowano przez zastosowanie 40 ml młynka do tkanek Kontes Glass Company (Vineland, NJ). Pozostałości komórkowe osadzono przez wirowanie przy 25,000 x g, a supernatant komórkowy zdekantowano, przepuszczono przez filtr 0,2 mikrona i poddano chromatografii anionowymiennej przy użyciu kolumny Pharmacia 10/10 wypełnionej perełkami Poroś HQ 50. Związane białka wymywano gradientem NaCl 0,0 do 1,0 M. Frakcje zawierające białko TcbA połączono i zatężono przy użyciu koncentratora 50 kDa i poddano żelowej filtrującej chromatografii Pharmacia CL-4B ze złożem perełkowym. Frakcje zawierające oligomer TcbA, o masie cząsteczkowej około 900 kDa, zebrano i poddano chromatografii anionowymiennej przy użyciu kolumn Pharmacia Mono Q 10/10 i zrównoważonych buforem 20 mM Tris pH - 7,3. W celu wymycia rekombinowanego białka TcbA zastosowano gradient NaCl od 0,0 do 1,0 M. Zrekombinowane białko wypłukano z kolumny przy NaCl o stężeniu około 0,3 - 0,4 M, przy tym samym stężeniu molowym, przy którym jest wymywany oligomer TcbA z kolumny Mono Q 10/10. Zrekombinowana frakcja TcbA powoduje śmiertelność kukurydzianej stonki korzeniowej SCR w eksperymentach podobnych do tych opisanych w tabeli 30.

¹ patenty US nr 4,945,050, dla Cornell i 5,141,131, dla DowElanco “ patenty US nr 5,177,010, dla University of Toledo, 5,104,310, dla Texas A&M, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0131624B1, europejskie zgłoszenia patentowe 120516, 159418B1 i 176,112, dla Schilperoot, patenty US nr 5,149,645, 5,469,976, 5,464,763, 4,940,838 i 4,693,976, dla Schilperoot, europejskie zgłoszenia patentowe nr 116718, 290799, 320500, wszystkie dla MaxPlanck, europejskie zgłoszenia patentowe nr 604662 i 627752, dla Japan Tobacco, europejskie zgłoszenia patentowe 0267159 i 0292435 i patent US nr 5,231,019, wszystkie dla Ciba Geigy, patenty US nr 5,463,174 i 4,762,785, oba dla Calgene, i patenty US nr 5,004,863 i 5,159,185, oba dla Agracetus

US 5,302,523 i 5,464,765, oba dla Zeneca ^1V WO nr 87/06614, dla Boyce Thompson Institute, 5,472,869 i 5,384,253, oba dla Dekalb, WO nr 9209696 i WO nr 9321335, oba dla PGS ^v K. Weising i in., w Ann. Rev. Genetics, 22,421 (1998), który włącza się jako odnośnik. v US ot 60/005,405 zarej'estrowarnym w 2dnu 13 paździeiruiki 1195 r., Jkóry włącza się jako odnośnik v“ US rn ot 4,762,785, 5,451,513 i 5,545,817, które wką:za sśę jako coinośiuki v^m Europejskie zgłoszenie patentowe nr 0400246A1 i* US nr nr 4,695,455; 4,695,462; 4,861,595, które włącza się. jako odnośniki x Przykłady takiej technologii są podane między innymi w zgłoszeniu patentowym PCT WO nr 93/23998, które włącza się jako odnośnik.

xi część 2.4.1 w Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel i wsp. wyd., John Wiley & Sons, 1994 ^x protokół CERES; „Restriction Fragment Lengch Polymorphism Laboratory Manual version 4.0”, rozdziały 4-40 i 4-47; CERES/NPI, Salt Lake City, UT. NPI obecnie nie istnieje, a jego działającym następcą jest Linkage Genetics x' Evans G. i G. Wahl., 1987, „Cosmid vectors for genomie walking and rapid restriction maping” w Guid to Moleculare Cloning Techniques. Meth. Enzymology, tom 152, S. Berger i A. Yimmel, ed., str. 604-610 xv Weavee L.H.. Keesee W.R. i Matthews B.W.. 1177, J. MoL BioL 111, 119-132 xv Famme 2^. 1194 Berge/' Manuaa of Ssyiemntic BaaCeriology, vd 1. pp 510 · 511; ed. Kreig KR. i Hoii J.G.; Williams & Wilkins, Baltimore.; Akhurst and Boemare, 1988, Boemare i in., 1993 xvi Akhurst R.J. i Boemare N.E., 1990, Entomopathogenic Nematodes in Biological Control; wyd. Gaugler R. i Kaya H.; str. 75-90. CRC Press, Boca Raton, USA; Baghdiguian S., Boyer-Giglio M.H., Thaler J.O., Bonnot G., Boemare N., 1993. Biol. Cell 79, 177 - 185). Zabarwienie kolonii badano po 5 - 7 dniach hodowli na agarze odżwyczym Bacto (Difco Laboratories, Detroit, MI

186 242 'v^u Tomabene T.C., 1985, Lipid Analysis and the Relationship to Chemotaxonomy in Methods in Microbiology, vol 18, 209-224; Goodfellow M. i O'Donnell A.G. 1993, Roots of Bacterial Systematics in Handbook of New Bacterial Systematics (ed. Goodfellow M. i O'Donnell A.G.) str. 3-54, Londyn: Academic Press Ltd.), artykuły te są zamieszczone w obrębie odnośników literaturowych mniejszego zgłoszenia ^χν“ przegląd: Versalovic J., Schneider M., De Bruijn F .J. i Lupski J.R., 1994, Methods Mol. Celi . Biol, , 5), 25410 ^x“ Versalovic J., Koeuth T. i Lupski J.R., 1991, Nucleic Acids Res. 19, 6823-6831; Vera Cuz; C.M,, HaldaAlija L., Louws F., Skinner D.Z., George M.L., Nelson R.J., De Bruijn F.J., Rice C. iLeach J.E., 1996, Phytopatology (w druku) ^xx Rosę, R. 1.1 McCabe, J.M. (1973). J.Econ. E^n^t^c^m^ol. 66, (398-400)

K^^^ie:L M.G,. Beland, G.L,, Bosman. C,. Carozzii, N.B,, Crenshaw, R. Crossland, L. Dawson, J.Desai. N. Hill,

M., Kadwell, S. Launis, K., Lewis, K., Maddox, D. McPherson, K., Meghji, M.Z., Merlin, E. Rhodes, R., Warren, G. W., Wright, M. i Evola, S.V. 1993, Bic/Technclcgy, 11, 194-195.

^Μη Studier, F.W., Rosenberg, A., Dunn, J., i Dubendorff, J., (1990). Użycie poUmierazy T7 RNA do kierowania wyrażaniem kołowanego genu. Metody Enzymol., 185:60-89.

186 242

Lista sekwencji ( 1 ) Informacje ogólne:

( i )Zgłaszający: Jerald C. Ensign David J. Bowen

James Petell Raymond Fatig Sue Schoonover

Richard ffrench-Constant

Gregory L. Orr

Donald J. Merlo

Jean L. Roberts

Thomas A. Rocheleau

Michael B.Blackburn Timothy D. Hey James A. Strickland (i ) Tytuł wynalazku: „Owadobójcze toksyny białkowe z Photorhabdus” (iii) Liczba sekwencji. 61 (iv) Adres do korespondencji (A) Adresat: Aarlsa & Qardy ( B ) Ulica: 1 South Pinckney Street ( C ) Miasto: Madison (D ) Stan: WI (E) Kraj: USA ( F ) Kod pocztowy: 53703 (v ) Redagowanie komputerowe:

( A ) Nośnik: dyskietka ( B ) Komputer: PC zgodny ze standardem IBM ( C ) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS ( D ) Program: PatentIn 1.0, wersja 1.30

186 242 vi ) Dane dotyczące bieżącego zgłoszenia:

(A) Tumer zgłoszenia:

B ) Data złożenia:

A ) Klasyfikacja:

(vii) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia:

(A) Tumer zgłoszenia: US 08/06/655 3 B ) Data złożenia: 18.05.1993 (vii) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia: 3 Ν ) Tumer zgłoszenia: US 08/395497 3 B ) Data złożenia: 28.02.1995 vii) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia: 3 A ) Tumer zgłoszenia: US 08/007255 3 B ) Data złożenia: 06.11.1995 (vii ) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia: 3 Ν ) Tumer zgłoszenia: US 08/608423 (B) Data złożenia: 28.02.1996 (vii ) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia: 3 C ) Tumer zgłoszenia: US 08/705484 (B) Data złożenia: 28.08.1996 viii) Dane dotyczące Raeeaoika/PeOodmdcoikn:

C) Imię i nazwisko: Tocholas J. Seny (B ) Tumer rejestru: 27386 3 C ) Referencje: 960296.93804 (ix ) Dane dotyczące łączności telefonicznej: (Ν) Telefon: 001 608 251-5000 (B) Faks: 001 608 251-9166

186 242 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 1;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A) Długość: 11 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici:

( D ) Topologia: liniowa (i) Typ cząsteczki: białko ( v ) Typ fragmentu: N-końcowy ( xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 1;

Phe Ile Gln Gly Tyr Ser Asp Leu Phe Gly Asn 1 5 10 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 2;

(i) Charakterystyka sekwencji.

( A) Długość: 12 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici:

( D ) Topologia: liniowa ( i ) Typ cząsteczki: białko (v) Typ fragmentu: N-końcowy ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 2;

Met Gln Asp Ser Pro Glu Val Ser Ile Thr Thr Trp 1 5 10 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 3;

(i) sekwencji:

( A ) Długość: 19 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici:

( D ) Topologia: liniowa ( ii) Typ cząsteczki: białko ( v) Typ fragmentu: N-końcowy

186 242 ( xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 3;

Ser Glu Ser Leu Phe Thr Gln Thr Leu Lys Glu Ala Arg Arg Asp Ala 15 10 15 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID.4;

(i ) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 14 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici:

( D ) Topologia: liniowa ( ii ) Typ cząsteczki: białko (v) Typ fragmentu: N-końcowy ( xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 4;

Ala Ser Pro Leu Ser Thr Ser Glu Leu Thr Ser Lys Leu Asn 1 5 10 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 5;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 9 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici:

( D ) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko ( v ) Typ fragmentu: N-końcowy ( xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 5;

Ala Gly Asp Thr Ala Asn Ile Gly Asp 1 5 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 6;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 15 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas (C ) Rodzaj nici: pojedyncza

186 242 (D) Topologia: liniowa ( ii ) Typ cząsteczki: białko ( v ) Typ fragmentu: N-końcowy ( xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID : 6;

Leu Gly Gly Ala Ala Thr Leu Leu Asp Leu Leu LeuPro Gln Ile 15 10 15 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 7;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 11 aminokwasów (B ) Typ: aminokwas (C ) Rodzaj nici:

(D ) Topologia: liniowa (ii ) Typ cząsteczki: białko ( v ) Typ fragmentu: N-końcowy ( xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 7;

Met Leu Ser Thr Met Glu Lys Gln Leu Asn Glu 1 5 10 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID:8;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A ) Długość: 9 aminokwasów (B ) Typ: aminokwas (C ) Rodzaj nici:

( D ) Topologia: liniowa ( ii ) Typ cząsteczki: białko ( v ) Typ fragmentu: N-końcowy ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 8;

Met Asn Leu Ala Ser Pro Leu Ile Ssr 1 5

86 242 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 9;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 16 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici.

(D) Topologia: liniowa (i) Typ cząsteczki: białko (v) Typ fragmentu: N-końcowy ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 9;

Met Ile Asn Leu Asp Ile Asn Glu Gln Asn Lys Ile Met Val Val Ser 15 10 15 (2) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 10;

(i) Chiarakterystyka sekwencji:

(A ) Długość: 20 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici:

(D) Topologia: liniowa ( ii ) Typ cząsteczki: białko (v) Typ fragmentu. N-końcowy (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 10;

Ala Ala Lys Asp Val Lys Phe Gly Ser Asp Ala Arg Val Lys Met Leu 15 10 15

Arg Gly Val Asn 20 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 11;

(i) sekwencji:

(A) Długość: 7515 par zasad (B ) Typ: kwas nukleinowy ( C ) Rodzaj nici: podwójna (D) Topologia: liniowa

186 242 (ii ) Typ cząsteczki: Dna ( genomow) (ix) Cechy:

( A ) Nazwa/Klucz: CDS ( B ) Położenie: 1 ..7515 (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 11;

ATG CAA AAC

TCA GTA TCA

AGC ACT ATT LAT ACT ATT TCG* LAG

GCA Lys 15

LTG Iluj

44

Mec Gln 1

Asn

S ee

Lse 5

Ser

Ser lTr

IIu

Asp 10

TCr

IIu

ces

Glu

CAA

TTA

ACT

TGT

CCC

GCG

GJd

AAT

CGT

1115

^gcc

TTT

GAT

ACC

ę-yc

35

Gln

Leu

Thr

Cys

Prr

Ala

Glu

IIu

Alu

Leu

Tys

Pro

pre

Act

The

Phe

20

25

30

CGG

GAA

.We

AAT

ccg;

TCA

ATT

CTT

LAT

LTG

cgg;

Gźd

GGA

Aid

GCG

ery*

144

Arg

Glu

Lys

Thr

Arg

Gly

Met

Val

Ast

Lep

Gly

Glu

Ala

Lys

Acp

IIu

35

40

45

TAT

GAA

ATA1

GCA

CCA

GcG

Gid

CAG

GAT

CTC

CAC

CTA

CCT

CAT

GCA

CCd

192

Tyr

Glu

Ile

Ala

Gln

Ala

Glu

G1u

Act

CaP

Asn

Leu

Llu

His

Glu

Lys

50

55

60

CGT

ATT

TTT

GGC

TAT

GGT

LAT

CCC

ccc

ccc

CATl

CCT

CGT

CGT

CCG

im

24 T

Arg

Ile

Phe

Ala

Tys

Alu

Asn

Prr

Lsu

Lse

Lys

TC»n

Aia

Val

Arg

Llu

186 242

70 75 30

GGT

ACC

CGG

CAA

ATG

TTG

GGT

TTT

ATA

CAA

GGT

TAT

AGT GAT

CTG TTT

283

Gly

Thr

Arg

Gln

Mec

Leu

Gly

Phe

Ile

Gln

Gly

Tyr

Ser Asp

Leu Phe

35

90

95

OCrT

AAT

CGT

GCT

GAT

AAC

TAT

GCC

GCG

CCG

GGC

TCG

GTT GCA

TCG ATG

335

Gly

Asn

Arg

Ala

Asp

Asn

Tyr

Ala

Ala

Pro

Gly

Ser

Val Ala

Ser Mec

100

105

110

Trc

TCA

CCG

gCg

GCT

TAT

TTG

ACG

GAA

TTG

TAC

CGT

GAA GCC

AAA AAC

334

Phe

Ger

Pro

Ala

Ala

Tyr

Leu

Thr

Glu

Leu

Tyr

Arg

Glu Ala

Lys Asn

115

120

125

TTG

CAT

GAC

AGC

AGC

TCA

ATT

TAT

TAC

CTA

GAT

AAA

CGT CGC

CCG GAT

432

Leu

His

Asp

Ser

Ser

Ser

Ile

Tyr

Tyr

Leu

Asp

Lys

Arg Arg

Pro Asp

130

135

140

TTA

GCA

AGC

TTA

ATG

CTC

AGC

CAG

AAA

AAT

ATG

GAT

GAG GAA

ATT TCA

430

Leu

Ala

Ger

Leu

Met

Leu

Ser

Gln

Lys

Asn

Met

Asp

Glu Glu

Ile Ser

145

150

155

160

ACG

CTG

GCT

CTC

TCT

AAT

GAA

TTG

TGC

CTT

GCC

GGG

ATC GAA

ACA AAA

523

Thr

Leu

Ala

Leu

Ser

Asn

Glu

Leu

Cys

Leu

Ala

Gly

Ile Glu

Thr Lys

155

170

175

ACA

GGA

AAA

TCA

CAA

GAT

GAA

GTG

ATG

GAT

ATS

TTG

TCA ACT

TAT CGT

576

Thr

Gly

Lys

Sei

Gln

Asp

Glu

Val

Met

Asp

Mec

Leu

Ser Thr

Tyr Arg

130

185

190

TTA

AGT

GGA

GAG

ACA

CCT

TAT

CAT

CAC

GCT

TAT

GAA

ACT GTT

CGT GAA

624

Leu

Ger

Gly

Glu

Thr

Pro

Tyr

His

His

Ala

Tyr

Glu

Thr Val

Arg Glu

195

200

205

ATC

GTT

CAT

CAA

CGT

GAT

CCA

GGA

TTT

CCT

CAT

TTG

TCA CAG

GCA CCC

672

Ile

Val

His

Glu

Arg

ASp

Pro

Gly

Phe

Arg

His

Leu

Ser Gln

Ala Pro

210

215

220

ATT

GTT

GCT

GCT

AAG

CTC

GAT

CCT

V l

ACT

TTG

TTG

GGT ATT

AGC TCC

720

Ile

Val

Ala

Ala

Lys

Leu

Asp

Pro

Val

Thr

Leu

Leu

Gly Ile

Ser Ser

225

230

235

240

CAT

ATT

TCG

CCA

GAA

CTG

TAT

AAC

TTG

CTG

ATT

CAG

GAG ATC

CCG GAA

753

His

Ile

Ser

Pro

Glu

Leu

Tyr

Asn

Leu

Leu

Ile

Glu

Glu Ile

Pro Glu

245

250

255

AAA

GAT

GAA

GCC

GCG

CTT

GAT

ACG

CTT

TAT

AAA

ACA

AA.C TTT

GGC GAT

816

Lys

Asp

Glu

Ala

Ala

Leu

Asp

Thr

Leu

Tyr

Lys

Thr

Asn Phe

Gly Asp

260

265

210

ATT

ACT

ACT

GCT

CAG

TTA

ATG

TCC

CCA

AGT

TAT

CTG

GCC CGG

TAT TAT

364

Ile

Thr

Thr

Ala

Gln

Leu

Met

Ser

Pro

Ser

Tyr

Leu

Ala Arg

Tyr Tyr

275

280

235

GGC

GTC

TCA

CCG

GAA

GAT

ATT

GCC

TAC

GTG

ACG

ACT

TCA TTA

TCA CAT

312

Gly

Val

Ser

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Tyr

Val

Thr

Thr

Ser Leu

Ser His

290

295

300

GTT

GGA

TAT

AGC

AGT

GAT

ATT

CTG

GTT

ATT

CCG

TTG

GTC GAT

GGT GTG

960

Val

Gly

Tyr

Ser

Ser

Asp

Ile

Leu

Val

Ile

Pro

Leu

Val Asp

Gly Val

3 05

310

315

320

CGT

AAG

ATG

GAA

GTA

GTT

CGT

GTT

ACC

CGA

ACA

CCA

TCG GAT

AAT TAT

1003

Tly

Lys

Met

Glu

Val

Val

Arg

Val

Thr

Arg

Thr

Pro

Ser Asp

Asn Tyr

325

330

335

186 242

ACC Thr

AGT Ser

CAG Gln

ACG AAT

TAT Tyc

ATT Ile

GAG Glu

CTG Leu 345

TAT CCA CAG GGT GGC GAC

AAT Asn

1056

Thr 34C

Asn

Tyr

Pro

Gln

Gly

Gly 350

Asp

TAT

TTG

ATC

AAA

TAC

AAT

CTA

AGC

AAT

AGT

TTT

GGT

TTG

GAT

GAT

TTT

1104

Tyr

Leu

Ile 355

Lys

Tyr

Ąsn

Leu

Ser 350

Asn

Ser

rhe

Gly

Leu 355

Asp

Asp

Phe

TAT

CTG

CAA

TAT

AAA

GAT

GGT

TCC

CCT

GAT

TOG

ACT

GAG

ATT

GCC

CAT

1152

Tyr

Leu 370

Gln

r/r

Lys

ASP

Gly 375

Ser

Ala

Asp

Trp

Thr 380

Glu

Iie

Ala

His

AAT

CCC

TAT

CCT

GAT

ATG

GTC

ATA

AAT

CAA

AAG

TAT

GAA

TCA

CAG

GCG

1200

Asn 335

Pro

Tyr

pro

Ass

Met 390

Val

Ile

Asn

Gln

Lys 395

Tyr

Glu

Ser

Gln

Ala 400

ACA

ATC

AAA

CGT

AGT

GAC

TCT

GAC

AAT

ATA

CTC

ACT

ATA

GGG

TTA

CAA

1243

Thr

Ile

Lys

Arg

ser 405

ASP

ser

Asp

Asn

Iie 410

Leu

Ser

Ile

Gly

Leu 415

Gln

AGA

TGG

CAT

AGC

GGT

AGT

TAT

AAT

TTT

GCC

GCC

GCC

AAT

TTT

AAA

ATT

1296

Arg

Trp

HIS

Ser 420

Gly

ser

Tyr

Asn

Phe 425

Ala

Ala

Ala

Asn

Phe 430

Lys

Ile

GAC

CAA

TAC

TCC

COO

AAA

GCT

TTC

CTG

CTT

AAA

ATG

AAT

AAG

GCT

ATT

1344

Asp

Gln

Tyr 435

ser

pro

Lys

Ala

Phe 440

Leu

Leu

Lys

Mec

Asn 445

Lys

Ala

Ib

CGG

TTG

CTC

AAA

GCT

ACC

GGC

CTC

TCT

TTT

GCT

ACG

TTG

GAG

CGT

ATT

1392

Arg

Leu 450

Leu

Lys

Ala

Thr

Gly 455

Leu

Ser

Phe

Ala

Thr 460

Leu

Glu

Arg

Ile

GTT

GAT

AGT

GTT

AAT

AGC

ACC

AAA

TCC

ATC

ACG

GTT

GAG

GTA

TTA

AAC

1440

val 465

ASp

ser

Val

Asn

Ser 470

Thr

Lys

Ser

Ile

Thr 475

Val

Glu

Cal

Leu

Asn 430

AAG

GTT

TAT

CGG

GTA

AAA

TTC

TAT

ATT

GAT

CGT

TAT

GGC

ATC

AGT

GAA

1483

Lys

val

Tyr

Arg

Val 485

Lys

Phe

Tyr

Ile

Asp 490

Arg

Tyr

Gly

Ile

Ser 495

Glu

GAG

ACA

GCC

GCT

ATT

TTG

GCT

AAT

ATT

AAT

ATC

TCT

CAG

CAA

GCT

GTT

1535

GlU

Thr

Ala

Ala 500

Ile

Leu

Ala

Asn

Ile 505

Asn

Ile

Ser

Gln

Gln 510

Ala

Val

GGC

AAT

CAG

CTT

AGC

CAG

TTT

GAG

CAA

CTA

TTT

AAT

CAC

CCG

CCG

CTC

1584

Gi/

Asn

Gln 515

Leu

Ser

Gln

Phe

Glu 520

Gln

Leu

Phe

Asn

His 525

Pro

Pro

Leu

AAT

GGT

ATT

CGC

TAT

GAA

ATC

ACT

GAG

GAC

AAC

TCC

AAA

CAT

CTT

CCT

1632

Asn

Gly 530

Ile

Arg

Tyr

Glu

Ile 535

Ser

Glu

Asp

Asn

Ser 540

Lys

His

Leu

Pro

AA.T

CCT

GAT

CTG

AAC

CTT

AAA

CCA

GAC

AGT

ACC

GGT

GAT

GAT

CAA

ccc

1630

Asn 545

Pro

Asp

Leu

Asn

Leu 550

Lys

Pro

Asp

Ser

Thr 555

Gly

Asp

Asp

Gln

Arg 560

AAG

GCG

GTT

TTA

AAA

CGC

GCG

TTT

CAG

GTT

AAC

GCC

AGT

GAG

TTG

TAT

1723

Lys

Ala

Val

Leu

Lys 565

Arg

Ala

Phe

Gln

Val 570

Asn

Ala

Ser

Glu

Leu 575

Tyr

CAG

ATG

TTA

TTG

ATC

ACT

GAT

CGT

AAA

GAA

GAC

GCT

GTT

ATC

AAA

AAT

1775

Gln

Met

Leu

Leu 530

Ile

Thr

Asp

Arg

Lys 535

Glu

Asp

Gly

Val

Ile 590

Lys

Asn

AAC

TTA

GAG

AAT

TTG

TCT

CAT

CTC

TAT

TTC

CTT

ACT

rrc

C*O

GCC

CAG

1024

Asn

Leu

Glu

Asn

Leu

Ser

Asp

Leu

Tyr

Leu

Val

Ser

Leu

Leu

Ala

Gln

186 242

595

600

605

%

CAT

-AAC

CTG

ACT

ATT

GCT

GAA

TTG

AAC

ATT

TTG

TTG

GTG

ATT

TCT

1872

Ile

Hls

Asn

Leu

Thr

Ile

Ala

Glu

Leu

Asn

Ile

Leu

Leu

Val

Ile

Cys

610

615

620

GGC

TAT

GGC

GAC

ACC

AAC

ATT

TAT

CAG

ATT

ACC

GAC

GAT

AAT

TTA

GCC

1920

Gly

Tyr

Gly

Asp

Thr

Asn

Ile

Tyr

Gln

Ile

Thr

Asp

Asp

Asn

Leu

Ala

625

630

535

540

AAA

ATA

GTG

GAA

ACA

TTG

TTG

TGG

ATC

ACT

CAA

T Gg

TTG

AAG

ACC

CAA

1363

Lys

Ile

Val

Glu

Thr

Leu

Leu

Trp

Ile

Thr

Gln

Trp

Leu

Lys

Thr

Gln

645

650

655

AAA

TCG

ACA

GTT

ACC

GAC

CTG

TTT

CTG

ATG

ACC

ACG

GCC

ACT

TAC

ACC

2016

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Asp

Leu

Phe

Leu

Met

Thr

Thr

Ala

Thr

Tyr

Ser

660

665

67 0

ACC

ACT

TTA

ACG

CCA

GAA

ATT

AjGC

AAT

CTG

ACG

GCT

ACG

TTG

TCT

TCA

2064

Thr

Thr

Leu

Thr

Pro

Glu

Ile

Ser

Asn

Leu

Thr

Ala

Thr

Leu

Ser

Ser

575

530

635

ACT

TTG

Cm

DGC

AAA

GAG

AGT

CTG

ATT

GGG

GAA

GAT

CTG

AAA

AGA

GCA

2112

Thr

Leu

His

Gly

Lys

Glu

Ser

Leu

Ile

Gly

Glu

Asp

Leu

Lys

Arg

Ala

690

595

700

ATG

GCG

CCT

TGC

TTC

ACT

TCG

GCT

TTG

CAT

TTG

ACT

TCT

CAA

GAA

GTT

2160

Mac

Ala

Pro

Cys

Phe

Thr

Ser

Ala

Leu

His

Leu

Thr

Ser

Gln

Glu

Val

705

710

715

720

GCG

TAT

GAC

CTG

CTG

TTG

TGG

ATA

GAC

CAG

ATT

CAA

CCG

GCA

CAA

ATA

2203

Ala

Tyr

Asp

Leu

Leu

Leu

Trp

Ile

Asp

Gln

Ile

Gln

Pro

Ala

Gln

Ile

725

730

735

ACT

GTT

GAT

GGG

TTT

TGC

GAA

GAA

GTG

CAA

ACA

ACA

CCA

ACC

AGC

TTG

2256

Thr

Val

Asp

Gly

Phe

Trp

Glu

Glu

Val

Gln

Thr

Thr

Pro

Thr

Ser

Leu

740

745

750

AAG

GTG

ATT

ACC

TTT

GCT

CAG

GTG

CTG

GCA

CAA

TTG

AGC

CTG

ATC

TAT

2304

Lys

Val

Ile

Thr

Phe

Ala

Gln

Val

Leu

Ala

Gln

Leu

Ser

Leu

Ile

Tyr

755

760

765

CGT

CGT

ATT

GGG

TTA

AGT

GAA

ACG

GAA

CTG

TCA

CTG

ATC

GTG

ACT

CAA

2352

Arg

Arg

Ile

Gly

Lau

Ser

Glu

Thr

Glu

Leu

Ser

Leu

Ile

Val

Thr

Gln

770

775

730

TCT

TCT

CTG

CTA

GTG

GCA

GGC

AAA

AGC

ATA

CTG

CAT

CAC

GGT

CTG

TTA

2400

Ser

Ser

Leu

Leu

Val

Ala

Gly

Lys

Ser

Ile

Leu

Asp

His

Gly

Leu

Leu

735

790

795

300

ACC

CTG

ATG

GCC

TTC

GAA

GGT

TTT

CAT

ACC

TGG

GTT

AAT

GGC

TTG

GGC

2443

Thr

Leu

Met

Ala

Leu

Glu

Gly

Phe

His

Thr

Trp

Val

Asn

Gly

Leu

Gly

305

310

315

CAA

CAT

GCC

TCC

TTG

ATA

TTG

GCG

GCG

TTG

AAA

GAC

GGA

GCC

TTG

ACA

2435

Gln

Has

Ala

Ser

Leu

Ile

Leu

Ala

Ala

Leu

Lys

Asp

Gly

Ala

Leu

Thr

320

325

330

GTT

ACC

GAT

GTA

GCA

CAA

GCT

ATG

AAT

AAG

GAG

GAA

TCT

CTC

CTA

CAA

2544

Val

Thr

Asp

Val

Ala

Gln

Ala

Met

Asn

Lys

Glu

Glu

Ser

Leu

Leu

Gln

335

340

345

ATG

GCA

GCT

AAT

CAG

GTG

GAG

AAG

GAT

CTA

ACA

AAA

CTG

ACC

AGT

TGG

2592

Met

Ala

Ala

Asn

Gln

Val

Glu

Lys

Asp

Leu

Thr

Lys

Leu

Thr

Ser

Trp

350 855 350

186 242

ACA CAG

ATT Ile

GAC ASp

GCT ATT

CTG Leu

CAA Gln

TGG Trp

TTA Leu

CAG Gin 875

ATG Met

TCT Ser

TCG Ser

GCC Ala

.TG Leu 38 0

2540

Thr 865

Gln

Ala

lle 370

CCG

GTT

TCT

CCA

CTG

GAT

CTG

GCA

GGG

ATG

ATG

GCC

C t j

AAA

TAT

GGG

2633

Ala

Val

ser

Pro

Leu 885

ASp

Leu

Ala

Gly

Met 890

Met

Ala

Leu

Lys

Tyr 895

Gly

ATA

GAT

CAT

AAC

TAT

GCT

GCC

TGG

CAA

GCT

GCG

GCG

GCT

GCG

CTG

ATG

2736

Ile

asp

MIS

Asn 300

Tyr

Ala

Ala

Trp

Gln 305

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala 910

Leu

Met

GCT

GAT

CAT

GCT

AAT

CAG

CCA

CAG

AAA

AAA

CTG

GA.T

CAG

ACG

TTC

AGT

2734

Ala

Asp

His 915

Ala

Asn

Gln

Ala

Gln 920

Lys

Lys

Leu

Asp

Glu 925

Thr

Phe

Ser

AAG

OCA

TTA

TGT

AAC

TAT

TAT

ATT

AAT

GCT

GTT

GTC

GAT

AGT

GCT

GCT

2332

Lys

Ala 930

Leu

Cys

Asn

Tyr

Tyr 935

Ile

Asn

Ala

val

val 940

Asp

Ser

Ala

Ala

GCA

GTA

CCT

GAT

CGT

AAC

GGT

TTA

TAT

ACC

TAT

TTG

CTG

ATT

CAT

AAT

2330

Gly 945

Val

Arg

ASO

Arg

Asn 950

Gly

Leu

Tyr

Thr

Tvr 955

Leu

Leu

Ile

Asp

Asn 960

CAG

GTT

TCT

GCC

GAT

GTG

ATC

ACT

TCA

CGT

ATT

GCA

GAA

GCT.

ATC'

GCC

2928

Gln

Val

ser

Ala

A5P 955

val

Ile

Thr

ser

Arg 970

Ile

Ala

Glu

Ala

Ile 975

Ala

GGT

ATT

CAA

CTG

TAC

GTT

AAC

CCG

GCT

TTA

AAC

CGA

GAT

GAA

GGT

CAG

2976

Gly

Ile

Gln

Leu 980

Tyr

val

Asn

Arg

Ala 985

Leu

Asn

Arg

Asp

Glu 990

Gly

Gln

CTT

GCA

TCG

GAC

GTT

AGT

ACC

CGT

CAG

TTC

TTC

ACT

GAC

TGG

GAA

CGT

3024

Leu

Ala

ser 995

Asp

val

ser

Thr

Arg Gln 1000

Phe

Phe

Thr

Asp Trp 1005

Glu

Arg

TAC

AAT

AAA

CGT

TAC

AGT

ACT

TGG

GCT

GGT

GTC

TCT

GAA

CTG

GTC

TAT

3072

Tyr

Asn Lys 1010

Arg

Tyr

Ser

Thr Trp 1015

Ala

Gly

Val

Ssr Glu 1020

Leu

Val

Tyr

TAT

CCA

GAA

AAC

TAT

GTT

GAT

CCC

ACT

CAG

CGC

ATT

GGG

CAA

ACC

AAA

3120

Tyr Pro 1025

Glu

Asn

Tyr

Val Asp 1030

Pro

Thr

Gln

Arg Ile 1035

Gly

Gln

Thr

Lys 1040

VTG

ATG

GAT

GCG

CTG

TTC

CAA

TCC

ATC

AAC

CAG

AGC

CAG

CTA

AAT

GCG

3158

Met

M«C

Asp

Ala

Leu Leu 1045

Gln

Ser

Ile

Asn Gln 1050

Ser

Gln

Leu

Asn Ala 1055

GAT

ACG

GTG

GAA

GAT

GCT

TTC

AAA

ACT

TAT

TTG

A.CC

AGC

TTT

GAG

CAG

3216

Asp

Thr

Val

Glu Asp 1060

Ala

Phe

Lys

Thr Tyr 1065

Leu

Thr

Ser

Phe Glu 1070

Gln

GTA

CCA

AAT

CTG

AAA

GTA

ATT

AGT

GCT

TAC

CAC

GAT

AAT

GTG

AAT

GTG

3264

Val

Ala

Asn Leu 1075

Lys

Val

Ile

Ser Ala 1080

Tyr

His

Asp

Asn Val 1085

Asn

Val

GAT

CAA

GGA

TTA

ACT

TAT

TTT

ATC

GGT

ATC

GAC

CAA

GCA

GCT

CCG

GGT

3312

Asp

Gln Gly 1090

Leu

Thr

Tyr

Phe Ile 1095

Gly

Ile

Asp

Gln Ala 1100

Ala

Pro

Gly

ACG

TAT

TAC

TGG

CGT

AGT

GTT

GAT

CAC

AGC

AAA

TGT

GAA

AAT

GGC

AAG

3 3 6J

Thr Tyr 1105

Tyr

Trp

Arg

Ser Val 1110

Asp

His

Ser

Lys Cys 1115

Glu

Asn

Gly

Lys 1120

TTT

GCC

GCT

AAT

GCT

TGG

GGT

GAG

TGT

AAT

AAA

ATT

ACC

tgt

CCT

GTC

3408

Phe

Ala

Ala

Asn

Ala

Trp

Gly

Glu

Trp

Asn

Lys

Ile

Thr

Cys

Ala

Val

186 242

1125 1130 1135

AAT Asn	CCT TGG Pro Trp	AAA AAT Lys Asn 1140	ATC Ile	ATC Ile	CGT CCG GTT	GTT Val	TAT ATG Tyr Ket	TCC CCC TTA	3456
Arg	Pro Val 1145	Ser Arg 1150	Leu
TAT	CTG CTA	TGG CTG	GAG	CAG	C.AA	TCA AAG	AAA	AGT GAT	GAT CGT	AAA	3504
Tyr	Leu Leu 1155	Trp Leu	Glu	Gln	Gln 1150	ser Lys	Lys	Ser Asp 1155	Asp Gly	Lys
ACC	ACG ATT	TAT CAA	TAT	AAC	TTA	AAA CTG	GCT	CAT ATT	CGT TAC	GAC	3352
Thr	Thr lle 1170	Tyr Gln	Tyr	Asn 1175	Leu	Lys Leu	Ala	His Ile 1130	Arg Tyr	Asp
GGT	AGT TGG	AAT ACA	CCA	TTT	ACT	TTT GAT	GTG	ACA GAA	AAG GTA	AAA	360C
Gly Ser Trp 1135	Asn Thr	Pro 119C	Phe 1	Thr	Phe Asp	Cal 1195	Thr Glu	Lys Val	Lys 1200
AAT	TAC ACG	TCG AGT	ACT	GAT	GCT	GCT GAA	TCT	TTA GGG	TTG TAT	TGT	3643
.Asn	Tyr Thr	Ser ser 1205	Thr	Asp	Ala	Ala Glu 1210	Ser 1	Leu Gly	Leu Tyr 1215	cys
ACT	GGT TAT	CAA GGG	GAA	GAC	ACT	CTA TTA	GTT	ATG TTC	TAT TCG	ATG	3695
Thr	Gly Tyr	Gln Gly 1220	Glu	Asp	Thr	Leu Leu 1225	Val	Met Phe	Tyr Ser 1230	Mec
CAG	AGT AGT	TAT ACC	TCC	TAT	ACC	GAT AAT	AAT	GCG CCG	GTC ACT	GGG	3744
Gin	Ser Ser Tyr Ser 1235	Ser	Tyr	Thr Asp Asn 1240	Asn	Ala Pro cal Thr 1245	Gly
CTA	TAT ATT	TTC GCT	GAT	ATG	TCA	TCA GAC	AAT	ATG ACG	AAT GCA	CAA	3792
Leu	Tyr Ile 1250	Phe Ala	Asp	Mec Ser 1255	Ser Asp	Asn	Met Thr 1250	Asn Ala	Gln
GCA	ACT AAC	TAT TGG	AAT	AAC	AGT	TAT CCG	CAA	TTT GAT	ACT GTG	ATG	3340
Ala Thr Asn 1255	Tyr Trp	Asn Asn 1270	ser	Tyr Pro	Gln Phe Asp 1275	Thr Val	Mec 1280
GCA	GAT CCG	GAT AGC	GAC	AAT	AAA	AAA GTC	ATA	ACC AGA	AGA GTT	AAT	3888
Ala	Asp Pro	Asp Ser Asp 1285	Asn	Lys	Lys Val Ile 1290	Thr Arg	Arg val Asn 1295
AAC	CGT TAT	GCG GAG	GAT	TAT	GAA	ATT CCT	TCC	TCT GTG	ACA ACT	AAC	3935
Asn	Arg Tyr	Ala Glu 1300	Asp	Tyr	Glu	Ile Pro 1305	ser	Ser Val	Thr Ser 1310	Asn
AGT	AAT TAT	TCT TGG	GGT	GAT	CAC	AGT TTA	ACC	ATG CTT	TAT GGT	GGT	3984
Ser	Asn Tyr Ser Trp 1315	Gly	Asp	His Ser Leu 1320	Thr	Met Leu Tyr Gly 1325	Gly
AGT	GTT CCT	AAT ATT	ACT	TTT	GAA	TCG GCG	GCA	GAA GAT	TTA AGG	CTA	4032
ser	Val Pro 1330	Asn Ile	Thr	Phe Glu 1335	Ser Ala	Ala	Glu Asp 1340	Leu Arg	Leu
TCT	ACC AAT	ATG GCA	TTG	AGT	ATT	ATT CAT	AAT	GGA TAT	GCG GGA	ACC	4080
Ser Thr Asn 1345	Mec Ala	Leu Ser 13S0	Ile	Ile His	Asn Gly Tyr 1355	Ala Gly	Thr 1360
CGC	CGT ATA	CAA TGT	AAT	CTT	ATG	AAA CAA	TAC	GCT TCA	TTA GGT	GAT	4128
Arg	Arg Ile	Gln Cys Asn 1365	Leu	Met	Lys Gln Tyr 1370	Ala Ser	Leu Gly Asp 1375

AAA TTT ATA ATT TAT GAT TCA TCA TTT GAT GAT GCA AAC CGT TTT AAT 417 5 Lys Phe Ile Ile Tyr Asp Ser Ser Phe Asp Asp Ala Asn Arg Phe Asn

1380 1385 1390

186 242

CTG Leu

GTT CCA TTC TTT AAA TTC

CCA Gly 1400

AAA Lys )

CAC Asp

CAC Glu

AAC Asn

TCA CAT Ser Asp 1405

GAT Asp

AGT Ser

422 4

”al

Pro Leu 1395

Phe

Lys

Phe

ATT

TGT

ATA TAT

AAT

CAA

AAC

CCT

TCC

tct

CAA

CAT

AAG AAG

TGG

TAT

42_2

Ile

Cys Ile Tyr 1410

Asn

Glu

Asn Pro 1415

Sar

Ser

Glu

Asp Lys Lys 1420

Trp

Tyr

TTT

TCT

TCG AAA

GAT

GAC

AAT

AAA

ACA

GCC

CAT

TAT

AAT GCT

CCA

ACT

432'

Phe jer 1425

Ser Lys

Asp

Asp Asn 1430

Lys

Thr

Ala

.Asp 1435

Tyr

Asn Gly

Gly

Thr 1440

CAA

TGT

ATA GAT

GCT

GCA

ACC

ACT

AAC

AAA

GAT

TTT

TAT TAT

AAT

CTC

436-

Gln

Cys

Ile Asp

Ala Gly 1445

Thr

Ser

Asn

Lys Asp 1453

Phe

Tyr Tyr

Asn Leu 1455

CAG

GAG

ATT CAA

CTA

ATT

ACT

CTT

ACT

cct

CCC

TAT

TOG TCG

AGT

TAT

4416

Gln

Glu

Ile Glu Val 1460

Ile

Ser

Val

Thr Gly 1465

Gly

Tyr

Trp Ser Ser 1470

Tyr

AAA

ATA

TCC AAC

CCG

ATT

AAT

ATC

AAT

ACC

GOC

ATT

CAT ACT

GCT

AAA

446 4

Lys

Ile

Ser Asn 1475

Pro

Ile

Asn

Ile 143C

Asn 1

Thr

Gly

Ile

Asp Ser 1435

Ala

Lys

GTA

AAA

CTC ACC

CTA

AAA

CCS

CCT

CCT

CAC

CAT

CAA

ATC ttT

ACT

GCT

4 512

Val

Lys Val Thr 1490

Val

Lys

Ala Gly 1495

Gly

Asp

Asp

Gln Ile Phe 1500

Thr

Ala

GAT

AAT

AGT ACC

TAT

CTT

CCT

CAC

CAA

CCC

CCA

CCC

AGT TTT

GAG

GAG

4560

Asp Asn 1505

Ser Thr

Tyr

Val Pro 1510

Gin

Gln

Pro

Ala 1515

Pro

Ser Phe

Glu

Glu 1520

ATC

ATT

TAT CAG

TTC

AAT

AAC

CTG

ACA

ATA

GAT

TGT

AAG AAT

TTA

AAT

4603

Mec

Ile

Tyr Gin

Phe Asn 1525

Asn

Leu

Thr

Ile Asp 1530

Cys

Lys Asn

Leu Asn 1535

TTC

ATC

GAC AAT

CAG

GCA

CAT

ATT

GAG

ATT

GAT

TTC

ACC GCT

ACG

GCA

4 656

Phe

Ile

Asp Asn Gln 1540

Ala

His

Ile

Glu Ile 1545

Asp

Phe

Thr Ala Thr 1550

Ala

CAA

GAT

GGC CGA

TTC

TTG

GGT

GCA

GAA

ACT

TTT

ATT

ATC CCG

GTA

ACT

47C4

Gln

Asp

Gly Arg 1555

Phe

Leu

Gly

Ala Glu 1560

Thr

Phe

Ile

Ile Pro 1565

Val

Thr

AAA

AAA

GTT CTC

GGT

ACT

GAG

AAC

GTG

ATT

GCG

TTA

TAT AGC

GAA

AAT

4752

Lys

Lys Val Leu 1570

Gly

Thr

Glu Asn 1575

Yal

Ile

Ala

Leu Tyr Ser 1580

Glu

Asn

AAC

GGT

GTT CAA

TAT

ATG

CAA

ATT

GGC

GCA

TAT

CGT

ACC CGT

TTG

AAT

4300

Asn Gly 1535

Val Gln

Tyr

Mec Gln 1590

Ile

Gly

Ala

Tyr Arg 1595

Thr Arg

Leu

Asn 1600

ACG

TTA

TTC GCT

CAA

CAG

TTG

GTT

ACC

CCT

GCT

AAT

CGT GGC

ATT

GAT

4343

Thr

Leu

Phe Ala

Gln Gln 1605

Leu

Val

Ser

Arg Ala 1510

Asn

Arg Gly

Ile Asp 1615

GCA

GTG

CTC AGT

ATG

GAA

ACT

CAG

AAT

ATT

CAC

GAA

CCG CAA

TTA

GGA

4396

Ala

Val

Leu Ser Mec 1620

Glu

Thr

Gln

Asn Ile 1625

Gln

Glu

Pro Gln Leu 1630

Gly

GCG

GGC

ACA TAT

GTG

CAG

CTT

GTG

TTG

GAT

AAA

TAT

GAT GAG

TCT

ATT

4944

Ala

Gly

Thr Tyr 1535

Val

Gln

Leu

Val Leu 1640

Asp

Lys

Tyr

Asp Glu 1645

Ser

Ile

CAT

GGC

ACT AAT

AAA

AGC

TTT

GCT

ATT

GAA

TAT

GTT

GAT ATA

TTT

AAA

4992

His

Gly

Thr Asn

Lys

Ser

Phe

Ala

Ile

Glu

Tyr

Val

Asp Ile

Phe

Lys

186 242

1650 1655

/» » <* Λ » ** ΛΛ'- Glu Asn 1665

GAT AGT Asp Ser

TTT Phe

GTG Val 157C

ATT Ile 1

TAT CAA

GGA GAA CTT

AGC Ser

GAA Glu

ACA Thr

AGT Ser 1530

5040

Tyr

Gin

Gly

Glu 1675

Leu

CAA ACT

CTT GTG

AAA

GTT

—Τ'

TTA

TCC

TAT

TTT

ATA

GAG

GCG

ACT

GGA

5033

Cln Thr

Va1 Va1

Lys Val 1635

Phe

Leu

Ser

Tyr 1690

Phe 1

Ile

Glu

Ala

Thr 1695

Gly

A--tT AAG

AAC CAC

TTA

TGG

GTA

CGT

GCT

AAA

TAC

CAA

AAG

GAA

ACG

ACT

5135

as n L.y s

Asn His Leu 1700

Trp

7al

Arg

Ala 1705

Lys

Tyr

Gln

Lys

Glu 171C

Thr 1

Thr

GAT AAG

ATC TTG

TTC

GAC

CGT

ACT

GAT

CAG

AAA

GAT

CCG

CAC

GGT

TGG

5184

Asp Lys

Ile Leu 1715

Phe

Asp

Arg

Thr Asp 1720

Glu

Lys

Asp

Pro 1725

His

Gly

Trp

TTT CTC

AGC GAC

GAT

CAC

AAG

ACC

TTT

AGT

GGT

CTC

TCT

TCC

GCA

CAG

5232

Phe Leu Ser Asp 1730

Asp

His

Lys Thr 1735

Phe

Ser

Gly

Leu Ser 1740

Ser

Ala

Gln

GCA TTA

AAG AAC

GAC

AGT

GAA

CCG

ATG

GAT

TTC

TCT

GGC

GCC

AAT

GCT

5230

Ala Leu L745

Lys Asn

Asp

Ser Glu 1750

Pro

Mec

Asp

Phe Ser 1755

Gly

Aia

Asn

Aia 1750

CTC TAT

TTC TGG

GAA

CTG

TTC

TAT

TAC

ACG

CCG

ATG

ATG

ATC

GCT

CAT

5323

Leu Tyr

Phe Trp

Glu Leu 1765

Phe

Tyr

Tyr

Thr Pro 1770

Met

Met

Met

Ala 1775

His

CGT TTC

TTG CAG

GAA

CAG

AAT

TTT

GAT

GCG

GCG

AAC

CAT

TGG

TTC

CGT

5376

Arg Leu

Leu Gln Glu 1780

Gln

Asn

Phe

Asp Ala 1785

Ala

Asn

His

Trp Phe 1790

Arg

TAT GTC

TGG AGT

CCA

TCC

GGT

TAT

ATC

GTT

GAT

GGT

AAA

ATT

GCT

ATC

5424

Tyr 7ai

Trp Ser 1795

Pro

ser

Gly

Tyr ile 1800

val

Asp

Gly

Lys Ile 1805

Ala

He

TAC CAC

TGG AAC

GTG

CCA

CCC

CTG

GAA

GAA

GAC

ACC

AGT

TGG

AAT

GCA

5472

Tyr His Trp Asn 1810

Val

Arg

Pro Leu 1815

Glu

Glu

Asp

Thr ser 1820

Trp

Asn

Ala

CAA CAA

CTG GAC

TCC

ACC

GAT

CCA

GAT

GCT

GTA

ccc

CAA

GAT

GAT

CCG

5520

Gln Gln 1825

Leu Asp

Ser

Thr Asp 1830

Pro

Asp

Ala

Val Ala 1335

Gln

Asp

Asp

Pro 1840

ATG CAC

TAC AAG

GTG

GCT

ACC

TTT

ATG

GCG

ACG

TTG

GAT

CTG

CTA

ATG

5543

Met His

Tyr Lys

Val Ala 1845

Thr

Phe

Met

Ala Thr 1850

Leu

Asp

Leu

Leu Mec 1855

GCC CGT

GGT GAT

GCT

GCT

TAC

CGC

CAG

TTA

CAG

CGT

GAT

ACG

TTG

GCT

56 i 6

Ala Arg

Gly Asp Ala 1860

Ala

Tyr

Arg

Cln Leu 1865

Glu

Arg

Asp

Thr Leu 1870

Ala

GAA GCT

AAA ATG

TGG

TAT

ACA

CAG

GCG

CTT

AAT

CTG

TTG

GGT

GAT

GAG

5664

Glu Ala

Lys Met 1375

Trp

Tyr

Thr

Gln Ala 1380

Leu

Asn

Leu

Leu Gly 1885

Asp

Glu

CCA CAA

GTG ATG

CTG

AGT

ACG

ACT

TCG

CCT

AAT

CCA

ACA

TTG

CGT

AAT

5712

Pro Gln Val Mer 1890

Leu

Ser

Thr Thr 1895

Trp

Ala

Asn

Pro Thr 1900

Leu

Gly

Asn

CCT CCT TCA AAA ACC ACA CAG CAG GTT CGT CAG CAA GTG CTT ACC CAG 57 60

Ala Ala Ser Lys Thr Thr Gln Gln Val Arg Gin Gln Val Leu Thr Gln

1305 1910 1915 1920

186 242

TTC Leu

CGT Arg

CTC Leu

AAT Asn

AGC agg Ser Arg 1925

GTA Val

AAA Lys

ACC Thr

CCG TTC Pro Leu 1930

CTA Leu

GGA Gly

ACA Thr

GCC .AAT Ala Asn 1935

5 88

TCC

CTG

ACC

GCT

<i—r * ttcTTA i A -

CTG

CCG

CAG

GAA AAT

AGC

AAG

CTC

AAA GGC

5356

Ser

Leu

Thr

Ala Leu Phe 1940

Leu

Pro

Gln Glu Asn 1945

Ser

Lys

Leu Lya Gly 1950

TAC

TGG

CGG

ACA

CTG GCG

CAG

CGT

» TH TG

TTT AAT

TTA

CGT

CAT

AAT CTG

5904

Tyr

Trp

Arg Thr 1955

Leu Ala

Gln

Arg Mec 1960

Phe Acn

Leu

Arg 1965

His

Asn Leu

TCG

ATT

GAC

GGC

CAG CCG

CTC

TCC

TTG

CCG CTG

TAT

GCT

AAA

CCG GCT

5952

Ser

Ile Asp 1970

Gly

Gln Pro

Leu Ser 1975

Leu

Pro Leu

Tyr Ala 1980

Lys

Pro Ala

GAT

CCA

AAA

GCT

TTA CTG

AGT

GCG

GCG

GTT TCA

GCT

TCT

CAA

GGG GGA

6000

Asp Pro 1985

Lys

Aia

Leu Leu Ser 1990

Ala

Ala

Val Ser Ala 1995

Ser

Gln

Gly Gly 2000

GCC

GAC

TTG

<<* «*·«»* ‘c CG

AAG GCG

«·<«··«

CTG

ACT

ATT CAC

CGC

TTC

CCT

CAA ATG

6048

Ala

Asp

Leu

Pro

Lys Ala 2005

Pro

Leu

Thr

Ile His 2010

Arg

Phe

Pro

gln Mec 2015

CTA

GAA

GGG

GCA

CGG GGC

TTG

GTT

AAC

CAG CTT

ATA

CAG

TTC

GGT ACT

6096

Leu

Glu

Gly

Ala Arg Gly 2020

Leu

Val

Asn Gln Leu 2025

Ile

Gln

Phe Gly ser 2030

TCA

CTA

TTG

GGG

TAC AGT

GAG

CGT

CAG

GAT GCG

GAA

GCT

ATG

AGT CAA

6144

Ser

Leu

Leu Gly 2035

Tyr Ser

Glu

Ar? Cln 2040

Asp Ala

Glu

Ala Mec 2045

Ser Gln

CTA

CTG

CAA

ACC

CAA GCC

AGC

GAG

TTA

ATA CTG

ACC

AGT

ATT

CGT ATG

6192

Leu

Leu Gln 2050

Thr

Gln Ala

Ser Glu 2055

Leu

lle Leu

Thr Ser 2060

lle

Arg Met

CAG

GAT

AAC

CAA

TTG GCA

GAG

CTG

GAT

TCG GAA

AAA

ACC

GCC

TTG CAA

6240

Gln Acp 2055

Asn

cln

Leu Ala Glu 2070

Leu

Asp

Set Glu Lys 2075

Thr

Ala

Leu Gln 2080

GTC

TCT

TTA

GCT

GGA GTG

CAA

CAA

CGG

TTT GAC

AGC

TAT

AGC

CAA CTG

5288

Val

Ser

Leu

Ala

Gly Val 2085

Gln

Gln

Arg

Phe Asp 2090

Ser

Tyr

Ser

Gln Leu 2095

TAT

GAG

GAG

AAC

ATC AAC

GCA

GGT

GAG

CAG CCA

GCG

CTG

GCG

TTA CGC

6335

Tyr

Glu

Glu

Asn Ile Asn 2100

Ala

Gly

Glu Gln Arg 2105

Ala

Leu

Ala Leu Arg 2110

TCA

GAA

TCT

GCT

ATT GAG

TCT

CAC

GGA

GCG CAG

ATT

TCC

CGT

ATG GCA

6384

Ser

Glu

Ser Ala 2115

Ile Glu

ser

Gln Gly 2120

Ala Gln

Ile

Ser Arg 2125

Met Ala

GGC

GCG

GGT

GTT

GAT ATG

GCA

CCA

AAT

ATC TTC

GGC

CTG

GCT

GAT GGC

6432

Gly

Ala Gly 2130

Val

Asp Met

Ala Pro 2135

Asn

Ile Phe

Gly Leu 2140

Ala

Asp Gly

GGC

ATG

CAT

TAT

GGT GCT

ATT

GCC

TAT

GCC ATC

GCT

GAC

GGT

ATT GAG

6480

Gly Met 2145

His

Tyr

Gly Ala Ile 2150

Ala

Tyr

Ala Ile Ala 2155

Asp

Gly

Ile Glu 2160

TTC

AGT

GCT

TCT

GCC AAG

ATG

GTT

GAT

GCG GAG

AAA

GTT

GCT

CAG TCG

6528

Leu

ser

Ala

Ser

Ala Lys 2165

Met

Val

Asp

Ala Glu 2170

Lys

Val

Ala

Gln Ser 2175

GAA

ATA

TAT

CGC

CCT CGC

CGT

CAA

GAA

TGG AAA

ATT

CAG

CGT

GAC AAC

637 6

Glu

Ile

Tyr

Arg

Arg Arg

Arg

Gln

Glu

Trp Lys

Ile

Gln

Arg

Asp Asn

186 242

2180 2135 2190

GCA CAA GCG GAG ATT

AA— Asn

CAG TTA AAC GCG

CAA Gln

CiO Leu

GAA TCA Giu Ser 2205

CTG Leu

TCT Ser

6624

Ala

Gln

Ala Glu 2195

Ile

Gln

Leu Asn Ala 2200

ATT

— G —

CGT GAA

GCC

GCT

GAA

ATG CAA AAA

GAG

TAC

cgt aaa

ACC

G* M

5572

Iie

Arg Arg Glu 2210

Ala

Ala

Glu 2215

Met Gln Ly s

Glu

Tyr 2220

Leu Lys 1

Thr

Gln

CAA

GCT

CAG TAT

CAG

GCA

CAA

CTT ACT TTC

TTA

AGA

A GC a * * TTC

TTC

AGT

6720

Gln Ala 2225

Gln Ala

Gln

Ala Gln 2230

Leu Thr Fha

Lea 2235

Arg

Ser Lys

Phe

Ser 2240

AAT

CAA

GCG TTA

TAT

AGT

TGG

TTA CGA GGG

CGT

TTG

TCA TTA

ATT

TAT

6753

Asn

Gln

Ala Leu

Tyr ser 2245

Trp

Leu Arg Gly 225C

Arg 1

Leu

ser Gly

Ile 2255

Tyr * J -

TTC

CAG

TTC TAT

GAC

TTG

GCC

GTA TCA CGT

TGC

CTG

ATG GCA

GAG

CAA

6815

Phe

Gln

Phe Tyr Asp 2260

Leu

Ala

Val Ser Arg 2265

—ys

Leu

Met Ala 227C

Glu 1

Gln

tcc

TAT

CAA TGG

GAA

GCT

AAT

GAT AAT TCC

ATT

AGC

TTT GTC

AAA

CCG

6864

Ser

Tyr

Gln Trp 2275

Glu

Ala

Asn

Asp A.sn Ser 2280

Ile

Ser

Phe Val 2285

Lys

Pro

GGT

GCA

TGG CAA

GGA

ACT

TAC

GCC GGC TTA

TTG

TGT

GGA GA.A

GCT

TTG

6912

Gly

Ala Trp Gln 2290

Giy

Thr

Tyr Ala Gly Leu 2295

Leu

Cys Gly Glu 2300

Ala

Leu

ATA

CAA

AAT CTG

GCA

CAA

ATG

GAA GAG GCA

TAT

CTG

AAA TGG

GAA

TCT

6960

Ile 2305

Gln

Asn Leu

Ala

Gln Met 2310

Glu Glu Ala

Tyr Leu 2315

Lys Trp

Glu

Ser 2320

CGC

GCT

TTG GAA

GTA

GAA

CGC

ACG GTT TCA

TTG

GCA

CTG GTT

TAT

GAT

7005

Arg

Ala

Leu Glu

Val Glu 2325

A.rg

Thr Val Ser Leu 2330

Ala

Val Val

Tyr Asp 2335

TCA

CTG

GAA GGT

AAT

GAT

CGT

TTT AAT TTA

GCG

GAA

CAA ATA

CCT

GCA

7056

Ser

Leu

Glu Gly Asn 2340

Asp

Arg

Phe Asn Leu 2345

Ala

Glu

Gln Ile Pro 2350

Ala

TTA

TTG

GAT AAG

GGG

GAG

GGA

ACA GCA GGA

ACT

AAA

GAA AAT

GGG

TTA

7104

Leu

Leu

Asp Lys 2355

Gly

Glu

Gly

Thr Ala Gly 2360

Thr

Lys

Glu Asn 2365

Gly

Leu

TCA

TTG

GCT AAT

GCT

ATC

CTG

TCA GCT TCG

GTC

AAA

TTG TCC

GAC

TTG

7152

Ser

Leu Ala Asn 2370

Ala

Ile

Leu Ser Ala Ser 2375

Val

Lys Leu Ser 2380

Asp

Leu

AAA

CTG

GGA ACO

GAT

TAT

CCA

GAC AGT ATC

GTT

GGT

AGC AAC

AAG

GTT

7200

Lys Leu 2335

Gly Thr

Asp

Ty! Pro 2390

Asp Ser Ile

Val Gly 2395

Ser Asn

Lys

Val 2400

CGT

CGT

ATT AAG

CAA

ATC

AGT

GTT TCG CTA

CCT

GCA

TTG GTT

GGG

CCT

7248

Arg

Arg

Ile Lys

Gln Ile 2405

ser

Val Ser Leu Pro 2410

Ala

Leu Val

Gly Pro 2415

TAT

CAG

GAT GTT

CAG

GCT

ATG

CTC AGC TAT

GGT

GGC

AGT ACT

CAA

TTG

72?5

Tyr

Gln

Asp Val Gln 2420

Ala

Met

Leu Ser Tyr 2425

Gly

Gly

Ser Thr 243

Gln 0

Leu

CCG

AAA

GGT TCT

TCA

GCG

TTG

GCT GTG TCT

CAT

GGT

ACC AAT

GAT

AG i

7344

Pro

Lys

Gly Cys 2435

Ser

Ala

Leu

Ala Val Ser 2440

His

Gly

Thr Asn 2445

Asp

Ser

186 242

GGT Gly

CAG TTC Gln Phe 2450

CAG Gln

TTG Leu

CAT Asp

TTC AAT Phe Asn 2455

GAC Asp

GGC Gly

AAA Lys

TAC CTG Tyr Leu 2460

CCA Pro

TTT Phe

GAA Glu

”332

GGT

ATT GCT

CTT

GAT

GAT

CAG GGT

ACA

CTG

AAT

CTT CAA

TTT

CCG

AAT

7440

Gly

Ile Ala

Leu

Asp

Asp

Gln Gly

Thr

Leu

Asn

Leu Gln

Phe

Pro

Asn

2465

2470

2475

2430

GCT

ACC GAC

AAG

CAG

AAA

GCA ATA

TTG

CAA

ACT

ATG AGC

GAT

ATT

ATT

7433

Ala

Thr Asp

Lys

Gln

Lys

Ala Ile

Leu

Gln

Thr

«ec Ser

Asp

Ile

Ile

2435

2490

2495

TTG

CAT ATT

CGT

TAT

ACC

ATC CGT

TAA

7515

Leu

His Ile

Arg

Tyr

Thr

Ile Arg

*

2500 2505 (2) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 12;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 2505 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 12,

Mac 1

Cln

Asn

Ser

Lau 5

Ser

ser

Thr

Ile

Asp Thr 10

Ile

cys

Gln

Lys 15

Lau

Gln

Leu

Thr

Cys 20

pro

Ala

Glu

Ile

Ala 25

Leu Tyr

Pro

Phe

Asp 30

Thr

Phe

Arg

Glu

Lys 35

Thr

Arg

Gly

Met

Val 40

Asn

Trp Gly

Glu

Ala 45

Lys

Arg

Ile

Tyr

Glu 50

Ile

Ala

Gln

Ala

Glu 55

Gln

Asp

Arg Asn

Lau 60

Lau

His

Glu

Lys

Arg 65

Ile

Phe

Ala

Tyr

Ala 70

Asn

Pro

Lau

Lau Lys 75

Asn

Ala

Val

Arg

Leu 80

Gly

Thr

Arg

Gln

Mt 85

Lau

Gly

Phe

Ile

Gln Gly 90

Tyr

ser

Asp

Leu 95

Phe

Gly

Asn

Arg

Ala 100

Asp

Asn

Tyr

ALa

Ala 105

Pro Gly

Ser

Val

Ala 110

Ser

Mec

Phe

S«r

Pro 115

Ala

ALa

Tyr

Leu

Tir 120

Glu

Lau Tyr

Arg

Glu 125

Ala

Lys

Asm

Leu

His 130

Asp

5er

Set

Set

Ile 135

Tyr

Tyr

Leu Asp

Lys 140

Arg

Arg

Pro

Asp

Leu 145

Ala

ser

Leu

Met

Leu 150

ser

Gin

Lys

Asn Mec 155

Asp

Glu

Glu

Ile

Ser 160

Thr

Leu

Ala

Leu

Ser

Asn

Glu

Lau

Cys

Lau Ala

Gly

Ile

Glu

Thr

Lys

165 170 175

Thr Gly Lys Ser Gln Asp Glu Val Met Asp Met Leu Ser Thr Tyr Arg 180 185 190

186 242

Leu

Ser

1 « t •Ji/ 195

Glu

Thr

pro

Pyr His His Ala 200

Tyr

Glu

Thr 205

'lal

Arg

Glu

Ile

‘.'al

His

Glu

Arg

Asp

Pro Gly Phe Arg

His

Leu

Ser

Gln

Ala

Pro

210

215

220

Ile

Val

Ala

Ala

Lys

Leu

Asp Pro Val Thr

Leu

Leu

Gly

Ile

Ser

Ser

225

230

235

240

His

Ila

Sar

Pro

Clu

Leu

Pyr Asn Leu Leu

Ile

Glu

Glu

ile

Pm

Glu

245

250

255

Lys

Asp

Glu

Ala

Ala

Leu

Asp Thr Leu Tyr

Lys

Thr

Asn

Phe

Gly

Asp

260

265

270

Ile

Thr

Thr

Ala

Gln

Leu

Met Ser Pro Ser

Pyr

Leu

Ala

Arg

Tyr

Pyr

275

280

285

Gly

7al

Ser

Pro

Glu

Asp

Ile Ala Tyr Val

Thr

Thr

Ser

Leu

ser

His

290

295

300

Val

Cly

Tyr

Sar

Ser

Acp

Ile Leu Val Ile

Pre

Leu

Val

Asp

cly

Val

305

310

315

320

Gly

Lys

Mec

GlU

Val

Val

Arg Val Thr Arg

Thr

Pro

Ser

Asp

Asn

Tyr

325

330

335

Thr

ser

Gln

Thr

Asn

Tyr

Ile Glu Leu Tyr

Pro

Gln

Gly

Gly

Asp

Asn

340

345

350

Pyr

Leu

Ile

Lys

Tyr

Asn

Leu Ser Asn Ser

Phe

Gly

Leu

Asp

Asp

Phe

355

360

365

Tyr

Leu

Cln

Tyr

Lys

Asp

Cly ser Ala Asp

Trp

Thr

Glu

Ile

Ala

His

370

375

380

Asn

Pro

Tyr

Pro

Asp

Met

Val Ile Asn Gln

Lys

Tyr

Glu

ser

Gln

Ala

38S

390

395

400

Thr

Ile

Lys

Arg

Ser

Asp

Ser Asp Asn Ile

Leu

Ser

Ile

Cly

Leu

Gln

405

410

415

Arg

Trp

His

Ser

Gly

Ser

Tyr Asn Phe Ala

Ala

Ala

Asn

Phe

Lys

Ile

420

425

430

Asp

Gln

Tyr

Ser

Pro

Lys

Ala Phe Leu Leu

Lys

Met

Asn

Lys

Ale

Ile

435

440

445

Arg

Leu

Leu

Lys

Ala

Thr

Gly Leu Ser Phe

Ala

Thr

Leu

Clu

Arg

Ile

450

455

460

Val

Asp

Ser

Val

Asn

Ser

Thr Lys ser Ile

Thr

val

Glu

Val

Leu

Asn

465

470

475

480

Lys

Val

Tyr

Arg

Val

Lys

phe Tyr Ile Asp

Arg

Pyr

Gly

Ile

ser

Glu

485

490

495

Glu

Thr

Ala

Ala

Ile

Leu

Ala Asn Ile Asn

Ile

Ser

Gln

Cln

Ala

Val

500

505

510

Gly

Asn

Gln

Leu

Ser

Gln

Phe Glu Gln Leu

Phe

Asn

His

Pro

Pro

Leu

515

520

525

Asn

Gly

Ile

Arg

'T'» *1 L

Glu

Ile Ser Glu Asp

Asn

Ser

Lys

His

Leu

Pro

530

S35

540

186 242

Asn 545

Pro

Asp

Leu

Asn

L«u 550

Lys

Pro

Asp

Ser

Thr 555

Gly

Asp

Asp

Gln

Arg 560

Lys

Ala

Val

Lau

Lys 565

Arg

Ala

Phe

Gln

Val 570

Asn

Ala

Ser

Glu

Leu 575

Tyr

Gin

Mec

Leu

Leu 580

Ile

Thr

Asp

Arg

Lys 585

Glu

Asp

Gly

Val

Ile 590

Lys

Asn

Asn

Leu

Glu 555

Asn

Leu

Ser

Asp

Leu 600

Tyr

Leu

val

Ser

Leu 605

Lau

Ala

Gln

Ile

His 610

Ann

Leu

Thr

Ile

Ala 615

Glu

Leu

Asn

Ile

Leu 620

Leu

Val

I 3a

Cys

Gly 625

Tyr

Gly

Asp

Thr

Asn 630

Ile

Tyr

Gln

Ile

Thr 635

Asp

Asp

Asn

Leu

Ala 640

Lys

Ile

Val

Glu

Thr 645

Leu

Lau

Trp

Ile

Thr 650

Gln

Trp

Lau

Lys

Thr 655

Gln

Lys

Trp

Thr

Val 660

Thr

Asp

Leu

Phe

Leu 665

Met

Thr

Thr

Ala

Thr 670

Tyr

Ser

Tnr

Tnr

Leu 675

Thr

pro

Glu

Ile

Ser 680

Asn

Leu

Thr

Ala

Thr 685

Leu

Ser

Ser

Thr

Lau 690

His

Gly

Lys

Glu

Ser 695

Leu

Ile

Gly

Glu

Asp 700

Leu

Lys

Arg

Ala

Met 705

Ala

Pro

Cys

Phe

Thr 710

Ser

Ala

Leu

His

Leu 715

Thr

Ser

Gln

Glu

Val 720

Ala

Tyr

Asp

Lau

Leu 725

Leu

Trp

Ile

Asp

Gln 730

Ile

Gln

Pro

Ala

Gln 735

Ile

Tnr

val

Asp

Gly 740

Phe

Trp

Glu

Glu

val 745

Gin

Thr

Thr

Pro

Thr 750

ser

Leu

Lys

Val

Ile 755

Thr

Phe

Ala

Gln

Val 760

Leu

Ala

Gln

Lau

Ser 765

Lau

Ile

Tyr

Arg

Arg 770

Ile

Gly

Leu

Ser

Glu 775

Thr

Glu

Lau

Ser

Lau 780

Ile

Val

Thr

Gln

Ser 785

Ser

Lau

Lau

val

Ala 790

Gly

Lys

Ser

Ile

Lau 795

Asp

His

Gly

Lau

Leu 800

Thr

Leu

Mec

Ala

Leu 805

Glu

Gly

Phe

His

Thr 810

Trp

Val

Asn

Gly

Leu 815

Gly

Gln

His

Ala

Ser 820

Leu

Ile

Leu

Ala

Ala 825

Leu

Lys

Asp

Gly

Ala 830

Leu

Thr

Val

Thr

Asp 835

Val

Ala

Gln

Ala

Met 840

Asn

Lys

Glu

Glu

Ser 845

Leu

Leu

Gln

Met

Ala aso

Ala

Asn

Gin

Val

Glu 355

Lys

Asp

Lau

Thr

Ly’s 860

Leu

Thr

Ser

Trp

Thr 865

Gln

Ile

Asp

Ala

Ile 870

Lau

Gln

Trp

Lau

Gln 875

Mat

Ser

Ser

Ala

Leu 880

Aa

Val

Ser

Pro

Leu 885

Asp

Leu

Ala

Gly

Met 890

Met

Ala

Leu

Lys

Tyr 895

Gly

186 242

Ile	Asp His	Asn 900	Tyr Ala Ala	Trp	Gin Ala Ala -Ala Ala Ala Leu Mec
905	910
Ala	Asp His 915	Ala	Asn Gln Ala	Gln 920	Lys Lys Leu	Asp Glu Thr Phe Ser 525
Lys	Ala Leu 930	Cys	Asn T/r Tyr 935	Ile	Asn Ala Val	Val Asp Ser Ala Ala 940
Gly 945	Vai Arg	A*p	Arg Asn aly 950	Leu	Tyr Thr Tyr 955	Leu Leu Ile Asp Asn 960
Gln	val Sar	Ala	Asp Val Ile 965	Thr	Ser Arg Ile 970	Ala Glu Aia Ile Ala 975
Gly	Ile Gln	Leu 980	Tyr Val Asn	Arg	Ala Leu Asn 985	Arg Asp Glu Gly Gin 990
Leu	Ala ser 995	Asp	Val Ser Thr	Arg Gln Phe Phe 1000	Thr Asp Trp Glu Arg 1005
Tyr	Asn Lys 1010	Arg	Tyr ser Thr Trp 1015	Ala Gly Val	Ser Glu Leu Val Tyr 1020
Tyr Pro Glu 1025	Asn	Tyr Val Asp 1030	Pro	Thr Gin Arg Ile Gly Gin Thr Lys 1035 1040
Mec	Mec Asp	Ala	Leu Leu Gln 1045	ser	Ile ten Gln 1050	Ser Gln Leu Asn Ala 1055
Asp	Thr Val	Glu Asp Ala Phe 1060	Lys	Thr Tyr Leu 1065	Thr Ser Phe Glu Gln 1070
Val	Ala ^n Leu 1075	Lys Val Ile	Ser Ala Tyr His 1080	Asp Asn Val ten val 1085
Asp	Gln Gly 1090	Leu	Thr Tyr Phe Ile 1095	Gly Ile Asp	Gln Ala Ala Pro Gly 1100
Thr Tyr Tyr 1105	Trp	Arg Ser Val 1110	Asp	His Ser Lys Cys Glu Asn Gly Lys 1115 1120
Phe	Ala Ala	Asn	Ala Trp Gly 1125	Glu	Trp Asn Lys 113 0	Ile Thr Cys Ala Val 1135
Asn	Pro Trp	Lys ten He He 1140	Arg	Pro Val Val 1145	Tyr Met Ser Arg Leu 1150
Tyr	Leu Leu Trp 1155	Leu Glu Gln	Gln Ser Lys Lys 1160	Ser Asp Asp Gly Lys 1165
Thr	Thr Ile 1170	Tyr	Gln Tyr Asn Leu 1175	Lys Leu Ala	His Ile Arg Tyr Asp 1180
Gly Ser Trp 1135	Asn	Thr Pro Phe 1190	Thr	Phe Asp Val Thr Glu Lys Val Lys 1195 1200
Asn	Tyr Thr	Ser	Ser Thr Asp 1205	Ala	Ala Glu Ser 1210	Leu Gly Leu Tyr Cys 1215
Thr	Gly T/r	Gln Gly Glu Asp 1220	Thr	Leu Leu Val 1225	Mec Phe Tyr Ser Mec 1230

Gln ser Ser Tyr Ser Ser Tyr Thr Asp Asn Asn Ala Pro Val Thr Gly 1235 1240 1245

186 242

Leu

Tyr Ile 1250

Phe

Ala

Asp

Mec Ser 1255

Ser

Asp

Asn

Met Thr 1260

Asn

Ala

Gln

Ala

Thr Asn

Tyr

Trp

Asn

Asn Ser

Tyr

Pro

Gln

Phe Asp

Thr

Val

Met

1265

127!

3

1275

1230

Ala

Asp Pro

Asp

Ser

Asp

Asn Lys

Lys

Val

Ile

Thr Arg

Arg

Val

Asn

1235

129 0

1295

Asn

Arg Tyr

Ala

Glu

Asp

Tyr Glu

Ile

Pro

ser

Ser Val

Thr

Sar

Asn

1300

1305

1310

Ser

Asn Tyr·

Ser

Trp

Gly

Asp His

Ser

Leu

Thr

Mec Leu

Tyr

Gly

Gly

1315

1320

1325

Ser

Val Pro

Asn

Ile

Thr

Phe Glu

Ser

Ala

Ala

Glu Asp

Leu

Arg

Leu

1330

1335

1340

Ser

Thr Asn

Met

Ala

Leu

Ser Ile

Ile

His

Asn

Gly Tyr

Ala

Gly

Thr

1345

1350

1355

1350

Arg

Arg Ile

Gln

Cys

Asn

Leu Met

Lys

Gln

Tyr

Ala Ser

Leu

Gly

Asp

1365

1370

1375

Lys

Phe Ile

Ile

Tyr

Asp

Ser Ser

Phe

Asp

Asp

Ala Asn

Arg

Phe

Asn

1330

1335

1390

Leu

Val Pro

Leu

Phe

Lys

Phe Gly

Lys

Asp

Glu

Asn Ser

Asp

Asp

Ser

1395

1400

1405

Ile

Cys Ile

Tyr

Asn

Glu

Asn Pro

Ser

Ser

Glu

Asp Lys

Lys

Trp

Tyr

1410

1415

1420

Phe

Ser Ser

Lys

Asp

Asp

Asn Lys

Thr

Ala

Asp

Tyr Asn

Gly

Gly

Thr

1425

1430

1435

1440

Gln

Cys Ile

Asp

Ala

Gly

Tnr Ser

ten

Lys

Asp

Phe Tyr

Tyr

Asn

Leu

1445

1450

1455

Gln

Glu Ile

Glu

Val

Ile

Ser Val

Thr

Gly

Gly

Tyr Trp

Ser

Ser

Tyr

1460

1465

1470

Lys

Ile ser

Asn

Pro

Ile

Asn Ile

Asn

Thr

Gly

Ile Asp

Ser

Ala

Lys

1475

1430

14S5

Val

Lya Val

Thr

Val

Lys

Ala Gly

Gly

Asp

Asp

Gln Ile

Phe

Thr

Ala

1490

1495

1500

Asp

Asn ser

Thr

Tyr

Val

Pro Gln

Gin

pro

Ala

Pro ser

Phe

Glu

Glu

1505

1510

1515

1520

Mec

Ile Tyr

Gln

Phe

Asn

ten Leu

Thr

Ile

tep

Cys Lys

ten

Leu

Asn

1525

1530

1535

Phe

Ile Asp

Asn

Gln

Ala

Hs Ile

Glu

Ile

Asp

Phe Thr

Ala

Thr

Ala

1540

1545

1550

Gln

Asp Gly

Arg

Phe

Leu

Gly Ala

Glu

Thr

Phe

Ile Ile

Pro

Val

Thr

1555

1560

1555

Lys

Lys Val

Leu

Gly

Thr

Glu Asn

Ile

Ala

Leu Tyr

Set

Glu

Asn

1570

1575

1530

Asn

Gly Val

Gln

Tyr

Mec

Gln Ile Gly

Ala

Tyr

Arg Thr

Arg

Leu

Asn

1535

1590

1595

1600

186 242

Thr	Leu	Phe	Ala	Gln Gln 1605	Leu Val	Ser	Arg Aia Asn Arg Gly 1610	Ile 1015	Asp
Ala	Val	Leu	Ser	Met Glu	Thr Gln	Asn	Ile Gln Hu Pro Cln	Leu	Gly
			1620		1625	i 1630
Ala	Gly	Thr	Tyr	Val Gln	Leu Val	Leu	Asp Lys Tyr Asp Glu	Ser	Ile
		1635		1640	1645
His	Gly	Thr	Asn	Lys Ser	Phe Ala	Ile	Glu Tyr Val Asp Ile	Phe	Lys
	1650			1655		1660
Glu	Asn	Asp	Ser	Phe Val	Ile Tyr	Gln	Gly Glu Leu Ser Glu	Thr	Ser
1665			1670		1675		1530
Gln	Thr	Val	Val	Lys Val	Phe Leu	Ser	Tyr Phe Ile Glu Ala	Thr	Gly
				1585			1690	1695
Asn	Lys	Asn	His	Leu Trp	Val Arg	Ala	Lys Tyr Gln Lys Glu	Thr	Thr
			1700		1705	i 1710
Asp	Lys	Ile	Leu	Phe Asp	Arg Thr	Asp	Glu Lys Asp Pro His	Gly	Trp
		1715		1720	1725
Phe	Leu	Ser	Asp	Asp His	Lys Thr	Phe	ser Gly Leu Ser Ser	Ala	Gln
	1730			1735		1740
Ala	Leu	Lys	Asn	Asp Ser	Glu Pro	Met	Asp Phe Ser Gly Ala	Asn	Ala
1745			1750		1755		1760
Leu	Tyr	Phe	Trp	Glu Leu	Phe Tyr	Tyr	Thr Pro Met Met Met	Ala	His
				1765			1770	1775
Arg	Leu	Leu	Gln	Glu Gln	Phe	Asp	Ala Ala Asn His Trp	Phe	Arg
			1780		1785 1790
Tyr	Val	Trp	Ser	Pro Ser	Gly Tyr	Ile	Val Asp Gly Lys Ile	Ala	Ile
		1795		1800	1805
Tyr	His	Trp	Asn	Val Arg	Pro Leu	Glu	Glu Asp Thr Ser Trp	Asn	Ala
	1810			1815		1820
Gln	Gln	Leu	Asp	Ser Thr	Asp Pro	Asp	Ala Val Ala Gln Asp	Asp	Pro
1825			1830		1835		1840
Met	His	Tyr	Lys	Val Ala	Thr Phe	Met	Ala Thr Leu ^p Leu	Leu	Met
				1845			1850	1855
Ala	Arg	Gly	Asp	Ala Ala	Tyr Arg	Gln	Leu Glu Arg Asp Thr	Leu	Ala
			1860		1865 1870
Glu	Ala	Lys	Met	Trp Tyr	Thr Gln	Ala	Leu Asn Leu Leu Gly	Asp	Glu
		1875		1880	1885
Pro	Gln	Val	Met	Leu Ser	Thr Thr	Trp	Ala Asn Pro Thr Leu	Gly	Asn
	1890			1895		1900
Ala	Ala	ser	Lys	Thr Thr	Gln Gln	Val	Arg Gln Gln Val Leu	Thr	Cln
1905			1910		1915		1920
Leu	Arg	Leu	Asn	Ser Arg	Val Lys	Thr	Pro Leu Leu Gly Thr	Ala	Asn
				1925			1930	1935
Ser	Leu	Thr	Ala	Leu Phe	Leu Pro	Gln	Glu Asn Ser Lys Leu	Lys	Gly
			1940		1945 1950

186 242

Tyr Trp Arg Thr Leu Ala	Gln	Arg Mec 1360	Phe Asn	Leu	Arg His 1965	As M
	1955
Ser	Ile Asp Gly Gln Pro	Leu	Ser Leu	Pro Leu	Tyr	Ala Lys	Pro Ala
	1970	1975		1930
Asp	Pro Lys Ala Leu Leu	Ser	Ala Ala	Val Ser	Ala	Ser Gln	Gly Gly
1935 1990		1995		2000
Ala	Asp Leu Pro Lys Ala	Pro	Leu Thr	Ile His	Arg	Phe Pro	Gln Mec
	2005			2010			2015
Leu	Glu Gly Ala Arg Gly	Leu	Val Asn	Gln Leu	Ile	Gln Phe	Gly Ser
	2020		2025		2030
Ser	Leu Leu Gly Tyr Ser	Glu	Arg Gln	Asp Ala	Glu	Ala Mec	Ser Gln
	2035		2040			2045
Leu	Leu'Gln Thr Gln Ala	Ser	Glu Leu	lle Leu	Thr	Ser Ile	Arg Mec
	2050	2055		2060
Gln	Asp Asm O!m Leu Ala	Glu	Leu Asp	Ser Glu	Lys	Thr Ala	Leu Gln
2065 2070		2075		2030
Val	Ser Leu Ala Gly Val	Gln	Gln Arg	Phe Asp	Ser	Tyr Ser	Gln Leu
	2035			2090			2095
Tyr	Glu Glu Asm Ile Asm	Ala	Gly Glu	Gln Arg	Ala	Leu Ala	Leu Arg
	2100		2105		2110
Ser	Glu Ser Ala Ile Glu	ser	Gln Gly	Ala Gln	Ile	Ser Arg	Mec Ala
	2115		2120			2125
Gly	Ala Gly Val Asp Mec	Ala	Pro Asn	Ile Phe	Gly	Leu Ala	Asp Gly
	2130	2135		2140
Gly	Mec His Tyr Gly Ala	Ile	Ala Tyr	Ala Ile	Ala	Asp Gly	Ile Glu
2145	i 2150		2155		2160
Leu	Ser Ala Ser Ala Lys	Mec	Val Asp	Ala Glu	Lys	Val Ala	Gln Ser
	2165			2170			2175
Glu	Ile Tyr Arg Arg Arg	Arg	Gln Glu	Trp Lys	Ile	Gln Arg	Asp Asn
	2130		2135		2190
Ala	Gln Ala Glu Ile Asm	GlM	Leu Asn	Ala Gln	Leu	Glu Ser	Leu Ser
	2195		2200			2205
Ile	Arg Arg Olu Ala Ala	Glu	Mec GlM	Lys Glu	Tyr	Leu Lys	Thr Gln
	2210	2215		2220
Gln	Ala Gln Ala Gln Ala	GlM	Leu Thr	Phe Leu	Arg	Ser Lys	Phe Ser
2225 2230		2235		2240
Asn	Gln Ala Leu Tyr Ser	Trp	Leu Arg	Gly Arg	Leu	Ser Gly	Ile Tyr
	2245			2250			2255
Phe	Gln Phe Tyr Asp Leu	Ala	Val Ser	Arg Cys	Leu	Mec Ala	Glu Gln
	2260		2265		2270
Ser	Pyr Gln Trp Glu Ala	Asn	Asp Asm	Ser Ile	Ser	Phe Val	Lys Pro
	2275		2230			2235
Gly	Ala Trp Gln Gly Thr	Tyr	Ala Gly	Leu Leu	Cys	Gly Glu	Ala Leu
	2290	2295		2300

186 242

Ile Cln Asn 2305	Leu	Aid	Gin Mec 2310	Glu	Glu	Aid	Pyr Leu Lys 2315	Trp	GlU	Ser 2320
Arg Ala Leu	Glu	Val Glu Arg 2325	Thr	Val	Ser Leu Ala Val 2330	val	Tyr 2335	Asp
Ser Leu Clu	Gly Asn 2340	Asp Arg	Phe	Asn Leu 2345	Aid. Giu Gin	Ile Pro 2350	Ala
Leu Leu Asp 2355	Lys	cly	Glu Cly	Thr Ala 2360	Gly	Thr Lys Glu Asn 2365	Gly	Leu
Ser Leu Ala 2370	Asn	Ala	Ile Leu 2375	Ser	Ala	Ser	Val Lys Leu 2380	Ser	Asp	Leu
Lys Leu Gly 2385	Thr	Asp	Pyr Pro 2390	Asp	Ser	Ile	Val Gly Ser 2395	Asn	Lys	Val 2400
Arg Arg Ile	Lys	Gln 2405	Ile Ser	Val	Ser	Leu 2410	Pro Ala Leu 1	VaL	cly 2415	Pro 1
Tyr Gln Asp	Val Gln 2420	Ala Mec	Leu	Ser Tyr 2425	Gly Gly Ser	Thr Gln 2430	Leu
Pro Lys cly cys 2435	Ser	Ala Leu	Ala Val 2440	Ser	His Gly Thr Asn 2445	Asp	Ser
Gly Gln Phe 2450	Gln	Leu	Asp Phe Asn 2455	Asp	Gly	Lys Pyr Leu 2460	Pro	Phe	Glu
Gly Ile Ala 2465	Leu	ASp	Asp Gln 2470	Gly	Thr	Leu	Asn Leu Gln 2475	Phe	Pro	Asn 2480
Ala Thr Asp	Lys	Gln Lys Ala 2485	Ile	Leu	Gln Thr Met Ser 2490	Asp	Ile Ile 2495

Leu His Ile Arg Tyr Thr Ile Arg *

2500 2505 ( 2) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 13;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 12 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa ( ii) Typ cząsteczki: peptyd ( xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 13;

Leu Ile Gly Tyr Asn Asn Głn Phe Ser Gły Xaa Ala 1 5 10 ( 2) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 14;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 12 aminokwasów (B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici, pojedyncza (D ) Topologia: liniowa

186 242 ( ii ) Typ cząsteczki: peptyd ( xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 14;

Met Gln Asn Ser Gln Thr Phe Ser Val Gly Glu Leu 1 5 10 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 15;

(i ) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 9 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici: pojedyncza ( D ) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opi sekkwencj i: SEK NR ID: 15;

Ala Gln Asp Gly Asn Gln Asp Tir F^ł^e Phe Ser Gly Asn TTrr 1 5 10 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 16;

( i ) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 5 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici: pojedyncza ( D ) Topologia: liniowa ( c ) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 16;

Met Gln Asn Ser Leu 1 5 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 17;

(i ) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 10 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici: pojedyncza ( D ) Topologia: liniowa (ii ) Typ cząsteczki: peptyd ( xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 17;

Ala Phe Asn Ile Asp Asp Val Ser Leu Phe

5 10

186 242 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 18;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 16 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici: pojedyncza ( D ) Topologia: liniowa (i) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 18,

Phe Ile Val Tyr Thr Ser Leu Gly Val Asn Pro Asn Asn Ser Ser Asn 15 10 15 (2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 19;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 21 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (i ) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 19;

Ile Ser Asp Leu Val Thr Thr Ser Pro Leu Ser Glu Ala Ile Gly Ser 15 10 15 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 20;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) EDługoć: 12 aa:ύnoCwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (i) Typ cząsteczki: peptyd ( xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 20;

Met Tyr Tyr Ile Gln Ala Gln Gln Leu Leu Gly Pro 1 5 10 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID:21;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 26 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici: pojedyncza ( D ) Topologia: liniowa

186 242 (ii ) Typ cząsteczki: peptyd ( xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 21;

Gly Ile Asp Ala Val Leu Ser Met Glu Thr Gln Asn Ile Gln Glu Pro 15 10 15 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID:22;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 15 aminokwasów (B) Typ: aminokwas ( C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii ) Typ cząsteczki: peptyd ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 22;

Ile Ser Asn Pro Ile Asn De Asn Thr Gly Ile Asp Ser Ala Lys 15 10 15 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID:23;

(i ) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 23;

Thr Tyr Leu Thr Ser Phe Glu Gln Val Ala Asn Leu Lys 1 5 10 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 24;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 22 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas (C) Rodzaj nici: pojedyncza ( D ) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd ( xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 24;

Val Leu Gly Thr Glu Asn Val Ile Ala Leu Tyr Ser Glu Asn Asn Gly 1 5 10 15

Val Gln Tyr Met Gln Ile

186 242 (2) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 25;

(i ) Charakterystyka sekwencji:

( A) Długość: 6005 par zasad ( B ) Typ: kwas nukleinowy (C ) Rodzaj nici: podwójna ( D ) Topologia: liniowa (ii ) Typ cząsteczki: DNA ( genomowy ) (Cc) Cechy:

(A) Nazwa/Klucz: RBS (B) Położenie: 1..9 (lx ) Cechy:

(A) Nazwa/Klucz: CDS ( B ) Położenie: 16.. 3585 ( D ) Inne dane: /produkt = „P8” ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 25;

AAGAAGGAAT TGATT ATC TCT GAA TCT TTA TTT ACA CAA ACG TTG AAA GAA 51

Mec Ser Glu Ser Leu Phe Thr Gln Thr Leu Lys Glu

10

GCG Ala

CGC CGT GAT GCA TTG

GTT GCT CAT TAT

ATT GCT ACT CAG GTG Ile Ala Thr Gin Val 25

CCC Pro

99

Arg

Arg Asp 15

Ala

Leu

Val Ala 20

His

Tyr

GCA

GAT

TTA

AAA

GAG

AGT

ATC

CAG

ACC

GCG

CAT

CAT

CTG

TAC

GAA

TAT

147

Ala

Asp

Leu

Lys

Glu

ser

Ile

Gln

Thr

Aia

Asp

Asp

Leu

Tyr

Glu

Tyr

30

35

40

CTG

TTG

CTG

GAT

ACC

AAA

ATT

AGC

CAT

CTC

GTT

ACT

ACP

TCA

CCG

CTG

195

Leu

Leu

Leu

Asp

Thr

Lys

Ile

Ser

Asp

Leu

Val

Thr

Thr

Ser

Pro

Leu

45

50

55

60

TCC

GAA

GCG

ATT

CCC

AGT

CTG

CAA

TTC

TTT

ATT

CAT

CGT

GCG

ATA

GAG

243

Ser

Glu

Ala

Ile

Gly

Ser

Leu

Gln

Leu

Phe

Ile

His

Arg

Ala

Ile

<31u

65

70

75

CGC

TAT

GAC

GGC

ACG

CTG

GCA

GAC

TCA

GCA

AAA

CCC

TAT

TTT

GCC

CAT

291

Gly

Tyr

tep

Gly

Thr

Leu

Ala

Asp

Ser

Ala

Lys

Pro

Tyr

Phe

Ala

Asp

80

85

90

GAA

CAG

TTT

TTA

TAT

AAC

TGG

GAT

ACT

TTT

AAC

CAC

CGT

TAT

AGC

ACT

339

Olu

Gin

Phe

Leu

Tyr

Asn

Trp

Asp

Ser

Phe

Asn

His

Arg

Tyr

Ser

Thr

95

100

105

TGG

GCT

GGC

AAG

GAA

CGG

TTG

AAA

TTC

TAT

GCC

GGG

GAT

TAT

ATT

GAT

387

Trp

Ala

dy

Lys

Glu

Arg

Leu

Lys

Phe

Tyr

Ala

Gly

Asp

Tyr

Ile

Asp

110

115

120

CCA

ACA

TTC

CGA

TTG

AAT

AAG

ACC

GAG

ATA

TTT

ACC

GCA

TTT

GAA

CAA

435

Pro

Thr

Leu

Arg

Leu

Asn

Lys

Thr

Glu

Ile

Phe

Thr

Ala

Phe

du

Gln

125

130

135

140

186 242

CCT Gly

ATT Ile

TCT Ser

C7_—_A OOO Gln Gly 145

AAA Lys

TTA AAA AGT GAA TTA CTC GAA TCT AAA

TTA Leu

433

Leu Lys

5er

Glu 150

Leu val Glu

Ser

Lys 155

CGT

GAT

TAT

CTA ATT

AGT

TAT GAC

ACT

TTA

CCC ACC CTT

GAT

TAT

ATT

531

Arg

Asp

Tyr

Leu Ile

Ser

Tyr Asp

Thr

Leu

Ala Thr Leu

ASP

Tyr

ile

160

165

170

ACT

GCC

TGC

CAA GGC

AAA

GAT AAT

AAA

ACC

ATC TTC TTT

ATT

CGC

CGT

57 9

Thr

r\ia

cys

Gln Gly

Lys

Asp Asn

Lys

Thr

Ile Phe Phe

Ile

Gly

Arg

175

180

185

ACA

CAG

AAT

GCA CCC

TAT

GCA TTT

TAT

TGG

CGA AAA TTA

ACT

TTA

GTC

627

Thr

Gln

Asn

Ala Pro

Tyr

Ala Phe

Tyr

Trp

Arg Lys Leu

Thr

Leu

Vai

190

195

200

ACT

CAT

GGC

GGT AAG

TTG

AAA CCA

GAT

CAA

TGG TCA CAG

TGC

CGA

GCA

675

Thr

Asp

Gly Gly Lys

Leu

Lys pro

ASP

Gln

Trp ser clu

Trp

Arg

Ala

205

210

215

220

ATT

AAT

GCC

GGG ATT

AGT

GAG GCA

TAT

TCA

GGG CAT GTC

GAC

CCT

TTC

723

Ile

Asn

Ala

Gly Ile

ser

GlU Ala

Tyr

Ser

Gly His Val

Glu

Pro

Phe

225

230

23 5

TCG

GAA

AAT

AAC AAG

CTG

CAC ATC

CGT

TGG

TTT KCT ATC

TCG

AAA

GAA

771

Trp

Glu

Asn

Asn Lys

Leu

His Ile

Arg

Trp

Phe Thr Ile

Ser

Lya

Glu

240

245

250

GAT

AAA

ATA

GAT TTT

GTT

TAT AAA

AAC

ATC

TCG CTG ATG

AGT

AGC

CAT

819

Asp

Lys

11«

Asp Phe

Val

Tyr Lys

Asn

Ile

Trp Val Met

Ser

Ser

Asp

255

260

265

TAT

ACC

TCG

GCA TCA

AAG

AAA AAA

ATC

TTG

GAA CTT TCT

TTT

ACT

GAC

367

Tyr

Ser

Trp

Ala Ser

Lys

Lys Lya

Ile

Leu

Clu Leu Ser

Phe

Thr

Asp

270

275

280

TAC

AAT

AGA

GTT GGA

GCA

ACA GGA

TCA

TCA

AGC CCG ACT

CAA

GTA

CCT

915

tyr

Asn

Arg

Val Gly

Ala

Thr Gly

Ser

Ser

Ser Pro Thr

Glu

Wal

Ala

28S

290

295

300

TCA

CAA

TAT

GGT TCT

GAT

GCT CAG

ATG

AAT

ATT TCT GAT

CAT

GGC

ACT

963

Sar

Gln

Tyr

Gly Ser

Asp

Ala cln

Met

Asn

Ile Ser Asp

Asp

Cly

Thr

305

310

315

GTA

CTT

ATT

TTT CAG

AAT

GCC GGC

GGA

GCT

ACT CCC ACT

ACT

CGA

GTC

1011

Val

Leu

Ile

Phe Gln

Asn

Ala Gly

Giy

Ala

Thr Pro Ser

Thr

Gly

V*1

320

325

330

ACG

TTA

TGT

TAT GAC

TCT

GGC AAC

GTG

ATT

AAG AAC CTA

TCT

AGT

ACA

1059

Thr

Leu

Cys

Tyr Asp

Ser

Cly Asn

VAl

Ile

Lys Asn Leu

Ser

Ser

Thr

335

340

345

GGA

AGT

GCA

AAT TTA

TCC

TCA AAG

CAT

TAT

GCC ACA ACT

AAA

TTA

CGC

1107

Gly

Ser

Ala

Asn Leu

Ser

Ser Lys

Asp

Tyr

Ala Thr Thr

Lys

Leu

Arg

350

355

360

ATG

TGT

CAT

GCA CAA

ACT

TAC AAT

CAT

AAT

AAC TAC TGC

AAT

TTT

ACA

1155

Met

cys

HiS

Gly Gln

Ser

Tyr Asn

Asp

Asn

Asn Tyr Cys

Asn

Phe

Thr

365

370

375

330

CTC

TCT

ATT

AAT ACA

ATA

GAA TTC

ACC

TCC

TAC GGC ACA

TTC

TCA

TCA

1203

Leu

Ser

Ile

Asn Thr

Ile

Glu Phe

Thr

Ser

Tyr Gly Thr

Phe

ser

Ser

385

390

395

GAT

GGA

AAA

CAA TTT

ACA

CCA CCT

TCT

GGT

TCT GCC ATT

GAT

TTA

CAC

12 51

ASP

Giy

Lys

Gln Phe

Thr

Pro Pro

Ser

Cly

Ser Ala Ile

Asp

Leu

His

100

186 242

400 405 410

CTC

CCT

AAT

TAT

GTA

GAT

CTC

AAC

GCG

CTA

TTA

GAT

ATT

AGC

CTC

GAT

1299

Lau

Pro

Asn 415

Tyr

Val

Asp

Leu

Asn 420

Ala

Leu

Leu

Asp

Ile 425

Ser

Leu

Asp

TCA

CTA

CTT

AAT

TAT

GAC

GTT

CAG

GGG

CAG

TTT

GGC

GCA

TCT

AAT

1347

Ser

Leu 430

Leu

Asn

Tyr

Asp

Val 435

Gln

Cly

Gln

Phe

Gly 440

Gly

Ser

Asn

Pro

GTT

GAT

AAT

TTC

ACT

GCT

CCC

TAT

GGT

ATT

TAT

CTA

TGC

GAA

ATC

TTC

1395

Val 445

Asp

Asn

Phe

Ser

Gly 450

Pro

Tyr

Gly

Ile

Tyr 455

Leu

Trp

Glu

Ile

Phe 460

TTC

CAT

ATT

CCG

TTC

CTT

GTT

ACG

GTC

CGT

ATG

CAA

ACC

GAA

CAA

CGT

1443

Phe

His

Ile

Pro

Phe 465

Leu

Val

Thr

Val

Arg 470

Met

Gln

Thr

Glu

Gln 475

Arg

TAC

CAA

GAC

GCG

GAC

ACT

TGC

TAC

AAA

TAT

ATT

TTC

CGC

AGC

GCC

GGT

1491

Tyr

Glu

Asp

Ala 430

Asp

Thr

Trp

Tyr

Lys 435

Tyr

Ile

Phe

Arg

Ser 490

Ala

Gly

TAT

CGC

GAT

GCT

AAT

GGC

CAC

CTC

ATT

ATG

GAT

GGC

ACT

AAA

CCA

CGT

1539

Tyr

Arg

Asp 495

Ala

Asn

Gly

Gln

Leu 500

Ile

Met

Asp

Cly

Ser 505

Lys

Pro

Arg

TAT

TGG

AAT

GTC

ATC

CCA

TTG

CAA

CTG

GAT

ACC

GCA

TGC

GAT

ACC

ACA

1537

Tyr

Trp 510

Asn

Val

Met

Pro

Leu 515

Gln

Leu

Asp

Thr

Ala 520

Trp

Asp

Thr

Thr

CAG

CCC

GCC

ACC

ACT

GAT

CCA

GAT

GTC

ATC

GCT

ATG

GCG

GAC

CCC

ATG

1535

Gln 525

Pro

Ala

Thr

Thr

Asp 530

Pro

Asp

Val

Ile

Ala 535

Mac

Ala

Asp

Pro

Met 540

CAT

TA.C

AAG

CTC

GCC

ATA

TTC

CTG

CAT

ACC

CTT

GAT

CTA

TTG

ATT

GCC

1633

His

Tyr

Lys

Leu

Ala 545

Ile

Phe

Leu

His

Thr 550

Leu

Asp

Leu

Leu

Ile 555

Ala

CGA

GGC

GAC

ACC

GCT

TAC

CCT

CAA

CTT

CAA

CGC

GAT

ACT

CTA

GTC

GAA

1731

Arg

Gly

Asp

Ser 560

Ala

Tyr

Arg

cin

Leu 565

Glu

Arg

Asp

Thr

Leu 570

val

Glu

GCC

AAA

ATO

TAC

TAC

ATT

CAG

OCA

CAA

CAG

CTA

CTC

GCA

CCG

CGC

CCT

1779

Ala

Lys

Met 575

Tyr

Tyr

Ile

Gln

Ala 580

Gln

Gln

Leu

Leu

Gly 585

Pro

Arg

Pro

GAT

ATC

CAT

ACC

ACC

AAT

ACT

TGC

CCA

AAT

CCC

ACC

TTC

AGT

AAA

GAA

1327

Asp

Ile 590

His

Thr

Thr

Asn

Thr 595

Trp

Pro

Asn

Pro

Thr 600

Leu

Ser

Lys

Glu

GCT

GGC

GCT

ATT

GCC

ACA

CCG

ACA

TTC

CTC

ACT

TCA

CCC

GAC

CTG

ATG

1375

Ala 605

Gly

Ala

Ile

Ala

Thr 610

Pro

Thr

Phe

Leu

Ser 615

ser

Pro

Glu

Val

Met 620

ACC

TTC

CCT

CCC

TGC

CTA

ACC

GCA

GGC

CAT

ACC

GCA

AAT

ATT

CCC

CAC

1923

Thr

Phe

Ala

Ala

Trp 625

Leu

Ser

Ala

Gly

Asp 630

Thr

Ala

Asn

Ile

Gly 635

Asp

GGT

GAT

TTC

TTC

CCA

CCG

TAC

AAC

CAT

GTA

CTA

CTC

GGT

TAC

TGG

GAT

1971

Gly

Asp

Phe

Leu 640

Pro

Pro

Tyr

Asn

Asp 645

Val

Leu

Leu

Gly

Tyr 650

Trp

Asp

AAA

CTT

GAC

TTA

CGC

CTA

TAC

AAC

CTG

CGC

CAC

AAT

CTC

AGT

CTG

GAT

2013

Lys

Leu

Clu 655

Leu

Arg

Leu

Tyr

Asn 660

Leu

Arg

His

Asn

Leu 665

Ser

Leu

Asp

186 242

101

GGT CAA

CCG CTA

AAT Asn

CTG Leu

CCA Pro 675

CTG TAT GCC

ACG CCG GTA GAC CCG AAA

20ó~

Gly

Gln 670

Pro

Lau

Leu Tyr

Ala

Thr

Pro 680

Val

Asp

Pro

Lys

ACC

CTG

CAA

CGC

CAG

CAA

GCC

GGA GGG

GAC

GGT

ACA

GGC

AGT

AGT

CCG

2115

Thr 685

Leu

Gln

Arg

Gln

Gln 690

Ala

Gly Gly

Asp

Gly 695

Thr

Gly

Ser

Ser

Pro 700

GCT

GGT

GGT

CAA

GGC

AGT

GTT

C.-.G GGC

TGG

CGC

TAT

CCG

TTA

TTG

GTA

2153

Ala

dy

dy

Gln

Gly 705

Ser

Val

Gln Gly

Trp 710

Arg

Tyr

Pro

Leu

Leu 715

Val

GAA

CGC

GCC

CGC

TCT

GCC

GTG

AGT TTG

TTG

ACT

CAG

TTC

GGC

AAC

AGC

2211

Glu

Arg

Ala

Arg 720

Ser

Ala

Val

ser Leu 725

Leu

Thr

dn

Phe

Gly 730

Asn

Ser

TTA

CAA

ACA

ACG

TTA

GAA

CAT

CAG GAT

AAT

GAA

AAA

ATG

ACG

ATA

CTG

2259

Leu

Gln

Thr 735

Thr

Leu

du

His

Gln Asp 740

ten

Glu

Lys

Met 745

Thr

Ile

Leu

TTG

CAG

ACT

CAA

CAG

GAA

GCC

ATC CTG

AAA

CAT

CAG

CAC

GAT

ATA

CAA

2307

Leu

Cln 750

Thi

Gln

Gln

Glu

Ala 755

Ile Leu

Lys

His

Gln 760

His

Asp

Ile

Gln

CAA

AAT

AAT

CTA

AAA

GGA

TTA

CAA CAC

AGC

CTG

ACC

GCA

TTA

CAG

GIT

2355

Gln 765

Asn

Asn

Leu

Lys

Gly 770

Leu

Gln His

Ser

Leu 775

Tit

Ala

Leu

Gln

Ala 730

AGC

CGT

CAT

GGC

GAC

ACA

TTG

CGG CAA

AAA

CAT

TAC

AGC

GAC

CTG

ATT

2403

Ser

Arg

Asp

dy

Asp 785

Thr

^au

Arg Gln

Lys 790

His

Tyr

Ser

Asp

Leu 795

Ile

AAC

GGT

GGT

CTA

TCT

GCG

GCA

GAA ATC

GCC

GTT

CTG

ACA

CTA

CGC

AGC

2451

Asn

Gly Gly

Leu 800

Ser

Ala

Ala

Glu Ile 805

Ala

dy

Leu

Thr

Leu 810

Arg

Ser

ACC

GCC

ATG

ATT

ACC

AAT

GGC

GTT GCA

ACG

GGA

TTG

CTG

ATT

GCC

GGC

2499

Thr

Ala

Mec 815

Ile

Thr

Asn

Giy

Val Ala 820

Thr

Gly

Leu

Leu 823

Ile

Ala

dy

GGA

ATC

GCC

AAC

GCG

GTA

CCT

AAC GTC

TTC

GGG

CTG

GCT

AAC

GGT

GGA

2547

Gly

Ile 830

Ala

Asn

Ala

val

Pro 835

ten Val

Phe

Gly

Leu 840

Ala

Asn

dy

Gly

TCG

GAA

TGG

GGA

GCG

CCA

TTA

ATT GGC

TCC

GGG

CAA

GCA

ACC

CAA

GTT

2595

Ser 845

Glu

Trp

Gly

Ala

Pro 850

Leu

Ile Gly

Ser

dy 855

Cln

Ala

Thr

dn

Val 860

GGC

GCC

GGC

ATC

CAG

GAT

CAG

AGC GCG

GGC

ATT

TCA

GAA

GTG

ACA

CGCA

2643

Gly

Ala

Gly

He

Gln 865

tep

Gln

Ser Ala

dy 870

Ile

Ser

Glu

Val

Thr 875

Ala

GGC

TAT

CAG

CGiT

CGT

CAG

GAA

GAA TOG

GCA

TTG

CAA

CGG

GAT

ATT

GCT

2691

Gly

Tyr

Gln

Arg 830

Arg

Gln

Glu

Glu Trp 885

Ala

Leu

Gln

Arg

tep 890

Ile

Ala

GAT

AAC

GAA

ATA

ACC

CAA

CTG

CAT GCC

CAG

ATA

CAA

AGC

CTG

CAA

GAG

2739

tep

Asn

Glu 895

Ile

Thr

Gln

Leu

tep Ala 900

Gln

Ile

Gln

Ser 905

Leu

Gln

du

CAA

ATC

ACG

ATG

GCA

CAA

AAA

CAG ATC

ACG

CTC

TCT

GAA

ACC

GAA

CAA

2737

Gln

Ile 910

Thr

Mec

Ala

Gln

Lys 915

Gln Ile

Thr

Leu

Ser 920

Glu

Thr

Glu

Gln

GCG

AAT

GIC

CAA

GIG

ATT

TAT

GAC CTG

CAA

ACC

ACT

CGT

ttt

ACC

GGG

2835

Ala

Asn

Ala

Gln

Ala

Ile

Tyr

Asp Leu

Gln

Thr

Thr

Arg

Phe

Thr

Gly

102

186 242

525	930	935	940
CAG GCA CTG TAT	AAC TGG	ATG GCC GGT CGT CTC TCC	GCG CTC TAT TAC 2333
Gln Ala Leu Tyr	Asn Trp	Mec Ala Gly Arg Leu Ser	Ala Leu Tyr Tyr
	945	950	955
CAA ATG TAT GAT	TCC ACT	CTG CCA ATC TGT CTC CAG	CCA AAA GCC GCA 2931
Gln Mec Tyr Asp	Ser Thr	Leu Pro Ile C/s Leu Gln	Pro Lys Aia Ala
960		965	970
TTA GTA CAG GAA	TTA GGC	GAG AAA GAG AGC GAC AGT	CTT TTC CAG GTT 2979
Leu Val Gln Glu	Leu Gly	Glu Lys Glu ser Asp ser	Leu Phe Gln val
975		980	985
CCG GTG TGG AAT	GAT CTG	TGG CAA GGG CTG TTA GCA	GGA GAA GG TTA 3027
pro Val Trp Asn	^p Leu	Trp Gln Gly Leu Leu Ala	Gly Glu dy Leu
990		995 1000
AGT TCA GAG CTA	CAG AAA	CTG GAT GCC ATC TGG CTT	GCA CGT GGT GGT 3075
Ser Ser Glu Leu	Gln Lys	Leu Asp Ala Ile Trp Leu	Ala Aieg Cly dy
1005	1010 1015	1020
ATT GGG CTA GAA	GCC ATC	CGC ACC GTG TCG CTG GAT	ACC CTG TTT GCC 3123
Ile Gly Leu Clu	Ala Ile	Arg Thr Val Ser Leu Mp	Thr Leu Phe Gly
	1025	1030	1035
ACA GGG ACG TTA	AGT GAA	AAT ATC AAT AAA GTG CTT	AAC GGG GAA ACG 3171
Thr dy Thr Lau	Ser Glu	Mn Ile ^n Lys Val Leu	Asn Gly Glu Thr
1040	1045	1050
GTA TCT CCA TCC	GGT GGC	GTC ACT CTG GCG CTG ACA	GGG GAT ATC TTC 3219
Val Ser Pro Ser	dy Gly	Val Thr Leu Ala Leu Thr	Gly Mp Ile Phe
1055		1060	1065
CAA GCA ACA CTG	GAT TTG	ACT CAG CTA GGT TTG GAT	AAC TCT TAC AAC 3267
Gln Ala Thr Leu	Asp Leu	Ser Gln Leu Gly Asn	Mn Ser Tyr Mn
1070		1075 1080
TTG GTT AAC GAG	AAG AAA	CGT CGT ATT AAA CGT ATC	GCC GTC ACC CTG 3315
Leu Gly Asn Glu	Lys Lys	Arg Ma Ile Lys Arg Ile	Ala Val Thr Leu
1085	1090 1095	1100
CCA ACA CTT CTG	GGC CCA	TAT CAA GAT CTT GAA GCC	ACA CTG GTA ATG 3363
Pro Thr Leu Leu	Gly Pro	Tyr Gln Mp Leu Glu Ala	Thr Leu Val Mec
	1105	1110	1115
GGT GCG GAA ATC	GCC GCC	TTA TCA CAC GGT GTG AAT	GAC GGA GCC CGG 3411
Gly Ala Glu Ile	Ala Ala	Leu Ser His Gly Val Asn	Asp Gly Gly Arg
1120	1125	1130
TTT GTT ACC GAC	TTT AAC	GAC AGC CGT TTT CTG CCT	m CAA GGT CGA 3459
Phe Val Thr ^p	Phe Asn	Mp Ser Arg Phe Leu Pro	Phe Glu Gly Arg
1135		1140	1145
GAT GCA ACA ACC	GGC ACA	CTG GAG CTC AAT ATT TTC	CAT GCG CTT AAA 3507
Asp Ala Thr Thr	dy Thr	Leu Glu Leu Mn Ile Phe	His Ala Gly Lys
1150		1155 1160
GAG GGA ACG CAA	CAC GAG	TTG GTC GCG AAT CTG AGT	GAC ATC ATT GTG 3555
du Gly Thr Gln	His Glu	Leu Vai Ala Asn Leu Ser	Mp Ile Ile Val
1165	1170 1175	1180
CAT CTG AAT TAC	ATC ATT	CGA GAC GCG TAA ArriLTrriT TTTCTCGJ^TT .5 6 Ul
Hls Leu Asn Tyr	Ile He	Arg Asp Ala *
	1185	1190

186 242

103

ACAa-λ-» AAGCT	atcaggggcc	TCTTATTAAG	GACTACTTAA	TCCAGGATTC	ACCAGAACTA	3 665
TCGATTACAA	CGCTGTCACT	TCCCAAAGCT	ggcggtgcta	TCAATGGCAT	GGGAGAAGCA	3715
CTGAATGCTG	CCGGCCCTGA	TGGAATGGCC	TCCCTATCTC	TGCCATTACC	CCTTTCGACC	3785
GGCAGAGGGA	CGGCTCCTGG	ATTATCGCTG	ATTTACAGCA	ACAGTGCAGG	TAATGGGCCT	3845
TTCGGCATCG	GCTGGCAATG	CGGTGTTATG	TCCATTAGCC	GACGCACCCA	ACATGGCATT	3905
CCACAATACG	GTAATGACGA	CACGTTCCTA	TCCCCACAAG	GCGAGGTCAT	GAATATCGCC	3S55
CTGAATGACC	AAGGGCAACC	TGATATCCGT	CAAGACGTTA	AAACGCTGCA	AGGCGTTACC	4025
TTGCCAATTT	CCTATACCGT	GACCCGCTAT	CAAGCCCGCC	AGATCCTGGA	TTTCACTAAA	4085
ATCGAATACT	GGCAACCTGC	CTCCGCTCAA	GAAGGACGCG	CTTTCTGGCT	GATATCGACA	4145
CCCGACCCCC	ATCTACACAT	CTTAGGGAAA	ACCGCGCAGG	CTGJTCTGGC	AAATCCGCAA	4205
AATGACCAAC	AAATCGCCCA	GTGGTG5CIG	GAAGAAACGG	TGACGCCAGC	CGGTGAACAT	4265
CTCACCTATC	AATATCGAGC	CGAAGATGAA	GCCCATTGTG	ACGACAATGA	AAAAACCGCT	4325
CATCCCAATG	TTACCGCACA	GCGCTATCTG	GTACAGGTGA	ACTACAGGCA	ACATCAAACC	4385
ACAACCCAGC	CVGTTCGTAC	TGGATAACGC	ACCTCCCGCA	CCGGAAGAGT	GgcTgTT tca	4445
TCTGGTCTTT	GACCACGGTG	AGCGCGTACC	TCACTTCATA	CCGTGCCAAC	ATGGGATGCA	4505
GGTACAGCGC	AATGGTCTGT	ACGCCCGGAT	ATCTTCTCTC	GCTATGAATA	TGGTTTTGAA	4565
GTGCGTACTC	GCCGCTTATG	TCAACAAGTG	CTGATGTTTC	ACCGCACCGC	GCTCATGGCC	4625
GGAGAAGCCA	GTACCAATGA	CGCCCCGGAA	CTGGTTGGAC	GCTTAATACT	GGAATATGAC	4685
AAAAACGCCA	GCGTCACCAC	CTTGATTACC	ATCCGTCAAT	TAAGCCATGA	ATCGGACGGG	4745
AGGCCAGTCA	CCCAGCCACC	ACTAGAACTA	GCCTGGCAAC	GGTTTGATCT	GGAGAAAATC	4805
CCGACATGGC	AACGCTTTGA	CGCACTAGAT	AATTTTAACT	CGCAGCAACG	TTATCAACTG	4865
GTTGATCTGC	GGGGAGAAGG	GTTOCCAGGT	ATGCTGTATC	AAGATCGAGG	CGCTTGCTGG	4925
TATAAAGCTC	CGCAACGTCA	GGAAGACGGA	GACAGCAATG	CCGTCACTTA	CGACAAAATC	4985
GCCCCACTCC	CTACCCTACC	CAATTTGCAG	GATAATGCCT	CATTGATGGA	TATCAACGGA	5045
gacggccaac	TGGATTGGGT	TGTTACCGCC	TCCGGTATTC	GCGGATACCA	TAGTCAGCAA	5105
CCCGATGGAA	AGTGGACGCA	CTTTACGCCA	ATCAATGCCT	TGCCCGTGGA	ATATTTTCAT	5165
CCAAGCATCC	AGTTCGCTGA	CCTTACCGGG	GCAGGCTTAT	CTGATTTAGT	GTTGATCGGG	5225
CCGAAAAGCG	TGCGTCTATA	TCCCAACCAG	CGAAACGGCT	GGCGTAAAGG	AGAAGATGTC	5235
CCCCAATCCA	CAGGTATCAC	CCTGCCTGTC	ACAGGGACCG	ATGCCCGCAA	ACTGGTGGCT	5345
TTCAGTGATA	TGCTCGGTTC	CGGTCAACAA	CATCTGGTGG	AAATCAAGGG	TAATCGCGTC	5405
ACCTCTGGCC	CGAATCTAGG	GCATGGCCGT	TTCGGTCAAC	CACTAACTCT	GTCAGGATTT	5465
AGCCAGCCCC	AAAATAGCTT	CAATCCCGAA	CGGCTGTTTC	TGGCGGATAT	CGACGGCTCC	5525
GGCACCACCG	ACCTTATCTA	TGCGCAATCC	GGCTCTTTGC	TCATTTATCT	cAACCAAAgi	5585

104

186 242

GGTAATCACT	TTτΛTTGGT	TTTTAGATTA	CC3TTCCCAC	AAGCCGTACA	d* ΓlGCccc.-	5645
ACTTGCCAAC	TTCACGTCGC		'GGC'^τlCGGGC	TAGCCAG^TT	GATTCTGCCT
CTGCCACATA	TCGCGCCCCC	TCACTTGCTT	TGTGACCTGT		ACCCTCCTTC	5765
TTGAATCTAA		CCGGCGCGCA	CCTCCCACGC	TACATTATCG	TACTTCGTCG	5825
CAATTCTGGT	TGGCTGACCA	ATTACAGCTC	CCCACAGCCG	GCCCCTCTCC	GGCTTCTTAT	5335
CTGCCGTTTC	C.A^TG^.^TTT	TCTATTGTAT	cccGccA·rτc	COGATGCAAT	CCGCGCcccC	5945
CGGCTCCCCC	σ'TσλAGTCcc	CTACAGCCAC	GGCGTCPGGJ	CTGGTCCCGA	GCGGGAATTC	5005

(2) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 12, (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1190 aminokwasów (B) lyp: aminokwas (D) Topologia: liniowa ( ii ) Typ cząsteczki · hiałkn ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 26;

Mec 1

Ser

Glu

Ser

Leu 5

Phe

Thr

Gln

Thr

Leu 10

Lys

Glu

Ala

Arg

Arg 15

Asp

Ala

Leu

val

da 20

His

Tyr

He

da

Thr 2S

Gin

Val

Pro

da

Asp 30

Leu

Lys

Giu

Ser

Ile 35

Gln

Thr

Ala

Asp

Asp 40

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Leu 45

Leu

Leu

Asp

Thr

Lye 50

Ha

Ser

Asp

Leu

Val 55

Thr

Thr

Ser

Pro

Leu 60

Ser

Glu

ALa

Ile

Gly 65

Ser

Leu

Gln

Leu

Phe 70

Ile

His

Arg

da

Ile 75

Glu

Gly

Tyr

Asp

Gly 80

Thr:

Leu

da

Asp

Ser 85

da

Lys

Pro

Tyr

Phe 90

da

Asp

Glu

Gln

Phe 95

Leu

Tyr

Asn

Trp

Asp 100

Ser

Phe

Asn

His

Arg 105

Tyr

Ser

Thr

Trp

da 110

Gly

Lys

Glu

Arg

Leu 11S

Lys

Phe

Tyr

da

Gly 120

Asp

Tyr

Ile

Asp

Pro 125

Thr

Leu

Arg

Leu

Asn 130

Lys

Thr

Glu

Ile

Phe 135

Thr

da

Phe

Glu

Gln 140

Gly

He

Ser

Gln

Cly 145

Lys

Leu

Lys

Ser

Glu 150

Leu

val

Glu

ser

Lys 155

Leu

Arg

Asp

Tyr

Leu 160

Ile

Ser

Tyr

Asp

Thr 155

Leu

da

Thr

Leu

Asp 170

Tyr

He

Thr

da

cys 175

Gln

Gly

Lys

Asp

Asn 130

Lys

Thr

He

Phe

Phe 185

Ile

Gly

Arg

Thr

Gln 190

Asn

Ala

Pro

Tyr

Ala 195

Phe

Tyr

Trp

Arg

Lys 200

Leu

Thr

Leu

Val

Thr 205

Asp

Gly

Gly

186 242

105

Lys

Leu 210

tys

Pro

ASP

Gln

Trp 215

Ser

Glu

Trp

Arg

Ala 220

Ile

Asn

Ala

Gly

Ile 225

Ser

Glu

Ala

Tyr

Ser 230

cly

His

Val

Glu

Pro 235

Phe

Trp

Clu

Asn

Asn 240

Lys

Leu

His

Ile

Arg 245

Trp

Phe

Thr

Ile

Ser 250

Lys

Glu

Asp

Lys

Ile 255

Asp

Phe

Val

Tyr

Lys 260

Asn

Ile

Trp

val

Mec 265

Ser

Ser

Asp

Tyr

ser 270

Trp

Ala

Ser

Lys

Lys 275

Lys

Ile

Leu

Glu

Leu 230

Ser

Phe

Thr

Asp

Tyr 285

Asn

Arg

Val

Gly

Ala 290

Thr

Gly

Ser

Ser

ser 295

Pro

Thr

Glu

Val

Ala 300

Ser

Gln

Tyr

Gly

Ser 305

Asp

Ala

Gln

Met

Asn 310

ile

ser

Asp

ASP

Gly 315

Thr

Val

Leu

Ile

Phe 320

Gln

Asn

Ala

Gly

Gly 325

Ala

Thr

Pro

Ser

Thr 330

Gly

Val

Thr

Leu

cys 335

Tyr

Asp

ser

Gly

Asn 340

Val

Ile

Lys

Asn

Leu 345

Ser

Ser

Thr

Gly

Ser 350

Ala

Asn

Leu

Ser

Ser 355

Lys

Asp

Tyr

Ala

Thr 360

Thr

Lys

Leu

Arg

Met 365

Cys

His

Gly

Gln

Sar 370

Tyr

Asn

Asp

Asn

Asn 375

Tyr

cys

Asn

Phe

Thr 380

Leu

Ser

ile

Asn

Thr 385

I-le

Glu

Phe

Thr

Ser 390

Tyr

Gly

Thr

Phe

Ser 395

Ser

Asp

Gly

Lys

Gln 400

Phe

Thr

Pro

Pro

Ser 405

Gly

Ser

Ala

Ile

Asp 410

Leu

His

Leu

Pro

Asn 415

Tyr

Val

Asp

Leu

Asn 420

Ala

Leu

Leu

Asp

Ile 425

Ser

Leu

Asp

Ser

Leu 430

Leu

Asn

Tyr

ASP

Val 435

Cln

Gly

Cln

Phe

Cly 440

Cly

Ser

Asn

Pro

Val 445

Aap

Asn

Phe

Ser

Gly 450

Pro

Tyr

Cly

Ile

Tyr 455

Leu

Trp

Glu

Ile

Phe 460

Phe

His

Ile

Pro

Phe 465

Leu

Val

Thr

Val

Arg 470

Mec

Gln

Thr

Glu

Gln 475

Arg

Tyr

Glu

Asp

Ala 480

Asp

Thr

Trp

Tyr

Lys 485

Tyr

Ile

Phe

Arg

Ser 490

Ala

Gly

Tyr

Arg

Asp 495

Ala

Asn

Gly

Gln

Leu 500

Ile

Mec

Asp

Gly

Ser 505

Lys

Pro

Arg

Tyr

Trp 510

Asn

Val

Met

Pro

Leu 515

Gln

Leu

Asp

Thr

Ala 520

Trp

Asp

Thr

Thr

Cln 525

Pro

Ala

Thr

Thr

Asp 530

Pro

Asp

Val

Ile

Ala 535

M«C

Ala

Asp

Pro

Ket 540

His

Tyr

Lys

Leu

Aia 545

Ile

Phe

Leu

His

Thr 550

Leu

Asp

Leu

Leu

Ile 555

Ala

Arg

Gly

Asp

Ser 560

106

186 242

Ala

Tyr

Arg

Gln

Leu 555

Glu

Arg

Asp

Thr

Leu 570

Val

Glu

Ala

Lys

Met 575

Tyr

Tyr

Ile

Gln

Ala 530

Gln

Gln

Leu

Leu

Gly 585

Pro

.Arg

Pro

Asp

Ile 590

His

Thr

Thr

Asn

Thr 595

Trp

Pro

Asn

Pro

Thr 600

Leu

Ser

Lys

du

Ala 605

Gly

Ala

Ile

Ala

Thr 610

Pro

Thr

Phe

Leu

Ser 615

Ser

Pro

du

Val

Mec 620

Thr

Phe

Ala

Ala

Trp 625

Leu

Ser

Ala

Gly

Asp 630

Thr

Ala

Asn

Ile

Gly 635

Asp

Gly

Asp

Phe

Lau 640

Pro

Pro

Tyr

Asn

Asp 645

Val

Leu

Leu

Gly

Tyr 650

Trp

Asp

Lys

Leu

du 655

Leu

Arg

L«u

Tyr

Asn 660

Leu

Arg

His

Asn

Leu 665

Ser

Leu

Asp

dy

dn 670

Pro

Leu

Asn

Lwu

Pro 675

Leu

Tyr

Ala

Thr

Pro 680

Val

Asp

Pro

Lys

Thr 685

Leu

Gln

Arg

Gln

Gln 690

Ala

dy

dy

Asp

dy 695

Thr

dy

Ser

Ser

Pro 700

Ala

Gly

Gly

Gln

Gly 705

Ser

Val

dn

Ο,γ Trp 710

Arg

Tyr

Pro

Leu

Leu 715

Val

Glu

Arg

Aia

Arg 720

Ser

Ala

Val

Ser

Leu 725

Leu

Thr

Gln

Phe

dy 730

Asn

Ser

Leu

Gln

Thr 735

Thr

Leu

Glu

His

Gln 740

Acp

Asn

du

Lys

Met 745

Thr

Ile

Leu

Leu

Gln 750

Thr

Gln

Gln

Glu

Ala 755

Ile

Leu

Lys

His

Gln 760

His

Ap

Ile

Gln

Gln 765

Asn

Asn

Leu

Lys

dy 770

Leu

dn

His

Ser

Leu 775

Thr

Ala

Leu

Gln

Ala 780

Ser

Arg

Asp

Gly

Asp 785

Thr

Lau

Arg

dn

Lys 790

His

Tyr

Ser

Asp

Leu 795

Ile

ten

dy

Gly

Leu 800

Ser

Ala

Ala

Glu

Ile 805

Ala

dy

Leu

Thr

Leu 810

Arg

Ser

Thr

Ala

Mec 815

Ile

Thr

Asn

dy

Val 820

Ala

Thr

Gly

Leu

Leu 825

Ile

Ala

Gly

Gly

Ile 830

Aia

ten

Ala

Val

Pro 835

Asn

Val

Ph·

dy

Leu 840

Ala

Asn

Gly

Gly

Ser 845

du

Trp

dy

Ala

Pro 550

Lau

Ile

Gly

Ser

dy 855

Gln

Ala

Thr

Gln

Val 860

Gly

Ala

dy

Ile

Gln 365

Asp

dn

Ser

Aia

dy 870

Ile

Ser

du

Val

Thr 875

Ala

Gly

Tyr

Gln

Arg 380

Airg

Gln

du

du

Trp 885

Ala

Lau

Gln

Arg

Asp 890

Ile

Ala

Asp

Asn

Glu 895

Ile

Thr

Gln

Leu

Asp 900

Ala

Gln

Ile

Gln

Ser 905

Leu

Cln

du

Gln

Ile 910

Thr

Mer

186 242

107

Ala Cln Lys Gln

Ile Thr

Leu

Ser 920

Glu

Thr

Glu

Cln

Ala 325

Asn

Ala

Cln

915

Ala

Ile Tyr Asp 93 0

Leu Cln

Thr 935

Thr

Arg

Phe

Thr

Cly 940

Hn

Ala

Leu

Tyr

Asn 945

Trp Met Ala

Gly Ar? 950

Leu

Ser

Ala

Leu

Tyr 955

Tyr

Cln

Met

Tyr

Asp 960

Ser

Thr Leo Pro

Il« Cys 965

Leu

Cln

Pro

Lys 970

Ala

Ala

Leu

Gln 975

Glu

Leu

Gly Glu Lys 980

Glu Ser

Asp

Ser

Leu 985

Phe

Gln

Val

Pro

Val 990

Trp

Asn

Asp

Leu Trp Gln 995

Gly Leu

Leu

Ala Cly 1000

Clu

Cly

Leu

Ser Ser 1005

Glu

Leu

Gln

Lys Leu Asp 1010.

Ala Ile

Trp Leu 1015

Ala

Arg

Cly

Cly Ile 1020

Gly

L«u

Glu

Ala He Arg Thr 1025

Val Ser Leu 1030

top

Thr

Leu

Phe Cly 1035

Thr

Gly

Thr

Leu 1040

Ser

Glu ton Ile

ton Lys 1045

Val

Leu

Asn

Gly Glu 1050

Thr

Val

Ser

Pro Ser 1055

Gly Gly Val Thr Leu Ala 1060

Leu

Thr

Gly top 1065

Ile

Phe

Gln

Ala Thr 1070

Leu

top

Leu Ser Gln 1075

Leu Gly

Leu

Asp Asn 1080

Ser

Tyr

Asn

Leu Gly 1085

Asn

Glu

Lys

Lys Arg Arg 1090

Ile Lys

tog Ile 1095

Ala

Val

Thr

Leu Pro 1100

Thr

Leu

Leu

Gly 1105

Pro Tyr Gln

top Leu Glu 1110

Ala

Thr

Leu

Val Mec 1115

Gly

Ala

Glu

Ile 1120

Ala

Ala Leu Ser

His Gly 1125

Val

Asn

Asp

Gly Gly 1130

Arg

Phe

Val

Thr Asp 1135

Phe

ton top Ser 1140

Arg Phe 1

Leu

Pro

Phe Clu 1145

Gly

Arg

Asp

Ala Thr 1150

Thr

Gly

Thr Glu 1155

Leu ton

Ile

Phe His 1160

Ala

Gly

Lys

Glu Gly 1165

Thr

Gln

His Ile

Glu Leu Val 1170 He tog Asp

Ala Asn Ala *

Leu Ser 1175

top

lie

Ile

Val His 1130

Leu

Asn

Tyr

1135 1190 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 27;

(i ) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1881 parzasad (B) Typ: kwas nukleinowy ( C ) Rodzaj nici: podwójna ( D ) Topologia· liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy)

108

186 242 (i) Cechy:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (b) Powożenie: 1..1881 (C) Inne informacje: produkt = P8 ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 27;

ATG

TCT

GAA

TCT

TTA

TTT

ACA

CAA

ACG

TTG

AAA

G.AA

GCG

CGC

CCT

CAT

43

Mec 1

Ser

Glu

Ser

Leu 5

Phe

Thr

Gln

Thr

Leu 10

Lys

du

Ala

Arg

Arg 15

Asp

GCA

TTG

GTT

GCT

CAT

TAT

.ATT

GCT

ACT

CAG

GTG

CCC

GCA

GAT

TTA

AAA

96

da

Leu

Val

Ala 20

His

Tyr

Ile

Ala

Tnr 25

Gln

Val

Pro

da

ASP 30

Leu

Lys

GAG

ACT

ATC

CAG

ACC

GCG

GAT

GAT

CTO

TAC

GAAA

TAT

CTG

TTG

CTG

GAT

144

du

Ser

Ile 35

Gln

Tłu.

da

Asp

Aep 40

Leu

Tyr

du

Tyr

Leu 45

Leu

Leu

Asp

ACC

AAA

ATT

ACC

GAT

CTG

GTT

ACT

ACT

TCA

CCG

CTG

TCC

GAA

GCG

ATT

192

Thr

Lys 50

Ile

Ser

Asp

Lau

Val 55

Thr

Thr

Ser

Pro

Leu 60

Ser

Glu

da

Ile

GGC

ACT

CTG

CAA

TTG

TTT

ATT

CAT

CGT

GCG

ATA

GAG

GGC

TAT

GACGGC

240

Gly 65

Ser

Leu

Gln

Leu

Pha 70

Ile

Hic

Arg

Ala

ile 75

Glu

Gly

Tyr

Asp

dy 80

ACG

CTG

CCA

GAC

TCA

GCA

AAA

CCC

TAT

TTT

GCC

GAT

CAA

CAG

TTT

TTA

288

Thr

Leu

da

Asp

Ser 35

da

Lys

Pro

Tyr

Phe 90

da

Asp

Glu

Gln

Phe 95

Leu

TAT

AAC

TGG

GAT

ACT

TTT

AAC

CAC

CGT

TAT

AGC

ACT

TGG

GCT

GGC

AAG

335

Tyr

Asn

Trp

Asp 100

Ser

Phe

Asn

His

Arg 105

'tyr

Ser

Thr

Trp

da 110

Gly

Lys

GAA

CGG

TTG

AC

TTC

TAT

GCC

GGG

GAT

TAT

ATT

GAT

CCA

ACA

TTG

CGA

334

du

Arg

Lau 115

Lys

Phe

Tyr

da

Gly 120

Asp

tyr

Ile

Asp

Pro 125

Thr

Leu

Arg

TTC

AAT

AAG

ACC

GAG

ATA

TTT

ACC

GCA

TTT

CAA

GGT

ATT

TCT

CA*

432

Leu

Asn 130

Lys

Thr

Glu

Ile

Phe 135

Thr

Ala

Phe

du

Gln 140

Gly

Ile

Ser

Gln

GGG

AAA

TTA

AC

ACT

GJAA

TTA

GTC

GAA

TCT

AJAA

TTA

CGT

CAT

TAT

CTA

430

Gly 145

Lys

Leu

Lys

Ser

Glu 130

Leu

Val

Glu

Ser

Lys 155

Leu

Arg

Asp

Tyr

Leu 160

ATT

ACT

TAT

GAC

ACT

TTA

GCC

ACC

CTT

GAT

TAT

ATT

ACT

GCC

TGC

CAA

528

Ile

Ser

Tyr

Asp

Thr 165

Leu

da

Thr

Leu

Asp 170

Tyr

Ile

Thr

ALa

Cys 175

Gln

GGC

A?A

GAT

AAT

AAA

ACC

ATC

TTC

TTT

ATT

GGC

CGT

ACA

CAG

AAT

GCA

576

Gly

Lys

Asp

Asn 180

Lys

Thr

Ile

Phe

Phe 185

Ile

dy

Arg

Thr

Gln 190

Asn

da

CCC

TAT

GCA

TTT

TAT

TGG

CGA

AAA

TTA

ACT

TTA

GTC

ACT

GAT

GGC

GGT

624

Pro

Tyr

da 195

Phe

Tyr

Trp

Arg

Lys 200

Leu

Thr

Leu

Val

Thr 205

Asp

Gly

Gly

.AAG

TTG

AAA

CCA

GAT

C.AA

TGG

TCA

GAG

TGG

CCA

GCA

ATT

AAT

GCC

GGG

672

Lys

Leu 210

Lys

Pro

Asp

Gln

Trp 215

Ser

Glu

Trp

Arg

Ala 220

Ile

Asn

da

dy

186 242

109

ATT Ile 225

AGT GAG CCA

TAT Tyr

TCA GCG

CAT GTC

GAG CTT TTC

T GG Trp

CAA -AAT AAC

-;·

Ser

Glu

Ala

Ser 230

Gly

His

Val

Glu

Pro 235

Phe

C lu

Asn Asn 240

AAG

CTG

CAC

ATC

CGT

TGG

TTT

ACT

e

TCC

AAA

GAA

CAT

AAA

ATA

GAT

7 68

L','s

His

Ile

Ar?

Trp

Phe

Thr

Ile

Ser

Lys

Glu

Asp

Lys

Ile

Asp

245

250

255

TTT

CTT

TAT

AAA

AAC

ATC

TGG

GTG

ATG

AGT

AGC

GAT

TAT

AGC

TGG

GCA

816

Phe

val

Tyr

Lys

Asn

Ile

Trp

val

Met

Ser

Ser

Asd

Tyr

Ser

Trp

Ala

260

265

270

TCA

AAG

AAA

AAA

ATC

TTG

CAA.

CTT

TCT

TTT

ACT

GAC

TAC

AAT

ACA

GTT

854

Ser

Lys

Lys

Lys

Ile

Leu

Glu

Leu

Ser

Phe

Thr

Asp

Tyr

Asn

Arg

Val

275

280

285

GGA

GCA

ACA

GGA

TCA

TCA

AGC

CCS

ACT

GAA

GTA

GCT

TCA

CAA

TAT

GGT

912

Gly

Ala

Thr

Gly

Ser

Ser

Ser

Pro

Thr

Clu

Val

Ala

Ser

Gln

Tyr

Gly

250

295

300

TCT

GAT

CCT

CAG

ATG

AAT

ATT

TCT

GAT

GAT

CGG

ACT

GTA

CTT

ATT

TTT

960

Ser

Asp

Ala

Gln

Met

Asn

Ile

Ser

Asp

Asp

Gly

Thr

Val

Leu

Ile

Phe

3 OS

310

315

320

CAG

AAT

GCC

GGC

CGA

GCT

ACT

CCC

AGT

ACT

GGA

GTG

ACG

TTA

TGT

TAT

1008

Gln

Asn

Ala

Gly

Gly

Ala

Thr

Pro

Ser

Thr

Gly

Val

Thr

Leu

Cys

Tyr

325

330

335

GAC

TCT

GGC

AAC

GTG

ATT

AAG

AAC

CTA

TCT

AGT

ACA

GGA

AGT

GCA

AAT

1056

Asp

Ser

Cly

Asn

Val

Ile

Lys

Asn

Leu

Ser

Ser

Thr

Gly

ser

Ala

Asn

340

345

350

TTA

TCG

TCA

AAG

CAT

TAT

GCC

ACA

ACT

AAA

TTA

CGC

ATC

TGT

CAT

GGA

1104

Leu

Ser

Ser

Lys

Asp

Tyr

Ala

Thr

Thr

Lys

Leu

Arg

Met

Cys

His

Gly

355

360

365

CAA

AGT

TAC

AAT

GAT

AAT

AAC

TAC

TGC

AAT

TTT

ACA

CTC

TCT

ATT

AAT

1152

Gln

Ser

Tyr

Asn

Asp

Asn

Asn

Tyr

Cys

Asn

Phe

Thr

Leu

ser

Ile

Asn

370

375

360

ACA

ATA

CAA

TTC

ACC

TCC

TAC

GGC

ACA

TTC

TCA

TCA

GAT

GGA

AAA

CAA

1200

Thr

Ile

Glu

Phe

Thr

Ser

Tyr

Gly

Thr

Phe

Ser

ser

Asp

Cly

Lys

Gln

385

390

395

400

TTT

ACA

CCA

CCT

TCT

GGT

TCT

GCC

ATT

GAT

TTA

CAC

CTC

CCT

AAT

TAT

1248

Phe

Thr

Pro

Pro

ser

Gly

Ser

Ala

Ile

Asp

Leu

His

Leu

Pro

Asn

Tyr

405

410

415

GTA

CAT

CTC

AAC

GCG

CTA

TTA

GAT

ATT

ACC

CTC

GAT

TCA

CTA

CTT

AAT

1296

Val

Asp

Leu

Asn

Ala

Leu

Leu

Asp

Ile

Ser

Leu

Asp

Ser

Leu

Leu

Asn

420

425

430

TAT

CAC

GTT

CAG

CGG

CAC

ttt

GGC

GGA

TCT

AAT

CCG

GTT

GAT

AAT

TTC

1344

Tyr

Asp

Val

Gln

Gly

Gln

Phe

Gly

Gly

Ser

Asn

Pro

Val

Asp

Asn

Phe

435

440

445

ĄGT

CGT

CCC

TAT

GGT

ATT

TAT

CTA

TGG

GAA

ATC

TTC

TTC

CAT

ATT

CCG

1392

Ser

Gly

Pro

Tyr

Gly

Ile

Tyr

Leu

Trp

Glu

Ile

Phe

Phe

His

Ile

Pro

450

455

460

TTC

CTT

GTT

ACG

GTC

CGT

ATG

CAA

ACC

GAA

CAA

CGT

TAC

GAA

GAC

CCG

1440

Phe

Leu

Val

Thr

Val

Arg

Met

Gln

Thr

Glu

Gln

Arg

Tyr

Clu

Asp

Ala

465

470

475

480

GAC ACT TGG TAC AAA TAT ATT TTC CGC AGC GCC GGT TAT CGC GAT GCT 1488

110

186 242

Asp Thr Trp

Tyr

Lys 436

Tyr

Ila

Phe

Arg

Ser 490

Ala

Gly

Tyr

Arg

Asp 435

Ala

AAT CGC cag

ATT

ATC

GAT

GGC

AGT

AAA

CCA

CGT

TAT

TCG

AAT

CTG 1535

Asn Gly Gln

Leu

Ile

Met

Asp

Gly

Ser

Lys

Pro

Arg

Tyr

Trp

Asn

Val

500

505

510

ATG CCA TTG

CAA

CTC

GAT

ACC

GCA

TGG

GAT

ACC

AGA

CAG

CCC

GCC

ACC 1584

Met Pro Leu

Gln

Leu

Asp

Thr

Ala

Trp

Asp

Thr

Thr

Gln

Pro

Ala

Thr

515

520

525

ACT GAT CCA

GAT

GTG

ATC

GCT

ATG

GCG

GAC

CCG

ATG

CAT

TAC

AAG

CTG 1632

Thr Asp Pro

Asp

Val

Ile

Ala

Met

Ala

Asp

Pro

Met

His

Tyr

Lys

Leu

S30

535

540

GCG ATA TTC

CTG

CAT

ACC

CTT

GAT

CTA

TTG

ATT

GCC

CGA

GGC

CAC

AGC 1680

Ala Ile Phe

Leu

His

Thr

Leu

Asp

Leu

Leu

Ile

Ala

Arg

Gly

Asp

Ser

545

550

555

560

GCT TAC COT

CAA

CTT

CAA.

CGC

GAT

ACT

CTA

GTC

CAA

GCC

AAA

ATG

TAC 1728

Ala Tyr Arg

Gin

Leu

Glu

Arg

Asp

Thr

Leu

Val

Glu

Ala

Lys

Met

Tyr

565

570

575

TAC ATT CAG

GCA

CAA

CAG

CTA

CTC

GGA

CCG

CGC

CCT

GAT

ATC

CAT

ACC 1776

Tyr Ile Gln

Ala

Gln

Gln

Leu

Leu

Gly

Pro

Arg

Pro

Asp

Ile

Hi?

Thr

580

585

590

ACC AAT ACT

TCG

CCA

AAT

CCC

ACC

TTG

ACT

AAA

GAA

CGT

GGC

GCT

ATT 1824

Thr Asn mr

Trp

Pro

Asn

Pro

Thr

Leu

ser

Lys

Glu

Ala

Gly

Ala

Ile

595

600

605

GCC ACA CCG

ACA

TTC

CTC

ACT

TCA

CCG

GAG

GTG

ATG

ACG

TTC

GCT

GCC 1872

Ala Thr Pro

Thr

Phe

Leu

Ser

Ser

Pro

Glu

val

Met

Thr

Phe

Ala

Ala

610

615

620

TGG CTA AGC

1831

Trp Lau Ser

625 (2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 28;

(i) Chatakterystykasekwencji:

(A) Długość: 627 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID' 28;

Met 1

Ser

Glu

Ser

Leu 5

Phe

Thr

Gln

Thr

Leu 10

Lys

Glu

Ala

Arg

Arg 15

Asp

Ala

Leu

Val

Ala 20

His

Tyr

Ile

Ala

Thr 25

Gln

Val

Pro

Ala

Asp 30

Leu

Lys

Glu

Ser

Ile 35

Gln

Thr

Ala

Asp

Asp 40

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Leu 45

Leu

Leu

Asp

Thr

Lys 50

Ile

Ser

Asp

Leu

Val 55

Thr

Thr

Ser

Pro

Leu 60

Ser

Glu

Ala

Ile

Gly Ser Leu Gln Leu Phe Ile His Arg Ala Ile Glu Gly Tyr Asp Gly

186 242

111

65

70

75

30

Thr

Lea

A.la

Asp

Ser 35

Ala

Lys

Pro

Tyr

Phe 90

Ala

Asp

Glu

Gin

Phe 95

Leu

Tyr

Asn

Trp

Asp 100

Ser

Phe

Asn

His

Arg 105

Tyr

Ser

Thr

Trp

Ala 110

Gly

Lys

Glu

Arg

Leu 115

Lys

Phe

Tyr

Ala

Cly 120

Asp

Tyr

Ile

Asp

Pro 125

Thr

Leu

Arg

Lau

Asn 130

Lys

Thr

Glu

Ile

Phe 135

Thr

Ala

Phe

Clu

Cln 140

Cly

Ile

Ser

Gln

Gly 145

Lys

Leu

Lys

Ser

Clu 150

Leu

Val

Glu

Ser

Lys 155

Leu

Arg

Asp

Tyr

Leu 160

Ile

Ser

Tyr

Asp

Thr 165

Leu

Ala

Thr

Leu

Asd 170

Tyr

Ile

Thr

Ala

Cys 175

Gln

Gly

Lys

Asp

Asn 130

Lys

Thr

He

Phe

Phe 135

Ile

Gly

Arg

Thr

Gln 190

Asn

Ala

Pro

Tyr

Ala 195

Phe

Tyr

Trp

Arg

Lys 200

Leu

Thr

Leu

Val

Thr 205

Asp

Gly

Gly

Lys

Leu 210

Lys

Pro

Asp

Gln

Trp 215

Ser

Glu

Trp

Arg

Ala 220

Ile

Asn

Ala

Gly

Ile 225

Ser

Glu

Ala

Tyr

Ser 230

Gly

His

Val

Glu

Pro 235

Phe

Trp

Glu

Asn

Asn 240

Lys

Leu

His

Ile

Arg 245

Trp

Phe

Thr

Ile

Ser 250

Lys

Clu

Asp

Lys

Ile 255

Asp

Phe

Val

Tyr

Lys 260

Asn

Ile

Trp

Val

Met 265

Ser

Ser

Asp

Tyr

Ser 270

Trp

Ala

Ser

Lys

Lys 275

Lys

He

Leu

Clu

Leu 230

Ser

Phe

Thr

Asp

Tyr 235

Asn

Arg

Val

Gly

Ala 290

Thr

Gly

Ser

Ser

Ser 295

Pro

Thr

Glu

Val

Ala 300

Ser

Gln

Tyr

Cly

Ser 305

Asp

Ala

Cln

Met

Asn 310

Ile

Ser

Asp

Asp

Gly 315

Thr

Val

Leu

Ile

Phe 320

Cln

Asn

Ala

Gly

Cly 325

Ala

Thr

Pro

Ser

Thr 330

Gly

val

Thr

Leu

Cys 335

Tyr

Asp

Ser

Cly

Asn 340

Val

He

Lys

Asn

Leu 345

ser

Ser

Thr

Gly

Ser 350

Ala

Asn

Leu

Ser

Ser 355

Lys

Asp

Tyr

Ala

Thr 3 60

Thr

Lys

Leu

Arg

Met 365

cys

His

Gly

Gln

Ser 370

Tyr

Asn

Asp

Asn

Asn 375

Tyr

Cys

Asn

Phe

Thr 330

Leu

Ser

Ile

Asn

Thr 335

Ile

Clu

Phe

Thr

Ser 390

Tyr

Cly

Thr

Phe

Ser 395

Ser

Asp

Gly

Lys

Gln 400

Phe

Thr

Pro

Pro

ser 405

Cly

Ser

Ala

Ile

Asp 410

Leu

His

Leu

Pro

Asn 415

Tyr

'.'al Asp Leu Asn Ala Leu Leu Asp Ile Ser Leu Asp Ser Leu Leu Asn

112

186 242

420 425 430

Tyr

CTp Val 435

Gln

cus cln ret clv 440

cls

Ser CTn rro Val 445

Ctp

Asn

?hs

Ser

dy

ero

Tsr

Giy

ile

Tsr

Leu

Trp

Clu

Ile

me

ree

HST

Ile

rro

450

455

450

Phe

Leu

Val

eer

Val

crg

Met

Cln

eer

Clu

Cln

Arg

Tsp

Glu

Atp

Cla

465

470

47S

43C

CTp

Ter

Trp

T/r

Lst

Tzr

Ile

rhe

Crg

Sep

cla

cl?

Tsr

Cpg

Ctp

Ala

485

490

495

ATn

Gly

Gln

Leu

Ile

Mec.

cer

GlY

Ser

L'st

rro

Cpg

Tyr

hpp

ATn

Val

500

505

510

Mec

rro

Leu

Gin

Leu

CTp

Thr

Cla

erp

Ctp

eer

eer

Cln

Pro

Ala

eer

515

520

525

Thr

Asp

Pro

Asp

Val

Ile

Ala

Met

Ala

Mp

Pro

Met

His

T/r

Lys

Leu

530

535

540

Ala

Ile

Phe

Leu

His

Thr

Leu

Mp

Leu

Leu

Ile

Cla

Arg

Gly

Atp

Sep

545

550

555

550

Ala

Tyr

Arg

Gln

Leu

Glu

Mg

Asp

Thr

Leu

Val

Glu

Ala

Lys

Mec

Tyr

565

570

575

Tyr

Ile

Gln

Ala

Gln

Gln

Leu

Leu

Gly

Pro

Mg

Pro

Mp

Ile

His

Thr

580

585

590

Thr

Asn

Thr

Trp

Pro

Mn

Pro

Tir

Leu

Ser

Lys

Glu

Ala

Gly

Cla

Ile

595

600

605

Ala

Thr

Pro

Thr

Phe

Leu

Ser

Ser

Pro

Glu

Val

Mec

Thr

Phe

Cla

Ala

610

615

620

Trp

Leu

ser

625

( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 29;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1689 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C ) Rodzaj nici: podwójna (D) Topologia: liniowa ( ii ) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (ix) Cechy:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (b) Pałażenie.: 1..1689 (D ) Inne informacje: /produkt + S8 ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 29;

GCA GC GAT ACC GA AAT ATT GGC GAC G7T GAT TTC TTG CCA CCG TAC

Ala Gly Asp Thr Ala Asn Ile Gly Asp Gly Asp Phe Leu Pro Pro Tyr l 5 10 15

186 242

AAC Asn

GAT Asp

GTA Vai

CTA Lau 20

CTC Leu

GgT Gly

TAC Tyr

T*G Trp

3AT Asp 25

AAA t -·»

CTT Leu

GAG Glu

TTA Leu

CGC Arg 30

CTA Lau

TAC Tyr

9 5

AAC

CTG

CGC

CAC

AAT

CTG

tT /

CTG

ttA

GGT

CAA

CCG

CTA

AAT

GTG

CCA

144

Asn

Leu

Arg 35

His

Asn

Leu

Ser

Lsu 40

Asp

dy

Gln

Pro

Leu 43

Asn

Leu

Pro

CTG

TAT

GCC

ACG

CCG

GTA

GAC

CCG

AAA

ACC

CTG

CAA

ATA

CAG

CAA

GCC

132

Leu

Tyr 50

Ala

Thr

Pro

Val

Asp 55

Pro

Lys

Thr

Leu

Gln 60

Arg

Gln

Gin

Ala

GA

GGG

GAC

GGT

ACA

GGC

ACT

ACT

CCG

GCT

GGT

GGT

CAA

GGC

AGT

GTT

240

Giy 65

Gly

Asp

Gly

Thr

Gly 70

Ser

Ser

Pro

Ala

Gly 75

Giy

Gln

Gly

Ser

Val 80

CAG

CGC

TGG

CGC

TAT

CCG

TTA

TTC

GTA

GAA

CGC

GCC

CGC

TCT

GCC

T/t

288

Gln

Gly

Trp

teg

Tyr 35

Pro

Leu

Leu

Val

Glu 90

Arg

Ala

Arg

Ser

Ala 95

Val

AST

TTG

TTC

ACT

CAG

TTC

GGC

AAC

AGC

TTA

CAA

ACA

ACG

TTA

GAA

CAT

336

Ser

Leu

Leu

Thr 100

Gln

Phe

Gly

ten

Ser 105

Leu

Gln

Thr

Thr

Leu 110

Glu

His

CAG

GAT

AAT

GAA

AAA

ATG

ACG

ATA

CTG

TTC

CAG

ACT

CAA

CAG

GAA

GCC

334

Gln

Asp

Asn 115

du

Lys

Mac

Thr

Ile 120

Leu

Leu

Gln

Thr

dn 125

Gln

Glu

Ala

ATC

CTG

AAA

CAT

CAG

CAC

GAT

ATA

CAA

CAA

AAT

AAT

CTA

AAA

GGA

TTA

432

Ile

Leu 130

Lys

His

Gln

His

Asp 135

Ile

Gln

Gln

ten

ten 140

Leu

Lys

Gly

Leu

CAA

CAC

AGC

CTG

ACC

GCA

TTA

CAG

GCT

AGC

CGT

CAT

GGC

GAC

ACA

TTC

480

Gin 143

His

Ser

Leu

Thr

Ala 150

Gln

Ala

Ser

teg 155

Asp

Gly

Asp

Thr

Leu 160

CGG

CAA

AAA

CAT

TAC

AGC

GAC

CTG

ATT

AAC

GGT

GGT

CTA

TCT

GCG

GCA

523

Arg

Gln

Lys

His

Tyr 165

Ser

tep

Leu

Ile

Asn 170

dy

Gly

Leu

Ser

Ala 175

Aia

GAA

ATC

GCC

CGT

CTG

ACA

CTA

CGC

AGC

ACC

GCC

ATG

ATT

ACC

AAT

GGC

576

du

Ile

Ala

Gly 180

Leu

Thr

Leu

Arg

Ser 185

Thr

Ala

Mec

Ile

Thr 190

Asn

Gly

GTT

GCA

ACG

TTA

TTG

CTC

ATT

GCC

GGC

GGA

ATC

GCC

AAC

GCG

GTA

CCT

624

Val

Ala

Thir Gly 195

Leu

Leu

Ile

Ala 200

Gly

Gly

Ile

Ala

Asn 205

Ala

Val

Pro

AAC

GTC

TTC

GGG

CTG

GT

AAC

GGT

GGA

TCG

GAA

TGG

Go-

GCG

CCA

TTA

672

Asn

Val 210

Phe

Gly

Leu

Ala

Asn 215

Gly Gly

Ser

Glu

Trp 220

dy

Ala

Pro

Leu

ATT

CGC

TCC

GGG

CAA

GCA

ACC

CAA

GTT

GGC

GCC

GGC

ATC

CAG

CAT

CAG

720

Ile 225

Gly

Ser

Gly

Gln

ALa 230

Thr

Gln

Val

Gly

Ala 235

Gly

Ile

Gln

Asp

Gln 240

AGC

GCG

GGC

ATT

TCA

GAA

GTG

ACA

GCA

GGC

TAT

CAG

CGT

CGT

CAG

GAA

763

Ser

Ala

Gly

Ile

Ser 245

Glu

val

Thr

Ala

Gly 250

tyr

Gln

Arg

teg

Gln 255

Glu

GAA

TGG

GCA

TTG

CAA

CGG

GAT

ATT

GCT

GAT

AAC

GAA

ATA

ACC

CAA

CTG

816

Glu

Trp

Ala

Leu 260

Gln

Arg

Asp

Ile

Ala 265

Asp

ten

Glu

Ile

Thr 270

dn

Leu

GAT GCC CAG ATA CAA AGC CTG CAA GAG CAA ATC ACG ATC GCA CAA AAA 354

114

186 242

Asp

AU

Gin 275

zie

Gln

Ser

Leu

Gln 280

Glu

Gln

His

Thr

Met 235

Ala

Gln

l/5

CAG

ATC

ACG

TCT

GAA

ACC

GAA

CAA

GCG

AAT

GCC

CAA

GCG

ATT

TAT

912

Gln

Ile 290

Thr

Leu

Ser

Glu

Thr 295

Glu

Gln

Ala

Asn

Ala 300

Gln

Ala

Ile

Tyr

GAC

CTG

CAA

ACC

ACT

·- i

TTT

ACC

GGG

CAG

GCA

CGG

TAT

AAC

TGG

ATG

960

Asp 305

Leu

Gln

Thr

Thr

Arg 310

Phe

Thr

Gly

Gln

Ala 3 15

Leu

Tyr

Asn

Trp

Mec 320

GCC

GGT

CGT

ctc

TCC

GCG

CTC

TAT

TAC

CAA

AGG

TAT

GAT

Tcc

ACT

CTG

1008

Ala

Gly

Arg

Leu

Ser 325

Ala

Leu

Tyr

Tyr

Gln 330

Mec

Tyr

Asp

Ser

Thr 335

Leu

CCA

ATC

TGT

CTC

CAO

CCA

AAA

GCC

GCA

TTA

GTA

CAG

GAA

TTA

GGC

GAC

1056

Pro

Ile

Cys

Leu 340

Gln

Pro

Lys

Ala

Ala 345

Leu

Val

Gln

Glu

Leu 350

Gly

Glu

AAA

GAG

AGC

GAC

AGT

CTT

TTC

CAG

GTT

CCG

CTG

TCG

AAT

GAT

CTG

TGG

1104

Lys

Glu

Ser 355

Asp

Ser

Leu

Phe

Gln 360

Val

Pro

Val

Trp

Asn 365

Asp

Leu

Trp

CAA

GGG

CTG

TTA

CCA

GGA

GAA

GGT

TTA

AGT

TCA

GAG

CTA

CAG

AAA

CTG

1152

Gln

Gly 370

Leu

Leu

Ala

Gly

Glu 375

Gly

Leu

Ser

Ser

Glu 380

Leu

Gln

Lys

Leu

GAT

GCC

ATC

TGG

CTT

GCA

CGT

GGT

GGT

ATT

GGG

CTA

GAA

GCC

ATC

CGC

1200

Asp 385

Ala

Ile

Trp

Leu

Ala 390

Arg

Gly

Gly

Ile

Gly 395

Leu

Glu

Ala

Ile

Arg 400

ACC

GTG

TCG

CTG

GAT

ACC

CTC

TTT

GGC

ACA

GGG

ACG

TTA

AGT

GAA

AAT

1248

Thr

Val

Ser

Leu

Asp 405

Thr

Leu

Phe

Gly

Thr 410

Gly

Thr

Leu

Ser

Glu 415

Asn

ATC

AAT

AAA

GTG

CTT

AAC

GGG

GAA

ACG

CTA

TCT

CCA

TCC

GGT

GGC

GTC

1296

Ile

Asn

Lys

Val 420

Lau

Asn

Gly

Glu

Thr 425

Val

Ser

Pro

Ser

Gly 430

Gly

Val

ACT

CTO

GCG

CTC

ACA

GGG

GAT

ATC

TTC

CAA

GCA

ACA

CTC

GAT

TTC

AGT

1344

Thr

Leu

Ala 435

Lau

Thr

Gly

Asp

Ile 440

Phe

Gln

Ala

Thr

Leu 445

Asp

Leu

Ser

CAG

CTA

GGT

TTO

GAT

AAC

TCT

TAC

AAC

TTC

GGT

AAC

GAG

AAG

AAA

CGT

1392

Gln

Leu 450

Gly

Leu

Asp

Asn

ser 455

Tyr

Asn

Leu

Gly

Asn 460

Glu

Lys

Lys

Arg

CGT

ATT

AAA

CGT

ATC

GCC

GTC

ACC

CTG

CCA

ACA

CTT

CTC

GGG

CCA

TAT

1440

Arg 465

Ile

Lys

Arg

Ile

Ala 470

Val

Thr

Leu

Pro

Thr 475

Leu

Leu

Gly

Pro

Tyr 480

CAA

GAT

CTT

GAA

GCC

ACA

CTC

GTA

ATG

GGT

GCG

GAA

ATC

GCC

GCC

TTA

1488

Gln

Asp

Leu

Glu

Ala 485

Thr

Leu

Val

Hec

Gly 490

Ala

Glu

Ile

Ala

Ala 495

Leu

TCA

CAC

GGT

GTC

AAT

GAC

GGA

GGC

CGG

TTT

GTT

ACC

GAC

TTT

AAC

GAC

1535

Ser

His

Gly

Val 500

Asn

Asp

Gly

Gly

Arg 505

Phe

Val

Thr

Asp

Phe 510

Asn

Asp

ACC

CGT

TTT

CTC

CCT

TTT

GAA

GGT

CGA

GAT

GCA

ACA

ACC

GGC

ACA

CTG

1534

Ser

Arg

Phe 515

Leu

Pro

Phe

Glu

Gly 520

Arg

Asp

Ala

Thr

Thr 525

Gly

Thr

Leu

GAG

ctc

AAT

ATT

TTC

CAT

GCG

GGT

AAA

GAG

GGA

ACG

CAA

CAC

GAG

TTG

1632

Glu

Leu 530

Asn

Ile

Phe

His

Ala 535

Gly

Lys

Glu

Gly

Thr 540

Gln

His

Glu

Leu

186 242

115

GTC GCG	AAT CTG AGT GAC	aC λ ΓΤ C AAa TAC ATC ATT	CGA 15 i ) Ars 3ćÓ
val 545	Ala	Asn	Leu	5er Asp 550	Ile Ile Val His Leu 355	Asn Tyr Ile Ile
GAC	GCG	TAA					1613
Asp	Ala	•

( 2 ) Dane dla sekwencji SEK	NR ID. 30:
(i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 563aminokwasów ( D ) Typ aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 30;
Aia Gly Asp Thr Ala Asn 1 5	Ile Gly Asp Gly Asp Pne Leu Pro pro Tyr 10 15
Asn Asp Val Leu Leu Gly 20	Tyr Trp Asp Lys Leu Glu Leu Arg Leu Tyr 25 30
Asn Leu Arg His Asn Leu 35	Ser Leu Asp Giy Gln Pro Leu Asn Leu Pro 40 45
Leu Tyr Ala Thr Pro '/al 50	Asp Pro Lys Thr Leu Gln Arg Gln Gln Ala 55 80
Gly Gly Asp Gly Thr Gly 65 70	ser ser pro Ala Gly Gly Gln Gly ser vai 75 30
Oln Gly Trp Arg Tyr Pro 85	Leu Leu val Glu Arg Ala Arg Ser Ala Val 90 93
Ser Leu Leu Thr Cln Ph· 100	Gly Asn ser Leu Gln Thr Thr Leu Glu His 105 110
Gln Asp Asn Glu Lys Met 115	Thr Ile Leu Leu Gln Thr Gin Gln Glu Ala 120 125
Ile Leu Lys His Gln Kis 130	Asp Ile Gln Gin Asn Asn Leu Lys Gly Leu 135 140
Gln His ser Leu Thr Ala 145 150	Leu cln Ala ser Arg Asp Cly Asp Thr Leu 155 160
Arg Gln Lys His Tyr ser 165	Asp Leu Ile Asn Gly Gly Leu Ser Ala Ala 170 175
Glu Ile Ala Gly Leu Thr 180	Leu Arg ser Thr Ala Mec ile Thr Asn Gly 185 190
Val Ala Thr Gly Leu Leu 195	Ile Ala Gly Gly Ile Ala Asn Ala Val Pro 200 205
Asn Val Phe Gly Leu Ala 210	Asn Gly Gly ser Glu Trp Gly Ala Pro Lau 213 220

Ile Gly Ser Gly Gln Ala Thr Cln Val Gly Ala Gly II· Gln Asp Gln

116

186 242

225

2J0

235

240

Sec

Aia

Gly

na

ser 245

Glu

Val

Thr

Ala

dy 250

Tyr

Gln

Arg

Arg

dn 255

Glu

Glu

Trp

Ala

Leu 260

Gln

Arg

Mp

Ile

Ala 265

Asp

Asn

Giu

Ile

Thr 270

G ln

Leu

Asp

Ala

Gln 275

Ile

Gln

Ser

Leu

Cln 280

Glu

Gln

Ile

Thr

Mec 235

Ala

Gln

Lys

Gln

Ile 290

Thr

Leu

Ser

Glu

Thr 295

Glu

Gln

Ala

Asn

Ala 300

Gln

Ala

Iie

Tyr

Mp 305

Leu

Gln

Thr

Thr

Mg 310

Phe

Thr

dy

Gln

Ala 315

Leu

Tyr

Asn

Trp

Mec 320

Ala

Gly

Mg

Leu

Ser 325

Ala

Leu

Tyr

Tyr

Gln 330

Mec

Tyr

Mp

Ser

Thr 335

Leu

Pro

Ile

Cys

Lau 340

Gln

Pro

Lys

Ala

Aia 345

Leu

Val

Gln

Glu

Leu 350

dy

Glu

Lys

Glu

Ser 335

Mp

Ser

Leu

Phe

Gln 360

Val

Pro

val

Trp

Asn 3 65

Asp

Leu

Trp

Gln

Gly 370

Leu

Leu

Ala

dy

du 375

dy

Leu

Ser

Ser

Glu 380

Leu

Gln

Lys

Leu

Asp 385

Ala

Ile

Trp

Leu

Ala 390

Arg

Gly

dy

Ile

dy 335

Leu

du

Ala

Ile

Arg 400

Thr

V al

Ser

Leu

Asp 405

Thr

Leu

Phe

dy

TUr 410

Gly

Th:

Lau

Ser

du 415

Mn

Ile

Asn

Lys

Val 420

Leu

Mn

Gly

Glu

Thr 425

Val

Ser

Pro

Ser

Gly 430

dy

Val

Thr

Lau

Ala 435

Leu

Thr

Gly

Asp

Ile 440

Pha

Gln

Ala

Thr

Leu 445

Mp

Leu

Ser

Gln

Leu 450

Gly

Leu

Asp

Mn

Ser 455

Tyr

Mn

Leu

Gly

Mn 460

Glu

Lys

Lys

Arg

Arg 455

Ile

Lys

Acg

Ile

Ala 470

Val

Thr

Leu

Pro

Thr 475

Lau

Leu

dy

Pro

Tyr 480

Gln

Mp

Leu

Glu

Ala 485

mr

Leu

Val

Gly 490

Ala

Glu

Ile

Ala

Ala 495

Leu

Ser

Hls

Gly

Val 500

Mn

Mp

Gly

dy

Mg 505

Pha

Val

Thr

Asp

Phe 510

Asn

Asp

Ser

Arg

Phe 515

Leu

Pro

Phe

Glu

Gly 520

Mg

Mp

Ala

Thr

Thr 525

dy

Thr

Leu

Glu

Leu 530

Mn

Ile

Pha

His

Ala 535

dy

Lys

du

dy

Thr 540

Gln

His

du

Leu

Vel 545

Ala

Asn

Leu

Ser

Mp 550

Ile

Ile

Val

HS

Leu 555

Mn

T/r

Ile

Ile

Arg 560

Asp Ala

186 242

117 ( 2 ) EOne dla sekwencji SEK NR HZ): 31;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 4458 par zasad ( B ) Typ: kwas nukleinowy ( C ) Rodzaj nici: podwójna ( D ) Topologia: liniowa ( n ) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (ix ) Cechy:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Położenie: 1.. 4458 (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID' 31;

ATG Met 1

CAG Gln

GAT Asp

TCA Ser

CCA GAA

GTA TCG ATT ACA ACG CTG TCA CTT

CCC Pro 15

AAA Lys

43

Pro 5

Glu

Val

Sar

Ile

Thr 10

Thr

Leu

Ser

Leu

3GT

GGC

GGT

GCT

ATC

AAT

GGC

ATG

GGA

GAA

GCA

CTG

AAT

GCT

GCC

CGC

9ó

Gly

Gly

Gly

Ala 20

Ile

Asn

Gly

Met

Gly 25

Glu

Ala

Leu

Asn

Ala 30

Ala

Gly

GAT

GGA

ATG

GCC

TCC

CTA

TCT

CTG

CCA

rfA

CCC

CTT

TCG

ACC

CGC

144

Pro

Asp

Gly 35

Met

Ala

Ser

Lau

Ser 40

Lau

Pro

Leu

Pro

Leu 45

Ser

Thr

Gly

AGA

GGG

ACG

GCT

CCT

GGA

TTA

TCG

CTG

ATT

TAC

AGC

AAC

AGT

GCA

CGT

192

Arg

Gly 50

Thr

Ala

Pro

Gly

Leu 55

ser

Leu

Ile Tyr

Ser 60

Aan

Ser

Ala

Gly

AAT

GGG

CCT

TTC

GGC

ATC

GGC

TCG

CAA

TGC

GGT

GTT

ATG

TCC

ATT

AGC

240

Asn 65

Gly

Pro

Phe

Gly

Ile 70

Gly

Trp

Gln

Cys

Gly 75

Val

Met

ser

Ile

ser 30

CCA

CGC

ACC

CAA

CAT

GGC

ATT

CCA

CAA

TAC

GGT

AAT

GAC

GAC

ACG

TTC

238

Arg

Arg

Thr

Gln

His 85

Gly

Ile

Pro

Gln

Tyr 90

Gly

Asn

Asp

Asp

Thr 95

Phe

CTA

TCC

CCA

CAA

GGC

GAG

GTC

ATG

AAT

ATC

GCC

CTG

AAT

GAC

CAA

GGG

336

Leu

Ser

Pro

Gln 100

Gly

Glu

Val

Met

Asn 105

Ile

Ala

Leu

Asn

Asp 110

Gln

Gly

CAA

CCT

GAT

ATC

CGT

CAA

GAC

GTT

AAA

ACG

CTG

CAA

GGC

GTT

ACC

TTC

33 4

Cln

pro

Asp 113

Ile

Arg

Gln

ASP

Val 120

Lys

Thr

Leu

Gln

Gly 125

Val

Thr

Leu

CCA

ATT

(CC

TAT

ACC

GTG

ACC

CGC

TAT

CAA

GCC

CGC

cag

ATC

CTC

GAT

432

Pro

Ile 130

Ser

Tyr

Thr

Val

Thr 135

Arg

Tyr

Gln

Ala

Arg 140

Gln

Ile

Leu

Asp

TTC

AGT

AAA

ATC

GAA

TAC

TGG

CAA

CCT

GCC

TCC

GGT

CAA

GAA

GGA

CCC

430

?ne 145

ser

Lys

Ile

Glu

Tyr 150

Trp

Gln

Pro

Ala

Ser 155

Gly

Gln

Glu

Gly

Arg 160

gCT

TTC

TGG

CTG

ATA

TCG

ACA

CCG

GAC

GGG

CAT

CTA

CAC

ATC

TTA

gGg

528

Ala

Phe

Trp

Leu

Ile 1S5

Ser

Thr

pro

Asp

Gly 170

His

Leu

His

Ile

Leu 175

g ’♦ t '-»±S

AAA

Λ - —

GCG

CAG

GCT

TGT

CTG

GCA

.AAT

*— 00

CAA

AAT

GAC

CAA

CAA

ATC

57 5

Lys

Thr

Ala

Gln

Ala

Cys

Leu

Ala

Asn

Pro

Gln

Asn

Asp

Gln

Gln

Ile

118

186 242

130 135 190

-·/» ~ — Ala

CAG Gin

« -4^ Trp 135

Leu

cTC Leu

Glu

GAaA Glu

ACT Thr 200

GTG V a 1

.nw g Thr

CCA Pro

gCC Ala

GCT Gly 205

GAA Glu

CAT His

GTc Val

524

AGG

TAT

CAA

TAT

CGA

CCC

gAA

gAT

GAA

GCC

CAT

TCT

GAC

GAC

AAT

GAA

Ser

’ 1 ·

Gln

Tyr

Arg

Ala

Clu

Asp

Glu

Ala

His

Cys

Asp

Asp

Asn

Glu

210

215

220

AAA

ACC

—

TAT

CGG

AAT

GTT

ACC

GCA

CAG

—

TAT

CTG

GTA

CAG

GTC

20

Lys

Thr

Ala

His

Pro

Asn

Val

Thr

Ala

Gln

Arg

Tyr

Leu

Val

Gln

Val

225

230

235

240

AAC

TAC

GGC

AAC

ATC

AAA

CCA

CAA

GCC

AGC

CTG

TTC

GTA

CTG

GAT

AAG

63

Asn

Tyr

Gly

Asn

Ile

Ly:s

Pro

Gln

Ala

Ser

Leu

Phe

Val

Leu

Asp

Asn

245

250

255

GCA

CCT

CCT

GCA

CCG

GAA

GAG

TGG

CTG

TTT

CAT

CTG

GTC

TTT

GAC

CAC

315

Aid

Pro

Pro

Ala

Pro

GlU

Glu

Trp

Leu

Phe

His

Leu

Val

Phe

Asp

His

260

265

270

GGT

GAG

CGC

GAT

ACC

TCA

CTT

CAT

ACC

GTG

CCA

ACA

TGG

GAT

GCA

GGT

364

Gly

Glu

Arg

Asp

Thr

Ser

Leu

His

Thr

Val

Pro

Thr

Trp

Asp

Ala

Gly

275

230

235

ACA

GGG

CAA

TGG

TCT

GTA

CGC

CCG

GAT

ATC

TTC

TCT

CGC

TAT

GAA

TAT

912

Thr

Ala

Gln

Trp

Ser

Val

Arg

Pro

Asp

Ile

Phe

Ser

Arg

Tyr

Clu

Tyr

290

295

300

GGT

TTT

GAA

GTG

CGT

ACT

CGC

CGC

TTA

TGT

CAA

CAA

GTC

CTG

ATG

TTT

950

Gly

Phe

Glu

Val

Arg

Thr

Arg

Arg

Leu

Cys

Cln

Cln

val

Leu

Met

Phe

305

310

315

320

CAC

CGC

ACC

GCG

CTC

ATG

CCC

CCA

GAA

GCC

AGT

ACC

AAT

GAC

CCC

CCC

1003

His

Arg

Thr

Ala

Leu

Mec

Ala

Cly

Glu

Ala

Ser

Thr

Asn

Asp

Ala

Pro

325

330

335

GAA

CTG

GTT

GCA

CGC

TTA

ATA

CTG

GAA

TAT

GAC

AAA

AAC

GCC

AGC

CTC

105 6

Glu

Leu

Val

Gly

Arg

Leu

Ile

Leu

Glu

Tyr

Asp

Lys

Asn

Ala

Ser

Val

340

345

350

ACG

ACG

TTG

ATT

ACC

ATC

CGT

CAA

TTA

AGC

CAT

GAA

TCG

CAC

GGC

AGG

1104

Thr

Thr

Leu

Ile

Thr

Ile

Arg

Cln

Leu

Ser

His

Glu

Ser

Asp

Gly

Arg

355

360

365

CCA

GTC

ACC

CAC

CCA

CCA

CTA

GAA

CTA

GCC

TGC

CAA

CGC

TTr

GAT

CTC

1152

Pro

val

Thr

Gln

fro

Pro

Leu

Clu

Lau

Ala

Trp

Gln

Arg

Phe

Asp

Leu

370

375

330

GAG

AAA

ATC

CCG

ACA

TGG

CAA

CGC

TTT

GAC

GCA

CTA

GAT

AAT

TTT

AAC

1200

Glu

Lys

Ile

Pro

Thr

Trp

Gln

Arg

Phe

Asp

Ala

Leu

Asp

Asn

Phe

Asn

3 35

390

395

400

TCG

CAG

CAA

CGT

TAT

CAA

CTG

GTT

CAT

CTG

CGG

GGA

GAA

GGG

TTG

CCA

1243

Ser

Gln

Gln

Arg

Tyr 405

Gln

Leu

Val

Asp

Leu 410

Arg

Gly

Glu

Cly

Leu 415

Pro

CGT

ATG

CTG

TAT

CAA

GAT

CGA

GGC

GCT

TGG

TGG

TAT

AAA

GCT

CCG

CAA

1295

G ’y lllj*

Met

Leu

Tyr 420

Gln

Asp

Arg

Cly

Ala 425

Trp

Trp

Tyr

Lys

Ala 430

Pro

Gln

CGT

CAG

GAA

GAC

GGA

GAC

AGC

AAT

GCC

GTC

ACT

TAC

GAC

AAA

ATC

GCC

12 44

Arg

Gln

Glu

Asp

Gly

Asp

Ser

Asn

Ala

Val

Thr

Tyr

Asp

Lys

Ile

Ala

435 440 445

186 242

119

. --C

AEC

c-A

AAT

TTG

CAG

GAT

AAT

gCC

- cA

TTG

ATG

GA. i

Pro Leu 450

Pro

Thr

LAU

Pro

Asn 455

Leu

Gin

Asb

Asn

Ala 460

Ser

Leu

Met

Asp-

ATC AAC

GGA

GAC

GGC

CAA

CTG

GAT

TGG

GTT

GTT

ACC

GCC

TCC

Gg 1

ATT

1440

Ele Asn 465

Gly

Asp

Gly

Gln 470

Leu

Asp

Trp

Val

Val 475

Thr

Ala

Ser

Gly

Ile 430

«'•yC vwA

TAC

CAT

AGT

CAG

CAA

CCC

CAT

GGA

AAG

TGG

ACG

CAC

TTT

ACG

1488

Arg Gly

Tyr

Hi 3

Ser 485

Gln

Gln

Pro

Asp

Gly 490

Lys

Trp

Thr

His

Phe 495

Thr

CCA ATC

AAT

GCC

TTG

ccc

CTG

CAA

TAT

TTT

CAT

CCA

AGC

ATC

CAG

T>T*C

1553

Pro Ile

Asn

Ala. 500

Leu

Pro

val

Glu

Tyr 505

Phe

His

Pro

Ser

Ile 510

Gln

Phe

GCT GAC

CTT

ACC

GGG GGG

GCA

GGC

TTA

TCT

GAT

TTA

GTG

TTG

ATC

GGG

rm

1584

Ala Asp

Leu 515

Thr

Gly

Ala

Cly

Leu 520

Ser

Asp

Leu

Val

Lau 525

Ile

Gly

Pro

AAA -AGC

GTG

CGT

CTA

TAT

CCC

AAC

CAC

CGA

AAC

GGC

TGC

CGT

AAA

GGA

1632

Lys Ser 530

Val

Arg

Leu

Tyr

Ala 535

Asn

Cln

Arg

Asn

Gly 540

Trp

Arg

Lys

Gly

CAA GAT

GTC

CCC

CAA

TCC

ACA

CGT

ATC

ACC

CTG

CCT

GTC

ACA

GGG

ACC

1680

Glu Asp 545

val

Pro

Gln

ser 550

Thr

Gly

Ile

Thr

Leu 555

Pro

Val

Thr

Gly

Thr 560

GAT GCC

CGC

AAA

CTG

GTG

GCT

TTC

AGT

GAT

ATG

CTC

GGT

TCC

GGT

CAA

1723

Asp Ala

Arg

Lys

Leu 565

Val

Ala

Phe

Ser

Asp 570

Met

Lau

Gly

Ser

Gly 575

Gln

CAA CAT

CTG

GTG

GAA

ATC

AAC

CGT

AAT

CGC

GTC

ACC

TGT

TGG

CcG

AAT

177 6

Gln His

Lau

Val 580

Glu

Ile

Lys

Gly

Asn 585

Arg

val

Thr

cys

Trp 590

Pro

Asn

CTA GGG

CAT

GGC

CGT

TTC

GGT

CAA

CCA

CTA

ACT

CTG

TCA

GGA

TTT

AGC

1324

Leu Gly

His 595

Gly

Arg

Phe

Gly

Gln 600

Pro

Leu

Thr

Leu

Ser 605

Gly

Phe

Ser

CAG cCC

GAA

AAT

ACC

TTC

AAT

CCC

GAA

CGG

CTG

TTT

CTG

GCG

CAT

ATC

1372

Gln Pro 510

Glu

Asn

Ser

Phe

Asn 615

Pro

Glu

Arg

Lau

Phe 620

Lau

Ala

Asp

Ile

GAC GGC

TCC

GGC

ACC

ACC

GAC

CTT

ATC

TAT

CCG

CAA

TCC

GGC

TCT

TTG

1920

Asp Gly 625

Ser

Gly

Thr

Thr 630

Asp

Leu

Ile

Tyr

Ala 635

Gln

Ser

Gly

Ser

Leu 640

CTC ATT

TAT CTC'

AAC

CAA

ACT

GGT

AAT

CAC

TTT

GAT

GCC

CCG

TTG

ACA

19 68

Leu Ile

Tyr

Leu

Asn 645

Gln

Ser

Gly

Asn

Gln 650

Phe

Asp

Ala

pro

Leu 655

Thr

TTA GCG

TTG

CCA

GAA

CGC

GTA

CAA

TTT

GAC

AAC

ACT

TCC

CAA

CTT

CAA

2015

Leu Ala

Leu

Pro 660

Glu

Gly

Val

Gln

Phe 665

Asp

Asn

Thr

cys

Gln 670

Lau

Gln

GTC GCC

GAT

ATT

CAG

GGA

TTA

GGG

ATA

GCC

ACC

TTG

ATT

CTG

ACT

GTG

2064

Val Ala

Asp 575

Ile

Gln

Gly

Leu

Gly 680

Ile

Ala

Ser

Leu

Ile 635

Leu

Thr

Val

CCA CAT

ATC

GCG

CCA

CAT

CAC

TGG

CGT

TGT

GAC

CTG

TCA

CTG

ACC

AAA

2112

Pro His 690

Ile

Ala

Pro

His

His 695

Trp

Arg

Cys

Asp

Leu 700

Ser

Leu

Thr

Lys

C TGG

TTC

TTG

AAT

GTA

ATG

AAC

AAT

AAC

CCG

GGC

GCA

CAT

CAC

ACG

216 0

?ro Trp

Leu

Leu

Asn

Val

Mee

Asn

Asn

Asn

Arg

Gly

Ala

His

His

Thr

120

186 242

765

710

715

720

CTA Leu

CAT His

TAT Tyr

CGT Arg

ACT Ser 725

TTC Ser

Ala

C.AA Gln

Phe

• Al Trp 730

Leu

Asp

Glu

Lys

Leu 735

Gln

2209

CTC

ACC

AAA

GCA

GGC

AAA

TCT

W

GCT

TGT

TAT

cTG

cCG

TTT

CCA

ATG

2256

Leu

Thr

Lys

Ala 740

Gly

Lys

Ser

Pro

Ala 745

cys

Tyr

Leu

Pro

Phe 75u

Pro

Mec

CAT

TTG

GTA

TTG

TAT

ACC

CAA

ATT

CAG

CAT

GAA

ATC

AGC

GGC

AAC

CGG

2334

His

Leu

Leu 755

Trp

Tyr

Thr

Glu

Ile 760

GlM

Asp

Glu

Ile

Ser 765

Gly

Asn

Arg

CTC

ACC

AGT

CAA

CTC

AAC

TAC

AGC

CAC

GGC

GTC

TGG

CAT

GGT

AAA

GAG

2352

Leu

Thr 770

Ser

Glu

Val

Asm

Tyr 775

Ser

His

Gly

Val

Trp 730

Asp

Gly

Lys

Glu

CGG

GAA.

TTC

ACA

CCA

ttt

TCC

ATC

AAA

CAG

ACA

GAT

ACC

ACA

AGO

2400

Arg 7θ5

Glu

Phe

Arg

Gly

Phe 790

Gly

Cys

Ile

Lys

Gin 795

Thr

Asp

Thr

Thr

Thr 300

T*”!*

TCT

CAC

CCC

ACC

CCC

CCC

CAA

CAG

GCG

GGA

CCG

TCO

CTG

ACT

ATT

2443

Phe

Ser

His

Gly

Thr 305

Ala

Pro

Glu

Gln

Ala 310

Ala

Pro

Ser

Leu

Ser 315

Ile

AGC

TOG

TTT

CCC

ACC

CCC

ATG

GAT

CAA

GTA

GAC

AGC

CAA

TTA

GGT

A.CG

2496

Ser

Trp

Phe

Ala 320

Thr

Gly

mcc

Asp

Glu 325

Val

Asp

Ser

Gln

Leu 330

Ala

Thr

GAA

TAT

TGG

CAG

GCA

GAC

ACS

CAA

GGT

TAT

AGC

GGA

TTT

CAA

ACC

CGT

2544

Glu

Tyr

Trp 335

GlM

Ala

Asp

Thr

Gln 340

Ala

Tyr

Ser

Gly

Phe 345

Glu

Thr

-Arg

TAT

ACC

GTC

TGG

GAT

CAC

ACC

AAC

CAG

ACA

GAC

CAA

GCA

TTT

ACC

CCC

2592

Tyr

Thr 350

Val

Trp

Asp

His

Thr 355

Asm

Gln

Thr

Asp

Gln 360

Ala

Phe

Thr

Pro

AAT

GAC

ACA

CAA

CGT

AAC

TGG

CTG

ACG

CGA

GCG

CTT

AAA

GGC

CAA

CTC

2640

Asn 365

Glu

Thr

Gln

Arg

Asn 370

Trp

Leu

Thr

Arg

Ala 375

Leu

Lys

Gly

GlM

Leu 330

CTA

CGC

ACT

GAG

CTC

TAC

GCT

cTg

GAC

CGA

ACA

GAT

AAG

CAA

ACA

GTG

2633

Leu

Arg

Thr

Glu

Leu 335

Tyr

Gly

Leu

Asp

Gly 390

Thr

Asp

Lys

Gln

Thr β95

Val

CCT

TAT

ACC

GTC

AGT

GAA

TCG

CGC

TAT

CAG

GTA

CGC

TCT

ATT

CCC

GTA

2736

Pro

Tyr

Thr

Val 900

Ser

Glu

Ser

Arg

Tyr 905

GlM

val

Arg

Ser

Ile 910

Pro

Val

AAT

AAA

CAA

ACT

CAA

TTA

TCT

CCC

TCC

GTG

ACT

CCT

ATT

CAA

AAT

CGC

2”34

Asn

Lys

Glu 915

Thr

Glu

Leu

ser

Ala 920

Trp

val

Thr

Ala

Ile 925

Glu

Asn

Arg

AGC

TA C T.n<L

CAC

TAT

CAA

ccT

ATC

ATC

ACT

GAC

CCA

CAG

TTC

AGC

CAG

AGT

2332

Ser

tyr 930

His

Tyr

Glu

Arg

Ile 935

Ile

Thr

Asp

Pro

Gln 940

Phe

Ser

GlM

5er

ATC

AAG

TTG

CAA

CAC

GAT

ATC

TTT

GGT

GAA

TCA

CTG

CAA

ACT

GTC

CAT

2330

Ile 945

Lys

Leu

GlM

His

Asp 950

Ile

Phe

Gly

Gln

Ser 955

Leu

Gln

Ser

val

Asp 553

ATT	GCC TCG	CCG CGC	CCC	CAA AAA	CCA	CCA		.AAT CCC	TAC	CCC CCT 2923
Ile	Ala Trp	Pro Arg 965	Arg	Glu Lys	Pro	Ala 370	Val	Asn Pro	Tyr	Pro ?ro 975

186 242

121

ACG Thr

CTG Leu

CCG Pro

GAA Glu 980

Thr

CTA Leu

7TT Phe

GAC Asp

Ser 335

Λ A C Ser

TAT T «r

GAT Asp

Asp

CAA Gln 990

Gln

TAA Gln

” * -

CTA

TTA

cGT

CTG

GTC

Aga.

CAA

AAA

AAT

AGC

TGG

CAT

c Ac

CTT

ACT

GAT

3024

Leu

Leu

Arg 995

Leu

Val

Arg

Gin

Lys Asn 1000

Ger

Trp

His

His Leu 1005

Thr

Asp

G GG

GAA

AAC

TGG

CCA

TTA

GCT

TTA

—

AAT

GCA

CAA

CCC

CGT

GAT

CTT

3072

Tly

Ciu Asn 1010

Trp

Arg

Leu

Cly Leu 1015

Pro

Asn

Ala

Cln 102«

Arg 0

Arg

Asp

TAT

Λ · *

• Afc

GAC

ACC

AAA

ATT

CCA

ACC

CAA

GGG

ATT

TV(-

CTT

TAA

3 120

Tyr 102'

Thr 5

Tyr

Asp

Arg

Ser Lys 1030

Ile

Pro

Thr

Clu Cly 1035

Ile

ser

Leu

G3‘J 1040

ATC

TTC

CTG

AAA

G A T 1

CAT

CGC

C»GC V. ()G

CTA

CCA

GAT

CAA

AAA

GCG

CCC

Gi »

3156

Ile

Leu

Leu

Lys

Asp 104*

Asp y

Cly

Leu

Leu

Ala . Asp 1050

Clu

Lys

Ala

Ala 1055

Vai

TAT

CTC

tgA

C.AA

CAA

CAG

ACG

ΤΓΓ

TAC

ACC

CCC

CGT

CAA

GCG

GAA

GTC

3216

Tyr

Leu

Cly

Gln Gln 1060

Cln

Thr

Phe

Tyr Thr 1065

Ala

Gly

Gln

Ala Glu 1070

Val

ACT

CTA

CAA

AAA

ccc

ACC

TTA

CAA

GCA

CTG

CTC

CCG

TTC

CAA

GAA

ACC

3264

Thr

Leu

Clu Lys 1075

Pro

Thr

Leu

Gln Ala 1080

Leu

Val

Ala

Phe Gln 1085

Glu

Thr

GCC AS. ‘w

ATC

ATG

GAC

GAT

ACC

TCA

TTA

CAG

GCC

TAT

GAA

GGC

GTT

ATT

G · * -ΙΛΛ

33 12

Aid

Met Met 1090

Asp

Asp

Thr

Ser Leu 1095

Gln

Ala

Tyr

Glu Cly 1100

Val

Ile

Clu

GAG

CAA

GAC

TTG

AAT

ACC

CCG

CTC

ACA

CAG

GCC

GGT

TAT

CAG

CAA

GTC

3360

Glu Gln 1105

Glu

Leu

Asn

Thr Ala 1110

Leu

Thr

Cln

Ala Cly 1115

Tyr

Gln

Gln

vai 1120

GCG

CCG

TTG

TTT

AAT

ACC

AGA

TCA

CAA

ACC

CCC

GTA

TCG

CCG

CCA

CGG

3408

Ala

Arg

Leu

Phe

Asn 1125

Thr

Arg

Ser

Clu

Ser 1130

Pro 1

Val

Trp

Ala

Ala 1135

Arg

CAA

GGT

TAT

ACC

CAT

TAC

CGT

CAC

CCC

CCA

CAC

TTC

TGG

CGG

CCT

CAG

3456

Gln

Cly

Tyr

Thr 1140

Asp 1

Tyr

Cly

Asp

Ala 1145

Ala

Gln

Phe

Trp

Arg Pro 1150

Gln

CCT

CAG

CGT

AAC

TCC

TTG

CTG

ACA

CGG

AAA

ACC

ACA

CTC

ACC

TC

CAT

3504

AU

Cln

Arg 1155

Asn

Ser

Lau

Leu

Thr Cly 1160

Lys

Thr

Thr

Leu Thr 1165

Trp

Asp

ACC

CAT

CAT

TCT

GTA

ATA

ATA

CAG

ACT

CAA

CAT

GCC

GCT

GGA

TTA

ACG

3552

Thr

His 1170

His 1

Cys

Val

Ile

Ile 1175

Gin

Thr

Gln

Asp

Ala Ala 1130

Gly

Leu

Thr

AcT

CAA

GCC

CAT

TAC

CAT

TAT

CGT

TTC

ctt

ACA

CCG

GTA

CAA

CTG

ACA

3600

Thr 1135

Gln

Ala

His

Tyr

Asp Tyr 1190

Arg

Phe

Leu

Thr Pro 1195

Val

Gin

Leu

Thr 1200

GAT

ATT

AAT

GAT

AAT

CAA

CAT

ATT

GTG

ACT

CTG

CAC

GCG

CTA

CGT

CGC

3648

Asp

Ile

Asn

Asp

Asn 1205

Gln

His

Ile

val

Thr 1210

Leu 1

Asp

Ala

Leu

Cly 1215

Arg

CTA

ACC

ACC

ACC

CCC

TTC

TGG

GGC

ACA

GAG

CCA

GGA

CAA

CCC

GCA

TGC

3656

Val

Thr

Thr

Ser 1220

Arg

Phe

Trp

Cly

Thr 1225

Glu

Ala

Gly

Gin

Ala 1230

Ala 1

Gly

TAT

T»C G

i\AC

CAG

ccc

TTC

ACA

CCA

CCC

GAC

TCC

(TTA

CAT

AAA

GCG

GTG

3~44

T.r i, r

Ser

Asn

Gln

Pro

Phe

Thr

Pro

Pro

Asp

Ser

Vłl

Asp

Lys

Ala

Leu

122

186 242

HA? 1245

5-ZA Aid

1 TA ACC Leu Thr 1250

GGC Cly

‘SC A Aid

CT7 Leu

ΣΤΤ ‘jTT Pro Tal 1255

Ala

CAA Gln

TGT Cys

*.λ 3TC Leu Tal 12 50

TA* T/r

— V Aid

ί' Vdl

' - ’

CAT

AGC TCC

ATG

CwG

fc — J

TTA TCT

TTG

wy

CAG

CAC

TCA

CAA

3840

Asp Ser Trp 1265

Mec

Pro

Ser 12~<

Leu Ser 3

Leu

Ser

Gln Leu Ser 1275

Gln

Ser

Cln 1230

JC-P A

jrtA

CTA

TGG GCG

CAA

CTC

CGT

GCC GCT

CAT

rt

ATT

•aaa

du

du Ala

Slu

Ala Leu i ;as

Trp Ala

Gln

Leu Arg 1290

Ala Ala

HlS

Mec 123:

Ile

ACC

GAA GAT

GGG

AAA

GTG

TGT GCG

TTA

AGC

GCG

AAA CGA

GGA

ACA

AGC

3936

Thr

Glu Asp

Gly Lys 1300

Val

Cys Ala

Leu Ser 1305

Cly

Lys Arg

Gly Thr 1310

Ser

CAT

CAC AAC

CTG

ACG

ATT

CAA CTT

ATT

TCG

CTA

TTC GCA

AGT

ATT

CCC

3534

His

Gln Asn Leu 1315

Thr

Ile

Gln Leu Iie 1320

Ser

Leu

Leu Ala Ser 132S

Ile

Pro

CGT

TTA CCG

CCA

CAT

GTA

CTG GGG

ATC

ACC

ACT

GAT CGC

TAT

GAT

4032

Arg

Leu Pro 1330

Pro

His

Tal

Leu Gly 1335

ile

Thr

Thr

Asp Arg 1340

T/r

Asp

Sar

CAT

CCC CAA

CAG

CAG

s.AC

CAA CAG

ACG

GTG

AGC

TTT AGT

GAC

GGT

•TT

4030

Asp pro Gin 1345

Gln

Gin

His Gln Gln 1350

Thr

val

Ser Phe Ser 1355

Asp

Gly

Phe 1360

CCC

CGG TTA

CTC

CAG

AGT

TCA GCT

CCT

CAT

GAG

TCA GGT

GAT

GCC

TCC

4123

cly

Arg Leu

Leu

Gln Ser 1365

Ser Ala

Arg

His Glu 1370

Ser Gly

Asp

Ala 1375

Trp

CAA

CGT AAA

GAG

GAT

GGC

CCG CTG

GTC

GTC

GAT

GCA AAT

GCC

CTT

CTC

4176

Gln

Arg Lys

Glu Asp 1380

Gly Gly Leu

val val 1385

ASP

Ala Asn

Gly Val 1390

Leu

CTC

AGT GCC

CCT

ACA

GAC

ACC CGA

TGC

GCC

GTT

TCC GGT

CGC

ACA

GAA

4224

al

ser Ala Pro 1395

Thr

Asp

Thr Arg Trp 1400

Aid

Val

Ser Gly Arg 1405

Thr

Glu

TAT

CAC CAC

AAA

GGC

CAA

CCT GTG

CGT

ACT

TAT

CAA CCC

TAT

TTT

CTA

4272

Tyr

Asp Asp 1410

Lys

Gly

Gln

Pro Val 1415

Arg

Thr

T/r

Gln pro 1420

Tyr

Phe

Lau

AAT

CAC TGG

CGT

TAC

GTT

AGT GAT

CAC

AGC

GCA

CGA GAT

GAC

CTG

TTT

4320

Asn Asp Trp 1425

Arg

Tyr

val Ser Asp 1430

ASP

Ser

Ala Arg Asp 1435

ASP

Leu

Phe 1440

CCC

CAT ACC

CAC

CTT

TAT

GAT CCA

TTC

GGA

CGG

GAA TAC

AAA

CTC

ATC

4363

Ala

Asp Thr

HIS

Leu Tyr 1445

Asp Pro

Leu

Gly Arg 1450

Glu T/r

Lys

Val Ile 1455

ACT

GCT AAG

AAA

TAT

TTG

CCA GAA

AAG

CTC

TAC

ACC CCG

TCG

TTT

ATT

44 1 o

Thr

Aia Lys

Lys T/r 1460

Leu

Arg Glu

Lys Leu 1465

T/r

Thr Pro

Trp 147;

Phe 0

Ile

GTC AGT GAG GAT GAA AAC GAT ACA GCA TCA AGA ACC CCA TAC '/al Ser clu Asp Glu Asn Asp Thr Aia Ser Arg Thr Pro *

1475 1430 1435

4453

186 242

123 (2) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 32;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1486 aminokwasów (B) Typ: nmiodkyay (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 32;

Mec 1

Gln

Asp

Ser

Pro 5

Glu

Val

Ser

Ile

Thr 10

Thr

Lau

Ser

Leu

Pro 15

Lys

Gly

Gly

Gly

Ala 20

Ile

Asn

Gly

Mec

Gly 25

Glu

Ala

Leu

Asn

Ala 30

Ala

Cly

Pro

Asp

Gly 35

Mec

Ala

Ser

Leu

Ser 40

Lau

Pro

Lau

Pro

Leu 45

Ser

Thr

Gly

Arg

Gly 50

Thr

Ala

Pro

Gly

Lau 55

Sar

Leu

Ile

Tyr

Ser 60

Asn

Ala

Gly

Asn 65

Gly

Pro

Phe

Gly

Ile TO

Gly

Trp

Gln

—ys

Gly 75

Val

Mec

Ser

Ile

Ser 80

Arg

Arg

Thr

Gln

His 85

Gly

Ile

Pro

Gln

Tyr 90

Gly

Asn

Asp

Asp

Thr 95

Phe

Leu

Ser

Pro

Gln 100

Gly

Glu

Val

Mec

Asn 105

Ile

Ala

Leu

Asn

Asp 1i0

Gln

Gly

Gln

Pro

Asp 115

ile

Arg

Gln

Asp

Val 120

Lys

Thr

Lau

Cln

Gly 125

Val

Thr

Leu

Pro

Ile 130

ser

Tyr

Thr

Val

Thr 135

Arg

Tyr

Gln

Ala

Arg 140

Gln

Ile

Lau

-Asp

Phe 145

Ser

Lys

Ile

Glu

Tyr 150

Trp

Gln

Pro

Ala

ser 155

Gly

Gln

Glu

Gly

Arg 160

Ala

Phe

Trp

Leu

Ile 165

Ser

Thr

Pro

Asp

Gly 170

His

Lau

His

Ile

Lau 175

Gly

Lys

Thr

Ala

Gln 130

Ala

Cys

Leu

Ala

Asn 185

Pro

Gln

Asn

Asp

Gln 150

Gln

Ile

Ala

Gln

Trp 195

Leu

Leu

Glu

Glu

Thr 200

Val

Thr

Pro

Ala

Gly 205

Glu

His

Val

Ser

Tyr 210

Gln

Tyr

Arg

Ala

Glu 215

Asp

Glu

Ala

His

Cys 220

Asp

Asp

Asn

Glu

Lys 225

Thr

Ala

His

Pro

Asn 230

Val

Thr

Ala

Gln

Arg 235

Tyr

Leu

Val

Gln

Val 240

Asn

Tyr

Gly

Asn

Ile 245

Lys

Pro

Gln

Ala

Ser 250

Leu

Phe

Val

Leu

Asp 255

Aan

Aid

Pro

Pro

Ala 260

Pro

Glu

Glu

Trp

Leu 26 5

Phe

His

Lau

Val

Phe 270

Asp

His

Gly

G lu

Arg 275

Asp

Thr

Ser

Leu

His 230

Thr

Val

Pro

Thr

Trp 235

Asp

Ala

Gly

Thr As Gln Trp ser Val Arg Pro Asp Ile Phe Ser Arg Tyr Glu Tyr

124

186 242

290 295 300

G ly 305

?ha

Glu

Val

Arg

Thr 310

Arg

Arg

Leu

Cys

Gln 3 15

Gin

Val

Lau

Mac

Pha 323

His

Arg

Thr

Ala

Lau 325

Met

Ala

Gly

Glu

Ala 330

3er

Thr

Asn

Asp

Ala 335

Pro

Glu

Leu

Val

Gly 3 4 0

Arg

Lau

Ile

Leu

Glu 3 45

Tyr

Asp

Lys

Asn

Ala 350

Ser

Val

Thr

Thr

Lau 355

Ile

Thr

Ile

Arg

Gln 360

Lau

Ser

His

Glu

Ser 355

Asp

Gly

Arg

Pro

Val 370

Thr

Gln

Pro

Pro

Leu 375

Glu

Leu

Ala

Trp

Gln 380

Arg

Phe

A.sp

Lau

Glu 335

Lys

Ile

Pro

Thr

Trp 390

Gln

Arg

Phe

Asp

Ala 355

Lau

Asp

Asn

Phe

Asn 400

Sar

Gln

Gln

Arg

Tyr 405

Gln

Leu

Val

Asp

Lau 410

Arg

Gly

Glu

Gly

Lau 415

Pro

Gly

Mec

Lau

Tyr 420

Gln

Asp

Arg

Gly

Ala 425

Trp

Trp

Tyr

Lys

Ala 430

Pro

Gln

Arg

Gln

Glu 435

Asp

Gly

Asp

Ser

Asn 440

Ala

Val

Thr

Tyr

Asp 445

Lys

Ile

Ala

Pro

Lau 450

Pro

Thr

Lau

Pro

Asn 455

Lau

Gln

Asp>

Asn

Ala 460

Ser

Leu

Mac

Asp

Ile 465

Asn

Gly

Asp

Gly

Gln 470

Lau

Asp

Trp

val

val 475

Thr

Ala

Ser

Gly

Ile 480

Arg

Cly

Tyr

His

Ser 485

Gln

Gln

Pro

Asp

Gly 490

Lys

Trp

Thr

His

Phe 495

Thr

Pro

Ile

Asn

Ala 500

Leu

Pro

Val

Glu

Tyr 505

Phe

His

Pro

Ser

Ile 510

Gln

Phe

Ala

Asp

Leu 515

Thr

Gly

Ala

Gly

Lau 520

Sar

Asp

Lau

Val

Leu 525

Ile

Gly

Pro

Lys

Ser 530

Val

Arg

Lau

Tyr

Ala 535

Asn

Gln

Arg

Asn

Gly 540

Trp

Arg

Lys

Gly

Glu 545

Asp

Val

Pro

Gln

Ser 550

Thr

Gly

Ile

Thr

Leu 555

Pro

Val

Thr

Gly

Thr 500

Asp

Ala

Arg

Lys

Lau 565

Val

Ala

Phe

Ser

Asp 570

Mec

Leu

Gly

Ser

Gly 575

Gln

Gln

His

Lau

Val 580

Glu

Ile

Lys

Gly

Asn 535

Arg

Val

Thr

Cys

Trp 590

Pro

Asn

Leu

Gly

His 555

Gly

Arg

Phe

Gly

Gln 600

Pro

Lau

Thr

Lau

Ser 605

Gly

Phe

Ser

Gln

Pro 610

Glu

Asn

Ser

Phe

Asn 615

Pro

Glu

Arg

Lau

Phe 620

Lau

Ala

Asp

Ile

Asp 625

Gly

Ser

Gly

Thr

Thr 630

Asp

Lau

Ile

Tyr

Ala 535

Gln

Ser

Gly

Ser

Lau 640

Leu Ile Tyr Lau Asn Gln Ser Gly Asn Gln Phe Asp Ala Pro Leu Thr

186 242

125

645 650 655

Leu

Ala

Leu

Pro 660

Glu

Gly

Val

GlO

=ha 665

Asp

asm

Thr

cys

Gln 670

Leu

Gln

Val

Ala

Asp 675

Ile

Gin

Gly

Lau

Gly 630

Ile

Ala

Ser

Leu

Ile 635

Leu

Thr

Val

Pro

His 690

Ile

Ala

Pro

His

His 695

Trp

Arg

Cys

Asp

Lau 700

Sar

Leu

Thr

Lys

Pro 705

Trp

Lau

Lau

Asn

Val 710

Mac

Asm

Asn

Asm

Arg 715

Gly

Ala

His

His

Thr ’20

Lau

His

Tyr

Arg

Ser 725

Ser

Ala

Gln

Phe

Trp 730

Leu

Asp

Glu

Lys

Lau 735

Gln

Leu

Thr

Lys

Ala 740

Gly

Lys

Ser

Pro

Ala 745

Cys

Tyr

Leu

Pro

Phe 750

Pro

Mac

His

Lau

Lau 755

Trp

Tyr

Thr

Glu

Ile 760

GlM

Asp

Glu

Ile

Ser 765

Gly

Asn

Arg

Lau

Thr 770

Ser

Glu

Val

Asm

Tyr 775

Ser

His

Gly

Vdl

Trp 730

Asp

Gly

Lys

Glu

Arg 735

Glu

Phe

Arg

Gly

Phe 790

Gly

cys

Ile

Lys

Gln 795

Thr

Asp

Thr

Thr

Thr 300

Phe

Ser

His

Cly

Thr β05

Ala

Pro

Glu

GlM

Ala 310

Ala

Pro

Ser

Lau

Ser 315

Ile

Sar

Trp

Phe

Ala 320

Thr

Gly

Mac

Asp

Glu 325

Val

Asp

Ser

Gln

Leu 330

Ala

Thr

Glu

Tyr

Trp 335

GlM

Ala

Asp

Thr

GlM 340

Ala

Tyr

Ser

Gly

Phe 345

Glu

Thr

Arg

Tyr

Thr 350

Val

Trp

Asp

His

Thr 355

asm

Gln

Thr

Asp

Gln 360

Ala

Phe

Thr

Pro

Asn 365

Glu

Thr

Gln

Arg

asm 370

Trp

Lau

Thr

•Arg

Ala 375

Lau

Lys

Gly

GlM

Leu 330

Lau

Arg

Thr

Glu

Lau β35

Tyr

Gly

Lau

Asp

Gly 390

Thr

Asp

Lys

GlM

Thr 395

Val

Pro_

Tyr

Thr

Val 900

Ser

Glu

Ser

Arg

Tyr 905

Gln

Val

Arg

Ser

Ile 910

Pro

Val

Asn

Lys

Glu 915

Thr

Glu

Leu

Ser

Ala 920

Trp

Val

Thr

Ala

Ile 925

Glu

Asn

Arg

Ser

Tyr 930

His

Tyr

Glu

Arg

Ile 935

Ile

Thr

Asp

Pro

gIm 940

Phe

Ser

Gln

Ser

Ile 945

Lys

Leu

GlM

His

Asp 950

Ile

Phe

Gly

Gln

Ser 955

Lau

Gln

Ser

Val

Asp 960

Ile

Ala

Trp

Pro

Arg 965

Arg

Glu

Lys

Pro

Ala 970

Val

Asn

Pro

Tyr

Pro 975

Pro

Thr

Leu

Pro

Glu 980

Thr

Lau

Phe

Asp

Ser 935

Ser

Tyr

Asp

Asp

Gin 990

Gin

Gln

Lau Lau Αι» Leu Val Arg Gin Lys Asn Ser Trp His His Leu Thr Asp

126

186 242

995 1000 1005

Gly Glu	Asn Trp A.rg Leu C lv	Lau Pro Asn Ala Gln	Arg Arg Asp Val
101(	3 101i	ś 1021	3
Tyr Thr	Tyr Asp Arg Ser Lys	Ile Pro Thr Glu Gly	Ile Ser Lau Glu
1025	1030	1035	1040
Ile Leu	Leu Lys Asp Asp Gly i.045	Leu Lau Ala Asp Glu 1050	Lys Ala Ala Val 1055
Tyr Lau	Cly Gln Gin Gln Thr 1060	Phe Tyr Thr Ala Gly 1065	Gln Ala Glu Val 1070
Thr Leu	Glu Lys pro Thr Lau 1075	Gln Ala Lau Val Ala 1030	Phe Gln Glu Thr 1035
Ala Met	Met Asp Asp Thr Ser	Leu Gln Ala Tyr Clu	Cly Val Ile Clu
1050 1095	i 1100
Glu Gln	Glu Leu Asn Thr Ala	Leu Thr Gln Ala Cly	Tyr Gln Cln Val
1105	1110	1115	1120
Ala Arg	Leu Phe Asn Thr Arg 1125	Ser Glu Ser Pro Val 113C	Trp Ala Ala Arg 1135
Gln Gly	Tyr Thr Asp Tyr Gly 1140	Asp Ala Ala Gln Phe 1145	Trp Arg Pro Cln 1150
Ala Gln	Arg Asn Ser Lau Lau 1155	Thr Gly Lys Thr Thr 1160	Lau Thr Trp Asp 1165
Thr His	His Cys Val Ile Ile	Gln Thr Cln Asp Ala	Ala Gly Lau Thr
1170 1175 1130
Thr Gln	Ala His Tyr Asp Tyr	Arg Phe Leu Thr Pro	Val Cln Lau Thr
1135	1190	1195	1200
Asp Ile	Asn Asp Asn Gln Mis 1205	Ile Val Thr Lau Asp 1210	Ala Lau Gly Arg 1215
Val Thr	Thr Ser Arg Phe Trp 1220	Gly Thr Glu Ala Gly 1225	Gln Ala Ala Cly 1230
Tyr Ser	Asn Gln Pro Phe Thr 1235	Pro Pro Asp Ser Val 1240	Asp Lys Ala Lau 1245
Ala Leu	Thr Gly Ala Leu Pro	Val Ala Gln Cys Lau	Val Tyr Ala Val
1250 1255 1260
Asp Ser	Trp Mec Pro Ser Leu	Ser Leu Ser Gln Lau	Ser Gln Ser Gln
1255	1270	1275	1230
Glu Glu	Ala Glu Ala Lau Trp 1235	Ala Cln Lau Arg Ala 1290	Ala His Met Ile 1255
Thr Clu	Asp Gly Lys Val Cys 1300	Ala Lau Ser Gly Lys 1305	Arg Gly Thr Ser 1310
His Gln	Asn Lau Thr Ile Gln 1315	Leu Ile Ser Lau Lau 1320	Ala ser Ile Pro 1325
Arg Leu	Pro Pro His Val Leu	Gly Ile Thr Thr Asp	Arg Tyr Asp Ser
1330 1335 1340

A_sp Pro Gln Gln Cln His Gln Gln Thr Val Ser ?he Ser Asp Gly Ph^e

186 242

127

Li45	1350	1355	.190
Gly Arg	Leu Leu Gln Ser Ser Ala	Arg His Clu Ser	Gly -Asp Ali Trp
	1365	1370	13~5
Gln Arg	Lys Glu Asp Gly Gly Leu	Val Val Asp Ala	Asn Gly Val Leu
	1330	1385	1390
'.al Ser	Ala Pro Thr Asp Thr Arg	Trp Ale ’Val Ser	Gly Arg Thr Siu
	1395 1400	1405
Tyr Asp	Asp Lys Cly Gln Pro Val	Arg Thr Tyr Gln	Pro Tyr Phe Leu
1410 1415	1420
Asn Asp	Trp Arg Tyr Val Ser top	Asp Ser Ala Arg	Asp Asp Leu Pha
1425	1430	1435	1440
Ala Asp	Thr His Leu Tyr Asp Pro	Leu Gly Arg Glu	Tyr Lys Vai ile
	1445	1450	1455
Thr Ala	Lys Lys Tyr Leu Arg Glu	Lys Leu Tyr Thr	Pro Trp Phe Ile
	1460	146S	1470
Val Ser	Glu Asp Glu Asn Asp Thr	Ala Ser Arg Thr	Pro
	1475 1430	1485

( 2) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 33;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 3288 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy ( C ) RodZaj nici: podwójna (d) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (xi) Cpńs sekwencji: SEK NR Di: 33;

ATG Met 1

GTG Val

ACT GTT

ATG Mac 5

CAA AAT AAA ATA TCA TTT TTA TCA GGT ACA

TCC Ser

48

Thr

Val

Gln

ton

Lys

Ile

Ser 10

Phe

Leu

Ser

Gly

Thr 15

CAA

CAG

CCC

CTG

CTT

GAC

GCC

GGT

TAT

CAA

AAC

GTA

TTT

GAT

ATC

GCA

96

Glu

Gln

Pro

Leu 20

Leu

Asp

Aia

Gly

Tyr 25

Gln

Asn

Val

Phe

Asp 30

Ile

Ala

TCA

ATC

AGC

CGG

GCT

ACT

TTC

OTT

CAA

TCC

GTT

CCC

ACC

CTG

ccc

GTT

144

Ser

Ile

Ser 35

Arg

Ala

Thr

Phe

Val 40

Gln

Ser

Val

Pro

Thr 45

Leu

Pro

Val

AAA

GAG

GCT

CAT

ACC

CTC

TAT

CGT

CAG

GCG

CGG

CAA

CGT

GCG

CAA

AAT

132

Lys

Glu 50

Ala

His

Thr

Val

Tyr 55

Arg

Glń

Ala

Arg

Gln 80

Arg

Ala

Glu

Asn

CTC

AAA

TCC

CTC

TAC

CGA

GCC

TGG

CAA

TTG

CGT

CAG

GAG

GTT

ATT

240

Leu 65

Lys

Ser

LSu

Tyr

Arg 70

Ala

Trp

Gln

Leu

Arg 75

Gln

Glu

Pro

Val

Ile 30

AAA

GGG

CTG

GCT

AAA

CTT

AAC

CTA

CAA

TCC

AAC

GTT

TCT

CTG

CTT

CAA

238

Lys

Gly

Leu

Ala

Lys 35

Leu

Asn

Leu

Gln

Ser 90

Asn

Val

Ser

Val

Leu 95

Cln

/-· » GA.

CTW 1

TTG

GTA

GAG

AAT

ATT

CCC

GGT

GAT

GGG

GAT

TTC

AGC

1

TTA

334

-Asp

Ala

Lau

Val

Glu

Asn

Ile

Cly

Gly

Asp

Gly

Asp

Phe

Ser

Asp

Leu

128

186 242

100

105

110

rec

CCC

CGT

TCT

CAA

TTT

z*.—··» Wl'* ·

GaC

GC 1

1 a

ATT

CAA

TCC

ctt

384

e.ec

CTn

Cpg

Ala

Sep

Gin

Tsr

Ala

Ctp

Ala

Ala

Stp

Ile

Cun

Str

Lau

115

120

125

tct

TCC

k_

Łajk.

_ -1 4

ctt i Λ 1

GCT

TCC

gcC

CTC

TAC

TGT

GTT

WM λ

TAC

a

432

ree

Sep

rro

r* g · Gls

Crg

Tsp

Cla

Stp

Tla

Lau

h/p

Arg

Val

Aid

L/t

Ctp

130

135

140

CTC

ctT Α.Λ 1

crc

TCC

CCT

TCC

CCT

TTG

CAT

ATT

GTT

TAT

CGC

GC*

Giy -.n-

430

Leu

Hit

Lst

Sap

Ctp

Stp

Sep

Stu

Hst

Ile

CTp

ATn

Trg

Crg

Ala

ATp

145

150

155

160

C*TG — * J

ACC

CTT

CTG

TTC

TTA

TGC

CCC

TCC

TCC

CTC

TAT

CAA

GCC

CTC

ACT

523

LSU

Lst

CTp

Lau

Ile

lau

Sep

Clu

eer

cep

Mec

CTn

L/T

Glu

Val

Tlig

165

170

175

TCC

CTT

CCT

CTC

TTC

TTC

CCT

GTC

CTA

CAC

ACC

GGC

CGT

AAA

GAT

ccc

576

Sar

Leu

Trp

Il·

Ltu

Lau

Ctp

Val

Stu

Gln

LyT

Gly

Cly

L/t

Atp

Ila

tao

185

190

CCT

gaG

CTG

TCC

GCC

GCC

TTC

TTC

CCA

ATG

ACG

TTC

CCT

TAT

GCC

GAT

624

Ter

Clu

Leu

Sep

Gls

Tla

ree

rtie

rro

etc

cep

Lau

rro

T/r

ATp

Trp

195

200

205

CTT

CTC

TCG

CCA

CTC

CAT

TCC

GCT

TTA

TCC

GCC

CCA

GCC

CGA

CCG

CTG

672

Hst

Leu

StP

Gln

Ila

Ctp

Stp

Tla

Lau

Stp

Ala

Gln

Ala

Agg

yer

Lau

210

215

220

TAC

CCT

CTC

TCG

CAT

CCT

TTC

CCC

CAT

ACC

TCG

GCA

CCA

CCC

CTT

TCA

720

CTn

cly

Val

Trp

CTn

yer

Lau

eep

CTp

cer

Tep

Ala

Gln

aIi

Val

Stp

225

230

235

240

CCA

CCA

CCC

ACT

ACT

CCC

CCT

CCC

CGC

AAA

CTG

TTC

CCT

CCC

CAA

GCT

7 68

Clu

Cln

yep

Ser

CTn

yep

CTn

Tbp

Arg

L/t

Lau

ret

Tla

Ala

Gln

crp

245

250

255

GGT

CAT

CCC

CCT

CCA

TTT

TTT

TCC

GCA

TAC

ACT

TTT

TCT

TTC

AAA

GCC

816

Gl/

CTn

cln

Trp

Tep

ret

rń®

Sep

Cly

CTn

eer

ree

Tyr

ree

L/T

Cla

260

265

270

GTC

GCA

TTC

CGC

GCC

CCC

CCT

ATG

GTT

ccc

CTG

TCA

CAG

TAC

ACC

CGC

364

'.'al

Cl-s

ree

Sep

Gls

Cln

rro

Mec

Val

T/r

Lau

Ser

Gin

Tyr

eer

Stp

275

280

285

GCG

CCC

CCC

CTT

CTC

GGC

CCA

CCC

TTC

ccc

CCA

CCT

TAT

CCA

CAC

CCA

912

Gls

CTn

Gly

Ile

Val

Cly

Cla

Cln

Lau

Ile

Tla

Gly

CTn

rro

TTp

Gin

290

295

300

CCC

GCC

GCC

GCC

CTA

CTC

CCA

CCC

TTC

TAA

CTC

ACT

TCC

TCA

CTC

GCC

960

Cla

Cla

Cla

Cla

Ile

Val

Cla

rro

Lau

L/T

Ltu

eer

ypp

Sar

Mec

Cla

305

310

315

320

.AAA

CCG

TCT

TCC

TAC

CPC

GTC

GCT

ccc

CCT

CGT

CCA

CCC

CTG

GGA

GAC

1008

L/t

Cln

C/t

Tsp

Tsp

Lau

Val

Tla

rro

atp

Cly

Ter

eer

Mac

cly

Trp

325

330

335

GCT

ATT

GTT

CTC

CCC

CCC

TGT

TTC

TTA

TCA

CGC

CAC

TGC

CCA

TCT

AAC

1056

Gls

CTn

Val

stu

yep

Gls

cyt

ree

Lau

Trg

Gls

ATn

Sep

rro

Ter

rrn

340

345

350

MM W

CCT

CCA

CCC

UkJ *

CTT

eee

CCT

CTC

CTT

CCC

TAC

CCA

TCA

Ctgc.

ACT

1104

rro

CTp

Lst

CTp

Gls

Ile

ret

CU

Gln

Val

Ala

CTn

L/T

Ser

cly

SaP

355 360 365

186 242

129

ACT

CAG

CCT

TTG

CCA

AGC

TTC

CAT

CTG

CCG

GTC

ACA

CTG

GAA

CAC

AGC

1152

Ahr

Tin 370

Pro

'L«u

Pro

Ser

Phe 375

His

Leu

Pro

Val

Thr 380

Leu

Glu

His

Ser

GAG

AAT

AAA

GAT

CAG

TAC

TAT

CTG

AAA

ACA

GAG

CAG

GTT

TAT

ATC

ACG

1200

Glu 385

Asn

Lys

Asp

Gln

Tyr 390

Tyr

Leu

Lys

Thr

Glu 395

dn

Gly

Tyr

Ile

Thr 400

GTA

GAT

AGT

TCC

Ga-

CAG

TCA

AAT

TGG

AAA

AAC

GCG

C^

CTT

ATC

AAT

1248

Val

Asp

Ser

Ser

dy 405

dn

Ser

Asn

Trp

Lys 410

Asn

Ala

Leu

Val

.He 415

Asn

GG3

ACA

AAA

GAC

AAG

GGG

CTG

TTA

TTA.

ACC

TTT

TCC

AGC

GAT

AGC

TCA

1296

Gly

Thr

Lys

Asp 420

Lys

dy

Leu

Leu

Leu 425

Thr

Phe

Cys

Ser

tep 430

Ser

Ser

GGC

ACT

CCG

ACA

AAC

CCT

CAT

GAT

GTG

ATT

cct

CCC

GCT

ATC

AAT

GAT

1344

Gly

Thr·

Pro 435

Thr

Asn

Pro

Asp

Asp 440

Val

Ile

Pro

Pro

Ala 445

Ile

Asn

Asp

ATT

CCA

TCG

CCG

CCA

GCC

CGC

GAA

ACA

CTG

TCA

CTG

ACG

CCG

GTC

AGT

1392

Ile

Pro 450

Ser

Pro

Pro

Ala

Arg 455

Glu

Thr

Leu

Ser

Leu 460

Thr

Pro

Val

Ser

TAT

CAA

TTG

ATG

ACC

AAT

CCG

GCA

CCG

ACA

GAA

GAT

GAT

ATT

ACC

AAC

1440

Tyr 465

Gln

Lea

Thr

Asn 470

Pro

Ala

Pro

Thr

Glu 475

Asp

Asp

Ile

Thr

Asn 480

CAT

TAT

GGT

TTT

AAC

GCC

<3ct

AGC

TTA

CGG

GCT

TCT

CCA

TTG

TCA

ACC

1488

His

Tyr

dy

Phe

ten 485

Gly

Ala

Ser

Leu

Arg 490

Ala

Ser

Pro

Leu

Ser 495

Thr

AGC

GAG

TTG

ACC

ACC

AAA

CTG

AAT

TCT

ATC

GAT

ACT

TTC

TCT

GAG

AAG

1535

Ser

Glu

Leu

Thr 500

Ser

Lys

Asn

Ser 505

Ile

Asp

Thr

Phe

Cys 510

Glu

Lys

ACC

CGG

TTA

AGC

TTC

AAT

CAG

TTA

ATG

GAT

TTG

ACC

GCT

CAG

CAA

TCT

1584

Thr

Arg

Leu 515

Ser

Phe

ten

Gln

Leu 520

Met

Asp

Leu

Thr

Ala 525

Gln

dn

Ser

TAC

AGT

CAA

AGC

AGC

ATT

GAT

GCG

AAA

GCA

GCC

AGC

CGC

TAT

GTT

CGT

1632

Tyr

Ser 530

Gln

Ser

Ser

Ile

tep 535

Ala

Lys

Ala

Ala

Ser 540

Arg

Tyr

Val

Arg

TTT

GGG

GAA

ACC

ACC

CCA

ACC

CGC

GTC

AAT

GTC

TAC

GGT

GCC

GCT

TAT

1680

Phe 545

Gly

Glu

Thr Thr

Pro 550

Thr

Arg

Val

ten

Val 555

Tyr

dy

Ala

Ala

Tyr 560

CTG

AAC

AGC

ACA

CTG

GCA

GAC

GCG

GCT

GAT

GGT

CAA

TAT

CTG

TGG

ATT

1728

Leu

Asn

Ser

Thr

Leu 565

Ala

Asp

Ala

Ala

tep 570

Gly

dn

Tyr

Leu

Trp 575

Ile

CAG

ACT

GAT

GGC

AAG

AGC

CTA

AAT

TTC

ACT

GAC

GAT

ACG

GTA

GTC

GCC

1776

Gln

Thr

Asp

Gly 580

Lys

Ser

Leu

Asn

Phe 585

Thr

Asp

Asp

Thr

Tal 590

Val

Ala

TTA

GCC

GCT

CGC

GCT

GAA

AAG

CTG

GTA

CGT

TTA

TCA

TCC

CAG

ACC

GGG

1824

Leu

Ala

dy 595

Arg

Ala

Glu

Lys

Leu 600

Val

Arg

Leu

ser

Ser 505

Gln

Thr

dy

CTA

TCA

TTT

GAA

GAA

TTG

GAC

TGG

CTG

ATT

GCC

AAT

GCC

AGT

CGT

AGT

1872

Leu

Ser □ 10

Phe

Glu

Glu

Leu

Asp 615

Trp

Leu

Iie

Ala

ten 620

Ala

Ser

Arq

Ser

GTG

CCG

GAC

CAC

CAC

GAC

AAA

ATT

GTG

CTG

GAT

AAC

CCG

GTC

CTT

GAA

1920

Val

Pro

Asp

His

HIS

tep

Lys

Ile

Val

Leu

Asp

Lys

Pro

Val

Leu

Glu

130

186 242

625					630
TCA	C .	CCA	CAG	TAT	TTC	AGC	CTA	AAA
Ala	Leu	aia	Glu	Tyr 645	VAl	Ser	Leu	Lys
AA?	ACC	Τ'Τ'Τ*	CCG	ACC	TTC	ATT	ACT	CCA
Asn	Thr	Phe	Aid 660	Thr	Phe	Ile	Ser	Ala 665
CAT	Ac A		ACT	TTC	TAT	CAA	ACC	CCT
Gln	Thr	Pro 575	5er	Phe	r/r	Glu	Thr 680	AlA
CAT	CTC	ATT	GCC	CTA	GGT	ACA	GAC	CTC
His	•Mi 690	Ile	Ala	Leu	Gly	Thr 695	Glu	VAl
CAT	GAG	TTA	GCC	CCC	ATA	TCC	TCC	AAA
Asp 70S	Glu	Leu	Ala	Ala	Ile 710	Cys	cys	Lys
CAA	CTG	CTC	CCT	ATT	GCT	CCC	TAT	TCC
Olu	Leu	Leu	Arg	I la 72S	Gly	Arg	Tyr	cys
ACC	TTC	CAT	CAA	TAT	ACC	GCC	ACT	CAC
Thr	Leu	Asp	Glu 740	Tyr	Thr	Ala	Ser	Gln 745
CCC	CCT	TTG	TTT	CGC	CTC	ACA	TTT	GCC
Pro	Arg	Leu 755	Phe	Cly	Leu	Thr	Phe 760	Ala
CTC	ATG	GAA	TCC	CCA	AAA	CAT	ATC	TTA
Leu	Mac 770	Glu	cly	Gly	Lys	Asp 775	Ile	Leu
AAA	TCC	CTT	CAA	CCA	CTG	GCT	ATT	TTA
L/C 785	Ser	Lau	Cln	Pro	Leu 790	Ala	Ile	Leu
CAT	TGG	ATC	TCC	TCC	CTA	AAT	CTA	ACT
Asp	Trp	Met	Ser	Ser 305	Val	Asn	Leu	Ser
GTA	ACT	ACC	CAA	TCC	AGC	GCT	ACC	GCC
Val	Ser	Thr	Gln 820	Trp	5er	Gly	Thr	Ala 825
TTC	GAA	AAC'TGTT	TCT	GAC	AGC	CTC	AAT
Leu	Clu	Asn 835	Val	Cys	Asp	Ser	Val 840	Asn
ACA	ATC	GAT	TCC	GCC	TTA	CAG	CAG	AAA
Thr	Met 850	Asp	Ser	Ala	Leu	Cln 855	Cln	Lys
TGT	TTC	GGC	ATT	AAC	AGC	AAT	CTG	ATC
Gly 365	Phe	Gly	Ile	Lys	Ser 370	Asn	Val	Met
GAG	AAA	ATC	ACA	ATC	GGT	ACT	GAT	AAT
Clu	Lys	Ile	Thr	Ile 885	Gly	Ser	Asp	Asn

635 640

CAG cln 650	Arg	TAT Tyr	Kg Tly	Leu	TAT Asd 655	TCC Ala
CTA	AAT	CCT	TAT	ACG	CCA	GAT	2012
Val	Asn	Pro	Tyr	Thr 670	Pro	Asp
TTC	CCC	TCT		GAC	TGT	AAT	2064
Phe	Arg	ser	Ala 685	Asp	Gly	Asn
AAA	TAT	GCA	CAA	AAT	GAG	CAG	2112
Lys	Tyr	Ala 700	Glu	Asn	Glu	Gln
GCA	TTC	GCT	GTC	ACC	ACT	TAT	2160
Ala	Leu 715	Gly	VAl	Thr	Ser	Asp 720
TTC	CCT	AAT	GCA	CGC	ACT	TTT	2208
Phe 730	cly	Asn	Ala	Gly	Ser 735	Phe
TTC	TAT	CGC	TTC	GGC	CCC	ATT	2256
Leu	Tyr	Arg	Phe	Gly 750	Ala	Ile
CAA	GCC	GAA	ATT	TTA	TCG	CCT	2304
Gln	Ala	Glu	Ile 765	Leu	Trp	Arg
TTC	CAA	CAG	TTA	GCT	CAG	TCA	2352
Leu	Gln	Gln 780	Leu	Gly	Gln	AlA
CCC	CGT	ACC	CAG	CAG	CTG	CTG	2400
Arg	Arg 795	Thr	Glu	Gln	val	Leu 300
CTG	ACT	TAT	CTC	CAA	GGC	ATG	2443
Leu 810	Thr	Tyr	Leu	Gln	cly Met 815
ACC	CCT	GAC	ATC	TTC	AAT	TTC	2496
Thr	Ala	clu	Met	Phe 830	Asn	Phe
AGT	CAA	GCT	GCC	ACT	AAA	GAA	2544
Ser	Gln	Ala	AlA 845	Thr	Lys	Glu
ctc	CTC	CCC	GCC	CTA	ACC	CCC	2592
Val	Leu	Arg 860	Ala	Leu	Ser	Ala
CGT	ATC	GTC	ACC	TTC	TCG	CTC	2640
Gly	Ile 875	Val	Thr	Phe	Trp	Leu 980
CCT	TTT	ACA	TTC	CCA	AAC	TAC	26aa
Pro 890	Phe	Thr	Leu	Ala	Asn 395	Tyr

186 242

131

TGG Trp

.Cis

Asp

ATi 9 0 0

C ln

AC c Thr

CTG Leu

tTt Phe

AurV- 5er 905

CAT His

GAC Asp

AAT Asn

Ala

ACG Thr 910

ttA Leu

CAG JA U

zzz

TTA

CAA

ACC

GAC

ACT

TCT

CTG

GTA

ATT

GCT

ACT

CAG

CAA

ctt

AGC

2784

Ser

Leu

Gln

Thr

Asp

Thr

5er

Leu

Val

Ile

Ala

Thr

Gin

Gln

Lau

Ser

915

920

925

CAG

CTA

CTG

TTA

ATT

GTC

AAA

TCG

CTG

AGC

CTG

ACC

GAG

CAG

gAT

CTG

2732

Gln

Leu

Val

Leu

Ile

Val

Lys

Trp

Leu

Ser

Leu

Thr

Glu

Gln

Asp

Lau

930

935

940

CAA

TTA

CTG

ACA

ACC

TAT

ccc

GAA

CCT

TTA

ATC

AAC

GGC

ATC

ACG

AAT

2880

Gln

Leu

Leu

Thr

Thr

Tyr

Pro

Glu

Arg

Lau

Ile

Asn

Gly

Ile

Thr

Asn

945

950

955

960

GTT

GCT

GTA

CCC

AAT

CCG

GAG

CTA

TTA

CTC

ACG

CTA

TCA

CGT

AAG

2928

Val

Pro

Val

Pro

Asn

Pro

Glu

Lau

Leu

Leu

Thr

Lau

Ser

Arg

Phe

Lys

965

970

975

CAG

TCG

GAA

ACT

CAA

GTC

ACC

GTT

TCC

CCT

GAT

GAA

GCG

ATG

CGC

TCT

2976

Gin

Trp

Glu

Thr

Gin

Val

Thr

VaL

Ser

Arg

Asp

Glu

Ala

Mac

Arg

cys

980

985

990

rcr

GAT

CAA

TTA

AAT

GCC

AAT

GAT

ATG

ACG

ACT

GAA

AAT

GCA

GGT

TCA

3024

Phe

Asp

Gln

Leu

Asn

Ala

Asn

Asp

Mec

Thr

Thr

Glu

Asn

Ala

Gly

Ser

995

1000

1005

CTG

ATC

GCC

ACA

TTG

TAT

GAG

ATG

GAT

AAA

GGT

ACC

GCA

GCG

CAA

GTT

3072

Leu

Ile

Ala

Thr

Leu

Tyr

Glu

Mec

Asp

Lys

Gly

Thr

Gly

Ala

Gln

Val

1010

1015

1020

AAT

ACC

TTG

CTA

TTA

GGT

GAA

AAT

AAC

TGG

CCC

AAA

AGT

TTT

ACC

TCT

3120

Asn

Thr

Leu

Lau

Leu

Gly

Glu

Asn

Asn

Trp

Pro

Lys

Ser

Phe

Thr

Ser

1025

1030

1035

1040

CTC

TCC

CAA

CTT

CTG

ACC

TGG

TTA

CGC

GTC

GK

CAA

AGA

CTG

AAT

GTC

3168

Leu

Trp

Gin

Lau

Leu

Thr

Trp

Lau

Arg

Val

Gly

Gln

Arg

Leu

Asn

Val

1045

1050

1055

GGT

ACT

ACC

ACT

CTG

GGC

AAT

CTG

TTG

TCC

ATG

ATG

CAA

GCA

GAC

CCT

3216

Gly

Ser

Thr

Thr

Leu

Gly

Asn

Lau

Leu

Ser

Mec

Mac

Gln

Ala

Asp

pro

1060

1065

1070

GCT

GCC

GAG

ACT

AGC

GCT

TTA

TTG

GCA

TCA

GTA

CCC

CAA

AAC

TTA

ACT

3264

Ala

Ala

Glu

Ser

Ser

Ala

Leu

Lau

Ala

Ser

Val

Ala

Gln

Asn

Leu

ser

1075

1080

1085

GCC

GCA

ATC

AGC

AAT

CCT

CAG

TAA

3285

Ala

Ala

Ile

Ser

Asn

Arg

Gln

. · ·

1090 1095 ( 2) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 34;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1095 amυ]mekkasók (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: llmioka (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Cechy od

254

254

SEK NR ID. 34; do opis

267 SEK NR ID' 15

492 TctA A pepeyd

132

186 242

Met 1

Va l

Thr

Val

Met

Gln

Asn

Lys

Ile

□er 10

Phe

Lau

Ser

Cly

Thr 15

Ser

Glu

Gln

Prą

Lau 20

Leu

Asp

.Ala

Gly

Tyr 25

Gln

Asn

Val

Phe

Asp 20

Ile

Ala

Sar

Ile

Ser 35

Arg

Ala

Thr

Phe

Val 40

Gln

Ser

Val

Pro

Thr 45

Lau

Pro

Val

Lys

Glu 50

Ala

His

Thr

Val

Tyr 55

Arg

Gln

Ala

Arg

Gin 60

Arg

Ala

Glu

Asn

Leu 65

Lys

Sar

Leu

Tyr

Arg 70

Ala

Trp

Gln

Leu

Arg 75

Gln

Clu

Pro

Val

Ile 30

Lys

Gly

Leu

Ala

Lys 35

Leu

Asn

Leu

Gln

Ser 90

Asn

Val

Ser

Val

Leu 95

Gln

Asp

Ala

Leu

val 100

Glu

Asn

Ile

Cly

Gly 105

Asp

Gly

Asp

Phe

Ser 110

Asp

Leu

Mac

Asn

Arg 115

Ala

Ser

Gln

Tyr

Ala 120

Asp

Ala

Ala

Ser

Ile 125

Gln

Ser

Leu

Phe

Ser 130

Pro

Gly

Arg

Tyr

Ala 135

Ser

Ala

Lau

Tyr

Arg 140

Val

Ala

Lys

Asp

Lau 145

His

Lys

Ser

Asp

Ser 150

Ser

Leu

His

Ile

Asp 155

Asn

Arg

Arg

Ala

Asp 160

Leu

Lys

A3P

Leu

Ile 165

Leu

Ser

Glu

Thr

Thr 170

Met

Asn

Lys

Glu

Val 175

Thr

Ser

Lau

Asp

ILe 130

Leu

Leu

Asp

Val

Leu 135

Gln

Lys

Gly

Gly

Lys Asp 190

Ile

Thr

Glu

Leu 195

Ser

Cly

Ala

Phe

Phe 200

Pro

Mac

Thr

Leu

Pro 205

Tyr

Asp

Asp

His

Leu 210

Ser

Gin

Ile

Asp

Ser 215

Ala

Leu

Ser

Ala

Gln 220

Ala

Arg

Thr

Leu

Asn 225

Gly

Val

Trp

Asn

Thr 230

Lau

Thr

Asp

Thr

Thr 235

Ala

Gln

Ala

Val

Ser 240

Glu

Gln

Thr

Ser

Asn 245

Thr

Asn

Thr

Arg

Lys 250

Leu

Phe

Ala

Ala

Gln 255

Asp

Gly

Asn

Gln

Asp 260

Thr

Phe

Phe

Ser

Gly 265

Asn

Thr

Phe

Tyr

Phe 270

Lys

AI*

Val

Gly

Phe 275

Ser

Gly

Cln

Pro

Met 230

val

Tyr

Leu

Ser

Gln 235

Tyr

Thr

Ser

Gly

Asn 290

Gly

Ile

Val

Gly

Ala 295

Gin

Lau

Ile

Ala

Gly 300

Asn

Pro

Asp

Gln

Ala 305

Ala

Ala

Ala

Ile

Val 310

Ala

Pro

Leu

Lys

Leu 315

Thr

Trp

Ser

Met

Ala 320

Lys

Cln

Cys

Tyr

Tyr

Leu

Val

Ala

Pro

Asp

Cly

Thr

Thr

Met

Cly

Asp

Gly Asn Val Leu Thr Cly Cys Phe Leu Arg Gly Asn Ser Pro Thr Asn

325 330 335

186 242

133

340

345

350

Pro

Asp

Lys

Asp

Gly

Ile

?he

Ala

Gln

Val

Ala

Asn

Lys Ser

Gly

Ser

355

360

365

Thr

Tin

Pro

Leu

Pro

Ser

Phe

His

Leu

Pro

Val

Thr

Lau Glu

His

Ser

370

375

330

Glu

Asn

Lys

Asp

Gln

Tyr

Tyr

Leu

Lys

Thr

Glu

Gln

Gly Tyr

Ile

Thr

335

390

395

400

Val

Asp

Ser

Sar

Gly

Gln

Ser

Asn

Trp

Lys

Asn

Ala

Leu Val

Ile

Asn

405

410

415

Gly

Thr

Lys

Asp

Lys

Gly

Leu

Lau

Leu

Thr

Phe

Cys

Ser Asp

Ser

Ser

420

425

430

Gly

Thr

pro

Tnr

Asn

pro

Asp

Asp

Val

ile

pro

pro

Ala Ile

Asn

Asp

435

440

445

Ile

Pro

Ser

Pro

Pro

Ala

Arg

Glu

Thr

Lau

ser

Leu

Thr Pro

Val

Ser

450

455

460

Tyr

Gin

Leu

Mec

Thr

Asn

Pro

Ala

Pro

Thr

Glu

Asp

Asp Ile

Thr

Asn

465

470

475

430

His

Tyr

Gly

Phe

Asn

Gly

Ala

ser

Leu

Arg

Ala

ser

Pro Leu

Ser

Thr

435

490

W4 »

495

Ser

Glu

Leu

Thr

Ser

Lys

Leu

Asn

Ser

Ile

Asp

Thr

Phe Cys

Glu

Lys

500

505

510

Thr

Arg

Leu

Ser

Phe

Asn

GiM

Leu

Mec

Asp

Leu

Thr

Ala Gln

Gln

Ser

515

520

525

Tyr

Ser

Gin

Ser

Ser

Ile

Asp

Ala

Lys

Ala

Ala

Ser

Arg Tyr

Val

Arg

530

535

540

Phe

Gly

Glu

Thr

Thr

Pro

Thr

Arg

Val

Asm

Val

Tyr

Gly Ala

Ala

Tyr

545

550

555

560

Leu

Asn

Ser

Thr

Lau

Ala

Asp

Ala

Ala

Asp

Gly

Gln

Tyr Leu

Trp

Ile

565

570

575

Gin

Thr

Asp

Gly

Lys

Ser

Leu

Asm

Phe

Thr

Asp

Asp

Thr Val

Val

Ala

530

535

590

Leu

Ala

Gly

Arg

Ala

Glu

Lys

Leu

Val

Arg

Leu

Ser

Ser Gln

Thr

Gly

595

600

605

Leu

ser

Phe

Glu

Glu

Leu

Asp

Trp

Leu

Ile

Ala

Asn

Ala Ser

Arg

Ser

610

615

520

Val

Pro

Asp

His

His

Asp

Lys

Ile

Val

Leu

Asp

Lys

Pro val

Leu

Glu

625

630

635

640

Ala

Leu

Ala

Glu

Tyr

Val

Ser

Leu

Lys

Gin

Arg

Tyr

Gly Leu

Asp

Ala

645

650

655

Asm

Thr

Phe

Ala

Thr

Phe

Ile

Ser

Ala

Val

Asm

Pro

Tyr Thr

Pro

Asp

660

665

570

GiM

Thr

Pro

Ser

Phe

Tyr

Glu

Thr

Ala

Phe

Arg

Ser

Ala Asp

Gly

Asn

675

630

63 5

HIS

val

ile

Ala

Leu

Gly

Thr

Glu

val

Lys

Tyr

Ala

Glu as M

Glu

Gln

134

186 242

695

700

Asp 705

Glu

Leu

Ala

Ala

Ile 710

Cys cys

Lys

Ala

Lau 715

Gly

Val

Thr

Ser

Asp 20

Clu

Leu

Leu

Arg

Ile 725

Cly

Arg Tyr

cys

Phe 730

Gly

Asn

Ala

Gly

Ser 735

Phe

Thr

Leu

Asp

Clu 740

Tyr

Thr

Ala Ser

Gln 745

Leu

Tyr

Arg

Phe

Gly 750

Ala

Ile

Pro

Arg

Leu 755

Phe

Cly

Leu

Thr Phe 760

Ala

Cln

Ala

Clu

Ile 765

Leu

Trp

Arg

Leu

Met 770

Clu

Cly

Gly

Lys

Asp Ile 775

Lau

Leu

Cin

Cln 780

Leu

Cly

Gln

Ala

Lys 735

Ser

Lau

Gln

Pro

Lau 790

Ala Ile

Leu

Arg

Ara 795

Thr

Glu

Gln

Val

Leu 800

Asp

Trp

Met

3er

Ser 305

Val

Asn Lau

Ser

Lau 810

Thr

Tyr

Leu

Cln

Cly Mbc 815

V a l

Ser

Thr

Gln 820

Trp

Ser

Cly Thr

Ala 825

Thr

Ala

Clu

Met

Phe 830

Asn

Phe

Lau

Clu

Asn 835

Val

cys

Asp

Ser Val 840

Asn

Ser

Cln

Ala

Ala 845

Thr

Lys

Glu

Thr

Mac 850

Asp

Ser

Ala

Lau

Gln Gln 855

Lys

Val

Leu

Arg 860

Ala

Leu

Ser

Ala

Cly 8 65

Phe

Gly

Ile

Lys

Ser 870

Asn Val

Met

Cly

Ile 875

Val

Thr

Phe

Trp

Leu 380

Glu

Lys

Ile

Thr

Ile 885

Gly

Ser Asp

Asn

Pro 890

Phe

Thr

Lau

Ala

Asn 895

Tyr

Trp

His

ASP

Ile 900

Gln

Thr

Lau Phe

Ser 905

His

Asp

Asn

Ala

Thr 910

Lau

Clu

Ser

Leu

Gln 915

Thr

Asp

Thr

Ser Lau 920

Val

Ile

Ala

Thr

Gln 925

Cln

Lau

Ser

Gln

Lau 930

Val

Lau

Ile

Val

Lys Trp 935

Leu

Ser

Leu

Thr 940

Glu

Gln

Asp

Lau

Gln 945

Lau

Leu

Thr

Thr

Tyr 950

Pro Glu

Arg

Lau

Ile 955

Asn

Cly

Ila

Thr

Asn 960

Val

Pro

Val

Pro

Asn 965

Pro

Glu Lau

Leu

Lau 970

Thr

Leu

Ser

Arg

Phe 975

Lys

Gln

Trp

Glu

Thr 980

Cln

Val

Thr Val

Ser 985

Arg

Asp

Clu

Ala

Met 990

Arg

cys

Phe

Asp

Cln 995

Lau

Asn

Ala

Asn Asp Met 1000

Thr

Thr

Clu

Asn Ala 1005

Gly

Ser

Leu

Ile Ala 1010

Thr

Leu

Tyr

Glu Mac 1015

Asp

Lys

Gly

Thr Cly 1020

Ala

Gln

Val

Asn

Thr

Leu

Lau

Leu

Gly

Clu Asn

Asn

Trp

Pro

Lys

Ser

Phe

Thr

Ser

1025

1030

1035

1040

Leu Trp Gln Lau Leu Thr Trp Leu Arg Val Gly Gln Arg Leu .Asn Val

135

186 242

10-15 1050 1055

	Ser	Thr	Thr Leu Gly Asn Leu Leu Ser Mac	Met	Sin Ala Asp Pro 10~0
1060	1065
Ala	Ala	Glu	Ser Ser	Ala Leu Leu Ala Ser Val	Aia	GLn Asn Leu Ser
		1075		1030		1085
aJ.S	Ala	Ile	Ser Asn	Arg cln --·
	1090			1095

(2) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 35;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 603 aminokwasy ( B ) Typ: aminokwas ( D ) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 35;

Pro 1

Lau

Ser

Thr

Ser 5

Glu

Lau

Thr

Ser

Lys 10

Leu

Asn

Ser

Ile

Asp 15

Thr

Phe

cys

Clu

Lys 20

Thr

Arg

Leu

Ser

Phe 25

Asn

Gin

Lau

Mac

Asp 30

Leu

Thr

Ala

Gln

Gln 35

Ser

Tyr

Ser

Gln

Sar 40

Ser

Ile

Asp

Ala

Lys 45

Ala

Ala

Ser

Arg

Tyr 50

Val

Arg

Ph·

Gly

Glu 55

Thr

Thr

Pro

Thr

Arg 60

Val

Asn

Val

Tyr

Cly 65

Ala

Ala

Tyr

Lau

Asn 70

Ser

Thr

Leu

Ala

Asp 75

Ala

Ala

Asp

Gly

Tln 30

Tyr

Leu

Trp

Ile

Gin 85

Thr

top

Gly

Lys

Ser 90

Leu

Asn

Phe

Thr

Asp 95

Asp

Thr

VAl

VAl

Ala 100

Lau

Ala

Gly

Arg

Ala 105

Glu

Lys

Lau

Val

Arg 110

Lau

Ser

Ser

Gln

Thr 115

Cly

Leu

Ser

Phe

Clu 120

Clu

Lau

Asp

Trp

Leu 125

Hle

Ala

Asn

Ala

Ser 130

Arg

Ser

Val

Pro

Asp 13 5

His

His

Asp

Lys

Ile 140

Val

Lau

Asp

Lys

Pro 145

Val

Leu

Clu

Ala

Leu 150

AlA

Glu

Tyr

Val

Ser 155

Leu

Lys

Gin

Arg

ryr i 10

Gly

Leu

Asp

Ala

Asn 165

Thr

Phe

Ala

Thr

Phe 170

Ile

Ser

Ala

Val

Asn 175

Pro

Tyr

Thr

Pro

Asp 180

Gln

Thr

Pro

Ser

Phe 135

Tyr

Glu

Thr

Α1Λ

Phe 190

Arg

Ser

Ala

Asp

Gly 195

Asn

His

Val

Ile

Ala 200

Leu

Tly

Thr

Glu

Val 205

Lys

Tyr

AiS

Clu

Asn 210

Glu

cln

Asp

Glu

Lau 215

Ala

Ala

Ile

Cys

Cys 220

Lys

Ala

Leu

cly

136

186 242

Val 225

Thr

Ser

Asp

Glu

Leu 330

Leu

Arg

Ile

Gly

Arg 235

Tyr

Cys

Phe

Cly

Asn 240

Ala

Gly

Arg

Phe

Thr 245

Leu

Asp

Clu

Tyr

Thr 250

Ala

Ser

Gln

Leu

Tyr 255

Arg

Phe

Gly

Ala

Ile 250

Pro

Arg

Leu

Phe

Gly 265

Leu

Thr

Phe

Ala

Gln 270

Alid

Clu

Ile X J-δ

uću

Trp 275

Arg

Leu

Met

Glu

Gly 230

Gly

Lys

Asp

Ile

Leu 235

Leu

Gln

Cln

XXX

Gly 290

Gln

Ala

Lys

Ser

Leu 295

Gln

Pro

Leu

Ala

Ile 300

Leu

Arg

Arg

Thr

Glu 305

Gln

Val

Leu

Asp

Trp 310

Met

Ser

Pro

Val

Asn 315

Leu

Ser

Leu

Thr

Tyr 320

Leu

Gln

Gly

Met

Val 325

Ser

Thr

Gln

Trp

Ser 330

Gly

Thr

Ala

Thr

Ala 335

Clu

Mec

Phe

Asn

Phe 340

Leu

Glu

Asn

Val

Cys 345

Asp

Ser

Val

Asn

Ser 350

Gln

Ala

Xxx

Thr

Lys 355

Glu

Thr

Met

Asp

ser 360

Ala

Leu

Gln

Gln

Lys 365

Val

Leu

Arg

Ala

Leu 370

Ser

Ala

Gly

Phe

Gly 375

Ile

Lys

Ser

Asn

Val 330

Met

Gly

Ile

Val

Thr 335

Phe

Trp

Leu

Glu

Lys 390

Ile

Thr

Ile

Gly

Aro 395

Asp

Asn

Pro

Phe

Thr 400

Leu

Ala

Asn

Tyr

Trp 405

His

Asp

Ile

Gln

Thr 410

Leu

Phe

Ser

His

Asp 415

Asn

Ala

Thr

Leu

Glu 420

Ser

Leu

Gln

Thr

Asp 425

Thr

ser

Leu

Val

Ile 430

Ala

Thr

Cln

Gln

Leu 435

ser

Gln

Leu

Val

Leu 440

Ile

Val

Lys

Trp

Val 445

Ser

Leu

Thr

Clu

Cln 450

Asp

Leu

Gln

Leu

Leu 455

Thr

Thr

Tyr

Pro

Glu 460

Arg

Leu

Ile

Asn

Gly 465

Ile

Thr

Asn

Val

Pro 470

Val

Pro

Asn

Pro

Glu 475

Leu

Leu

Leu

Thr

Leu 430

Ser

Arg

Phe

Lys

Gln 4B5

Trp

Glu

Thr

Gln

Val 490

Thr

val

Ser

Arg

Asp 495

Glu

Ala

Met

Arg

Cys 500

Phe

Asp

Cln

Leu

Asn 505

Ala

Asn

Asp

Met

Thr 510

Thr

Glu

Asn

Ala

Gly 515

Ser

Leu

Ile

Ala

Thr 520

Lau

Tyr

Glu

Met

Asp 525

Lys

Cly

Thr

Gly

Ala 530

Gln

Val

Asn

Thr

Leu 535

Leu

Leu

Gly

Clu

Asn 540

Asn

Trp

Pro

Lys

Ser 545

Phe

Thr

Ser

Leu

Trp 550

Gln

Leu

Leu

Thr

Trp 555

Leu

Arg

Val

Cly

Gln 560

Arg

Leu

Asn

Val

Gly 565

Ser

Thr

Thr

Leu

Gly 570

Asn

Leu

Leu

Ser

Met 575

Met

186 242

137

Gln	Ala	Asp	Pro Aii Ala Glu 3er	Sse	Ala Leu	Leu Ala 5-er Val Aia
			580	558		590
Gln	Asn	Leu	Ser Ala Ala I le Ser	Asn	Arg Gln	*
		595	600
(2)	Dane	dla sekwencji SEK NR ID: 36;

(i) Charakterystyka sekwencji (A) Długość: 2557 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA ( genomowy ) (xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 36;

GASTTCGTCT TTCGTTTAAT ATTGATCATG TCTCGCTCTT CCGCCTGCTT sAAATTACCG SCCATTSTAS TAAATA.TGTS SSSATTAASS ATAACCTSAS GASTCTTTCC SATTTSTSTA TTCGAAAATT SCTGGCSGAT ATTCATCAAT TAACCATTCA TGSSCTGGST TTATTACTGA TTGCCGTAGG TTASTTSSSS ACTAATTTST CCTCTATCAT TTATAAGCAA TTCCCTACCC TGATCASGASA ACTCASTACT ASTTCCAOCT GTCTSCATAC ACAGSATTGT SGTGTATTCC AGCTATTTAT catgacctcc accagctata acaaaacgct aacgcctcaa sttastastt TGCTGTATAC CGTCTACCAC GGTTTACAAC GTTTTGATAA AGACAAAGCA GATTTGCTAC ATGTCATGGC GCCCTATATT GCGGCCACCT TCCAATTATC ATCGGAAAAT GTCGCCCACT CGGTACTCCT TTGGGCAGAT AAGTTACAGC CCGGCGACGG CGCSATTACS CCAGAGGGAN TCTGGGACTG GTTGAATACT AAGTATACCC CGGGTTCATC CGAAGCCGTA GAAACiTAGG SSCSTSTCGT TCAGTATTGT CAGGCTCTGG CACAATTGGA AATGCTTTAC CATTCCACCG GCATCSACGA AAACGCCTTC CGTCTATTTG TGACAAAACC AGAGATGTTT GCCGCTCCSA CTGCAGCACC GCCCGCGCAT GATGCCCTTT CSCTGATTST GCTOACACOT TTTClCAGATT GGGTGAACGC ACTAGGCCAA SAAGCGTCCT CGGTGCTAGC GCCATTTGAA GCTAACTCGT TAACGGCAGA acaactggct gatcccatga atcttgatcc taatttgcts ttgcaagcca GTATTCAAGC ACAAAATCAT CAACATCTTC CCCCSGTASC TCCAGAAAAT GCGTTCTCCT GTTGGACATC TATCSATACT STCCTCCAAT GGCTTAATCT CGCACAACAA TTGSAATGTC GCCCCACAGT GCGTTTCCGC TTTGGTCGGG CTTGATTATS TTCAATCAAT TASATAGACA CCGACCTATG CCCAGTCTTS SAACGCGGCS GGCGTATTAA CCOCCCTTTT GASTTCSACA ACAGCCTAAT ACATTACAAC GCTTTTCTGT ATTSATCTCG CAGTOCCGCA TTAAGCACCT ACTATATCCC TCAACTCCCC SAGCCACCGG CGTCTATTAA SACCCSTGAT CACTTCTATC AATACTTACT GATTCSTSAT CATCTTTCTT CGGCAATAAA AACCACCCGT ATCGCCGAAT CCATTGCCSC TSTTCAACTG TACGTCAACC GGGCSTTGTA AAATGTGGAAA GAAASTGCCA ATTCGGGCGT TATCAGCCGC CAATTCTTTA TCGACTGGTA CAAATACAAT AASCGCTACA GCACTTCGGC GGTTGTTTCT CAATTAGTTT ACTSCCCGGA SAACTATATT GATCCGACCA TTCGTATCGT SCSASCCSAS ATCATTGACC CATTACTGCA ATCCGTCAGC CAAAGCCAAT TAAACGCCCA TACCGTCGAA GATGCCTTTA TGTCTTATCT GACATCCTTT GAACAAGTTG CTAATCTTAA STTTSTTAGC GCATATCACG ATAATATTAA TAACGATCAA GGTCTGACCT ATTTTATCCG ACTCSCTGAA ACTCATGCCG GTGAATATTA TTCCCTCAGT CTCCATCACS GTAAATTCAA CGACGGTAAA TTCTCCGCTA ATCCCTSGAG TGAATTGCAT AAAATTGATT GTCCAATTAA CCCTTATAAA ATCACTATCC GTCCAGTTAT ATATAAATCC CGCCTGTATC όΰ

120

130

240

00

360

420

480

540

Ó00

660

720

780

840

900

960

1020

1C80

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1300

1360

138

186 242

((/mg /TUT')1	GGTTCTATAG	G AGTTCTCCT	TTC TGTCTGC	TATTTGTTTA	G -	1320
TTTCTCTAAC	G3TTTTTCCT	TTTCAACTTA	AATTCGCCCA	TTTCCOCTTT	3TTGGCλTTT	1980
GoTATTCCCC	TTTCTCCTTT	GTTCTCATTT	TAATTTTATC	CGTGCTTTTA	((GGττTττA	1640
TTTGAKGCC	C3GACTCTTT	TGTGCCGGTT	TTCTAGCTGT	AGATTCGTTG	CTCGTGTTCT	2100
TTTTTTACCT	TCTAGACTCA	CTAG^TAGTT	TTTTATACGC	TTCTATCCTT	GGTC TAT AT T	2160
TCTTTGCTCT	TTTCGCTTCC	.ATTGATTTCT	CCCCTGAACT	GTGC.ATTGTT	T.aTCcht τ T	2220
TT.TGCTTTCT	TCTATTTGTT	TCCTATTTTC	TCAGArGAUT	GTTTTTCCGC	TTTGCTGTCC	2280
TTTATGTGTT	TCCTTCTTCG	GTTAGTTGCC	GTATTGACTT	TCGTTCCCCT	GATTATTACC	2340
TCACCATGCT	ATATAACGGA	GATATTCCAA	CTATCAATTA	CAAAGCCTCA	TCAAGTGATT	2400
TAAAAATTTA	TATTTCACCA	AAATTAAGAA	TTATTCATAA	TGGATATGAA	GGACTGJAGC	2460
GCAATCAATC	CAATTTGATG	AATAAATATG	GCAAACTAGG	TGATAAATTT	ATTSTGTATA	2520
CCACCCTGGG	CGTTAATCCG	AATAATAAGC	CGAATTC			2550

(2) Dane dla sekwencji SEK NR ED: 37 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość. 845 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii ) Typ cząsteczki: białko ( częściowo ) (X) Opis sekwencji: SEK NR ID: 37;

Aid 1

Phe

Asn

Ile

Asp 5

Asp

Val

Ser

Leu

Phe 10

Arg

Leu

Leu

Lys

Ile 15

Thr

Asp

His

Asp

Asn 20

Lys

Asp

Gly

Lys

Ile 25

Lys

Asn

Asn

Leu

Lys 30

Asn

Leu

Ser

Asn

Leu 35

Tyr

Ile

Gly

Lys

Leu 40

Leu

Ale

Asp

Ile

His 45

Gln

Leu

Thr

Ile

Asp 50

Glu

Leu

Asp

Leu

Leu 55

Leu

Ile

Ala

VAl

Cly 60

Glu

Gly

Lys

Thr

Asn 65

Leu

Sar

Ale

Ile

Ser 70

Asp

Lys

Gln

Leu

AlA 75

Thr

Leu

Ile

Arg

Lys 80

Leu

Asn

Thr

Ile

Thr 85

Ser

Trp

Leu

His

Thr 90

Gln

Lys

Trp

Ser

Val 95

Phe

Gin

L«u

Phe

Ile 100

Met

Thr

Ser

Thr

ser 105

Tyr

Asn

Lys

Thr

Leu 110

Thr

Pro

Tlu

Ile

Lys 115

Asn

Leu

Leu

Asp

Thr 120

VAl

Tyr

His

Gly

Leu 125

Gln

Gly

Phe

Asp

Lys 130

Asp

Lys

Ala

Asp

Leu 135

Leu

His

Val

Met

Ale 140

Pro

Tyr

Ile

Ala

Ala 145

Thr

Leu

Gln

Leu

ser 150

Ser

Glu

Asn

VAl

Ale 155

His

Ser

Vel

Leu

Leu 160

Trp

Ale

Asp

Lys

Leu 165

Gln

Pro

Gly

Asp

Gly 17 0

Ala

Met

Thr

Ala

Glu 175

Gly

Phe

Trp

Asp

Trp

Leu

Asn

Thr

Lys

Tyr

Thr

Pro

Gly

Ser

Ser

Clu

Ala

186 242

139

130

135

190

vai

Glu

Thr 195

Gln

Glu

His

Ile

Yal 200

Gln

T/r

lys

Gln

Ala 205

Leu

Ala

Gln

Leu

Glu 210

Mec

Yal

Tyr

His

Ser 215

Thr

Gly

Ile

A3n

Glu 220

Asn

Ala

Phe

-Arg

Leu 225

Phe

Yal

Thr

Lys

Pro 230

GlU

Met

Pha

Gly

Ala 235

Ala

Thr

Gly

Aia

Ala 240

Pro

Ala

HlS

Asp

Ala 245

Leu

Ser

Leu

Ile

Mec 250

Leu

Thr

Arg

Pha

Ala 235

Asp

Trp

Yal

Asn

Ala 260

Lau

Gly

Glu

Lys

Ala 265

Sar

Ser

Val

Leu

Ala 270

Ala

Phe

Glu

Aia

Asn 275

Ser

Leu

Thr

Ala

Glu 280

Gln

Leu

Ala

Asp

Ale 285

Mec

Asn

Leu

Asp

Ala 290

Asn

Leu

Leu

Leu

Gln 295

Ala

Ser

Ile

Gln

Ala 300

Gln

Asn

His

Gln

His 305

Lau

Pro

Pro

Yal

Thr 310

Pro

Glu

Asn

Ala

Pha 315

Sar

cys

Trp

Thr

Ser 320

Ile

Asn

Thr

Ile

Lau 325

Gln

Trp

Val

Asn

Val 330

Ala

Gln

Gln

Leu

Lys 335

Cys

Arg

Pro

Thr

Gly 340

Arg

Phe

Arg

Phe

Gly 345

Arg

Ala

Gly

Leu

Tyr 350

Ser

lla

Asn

Glu

Arg 355

Asp

Thr

Asp

Lau

cys 360

Pro

Val

Gly

Lys

Arg 365

Gly

Arg

Arg

Ile

Asn 370

Arg

Arg

Val

Glu

Pha 375

Asn

Asn

Arg

Lau

Ile 330

His

Tyr

Asn

Ala

Phe 385

Leu

Asp

Glu

Ser

Arg 390

ser

Ala

Ala

Leu

Ser 395

Thr

Tyr

Tyr

Ile

Arg 400

Gln

Val

Ala

Lys

Ala 405

Ala

Ala

Ala

Ile

Lys 410

Ser

Arg

Asp

ASP

Lau 415

Tyr

Gln

Tyr

Lau

Lau 420

Ile

Asp

Asn

Gln

Val 425

Sar

Ala

Ala

Ile

Lys 430

Thr

Thr

Arg

lla

Ala 435

Glu

Ala

Ile

Ala

Ser 440

Ile

Gln

Leu

Tyr

Yal 445

Asn

Arg

Ala

Leu

Glu 450

Asn

Val

Glu

Glu

Asn 455

Ala

Asn

Ser

Gly

Yal 460

Ile

Ser

Arg

Gln

Phe 4 55

Phe

Ile

Asp

Trp

Asp 470

Lys

Tyr

Asn

Lys

Arg 475

Tyr

Ser

Thr

Trp

Ala 430

Gly

Val

Ser

Gln

Leu 485

Val

Tyr

Tyr

Pro

Glu 490

Asn

Tyr

Ile

Asp

Pro 495

Thr

Mec

Arg

Ile

Cly 500

Gln

Thr

Lys

Mec

Mec 505

Asp

Ala

Lau

Leu

Gln 510

Ser

Yal

Ser

Gln

ser 515

Gln

Leu

Asn

Ala

Asp 520

Thr

Yal

GlU

Asp

Ala 525

Phe

Mec

ser

Tyr Leu Thr Ser Phe Glu Gln Yal Ala Asn Leu Lys Yal Ile Ser Ala

140

186 242

530

535

540

T/r

Hst

Crp

Crn

I la

csn

Asn

csp

Gln

Gl/

Leu

cep

T/p

rtie

Ila

Cly

545

550

555

560

Leu

Sap

Clu

cep

Arp

Ala

Cl/

Glu

Typ

T/p

Trp

Crg

Sep

Val

Asp

Hsr

565

570

575

Sar

Lyr

ret

Csn

Arp

Gl/

Lys

ree

Cla

T l a

Csn

Cla

ypp

Sar

Glu

Trp

580

585

550

Hst

L/T

Ilt

Arp

cyr

rro

Ila

Asn

rro

Tyr

Lys

Ser

cep

Ilt

Arg

rro

595

600

505

Tal

Ile

Tyr

L/t

Sar

crg

Ltu

T/r

Ltu

Leu

Trp

Ltu

Clu

Gln-

L/T

Clu

610

613

620

Ile

eer

Lys

Cln

cep

cly

Crn

Sar

Lys

Arp

Gly

Tyr

Gln

eer

Glu

cer

525

630

635

640

cTp

T/r

Arg

T/r

Glu

Ltu

L/s

Ltu

Cla

His

Ila

crg

Tyr

ATp

Gl/

eer

645

650

655

Trp

CTn

eer

rro

Ilt

cer

ret

Asp

Va|

Asn

Lys

Lys

Ile

Ser

Clu

Leu

660

665

67 0

L/t

Ltu

Glu

L/t

Crn

Crg

Cla

rro

Gly

Leu

T/p

C/T

cla-

-Gly

Tyr

Cln

675

680

685

Cly

Clu

Arp

cer

Ltu

Ltu

Val

Mat

rbe

Typ

Csn

Cln

Cln

csp

eer

Ltu

690

695

700

Trp

Ser

Tyr

Lyr

Crn

Ala

Ser

Mat

Gln

Cly

Leu

Tyr

Ilt

rb«

Cla

Arp

705

710

715

720

Mat

Ala

Ser

Lyr

Arp

Met

hep

rro

clu

Cln

Str

Csn

Val

Tyr

Crg

Asp

725

730

735

Asn

Ser

Typ

Gln

Cln

re®

Trp

eer

Asn

Asn

Val

Arg

Arg

ViI

Crn

Arn

740

745

750

Arg

T/r

Ala

Glu

Asp

Typ

Glu

Ile

rro

Str

Ser

Val

Sep

Sar

Arg

Lys

755

760

765

Crp

Typ

Gly

Trp

Gly

Asp

Tyr

Tyr

Lau

Ser

Met

Val

T/P

Csn

Cly

Asp

770

775

780

Ile

rro

TbP

Ilt

csn

Tyr

L/T

Ala

Ala

Sep

Sar

Arp

Lau

Lys

Ile

T/r

785

790

795

800

11«

Sar

rpo

Lyr

Lau

crg

Ila

Ilt

His

Asn

Gly

T/p

Clu

Cly

Cln

L/t

805

810

815

Crg

Crn

Gln

Cyr

Csn

Ltu

Mec

Asn

L/T

T/r

Gly

L/T

Lau

Cly

Crp

L/T

820

825

830

ret

Ila

Val

Typ

Ter

Ser

Leu

Gly

Val

Arn

rpo

Crn

Csn

835 840 345 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 38, (i) Charakterystyka sekwenq'i:

( A ) Długość: 16 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C ) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia, liniowa

186 242

141 ( ii ) Typ cząsteczki: białko (v ) Typ fragmentu: N-końcowy ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 38;

Arg Tyr Tyr Asn Leu Ser Asp Glu Glu Leu Ser Gln Phe Ile Gly Lys 15 10 15 (2) Dane dla sekwencji SEK NR ID:39;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 20 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas (C ) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii ) Typ cząsteczki: białko (v) Typ fragmentu: N-końcowy (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 39;

Gly Thr Ala Thr Asp Val Ser Gly Pro Val Glu He Asn Thr Ala 15 10 15

De Ser Pro Ala Lys ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ED:40;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 11 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko ( v ) Typ fragmentu: N-końcowy ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 40;

Ala Asn Ser Leu Tyr Ala Leu Phe Leu Pro Gln 1 5 10 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID:41;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A) Długość: 14 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas

142

186 242

C ) Rodzaj nici: pojedyncza 3 D ) Topologia: liniowa ii ) Typ cząsteczki: białko ^v ) Typ fragmentu: T-końcowy xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 41;

Leu Arg Ser Ala Asn Thr Leu Thr Asp Leu Phe Leu Pro Gln 1 5 10

2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 42;

i) Charakterystyka sekwencji:

(Ν) Długość: 19 aminokwasów 3 B ) Typ: aminokwas 3 A ) Rodzaj nici: pojedyncza 3 D) Topologia: liniowa

i) Typ cząsteczki: birłko

v) Typ fragmentu: T-końcowy

X ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 42;

Arg Cla Leu Glu Vnl Glu Arg Thr Vnl Ser Leu Ala Alu Vnl Ayr 15 10 15

Cla Tly Leu Alu

2) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 43;

i) Charakterystyka sekwencji:

Ν ) Długość: 11 aminokwasów 3 B ) Typ: aminokwas 3 C) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (v) Typ fragmentu: T-końcowy ( X ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 43;

De Arg Alu Asp Tyr Pro Ala Ser Leu Tly Lys 1 5 10 (2) Dane dla sekwencji SEK NR ID:44, (i) Charakterystyka sekwencji:

Ν ) Długość: 16 aminokwasów (B ) Typ: aminokwas 3 C ) Rodzaj nici: pojedyncza (D ) Topologia: liniowa

186 242

143 ( u ) Typ cząsteczki: białko ( v ) Typ fragmentu: N-końcowy ( x ) Cpis sekwencji: SEK NR ID: 44;

Asp Asp Ser Gly Asp Asp Asp Lys Val Thr Asn Thr Asp Ile His Arg 15 10 15 (2) Dane dla sekwencji SEK NR ID:45;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas (C ) Rodzaj nici: pojedyncza (D) Topologia: liniowa ( u ) Typ cząsteczki: białko (v) Typ fragmentu: N-końcowy ( x ) Cpis sekwencji: SEK NR ID: 45;

Asp Val Xaa Gly Ser Glu Lys Ala Asn Glu Lys Leu Lys 1 5 10 (2) Dane dla sekwencji SEK NR ID:46;

( i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 7551 par zasad ( B ) Typ: Kwas nukleinowy ( C ) Rodzaj nici: podwójna (D) Topologia: liniowa ( u ) Typ cząsteczki: DNA ( genomowy ) ( xi) Cpis sekwencji: SEK NR ID: 46; (tcdA )

ATC Met 1

AAC GAG TCT

GTA Val 5

AAA Lys

GAG ATA

CCT GAT GTA TTA AAA AGC

CAG Gln 15

TCT cys

43

Asn

Glu

s«r

Clu

Ile

Pro

Asp 10

Val

Leu

Lys

Ser

GGT

TTT

AAT

TCT

CTG

ACA

GAT

ATT

AGC

CAC

AGC

TCT

TTT

AAT

GAA

TTT

96

Gly

Phe

Asn

cys

Leu

Thr

Asp

Ile

Ser

His

Ser

Ser

Phe

Asn

Glu

Phe

20

25

30

CCC

CAG

CAA

GTA

TCT

GAG

CAC

CTC

TCC

TCG

TCC

CAA

ACA

CAC

GAC

TTA

144

Arg

Gln

Gln

Val

Ser

Glu

His

Leu

Ser

Trp

ser

Glu

Thr

His

Asp

Leu

35

40

45

TAT

CAT

GAT

GCA

CAA

CAG

GCA

CAA

AAG

GAT

AAT

CwC

CTC

TAT

GAA

GCG

192

Tyr

His

Asp

Ala

Gln

Gln

Ala

Gln

Lys

Asp

Asn

Arg

Leu

Tyr

Glu

Ala

50

55

60

CGT

ATT

CTC

AAA

CGC

GCC

AAT

CCC

CAA

TTA

CAA

AAT

GCG

GTG

AT

CTT

240

Arg

Ile

Leu

Lys

Arg

Ala

Asn

Pro

Gln

Leu

Cln

Asn

Ala

Val

His

Leu

óó

70

75

30

144

186 242

GCC Ala

ATT Ile

CTC Leu

GCT CCC

AAT Asn

.Ala

SAA Giu

CTC Leu

ATA Ile JO

GGC dy

TAT Tyr

AAC Asn

AAT Asn

ΙΑΛ Gln 35

TTT Phe

2&3

Aa a

Pr: 35

AGC

GCT

AGA

AGT

C.AA

·— * m i-ii

GTT

WUfeł

X

ACC

GTT

TCT

TCC

ATG

33 5

Ser

Gly

Arg

Ala 100

Ser

Gln

T/r

Val

Ala 105

Pro

Thr

Val

Ger 110

Ser

Mec

TTC

TCC

ccc

GCC

GCT

TAT

TTG

ACT

GAA

CTT

TAT

CGT

GAA

GCA

w'av

AA x

334

Phe

Ser

Pro 115

Ala

Ala

Tyr

Leu

Thr 120

Glu

Leu

T/r

Arg

Glu 125

Ala

Arg

Asn

TTA

CAC

GCA

AGT

GAC

TCC

ctt

TAT

TAT

CTG

GAT

ACC

CGC

CGC

CCA

GAT

432

Leu

His 130

Ala

Sar

Asp

Ser

Val 135

Tyr

Tyr

Leu

Asp

Thr 140

Arg

Arg

Pro

Asp

CTC

AAA

TCA

ATG

GCG

CTC

AGT

CAG

CAA

.AAT

ATG

GAT

ATA

CAA

TTA

Tor

480

Leu 145

Lys

ser

Mer

Ala

Lau 150

Ser

Gln

Gln

Asn

Mec 155

Asp

Ile

du

Leu

Ser 150

ACA

CTC

TCT

TTG

TCC

AAT

GAG

CTG

TTA

TTG

GAA

AGC

ATT

AAA

ACT

GAA

523

Thr

Lau

Sar

Lau

Ser 165

Asn

□ lu

Leu

Leu

Leu 170

Glu

ser

Ile

Lys

Thr 175

Glu

TCT

AAA

CTG

GAA

AAC

TAT

ACT

AAA

GTG

ATC

GAA

ATG

CTC

TCC

ACT

TTC

57 6

Ser

Lys

Leu

Glu 130

Asn

Tyr

Thr

Lys

Val 135

Mec

Clu

Mec

Leu

Ser 190

Ttur

Pha

CGT

CCT

TCC

uw

GCA

ACG

CCT

TAT

CAT

GAT

GCT

TAT

GAA

AAT

CGT

624

Arg

Pro

Ser 195

Gly

Ala

Thr

Pro

Tyr 200

His

Asp

Ala

Tyr

Glu 205

Asn

Val

Arg

GAA

GTT

ATC

s* « /W

CTA

CAA

GAT

CCT

GGA

CTT

GAG

CAA

CTC

AAT

CCA

TCA

672

Glu

Val 210

Ile

Gln

Leu

Gln

Asp 215

Pro

Gly

Leu

Glu

Gln 220

Leu

Asn

Ala

Ser

CCG

GCA

ATT

GCC

GGC

TTG

ATG

CAT

CAA

GCC

TCC

CTA

TTG

GGT

ATT

AAC

720

Pro 225

Ala

Ile

Ala

Cly

Leu 230

Mec

His

Gln

Ala

Ser 235

Leu

Leu

Giy

Ile

Asn 240

GCT

TCA

ATC

TCG

CCT

GAG

CTA

TTT

AAT

ATT

CTG

ACG

GAG

GAG

ATT

ACC

753

Ala

Ser

Ile

ser

Pro 245

Glu

Lau

Ph*

Asn

Ile 250

Leu

Thr

Glu

Glu

Iie 255

Thr

GAA

GGT

AAT

GCT

GAG

GAA

CTT

TAT

AAG

AAA

AAT

TTT

GGT

AAT

ATC

GAA

316

GlU

Gly

Asn

Ala 260

Glu

Glu

Lau

Tyr

Lys 265

Lys

Asn

Phe

Gly

Asn 270

Ile

Glu

CCG

GCC

TCA

TTG

GCT

ATG

CCG

GAA

TAC

CTT

AAA

CGT

TAT

TAT

AAT

TTA

364

Pro

Ala

Ser 275

Leu

Ala

Mec

Pro

Glu 2ao

Tyr

Lau

Lys

Arg

Tyr 235

Tyr

Asn

Leu

AGC

GAT

GAA

GAA

CTT

AGT

CAG

TTT

ATT

GGT

AAA

GCC

AGC

AAT

•T»TWł»

GGT

912

Ser

Asp 290

Glu

Glu

Leu

Ser

Gln 295

Phe

Ile

Gly

Lys

Ala 300

Ser

Asn

Phe

Gly

CAA

CAG

GAA

TAT

AGT

AAT

AAC

CAA

CTT

ATT

ACT

CCG

GTA

GTC

AAC

AGC

960

Gln 305

Gln

Glu

Tyr

Ser

Asn 310

Asn

Gln

Leu

Iie

Thr 315

Pro

Val

Val

Asn

Ser 320

ACT

CAT

GGC

ACG

GTT

AAG

GTA

TAT

CGG

ATC

ACC

CGC

GAA

TAT

ACA

ACC

1003

Ser

Asp

Cly

Thr

Val 325

Lys

Val

Tyr

Arg

He 330

Thr

Arg

Glu

Tyr

Thr 335

Thr

AAT

GCT

TAT

CAA

ATG

GAT

GTG

GAC

CTA

TTT

ccc

TTC

GGT

CGT

GAG

AAT

1055

Asn

Ala

Tyr

Gln 340

Mec

Asp

Val

Glu

Leu 345

Phe

Pro

Phe

Gly

Gly 350

Glu

Asn

TAT

CCG

TTA

GAT

TAT

AAA

TTC

AAA

AAT

TTT

TAT

AAT

GCC

<TV-rrt i V, L

TAT

TTA

1104

r/r

arg

Leu

Asp

Tyr

Lys

Phe

Lys

Asn

Phe

T/r

Asn

Ala

Ser

Τ'/r

Lau

355 350 355

145

186 242

TCC Ser	ATC Hs 370	AAC Lys	TTA Leu
CCT Pro 385	CAA Gln	GTC Vel	AAT Asn
CAT Asp	ATC Ile	AGT Ser	CAA Gln
CGT	TCT	TGG	CCA

AAT Asn	CAT Asp	AAA Lys 375	.AGA Arg	GAA clu
ATA	CAA	TAC	TGC	GCA
Ile	Clu 390	Tyr	Ser	Ala

CGT· et·	TTT	CGA	ACT
Leu	Val	Arg 380	Thr
-AAT	ATC	ACA	TTA

CAA GGC GCT 11S2 Tlu GGy Ala

1200

1248

1255

1344

1392

1440

1488

1536

1584

1532

1680

1728

1776

1324

1372

1320

1968

AAT ACC GCT Asn Ile Thr Leu Asn Thr Ale 395 400

CCT TTT GAA ATT CCC CTC TCT CGT GTA CTT CGT TCC

Pro Phe Glu Ile Gly Leu Thr Arg Val Leu Pro ₅·γ

405 410 415

TAT GCC GCC GCA AAA TTT ACC GTT GAA GAG TAT TTC

Gly ser Trp .Ala Tyr Ale Ale Ale Lys Phe Thr Val Clu Clu Tyr A_sn

420 425 430

CAA

TAC

TCT

TTT

CTG

CTA

AAA

CTT

AAC

AAG

GCT

ATT

CGT

CTA

TCA

CGT

Gln

Tyr

Ser 435

Phe

Leu

Leu

Lys

Leu 440

Asn

Gys

Ale

He

Arg 445

Leu

Ser

Arg

TCG

ACA

GAA

TTC

TCA

CCC

ACC

ATT

CTG

GAA

CGC

ATT

GTG

CCC

AGT

TTT

Ala

Thr 450

Glu

Leu

Ser

Pro

Thr 455

I te

Leu

Glu

Gly

Ile 460

Vel

Arg

3er

Val

AAT

CTA

CAA

CTG

GAT

ATC

AAC

ACA

GAC

GTA

TTA

GGT

AAA

GTT

« - a

CTG’ k. a <9

Asn 465

Leu

Cln

Leu

Asp

Ile 470

Asn

Thr

Asp

Val

Leu 475

Gly

Lys

VAl

Phe

Lau 480

ACT

AAA

TAT

TAT

ATC

CAG

CGT

TAT

GCT

ATT

CAT

GCT

GAA

ACT

GCO·

CTG

Thr

Lys

Tyr

Tyr

Mec 485

Gln

Arg

Tyr

Ale

Ile 490

His

Ale

Glu

Thr

Ala 435

_ Leu

ATA

CTA

TCC

AAC

GCG

CCT

ATT

TCA

CAA

CGT

TCA

TAT

GAT

AAT

CAA

CCT

Ile

Leu

C3

Asn 500

Ala

Pro

Ile

Ser

Gln 505

Arg

Ser

Tyr

Asp

Asn 510

Gln

Pro

AGC

CAT

TTT

CAT

CGC

CTG

TTT

AAT

ACG

CCA

TTA

CTG

AAC

GGA

CAA

TAT

Ser

Gln

Phe 515

Asp

Arg

Leu

Phe

Asn 520

Thr

Pro

Leu

Leu

Asn 525

Gly

Gln

Tyr

TTT

TCT

ACC

GGC

GAT

GAG

GAG

ATT

GAT

TTA

AAT

TCA

GGT

AGC

ACC

TGC

Phe

ser 530

Thr

Gly

Asp

Glu

Glu 535

Ile

Asp

Leu

Asn

Ser 540

Gly

Ser

Thr

Gly

CAT

TCG

CGA

AAA

ACC

ATA

CTT

AAG

CGT

GCA

TTT

AAT

ATT

GAT

GAT

GTC

Asp 545

Trp

Arg

Lys

Thr

Ile 550

Leu

Lys

Arg

Ale

Phe 555

Asn

Ile

Asp

Asp

Val 560

TCC

CTC

TTC

CGC

CTG

CTT

AAA

ATT

ACC

GAC

CAT

GAT

AAT

AAA

GAT

GGT

Ser

Leu

Phe

Arg

Leu 565

Leu

Lys

Ile

Thr

Asp 570

His

Asp

Asn

Lys

Asp 575

Gly

AAA

ATT

AAA

AAT

AAC

CTA

AAG

AAT

CTT

TCC

AAT

TTA

TAT

ATT

CGA

AAA

Lys

Ile

Lys

Asn 580

Asn

Leu

Lys

Asn

Leu 585

Ser

Asn

Leu

Tyr

Ile 590

Gly

Lys

TTA

ctc

GCT

CAT

ATT

CAT

CAA

TTT

TCC

TTT

GTT

GAA

CTG

GAT

TTA

TTA

Leu

Leu

Ale 595

Asp

Ile

His

Gln

Leu 600

Thr

Ile

Asp

GlU

Leu 605

Asp

Leu

Leu

CTG

ATT

GCC

GTA

GCT

GAA

CGA

AAA

ACT

AAT

TTA

TCC

GCT

ATC

AGT

GAT

Leu

Ile 610

Tla

Val

Gly

Glu

Gly 615

Lys

Thr

Asn

Leu

Ser 620

Ale

Ile

Ser

Tsp

.TAG

CTT

TTG

GCT

TCC

CTG

ATC

AGA

AAA

CTC

AAT

ACT

ATT

TTC

TCC

TCC

Lys 325

cn

Leu

Ale

Thr

Leu 630

Ile

Arg

Lys

Leu

Asn 635

Thr

I le

Thr

Ser

Trp 640

CTT

CTT

TCT

CAG

AAG

TGG

TGT

GTA

TTC

CTG

CTA

TTT

ATC

ATC

ACC

tcc

Leu

His

Thr

Gin

Lys

Trp

Ser

Val

Phe

Gin

Lau

Phe

Ile

Met

Thr

Ser

146

186 242

645 550 jS5

ACT Thr

AGC Ser

Tyr

AAC Asn 6 60

AAA Lys

ACC Thr

CTA Leu

ACG CCT

GAA Glu

ATT Ila

AAG Lys

AAT Asn

L Lau 670

C TG Leu

Z· » w.-i I Asp

2016

Thr

Pro 665

ACC

. V.

TAC

CAC

GGT

eea « a a.-k

CAA

GGT

TTT

GAT

AA.A

GAC

AAA

GCA

GAT

TTG

2064

Thr

Val

Tyr 675

His

Gly

Leu

Gln

Gly 630

Phe

Asp

Lys

Asp

Lys 635

Ala

Asp

Leu

CTA

CAT

GTC

ATG

GCG

CCC

TAT

ATT

GCG

TCC

ACC

TTG

CAA

TTA

TCA

TCT

2112

Leu

His 690

val

Mec

Ala

Pro

Tyr 695

Ile

Ala

Ala

Thr

Leu 700

Gln

Leu

Ser

Ser

CAA

AAT

TTC

GCC

CAC

TCG

CTA

CTC

CTT

TGG

GCA

GAT

AAG

TTA

CAG

Z-·/—Λ

2160

Tlu 705

Asn

Val

Ala

HlS

Ser 710

Val

Leu

Lau

Trp

Ala 715

Asp

Lys

Lau

Gln

Pro 720

TGC

GAC

GGG

GCA

ATC

ACA

GCA

CAA

AAA

TTC

TGG

GAC

TCG

TTC

AAT

ACT

2203

Tly

Asp

Gly

Ala

Mec 725

Thr

Ala

Glu

Lys

Phe 730

Trp

Asp

Trp

Leu

Asn 735

Thr

AAC

TAT

ACG

CCT

GGT

TCA

TCG

CAA

GCC

GTA

GAA

ACC

CAG

GAA

CAT

ATC

2256

L/s

Tyr

Thr

Pro 740

Gly

Ser

5er

Glu

Ala 745

Val

Glu

Thr

Gln

Tlu 750

His

Ile

TTT

CAG

TAT

TCT

CAG

GCT

CTG

GCA

CAA

TTC

CAA

ATG

GTT

TAC

CAT

TCC

2304

Val

Gln

Tyr 755

Cys

Gln

Ala

Leu

Ala 760

Gln

Lau

Glu

Mec

Val 765

Tyr

His

Ser

ACC

GGC

ATC

AAG

GAA

AAC

GCC

TTC

CGT

CTA

TTT

CTG

ACA

AAA

CCA

CAG

2352

Thr

Gly 770

Ile

Asn

Glu

Asm

Ala 775

Phe

Arg

Lau

Phe

Val 730

Thr

Lys

Pro

Tlu

ATT

TTT

TGG

GCT

GGA

AGT

GGA

GCA

CCC

CCC

CCC

CAT

GAT

GCC

GTT

TCA

2400

Mec 735

Phe

Gly

Ala

Ala

Thr 790

Gly

Ala

Ala

Pro

Ala 795

His

ASP

Ala

Leu

Ser 300

CTG

ATT

ATG

CTG

ACA

CCT

TTT

GCT

GAT

TCC

CTG

AAC

GCA

CTA

GGC

CAA

2443

Leu

Ile

mcc

Leu

Thr 305

Arg

Phe

Ala

Asp

Trp 310

Val

Asn

Ala

Lau

Gly 315

Tlu

AAA

GGG

TGC

TCC

GTC

CTA

GCG

TCA

TTT

CAA

GCT

AAC

TCG

TTA

ACG

GCA

2196

Lyc

Ala

Ser

Ser 320

Val

Leu

Ala

Ala

Phe 325

Glu

Ala

Asn

Ser

Leu 330

Thr

Ala

TAA

CAA

CTG

GCT

CAT

GGC

ATG

AAT

CTT

CAT

TCT

AAT

TTG

CTG

TTC

CAA

2544

Glu

Gln

Leu 335

Ala

Asp

Ala

Mac

Asm 340

Leu

Asp

Ala

Asn

Leu 345

Leu

Lau

Gln

GCC

AGT

ATT

CAA

GGA

CAA

AAT

CAT

CAA

CAT

CTT

CCC

CCA

GTA

ACT

CCA

2592

Ala

Ser 350

Ile

Gln

Ala

Gln

Asn 355

His

Gln

His

Leu

Pro 360

Pro

Val

Thr

Pro

CAA

AAT

GCG

TTC

TGC

TGT

TCC

ACA

TCT

ATC

AAT

ACT

ATC

CTC

CAA

TCC

2640

Glu 365

Asm

Ala

Phe

Ser

Cys 370

Trp

Thr

Sar

Ile

Asn 375

Thr

Ile

Leu

GlM

Trp aso

TTT

AAT

TTG

GGA

CAA

CAA

TTG

AAT

GTG

CCC

CCA

CAG

TGC

TTT

TCC

GCT

2633

Val

Asn

Val

Ala

Gln 335

Gln

Lau

Asn

Val

Ala 390

Pro

Gln

Tly

Val

Ser 395

Ala

TTG

GTC

TGG

CTC

GAT

TAT

ATT

CAA

TCA

ATT

AAA

CAG

ACA

CCG

ACC

TAT

2735

Lau

Val

Gly

Leu 900

Asp

Tyr

Ile

GlM

ser 905

Mec

Ly3

Tlu

Thr

Pro 910

Thr

Tyr

CCC

CAG

TGG

GAA

AAC

CGG

TCA

GGC

GTA

TTA

ACC

CCC

GGG

TTG

AAT

TCA

2734

Ala

GlM

Trp 915

Glu

Asm

Ala

Ala

Gly 920

Val

Lsu

Thr

Ala

Gly 925

Lau

Asn

5er

C.AA

CAT

CGT

AAT

ACA

TTA

CAC

GCT

TTT

CTC

GAT

TAA

TCT

CTC

AGT

GCC

2332

186 242

147

Cln

Cln 930

Ala

Asn

Thr

Leu

His 935

Ala

Phe

Leu

Asp

Glu 940

Ser

Arg

Ser

Ala

CCA

TTA

ACC

AGG

TAG

tAT

ATG

CCT

GAA

CTG

GGG

AAG

CGA

gcG

2330

Ala 545

Leu

Ser

Thr

Tyr

Tyr 950

Ile

Arg

Cln

'-'al

Ala 955

Lya

Ala

Ala

Ala

Axd 5g0

A X *

AAA

AGG

CGT

CAT

CAG

TTC

TAT

GAA

TAG

TTA

GTG

ATT

AAT

CAG

292a

Ile

Lya

Ser

Arg

ASP 965

Asp

Leu

Tyr

Gln

Tyr 970

Lau

Leu

Ile

Asp

Asn 975

Cln

GTT

TCT

GGA

ATA

AAA

AGC

AGG

CGG

ATC

GGG

CAA

GGC

ATT

CCC

« ywaat ΠΛ_» χ

2976

Val

Ser

Ala

Ala 930

Ile

Lys

Thr

Thr

Arg 935

Ile

Ala

Clu

Ala

Ile 990

Ala

Ser

ATT

GAA

CTC

TAG

CTC

AAG

GCG

CGA

TTC

CAA

AAT

GTC

GAA

GAA

AAT

GGC

3021

Ile

Gln

Leu 995

Tyr

Val

Asn

Arg

Ala Leu 1000

Glu

Asn

Val

Glu Clu 1005

Asn

Ala

AAT

TGG

GCG

CTT

ATG

AGG

CGG

CAA

TTC

TTT

ATG

CAG

TCC

GAC

AAA

TAG

3072

Asn

Ser Gly 1010

Val

Ile

Ser

Arg Cln 1015

Phe

Phe

Ile

Asp Trp 1020

Asp

Lys

Tyr

AAT

AAA

CGC

TAG

ACC

ACT

TCC

CGG

GGT

CTT

TCT

CAA

TTA

GTT

TAG

TAG

3120

Asn Lys 1025

Arg

Tyr

Ser

Thr Trp 103C

Ala

Cly

Val

Ser Cln 1035

Leu

Val

Tyr

Tyr 1040

GGG

GAA

AAC

TAT

ATT

GAT

CGG

ACC

ATC

CGT

ATC

GGA

GAA

AGG

-AAA

ATG

3163

Pro

Clu

Aan

Tyr

Ile Asp 1045

Pro

Thr

Met

Arg Ile 10SC

Cly

Gln

Thr

Lys Met 1055

ATC

GAG

GCA

TTA

GTC

CAA

TCC

GTG

AGG

GAA

AGG

GAA

TTA

AAG

GCC

GAT

3216

Met

Asp

Ala

Leu Leu 1060

Cln

Ser

Val

Ser Cln 1065

Ser

Cln

Lau

Asn Ala 1070

Asp

ACC

GTG

CAA

GAT

CCC

TTT

ATC

TGT

TAT

CTG

AGA

TGC

TTT

GAA

GAA

GTG

•3264

Thr

Val

Glu 1075

Asp

Ala

Phe

Met

Ser Tyr 1080

Leu

Thr

Ser

Phe 1035

Glu

Gln

Val

GGT

AAT

CTT

AAA

GTT

ATT

ACG

GGA

TAT

GAG

GAT

AAT

ATT

AAT

AAC

GAT

3312

Ala

Asn 1090

Leu 1

Lys

Val

Ile

Ser Ala 1035

Tyr

His

Asp

Asn Ile 1100

Asn

Asn

Asp

CAA

GCG

CTG

AGG

TAT

TTT

ATG

GGA

CTG

ACT

CAA

ACT

GAT

GGG

GGT

GAA

3360

Gln 1105

Gly 1

Leu

Thr

Tyr

Phe Ile 1110

Gly

Leu

Ser

Clu Thr 11X5

Asp

Ala

Gly

Glu 1120

TAT

TAT

TCG

GCG

AGT

GTG

GAT

CAG

ACT

AAA

TTG

AAC

CAG

GGT

AAA

TTG

3403

Tyr

Tyr

Trp

Arg

Ser Val 1125

Asp

His

Ser

Lys Phe 113C

Asn

Asp

Gly

Lys Phe 1135

GGC

GCT

AAT

GGC

TCC

AGT

GAA

TCC

GAT

AAA

ATT

CAT

TCT

GCA

ATT

AAG

3456

Ala

Ala

Asn

Ala Trp 114C

Ser

Clu

Trp

His Lys 1145

Ile

ASP

Cys

Pro Ile 1150

Asn

CGT

TAT

AAA

ACG

ACT

ATG

GGT

CGA

CTG

ATA

TAT

AAA

TCC

GGG

CTC

TAT

3504

Pro

Tyr

Lys 1155

Ser

Thr

Ile

Arg

Pro Val 1160

Ile

Tyr

Lys

Ser Arg 1165

Leu

Tyr

CTG

CTC

TGC

TTC

CAA

GAA

AAC

CAC

ATG

AGG

.AAA

GAC

ACA

GCA

AAT

AGT

3552

Leu

Leu Trp 1170

Leu

Clu

Cln

Lys Glu 1175

Ile

Thr

Lys

Cln Thr iiao

Gly

Asn

Ser

AAA

GAT

Ccc

TAT

GAA

AGT

GAA

ACC

CAT

TAT

CCT

TAT

GAA

GTA

AAA

TTG

3600

Lys 1135

Asp

Gly

Tyr

Cln

Thr Clu 1190

Thr

Asp

Tyr

Arg Tyr 1195

Clu

Leu

Lys

Leu 1200

CCG

CAT

ATG

GcG

TAT

CAT

GCG

AGT

TCC

AAT

ACC

GCA

ATC

ACG

TTT

un x

3643

Ala

His

Ile

Arg

Tyr

Asp Cly

Thr

Trp

Asn

Thr

Pro

Ile

Thr

Phe

Asp

1205 1210 1215

148

186 242

CTC Val

AUT Asn

AUA Lys

UUA ATU L/S I le 1220

Tcc Ser

CUC Clu

CTA Leu

UAA CTG Lys Leu 1225

caU du

UAA Lys

UAT Usn

UCA GCG Arg Ula 1230

CCC Pirs

3636

CGA

CTC

TUT

TGT G0C

GCT

TAT

CAA

CGT CUA

CAT

A'*, w

TTG

cTG CTC

ATC

3744

c ly

Leu

Tyr

Cys Ala

Cly

Tyr

Cln

Gly Glu

usp

Thr

Lau

Leu Val

Met

1235

1240

1245

TTT

TUT

AAC

CUA CUA

CAC

UCA

CTA

GAT AGT

TAT

UAU

AlC

CCT TCA

ATC

3792

Phe

Tyr

Usn

Cln C.n

Usp

Thr

Lau

Usp Ser

Tyr

Lys

Usn

Ula Ser

Mec

1255

1230

CAA

CGA

CTA

TUT ATC

TTT

GCT

CAT

ATG GCA

TCC

UAA

CAT

ATC ACC

CCA

3840

Cln

Cly

Leu

Tyr Ile

Phe

Ala

Asp

Met Ala

Ser

Lys

usp

Met Thr

Pro

1265

1270

1275

1230

CUA

CUG

AGC

UAT GTT

TAT

CGG

GAT

AUT AGC

TAT

CAA

CAA

TTT CAT

ACC

3333

Clu

Cln

Ser

Asn Val

Tyr

Arg

Asp

Asn Ser

Tyr

Cln

Cln

Phe Asp

Thr

1285

1290

1295

AAT

AAT

GTC

AGA AGA

GTG

AUT

AAC

CGC TAT

CCA

CAC

CAT

TUT CUG

ATT

3936

usn

Usn

Val

Arg Arg

Val

Asn

Asn

Arg Tyr

Ala

Glu

Asp

Tyr Clu

Ile

1300

1305

1310

CCT

TCC

TCG

CTA ACT

ACC

CCT

AAA

CAC TAT

CCT

TGG

CCA

CAT TAT

TAC

3984

Pro

Ser

Ser

Val Ser

Ser

Urg

Lys

Asp Tyr

Cly

Trp

Cly

usp Tyr

Tyr

1315

1320

1325

CTC

AGC

ATG

GTA TAT

AUC

GGA

GAT

ATT CCA

UCT

ATC

AUT

TAC UAA

CCC

4032

Leu

Ser

Met

Val Tyr

Asn

Cly

Asp

He Pro

Thr

Ile

Asn

Tyr Cys

Ala

1330

1335

1340

CCA

TCA

ACT

GAT TTA

UAA

ATC

TAT

ATC TCA

CCA

AAA

TTA

UGA ATT

ATT

4080

ula

Ser

Ser

Asp Lau

Lys

Hla

Tyr

Ile Ser

Pro

Lys

Lau

Arg Ile

ILe

1345

1350

1355

1360

CAT

AAT

GCA

TAT GAA

GGA

CAG

AAG

CGC AAT

CAA

TCC

UAT

CTC ATC

UAT

412a

His

Asn

Gly

Tyr Glu

Gly

Gln

Lys

Arg Asn

Cln

Cys

Usn

Leu Met

Usn

1365

1370

1375

UAA

TAT

GGC

AAA CTA

GGT

GAT

AUA

TTT ATT

CTT

TAT

UCT

ACC TTC

GCC

4176

L'/S

Tyr

Gly

Lys Leu

Gly

Asp

Lys

Phe Ile

val

Tyr

Thr

Ser Lau

Cly

1380

1385

1390

CTC

AAT

CCA

UAT AAC

TCC

TCA

UAT

AUG CTC

ATG

TTT

TAC

CCC CTC

TAT

4224

Val

Asn

Pro

Asn Asn

Ser

Ser

Asn

Lys Leu

Met

Phe

Tyr

Pro Val

Tyr

1395

1400

1405

CAA

TAT

AGC

GGA UAC

ACC

AGT

CGA

CTC AUT

CAA

CCC

ACA

CTA CTA

TTC

4272

Cln

Tyr

Ser Gly Asn

Thr

Ser

Gly

Lei Asn

Cln

Cly

Arg

Lau Leu

Phe

1410

1415

1420

cuc

CCT

CAC-ACC ACT

TAT

CCA

TCT

AAA GTA

CAA

CCT

TGC

ATT CCT

CCA

4320

His

Arg

Asp

Thr Thr

Tyr

Pro

Ser

Lys Val

Clu

Ala

Trp

Ile Pro

Cly

1425

1430

1435

1440

CCA

UAA

CGT

TCT CTA

UCC

AAC

CUA

AUT GCC

CCC

ATT

GGT

CAT GAT

TAT

4368

ula

Lys

Arg

Ser Leu

Thr

Asn

Gln

Asn Ala

Ala

Ile

Cly

Asp Usp

Tyr

1445

1450

1455

GCT

ACA

GAC

TCT CTC

UAT

UAA

CCG

GAT GAT

CTT

AAG

CUA

TAT ATC

TTT

4416

Ula

Nar

Asp

Ser Leu

Usn

Lys

Pro

Asp Usp

Lau

Lys

Gln

Tyr Ile

Phe

1460

1465

1470

ATG

ACT

GAC

AGT AAA

CGG

ACT

GCT

ACT CAT

CTC

TCA

CGC

CCA CTU

CAG

4464

Mec

Thr

Asp

Ser Lys

Cly

Thr

ula

Thr Usp

Val

Ser

Gly

pro Val

Clu'

1475

1480

1485

ATT

AUT

ACT

GCA ATT

TCT

CCA

GCU

AUA GTT

CAC

ATU

ATA

CTC UAA

cCC

4512

•le

Asn

Thr

Ala Ile

Ser

Pro

Ula

Lys Val

Cln

Ile

ila

Val Lys

Ala

1490 1495 1500

186 242

149

4 GWM Cl/ Gly 1505

TAC L/T

GAC Clu

cAA Gln

act Ter 151

TCC rea 0

TC C eer

GCC Cla

CCT csp

.CAA Lys 1515

CAT Csp 5

GhC /al

yoc Stp

ACT Ila

ocG Gln 1520

4560

CCA TCA

CCT

CCC

TTT

CAT

GAC

ATC

CCC

CCC

CAA

TTT

TAC

GCC

CTC

GAA

4608

rpo Sep

rpo

Sap

re®

Asp

Glu

Mat

Asn

h/r

Gln

re®

Csn

Ala

Leu

Glu

1525

1530

1535

X Λ W.—.<·

CCT

cct

GCT

ccc

TAC

TTT

CCC

TAC

AC-C

CCC

CCC

CGT

CCC

GA 1

4655

Ha Asp

Cl/

StP

Cl/

Lau

Csn

re®

Ila

Asn

Csn

Sap

CIi

Sep

11®

.A3C

1540

1545

1550

CTT ACT

ctt

CCC

CCA

T**?

CCC

SCC

CAC

GCC

CCC

CAC

CCG

GGC

CAC

GAA

4704

/al eer

rbe

eer

Ala

re®

Cla

Clu

Csp

cl/

Crg

L/s

Liu

Gl/

Typ

Glu

1555

1560

1565

AGT TTC

ACT

CTT

CCT

cct

CCC

CTC

CAC

CTC

CGT

CCC

CCC

CAC

CCC

CTC

4752

śer ree

Sep

lift

ppo

/al

eer

Lau

Lys

/al

Sar

Ter

Asp

Csn

Cla

Lau

1570

1575

1590

ACC CTG

CAC

CCT

atc

G.AA

AAC

CGT

CCG

CCA

CAC

ATC

CCA

TGG

CAA

4 w

4800

yer LSU

Hls

His

csn

Clu

csn

Cl/

cla

cln

T/r

Mat

Cln

hpp

Cln

Sar

1585

1590

1595

1600

TAT CCT

ccr

CCC

CTG

AAT

CCT

CTC

hCT

CCC

CCC

CCC

CTG

CCC

GCA

MGM

4343

Tyr Crg

cer

Apg

Lau

Csn

cer

Leu

re®

Cla

cpg

Cln

Ltu

/al

Ala

Crg

1605

1610

1615

CCC CCC

ACC

CCA

ccc

GCT

ACC

ATT

CTC

AGC

CCC

GAA

ACC

CCG

TAC

CCT

4396

Ala eer

eer

Cly

Ila

Csp

yer

Ilt

Lau

Str

Mac

Clu

eer

Cln

Csn

Ile

1620

1625

1630

CAC CCT

CCG

CAG

TTA

CGC

CAA

CGT

CTC

CAT

CGT

CCG

TCC

CTG

ACA

CCT

4944

Cln Glu

rro

Gln

Lau

Cly

Lys

Cly

re®

Tyr

Ala

eer

re®

/al

Ilt

rro

1635

1640

1645

CCC TAT

AAG

CTA

TCA

ACT

CAC

CCT

GAT

CAC

CGT

CGG

TCT

CAG

CTC

CAC

4992

rro T/r

Asn

Lau

Sep

eer

Hst

cl/

Asp

Clu

Crg

Tpp

re®

L/S

Leu

T/r

1650

1655

1660

ATC AAA

CAT

cct

CTT

GAT

AAC

CAT

TCC

CAC

CTT

ACC

TAT

CCA

GGC

CAG

5040

Ilt Lys

His

/al

/al

Csp

Asn

Csn

Sep

His

Ilt

Ila

Typ

Sep

Cly

Cln

1655

1670

1675

1080

CTA ACA

CAT

CCA

AAT

CTA

TAC

CCC

ACA

TCA CTC

ACT

CCT

CTT

CAT

GAC

5088

Lau eer

Asp

Ter

Asn

Ilt

Asn

Ile

eer

Lau

re®

Ila

rro

Lau

Csp

Csp

1685

1690

1695

GTC CCA

TTG

CAT

CAC

CAC

TAC

CAC

GCC

ACC

CTT

CCT

CTG

CCC

TTC

CCG

5136

/al rro

Leu

Csn

Cln

Csp

Cyr

HiS

Cla

L/s

/al

T/p

Muc

eer

re®

L/s

1700

1705

1710

ACA TCA

CCA

ecA

CAT

GGT

CCC

CGG

CCC

CCC

CCT

CCC

TTC

GTC

AGA

GAC

5134

L/s Sep

rro

Ser

Csp

Gly

eep

Crp

Tpp

Gly

rro

HiS

re®

/al

Arg

CSr

1715

1720

1725

CCT AAA

CCA

CTA

CTC

CCA

CCA

CAC

CCT

CAA

T00

ATT

CTC

CCC

CAT

CCT

5232

Asp Lys

Gly

Ilt

/al

Cer

Ilt

Asn

rro

Lys

Sep

Ile

Leu

eer

Hss

re®

1730

1735

1740

GCG CGg

CTC

CAT

CTC

CCG

CAT

ACC

ATT

CCC

ACC

CCA

CCA

CTC

CAC

TTC

5280

clu Sep

/al

Csn

/al

Leu

Asn

Asn

Ila

Ser

Sar

Clu

rro

Mat

Csp

re®

1745

1750

1755

1760

CCC CCC

CCT

CAC

ACC

CTC

TAC

ttc

TCC

GAT

CCO

TCC

CCC

CAT

ACC

CCG

5323

Ser Cly

Ala

Asn

Stp

Lau

Tyr

re®

Crp

Clu

Lau

re®

T/r

C/P

cep

rro

17 65

1770

1775

CTC CTC

CTT

CCT

CAC

CCT

CTG

CCG

CCC

GAA

CAG

AAC

TCh

GAT

CCA

CC?

5 3 7 6

Mac Lau

/al

Ala

Cln

Crg

Ltu

Lau

Hst

Clu

Gln

Asn

rea

Csp

Glu

Ala

150

186 242

1730 1735 1750

AAC Asn

Arg

TTG CTG Trp Leu 1735

AAA Lys

TAT Tyr

TTG Val

TGG AGT Trp Ser 1300

GG · Pro

TCC Ser

GGT Gly

TAT ATT Tyr Ile 1305

GTG Val

CAC His

5421

CGC

CAG

ATT CAG

AAC

TAC

CAG

TGG AAC

GTC

CGG

C cG

TTA CTG

CAA

TAC

54^2

^^y

Gln Ile cln 1810

Asn

Tyr

Tln Trp Asn 1315

val

Arg

Pro Leu Leu 1320

Clu

Asp

ACC

ACT

TCC ATC

ACT

GAT

CCT

TTG GAT

tcc

GTG

GAT

CCT GAC

GcG

CTA

5520

Thr Ser 1825

Trp Asn

Ser

Asp Pro 1830

Leu Asp

Ser

Vel Asp 1335

Pro Asp

Ala

Val 1340

GCA

CAG

CAC GAT

CCA

ATG

CAG

TAC AAA

CTT

TCA

ACT

TTT ATG

CGT

ACC

5568

Ala

Cln

His Asp

Pro Mec 1845

His

Tyr Lys

Val Ser 1850

Thr

Phe Mec

Arg 1355

Thr i

TTG

GAT

CTA TTG

ATA

CGA

CGC

GGC GAG

CAT

GGT

TAT

CGG CAA

CTG

GAA

5616

Leu

Asp

Leu Leu Ile 1360

Ala

Arg

Gly Asp His 1365

Ale

Tyr

Arg Gln Leu 1870

Clu

CCA

GAT

ACA CTC

AAC

GAA

GCG

AAG ATG

TGG

TAT

ATG

CAA GGG

CTC

GAT

5664

Arg

Asp

Thr Leu 1375

Asn

Glu

Ale

Lyo ma· 1830

Trp

Tyr

Met

cm Ala 1335

Lau

His

CTA

TTA

GGT GAC

AAA

CCT

TAT

CTA GCG

CTC

AGT

AGG

ACA TGG

AGT

GAT

5712

Leu

Leu Cly Asp 1390

Lys

Pro

Tyr Leu Pro 1895

Leu

ser

Thr Thr Trp 1900

Ser

Asp

CCA

CCA

CTA GAC

AGA

GGG

GCG

GAT ATG

ACT

AGC

CAA

AAT CGT

CAC

CAC

5760

Pro Arg 1905

Leu Asp

Arg

Ale Ale 1910

Asp Ile

Thr

Thr Gin 1915

Asn Ala

His

Asp 1320

ATC

GCA

ATA GTC

GGT

CTG

GGG

CAG AAT

ATA

GGT

AGA

CCG CCA

CCT

TTA

5303

Ser

Ale

Ile VAl

Ale Leu 1925

Arg

Gin Asn

Ile Pro 1930

Thr

Pro Ale

Pro Leu 1935

TCA

TTG

CGC ATC

GCT

AAT

ACC

CTG ACT

GAT

CTG

TTG

CTG CCG

CAA

ATC

5355

Ser

Leu

Arg Ser Ala 1940

Asn

Thr

Leu Thr Asp 1945

Leu

Phe

Leu Pro Gln 1950

Ile

AAT

GAA

GTG ATG

ATG

AAT

TAG

TGG CAG

ACA

TTA

GGT

CAG ACA

CTA

TAC

5904

Asn

Glu

Vel Met 1955

Met

Asn

Tyr

Trp Gln 1960

Thr

Leu

Ale

Cln Arg 1965

Vel

Tyr

AAT

CTG

GGT CAT

AAC

CTC

TCT

ATC GAC

GGG

GAG

CCG

TTA TAT

CTG

CCA

5952

Asn

Leu Arg His 1970

Asn

Leu

Ser Ile Asp 1975

Gly

Gln

Pro Leu Tyr 1930

Leu

Pro

ATC

TAT

GGC AGA

GGG

GGC

GAT

CCG AAA

GGG

TTA

GTG

ACC CCC

CGC

GTT

6000

Ile Tyr 1985

Ale Thr

Pro

Ala Asp 1990

Pro Lys

Ala

Leu Leu 1995

Ser Ala

Ala

Vel 2000

ACC

ACT

TGT CAA

GGT

GGA

CCC

AAC CTA

CCG

GAA

TGA

TTT ATC

TCC

CTG

6043

Ale

Thr

ser Gin

Gly Gly 2005

Gly

Lys Leu

Pro Glu 2010

Ser

Phe Mec

Ser Leu 2015

TCG

CCT

ttg cce

cac

ATG

CTT

GAA AAT

GGG

CGG

CGG

ATG GTT

AGG

CAG

6096

Trp

Arg

Phe Pro His 2020

Het

Leu

Glu Asn Ale 2025

Arg

Gly

Mec Vel Ser 2030

Gin

CTC

ACC

CAG TTG

GGC

TCC

AGG

TTA CAA

AAT

ATT

ATC

GAA CGT

CAG

GAC

6144

Leu

Thr

Gin Phe 2035

Gly

Ser

Thr

Leu Gin 2040

Asn

Ile

Ile

Glu Arg 2045

Gin

Asp

GCG

GAA

GCG GTG

AAT

GGG

TTA

TTA CAA

AAT

CAG

GGC

CCl GAG

CTG

ATA

6192

Ala

Glu Ale Leu 2050

Asn

Ala

Leu Leu Gin 2055

Asn

Gln

Ale Ala clu 2060

Leu

Ile

TTG

ACT

.AAG GTG

AGC

ATT

CAG

GAC AAA

ACC

ATT

CAA

CAA TTG

CAT

6240

151

186 242

Leu 2C6

ΓΚΓ

Asn

L~u

Ser

Iie Gin 2073

ASP

Lys

Thr

iie 207’

Glu e

Glu

Lau

A3p

Aia 2080

CAG

AAA

ACC

CTC

TTO

GAA

AAA

7CC

AAA

GCj

•CCA

CCA

CAA

TCG

TTT

62 3 3

Glu

Lys

Thr

Tai

Leu Glu 2035

Lys

Ser

tys

Ala Gly 2090

Ala

Gln

Ser

Arg Phe 2095

CAT

AGC

TAC

CGC

AAA

TCj

TAC

CAT

GAG

AAT

ATC

AAC

CCC

cct

CAA

AAC

5336

Asp

ser

Tyr

Gly Lys 2100

Leu

Tyr

Asp

Glu Asn 2105

Ile

Asn

Ala

Gly Glu 2110

Asn

C.AA

GCC

ATC

rvCG

CTA

CGA

T**C

GCC

CGG

CTT

ACC

ACC

CCA

CTT

63 34

Cln

Aid

Mec Thr 2115

Leu

Arg

Ala

Ser Ala 2120

Aid

Gly

Leu

Thr Thr 2125

Ala

Val

CAG

GCA

TCC

CGT

CTG

GCC

GGT

GCG

GCG

GCT

GAT

CTG

GTG

CCT

AAC

ATC

6432

Cln

Ala Ser 2130

Arg

Leu

Aid

Gly Ala 2135

Aia

Ala

Asp

Leu Val 2140

Pro

Asn

Ile

TTC

GGC

TTT

GCC

GGT

GGC

AGC

CGT

T>—«-» • ww

GGC

GCT

ATC

GCT

GAG

CCG

5430

Phe Gly 2145

Phe

Ala

Gly

2150

Ser

Arg

Trp

Gly Ala 2155

Ile

Aia

Glu

Ala 2160

ACA

CCT

TAT

CTG

ATC

CAA

TTC

TCC

ccc

AAT

CTT

ATC

AAC

ACC

CAA

ccc

□ 5 2 0

Thr

Gly

Tyr

val

Mec 2155

Glu

Phe

Ser

Ala

Asn 217C

Tal l

Mec

Asn

Thr

Clu 2175

Ala

CAT

AAA

ATT

ACC

CAA

TCT

CAA

ACC

TAC

CCT

CCT

CCC

CGT

CAC

gAC

TCC

55~5

Asp

Lys

Ile

Ser 218C

Gin 1

Ser

Glu

Thr

Tyr Arg 2185

Arg

Arg

Arg

Gln Glu 2190

Trp

GAC

ATC

CAC

CGG

AAT

AAT

CCC

GAA

GCC

GAA

TTC

AAG

CAA

ATC

CAT

GCT

5524

Glu

Ile

Gln Arg 2195

Asn

Asn

Ala

Glu Ala 2200

Glu

Leu

Lys

Gln 2205

Ile

ASP

Ala

CAG

CTC

AAA

TCA

CTC

CCT

GTA

CGC

CCC

GAA

GCC

ccc

CTA

TTG

CAG

AAA

55~2

Gln

Leu Lys 2210

Ser

Leu

Ala

Val Arg 2215

Arg

Clu

Ala

Ala Val 2220

Leu

Cln

Lyc

ACC

ACT

CTC

AAA

ACC

CAA

CAA

GAA

CAG

ACC

CAA

TCT

CAA

TTG

GCC

TTC

520

Thr 2225

Ser

Leu

Lys

Thr

Gin Gin 2230

Clu

Gln

Thr

Cln Ser 2235

Cln

Leu

Ala

Phe 2240

CTG

CAA

CCT

AAG

TTC

AGC

AAT

CAG

GCG

TTA

TAC

AAC

TGG

CTG

CCT

CGT

6 b8

Leu

Cln

Arg

Lys

Phe Ser 2245

Asn

Cln

Ala

Leu Tyr 2250

Asn

Trp

Leu

Arg Gly 2255

CGA

CTG

GCG

GCG

ATT

TAC

TTC

CAG

TTC

TAC

GAT

TTG

GCC

GTC

GCG

*

6316

Arg

Leu

Ala

Ala Ile 2260

Tyr

Phe

Cln

Phe Tyr 2265

Asp

Leu

Ala

Val Ala 2270

Arg

TCC

CTG

ATG

GCA

CAA

CAA

CCT

TAC

CGT

TGG

GAA

CTC

AAT

GAT

GAC

TCT

6354

Cys

Leu

Mec Al* 2275

Glu

Cin

Ala

Tyr Arg 2280

Trp

Clu

Leu

Asn Asp 2285

Asp

Ser

ucc

kr«-*C

TTC

ATT

AAA

CCG

GGC

GCC

TGG

CAC

GGA

ACC

TAT

GCC

GCT

CTG

5912

Ala

Arg Phe 2290

Ile

Lys

Pro

Gly Ala 2295

Trp

Gln

GLy

Thr Tyr 2300

Ala

Cly

Leu

CTT

GCA

GGT

GAA

ACC

TTC

ATG

CTG

AGT

CTG

GCA

CAA

ATG

GAA

GAC

CCT

5960

Leu Ala 2305

Gly

Glu

Thr

Leu Mec 2310

Leu

Ser

Leu

Ala Gln 2315

Mec

Glu

Asp

Ala 2320

CAT

CTG

AAA

CGC

GAT

AAA

CGC

GCA

TTA

GAG

GTT

GAA

CGC

ACA

GTA

TCC

7003

His

Leu

Lys

Arg

Asp Lys 232S

Arg

Ala

Leu

Glu Val 2330

GlU

Arg

Thr

Val Ser 2335

CTG

GCC

GAA

GTT

TAT

GCA

GGA

TTA

CCA

AAA

GAT

AAC

GGT

CCA

TTT

TCC

7055

Leu

Ala

Glu

Val Tyr 2340

Ala

cly

Lau

Pro Lys 2345

Asp

Asn

Gly

Pro Phe 2350

Ser

152

186 242

CTC Leu

GCT Αία

CAG GAA Gln Glu 2355

ATT Ile

GAC Asp

Lys

CTG Leu 23ńi

GTG Val 3

AG T 5er

CaA Tln

Tly

TCA AAA Ser Tly 2365

AGT Ser

GCg Aia

7194

GGC

AGT

GGT AAT

AAT

AAT

TTG

GCg

TTC

GG—

cCC

GGC

ACG GAC

TCA

AAA

7152

Gly

Ser

Gly Asn

Asn

Asn

Leu

Ala

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr Asp

Thr

Lys

2370

2375

2330

AC—

TCT

TTG CAG

GCA

TCA

GTT

TCA

TTC

GCT

GAT

TTC

AAA ATT

CGT

GAA

7200

Thr

Ser

Leu Aln

Ala

Ser

Val

Ser

Phe

Ala

Asp

Leu

Lys Tle

Trg

Clu

2385

2390

2395

2400

GAT

TAC

AAT GCA

TCG

CTT

GGC

AAA

ATT

CGA

CGT

ATC

AAA CAG

ATC

AGC

7248

Asp

Ayr

Pro Ala

Ser

Leu

Gly

Lys

Ile

Arg

Arg

Ile

Lys Gln

Ile

Ser

2405

2410

2415

GTC

ACT

TTG CCC

GCG

CTA

CTG

CGA

CCG

TAT

CAG

GAT

GTA CAG

GCA

ATA

7296

Val

Thr

Leu Pro

Ala

Leu

Leu

Gly

Pro

Tyr

Gln

Asp

Val Gln

Ala

Ile

2120

2425

2430

TTG

TCT

TAC GGC

GAT

AAA

GC

GGA

TTA

GCT

AAC

GGC

TGT GAA

GCG

CTG

7344

Leu

Ser

Tyr Gly

Asp

Lys

Ala

Gly

Leu

Ala

Asn

Gly

Cys Glu

Ala

Leu

2435

2440

2445

A

GTT

TCT CAC

GGT

ATC

AAT

GAC

ACC

GCC

CAA

TTC

CAG CTC

GAT

TTC

7392

Tle

Val

Ser His

Gly

Met

Asn

Asp

Ser

Gly

Gln

Phe

Gln Leu

Asp

Phe

2450

2455

2460

.AAC

CAT

GGC AAA

TTC

CTG

CCA

TTC

CAA

GGC

ATC

GCC

CAA GAT

CAA

GGC

7440

Tsn

Asp

Gly Lys

Phe

Leu

Pro

Phe

Glu

Gly

Ile

Ala

Ile Asp

Gln

Gly

2465

2470

2475

24ao

ACC

CTC

ACA CTC

ACC

TTC

CCA

AAT

CCA

TCT

ATG

CCG

CAG AAA

GCT

AAA

7483

Thr

Leu

Thr Leu

Ser

Phe

Pro

Asn

Ala

Ser

Met

Pro

Glu Lys

Gly

Lys

2485

249A

2495

CAA

AAA

ACT ATC

TTA

AAA

ACC

CTG

AAC

GAT

ATC

ATT

TTG CAT

ATT

CGC

7536

Gln

Ala

Thr Met

Leu

Lys

Thr

Leu

Asn

Asp

Ile

Ile

Leu His

Ile

Arg

2500

2505

2510

TAC

ACC

ATT .AAA

TAA

7551

Tyr

Thr

Ile Lys

• ee

2516

(2) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 47;

(i) ΑΗ-τ-Ηπ^^Ιη sekwencji:

(A) Długość: 2516 rmmokwayry (B) Typ: aminokwas ( C) Rodzaj nici :

(D ) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 47 (AcdN);

Cechy	Od	Do	Opis
Peptyd	1	2516	białka AcdC
Peptyd	89	1937	peptyd AcdCii
Fragment	89	100	S2 T-końcowy 3 SEK TR ID: 13 )
Fragment	284	299	3 SEK NR ID: 38 )
Fragment	554	563	(SEK NR ID: 17)
Fragment	1080	1092	(SEK NR ID: 23, 12/13)
Fragment	1385	1400	(SEK NR ID: 18)
Fragment	1478	1497	(SEK NR ID· 39)
Fragment	1620	1642	(SEK NR ID: 21; 19/23)
Fragment	1938	2516	( SEK NR ID: 41 )
Peptyd	1938	2516	peptyd AcdTiii
Fragment	2327	2345	( SEK NR ID: 42 )
Fragment	2398	2408	( SEK NR ID : 43 )

186 242

153

Mec 1

Asn

Glu

□er

Val

Lys

Glu

Ile

Pro

Aso 10'

Val

Leu

Lys

Ser

Gln 15

cys

Gly

Phe

Asn

Cys 20

Leu

Thr

Asp

Ile

Ser 25

His

Ser

Ser

Phe

Asn 30

Glu

Phe

Arg

Gln

GlM 35

Val

Ser

Glu

His

Leu 40

Ser

Trp

Ser

Glu

Thr 45

His

Asp

Leu

Tyr

His 50

Asp

Ala

Gln

GlM

Ala 55

Gln

L/s

Asp

Asn

Arg 60

Lau

Tyr

Tlu

Ala

Arg 65

Ile

Leu

Lys

Arg

Ala 70

Asm

Pro

GlM

Lau

Gln 75

Asn

Ala

Val

His

Lau 30

Ala

Ile

Leu

Ala

Pro 35

Asm

Ala

Tlu

Lau

Ile 90

Gly

Tyr

Asn

asm

GlM 55

Phe

Ser

Gly

Arg

Ala 100

Ser

Gln

Tyr

Val

Ala 105

Pro

Gly

Thr

Val

Ser 110

Ser

Mec

Phe

Ser

Pro 115

Ala

Ala

T/r

Leu

Thr 120

Glu

Leu

Tyr

Arg

Glu 125

Ala

Arg

Asn

Leu

His 130

Ala

Ser

Asp

Ser

Val 135

Tyr

Tyr

Leu

Asp

Thr 140

Arg

Arg

Pro

Asp

Lau 145

Lys

Ser

Mec

Ala

Leu 150

Ser

Gln

Gln

Ajsn

Mec 155

Asp

Ile

Glu

Leu

Ser 160

Thr

Lau

Ser

Leu

Ser 165

Asn

Glu

Leu

Lau

Lau 170

Glu

5er

Ile

Lys

Thr 175

Glu

Ser

Lys

Lau

Glu 130

Asn

Tyr

Thr

Lys

Val 135

Mec

Glu

Mec

Lau

Ser 190

Thr

Phe

Arg

Pro

Ser 195

Tly

Ala

Thr

Pro

Tyr 200

His

Asp

Ala

Tyr

Glu 205

Asm

Val

Arg

Glu

Val 210

Ile

Gln

_eu

Gln

Asp 215

Pro

Gly

Leu

Glu

Gln 220

Leu

Asn

Ala

Ser

Pro 225

Ala

Ile

Ala

Gly

Leu 23 0

Mec

His

Gln

Ala

Ser 235

Leu

Leu

Gly

Ile

Asn 240

Ala

Ser

Ile

Ser

Pro 245

Glu

Leu

Phe

Asn

Ile 250

Leu

Thr

Glu

Glu

Ile 255

Thr

Glu

Gly

Asn

Ala 2S0

Glu

Glu

Leu

Tyr

Lys 26S

Lys

Asm

Phe

Gly

Asn 270

Ile

Glu

Pro

Ala

Ser 275

Leu

Ala

Mec

Pro

Glu 280

Tyr

Leu

Lys

Arg

Tyr 235

Tyr

Asn

Leu

Ser

Asp 290

Glu

Glu

Leu

Ser

Gln 295

Phe

Ile

Gly

Lys

Ala 300

Ser

Asn

Phe

Gly

Gln 305

Gln

Glu

Tyr

Ser

Asm 310

Asn

Gln

Leu

Ile

Thr 315

Pro

Val

Val

Asn

Ser 320

Ser

Asp

Gly

Thr

Val 325

Lys

Val

Tyr

Arg

Ile 330

Thr

Arg

Glu

Tyr

Thr 335

Thr

Asn

Ala

Tyr

Gln 340

Mec

Asp

Val

Glu

Leu 3 45

Phe

Pro

Phe

Gly

Gly 350

Glu

Asn

Tyr

Arg

Leu 355

Asp

Tyr

Lys

Phe

L/s 3 60

Asn

Phe

Tyr

Asm

Ala 365

Ser

Tyr

Lau

Ser Ile Lys Leu Asn Asp Lys Arg Tlu Leu Val Arg Thr Glu Tly Ala

154

186 242

370

375

330

Pro

Cln

Val

Asn

Ile

Glu

Tyr

Ser

Ala

Asn

Ile

Thr

Leu

Asn

Thr

Ala

385

390

395

400

Asp

Ile

Ser

cln

Pro

Phe

Clu

Ile

Gly

Leu

Thr

Arg

Val

Leu

Pro

Ser

405

410

415

51-y

Ser

Trp

Ale

Tyr

Ale

Ale

Ala

Lys

Phe

Thr

Val

Glu

Glu

ryr

Asn

420

425

430

Gln

Tyr

Ser

Phe

Leu

Leu

Lys

Leu

.Asn

Lys

Ala

Ile

Arg

Leu

Ser

•Arg

433

440

445

Ala

Thr

Clu

Leu

Ser

Pro

Thr

Ile

Leu

Glu

Gly

Ile

Vel

Arg

Ser

Val

450

455

460

Asn

Leu

Gln

Lau

Asp

Ile

Asn

Thr

Asp

Vel

Leu

Cly

Lys

Val

Phe

Leu

465

470

475

480

Thr

Lys

Tyr

Tyr

Met

Gln

Arg

Tyr

Ale

Ile

His

Ala

Clu

Thr

Ala

Leu

485

490

495

Ile

Leu

Cys

Asn

Ala

Pro

Ile

Ser

Gln

Arg

Ser

Tyr

Asp

Asn

Gin

Pro

500

505

510

Ser

Gln

Phe

Asp

Arg

Lau

Phe

Asn

Thr

Pro

Leu

Leu

Asn

Gly

Gln

Tyr

515

520

525

Phe

Ser

Thr

Cly

Asp

Glu

Glu

He

Asp

Leu

Asn

Ser

Cly

Ser

Thr

Gly

530

535

540

Asp

Trp

Arg

Lys

Thr

Ile

Leu

Lys

Arg

Ale

Phe

Asn

Ile

Asp

Asp

Val

545

550

555

560

Ser

Lau

Phe

Arg

Leu

Lau

Lys

He

Thr

Asp

His

Asp

Asn

Lys

Asp

Cly

565

570

575

Lys

Ile

Lys

Asn

Asn

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Asn

Leu

Tyr

Ile

Gly

Lys

580

585

590

Leu

Lau

Ale

Asp

Ile

His

Gln

Leu

Thr

Ile

Asp

Clu

Leu

Asp

Leu

Leu

595

600

605

Leu

Ile

Ala

Vel

Cly

Glu

Gly

Lys

Thr

Asn

Leu

Sec

Ala

Ile

Ser

Asp

610

615

620

Lys

Gln

Leu

Ale

Thr

Leu

Ile

Arg

Lys

Leu

Asn

Thr

Ile

Thr

Ser

Trp

625

630

535

640

Leu

His

Thr

Gin

Lys

Trp

Ser

Vel

Phe

Cln

Leu

Phe

Ile

Mec

Thr

Ser

645

650

655

Thr

Ser

Tyr

Asn

Lys

Thr

Leu

Thr

Pro

Glu

Ile

Lys

Asn

Leu

Leu

Asp

660

665

670

Thr

Val

Tyr

His

cly

Leu

cln

Cly

Phe

Asp

Lys

Asp

Lys

Ale

Asp

Leu

675

680

685

Leu

His

Val

Met

Ale

Pro

Tyr

Ile

Ala

Ale

Thr

Leu

Gln

Leu

Ser

Ser

690

695

700

Clu

Asn

Val

Ala

His

Ser

VAl

Leu

Leu

Trp

Ala

Asp

Lys

Leu

Gln

Pro

705

710

715

720

cly

Asp

Gly

Ale

Met

Thr

Ala

Glu

Lys

Phe

Trp

Asp

Trp

Leu

Asn

Thr

725

730

735

Lys

Tyr

Thr

pro

Gly

Ser

Ser

Clu

Ala

val

Glu

Thr

Gln

Glu

His

Ile

740

745

750

186 242

155

Val

Gln Tyr Cys 735

Gln

Ala

Leu

Ala 760

Gln

Leu

Mac

Val 765

Tyr

His

Ser

Thr

Gly Ile Asn

Glu

Asn

Ala

Phe

Arg

Leu

Phe

Val

Thr

Lys

Pro

Glu

770

775

780

Met

Phe Gly Ala

Ala

Thr

Gly

Ala

Ala

Pro

Ala

His

Asp

Ala

Leu

Ser

735

790

795

300

Leu

Ile Mec Leu

Thr

Arg

Phe

Ala

Asp

Trp

Val

Asn

Ala

Leu

Gly

Glu

305

310

3l5

Lys

Ala Ser Ser

Val

Leu

Ala

Ala

Phe

Glu

Ala

Asn

Ser

Leu

Thr

Ala

320

325

330

Glu

Gln Leu Ala

Asp

Ala

Met

Asn

Leu

Aso

Ala

Asn

Leu

Lau

Leu

Gln

335

340

345

Ala

Ser Ile Gln

Ala

Gln

Asn

His

Gln

His

Leu

Pro

Pro

Val

Thr

Pro

850

855

860

Glu

Asn Ala Phe

Ser

Gys

Trp

Thr

Ser

Ile

Asn

Thr

Ile

Leu

Gln

Trp

365

370

375

330

Val

Asn Val Ala

Gln

Gln

Leu

Asn

Val

Ala

Pro

Gln

Gly

Val

Ser

Ala

385

890

395

Leu

Val Gly Leu

Asp

Tyr

Ile

Gln

Ser

Met

Lys

Glu

Thr

Pro

Thr

Tyr

900

905

910

Ala

Gln Trp Glu

Asn

Ala

Ala

Gly

Val

Leu

Thr

Ala

Gly

Lau

Asn

Ser

915

920

925

Gln

Gln Ala Asn

Thr

Leu

His

Ala

Phe

Leu

Asp

Glu

Ser

Arg

Ser

Ala

930

935

940

Ala

Leu Ser Thr

Tyr

Tyr

Ile

Arg

Gln

val

Ala

Lys

Ala

Ala

Ala

Ala

945

950

955

960

Ile

Lys Ser Arg

Asp

Asp

Lau

Tyr

Gln

Tyr

Leu

Leu

Ile

Asp

Asn

Gln

965

970

975

Val

ser Ala Ala

Ile

Lys

Thr

Thr

Arg

Ile

Ala

Glu

Ala

Ile

Ala

Ser

980

935

990

Ile

Gln Leu Tyr

Val

Asn

Arg

Ala

Leu

Glu

Asn

Val

Glu

Glu

Asn

Ala

995

1000

1005

Asn

Ser Gly Val

Ile

Ser

Arg

Gln

Phe

Phe

Ile

Asp

Trp

Asp

Lys

Tyr

1010

1012

1020

Asn

Lys Arg Tyr

Ser

Thr

Trp

Ala

Gly

Val

Ser

Gln

Leu

Val

Tyr

Tyr

1025

1030

1035

1040

Pro

Glu Asn Tyr

Ile

Asp

Pro

Thr

Met

Arg

Ile

Gly

Gln

Thr

Met

1045

1050

1055

Met

Asp Ala Leu

Leu

Gln

ser

Val

Ser

Gln

Ser

Gln

Leu

Asn

Ala

Asp

1060

1065

107C

Thr

Val Glu Asp

Ala

Phe

Met

Ser

Tyr

Lau

Thr

Ser

Phe

Glu

Gln

Val

1075

1080

1085

Ala

Asn Leu Lys

Val

Ile

Ser

Ala

Tyr

His

Asp

Asn

Ile

Asn

Asn

Asp

1090

1095

1100

Gln

Gly Leu Thr

Tyr

Phe

Ile

Gly

Lau

Ser

Glu

Thr

Asp

Ala

Gly

Glu

1105

1110

1115

1120

Tyr

Tyr Tro Aro

Ser

Val

Asp

His

Ser

Lys

Phe

Asn

Asp

Gly

Lys

Phe

1125

1130

113 5

156

186 242

Ula

Ula

Asn

Ula Trp 1140

Ser

Clu

Trp

His Lys 1145

Ha

Usp

cys

Pro He 115 0

Asn

Pro

Tyr

Lys

Ser Thr

ii·

Urg

Pro

Val Ile

Tyr

Lys

Ser

Arg lsu

Tyr

1155

11ó0

1165

Leu

Leu

Trp

Leu Clu

Cln

Lys

Clu

Ile Thr

Lys

Cln

Thr

Cly Usn

Ser

1170

1175

1130

Lys

Usp

Cly

Tyr Cln

Thr

Clu

Thr

Asp Tyr

Urg

Tyr

Clu

Lau Lys

Leu

1185

1190

1195

1200

Ula

His

Ila

Arg Tyr

Usp

Cly

Thr

Trp usn

Thr

Pro

ii·

Thr Phe

Asp

1205

1210

1213

Val

Usn

Lys

Lys Ile

Ser

Glu

Leu

Lys Leu

Clu

Lys

Asn

Arg Ala

Pro

1220

1225

1230

Cly

Leu

Tyr

cys Ula

Cly

Tyr

Cln

Cly Clu

Asp

Thr

Leu

Lau Val

Mec

1235

1240

1245

Phe

Tyr

Usn

Cln Cln

Usp

Thr

Lsu

Usp ser

Tyr

Lys

Usn

Ala Ser

Mec

1250

1255

1260

Gln

Cly

Leu

Tyr Ile

Phe

Ula

usp

Mat Ala

Ser

Lys

Usp

mcc Thr

Pro

1265

1270

1275

1280

Clu

Cln

Ser

Asn Val

Tyr

Arg

Asp

Asn Ser

Tyr

Cln

Cln

Phe Usp

Thr

1285

1290

1295

Asn

Asn

Val

Arg Urg

Val

Asn

Asn

Arg Tyr

Ala

Clu

Usp

Tyr Clu

Ha

1300

1305

1310

Pro

Ser

Ser

Val Ser

Ser

Arg

Lys

usp Tyr

Cly

Trp

Cly

Asp Tyr

Tyr

1315

1320

1325

Leu

Ser

Met

Val Tyr

Usn

Gly

Usp

Ile Pro

Thr

Hle

Asn

Tyr Lys

Ala

1330

1335

1340

Ala

Ser

Ser

Asp Leu

Lys

Ile

Tyr

Ile ser

Pro

Lys

Leu

Arg Hle

Hle

1345

1J50

1355

1360

His

Usn

Cly

Tyr Clu

Cly

Cln

Lys

Arg Asn

Cln

Cys

Asn

Leu Met

Asn

1365

1370

1375

Lys

Tyr

Cly

Lys Leu

Cly

Asp

Lys

Phe Ile

Val

Tyr

Thr

ser Leu

Cly

1380

1385

1390

val

Usn

Pro

Asn Usn

Ser

Ser

Usn

Lys Leu

Mat

Phe

Tyr

Pro Val

Tyr

1395

1400

1405

Cln .

Tyr .

Ser

Cly Asn

Thr

Ser

Cly

Leu Asn

Gln

Gly

Urg

Leu Lau

Phe

1410

1415

1420

His

Urg

Usp

Thr Thr

Tyr

Pro

Ser

Lys Val

Clu

Ala

Trp

Ila Pro

Cly

1425

1430

1435

1440

Ala

Lys

ura

Ser Leu

Thr

Asn

Cln

Asn Ala

Ula

Ile

Cly

Usp Usp

Tyr

1445

1450

1455

Ala

Thr

Usp

Ser Leu

Asn

Lys

Pro

Asp Asp

Leu

Lys

Cln

Tyr He

Pha

1460

1465

1470

Met

Thr

Usp

Ser Lys

Gly

Thr

Ula

Thr Asp

Val

Ser

Cly

Pro Val

Clu

1475

1480

1485

Ile

lsn

Thr

Ula Ile

Ser

Pro

Ula

Lys Val

Cln

Ile

Ile

Val Lys

Ula

1490

1495

1500

Cly Cly Lys Clu Cln Thr Phe Thr Ula Usp Lys Usp Val Ser Ile Cln

186 242

157

1565	1510	1515	1520
Pro Ser Pro	Jer Phe Asp Clu	Mer Asn Tyr Gln Pha	Asn Ala Lau Glu
	1525	1530	1535
Ile Asp Cly	Ser Gly Lau Asn	Phe Ile Asn Asn Ser	A.la Ser Ile Asp
	1540	154?	1550
'.'al Thr Phe	Thr Ala Phe Ala	Glu Asp Gly Arg Lys	Leu Gly T/r Glu
1555	1560	1565
Sec Phe Ser	Ila Pro 7al Thr	Leu L/s Tal Ser Thr	ASS Asn Ala Leu
x573	1575 1580
Thr Leu His	His Asn Glu Asn	Gly Ala Gln Τ'- Mec	cln Trp Gln Ser
1535	1590	1595	1600
T/r Arg Thr	Arg Leu Asn Thr	Leu Phe Ala Arg Gln	Leu Vai Ala Arg
	1605	1610	1615
Ala Thr Thr	Gly Ile Asp Thr	Ile Leu Sar Met Glu	Thr Gln Asn Ile
	1620	1625	1630
Cln Glu Pro	Gln Leu Gly Lys	Gly Phe Tyr Ala Thr	Phe Val Ile Pro
1635	1640	1645
Pro T/r Asn	Leu Ser Thr His	Gly Asp Glu Arg Trp	Phe Lys Leu T/r
1550	1655 1660
Ile L/s His	Vai ’/ai Asp Asn	Asn Ser His rie Ile	T/r Ser Cly Cln
1665	1670	1675	1630
Leu Thr Asp	Thr Asn Ile Asn	Ile Thr Leu Phe Ile	Pro Leu Asp Asp
	1685	1690	1695
Val Pro Leu	Asn Gln Asp Tyr	His Ala Lys Val Tyr	Mec Thr Phe Lys
	1700	1705	1710
L/s Ser Pro	Ser Asp Gly Thr	Trp Trp Cly Pro His	Phe val Arg Asp
1715	1720	1725
Asp L/s Gly	Ile Val Thr Ile	Asn Pro Lys Ser Ile	Leu Thr His Phe
1730	1735 1740
Glu Ser Val	Asn Val Leu Asn	Asn Ile Ser Ser Glu	Pro Mec Asp Phe
1745	1750	1755	1760
Ser Gly Ala	Asn Ser Leu T/r	Phe Trp Glu Leu Phe	T/r T/r Thr Pro
	1765	1770	1775
Met Leu Vai	Ala Gln Arg Leu	Leu His Glu Gin Asn	Phe Asp Glu Ala
	1780	1785	1790
Asn Arg Trp	Leu Lys Tyr Val	Trp Ser Pro Ser Gly	Tyr Ile vai His
17 ?5	1800	1305
Gly Gln Ile	Gln Asn Tyr Gln	Trp Asn val Arg Pro	Leu Leu Glu Asp
1310	1815 1320
Thr ser Trp	Asn Ser Asp Pro	Leu Asp ser Val Asp	Pro Asp Ala Val
1325	1830	1335	1340
Ala cln His	Asp Pro Mec His	T/r Lys val ser Thr	Phe Mec Arg Thr
	184S	1350	1855
Leu Asp Leu	Leu Ile Ala Arg	Gly Asp His Aia Tyr	Arg Gln Leu Glu
	1860	1365	1870
Arg Asp Thr	Leu Asn Glu Ala	Lys Mec Trp T/r Mec	Gln Ala Leu His
1375		1880	1335

158

186 242

Leu Uy ig30

Asp

Lys

Pro

Tyr Leu 1395

Pro

Leu

Ser

Thr Thr 1900

Trp

Ser

Asp

Pro

Arg Leu

Asp

Arg

Ala

Ale Asp

Ile

Thr

Thr

Tln Asn

Ala

His

Asp

1905

1910

191:

1920

Ser

Ala Ile

Val

Ala

Leu

Arc Tln

Asn

Ile

Pro

Thr Pro

Ala

Pro

Leu

1925

1930

3

1935

Ser

Leu Arg

Ser

A La

Asn

Thr Leu

Thr

Asp

Leu

Phe Leu

Pro

Gln

Ile

1940

1945

1950

Asn

Glu Val

Met

Met

Asn

Tyr Trp

Cln

Thr

Leu

Ala Gln

Arg

Val

Tyr

1955

1960

1965

Asn

Leu Arg

His

Asn

Leu

Ser Ile

Asp

Cly

Gln

Pro Leu

Tyr

Leu

Pro

1970

1975

1980

Ele

Tyr .Ala

Thr

Pro

Ala

Asp Pro

Lys

Ale

Leu

Leu Ser

Ala

Ala

VAl

1985

1990

1995

2000

Ala

Thr Ser

Gln

Cly

Gly

Cly Lys

Leu

Pro

Clu

Ser Phe

Met

ser

Leu

2005

2010

2015

Trp

Arg Phe

Pro

His

Met

Leu clu

Asn

Ale

Arg

Gly Met

Val

Ser

cm

2020

2025

2030

Leu

rhr Glu

Phe

Oly

Ser

Thr Leu

cln

Asn

Ile

Ile Glu

Arg

Gln

Asp

2035

2040

2045

Ale

Clu Ale

Leu

Asn

Ala

Leu Leu

Gln

Asn

Cln

Ala Ala

Glu

Leu

Ile

2050

2055

2060

Leu

Thr Asn

Leu

Ser

Ile

Gln Asp

Lys

Thr

Ile

Glu Glu

Leu

Asp

Ala

2065

2070

2075

2080

Glu

Lys Thr

Vel

Leu

Clu

Lys Ser

Lys

Ale

Tly

Ala Cln

Ser

Arg

Phe

2085

2090

2095

Asp

Ser Tyr

Gly

Lys

Leu

Tyr Asp

Clu

Asn

Ile

Asn Ala

Cly

Glu

Asn

2100

2105

2110

Cln

Ala Met

Thr

Leu

Arg

Ale Ser

Ala

Ala

Gly

Leu Thr

Thr

Ale

VAl

2115

2120

2125

Cln

Ala Ser

Arg

Leu

Ale

Gly Ale

Ale

AlA

Asp

Leu Vel

Pro

Asn

Ile

2130

2135

2140

Phe

Gly Phe

Ale

Gly

Gly

cly Ser

Arg

Trp

Cly

Ale Ile

Ale

Glu

Ale

2145

2150

2155

2160

Thr

Cly Tyr

Vel

Met

Glu

Phe Ser

Ala

Asn

VAl

Met Asn

Thr

Glu

Ale

2165

2170

2175

Asp

Lys Ile

Ser

Cln

Ser

Clu Thr

Tyr

Arg

Arg

Arg Arg

Gln

Clu

Trp

2180

2185

2190

Clu

Ile Gln

Arg

Asn

Asn

Ale Clu

Ale

Glu

Leu

Lys Gln

Ile

Asp

Ale

2195

2200

2205

Cln

Leu Lys

Ser

Leu

Ala

Val Arg

Arg

Glu

Ala

Ala Val

Leu

Gln

Lys

2210

2215

2220

Thr

Ser Leu

Lys

Thr

Cln

Gln Glu

cln

Thr

Cln

Ser Gln

Leu

Ale

Phe

2225

2230

2235

2240

Leu

Cln Arg

Lys

Phe

Ser

Asn Gln

Ala

Leu

Tyr

Asn Trp

Leu

Arg

Cly

2245

2250

2255

•Arg

Leu Ala

Ala

Ile

Tyr

Phe Gln

Phe

Tyr

Asp

Leu Ala

Val

Ala

Arg

2260

2265

2270

159

186 242

cys

Leu

Mec 227

Ala 5

Glu

Gln

Ala

Tyr Arg 2230

Trp

Glu

Leu

Asn Asp 2235

Asp

Ser

Ala

Arg

Phe

I la

Lys

Pro

Gly

Ala Trp

Gln

Gly

Thr

Tyr Ala

Gly

Leu

2290

2255

2300

Leu

Ala

Gly

Glu

Thr

Lau

Mec

Leu Ser

Leu

Ala

Gln

Mec Glu

Asp

Ala

230

c

2310

2315

2320

His

Leu

Lys

Arg

-Asp

Lys

Arg

Ala Leu

Glu

Val

Glu

Arg Thr

Val

Ser

2325

2330

2335

Leu

Ala

Giu

Val

Tyr

Ala

Gly

Lau Pro

Lys

Asp

Asn

Gly Pro

Phe

Ser

2340

2345

2350

Leu

Ala

Gln

Glu

Ile

Asp

Lys

Leu Val

Ser

Gln

Gly

Ser Gly

Ser

Ala

2355

2360

2365

Gly

Ser

Gly

Asn

Asn

Asn

Leu

Ala Phe

Gly

Ala

Gly

Thr Asp

Thr

Lys

2370

2375

2380

Thr

Ser

Leu

Gln

Ala

Sar

Val

Ser Phe

Ala

Asp

Lau

Lys Ile

Arg

Glu

23Θ5

2390

2395

240ę

Asp

Tyr

Pro

Ala

Ser

Leu

Gly

Lys Ile

Arg

Arg

Ile

Lys Gln

Ile

Sar

2405

2410

2415

Val

Thr

Leu

Pro

Ala

Leu

Leu

Gly Pro

Tyr

Gln

Asp

Val Gln

Ala

Ha

2420

2425

2430

Leu

Ser

Tyr

Gly

Asp

Lys

Ala

Gly Leu

Ala

Asn

Gly

Cys Glu

Ala

Leu

2435

2440

2445

Ala

Val

Ser

His

Gly

Mec

Asn

Asp Ser

Gly

Gln

Phe

Gln Leu

Asp

Phe

2450

2455

2460

Asn

Asp

Gly

Lys

Phe

Leu

Pro

Phe Glu

Gly

Ile

Ala

Ile Asp

Gln

Gly

2465

2470

2475

2480

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Phe

Pro

Asn Ala

Ser

Mec

Pro

Glu Lys

Gly

Lys

2485

2490

2495

GlM

Ala

Thr

Mac

Leu

Lys

Thr

Leu Asn

Asp

Ile

Ile

Leu His

Ile

Arg

2500

2505

2510

Tyr

Thr

Ile

Lys

2516

( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 48;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 5547 par zasad ( B ) Typ: kwas nukleinowy ( C ) Rodzaj nici: podwójna ( D ) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA ( genomowa ) ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 48 (TcdAii obszar kodowania);

CTG lSu t

ATA Ile

GGC Gly

TAT Tyr

AAC Asn 5

•AAT Asn

CAA Gln

TTT Phe

AGC Ser

GGT Gly 10

AGA GCC

AGT Ser

CAA Gln

TAT Tyr 15

GTT Val

48

Arg

Ala

GCC

CCG

GGT

ACC

GTT

TCT

TCC

ATG

TTC

TCC

CCC

GCC

GCT

TAT

TTC

ACT

9 6

Aia

Pro

Gly

Thr 20

Val

Sar

Ser

Mec

Phe 25

Ser

Pro

Ala

Ala

Tyr 30

Leu

Thr

160

186 242

TTA Alu

AAA Leu

TTT Ayr 35

Trg

T.-uA Tłu

taT Tia

— Grg

GGA Asn 40

TAT LeU

ATA His

TAC Tla

GTA

TCA Gsp 45

AAA Ser

TCA Val

TAT Ayr

Hi

TTA

ACG

TTC

TAA

ATA

TTT

ATA <— k 'm.

GGG

TAA

CTT

TAT

ACA

TTA

CAG

19 2

Ayr

Leu 50

Asp

Chr

Grg

Grg

Pro 55

Asp

Leu

Lys

Ser

Mec 60

Gla

Leu

Ser

A i n

—aa

TCC

TCT

TTC

CCT

TCC

TAC

AAA

TAC

CAA

TCT

CAA

GAA

TG.T

i

240

Tln o 5

Tsn

Mec

Asp

Iie

Alu 10

Leu

Ser

Ahr

Leu

ser 75

Leu

Ser

Tsn

Tlu

Leu 3 A

ACT

TAG

TAT

TTA

CAA

/ / / .-ΧΛΛ

TAA

TAT

TCT

ATT

ATA

TTG

•AGA

CCA

CAC

ΛΛΛ

233

Leu

Leu

Alu

Ser

Ile 85

Lys

Ahr

Alu

Ser

Lys 90

Leu

Tlu

Tsn

Tyr

Chr 95

L'y 3

TTT

TCT

TTC

TTT

AAA

CAA

CAC

TTC

ATA

AAC

CAA

TTC

TAC

GAT

AAA

TTC

3 3 5

Val

Mec

TIu

Mec 100

Leu

Ser

Chr

Phe

Grg 105

Pro

Ser

Tly

Gla

Chr 110

Pro

Ayr

ATA

TCA

TAA

CCC

TTA

CCC

TAA

ATA

TTA

TTA

TAC

ACT

ACC

AAG

TCC

AAC

334

His

Asp

Tla 115

Ayr

Alu

Gsn

v-i

Grg 120

Tlu

Val

Ile

Tin

Leu 125

Tln

Asp

Pro

Tac

AAA

TTT

AAC

AAA

GGT

GAG

CAC

AAT

AAG

CTA

TAA

TAT

TAT

TCT

GAT Χ-Λ 1

432

Tly

Leu 130

TIu

Tin

Leu

Tsn

Gla 135

Ser

Pro

Ala

Ile

Tla 140

Tly

Leu

Met

His

ATC

TAC

CAA

ACA

TAT

ATA

TAA

TCA

TAA

TCG

CCA

AAT

AAC

TGT

AAA

TAA

480

Tin 145

Tia

Ser

Leu

Leu

Tly 150

Ile

Asn

Gla

Ser

Ile 155

Ser

Pro

Tlu

Leu

Phe 160

TAC

TCA

AAT

CAT

TCT

TCG

ATA

CAA

TGA

TAA

ATA

TCC

TGT

TCG

AAA

CTA

528

Tsn

Ile

Leu

Chr

TIu 165

Tlu

Ile

Chr

Tlu

Tly 170

Gsn

Gla

Tlu

Tlu

Leu 175

Ayr

TCT

tan

CTC

TAA

TGA

CCA

GAC

TCC

AAT

TCA

AAC

TAT

TAC

CAG

AAT

TGT

57 6

Lys

Lys

A.sn

Phe 180

Tly

ten

Ile

Tlu

Pro 185

Cla

Ser

Leu

Cla

Mec 190

Pro

Alu

TTA

A AAł Lii

CTC

ATA

ACA

ATA

GAC

TAC

GTA

TGC

TGC

TGA

ACA

CTA

ACT

T/T

624

Ayr

Leu

Lys 195

Grg

Ayr

Ayr

Tsn

Leu 200

Ser

Asp

Tlu

Tlu

Leu 205

Ser

Tln

Phe

TTC

TTA

CCC

TAA

CGA

GGA

TAA

GGT

ACG

ACT

TGC

ACC

TTA

AGA

TAA

ACC

672

Ile

Tly 210

Lys

Cla

Ser

ten

Phe 215

Tly

Tin

Tin

Tlu

Ayr 220

Ser

Gsn

G:n

Tln

ATA

CAA

CAA

AAT

TAC

TAA

GGA

TTC

CTA

TTC

TTC

GAT

TCA

TAG

TAC

CCC

720

Lau 225

Ile

Chr

Pro

Val

Vsl 230

Gsn

Ser

Ser

Asp

Tly 235

Ahr

Val

Lys

Val

Ayr 240

CTG

TAA

TCA

ATA

TCA

TCA

GCG

CAA

GGA

TAA

AGA

CGG

CCT

TCA

TCG

TCT

768

Trg

Ile

Chr

Grg

Alu 245

Tyr

Thr

Ahr

Tsn

Ala 250

Ayr

Tin

Mec

Asp

Val 255

Tlu

CCC

TAA

AAA

TAA

ATT

TGA

TCT

CCA

CCA

ATG

TAT

TGA

ACC

AGT

TAA

TAC

315

Leu

Phe

Pro

Phe 260

Tly

Tly

Tlu

Tsn

Tyr 265

Grg

Leu

Gsp

Ayr

Lys 270

Phe

Lys

.ngc

TAA

CTC

AGA

TAA

TAA

CGA

TAT

AAA

CCA

ATT

TAG

GTA

TGA

TGG

CAT

364

Tsn

Phe

Ayr 275

Tsn

Cla

Ser

Tyr

Leu 280

Ser

Ile

Lys

Leu

Tsn 285

Gsp

Lys

Grg

>τ/.·λ«Λ

TAA

ATC

TCA

TTA

TTA

TAA

AAA

ATA

TAA

ATA

CCG

TCG

AAA

AAA

912

A .Lu

Leu 290

V.al

Trg

Chr

Tlu

Tly 295

Tla

Pro

Tin

Vsl

Gsn 300

Ile

Alu

Ayr

Ser

TAT

gna

TCA

TAT

TAT

TCA

TAA

AA f-D i

TTC

TTA

CTA

ATA

AAC

TTG

TTC

9 60

Tl a

Tsn

Ile

Thr

Leu

Tsn

Thr

Ala

Asp

11 s

Ser

Tln

Pro

Phe

Tlu

Ile

186 242

161

05

L0

20

Gly

CTC Leu

ACA Thr

CGA Arg

GTA Va l 325

CTT Leu

CCT Pro

TCC Ser

GGT Gly

TCT Ser 330

TGG Trp

GCA Ala

TAT Tyr

GCC Ala

GCC Aia 335

Ala

1003

AAA

TTT

1 ACC

GTT

GAA

GAG

TAT

AAC

CAA

TAC

TCT

TTT

CTG

CTA

AAA

CTT

1056

Lys

Phe

Thr

Vai 340

Glu

Glu

T/r

Asn

Gln 345

Tyr

Ser

Phe

Lau

Leu 350

Lys

Leu

AAC

AAG

GCT

ATT

CGT

CTA

TCA

CGT

GCG

ACA

GAA

TTG

TCA

CCC

aCG

ATT

1104

Asn

Lys

Ala 355

Ile

.Arg

Leu

Ser

Arg 350

Ala

Thr

Glu

Leu

Ser 365

Pro

Thr

Ile

CTC

GAA

GGC

ATT

GTG

CGC

AGT

GTT

AAT

CTA

CAA

CTG

GAT

ATC

AAC

ACA

i i 5 2

Leu

Glu 370

Gly

Iie

Val

Arg

Ser 375

Val

Asn

Leu

Gln

Leu 3ao

Asp

Ile

.Asn

Thr

GAC

GTA

TTA

GGT

AAA

GTT

TTT

CTG

ACT

AAA

TAT

TAT

ATG

CAG

CGT

TAT

1200

Asp 385

Val

Leu

Gly

Lys

Val 390

Phe

Leu

Thr

Lys

Tyr 395

Tyr

Mec

Gin

Arg

Tyr 400

GCT

ATT

CAT

GCT

GAA

ACT

GCC

CTG

ATA

CTA

TGC

AAC

GCG

CCT

ATT

TCA

1248

Ala

Ile

His

Aia

Glu 405

Thr

Ala

Leu

Ile

Leu 410

cys

Asn

Ala

Pro

Ile 415

Ser

CAA

CGT

TCA

TAT

GAT

AAT

CAA

CCT

AGC

CAA

TTT

GAT

CGC

CTG

TTT

AAT

1296

Gln

Arg

Ser

Tvr 420

Asp

Asn

Gln

Pro

Ser 425

Gln

Phe

Asp

Arg

Leu 430

Phe

Asn

ACG

CCA

TTA

CTG

AAC

gGA

CAA

TAT

TTT

TCT

ACC

GGC

GAT

GAG

GAG

ATT

1344

Thr

Pro

Leu 435

Leu

Asn

Gly

Gin

Tyr 440

Phe

Ser

Thr

Gly

Asp 445

Glu

Glu

Ile

GAT

TTA

AAT

TCA

GGT

AGC

ACC

GGC

GAT

TGG

CGA

AAA

ACC

ATA

CTT

AAG

1392

-Asp

Leu 450

Asn

Ser

Gly

Ser

Thr 455

Gly

tep

Trp

Arg

Lys 460

Thr

Ile

Leu

Lys

CGT

GCA

TTT

AAT

ATT

GAT

GAT

GTC

TCG

CTC

TTC

CGC

CTG

CTT

AAA

ATT

1440

Arg 4 85

Ala.

Phe

Asn

Ile

Asp 470

Asp

Val

Ser

Leu

Phe 475

Arg

Leu

Lau

Lys

Ile 480

ACC

GAC

CAT

GAT

AAT

AAA

GAT

GGA

AAA

ATT

AAA

AAT

.AAC

CTA

AAG

AAT

1488

Thr

Asp

His

tep

Asn 485

Lys

Asp

Gly

Lys

Ile 490

Lys

Asn

ten

Leu

Lys 495

.Asn

CTT

TCC

AAT

TTA

TAT

ATT

GGA

AAA

TTA

CTG

GCA

GAT

ATT

CAT

CAA

TTA

1536

Leu

Ser

Asn

Leu 500

Tyr

Ile

Gly

Lys

Leu 505

Leu

Ala

Asp

Ile

His 510

Gln

Leu

ACC

ATT

GAT

GAA

CTG

GAT

TTA

TTA

CTG

ATT

GCC

GTA

GGT

GAA

GGA

AAA

1584

Thr

Ile

Asp 515

Clu

Leu

Asp

Leu

Lau 520

Leu

Ile

Ala

Val

Gly 525

Glu

Gly

Lys

ACT

AAT

TTA

TCC

GCT

ATC

AGT

GAT

AAG

CAA

TTG

GCT

ACC

CTG

ATC

AGA

1632

Thr

Asn 530

Leu

Ser

Ala

Ile

Ser 535

Asp

Lys

Gln

Leu

Ala 540

Thr

Leu

Ile

Arg

AAA

CTC

.AAT

ACT

ATT

ACC

AGC

TGG

CTA

CAT

ACA

CAG

AAG

TGG

AGT

GTA

1680

Lys 545

Lau

Asn

Thr

Ile

Thr 550

Ser

Trp

Leu

His

Thr 555

Gln

Lys

Trp

Ser

Val 560

ttc

CAG

CTA

TTT

ATC

ATG

ACC

TCC

ACC

AGC

TAT

AAC

AAA

ACG

CTA

ACG

1728

?he

Gln

Leu

Phe

Ile

Mec

Thr

Ser

Thr

Ser

Tyr

Asn

Lys

Thr

Leu

Thr

565 570 575

CCT

GAA

ATT

AAG

AAT

TTG

CTG

u AT

ACC

GTC

TAC

CAC

GGT

TTA

CAA

GGT 1/76

Pro

Glu

Ile

Lys 580

Asn

Leu

Leu

Asp

Thr 585

Val

Tyr

His

Gly

Leu 590

Gln

Gly

TTT

gAT

AAA

GAC

AAA

GCA

GAT

TTG

CTA

CAT

GTc

ATG

GCG

CCC

TAT

ATT 1324

162

186 242

Phe

Asp

Lys 252

.Asp

Lys

Tla

Asp

Leu 6 00

Leu

His

Vsl

Met

Tla 60 5

Pro

Tyr

Ile

GCG

GCC

TCC

TTG

c.-A

—A *

.

GAT

ATT

GTC

OG ·—

CTC

TCG

GTT

CTC

3~2

Tla

Ala 6 10

Thr

Lau

Gln

Leu

Ser 615

5er

Glu

Tsn

Vsl

Tla 620

His

ser

Vsl

Leu

3 77

TG.

GCT

GTT

A-.G

TTT

CTG

CCC

gog

GAG

ioy

GCT

ATG

TCT

GG Λ

GTT

1.520

Leu

Trp

Tla

Tsp

Lys

Leu 6 3 0

G Ln

Pro

Gly

Tsp

Gly 63 5

Ala

Met

Thr

Tla

G l u 6 4 0

A-A

TTC

TGG

GTC

TGG

TTG

.ATT

TCT

ATG

TTT k Λ i

CCG

GGT

TCT

TCG

GAT

3ÓD

— 4 ·=>

Phe

Trp

Tsp

Trp 64 5

Leu

Tsn

Thr

Lys

Tyr 650

Thr

Pro

Gly

Ser

Ser 62 2

Glu

077

GTT

GTT

tCg

CTG

GAT

CTT

TTC

GTT

CTG

TTT

TGT

CTG

GCT

CTG

'ggT

2016

Ala

Cal

Glu

Thr 660

Gln

Glu

His

Ile

Cal 6 55

Gln

Tyr

Cys

Gln

Aia 67 0

Leu

Tla

( .“-“V

TTG

GTT

TTG

GTT

TTC

CTT

TCC

TCC

Gcg

TTC

TTC

GTT

ATC

.CC

TTC

2064

. In.

Leu

Glu 575

Mec

Vsl

Tyr

His

Ser 630

Thr

Giy

Ile

Tsn

Glu 535

Tsn

Tla

Phe

777

GTA

-rvp»T

GTG

TcT

AAT

CCT

GTG

TTG

TTT

GGG

GCT

GCT

TCT

GGT

GCT

2112

Trg

Leu 6 9 0

Phe

Vsl

Thr

Lys

Pro 595

Glu

Met

Phe

Gly

Tla 700

Tla

Thr

Gly

Tla

UL kj

(CC

GCG

CTT

GTT

GCC

CTT

TCT

CTG

TTT

TTG

CTG

TCT

CGT

TTT

G( LJ

2160

Tia 7 05

Pro

Ala

His

Tsp

Ala 710

Leu

Ser

Leu

Ile

Met 715

Leu

Thr

Arg

Phe

.Ala 720

gtT

TGG

GTG

ATC

GcT

CTT

LAJU

GAT

AAT

GCG

TCC

TCG

GTG

CTT

GCG

GCT

2203

Tsp

Trp

V<sl

Tsn

Tla 725

Leu

Gly

Glu

Lys

Tla 730

Ser

Ser

Val

Leu

Ala 73 5

Tia

TTT

GAT

GCT

TTC

TCG

TTT

TCG

GCT

GTT

CTT

CTG

GCT

GTT

GCC

TTG

ATT

2256

?he

Glu

Tla

Tsn 740

Ser

Leu

Thr

Tla

Glu 745

Gln

Leu

Tla

Tsp

Tla 750

Met

Tsn

(T)

GTT

GCT

ATT

TTG

CTG

TTG

CTT

GCC

TGT

ATT

CTA

GCT

CTT

ATT

CTT

2304

Leu

Tsp

Tla 755

Tsn

Leu

Leu

Leu

Gln 760

Tla

Ser

Ile

Gln

Ala 765

Gln

ton

His

CTT

CTT

CTT

CCC

CCT

GTT

TCT

CCT

GTT

AAT

GCG

TTC

TCC

TGT

TGG

TCT

2352

Gin

His 770

Leu

Pro

Pro

Val

Thr 775

Pro

Glu

Tsn

-Tla

Phe 730

Ser

Cys

Trp

Thr

TCT

TTC

ATT

TCT

TTC

CTG

CAT

TGG

GTT

ATT

GTC

GCA

CAT

CTA

TTG

TTT

2400

Ser 735

Ile· -Tsn

Thr

Ile

Leu 790

Gln

Trp

Val

Tsn

Vsl 795

Tla

Gln

Gln

Leu

Asn 800

CTC

GCC

CCT

CTG

GGC

GTT

TCC

GCT

TTG

GTC

GGG

CTG

GTT

TTT

TTT

CTT

2443

Cal

Tla

Pro

Gln

Gly 805

Vsl

Ser

Tla

Leu

Val 810

Gly

Leu

top

Tyr

Ile 315

Gln

ta

TTG

AAT

GTG

TCT

CCG

TCC

TTT

GCC

CTG

TGG

GAT

ATC

GCG

GCT

CGC

2496

Ser

Mec

Lys

Glu 820

Thr

Pro

Thr

Tyr

Ala 825

Gln

Trp

Glu

ton

Tla 830

Tla

Gly

G 1 Λ

TTT

TCC

G cg GGG

kj(Jd

TTG

ATT

TCT

CTA

CTG

GCT

ATT

TCT

TTT

CTC

GCT

2544

Cal

Leu

Thr 335

Tla

Gly

Leu

Tsn

Ser 340

Gin

Gin

Tla

Tsn

Thr 345

Leu

His

Ala

TTT

» (tG

GTT

GTT

TCT

CGC

TGT

GCC

GCT

TTT

TGC

TCC

TTC

TTT

A TC I K

( G 1

2592

Phe

Leu 350

Tsp

Glu

Ser

-Arg

Ser 855

Ala

Tla

Leu

Ser

Thr 360

Tyr

TS , V

Ile

-Arg

'12.

GCG

G ~ C( —

ATG

GC.T

Lj((»

GGG

GCT

ATT

TGC

CGT

GTT

GTC

TTG

8 80 .A 4

2640»

Gln

vSl

Ala

Lys

Tl a

Tla 8A

Tla

.Ala

i le

Lys

Ser 375

.Arg

.Asp

Tsp

Leu

Tyr 330

186 242

163

Gln

Cyr

TCC Ltu

CCC Ltu

CCT I x a 835

GCC Asp

A_Ah Csn

* AG Gin

GCT /al

CCC □ 890

GMG Cla

GCC CIi

ACC Ile

L/T

CCC eep 8-95

CCC 213 8 cep

CCG

CCC

GGC

GAA

CCC

ACT

CCC

AGT

CCT

CCA

CTC

CAC

GTC

CAC

GGg

CGC 2“35

Crg

Ile

Ala

Glu 900

Cla

Il®.

CIi

Sap

Ilt 905

Gin

Ltu

Tyr

/al

Csn 910

Arg

Cla

CTC

GAT

.CCT

GTC

CCA

GAT

TAC

GGC

CAT

CCG

gGg

CTC

CCC

CCC

CCC

CAT 1 “ 3 -1’

L.t?u

Clu

Csn 515

/al

Clu

Glu

Asn

Cla 920

Csn

Sap

Gly

/al

Ilt 92.5

Crg

CnH

CTC

CTT

CCG

CAG

CGG

GCC

CAA

TAC

CAC

AAA

CGG

TAC

CGG

CGT

CCG

CGC 2332

re®

re® 930

Ilt

Csp

Crp

Csp

L/T 935

Cyr

Csn

L/s

crg

Typ 940

Sar

cer

Crp

Ala

CGC

GTT

CCT

CTC

CTC

CCT

CAC

CAC

CCG

GAA

CAG

TAC

CCT

CCC

GCC

CCC 2 880

Cl/ 945

/al

Ser

Cln

Ltu

/al 950

Cyr

Tyr

rro

Glu

Asn 955

Typ

Ile

Csp

rpo

eer 960

CCG

CCT

ACG

CGA

CAT

CCC

AAA

CCC

CCC

GCC

GGA

CTA

CCC

CAC

CCC

CTG 2928

Mac

Arg

Ilt

Gly

Cln

eer

Lys

Mec

Mec

Asp

CIi

Lau

Ltu

Cln

Stp

/al

965 970 575

CCC Sep

GAT CGC

CAT CTA ACC

CCC CCT

CCC eer 985

CCC GCA /al Glu

GAC Asp

CGC Cla

CCT re® 990

A TC Λ * G Muc

CCC Str

2 976

Gin

Ser

Gln 980

Leu

Csn

Cla

Csp

CAC

CTG

CCA

TCC

CTT

GCA

CCA

GCG

CGC

CAC GTT

TAA

GCT

CCT

ACC

GM Λ

3024

Cyr

Ltu

Ter

Sep

re®

Clu

Cln

/al

Cla

Asn Leu

Lys

/al

Ila

Sap

Ala

995

1000

1005

CCC

CAG

GAT

CAT

ACT

TAC

AAG

GAT

CAA

GGG GTG

ACG

CAC

TCT

CCC

GGA

3072

T/r

Hss

Csp

Asn

Ile

Csn

Csn

Csp

Gln

Gl/ Leu

Ter

Tyr

re®

Ila

Gly

1010

1015

1020

CTG

AGT

GAA

CGT

CAC

CGC

GGC

CTA

TAT

TAC TGG

GCG

ACT

CTC

CAT

CAC

3 120

Ltu

Ser

Clu

eer

Csp

Cla

Cly

Clu

Cyr

Tyr Tpp

Arg

Str

/al

Csp

Hst

1025

1030

1035

1040

CCT

TAC

CTC

TCG

GAG

CGT

AAA

CTG

GCG

GCT AAT

GCC

CGG

CGT

GAT

CGC

3168

StP

Lys

ree

Asn

Csp

Cl/

Lys

re®

Ala

Ala Asn

Ala

Crp

Sar

Clu

Crp

1045

1050

1055

CAT

CAA

CTT

GAT

CCT

CCA

CCT

TAC

CCT

CAC ACT

AGG

ACT

CCC

CGC

GCA

3216

Hss

Lys

Ile

Asp

Cys

rpo

Ila

Csn

rro

Tyr Lys

Sep

cer

Ile

Arg

rpo

1060

1065

1070

CTG

CTA

CTT

CTA

CCG

CCC

CCC

CAC

CCG

CTG TGG

CTC

GAA

CAA

CAG

GAG

3264

/al

Ile

Typ

Lys

Sep

Apg

Ltu

Cyr

Leu

Lau Trp

Leu

Clu

Cin

Lys

c lu

1075

1080

1085

CTG

CGG

CAA

GAG

CGA

CCA

TAC

CCT

CAA

CAC GGC

CAT

CCA

CCT

CAA

AGG

33 12

Ilt

eep

L/s

Gln

eer

Cl/

Asn

Ser

Lys

Csp Gly

Tyr

Cln

eer

Clu

eer

1090

1095

1100

CAT

CAT

CCT

CAT

CCA

CCC

CAA

CCG

CCG

CCC ATG

CGC

CCC

GAT

CGC

ACT

3 360

Csp

Tyr

Arg

Cyr

Glu

Lau

Lys

Lau

Ala

Hst Ile

Arg

Cyr

Csp

Cly

eer

1105

1110

1115

1120

CGG

ATT

ACC

GGA

ATC

CCC

CTT

CAC

CCC

CAC Aaa

AAA

ACA

CCG

GAG

CTA

3408

ypp

Csn

Ter

rro

Ila

cer

re®

Csp

/al

Csn Lys

Lys

Ilt

Sar

Clu

Ltu

1125

1130

1135

ATT

CTG

GAA

.TAA

CAC

AGA

GCG

CCC

GGA

CCC TAT

CGT

CCG

CGT

CAC

CAA

2 456

Lys

Leu

Glu

L/s

Asn

Arg

Cla

Pro

Gly

Lau Tyr

C/s

Tla

Gly

Tyr

Gln

1140

1145

1150

gGT

GAA

GAT

CGC

CTG

CCC

GTG

CCC

CCC CAC

GAA

CAA

GCG

ACA

CTA.

3504

Giy

Clu

Asp

cep

Ltu

Leu

/al

Mac

re®

Typ csn

Cln

Cin

Csp

eer

Lau

1155

1160

1165

164

186 242

» 't' ^»Λ X Asp

' ACT TAT Ser Tyr 1170

’ UAU Lys

. AAC Usn

CCT Ala

TCA Sar 117

ATC Mcc 5

cuu Cln

CcU Cly

CTA Lau

TAT ATC Tyr ile 1130

TTT Phe

CCT Ala

CAT Asp

3552

ATC

CCA TCC

AAA

CAT

ATC

ACC

CCA

CAA

CAC

AGC

AUT CTT

TAT

CCC

CAT

3600

Mcc Ala Sar 1135

Lys

Asp

Mcc Thr 1190

Pro

Clu

Cln

Ser Usn Val 1195

Tyr

Arg

Asp 1200

UAT

UGC TAT

CAA

CAA

TTT

GAT

ACC

A A T .-.Ί4

UAT

CTC

aCU UCA

CTC

AAT

UAC

3 648

Asn

Sar Tyr

Cln

Cln Ph· 1205

Asp

Thr

Asn

Asn Val 1210

Arg .Urg

Val

Asn Asn 1215

CCC

TAT CCA

GAC

CAT

TAT

CAG

ATT

CCT

TCC

TCC

CTA AGT

ACC

CCT

AAA

3 096

Arg

Tyr Ala

Clu Asp 1220

Tyr

Clu

Ila

Pro Sar 1225

Ser

Val Ser

Ser Arg 1230

Lys

CAC

TAT CGT

TCG

CGA

CAT

TAT

TAC

CTC

AGC

ATC

CTA TUT

AAC

CGA

GAT

3744

Asp

Tyr Cly Trp 1235

Cly

Asp

Tyr

Tyr Lau 1240

Ser

Mcc

Val Tyr Asn 1245

Cly

Asp

ATT

CCA ACT

ATC

AAT

TAC

UAA

GCC

GCA

TCA

AGT

CAT TTA

AUA

ATC

TAT

3792

ila

Pro Thr 1250

Ila

Asn

Tyr

Lys Ala 1255

Ala

Sar

Ser

Asp Lau 1260

Lys

Ile

Tyr

ATC

TCA CCA

AAA

TTA

AGA

ATT

ATT

CAT

AUT

GCA

TAT GUU

GGA

CAC

AAG

3840

Ila Ser Pro 1265

Lys

Lau

Arg Il· 1270

il·

His

Asn

Gly Tyr Clu 1275

Cly

Gln

Lys 1280

CCC

AAT CAA

TGC

AAT

CTG

ATG

AUT

AAA

TAT

CCC

UUA CTA

CCT

CUT

AAU

3333

Arg

Asn Gln

Cys

Asn Leu 1285

Met

Asn

Lys

Tyr Cly 1290

Lys Lcu

Gly

Asp Lys 1295

TTT

ATT GTT

TAT

ACT

AGC

TTG

GCC

GTC

AUT

CCA

UAT UAC

TCC

TCU

AAT

3936

Phe

Ile Val

Tyr Thr 1300

Ser

Leu

Gly

Val Asn 1305

Pro

Asn Usn

Ser Ser 1310

Asn

AAC

CTC ATC

TTT

TAC

CCC

CTC

TUT

CAA

TAT

AGC

GGU AAC

ACC

AGT

GCA

3934

Lys

Lau Mec 1315

Phe

Tyr

Pro

Val

Tyr Cln 1320

Tyr

Ser

Cly Asn Thr 1325

Ser

Cly

CTC

AAT CAA

GCC

AGA

CTA

CTU

TTC

CAC

CCT

CAC

ACC ACT

TAT

CCA

TCT

4032

Lau

Asn Gln 1330

Gly

Arg

Leu

Leu Ph· 1335

His

Arg

Asp

Thr Thr 1340

Tyr

Pro

Ser

.AUA

CTA GAA

CCT

TCC

ATT

CCT

CCA

GCA

AAU

CCT

TCT CTA

ACC

AAC

CAA

4080

Lys 1345

Val Glu

Ala

Trp

Ile Pro 1350

Gly

Ala

Lys

Arg 1355

Ser Leu

Thr

Asn

Gln 1360

AAT

GCC GCC

ATT

CCT

GUT

GAT

TAT

GCT

ACA

CAC

TCT CTC

AUT

AAU

CCC

4128

Asn

Ala Ala

Il·

Cly 1365

Asp

Asp

Tyr

Ala

Thr 137C

Asp 1

Ser Leu

Asn

Lys 1375

Pro

GAT

CAT CTT

UAC

CAA

TAT

ATC

TTT

ATC

ACT

GAC

ACT UUU

CGC

ACT

GCT

4176

Asp

Asp Leu'

Lys 1380

Cln 1

Tyr

Ile

Phe

Mec 1385

Thr

Asp

Ser Lys

Cly Thr 13 90

Ala

ACT

CAT CTC

TCA

CCC

CCA

GTU

GAG

ATT

AAT

ACT

CCA ATT

TCT

CCA

GCA

4224

Thr

Asp Val 1395

Ser

Cly

Pro

Val Clu 1400

Ila

Asn

Thr

Ala il· 1405

Ser

Pro

Ala

AAA

GTT CAG

ATA

ATA

CTC

AAA

GCG

CCT

CCC

AAG

GAG CAA

ACT

TTT

ACC

42~2

Lys

Val Cln 1410

Il·

Ile

Val

Lys 1415

Ala 1

Gly

cly

Lys

Glu Gln 1420

Thr

Ph·

Thr

CCA

CAT UAA

GAT

CTC

TCC

ATT

CAC

CCA

TCA

CCT

ACC TTT

CAT

GAA

ATC

4320

Ala 1425

Asp Lys

Asp

Val

Ser 1430

Ile

Cln

Pro

Sar

Pro 1435

Sar Phe

Asp

Clu

Met 1440

UAT

TAT CAA

TTT

UAT

CCC

CTT

GAA

ATA

CAC

CGT

TCT CGT

CTG

AAT

TTT

4368

Usn

Tyr Cln

Pha

Usn

Ala

Lau

Clu

ila

Asp

Cly

Sar Cly

Lau

As n

Pha

165

186 242

1445 1450 1455

ATT I le

AAC Asn

AAC .Asn

TCA Ser 146

GGC Ala 0

AGT Ser

ATT Ile

GAT Asp

GTT Val 146

AGT Thr 5

TTT Phe

AGC Thr

GCA Ala

Ili Phe Ala 1470

GAG Glu

4416

CAT

GCG

CGG

AAA

CTG

GGT

TAT

GAA

AGT

TTG

AGT

ATT

GCT

GTT AGC

CTC

44 64

Asp

Gly

Arg Lys 1475

Leu

Gly

Tyr

Glu Ser 1430

Phe

Ser

Ile

Pro Val Thr 1435

Leu

.'„Λ'-)

GTA

AGT

AGG

GAT

AAT

GCC

GTG

AGC

CTG

-GAG

CAT

AAT

GAA AAT

ccT

4512

Lys

Val Ser 1490

Thr

Asp

Asn

Ala Leu 1495

Thr

Leu

His

His Asn 1500

Glu Asn

Gly

GCG

CAA

TAT

ATG

GAA

TGG

CAA

TGC

TAT

GGT

ACC

CGG

GTG

.AAT ACT

GTA

4560

Ala Gin 1505

Tyr

Met

Gln

Trp Gln 1510

Ser

Tyr

Arg

Thr Arg 1515

Leu

Asn Thr

Leu 1520

TTT

GCC

CGC

CAG

TTG

GTT

GGA

CGG

GGG

AGC

ACC

GGA

ATG

GAT ACA

ATT

4603

Phe

Ala

Arg

Gln

Leu Val 1525

Ala

Arg

Ala

Thr Thr 1530

Gly

Ile

Asp Thr Ile 1535

GTG

AGT

ATG

GAA

ACT

GAG

AAT

ATT

CAG

GAA

CCG

CAG

TTA

GGG AAA

GGT

4656

Leu

Ser

Mec

Glu Thr 1540

Gln

Asn

Ile

Gln Glu 1545

Pro

Gln

Leu

Gly Lys 1550

Gly

TTC

TAT

GGT

AGG

TTG

GTG

ATA

GGT

GGG

TAT

AAG

CTA

TGA

AGT CAT

GGT

4704

Phe

Tyr

Ala Thr 1555

Phe

Val

Ile

Pro Pro 1560

Tyr

Asn

Leu

Ser Thr His 1565

Gly

GAT

GAA

CGT

TGG

TTT

AAG

CTT

TAT

ATG

AAA

CAT

GTT

GTT

GAT AAT

AAT

4752

•Asp

Glu Arg 1570

Trp

Phe

Lys

Leu Tyr 1575

Ile

Lys

His

Val Val 1530

Asp Asn

Asn

TGA

CAT

ATT

ATG

TAT

TCA '

GGG

CAG

GTA

ACA

GAT

AGA

AAT

ATA AAG

ATG

4300

Ser His 1535

Ile

Ile

Tyr

Ser Gly 1590

Gln

Leu

Thr

Asp Thr 1595

Asn

Ile Asn

Ile 1600

ACA

TTA

TTT

ATT

GCT

CTT

GAT

GAT

GTG

CGA

TTG

AAT

GAA

GAT TAT

GAG

4343

Thr

Leu

Phe

Ile

Pro Leu 1505

Asp

Asp

Val

Pro Leu 1610

Asn

Gln

Asp Tyr His 1615

GCC

AAG

GTT

TAT

ATG

AGG

TTG

AAG

AAA

TGA

GCA

TGA

GAT

GGT AGC

TGG

4396

Ala

Lys

Val

Tyr 1620

Mec 1

Thr

Phe

Lys

Lys 1625

Ser

Pro

Ser

Asp

Gly Thr 163C

Trp

TGG

GGG

CCT

CAG

TTT

GTT

AGA

GAT

GAT

AAA

GGA

ATA

GTA

ACA ATA

AAG

4944

Trp

Gly

Pro 1635

His

Phe

Val

Arg

Asp Asp 1640

Lys

Gly

Ile

Val 1645

Thr Ile

Asn

GGT

AAA

TGG

ATT

TTG

AGC

GAT

TTT

GAG

AGG

GTG

AAT

GTG

CTG AAT

AAT

4992

Pro

Lys 1650

Ser 1

Ile

Leu

Thr

His 1655

Phe

Glu

Ser

Val

Asn Val 1660

Leu Asn

Asn

ATT

AGT

AGG

GAA

CGA

ATG

GAT

TTG

AGG

GGC

GCT

AAG

AGG

CTG TAT

TTG

5040

Ile 1665

Ser

Ser

Glu

Pro

Met 1670

Asp 1

Phe

Ser

Gly

Ala 1675

Asn

Ser

Leu Tyr

Phe 1630

TGG

GAA

GTG

TTC

TAG

TAT

ACC

GCG

ATG

CTG

GTT

GGT

CAA

CGT TTG

CTG

5033

Trp

Glu

Leu

Phe

Tyr 1635

Tyr

Thr

Pro

Met

Leu 1690

Val

Ala

Gln

Arg Leu 1655

Leu

GAT

GAA

CAG

AAG

TTC

GAT

GAA

GGC

AAG

GGT

TGG

CTG

AAA

TAT GTG

TGG

5136

His

Glu

Gln

Asn 1700

Phe

Asp

Glu

Ala

Asn 1705

Arg

Trp

Leu

Lys

Tyr Val 1710

Trp

AGT

GGA

TGG

GGT

TAT

ATT

GTC

GAG

GGG

GAG

ATT

GAG

AAC

TAC CAG

TGG

5134

Ser

Pro

Ser 1715

Gly

Tyr

Ile

Val

His 1720

Gly

Gln

Ile

Gln

Asn 1725

Tyr Gln

Trp

AAC GTG

CGC CCG TTA CTG

GAC ACC AGT TGG AAG AGT GAT CCT TTC 5232

166

186 242

Asn

Yal 173

Arg 0

Pro

Lau

Leu

Glu 173'

Asp

Thr

OcT

Trp

Asn Sgt 1740

Asp

Pro

Lau

<jAT

TCC

GTC

GAT

CCT

GAC

GCG

GTA

Iju Λ

CAG

CAC

GAT CCA

ATG

Ak-

TAC 5230

Asp

Sar

Yal

Asp

Pro

Asp

Ala

Yal

Ala

Gln

His

Asp Pro

Mec

His

T/r

1745

1750

1755

17 60

AAA

GTT

TCA

ACT

TTT

ATG

CGT

ACC

TTG

GAT

CTA

TTG ATA

GCA

CGC

GGC 5323

Lys

Yal

Sar

Thr

Phe

Mec

Arg

Thr

Lau

Asp

Leu

Lau Ile

Ala

Arg

Gly

176'

1770

177:

=

GAC

CAT

GCT

TAT

CGC

CAA

CTG

GAA

CGA

GAT

ACA

CTC AAC

GAA

GCG

AAG 537 6

Asp

His

Ala

Tyr

Arg

Gln

Lau

Glu

Arg

•Asp

Thr

Lau .Asn

Glu

Ala.

Lys

1730

1785

1790

ATG

TGG

TAT

ATG

CAA

GCG

CTG

CAT

CTA

TTA

GGT

GAC AAA

CCT

TAT

CTA 5424

Mec

Trp

Tyr

Mec

Gln

Ala

Leu

His

Leu

Lau

Gly

Asp Lys

Pro

Tyr

Leu

1795

1300

1305

CCG

CTG

AGT

ACG

ACA

TGG

AGT

GAT

CCA

CGA

CTA

GAC AGA

GCC

GCG

GAT 5472

Pro

Lau

Ser

Thr

Thr

Trp

Ser

Asp

Pro

Arg

Leu

Asp Arg

Ala

Ala

Asp

1310

1815

1820

ATC

ACT

ACC

CAA

AAT

GCT

CAC

GAC

AGC

GCA

ATA

GTC GCT

CTG

CGG

CAG 5520

Ile

Thr

Thr

Gln

Asn

Ala

His

Asp

Ser

Ala

Ile

Yal Ala

Leu

Arg

Gln

1325

1330

1335

1340

AAT

ATA

CCT

ACA

CCG

GCA

CCT

TTA

TCA

5547

Asn

Ile

Pro

Thr

Pro

Ala

Pro

Lau

Ser

1845

1349

( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 49;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A) Długość: 1849 aminokwasów (B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici: pojedyncza (D ) Topologia: liniowa (ii ) Typ cząsteczki: białko

( xi) Opis sekwencji:	SEK NR	ID: 49	(TcdAii);
Cechy	Od	Do	Opis
Peptyd	1	1849	peptyd TcdAii
Fragment	1	12	S2 N-końcowy ( SEK NR E
Fragment	196	211	( SEK NR ID: 38 )
Fragment	466	475	( SEK NR ID: 17 )
Fragment	993	1004	( SEK NR ID: 23; 12/13 )
Fragment	1297	1312	( SEK NR ID: 18 )
Fragment	1390	1409	( SEK NR ID: 39 )
Fragment	1532	1554	( SEK NR ID: 21; 19/23 )

Leu 1

Ile

Gly

Tyr

Asn 5

Asn

Gln

Phe

Ser

Gly 10

Arg

Ala

Sar

Gln

Tyr 15

Val

Aid.

Pro

Gly

Thr 20

Val

Ser

Ser

Mec

Phe 25

Ser

Pro

Ala

Ala

Tyr 30

Leu

Thr

Glu

Leu

Tyr 35

Arg

Glu

Ala

Arg

Asn 40

Leu

His

Ala

Ser

Asp 45

Ser

Val

Tyr

Tyr

Leu 50

Asp

Thr

Arg

Arg

Pro 55

Asp

Leu

Lys

Ser

Mec ó0

Ala

Leu

Ser

Gln

Gln 65

Asn

Mec

Asp

Ile

Glu 70

Lau

Ser

Thr

Leu

Ser 75

Lau

Sar

Asn

Glu

Lau 30

Lau Lau Glu Sar Ila Lys Thr Glu Ser Lys Lau Glu Asn T/r Thr Lys

186 242

167

50 95

Val

. Met

Clu

, Mee 100

Leu

i Ser

• Thr

Phe

Arg 105

Pro

Ser

Cly

Ale

Thr 110

Pro

Tyr

His

; Asp

i Ala 115

. Tyr

Clu

. Asn

Val

Arg 120

Clu

Val

Ile

Gln

Leu 125

Gln

Asp

Pro

Cly

Leu 130

Glu

Gln

Leu

Asn

Ala 135

Ser

Pro

Ale

Ile

Ala 140

Gly

Leu

Mee

His

Gln 145

Ala

Ser

Leu

Leu

Cly 150

Ile

Asn

Ale

Ser

Ile 155

Ser

Pro

Clu

Leu

Phe 160

Asn

Ile

Leu

Thr

Glu 165

Clu

Ile

Thr

Glu

Cly 170

Asn

Ala

Glu

Glu

Leu 175

Tyr

Lys

Lys

Asn

Phe 130

Gly

Asn

Ile

Glu

Pro 185

Ala

Ser

Leu

Ale

Mac 190

Pro

Clu

Tyr

Leu

Lys 195

Arg

Tyr

Tyr

Asn

Leu 200

Ser

Asp

Glu

Clu

Leu 205

Ser

Gln

Phe

Ile

Gly 210

Lys

Ale

Ser

Asn

Phe 215

Gly

Cln

Cln

Glu

Tyr 220

Ser

Asn

Asn

Cln

Lau 225

Ile

Thr

Pro

Vel

Val 230

Asn

Ser

Ser

Asp

Gly 235

Thr

VAl

Lys

Vel

Tyr 240

Arg

Ile

Thr

Arg

Glu 245

Tyr

Thr

Thr

Asn

Ala 250

Tyr

Gln

Met

Asp

Vel 255

Clu

Leu

Phe

Pro

Phe 260

Gly

Gly

Glu

Asn

Tyr 265

Arg

Leu

Asp

Tyr

Lys 270

Phe

Lys

Asn

Phe

Tyr 275

Asn

Ale

Ser

Tyr

Leu 280

Ser

Ile

Lys

Leu

Asn 285

Asp

Lys

Arg

Glu

Leu 290

Val

Arg

Thr

Glu

Gly 295

Ale

Pro

Cln

VAl

Asn 300

Ile

Glu

Tyr

Ser

Ala 305

Asn

Ile

Thr

Leu

Asn 310

Thr

Ale

Asp

Ile

Ser 315

Gln

Pro

Phe

Glu

Ile 320

Cly

Leu

Thr

Arg

Val 325

Leu

Pro

Ser

Cly

Ser 330

Trp

Ale

Tyr

Ala

Ale 335

Ale

Lys

Phe

Thr

VAl 340

Glu

Glu

Tyr

Asn

Gln 345

Tyr

Ser

Phe

Leu

Leu 350

Lys

Leu

Asn

Lys

Ala 355

Ile

Arg

Leu

Ser

Arg 360

Ale

Thr

Glu

Leu

Ser 365

Pro

Thr

Ile

Leu

Glu 370

Gly

Ile

Vel

Arg

Ser 375

Vel

Asn

Leu

Gln

Leu 380

Asp

Ile

Asn

Thr

Asp 335

Vel

Leu

Gly

Lys

Vel 390

Phe

Leu

Thr

Lys

Tyr 395

Tyr

Met

Gln

Arg

Tyr 400

Ale

Ile

His

Ala

Glu 405

Thr

Ala

Leu

Ile

Leu 410

Gys

Asn

Ala

Pro

Ile 415

Ser

Cln

Arg

Ser

Tyr 420

Asp

Asn

Gln

Pro

Ser 425

Cln

Phe

Asp

Arg

Leu 430

Phe

Asn

Thr

Pro

Lau 435

Leu

Asn

Gly

Cln

Tyr 440

Phe

Ser

Thr

Gly

Asp 445

Glu

Glu

Ile

Tsp

Leu 450

Asn

Ser

Cly

Ser

Thr 455

Cly

Asp

Trp

Arg

Lys 4 60

Thr

Ile

Leu

Lys

168

186 242

Arg 465

Ala

Phe

Asn

Ile

Asp 470

Asp

Yal

Ser

Leu

Phe 475

Arg

Lau

Leu

Lys

Iie 430

Thr

Asp

His

Asp

Asm 435

Lys

Asp

Gly

Lys

Ile 430

L/s

Asn

Asn

Lau

Lys 495

Asn

Leu

Ser

Asn

Leu 500

Tyr

Ile

Tly

L/s

Leu 505

Leu

Ala

Asp

Ile

His 510

GlM

Leu

Thr

Ile

Asp 515

Glu

Leu

Asp

Leu

Leu 520

Leu

Ile

Ala

Vai

Gly 525

Glu

Gly

Lys

Thr

Asn 530

Leu

Ser

Ala

Ile

Ser 535

Asp

Lys

Gln

Leu

Ala 540

Thr

Leu

Ile

Arg

Lys 545

Leu

Asn

Thr

Ile

Thr 550

Ser

Trp

Leu

His

Thr 555

GIm

Lys

Trp

Ser

Vai 560

Phe

Gln

Leu

Phe

Ile 565

Mec

Thr

Ser

Thr

Ser 570

Tyr

Asn

Lys

Thr

Leu 575

Thr

Pro

Tlu

Ile

Lys 5δ0

Asn

Leu

Leu

Asp

Thr 5δ5

Val

Tyr

His

Gly

Leu 590

GIm

Giy

Phe

Asp

Lys 595

Asp

Lys

Ala

Asp

Leu 600

Leu

His

Val

Mec

Aia 605

Pro

Tyr

Iie

Ala

Ala 510

Thr

Leu

GlM

Leu

Ser 615

Ser

Glu

Asm

Val

Aia 620

His

Ser

Val

Leu

Leu 625

Trp

Ala

Asp

Lys

Leu 630

Gln

Pro

Gly

Asp

Gly 635

Aia

Mec

Thr

Ala

Giu 640

Lys

Phe

Trp

Asp

Trp 645

Leu

Asm

Thr

Lys

Tyr 650

Thr

Pro

Gly

Ser

Ser 655

Giu

Ala

Val

Glu

Thr 660

GlM

Glu

His

Ile

Val 665

GlM

Tyr

cys

Gin

Aia 670

Leu

Aia

Gln

Leu

Glu 675

Mac

Val

Tyr

His

Ser 630

Thr

Gly

Ile

Asn

Glu 635

Asn

Aia

Phe

Arg

Leu 690

Phe

Val

Thr

Lys

Pro 695

Glu

Mec

Phe

Gly

Aia 700

Aia

Thr

Giy

Ala

Ala 705

Pro

Ala

His

Asp

Ala 710

Leu

Ser

Leu

Ile

Mec 715

Leu

Thr

Arg

Phe

Aia 720

Asp

Trp

Val

Asn

Ala 725

Leu

Gly

Glu

Lys

Ala 730

Ser

Ser

Val

Leu

Aia 735

Ala

Phe

Glu

Ala.

Asm 740

Ser

Leu

Thr

Ala

Glu 745

GlM

Leu

Aia

Asp

Aia 750

Mec

Asn

Leu

Asp

Ala 755

Asn

Leu

Leu

Leu

Gln 760

Ala

Ser

Ile

Gin

Ala 765

Gln

Asm

His

Gln

His 770

Leu

Pro

Pro

Val

Thr 775

Pro

Glu

Asn

Ala

Phe 730

Ser

Cys

Trp

Thr

Ser 735

Ile

Asn

Thr

Ile

Leu 790

GlM

Trp

Val

Asm

Vai 795

Aia

Gln

Gin

Leu

Asm 300

Val

Ala

Pro

Gln

Gly 305

Val

Ser

Ala

Leu

Val 310

Gly

Leu

Asp

Tyr

Ile 315

Gln

Ser

Mec

Lys

Glu Θ20

Thr

Pro

Thr

Tyr

Ala 325

GlM

Trp

Giu

Asn

Aia 330

Aia

Gly

Vai

Leu

Thr 335

Ala

Gly

Leu

Asn

Ser 340

Gin

Gln

Ala

Asm

Thr 345

Lau

His

Aia

169

186 242

re®

Lau 350

Csp

G X ul

Sap

Ara

Sap 3 3 3

Cla

Ala

Leu

Sap

cer 360

h/r

Cyr

I l t

Crg '

Gln

/al

Ala

Lys

Tla

Cla

Tla

Tla

Ile

Lys

3®P

Crg

Tsp

Asp

Leu

Typ

365

370

375

330

j i n

Typ

Lau

Lau

Ila

Asp

Tsn

Cln

/al

Sar

Ala

Ala

Ilt

Lys

eep

Ter

335

390

895

Arg

τ i a

Cla

Clu

CIi

Ila

Ala

Sap

Ilt

Gln

Leu

h/r

/al

Tsn

Arg

Ala

900

905

910

Lau

Glu

Asn

/al

Glu

Clu

Asn

Cla

Asn

Sar

Gly

/al

Ilt

Ser

Arg

Gln

915

920

925

ree

ree

Ile

Asp

Crp

Tsp

Lys

T/r

Asn

Lys

Crg

Typ

Sap

eer

Crp

Ala

930

935

940

cl·/

/al

Str

Gln

Lau

/al

T/r

h/r

rro

Clu

Csn

Typ

Ile

Csp

rro

Ter

945

950

955

960

Mac

Arg

Ile

Gly

Gln

Ter

Lys

Met

Met

Csp

Cla

Leu

Ltu

Gln

Sep

Van

965

970

975

Str

Gln

Ser

Gln

Ltu

Asn

Tla

Tsp

eer

/al

Glu

Csp

Ala

ree

Met

Sep

980

985

990

T/P

Lau

Tep

Ser

ree

Clu

Gln

/al

Ala

Tsn

Leu

Lys

/al

Ile

Ser

Ala

995

1000

1005

Cyr

His

Asp

Asn

Ilt

Csn

Asn

Csp

Gln

Cly

Leu

Ter

Tyr

ree

Ilt

Gly

1010

1015

1020

Leu

Str

Glu

Ter

Asp

Cla

Gly

Glu

Tyr

Tyr

Trp

Arg

Ser

/al

Asp

His

1025

1030

1035

1040

Sep

Lys

re®

Asn

Asp

Gly

Lys

re®

Ala

Ala

Asn

Ala

Crp

Sep

Glu

Trp

1045

1050

1055

Hss

Lys

Ile

Asp

Gys

rro

Ilt

Csn

rro

Cyr

L/s

Ser

eer

Ile

Crg

rpo

1060

1065

1070

/al

Ile

Typ

Lys

Ser

Arg

Leu

Typ

Leu

Ltu

Trp

Leu

Glu

Gln

Lys

Glu

1075

1080

1085

Ile

Ter

Lys

Gln

Ter

Gly

Asn

Ser

Lys

Asp

Gly

Cyr

Gln

Ter

Glu

Ter

1090

1095

1100

Tsp

Typ

Arg

Tyr

Glu

Leu

L/s

Ltu

Ala

His

Ilt

Arg

Tyr

Asp

Gly

Ter

1105

1110

1115

1120

Crp

Asn

Ter

rro

Ile

eer

re®

Asp

/al

Csn

Lys

L/s

Ilt

Ser

Glu

Leu

1125

1130

1135

Lys

Lau

Glu

Lys

Asn

Arg

Ala

rro

Gly

Leu

Cyr

Cys

Ala

Gly

Tyr

Gln

1140

1145

1150

Cly

Glu

Csp

Ter

Leu

Ltu

/al

Mat

ree

Cyr

Asn

Gln

Gln

Asp

Ter

Ltu

1155

1160

1165

Csp

Sap

Tyr

Lys

Asn

Cla

Ser

Mee

Gln

Gly

Ltu

Tyr

Ilt

ree

Ala

Asp

1170

1175

1180

Mat

Ala

Sar

Lys

Asp

Mat

cer

rro

Glu

Cln

Ser

Asn

/al

h/r

Arg

Asp

1185

1190

1195

1200

Tsn

Sap

h/r

Gln

Gln

re®

Csp

cer

Csn

Tsn

/al

Crg

Trg

/al

Csn

Csn

1205

1210

1215

crg

Typ

Ala

Glu

Csp

T/r

Glu

Ila

rro

Sar

Ser

/al

Ser

Ser

Arg

L/s

1220

1225

1230

170

186 242

Asp	Tyr Gly	Trp Gly Aso Tyr Tyr	Leu Ser Met Val Tyr	Asn Gly Asp
123	5 124(	3 124'
Ile	Pro Thr 1250	Ile Asn Tyr Lys Ala 1255	Ala Ser Ser Asp Leu 12 = 0	Lys Ile Tyr
Ile	Ser Pro	Lys Leu Arg Ile Iie	Us Asn Gly Tyr Glu	Gly Gin Lys
12 0	5	1270	1275	1280
Arg	Asn Gln	Cys Asn Leu Mec Asn 1285	Lys lyr Gly Lys Leu 1290	Gly Ssp Lys 1295
Phe	Ile Val	Tyr Thr Ser Leu Gly 1300	Val Ssn Pro Asn Asn 1305	Ser Ser Ssn 1310
Lys	Leu Mec	Phe Tyr Pro Val Tyr	Gln Tyr Ser Gly Asn	Thr Ser Gly
	1315 1320 1325
Leu	Asn Gln 1330	Gly Arg Leu Leu Phe 1335	His Arg Asp Thr Thr 1340	Tyr Pro Ser
Lys	Val Glu	Ala Trp Ile Pro Gly	Ala Lys Arg Ser Leu	Thr Asn Gln
1345	1350	1355	1360
Asn	Ala Ala	Ile Gly Asp Asp Tyr 1365	Ala Thr Ssp Ser Leu 1370	Ssn Lys Pro 1375
Asp	Asp Leu	Lys Tln Tyr Ile Phe 1380	Mec Thr Ssp Ser Lys 1385	Gly Thr Sla 1390
Thr	Asp Val Ser Gly Pro Val Glu 1395 1400	He Ssn Thr Ala He 1405	Ser Pro Ala
Lys	Val Gln 1410	Ile Ile Val Lys Ala 1415	Gly Gly Lys Glu Tin 1420	Thr Phe Thr
Ala	Asp Lys	Asp Val Ser Ile Tln	Pro Ser Pro Ser Phe	Ssp Glu Mec
1425	1430	1435	1440
Asn	Tyr Gln	Phe Asn Ala Leu Glu 1445	Ile Asp Gly Ser Gly 1450	Leu Asn Phe 1455
Ile	Asn Asn	Ser Ala Ser Ile Asp 1460	Val Thr Phe Thr Sla 1465	Phe Sla Glu 1470
Asp	Gly Arg	Lys Leu Tly Tyr Glu	Ser Phe Ser Ile Pro	Val Thr Leu
	1475	1480	1 1485
Lys	Val Ser 1490	Thr Ssp Asn Ala Leu 1495	Thr Leu His His Ssn 1500	Tlu Asn Gly
Ala	Gln Tyr	Mec Tin Trp Tln Ser	Tyr Srg Thr Srg Leu	Ssn Thr Leu
1505	1510	1515	1520
Phe	Ala Arg	Tln Leu Val Sla Arg 1525	Ala Thr Thr Gly Ile 1530	Ssp Thr Ile 1535
Leu	Ser Mec	Glu Thr Tln Asn Ile 1540	Gln Glu Pro Tln Leu 1545	Gly Lys Tly 1550
Phe	Tyr Ala	Thr Phe Val Ile Pro	Pro Tyr Asn Leu Ser	Thr His Tly
	1555	1560	i 1565
Asp	Glu Arg 1570	Trp Phe Lys Leu Tyr 1575	Ile Lys His Val Val 1580	Ssp Asn Asn
Ser	His Ile	Ile Tyr Ser Gly Gln	Leu Thr Ssp Thr Ssn	He Asn Ile
1585	1590	1595	1600

Thr Leu Phe Ile Pro Leu Asp Asp Val Pro Leu Asn Tln Asp Tyr His

186 242

171

1605 1610 1615

Ala

Lys

Val

Tyr 162

msc 0

Thr

Phe

Lys

Lys Ser 1625

Pro

Ser

Asp

Gly Thr Trp 1630

Trp

Gly

Pro

His

Phe

Val

Arg

Asp

.Asp Lys

Gly

Hle

Val

Thr He asp

1635

1640

1645

Pro

L-/s

Ser

Ile

Leu

Thr

His

Phe

Glu Ser

Val

Asn

Val

Leu Asm Asn

1650

1655

1660

Ile

Ser

Ser

Glu

Pro

Met

Asp

Phe

Ser Cly

Ala

Asn

Ser

Leu Tyr Phe

1655

1670

1675

1680

Trp

Clu

Leu

Phe

Tyr

Tyr

Thr

Pro

Met Leu

Val

Ala

Gln

.Arg Leu Leu

1635

1690

1655

His

Glu

Gln.

Asn

Phe

Asp

Glu

Ala

Asn Arg

Trp

Leu

Lys

Tyr Val Trp

1700

1705

1710

Ser

Pro

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

His

Gly Gln

Ile

Gln

Asn

Tyr Glm Trp

1715

1720

1725

Asn

Va l

Arg

Pro

Leu

Leu

Glu

Asp

Thr Ser

Trp

Asn

Ser

Asp Pro Leu

1730

1735

1740

Asp

Ser

Val

Asp

Pro

Asp

Ala

Val

Ala Gln

Hus

Asp

Pro

Mec His Tyr

1745

175C

1755

1760

Lys

val

ser

Thr

Phe

Met

Arg

Thr

Leu Asp

Leu

Leu

He

Ala Arg Gly

1765

1770

1775

Asp

His

Ala

Tyr

Arg

Gln

Leu

Glu

Arg top

Thr

Leu

ton

Glu Ala Lys

1780

1785

1790

Mec

Trp

Tyr

Mee

Gln

Ala

Leu

HLs

Leu Leu

Gly

top

Lys

Pro Tyr Leu

1795

1800

1305

Pro

Leu

Ser

Thr

Thr

Trp

Ser

Asp

Pro Arg

Leu

Asp

Arg

Ala Ala Asp

1810

1815

1820

Ile

Thr

Thr

Gln

Asn

Ala

His

Asp

Ser Ala

Ile

Val

Ala

Leu Arg Gln

1825

1330

1835

1840

Asn

Ile

Pro

Thr

Pro

Ala

Pro

Leu

Ser

1845

1849

( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 50;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 1740 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowi) (X ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 50 ( TcdAiii obszar kodowania);

TTG Leu

CCC Arg

AGC Ser

GCT Ala

AAT Asm 5

ACC CTC

ACT Thr

CAT top

CTC Leu 10

TTC Phe

CTC Leu

CCC Pro

CAA Glm

ATC Ile 15

AAT Asn

48

Thr

Leu

GAA

GTG

ATG

ATG

AAT

TAC

TCG

CAC

ACA

TTA

GCT

CAG

AGA

GTA

TAC

AAT

96

Glu

Val

Mec

Mec 20

Asm

Tyr

Trp

Glm

Thr 25

Leu

Ala

Glm

Arg

Val 30

Tyr

Asm

,— 'Τ'Γ' c i sj

CGT

CAT

AAC

CTC

TCT

ATC

GAC

CCC

CAC

CCC

TTA

TAT

CTC

CCA

ATC

144

172

186 242

Leu

Arg

His 35

Asn

Leu

Ile

Asp 40

c y

Gin

Pro

Leu

Tyr 45

Leu

Pro

i 1 e

TAT

1 GGC

ACA

GGG

GCC

GAT

CGG

ΑΛΛ

TTA

CTC

AGC

GGC

GGC

GTT

—

1 9 Λ ± ~

Tyr

Ala 50

Thr

Pro

Ala

Asp

Pro 55

Ala

Leu

Leu

Ser 50

Ala

Ala

Val

Ala

ACT

TCT

CAA

GGT

GGA

GGC

AAG

*

CCG

GaA

TCA

TTT

ATG

TGC

CTG

TGG

240

Thr 55

Ser

Gln

Gly

Gly

Gly 70

Lys

Leu

Pro

Glu

Ser 75

Phe

Met

Ser

Leu

Trp 30

GGT

GGG

CAG

ATG

GTG

gAA

AAT

GCG

CGC

GGG

ATG

GTT

AGG

CAG

233

Arg

Phe

Pro

His

Mec 35

Leu

Glu

Asn

Ala

Arg 90

Gly

Mec

Val

Ser

Gln 95

Leu

AGG

GAG

TTC

GGC

TCC

ACG

TTA

CAA

AAT

ATT

ATG

GAA

CGT

CAG

GAC

GCG

3 3 6

Thr

Gln

Phe

Gly 100

Ser

Thr

Leu

Gln

Asn 105

Ile

Ile

Glu

Arg

Gln 110

Asp

Al a

GAA

GCG

CTG

AAT

GGG

TTA

TTA

GAA

AAT

CAG

GGG

GCC

GAG

GTG

ATA

TTG

334

Glu

•Ala

Leu 115

Asn

Ala

Leu

Leu

Gln 120

Asn

Gln

Ala

Ala

Glu 125

Leu

Ile

Leu

ACT

AAG

CTG

AGG

ATT

CAG

GAC

.AAA

ACC

ATT

GAA

GAA

TTG

GAT

GGC

GAG

432

Thr

Asn 130

Leu

Ser

Ile

Gln

Asp 135

Lys

Thr

Ile

Glu

Glu 140

Leu

Asp

Ala

Glu

AAA

ACG

GTG

TTG

GAA

AAA

TGC

AAA

GCG

GGA

GCA

CAA

TCG

GGC

TTT

GAT

430

Lys 145

Thr

Val

Leu

Glu

Lys 150

Ser

Lys

Ala

Gly

Ala 155

Gln

Ser

Arg

Phe

Asp 160

AGG

TAG

GGC

AAA

CTG

TAC

GAT

GAG

AAT

ATG

AAG

GGC

GGT

GAA

AAG

CAA

523

Ser

Tyr

Gly

Lys

Leu 165

Tyr

Asp

Glu

Asn

Ile 170

Asn

Ala

Gly

Glu

Asn 175

Gln

GGC

ATG

ACG

GTA

CGA

GGG

TGG

GGC

GGC

GGG

CTT

ACC

AGG

GGA

GTT

CAG

576

Ala

Met

Thr

Leu 130

Arg

Ala

Ser

Ala

Ala 135

Gly

Leu

Thr

Thr

Ala 190

Val

Gln

GGA

TGG

GGT

GTG

GGG

GGT

GGG

GGG

GGT

GAT

CTG

GTG

CGT

AAG

ATG

TTG

624

Ala

Ser

Arg 195

Leu

Ala

Gly

Ala

Ala 200

Ala

Asp

Leu

Val

Pro 205

Asn

Ile

Phe

GGG

TTT

GCG

GGT

GGG

GGG

AGG

CGT

TGG

GGG

GGT

ATC

GCT

GAG

GGG

AGA

672

Gly

Phe 210

Ala

Gly

Gly

Gly

Ser 215

Arg

Trp

Gly

Ala

Ile 220

Ala

Glu

Ala

Thr

GGT

TAT

GTG

ATG

GAA

TTC

TGC

GGG

AAT

GTT

ATG

AAC

ACC

GAA

GGG

GAT

720

Gly 225

Tyr

Val

Met

Glu

Phe 230

Ser

Ala

Asn

Val

Mec 235

Asn

Thr

Glu

Ala

Asp 240

AAA

ATT

AGG

CAA

TGT

GAA

AGG

TAG

CGT

CGT

CGC

CGT

CAG

GAG

TGG

GAG

763

Lys

Ile

Ser

Gln

Ser 245

Glu

Thr

Tyr

Arg

Arg 250

Arg

Arg

Gln

Glu

Trp 255

Glu

ATG

CAG

CGG

AAT

AAT

GGC

GAA

GGG

GAA

TTG

AAG

CAA

ATG

GAT

GGT

CAG

316

Ile

Gln

Arg

Asn 260

Asn

Ala

Glu

Ala

Glu 265

Leu

Lys

Gln

Ile

Asp 270

Ala

Gln

GTC

AAA

TGA

CTC

GCT

GTA

GGG

GGG

GAA

GGC

GGC

GTA

TTG

GAG

AAA

ACC

364

Leu

Lys

Ser 275

Leu

Ala

Val

Arg

Arg 230

Glu

Ala

Ala

Val

Leu 235

Gln

Lys

Thr

AGT

GTG

AAA

AGG

CAA

CAA

GAA

GAG

ACG

GAA

TCT

CAA

TTG

GGC

TTG

GTG

912

Ser

Leu 290

Lys

Thr

Gln

Gln

Glu 295

Gln

Thr

Gln

Ser

Gln 300

Leu

Ala

Phe

Leu

CAA

GGT

AAG

TTG

AGC

AAT

GAG

GGG

TTA

TAC

AAC

TGG

CTG

CGT

GGT

CGA

950

Gln 305

Arg

Lys

Phe

Ser

Asn 310

G ln

Ala

Leu

Tyr

Asn 315

Trp

Leu

Arg

Gly

Arg 3 20

186 242

173

CTC GCC Leu Ha

. Ala

; att Ile

Tyr 325

Phe

CAG Gin

TTC Phe

TAC Tyr

GA.T Aso 3 30

TGC Leu

GCC Ala

gTC Val

Ala

Arg •35

T—C —ys

1C08

CTG

ATG

: GCA

. GAA

CAA

GCT

TAC

CGT

TGG

GAA

CTC

i i

GAT

GA.C

TCT

1056

Leu

Met

Ala

Glu 340

Gln

Ala

n. a r g

Arg

Trp 345

Glu

Leu

Asn

Asp

Asp 350

Ser

Ala

CGC

—r»^P e —

ATT

AAA

CCG

GGC

GCC

TGG

CAG

tGN

ACC

TAT

GCC

GGT

CTG

CTT

1104

Arg

Phe

Ile 355

Lys

Pro

Gly

Ala

Trp 360

Gln

Gly

Thr

Tyr

Ala 365

Gly

Leu

Leu

GCA

GGT

GAA

ACC

TTG

ATG

CTG

AGT

CTG

GCA

CAA

ATG

GAA

GAC

GCT

CAT

1152

Ala

Gly 370

Glu

Thr

Leu

Met

Leu 375

Ser

Leu

Ala

Gln

Met 330

Glu

Asp

Ala

His

CTG

AA_A

CGC

GAT

AAA

CGC

GCA

TTA

GAG

GTT

GAA

CGC

ACA

GTA

TCG

CTG

1200

Leu 385

Lys

Arg

Asp

Lys

Arg 390

Ala

Leu

Glu

Val

Glu 395

Arg

Thr

Val

Ser

Leu 400

GCC

GAA

GTT

TAT

GCA

GGA

TTA

CCA

AAA

GAT

AAC

GGT

CCA

TTT

TCC

CTG

1248

Ala

Glu

Val

Tyr

Ala 405

Gly

Leu

Pro

Lys

Asp 410

.Asn

Gly

Pro

Phe

Ser 415

Leu

GCT

CAG

GAA

ATT

GAC

AAG

CTG

GTG

AGT

CAA

GGT

TCA

GGC

AGT

GCC

GGC

1296

Ala

Gin

Glu

Ile 420

Asp

Lys

Leu

Val

Ser 425

Gln

Gly

Ser

Gly

Ser 430

Ala

Gly

AGT

GGT

AAT

AAT

AAT

TTG

GCG

TTC

GGC

GCC

GGC

ACG

GAC

ACT

AAA

ACC

1344

Ser

Gly

Asn 435

Asn

Asn

Leu

Ala

Phe 440

Gly

Ala

Gly

Thr

Asp 445

Thr

Lys

Thr

TCT

TTG

CAG

GCA

TCA

GTT

TCA

TTC

GCT

GAT

TTG

AAA

ATT

CGT

GAA

GAT

1392

Ser

Leu 450

Gln

Ala

Ser

Val

Ser 455

Phe

Ala

Asp

Leu

Lys 460

Ile

Arg

Glu

Asp

TAC

CCG

GCA

TCG

CTT

GGC

AAA

ATT

CGA

CGT

ATC

AAA

CAG

ATC

AGC

GTC

1440

Tyr 465

Pro

Ala

Ser

Leu

Gly 470

Lys

Ile

Arg

Arg

Ile 475

Lys

Gln

Ile

Ser

Val 480

ACT

TTG

CCC

GCG

CTA

CTG

GGA

CCG

TAT

CAG

GAT

GTA

CAG

GCA

ATA

TTG

1488

Thr

Leu

Pro

Ala

Leu 485

Leu

Gly

Pro

Tyr

Gln 490

Asp

Val

Gln

Ala

Ile 495

Leu

TCT

TAC

GGC

GAT

AAA

GCC

GGA

TTA

GCT

AAC

GGC

TGT

GAA

GCG

CTG

GCA

1536

Ser

Tyr

Gly

Asp 500

Lys

Ala

Gly

Lau

Ala 505

Asn

Gly

Cys

Glu

Ala 510

Leu

Ala

GTT

TCT

CAC

GGT

ATG

AAT

GAC

AGC

GGC

CAA

TTC

CAG

CTC

GAT

TTC

AAC

1584

Val

Ser

His 515

Gly

Met

Asn

Asp

Ser 520

Gly

Gln

Phe

Gln

Leu 525

Asp

Phe

Asn

GAT

GGC

AAA

TTC

CTG

CCA

TTC

GAA

GGC

ATC

GCC

ATT

GAT

CAA

GGC

ACG

1632

Asp

Gly 530

Lys

Phe

Leu

Pro

Phe 535

Glu

Gly

Ile

Ala

Ile 540

Asp

Gln

Gly

Thr

CTG

ACA

CTG

AGC

TTC

CCA

AAT

GCA

TCT

ATG

CCG

GAG

AAA

GGT

AAA

CAA

1680

Leu 545

Thr

Leu

Ser

Phe

Pro 550

Asn

Ala

Ser

Met

Pro 555

Glu

Lys

Gly

Lys

Gln 560

GCC

ACT

ATG

TTA

AAA

ACC

CTG

AAC

GAT

ATC

ATT

TTG

CAT

ATT

CGC

TA—

1728

Ala

Thr

Mec

Leu

Lys 565

Thr

Leu

Asn

Asp

Ile 570

Ile

Leu

His

Ile

Arg 575

Tyr

ACC ATT AAA TAA 1740 Thr Ile Lys ···

579 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 51;

174

186 242 (i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 279 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici: pojedyncza (D ) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko

	( x ) Opis sekwencji:	SEK	NR ID: 51	( TctdAii);
Leu 1	Arg Ser Ale Asn Thr Leu 5	Thr	Asp Leu 10	Phe Leu Pro Gin Ile Asn 15
Tlu	Vel Met Mec Asn Tyr Trp 20	Cln	Thr Leu 25	Ala Gln Arg Val Tyr Asn 30
Leu	Arg His Asn Leu Ser Ile 35	Asp 40	Cly Cln	Pro Leu Tyr Leu Pro Ile 45
Tyr	Ala Thr Pro Ala Asp Pro 50 55	Lys	Ala Leu	Leu Ser Ala Ala Vel Ale 60
Thr 65	Ser Gln Cly Gly Gly Lys 70	Leu	Pro Glu	Ser Phe Mec Ser Leu Trp 75 30
Arg	Phe Pro His Mec Leu Glu 35	Asn	Ala Arg 90	Gly Mec Vel Ser Gln Leu 95
Thr	Cln Phe Cly Ser Thr Leu 100	Gln	Asn Ile 105	Ile Glu Arg Cln Asp Ale 110
Glu	Ala Leu Asn Ale Leu Leu 115	Cln 120	Asn Gln	Ale Ala Glu Leu Ile Leu 125
Thr	Asn Leu Ser Ile Gln Asp 130 135	Lys	Thr Ile	Glu Glu Leu Asp Ale Clu 140
Lys 145	Thr Val Leu Clu Lys Sar 150	Lys	Ala Gly	Ale Cln Ser Arg Phe Asp 155 160
Ser	Tyr Gly Lys Leu Tyr Asp 165	Clu	Asn Ile 170	Asn Ala Gly Glu Asn Cln 175
Ala	Mec Thr Leu Arg Ala Sar 180	Ale	Ale Gly 185	Leu Thr Thr Ala Vel Gln 190
Ale	Ser Arg Leu Ala Gly Ala 19 5	Ale 200	Ala Asp	Leu Val Pro Asn Ile Phe 205
Cly	Phe Ala Gly Gly Gly Ser 210 215	Arg	Trp Gly	Ala Ile Ale Clu Ale Thr 220
Gly 225	Tyr Val Mac Glu Phe Sar 230	Ale	Asn Val	Mec Asn Thr Clu Ale Asp 235 240
Lys	Ile Ser Gln Ser Glu Thr 245	Tyr	Arg Arg 250	Arg Arg Gln Glu Trp Glu 255
Ile	Gln Arg Asn Asn Ale Glu 260	Ale	Clu Leu 265	Lys Gln Ile Asp Ale Gln 270
Leu	Lys Ser Leu Ala Val Arg 275	Arg 280	Clu Ale	Ala Vel Leu Gln Lys Thr 285
Ser	Leu Lys Thr Gin Gin Glu 290 295	Cln	Thr Gin	Ser Gln Leu Ale Phe Leu 300
Gin 305	Arg Lys Phe Ser Asn Gln 310	Ala	Leu Tyr	Asn Trp Leu Arg Gly Arg 315 320

186 242

175

Leu

Ala

Ala

Ile

Tyr 325

Phe

Gln

Phe

Tyr

Asp 330

Leu

Ala

Val

Ala

•Arg 335

Cys

Leu

Mer

Ala

Glu 340

Gln

Ala

Tyr

Arg

Trp 345

Glu

Leu

Asn

Asp

-Asp 350

Ser

Ala

Arg

Phe

Ile 355

Lys

Pro

Gly

Ala

Trp 360

Gln

Gly

Thr

u<·

Ala 355

Gly

Leu

Leu

Ala

Gly 370

Glu

Thr

Leu

Mec

Leu 375

Ser

Leu

Ala

Gln

Mec 330

Glu

Asp

Ala

His

Leu 335

Lys

Arg

Asp

Lys

-Arg 390

Ala

Leu

Glu

Val

Glu 395

Arg

Thr

Val

Ser

Leu 400

Ala

Glu

Val

Tyr

Ala 405

Gly

Leu

Pro

Lys

Asp 410

ten

Gly

Pro

Phe

Ser 415

Leu

Ala

Gln

Glu

Ile 420

Asp

Lys

Leu

Val

Ser 425

Gln

Gly

Ser

Gly

Ser 430

Ala

Gly

Ser

Gly

As n 435

Asn

Asn

Leu

Ala

Phe 440

Gly

Ala

Gly

Thr

Asp 445

Thr

Lys

Thr

Ser

Leu 450

Gln

Ala

Ser

Val

Ser 455

Phe

Ala

Asp

Leu

Lys 460

Ile

Arg

Glu

Asp

Tyr 4ó5

Pro

Ala

Ser

Leu

Gly 470

Lys

Ile

Arg

Arg

Ile 475

Lys

Gln

Ile

Ser

Val 480

Thr

Leu

Pro

Ala

Leu 485

Leu

Gly

Pro

Tyr

Gln 490

Asp

Val

Gln

Ala

Ile 495

Leu

Ser

Tyr

Gly

Asp 500

Lys

Ala

Gly

Leu

Ala 505

Asn

Gly

cys

Glu

Ala 510

Leu

Ala

Val

Ser

His 515

Gly

Mec

Asn

tep

Ser 520

Gly

Gln

Phe

Gln

Leu 525

tep

Phe

Asn

-Asp

Gly 530

Lys

Phe

Leu

Pro

Phe 535

Glu

Gly

Ile

Ala

Ile 540

tep

Gln

Gly

Thr

Leu 545

Thr

Leu

Ser

Phe

Pro 550

Asn

Ala

Ser

Mec

Pro 555

Glu

Lys

Gly

Lys

Gln 560

Ala

Thr

Mec

Leu

Lys

Thr

Leu

ten

tep

Ile

Ile

Leu

His

Ile

Arg

Tyr

565 570 575

Thr Ile Lys ··♦

579 (2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 52;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 5532 par zasad ( B ) Typ: kwas nukleinowy ( C ) Rodzaj nici: podwójna ( D ) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA ( genomowa) ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 52 (TcdAiii obszar kodowania);

TTT ATA CAA GGT TAT AGT GAT CTG TTT GGT AAT CGT GCT GAT .AAC TAT 43

Phe Ile Gln Gly Tyr Ser Asp Leu Phe Gly Asn Arg Ala Asp Asn Tyr i 5 10 15

GCC CCG CCG GGC TCG GTT GCA TCG ATG TTC TCA CCG GCG GC g region;:

T TAT TTG 95

176

186 242

Aia

. Ala

Pro

Gly 20

Ser

Val

Ala

Ser

Met 25

Phe

Ser

Pro

Ala

Ala 3 0

Τ» r• Z -

Leu

ACG

'jrA

TTG

TAC

CGT

GAA

scc

AAA

aAC

TTG

Λ*!*

GAC

AGC

AGC

TCA

14 4

Thr

Glu

Leu 35

Tyr

Arg

Glu

Ala

Lys 40

Asn

Leu

His

Asp

Ser 45

Ser

Ser

Ile

TAT

TAC

CTA

TAT

AAA

CGT

GAT

TTA

TCA

AGC

TTA

ATG

i-TT·

AGC

19 2

Tyr

Tyr 50

Leu

Asp

Lys

Arg

Arg 55

Pro

Asp

Leu

Aia

Ser 50

Leu

Mec

Leu

Ser

CAT

AAA

AAT

ATG

TAT

GAG

tAA

ATT

TCA

ACG

CTG

GCT

CTC

TCT

AAT

TAA

24 C

Tin 6 5

L'ys

Asn

Mec

Asp

Glu 70

Giu

Iie

Ser

Thr

Leu 75

Ala

Leu

Ser

Asn

Giu 30

TTG

TGC

CTT

GCC

GGG

ATC

GAA

ACA

AAA

ACA

GGA

AAA

TCA

CAA

GAT

GAA

233

Leu

cys

Leu

Aia

Gly 35

Ile

Glu

Thr

Lys

Thr 90

Gly

Lys

Ser

Gin

Asp 95

Giu

TTT

ATG

GAT

ATG

TTG

TCA

ACT

TAT

CGT

TTA

AGT

GGA

TAG

ACA

CCT

TAT

335

Vai

Mec

Asp

Mec 100

Leu

Ser

Thr

Tyr

Arg 105

Leu

Ser

Giy

Giu

Thr 110

Pro

Tyr

CAT

CAC

GCT

TAT

GAA

ACT

GTT

CGT

GAA

ATC

GTT

CAT

GAA

CGT

GAT

CCA

384

His

His

Aia 115

Tyr

Glu

Thr

Vai

Arg 120

Giu

Iie

Vai

His

Glu 125

Arg

Asp

Pro

GGA

TTT

CGT

CAT

TTG

TCA

CAG

GCA

CCC

ATT

GTT

GCT

GCT

AAG

CTC

GAT

432

Gly

Phe 130

Arg

His

Leu

Ser

Gln 135

Aia

Pro

Ile

Vai

Aia 140

Aia

Lys

Leu

Asp

CCT

GTG

ACT

TTG

TTG

GGT

ATT

AGC

TCC

CAT

ATT

TGG

CCA

TAA

CTG

TAT

480

Pro 145

Vai

Thr

Leu

Leu

Gly 150

Ile

Ser

Ser

His

Ile 155

Ser

Pro

Giu

Leu

Tyr 160

AAC

TTG

CTG

ATT

GAG

GAG

ATC

CCG

GAA

AAA

GAT

GAA

GCC

GCT

CTT

GAT

523

Asn

Leu

Leu

Ile

Giu 165

Giu

Iie

Pro

Giu

Lys 170

Asp

Glu

Aia

Aia

Leu 175

Asp

ACG

CTT

TAT

AAA

ACA

AAC

TTT

GGC

GAT

ATT

ACT

ACT

GCT

CAG

TTA

ATG

57 6

Thr

Leu

Tyr

Lys 180

Thr

Asm

Phe

Giy

Asp 185

Iie

Thr

Thr

Aia

GlM 190

Leu

Mec

TCC

CCA

AGT

TAT

CTG

GCC

CTG

TAT

TAT

GGC

GTC

TCA

CCG

GAA

GAT

ATT

624

Ser

Pro

Ser 195

Tyr

Leu

Aia

Arg

Tyr 200

Tyr

Giy

Vai

Ser

Pro 205

Glu

Asp

Ile

GCC

TAC

GTG

ACG

ACT

TCA

TTA

TCA

CAT

GTT

GGA

TAT

AGC

AGT

GAT

ATT

672

Ala

Tyr 210

Val

Thr

Thr

Ser

Leu 215

Ser

His

Vai

Giy

Tyr 220

Ser

Ser

Asp

Iie

CTG

GTT

ATT

CCG

TTG

GTC

GAT

GGT

GTG

GGT

AAG

ATG

GAA

GTA

GTT

CGT

720

Leu 225

Val

Iie

Pro

Leu

Val 230

Asp

Gly

Vai

Giy

Lys 235

Mec

Giu

Val

Vai

Arg 240

TTT

ACC

CGA

ACA

CCA

TCG

GAT

AAT

TAT

ACC

AGT

CAG

ACG

AAT

TAT

ATT

7 63

Val

Thr

Arg

Thr

Pro 245

Ser

Asp

ASM

Tyr

Thr 250

Ser

Gin

Thr

Asn

Tyr 255

Iie

GAG

CTG

TAT

CCA

CAG

GGT

GGC

GAC

AAT

TAT

TTG

ATC

AAA

TAC

AAT

CTA

816

Giu

Leu

Tyr

Pro 260

Gin

Giy

Gly

Asp

Asm 265

Tyr

Leu

Iie

Lys

Tyr 270

Asn

Leu

AGC

AAT

AGT

TTT

TGT

TTG

GAT

GAT

TTT

TAT

CTG

CAA

TAT

AAA

GAT

GGT

3 6 4

Ser

Asn

Ser 275

Phe

Gly

Leu

Asp

Asp 280

Phe

Tyr

Leu

Gln

Tyr 285

Lys

Asp

Gly

TCC

GCT

TAT

TTG

ACT

TAT

ATT

GCC

CAT

AAT

CCC

TAT

CCT

GAT

ATG

TTC

912

Ser

Aia 290

Asp

Trp

Thr

Giu

Ile 295

Aia

His

Asn

Pro

Tyr 300

Pro

Asp

Mec

Vai

186 242

177

a A * _.-A AAG - AT a .-A

; aca

. ATC

1 AAA

. CGT

AGT

Gac

cc T

? s ·:·

Ile Asn dn Lys

; Tyr Gi’J

oer

Gln

i Ala

. Thr

' I;a

Lys

Arg

Ser

Asp

Ser

' ,1

3 10

3 15

320

GAC AAT ATA CTC

. AGT ATA

• GGG

TTA

. CAA

• AGA

. TGG

CAT

AGC

GGT

AGT

TAT

1003

Asp Asn Iie Leu

, Ser Iie

• Gly

Leu

Gln

Arg

Trp

His

Ser

Giy

Ser

Tyr

325

330

335

A_AT TTT GCG GCC

• GCC .AAT

TTT

AAA

ATT

GAC

CAA

TAC

TCC

CCG

AAA

GCT

1056

Asn Phe Ala Ala

Ala Asn

Phe

Lys

He

Asp

Gln

Tyr

Ser

Pro

Lys

Ala

340

345

350

TTC CTG CTT AAA

ATG AAT

AAG

GCT

ATT

CGG

TTG

CTC

AAA

GCT

ACC

GGC

1104

Phe Leu Leu Lys

Mec Asn

Lys

Ala

Ile

Arg

Leu

Leu

Lys

Aia

Thr

Gly

355

360

365

ctc tct cct

ACG TTG

GAG

CGT

ATT

GTT

GAT

AGT

GTT

AAT

AGC

ACC

1152

Leu Ser Phe Ala

Thr Leu

Glu

Arg

Ile

Val

Asp

Ser

Val

Asn

Ser

Thr

370

375

380

.AAA TCC ATC ACG

GTT GAG

GTA

TTA

AAC

AAG

GTT

TAT

CGG

GTA

AAA

TTC

1200

Lcs Ser Ile Thr

Val Glu

Val

Leu

Asn

Lys

Val

T/r

Arg

Val

Lys

Phe

335

390

395

400

TAT ATT GAT CGT

TAT GGC

ATC

AGT

GAA

GAG

ACA

GCC

CCT

ATT

TTG

GCT

1243

Ty r Ile Asp Arg

Tyr Gly

Ile

Ser

Glu

Glu

Thr

Ala

Ala

Ile

Leu

Ala

405

410

415

AAT ATT AAT ATC

TCT CAG

CAA

GCT

GTT

GGC

AAT

CAG

CTT

AGC

CAG

TTT

1296

Asn Ile Asn He

Ser Gln

Gln

Ala

Val

Gly

Asn

Gin

Leu

Ser

Gln

Phe

420

425

430

GAG CAA CTA TTT

AAT CAC

CCG

CCG

CTC

AAT

GGT

ATT

CGC

TAT

GAA

ATC

1344

Glu Gln Leu Phe

Asn His

Pro

Pro

Leu

Asn

Gly

Ile

Arg

Tyr

Glu

Ile

435

440

445

AGT GAG GAC AAC

TCC AAA

CAT

CTT

CCT

AAT

CCT

GAT

CTG

AAC

CTT

AAA

1392

Ser Glu Asp Asn

Ser Lys

His

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp

Leu

Asn

Leu

Lys

450

455

460

CCA GAC AGT ACC

GGT GAT

GAT

CAA

CGC

AAG

GCG

GTT

TTA

AAA

CGC

GCG

1440

Pro Asp Ser Thr

Gly Asp

Asp

Gln

Arg

Lys

Ala

Val

Leu

Lys

Arg

Ala

465

470

475

480

TTT CAG GTT AAC

GCC AGT

GAG

TTG

TAT

CAG

ATG

TTA

TTG

ATC

ACT

GAT

1433

Phe Gln Val Asn

Ala Ser

Glu

Leu

Tyr

Gln

Mec

Leu

Leu

Ile

Thr

Asp

485

490

495

CGT AAA GAA GAC

GGT GTT

ATC

AAA

AAT

AAC

TTA

GAG

AAT

TTG

TCT

GAT

1536

Arg Lys Glu Asp

Gly Val

Ile

Lys

Asn

Asn

Leu

Glu

Asn

Leu

Ser

Asp

500

505

510

CTG TAT TTG GTT

AGT TTG

CTG

GCC

CAG

ATT

CAT

AAC

CTG

ACT

ATT

GCT

1584'

Leu Tyr Leu Val

Ser Leu

Leu

Ala

Gln

Ile

His

Asn

Leu

Thr

Ile

Ala

515

520

525

GAA TTG AAC ATT

TTG TTG

GTG

ATT

TGT

GGC

TAT

GGC

GAC

ACC

AAC

ATT

1632

Glu Leu Asn Ile

Leu Leu

Val

Ile

Cys

Gly

Tyr

Gly

Asp

Thr

Asn

He

530

535

540

TAT CAG ATT ACC

GAC GAT

AAT

TTA

GCC

AAA

ATA

GTG

GAA

ACA

TTG

TTG

1680

Tyr Gln Ile Thr

Asp Asp

Asn

Leu

Ala

Lys

Iie

Val

Glu

Thr

Leu

Leu

545

550

555

560

CGG ATC ACT CAA

TGG TTG

AAG

ACC

CAA

AAA

TGG

ACA

GTT

ACC

GAC

CTG

1728

Trp He Thr Gln

Trp Leu

Lys

Thr

Gln

Lys

Trp

Thr

Val

Thr

Asp

Leu

565

570

575

TTT CTG ATG ACC

ACG GCC

ACT

TAC

AGC

ACC

ACT

TTA

ACG

CCA

GAA

ATT

: —

Phe Leu Met Thr

Thr Ala

Thr

Tyr

Ser

Thr

Thr

Leu

Thr

Pro

Glu

He

530

535

590

178

186 242

TGC

TTT

L . uJ

TC.

GCT

Tc g

TTG

GG * L ( Λ

TCT

TTG

(T)

GGA.

TTA

GTG

1824

Ser

Tsn

Leu

Thr

Tla

Thr

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

His

G L'/

Lys

G Lu

Ser

595

600

6 0 5

ctG

TTT

CGG

GAT

GTT

(TG

AAT

TgT

GCT

TTG

gA»g

CCT

TGC

'Twpr·

TCT

TCG

1872

Leu

Ile

Gly

Glu

Asp

Leu

Lys

Trg

.Ala

Met

Tla

Pro

Cys

Phe

Thr

Ser

610

615

520

GCT

TTG

CTT

TTG

TCT

TCT

CTA

GAT

GTT

GCG

TTT

GTC

CTG

CTG

TTG

TGG

1920

Ala

Lrn

His

Leu

Thr

Ser

Gln

Glu

Cal

Ala

Tyr

Asp

Leu

Leu

Leu

Trp

625

6 3 0

6 3 5

64 0

TTT

GAU

C TG

TTT

CTT

CCG

GCT

CAT

TTT

TCT

GTT

GTT

(GG

TTT

Af*GG k GG

.AT

963

Iii

Tsp

Gln

Ile

Gln

Pro

Ala

Gln

Ile

Thr

Val

Tsp

Gly

Phe

Trp

Glu

645

550

555

GTT

GTG

CTT

TCT

TCA

CCT

TCC

TGC

TTG

ATG

GTG

TTT

TCC

TTT

GCT

CTG

2016

Glu

Vsl

Gln

Thr

Thr

Pro

Thr

Ser

Leu

Lys

Val

Ile

Thr

Phe

Ala

Gln

660

665

670

GTG

CTG

GCA

CTA

TTG

TGC

CTG

TTC

TTT

CGT

CGT

TTT

GGG

TTT

TGT

GAT

2064

Cal

Leu

Ala

Gln

Leu

Ser

Leu

Ile

Tyr

Arg

Trg

Ile

Gly

Leu

Ser

Glu

575

680

685

TCG

.TT

CTG

TCT

CTG

TTC

GTG

TCT

CTT

TCT

TCT

CTG

CTT

GTG

GCT

cgC

2112

Thr

Glu

Leu

Ser

Leu

Ile

Val

Thr

Gln

Ser

Ser

Leu

Leu

Val

Ala

Gl'Z

690

695

700

-ATT

TGC

TTT

CTG

GAT

CTC

GGT

CTG

TTT

TCC

CTG

TTG

GCC

TTG

GTT

cgT

2160

Lys

Ser

Ile

Leu

Tsp

His

Gly

Leu

Leu

Thr

Leu

Met

Tla

Leu

Glu

.ly

705

710

715

20

TTT

CTT

TCC

TGG

GTT

ATT

GGC

TTG

GGG

CTT

CTT

GCC

TCC

TTG

TTT

TTG

2208

Phe

His

Thr

Trp

Val

Tsn

Gly

Leu

Gly

Gln

His

Tla

Ser

Leu

Ile

Leu

725

730

735

GCG

GCG

TTG

ATT

GTC

GGT

GCC

TTG

TCA

GTT

TCC

GTT

GTA

GCT

CTT

GCT

2256

Tla

Tla

Leu

Lys

Tsp

Gly

Tla

Leu

Thr

Val

Thr

Tsp

Val

Tla

Gln

Ala

740

745

750

TTG

ATT

ATG

GTG

GAT

TCT

CTC

CTA

CTA

TTG

GCT

GCT

ATT

CTG

GTG

GTG

2304

Met

Tsn

Lys

Glu

Glu

Ser

Leu

Leu

Gln

Mgt

Tla

Ala

Tsn

Gln

Val

Clu

755

760

765

TTG

GTT

CTA

TCA

ATT

CTG

TCC

TGT

TGG

TCA

CTG

ATT

GAC

GCT

ATT

CTG

2352

Lys

Tsp

Leu

Thr

Lys

Leu

Thr

Ser

Trp

Thr

Gln

Ile

Tsp

Ala

Ile

Leu

770

775

780

CAT

TGG

TTT

CTG

TTG

TCT

TCG

GCC

TTG

GCG

GTT

TCT

CCT

CTG

GTT

CTG

2400

Gln

Trp

Leu

Gln

Mec

Ser

Ser

Ala

Leu

Ala

Val

Ser

Pro

Leu

Tsp

Leu

785

790

795

300

GCT

GGG

TTG

TTG

GCC

CTG

ATT

TTT

GGG

ATT

GTT

CTT

TTC

TTT

GCT

GC (

2443

Ala

Gly

Mec

Met

Tla

Leu

Lys

Tyr

Gly

Ile

Tsp

His

.Tsn

Tyr

Tla

Tla

805

810

815

TCC

CAT

GCT

GCG

GCG

GCT

GCG

CTG

TTG

GCT

GTT

CTT

GCT

ATT

CTG

GCT

2496

Trp

Gln

Tla

Ala

Tla

Tla

Tla

Leu

Met

Ala

Tsp

His

Ala

Tsn

Gin

Aid

820

825

83 0

CTG

TAT

TTA

CTG

GAT

GAG

TCG

TTC

TGT

TTG

GCT

TTA

TGT

TTC

TTT

TTT

2544

Gln

Lys

Lys

Leu

Tsp

Glu

Thr

Phe

Ser

Lys

Ala

Leu

Cys

.Tsn

Tyr

Tyr

335

840

845

TTT

ATT

GCT

GTT

GTC

GTT

TCT

GCT

GCT

GGT

GTT

CGT

GTT

CGT

ATC

GGT

2592

Ile

Tsn

Tla

Val

Val

Tsp

Ser

Tla

Tla

Gly

Vsl

Arg

Tsp

Arg

Tsn

Gly

350

355

860

TTT

TTT

TCC

TTT

GG>G ()G

CTG

TTT

GTT

ATT

CTg

GTT

TCT

GCC

GTT

GTG

W GG

2540

Leu

Tyr

Thr

Tyr

Leu

Leu

I le

Tsp

.Tsn

Gln

Val

Ser

Tla

-Tsp

Vsl

I.e

186 242

179

8 6 5	870	875	3 3·0
UCT TCA CCT	' ATT CCU GAA	. CCT UTC CCC CCT UTT CAA CTC TAC	c TT 2 6 88
Thr Ser Arg	Ile Ala Clu 885	Ula ile Ula Gly ila Gln Lau Tyr 390	Val Asn 395
CGC CCT TTA	UAC CCA GAT	gAA GGT CaC cTT CCA TCC CAC CTT	AGT UCC 2736
Arg Ala Leu	Asn Urg Asp 900	Clu Cly Cln Lau Ala Ser Asp Val 905 910	Ser Thr
CGT CAG TTC	TTC UCT GAC	TCG CUA CGT TAC AUT AAU CGT TAC	AGT ACT 2784
Arg Cin Phe 915	Phe Thr Asp	Trp Clu Arg Tyr Asn Lys Arg Tyr 520 925	Ser Thr
TGG CCT GGT	CTC TCT CUA	CTG CTC TUT TAT CCA GAA AUC TAT	GTT CAT 2332
Trp Ala Cly 930	Val Ser Glu	Leu Val Tyr Tyr Pro Glu Asn Tyr 935 940	Val Usp
CCC ACT CAG	CGC ATT GCG	CUA UCC UUU ATC ATG CAT GCG CTG	TTC CAA 2880
Pro Thr Cln 945	Arg ile Gly 950	Cln Thr Lys Met Mec Asp Ala Leu ' 955	Leu Gln 960
TCC ATC AAC	CUG UCC CAC	CTU UAT CCC CAT ACG GTC GAA GUT	GCT TTC 2923
Ser Ile Asn	Cln Ser Gln 965	Leu Asn Ula Asp Thr Val Glu Asp 970	Ala Phe 975
UAA ACT TAT	TTC ACC UGC	TTT CAC CUG CTA GCA AAT CTG AUA	CTA ATT 2976
Lys Thr Tyr	Leu Thr Ser 980	Ph· Clu Gln Val Ala Asn Leu Lys 985 990	Val Il·
AGT CCT TAC	CAC GAT AAT	CTC AAT CTC CAT CAA GCU TTA ACT	TAT TTT 3024
Ser Ala Tyr 995	His Asp Usn	Val Asn Val Asp Gln Gly Leu Thr 1000 1005	Tyr Phe
ATC CCT ATC	GAC CUA GCA	GCT CCG CGT ACG TUT TAC TGG CGT	ACT GTT 3072
ile Cly ile 1010	Usp Gln Ala	Ala Pro Cly Thr Tyr Tyr Trp Urg 1015 1020	Ser Val
GUT CAC ACC	AUA TGT GAA	AAT GGC AUC TTT CCC CCT AUT GCT	TGG GCT 3120
Asp His Ser 1025	Lys Cys Clu Asn Gly Lys Phe Ala Ala Asn Ula 1030 1035	Trp Gly 1040
CAG TGG AUT	AAU ATT ACC	TCT GCT CTC AAT CCT TGG AUA AAT	UTC UTC 3168
Clu Trp Asn	Lys Il· Thr 1045	Cys Ala Val Usn Pro Trp Lys Usn 1050	Ile Il· 1055
CGT CCG CTT	CTT TAT UTG	TCC CCC TTA TUT CTG CTA TGG CTG	GUC CAC 3216
Arg Pro Val	Val Tyr Met 1060	Ser Arg Leu Tyr Lau Leu Trp Leu Glu Gln 1065 1070
CAA TCA AAC	AAU ACT CAT	CUT CCT AAU ACC ACC ATT TAT CUA	TAT AAC 3264
Gln Ser Lys 1075	Lys Ser Asp	Usp Gly Lys Thr Thr Ile Tyr Cln 1080 1085	Tyr Asn
TTU AAA CTC	GCT CAT ATT	CGT TAC GAC GGT UGT TCG AAT ACA	CCA TTT 3312
Lau Lys Leu 1090	Ala His Ile	Urg Tyr Usp Gly Ser Trp Usn Thr 1095 1100	Pro Ph·
ACT TTT CUT	GTG ACA CUA	UAC CTA AAA AUT TAC ACC TCC ACT	ACT CAT 3360
Thr Phe Asp 1105	Val Thr Glu 1110	Lys Val Lys Asn Tyr Thr Ser Ser 1115	Thr Asp 1120
CCT GCT CUA	TCT TTU GCG	TTG TAT TCT ACT CGT TAT CAA CGG	CAA CAC 3403
Ala Ala Clu	Sar Leu Gly 1125	Leu Tyr Cys Thr Cly Tyr Gln Cly 1130	Glu Asp 1135
UCT CTA TTA	GTT UTG TTC	TAT TCG ATG CAC UCT AGT TAT AGC	TCC TAT 3456
Thr Leu Leu	Val Mac Phe 1140	Tyr Sar Mac Cln Ser Ser Tyr Ser 1145 1150	Sar Tyr 1
ACC CAT AAT	AAT CCC CCC	CTC ACT GCC CTU TAT ATT TTC CCT	GAT UTC 3 504

180

186 242

tu r

Ssp

Ssn Asn liS5

Sla

Pro

Val

Thr 11 ó

i Gly ć

Leu

Tyr

Ile

Phe 116

sla 5

Ssp

.Mec

tg a

. TCA

GAC AAT

ATG

SCG

AnT

acA

CSA

GCA

SCT

ASC

TAT

TGG

AAT

Sac 3 7 7 2

Ser

Ser

Ssp Ssn

Mec

Thr

Acn

Ala

Gln

Sla

Thr

Ssn

Tyr

Trp

Ssn

Asn

1170

1175

1130

SGT

TAT

CCG CSA

TTT

GAT

ACT

GTG

ATG

GCA

GAT

CCG

GAT

AGC

GSC

SAT 3600

Ser

Tyr

Pro Gln

Phe

-Ssp

Thr

Val

Mec

Sla

Ssp

Pro

Ssp

Ser

Ssp

Ssn

1135

1190

1195

1200

-SSA

AAA

GTC STA

ACC

ATS

AGA

GTT

AAT

SSC

CGT

TAT

GCG

GST

GST

TST 3643

Lys

Val Ile

Thr

Srg

Arg

Val

Ssn

Asn

Srg

Tyr

Ala

Glu

Ssp

Tyr

1205

1210

1215

GSA

STT

CCT TCC

TCT

GTG

SCA

STT

SAC

SGT

SST

TAT

TCT

TTG

GTT

GAT 3696

Glu

Ile

Pro Ser

Ser

Va 1

Thr

Ser

Ssn

Ser

Asn

Tyr

Ser

Trp

Gly

Ssp

1220

1225

1230

CSC

AGT

TTA ACC

ATG

CTT

TAT

GGT

GTT

SGT

GTT

CCT

SAT

STT

ACT

TTT 3744

His.

Ser

Leu Thr

Mec

Leu

Tyr

Tly

Gly

Ser

Val

Pro

Ssn

Ile

Thr

Phe

1235

1240

1245

GSA

TCG

GCG GCA

GSA

TAT

TTA

AGG

CTA

TCT

SCC

SAT

STG

GCS

TTG

SGT 3792

Glu

Ser

Sla Ala

Glu

Asp

Leu

Arg

Leu

Ser

Thr

Asn

Mec

ma

Leu

Ser

1250

1255

1260

ATT

ATT

CAT AST

GGA

TAT

GCT

GGA

ACC

CGC

CGT

ATA

CSA

TGT

AST

CTT 3840

Ile

Ile

His Ssn

Gly

Tyr

Sla

Gly

Thr

Srg

Arg

Ile

Gln

Cys

Asn

Leu

1265

1270

1275

1280

ATT

SAS

CAA TAC

GCT

TCA

TTA

GGT

GAT

ASS

TTT

ATA

ATT

TAT

GAT

TCA 3388

Mec

Lys

Gln Tyr

Ala

Ser

Leu

Gly

Ssp

Lys

Phe

Ile

Ile

Tyr

Asp

Ser

1285

1290

1295

TCA

TTT

GAT GAT

TCA

SSC

CGT

TTT

AST

CTG

GTT

CCS

TTG

TTT

SSA

TTC 3936

Ser

Phe

Asp Asp

Ala

Ssn

Arg

Phe

Asn

Leu

Val

Pro

Leu

Phe

Lys

Phe

1300

1305

1310

GGA

AAA

GAC GAG

AAC

TCA

GAT

TAT

ATT

ATT

TGT

ATA

TAT

SAT

GAS

SAC 3984

Gly

Lys

Asp Glu

Ssn

Ser

Asp

Ssp

Ser

Ile

Cys

Ile

Tyr

Ssn

Glu

Asn

1315

1320

1325

CCT

TCC

TCT GAA

GAT

SAT

ASG

TTG

TAT

TTT

TCT

TCG

SSA

GST

GAC

AST 4032

Pro

Ser

Ser Glu

Ssp

Lys

Lys

Trp

Tyr

Phe

Ser

Ser

Lys

Ssp

Ssp

Asn

1330

1335

1340

SAA

ACA

GCG GAT

TAT

SAT

GGT

GGA

ACT

CAA

TTT

ATS

GST

GCT

GGA

AC C 4080

Lys

Thr

Ala Ssp

Tyr

Ssn

Tly

Gly

Thr

Gln

Cys

Ile

Asp

Sla

Tly

Thr

1345

1350

1355

1350

AGT

SAC

SAS GAT

TTT

TAT

TAT

SAT

CTC

CAG

GAT

STT

GSA

GTS

ATT

AGT 4123

Ser

Ssn

Lys Ssp

Phe

Tyr

Tyr

Asn

Leu

Gln

Glu

Ile

Glu

Val

Ile

Ser

1365

1370

1375

GTT

ACT

GGT GTG

TAT

TGG

TCT

AGT

TAT

SSA

STA

TCC

SAC

CCG

STT

AAT 4176

Val

Thr

Gly Gly

Tyr

Trp

Sar

Ser

Tyr

Lys

Ile

Ser

Ssn

Pro

Ile

Asn

1330

1385

1390

STC

AAT

ACG GGC

ATT

GAT

ATT

GCT

ASA

GTA

SAS

GTC

ACC

GTA

SAA

GCG 4224

Ile

Ssn

Thr Gly

Ile

Asp

Ser

Ala

Lys

Val

Lys

Val

Thr

Val

Lys

Sla

1395

1400

1405

GGT

GGT

GAC GAT

CAA

ATC

TTT

ACT

GCT

GAT

AST

AGT

SCC

TAT

TTT

CCT 4272

Gly

Gly

Asp Asp

Gln

Ile

Phe

Thr

Sla

Ssp

Asn

Ser

Thr

Tyr

Val

Pro

1410

1415

1420

CSG

CAA

CCG TCA

CCC

SGT

TTT

GAG

GAG

STG

STT

TAT

CAT

TTC

SAT

AAC 4320

Gin

Gln

Pro Sla

Pro

Ser

Phe

Glu

Glu

Mec

Ile

Tyr

Gin

Phe

Ssn

Ssn

1425

1430

1435

1440

186 242

181

CTG·

GAA

GAA

GAC

ACC .AGT

TCG

AAT

GCA

CAA

CAA

CTG

GAC

TCC

— _ł.-M

Leu

Giu

Glu

Asp

Thr Ser

Trp

Usn

Ala

Gln

Glm

Leu

Asp

Sar

Thr Asp

1730

1735

1740

u. A

GAT

GCT

GTA

GCC CAA

GAT

GAT

CCG

ATG

CAC

TAC

AAG

GTG

GCT ACC

3233

Pro

Asp

Ala

Val

Ala Glm

Asp

Asp

Pro

Mec

His

Tyr

Lys

Val

Ala Thr

1745

1750

1755

1760

ATG

GCG

ACG

TTG GAT

CTG

CTA

ATG

GCC

CGT

GGT

GAT

GCT

GCT TAC

5323

Pme

Mec

Ala

Thr

Leu Asp

Leu

Leu

Mec

Aia

Arg

Gly

Asp

Ala

Ala Tyr

1755

1770

17/5

CGC

CAG

TTA

GAG

CGT GAT

ACG

TTG

GCT

GAA

GCT

AAA

ATG

TGG

TAT ACA

5376

Arg

Glm

Leu

Glu

Arg Asp

Thr

Leu

Ala

Glu

Ala

Lys

Mec

Trp

Tyr Thr

1780

1735

179C

CAG

GCG

CTT

AAT

CTG TTG

GGT

GAT

GAG

CCA

CAA

GTG

ATG

CTG

AGT ACG

542 -

Glm

Ala

Leu

Asm

Leu Leu

Gly

Asp

Glu

Pro

Glm

Val

Mec

Leu

Ser Thr

1795

1300

1805

.ACT

TGG

GCT

AAT

CCA ACA

TTG

GGT

AAT

GCT

GCT

TCA

AAA

ACC

ACA CAG

5472

Thr

Trp

Ala

Asm

Pro Thr

Leu

Gly

Asn

Ala

Ala

Ser

Lys

Thr

Thr Glm

1310

1315

1320

CAG

GTT

CGT

CAG

CAA GTG

CTT

ACC

CAG

TTG

CGT

CTC

AAT

AGC

AGG GTA

5520

Glm

Val

Arg

Glm

Gln Val

Leu

Thr

Gln

Leu

•Arg

Leu

Asm

Ser

.Arg Val

1825

1330

1335

1840

AAA ACC CCG TTG 5532 Lys Thr Pro Leu

1344 ( 2 ) Dame dla sekwencji SEK NR ID: 53;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 1844 aminokwasów ( B ) Typ: aminokwas ( C ) Rodzaj nici: pojedyncza (D ) Topologia: liniowa ( u ) Typ cząsteczki: białko

( X ) Cpis sekwencji: SEK NR	ID: 49	( TcbAii);
Cechy	Cd	Do	Cpis
Peptyd	1	1844	peptyd TcbAii
Fragment	1	11	( SEK NR ID: 1 )
Fragment	978	990	( SEK NR ID: 23 )
Fragment	1387	1401	( SEK NR ID: 22 )
Fragment	1484	1505	( SEK NR ID: 24 )
Fragment	1527	1552	( SEK NR ID: 21 )

Phe i

Ile

Glm

Gly

Tyr 5

Ser

Asp

Leu

Phe

Gly 10

Asn

Arg

Ala

top

Asm 15

Tyr

Ala

Ala

Pro

Gly 20

Ser

Val

Ala

Ser

Mec 25

Phe

Ser

Pro

Ala

Ala 30

Tyr

Leu

Thr

Glu

Leu 35

Tyr

Arg

Glu

Ala

Lys 40

Asn

Leu

His

Asp

Sec 45

Ser

Ser

He

Tyr

Tyr 50

Leu

Asp

Lys

•Arg

-Arg 55

Pro

Asp

Leu

Ala

Ser 50

Leu

Mec

Leu

Ser

Glm 55

Lys

Asm

Mec

Asp

Glu 70

Glu

Ile

Ser

Thr

Leu 75

Ala

Leu

Ser

Asp.

Glu 30

Leu

Cys

Leu

Ala

Gly

Ile

Glu

Thr

Lys

Thr

Gly

Lys

Ser

Glm

Asp

Glu

182

186 242

30 95

Val

Mee

Asp

Met 100

Leu

Ser

Tyr

Arg 105

Leu

Ser

Gly

Glu

Thr 110

Pro

Tyr

His

His

Ala 115

Tyr

Glu

Thr

Val

Arg 120

Glu

Ile

Val

His

Glu 125

Arg

Asp

Pro

Gly

Phe 130

Arg

His

Leu

Ser

Gln 135

Ala

Pro

Ile

Val

Ala 140

Ala

Lys

Leu

Asp

Pro 145

Val

Thr

Leu

Leu

Gly 150

Ile

Ser

Ser

His

Ile 155

Ser

Pro

Glu

Leu

Ty*· 1S0

Asn

Leu

Leu

Ile

Glu 165

Glu

Ile

Pro

Glu

Lys 170

Asp

Glu

Ala

Ala

Leu 175

Asp

Thr

Leu

Tyr

Lys 130

Thr

Asn

Phe

Gly

Asp 135

Ile

Thr

Thr

Ala

Gln 190

Leu

Mee

Ser

Pro

Ser 195

Tyr

Leu

Ala

Arg

Tyr 200

Tyr

Gly

Val

Ser

Pro 205

Glu

Asp

Ile

Ala

Tyr 210

Val

Thr

Thr

Ser

Leu 215

Ser

His

Val

Gly

Tyr 220

Ser

Ser

Asp

Ile

Leu 225

Val

Ile

Pro

Leu

Val 230

Asp

Gly

Val

Gly

Lys 235

Met

Glu

Val

Val

Arg 240

Val

Thr

Arg

Thr

Pro 245

Ser

Asp

Asn

Tyr

Thr 250

Ser

Gln

Thr

Asn

Tyr 255

Ile

Glu

Leu

Tyr

Pro 260

Gln

Gly

Gly

Asp

Asn 265

Tyr

Leu

Ile

Lys

Tyr 270

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser 275

Phe

Gly

Leu

Asp

Asp 230

Phe

Tyr

Leu

Gln

Tyr 235

Lys

Asp

Gly

Ser

Ala 290

Asp

Trp

Thr

Glu

Ile 295

Ala

His

Asn

Pro

Tyr 300

Pro

Asp

Met

Val

Ile 305

Asn

Gln

Lys

Tyr

Glu 310

Ser

Gln

Ala

Thr

Ile 315

Lys

Arg

Ser

Asp

Ser 320

Asp

Asn

Ile

Leu

Ser 325

Ile

Gly

Leu

Gln

Arg 330

Trp

His

Ser

Gly

Ser 335

Tyr

Asn

Phe

Ala

Ala 340

Ala

Asn

Phe

Lys

Ile 345

Asp

Gln

Tyr

Ser

Pro 350

Lys

A.la

Phe

Leu

Leu 355

Lys

Met

Asn

Lys

Ala 360

Ile

Arg

Leu

Leu

Lys 365

Ala

Thr

Gly

Leu

Ser 370

Phe

Ala

Thr

Leu

Glu 375

Arg

Ile

Val

Asp

Ser 330

Val

Asn

Ser

Thr

Lys 335

Ser

Ile

Thr

Val

Glu 390

Val

Leu

Asn

Lys

Val 395

Tyr

Arg

Val

Lys

Phe 400

Tyr

Ile

Asp

Arg

Tyr 405

Gly

Ile

Ser

Glu

Glu 410

Thr

Ala

Ala

Ile

Leu 415

Ala

Asn

Ile

Asn

Ile 420

Ser

Gln

Gln

Ala

Val 425

Gly

Asn

Gln

Leu

Ser 430

Gln

Phe

Glu

Gln

Leu 435

Phe

Asn

His

Pro

Pro 440

Leu

Asn

Gly

Ile

Arg 445

Tyr

Glu

Ile

Ser

Glu 450

Asp

Asn

Ser

Lys

His 455

Leu

Pro

Asn

Pro

Asp 460

Leu

Asn

Leu

Lys

186 242

183

Pro 4 6 5

' Ser

A Ly

Asp 470

Nsp

G 1 -JA.,

Crg

Lys

Tla 475

Vsl

Leu

Lys

Trg

Ala 4 8 0

Phe

Tl o

. Va l

Tsn

Cla 435

Ser

Alu

Lnu

Ayr

Aln 490

Met

Leu

Leu

T 1 - 4. i β

Thr 495

Gsp

Crg

Lys

Tlu

Csp 500

Tly

Val

Ile

Lys

Tsn 505

Tsn

Leu

Tlu

Gsn

Leu 510

Ser

Gsp

Leu

Ayr

Leu 515

Vrl

Ser

Leu

Leu

Tla 520

Aln

Ile

His

Gsn

Leu 525

Chr

Ile

Ala

Tlu

Leu 530

Tsn

Ile

Leu

Leu

Val 535

Ile

Cys

u./

Ayr

Tly 540

Asp

Chr

Gsn

Ile

Ayr 545

Aln

Ile

Chr

Asp

Asp 550

Tsn

Lau

Gla

Lys

Ile 555

Val

Tlu

Thr

Leu Leu 5 60

Arp

Ile

Chr

Tln

Arp 5 65

Leu

Lys

Ahr

Tln

Lys 570

Arp

Ahr

Val

Ahr

-Gsp 575

Leu

Phe

Leu

Mer

Chr 580

Ahr

Cla

Ahr

Ayr

Ser 585

Thr

Ahr

Leu

Ahr

Pro 590

Tlu

Ile

Ser

Gsn

Leu 595

Ahr

Ala

Ahr

Leu

Ser 600

Ser

Thr

Lau

His

Tly 605

Lys

Alu

Ser

Leu

Ile 610

Tly

Tlu

.Asp

Leu

Lys 615

Grg

Cla

Met

Cla

Pro 620

Ays

Phe

Ahr

Ser

Cla 625

Leu

His

Leu

Ahr

Ser 630

Tln

Tlu

Vłl

Tla

Ayr 635

Asp

Leu

Leu

Leu

Arp 640

Ile

Asp

Tln

Ile

Gln 645

Pro

Cla

Tln

Ile

Chr 650

Vrl

Asp

Tly

Phe

Arp 655

Alu

Alu

Vłl

Tln

Chr 660

Ahr

Pro

Chr

Ser

Leu 665

Lys

Val

Ile

Ahr

Phe 670

Cla

Tln

Vłl

Leu

Tia 67 5

Tln

Leu

Ser

Leu

Ile 630

Ayr

Crg

Grg

Ile

Gly 685

Leu

Ser

Tlu

Chr

Alu 690

Leu

Ser

Leu

Ile

Vrl 695

Thr

Tln

Ser

Ser

Leu 700

Leu

Val

Gla

Tly

Lys 705

Ser

Ile

Leu

Asp

His 710

Tly

Lau

Leu

Ahr

Leu 715

Met

Cla

Leu

Tlu

Tly 720

Phe~

His

Ahr

Arp

Val 725

Gsn

Tly

Leu

Tly

Tln 730

His

Gla

Ser

Leu

Ile 735

Leu

.Gla

Gla

Leu

Lys 740

Asp

Tly

Cla

Leu

Ahr 745

Val

Ahr

Gsp

Val

Cla 750

Tln

Cla

Met

Gsn

Lys 755

Alu

Tlu

Ser

Leu

Leu 760

Tln

Met

Cla

Cla

ten 765

Aln

Val

Tlu

Lys

Csp 770

Leu

Ahr

Lys

Leu

Ahr 775

Ser

Arp

Chr

Gln

Ile 780

Gsp

Gla

Ile

Leu

Tln 735

Arp

Leu

Tln

Met

Ser 790

Ser

Gla

Leu

Cla

Val 795

Ser

Pro

Leu

Asp

Leu 300

Ala

Tly

Mec

Met

Ala 305

Leu

Lys

Ayr

Tly

Ile 310

Gsp

His

A.sn

Ayr

.Gla 315

Ala

Trp

Aln

Ala

.Ala 320

Gla

Gla

Gla

Leu

Met 825

Tla

Gsp

His

Cla

Gsn 830

G l n

Tla

tIo

Lys

Lys 335

Lau

Gsp

Tlu

Thr

Phe 340

Ser

Lys

Tia

Leu

Cys 845

Tsn

Ayr

Ayr

184

186 242

Ile

A.s n 350

Ala

/al

/al

Asp

Ser 355

Ala

Ala

Gly

/al

•Arg 860

Asp

•Arg

.-iS n

Leu

iy-r

Thr

Tyr

Leu

Leu

Ile

.Asp

Asn

Gln

/a i

Ser

Aia

Asp

/al ILe

3 6 5

370

375

880

Thr

Ser

.Arg

Ile

Ala

Glu

Ala

I la

Ala

Gly

Ile

Gln

Leu

Tyr

/al Asn

885

890

395

.Arg

Aia

Leu

Asn

Arg

Asp

Glu

Gly

Gln

Leu

Ala

Ser

Asp

/al

Ser Thr

900

905

910

Arg

Gln

Phe

Phe

Thr

Asp

Trp

Glu

Arg

Tyr

Asn

Lys

Arg

Tyr

Ser Thr

915

920

925

Trp

Aia

Gly

/al

Ser

Glu

Leu

/al

Tyr

Tyr

Pro

Glu

Asn

Tyr

/al Asp

530

935

940

Pro

Thr

Gln

Arg

Ile

Gly

Gln

Thr

Lys

Mec

Met

Asp

Ala

Leu

Leu Gln

945

950

955

960

Ser

Ile

Asn

Gln

Ser

Gln

Leu

Asn

Ala

Asp

Thr

/al

Glu

Asp

Ala Phe

965

970

975

Lys

Thr

Tyr

Leu

Thr

Ser

Phe

Glu

Gln

/al

Ala

Asn

Leu

Lys

/al Iie

980

985

990

Ser

Ala

Tyr

His

-Asp

Asn

/al

Asn

/al

Asp

Gln

Gly

Leu

Thr

Tyr Phe

995

1000

1005

Ile

Gly

Ile

Asp

Gln

Aia

Ala

Pro

Gly

Thr

Tyr

Tyr

Trp

Arg

Ser /al

1010

1015

1020

Asp

His

Ser

Lys

Cys

Glu

Asn

Gly

Lys

Phe

Ala

Ala

Asn

Ala

Trp Gly

1025

1030

1035

1040

Glu

Trp

Asn

Lys

Ile

Thr

Cys

Ala

/al

Asn

Pro

Trp

Lys

Asn

Ile Ile

1045

1050

1055

Arg

Pro

/al

/al

Tyr

Mec

Ser

Arg

Leu

Tyr

Leu

Leu

Trp

Leu

Glu Gln

1060

1065

1070

Gln

Ser

Lys

Lys

Ser

Asp

Asp

Gly

Lys

Thr

Thr

Ile

Tyr

Gln

Tyr Asn

1075

1080

1085

Leu

Lys

Leu

Ala

His

Ile

Arg

Tyr

Asp

Gly

Ser

Trp

Asn

Thr

Pro Phe

1090

1095

1100

Thr

Phe

Asp

/al

Thr

Glu

Lys

/al

Lys

Asn

Tyr

Thr

Ser

Ser

Thr Asp

1105

1110

1115

1120

Ala

Ala

Glu

Ser

Leu

Gly

Leu

Tyr

Cys

Thr

Gly

Tyr

Gln

Gly

Glu .Asp

1125

1130

1135

Thr

Leu

Leu

/al

Met

Phe

Tyr

Ser

Mec

Gln

Ser

Ser

Tyr

Ser

Ser Tyr

1140

1145

1150

Thr

Asp

Asn

Asn

Ala

Pro

/al

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Phe

Ala

Asp Mett

1155

1160

1165

Ser

Ser

Asp

Asn

Met

Thr

Asn

Ala

Gln

Ala

Thr

Asn

Tyr

Trp

Asn Asn

1170

1175

1130

Ser

Tyr

Pro

Gln

Phe

Asp

Thr

/al

Mec

Aia

Asp

Pro

•Asp

Ser

Asp Asn

1135

1190

1195

1200

Lys

Lys

/al

Ile

Thr

.Arg

Arg

/al

Asn

Asn

Arg

Tyr

Ala

Glu

.Asp Tyr

1205

1210

1215

Glu Ile Pro Ser Sar /al Thr Ser Asn Ser Asn Tyr Ser Trp Gly Asp

186 242

185

		1225	1230
H i s	Ser Leu Thr Met Leu Tyr	Gly Gly Ser Val	Pro Asn ile Thr Phe
	123 5	1240	1245
Glu	Ser Ala Ala Glu Asp Leu	Arg Leu Ser Thr	Asn Mec Ala Leu Ser
	1250 1255	5	1260
ΐ i —	ile His Asn Gly Tyr Ala	Gly Thr .Trg Trg	Ile Gln Cys Tsn Leu
1 6 5 i u	5 1270	1)5 i. <	5 1230
Mec	Lys Gln Tyr .Ala Ser Leu	Gly Tsp Lys Phe	Ile Ile Tyr top Ser
	1235	1290	1295
Ser	Phe .Tsp Tsp Ala Tsn Arg	Phe Tsn Leu Cal	Pro Leu Phe Lys Phe
	1300	1305	1310
Gly	Lys .Tsp Glu Tsn Ser Tsp	Tsp Ser Ile Cys	Ile Tyr ton Glu Asn
	1315	1320	1325
Pro	Ser Ser Glu Tsp Lys Lys	Trp Tyr Phe Ser	Ser Lys top top ton
	1330 1335	1340
Lys	Thr Ala Tsp Tyr Tsn Gly	Gly Thr Gln Cys	Ile top Tla Gly Thr
1345 1350	1355 1360
Ser	Tsn Lys Tsp Phe Tyr Tyr	Tsn Leu Gln Glu	Ile Glu Cal Ile Ser
	1365	1370	1375
Cal	Thr Gly Gly Tyr Trp Ser	Ser Tyr Lys Ile	Ser ton Pro Ile ton
	1380	1385	1390
Ile	Tsn Thr Gly Ile Tsp Ser	Ala Lys Val Lys	Cal Thr Cal Lys Ala
	1395	1400	1405
Gly	Gly Tsp Tsp Gln Ile Phe	Thr Ala top ton	Ser Thr Tyr Cal Pro
	1410 1415	1420
Gln	Gln Pro Ala Pro Ser Phe	Glu Glu Mec Ile	Tyr Gln Phe Asn ton
1425 1430	1435 1440
Leu	Thr Ile Tsp Cys Lys Tsn	Leu ton Phe Ile	top ton Gln Ala His
	1445	1450	1455
Ile	Glu Ile Asp Phe Thr Ala	Thr Ala Gln top	Gly Arg Phe Leu Gly
	1460	1465	1470
Tla	Glu Thr Phe Ile Ile Pro	Cal Thr Lys Lys	Cal Leu Gly Thr Glu
	1475	148(	1485
Tsn	Cal Ile Ala Leu Tyr Ser	Glu Asn Asn Gly	Cal Gln Tyr Mec Gln
	1490 1495	150(
Ile	Gly Ala Tyr Arg Thr Arg	Leu Tsn Thr·Leu	Phe Ala Gln Gln Leu
1505	1510	1222	i 1520
Cal	Ser Arg Ala Tsn Arg Gly	Ile top Ala Cal	Leu Ser Mec Glu Thr
	1525	153 (	1535
Gln	Tsn Ile Gln Glu Pro Gln	Leu Gly Tla Gly	Thr Tyr Cal Gln Leu
	1540	1545	1550
Cal	Leu Tsp Lys Tyr Tsp Glu	Ser Ile His Gly	Thr ton Lys Ser Phe
	1222	1560	1565
Tla	Ile Glu Tyr Cal Tsp Ile	Phe Lys Glu ton	top Ser Phe Cal Ile
	1570 1575		1580
(yr	Gln Gly Glu Leu Ser Glu	Thr Ser Gin Thr	Cal Cal Lys Cal Phe
285	1590	1595	1600

186

186 242

Ls“

i e r

Tyr

Phe

lle 1Ó0:

GLu 5

Al a

Thr

G i y

Asn Lys 1610

A.sn

His

Leu

Trp Val 1615

•Arg

Ala

Lys

Tyr

Gln

Lys

Glu

Thr

Thr

Asp Lys

Ie

Leu

Phe

Asp Arg

1520

1625

1630

Thr

Asp

Glu

Lys

Asp

Pro

His

Gly

Trp

Phe Leu

Ser

Asp

Asp

His Lys

1535

1640

1645

Thr

Phe

Ser

Gly

Leu

Ser

Ser

Ala

Gln

Ala Leu

Lys

Asn

Asp

Ser Glu

i o 5 0

1655

i o 6C

1

Pro

Mec

Asp

Phe

Ser

Gly

Ala

Asn

.Ala

Leu Tyr

Phe

Trp

Glu

Leu Phe

1665

157C

1675

1680

Tyr

Tyr

Thr

Pro

Mec

Mec

Mee

Ala

His

Arg Leu

Leu

Gln

Glu

Gln Asn

1635

169C

1695

Phe

Asp

Ala

Ala

Asn

His

Trp

Phe

Arg

Tyr Val

Trp

Sar

Pro

Ser Gly

1700

1705

1710

Tyr

Ile

Val

Asp

Gly

Lys

Ile

Ala

Ile

Tyr His

Trp

Asn

Val

Arg Pro

1715

1720

1725

Leu

Glu

Glu

Asp

Thr

Ser

Trp

Asn

Ala

Gln Gln

Leu

Asp

Ser

Thr Asp

1730

1735

1740

Pro

Asp

Ala

Val

Ala

Gln

Asp

Asp

Pro

Mec His

Tyr

Lys

Val

Ala Thr

1745

1750

1755

17 60

Phe

Mec

Ala

Thr

Leu

Asp

Leu

Leu

Mec

Ala Arg

Gly

Asp

Ala

Ala Tyr

1765

1770

1775

Arg

Gln

Leu

Glu

Arg

Asp

Thr

Leu

Ala

Glu Ala

Lys

Mec

Trp

Tyr Thr

1730

1785

1790

Gln

Ala

Leu

Asn

Leu

Leu

Gly

Asp

Glu

Pro Gln

Val

Mec

Leu

Ser Thr

1795

1300

1805

Thr

Trp

Ala

Asn

Pro

Thr

Leu

Gly

Asn

Ala Ala

Ser

Lys

Thr

Thr Gln

1310

1815

182C

Gln

Val

Arg

Gln

Gln

Val

Leu

Thr

Gln

Leu Arg

Leu

Asn

Ser

Arg Val

1325

1330

1835

1340

Lys Thr Pro Leu 1344 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 54;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 1722 par zasad ( B ) Typ: kwas nukleinowy ( C ) Rodzaj nici: podwójna ( D ) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsłeczki: DNA (genomowa) ( xi) Opis sekwencji. SEK NR ID. 54 ( TcbAiii obszar kodowania);

CTA

lajA

ACA

CCC

AAT

TCC

CTG

ACC

TCT

TTA

TTC

CTG

CCG

GAA

AAT

43

Leu

Gly

Thr

Ala

Asn

Ser

Leu

Thr

Ala

Leu

Phe

Leu

Pro

Gln

Glu

Asn

I

5

10

15

AGC

,-waj

CTC

AAA

aj\jA_

TAC

TGG

CGG

ACA

CTG

GC*j

CAG

CGT

ATG

TTT

AAT

96

Ser

f · / — 2 3

Leu

Lys

Gly

Tyr

Trp

Arg

Thr

Leu

Ala

Gln

•Arg

Mec

Phe

Asn

20

25

30

186 242

187

TTA CCT Leu Arg

3 5

-Χ-. x As n

— X -J . Leu

! x — j -

Ile

j Ir.

Pro

Lsu

45

X X -J Lsu

Pro

Lsu

X -i -i

• Asp 40

U - i

TAT TCT

' .AAA

. CCG

GCT

GAT

CCA

AAA

J — -

TTA

CTG

Ł

GCG

GCC

-jTT

-T»/-' »

a 3 £

Τ’.-'Τ .-\id

Lys

Pro

Aia

Asp

Pro

Lys

.Aia

Leu

Leu

Ser

Ala

Ala

'/a i

Ser

50

55

50

-JM Ł 1^1

C.AA

GGG

GGA

GCC

/»λμ

TTG

CCG

AAG

/—/—/— —I1.—

CGG

CTG

ACT

ATT

CAC

240

Ala Ser

Gin

Gly

Giy

Ala

Asp

Leu

Pro

Lys

Axd

Pro

Leu

Thr

Ile

His

5 5

70

OS

30

CCC TTC

CCT

CAA

ATG

CTA

GAA

GGG

GCA

CGG

TTG

GTT

AAC

CAG

CTT

233

Arg Phe

Pro

Gln

Mec

Lau

Glu

Gly

Aia

Arg

Gly

Leu

Val

Asn

Gln

Leu

35

90

95

ATA CAG

TTC

GGT

AGT

TCA

CTA

TTG

GGG

TAC

AGT

GAG

CGT

CAG

GAT

GCG

3 3 6

Ile Gln

Phe

Gly

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Tyr

Ser

Giu

Arg

Gln

Asp

Ala

100

105

110

GAA GCT

ATG

AGT

C.AA

CTA

CTG

CAA

ACC

CAA

GCC

AGC

GAG

TTA

ATA

CTG

334

Glu Ala

Mec

Ser

Gln

Leu

Leu

Gln

Thr

Gin

Ala

Ser

Glu

Leu

Ile

Leu

115

120

125

ACC AGT

ATT

CGT

ATG

CAG

GAT

AAC

CAA

TTG

GCA

GAG

CTG

GAT

TCG

GAA

432

Thr Ser

Ile

Arg

Mec

Gln

Asp

Asn

Gln

Leu

Ala

Glu

Leu

Asp

Ser

Glu

130

135

140

.AAA ACC

GCC

TTG

CAA

GTC

TCT

TTA

GCT

GGA

GTG

CAA

CAA

CGG

TTT

GAC

430

Li’ s Thr

Ala

Leu

Gln

Val

Ser

Leu

Ala

Gly

Val

Gln

Gln

Arg

Phe

Asp

145

150

155

160

AGC TAT

AGC

CAA

CTG

TAT

GAG

GAG

AAC

ATC

AAC

GCA

GGT

GAG

CAG

CGA

523

Ser T/r

Ser

Gln

Leu

Tyr

Glu

Glu

Asn

Ile

Asn

Ala

Gly

Glu

Gln

Arg

165

17 0

175

GCG CTG

GCG

TTA

CGC

TCA

GAA

TCT

GCT

ATT

GAG

TCT

CAG

GGA

GCG

CAG

57 5

Ala Leu

Ala

Leu

Arg

Ser

Glu

Ser

Ala

Ile

Glu

Ser

Gln

Gly

Ala

Gln

180

185

190

ATT TCC

CGT

ATG

GCA

GGC

GCG

GGT

GTT

GAT

ATG

GCA

CCA

AAT

ATC

TTC

624

Ile Ser

Arg

Mec

Ala

Gly

Ala

Gly

Val

Asp

Met

Ala

Pro

Asn

Ile

Phe

195

200

205

GGC CTG

GCT

GAT

GGC

GGC

ATG

CAT

TAT

GGT

GCT

ATT

GCC

TAT

GCC

ATC

57 2

Gly Leu

Ala

Asp

Gly

Gly

Mec

His

Tyr

Gly

Ala

Ile

Ala

Tyr

Ala

Ile

210

215

220

GCT GAC

GGT

ATT

GAG

TTG

AGT

GCT

TCT

GCC

AAG

ATG

GTT

GAT

GCG

GAG

720

Ala Asp

Gly

Ile

Glu

Leu

Ser

Ala

Ser

Aia

Lys

Mec

Val

Asp

Ala

Glu

225

230

235

240

AAA GTT

GCT

CAG

TCG

GAA

ATA

TAT

CGC

CGT

CGC

CGT

CAA

GAA

TGG

AAA

763

Lys Val

Ala

Gln

Ser

Glu

Ile

Tyr

Arg

Arg

Arg

Arg

Gln

Glu

Trp

Lys

245

250

255

ATT CAG

CGT

GAC

AAC

GCA

CAA

GCG

GAG

ATT

AAC

CAG

TTA

AAC

GCG

CAA

316

Ile Gln

Arg

Asp

Asn

Ala

Gln

Ala

Glu

Ile

Asn

Gln

Leu

Asn

Ala

Gln

260

265

270

CTG GAA

TCA

CTG

TCT

ATT

CGC

CGT

GAA

GCC

GCT

GAA

ATG

CAA

AAA

GAG

3 6 4

Leu Glu

Ser

Leu

Ser

Ile

Arg

Arg

Glu

Ala

Ala

Glu

Mec

Gln

Lys

Glu

275

280

285

TAC CTG

AAA

ACC

CAG

CAA

GCT

CAG

GCG

CAG

GCA

CAA

CTT

ACT

TTC

TTA

912

T/r Leu

Lys

Thr

Gln

Gln

Ala

Gln

Ala

Gln

Ala

Gln

Leu

Thr

Phe

Leu

290

295

300

AuA AGC

AAA

TTC

AGT

AAT

CAA

GCG

TTA

TAT

AGT

TGG

TTA

CGA

GGG

-J 1

5 5 2

Arg Ser

Lys

Phe

Ser

Asn

Gln

Ala

Leu

» T- *· I -

Ser

Trp

Leu

Arg

Giy

Arg

3 25

3 10

3 15

320

188

186 242

T TG Leu

. - .A Sar

gGT Cly

UTT ile

TAT T* -r • l · 325

Pha

CAG Cln

Phe

TAT Tyr

CAC Usp 330

TTG Leu

CCC Ala

,GTA Val

TCA Ser

CCT Arg 335

TCC Cys

10 03

CTG

ATG

CCA

CAG

CUA

TCC

TAT

CAA

TGG

CAA

GCT

UAT

CUT

AUT

TCC

ATT

1056

Leu

Mec

Ala

Clu

Cln

Ser

Tyr

Gin

Trp

Clu

Ala

Asn

Asp

Asn

Ser

il·

340

345

350

uCC

TTT

CTC

.UUU

CCG

CCT

CCU

TGG

CUA

CCA

ACT

TAC

GCC

GGC

TTA

TTG

1101

Sar

Ph·

p . 1

Lys

Pro

Cly

Ala

Trp

Gln

Cly

Thr

Tyr

Ala

Gly

Lcu

Leu

355

360

365

TGT

GGA

CUA

CCT

TTG

ATA

CAA

AUT

CTG

CCA

CAA

ATG

CUA

GUC

GCA

TAT

1152

cys

Gly

Clu

Ala

Leu

Ile

Gln

Asn

Lcu

Ala

CLn

Mec

Glu

Clu

Ala

Tyr

370

375

380

CTG

AAA

TCC

CAU

TCT

CCC

GCT

TTC

CUA

CTU

GUA

CGC

ACC

CTT

TCA

TTC

1200

Lau

Lys

Trp

Glu

Ser

Arg

Ala

Leu

Glu

Val

Clu

Arg

Thr

Val

Ser

Leu

335

390

395

400

GCA

GTC

CTT

TAT

GUT

TCU

CTG

GAA

CGT

AAT

GUT

CGT

TTT

AAT

TTA

GCG

1243

Ala

Val

Val

Tyr

Asp

Ser

Leu

Glu

Gly

Asn

Asp

Arg

Phe

Usn

Leu

Ula

405

410

415

GAA

CAA

ATU

CCT

CCU

TTA

TTG

CAT

AAG

GCG

GAG

GGA

ACA

GCA

GGA

ACT

1296

Clu

Cln

Ile

Pro

Ala

Leu

Leu

Usp

Lys

Cly

Glu

Cly

Thr

Ula

Gly

Thr

420

425

430

AAA

CUA

AAT

CGG

TTA

TCA

TTC

GCT

AUT

CCT

ATC

CTC

TCA

GCT

TCC

CTC

1344

Lys

Glu

Asn

Cly

Leu

ser

Leu

Ula

Usn

Ala

Ile

Leu

Ser

Ula

Ser

Val

435

440

445

UAA

TTG

TCC

GUC

TTG

AUU

CTC

GGU

UCC

GUT

TAT

CCU

GAC

UGT

UTC

GTT

1392

Lys

Lcu

Ser

Asp

Lcu

Lys

Leu

Gly

Thr

Asp

Tyr

Pro

Usp

Ser

II·

Val

450

455

460

CGT

UCC

AAC

AAC

GTT

CCT

CCT

UTT

UUG

CAA

UTC

ACT

GTT

TCC

CTU

CCT

1440

Cly

Ser

Usn

Lys

Val

Arg

Arg

II·

Lys

Gln

Ile

Ser

Val

Ser

Leu

Pro

465

470

475

430

CCA

TTG

GTT

GCG

CCT

TUT

CAC

GAT

GTT

CAC

GCT

UTC

CTC

ACC

TAT

GGT

1488

Ala

Leu

Val

Cly

Pro

Tyr

Cln

Usp

Val

Gln

Ala

Mec

Leu

Ser

Tyr

Cly

485

490

495

CCC

UCT

ACT

CUA

TTC

CCC

AUU

GGT

TGT

TCA

GCC

TTG

GCT

GTC

TCT

CAT

1536

Cly

Ser

Thr

Cln

Leu

Pro

Lys

Cly

Cys

Ser

Ula

Leu

Ala

Val

Ser

His

500

505

510

CCT

UCC

AAT

CAT

UGT

GCT

CAC

TTC

CAC

TTG

GAT

TTC

UAT

GAC

GCC

AAU

1534

Cly

Thr

Asn

Asp

Ser

Gly

Cln

Ph·

Cln

Lau

Asp

Phe

Usn

Usp

Gly

Lys

515

520

525

TAC

CTG

CCA

TTT

CUA

GCT

UTT

GCT

CTT

GAT

GAT

CUC

GGT

UCA

CTG

AAT

1632

Tyr

Leu

Pro

Ph·

Clu

Gly

Il·

Ula

Leu

Asp

Asp

Cln

Gly

Thr

Leu

Usn

530

535

540

CTT

CUA

TTT

CCG

AAT

GCT

UCC

GAC

AAG

CAC

AUA

GCA

ATA

TTG

CAU

ACT

1630

Leu

Gln

Phe

Pro

Asn

Ula

Thr

Asp

Lys

Gln

Lys

Ala

Ile

Leu

Cln

Thr

545

550

555

560

ATG

AGC

CUT

ATT

UTT

TTG

CAT

ATT

CCT

TUT

ACC

ATC

CCT

TAA

1722

Mec

Ser

Asp

Ile

Ile

Leu

His

Ile

Urg

Tyr

Thr

Ile

Urg

• · ·

565

570

573

( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 55;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 573 aminokwasów (B ) Typ: aminokwas

186 242

189 ( C ) Rodzaj nici: pojedyncza ( D ) Topologia: liniowa

	(ii) Typ cząsteczki: białko
( xi) Opis sekwencji:	SEK NR ID: 55 (TcbAiii);
Leu £	: Gly Thr Tla Tsn Ser 5	Leu Thr Ala Leu Phe Leu Pro Gin Clu Asn 10 15
Ser	Lys Leu Lys Cly Tyr 20	Trp Arg Thr Leu A1a Gln Arg Mee Phe Asn 25 30
Leu	Arg His Asn Leu Ser 35	Ile Asp Gly Gin Pro Leu Ser Leu Pro Leu 40 45
Tyr	Ale Lys Pro Ale Asp 50	Pro Lys Ale Leu Leu Ser Ale A1a Val Ser 55 60
A1a 65	Ser Gln Gly Gly Ala 70	Asp Leu Pro Lys Ale Pro Leu Thr Ile His 75 80
Arg	Phe Pro Cln Mee Leu 85	Clu Gly Ale Arg Gly Leu Vel Asn Cln Leu 90 95
Ile	Gln Phe Gly Ser Ser 100	Leu Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Gln Asp Ala 105 110
Glu	A1a Met Ser Gln Leu 115	Leu Cln Thr Cln Ala Ser Glu Leu Ile Leu 120 125
Thr	Ser Ile Arg Mat Gln 130	Asp Asn Gln Leu Ale Glu Leu Asp Ser Glu 135 140
Lys 145	Thr Ale Leu Gln Va1 150	Ser Leu Ale Gly Va1 Gln Gln Arg Phe Asp 155 160
Ser	Tyr Ser Gln Leu Tyr 155	Glu Glu Asn Ile Asn Ala Gly Glu Gln Arg 170 175
Ala	Leu Ale Lau Arg Ser 130	Glu Ser Ala Ile Glu Ser Gln Gly A1a Gln 185 190
Ile	Ser Arg Mee Ala Gly 195	Ale Cly Va1 Asp Met Ala Pro Asn Ile Phe 200 205
Gly	Leu A1a Asp Gly Gly 210	Met His Tyr Gly A1a Ile A1a Tyr A1a Ile 215 220
Ale 225	Asp Gly Ile Glu Leu 230	Ser A1a Ser A1a Lys Met Va1 Asp Ala Glu 235 240
Lys	Va1 A1a Gln Ser Glu 245	Ile Tyr Arg Arg Arg Arg Gln Glu Trp Lys 250 255
Ile	Gln Arg Asp Asn A1a 260	Gln Ale Glu Ile Asn Gln Leu Asn A1a Gln 265 270
Leu	Glu Ser Leu ser Ile 27 5	Arg Arg Glu Ala A1a Glu Met Gln Lys Glu 280 285
Tyr	Leu Lys Thr Cln Cln 290	Ale Cln A1a Cln Ale Gln Leu Thr Phe Leu 295 300
Trg 305	Ser Lys Phe Ser Asn 310	Gln Ale Leu Tyr Ser Trp Leu Arg Gly Arg 315 320
Leu	Ser Cly Ile Tyr Phe 325	Cln Phe Tyr Asp Leu A1a Vel Ser Arg Gys 330 335

190

186 242

Leu Mec

Ala

Glu Gln Ser Tyr Gln Trp Glu

Ala

Asn

Asp

Asn 350

Ser

Ile

340

345

Ser

Phe

Val

Lys

Pro

Gly

Ala

Trp

Gln

Gly

Thr

Tyr

Ala

Gly

Leu

Leu

355

360

365

Cys

Gly

Glu

Ala

Lau

Ile

Gln

Asn

Leu

Ala

Gln

Met

Glu

Glu

Ala

Tyr

370

375

330

Lau

Lys

Trp

Glu

Ser

Arg

Ala

Leu

Glu

V<al

Glu

Arg

Thr

Val

Ser

Leu

335

390

395

400

Ala

Val

Val

Tyr

Asp

Ser

Leu

Glu

Gly

Asn

Asp

Arg

Phe

Asn

Lau

Ala

405

410

415

Glu

Gln

Ile

Pro

Ala

Leu

Leu

Asp

Lys

Gly

Glu

Gly

Thr

Ala

Gly

Thr

420

425

430

Lys

Glu

Asn

Gly

Leu

Ser

Leu

Ala

Asn

Ala

Ile

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

435

440

445

Lys

Leu

Ser

Asp

Leu

Lys

Leu

Gly

Thr

Asp

Tyr

Pro

Asp

Ser

Ile

Val

450

455

460

Gly

Ser

Asn

Lys

Val

Arg

Arg

Ile

Lys

Gln

Ile

Ser

Val

Ser

Leu

Pro

465

470

475

430

Ala

Lau

Val

Gly

Pro

Tyr

Gln

Asp

Val

Gln

Ala

Mac

Lau

Ser

Tyr

Gly

435

490

495

Gly

Ser

Thr

Gln

Leu

Pro

Lys

Gly

Cys

Ser

Ala

Leu

Ala

Val

Ser

His

500

505

510

Gly

Thr

Asn

Asp

Ser

Gly

Gin

Phe

Gln

Leu

Asp

Phe

Asn

Asp

Gly

Lys

515

520

525

Tyr

Lau

Pro

Phe

Glu

Gly

Ile

Ala

Lau

Asp

Asp

Gln

Gly

Thr

Leu

Asn

530

535

540

Leu

Gln

Phe

Pro

Asn

Ala

Thr

Asp

Lys

Gln

Lys

Ala

Ile

Leu

Gln

Thr

545

550

555

560

Mac

Ser

Asp

Ile

Ile

Leu

His

Ile

Arg

Tyr

Thr

Ile

Arg

• « ·

565

570

573

(2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 56;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 2898 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA ( genomowa ) (xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 56 (tccA)

ATG AAT GAA CTG GGC AGT GGG CTG ATT TCG CGG ACC GAA GAG ATG GAC 43 1 Mec Asn Gln Leu Ala Ser Pro Lau Ile Ser Arg Thr Glu Glu Ile His 16

49

AAG

TTA

CCC

GGT

AAA

TTG

AGG

GAT

CTT

GGT

TAT

AGC

TGA

GTG

TTT

GAT

9 6

17

Asn

Lau

Pro

Gly

Lys

Leu

Thr

Asp

Leu

Gly

Tyr

Thr

Ser

Val

Phe

Asp

32

97

GTG

GTA

CGT

ATG

CCG

CGT

GAG

CGT

TTT

ATT

CGT

GAG

CAT

CGT

GCT

GAT

144

186 242

191

33

Val

Val

Arg

Mee

Pro

srg

Glu

Arg

Phe

Ile

srg

Glu

His

Arg

Sla

Ssp

4 8

145

CTC

: GGG

; cgc

' AGT

’ GCT

' GSA

. SAS

. ATG

TAT

' GAC

CTG

GCA

GTG

GGC

TAT

GCT

192

49

Leu

. Gly

Srg

Ser

Als

. Glu

Lys

Mec

Tyr

Ssp

Leu

Ala

Val

Gly

Tyr

Ala

64

193

CAT

' CAT

GTG

TTA

CAC

CAT

TTT

CGC

CGT

AST

TCT

CTT

AGT

TSA

GCT

GTT

240

6 5

His

Tln

Val

Leu

His

HIS

Phe

Arg

Srg

Ssn

Ser

Leu

Ser

Glu

Ala

Val

30

241

CAT

TTT

GGC

TTG

AGA

AGT

CCG

TTC

TCC

GTA

TCA

GGC

CCG

TAT

TAC

GCC

233

31

Gln

Phe

-Gly

Leu

Arg

Ser

Pro

Phe

Ser

Val

Ser

Tly

Pro

Ssp

Tyr

Ala

96

289

AAT

CSG

TTT

CTT

GST

GCA

SAC

ACG

TTT

TGG

SAS

TAT

AAA

TCA

CCA

AGT

336

97

Asn

Tln

Phe

Leu

Ssp

Ala

Ssn

Thr

Tly

Trp

Lys

Ssp

Lys

Sla

Pro

Ser

» 1 2

337

GGA

TCS

CCT

GSA

GCC

AST

GAT

GCT

CCG

GTA

TCC

TAT

CTT

ACT

CAT

ATT

334

113

Gly

Ser

Pro

Glu

Ala

Asn

Asp

Ala

Pro

Val

Ala

Tyr

Leu

Thr

His

Ile

123

335

TAT

CAA

TTG

GCC

CTT

GAS

CAT

GAA

SAG

SAT

GGC

GCC

ACT

ACC

STT

ATG

432

129

Tyr

Gln

Leu

Ala

Leu

Glu

Tln

Tlu

Lys

Ssn

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile

Mec

144

433

SAT

SCT

CTG

TCG

GAC

CTT

CGC

CCC

GAT

CTG

GGT

GCT

TTG

TTA

ATT

SAT

480

145

Asn

Thr

Leu

Ala

Glu

Srg

Arg

Pro

Asp

Leu

Tly

Ala

Leu

Leu

Ile

Ssn

160

431

GST

SAA

TCS

STC

AST

GAG

GTG

ATA

CCG

CAA

TTT

CAT

TTT

GTC

AST

GSA

528

161

Ssp

Lys

Sla

Ile

Asn

Glu

Val

Ile

Pro

Gln

Leu

Tln

Leu

Val

Asn

Glu

175

529

ATT

CTG

TCC

SSA

TCT

ATT

CAG

SAG

SAA

CTG

ATT

TTT

ACT

TAT

CTG

GAA

57 6

177

Ile

Leu

Ser

Lys

Sla

Ile

Tln

Lys

Lys

Leu

Ser

Leu

Thr

Ssp

Leu

Glu

192

577

GCT

GTA

SAC

TCC

ATS

CTT

TCC

ACT

ACC

CGT

TAC

CCT

AST

AST

CTG

CCT

624

193

Ala

Val

Ssn

Sla

Srg

Leu

Sar

Thr

Thr

Srg

Tyr

Pro

Asn

Asn

Lau

Pro

208

525

TST

CAT

TST

GTT

CAT

CAG

CAT

ATT

CAG

ACA

TCT

CAA

TCG

GTA

TTG

GGT

672

209

Tyr

His

Tyr

Tly

His

Gln

Tln

Ile

Gln

Thr

Ala

Gln

Ser

Val

Leu

Tly

224

673

ACT

SCG

TTG

CSA

GST

ATC

ACT

TTG

CCA

CAG

ACT

CTG

GAT

CTT

CCG

CSA

720

225

Thr

Thr

Leu

Gln

Ssp

Ile

Thr

Leu

Pro

Gln

Thr

Lau

Ssp

Leu

Pro

Gln

240

721

SAC

TTC

TTG

GCS

ACA

TCA

SAS

GGA

SAS

CTG

AGC

TAT

ACT

ACT

GCC

AGT

753

241

Asn

Phe

Trp

Ala

Thr

Ala

Lys

Tly

Lys

Leu

Ser

Asp

Thr

Thr

Ala

Ser

256

769

TCT

TTG

ACC

CGA

CTG

CSA

ATC

ATT

TCT

SGT

CAG

TTT

TCT

CCA

TST

CST

816

257

Ala

Leu

Thr

Srg

Leu

Tln

Ile

Mec

Ala

Ser

Tln

Phe

Ser

Pro

Tlu

Gln

272

817

CAT

ASA

ATC

ATT

ACG

GAT

ACT

TTC

GGT

CAG

TAT

TTC

TAT

CAT

CTT

AAC

364

273

Gln

Lys

Ile

Ile

Thr

Glu

Thr

Val

Tly

Gln

Asp

Phe

Tyr

Gln

Leu

Ssn

233

355

TAT

TGT

GAC

AGT

TCG

CTT

ACT

TTG

AST

SGT

TTC

ATC

GAC

ATG

SCC

STA

912

239

Tyr

Gly

Asp

Ser

Ser

Leu

Thr

Val

Asn

Ser

Phe

Ser

Asp

Mec

Thr

Ile

Jv4

192

186 242

9 . 3

ATC

ACT GAT

CGT

TCT

* G TG τ

TTG

ACT

.TT

CSC

G * — (AG

GTA

GAA.

CTG

Λ i. J

TTS

9 - ·?

3C5

Met

Thr Asp

Arg

Thr

Ser

Leu

Thr

Vai

Pro

Gln

Val

Clu

Leu

Met

—au

- - J

961

TCT

TCA ACT

GTC

GGA

GGT

TCT

AGC

CTT

CTT

AAG

TCT

CAT

i »T

GTC

aGT

1CC3

321

Cys

Ser Thr

Vel

cly

Giy

Ser

Thr

Vel

Vel

Lys

Ser

Asp

Asn

Val

Ser

3 3 3

1009

TGT

GGT GAC

AGG

ACA

CCG

ACC

CCA

TTT

GCG

TAT

CGC

CGC

CCG

TTT

ATT

1056

3 3 7

Ser

Cly Asp

Thr

Thr

Ala

Thr

Pro

Phe

Ale

Tyr

Cly

Ale

Arg

Phe

Ile

3 52

1057

CAT

CGG GGT

AAG

CCG

GAG

GCG

ATT

ACG

CTG

AGT

CCC

AGT

CGT

GGG

Gag

1104

353

His

A1a Giy

Lys

Pro

Glu

Ala

Ile

Thr

Leu

Ser

Arg

Ser

Giy

Ale

Giu

3 56

1105

GGC

CAT TTT

CGT

CTG

AGC

CTT

AAG

AAT

CTG

AGA

GAT

GAC

AAG

TTG

GA0

1152

369

Ale

His Phe

Ale

Leu

Thr

Vel

Asn

Asn

Leu

Thr

Asp

Asp

Lys

Leu

Asp

3 34

1153

CGT

ATT AAC

CGG

ACA

CTG

GCC

CTG

CAA

AAA

TGG

CTG

AAT

CTG

CGT

TAT

1200

335

Arg

Ile Asn

Arg

Thr

Val

Arg

Leu

Cln

Lys

Trp

Leu

Asn

Leu

Pro

Tyr

4 00

1201

GAG

GAT ATT

GAG

CTC

TTA

CTG

AGT

TGT

GCT

ATG

GAT

GGG

GAA

ACA

CGA

1248

401

Clu

Asp Iie

Asp

Leu

Leu

Vel

Thr

Ser

Ala

Met

Asp

A1a

Clu

Thr

Gly

416

1249

AAT

AGG GCG

GTG

TGG

ATG

AAG

GAG

AAT

AGG

GTG

GGT

ATG

TTG

CGA

GTG

1296

417

Asn

Thr Ale

Leu

Ser

Met

Asn

Asp

Asn

Thr

Leu

Arg

Met

Leu

Gly

Va1

432

1297

TTG

AAA GAT

TAT

GAG

CGG

AAG

TAT

CGT

CTT

AGG

GGT

AAA

CAA

TTT

CCT

1344

433

Phe

Lys His

Tyr

Cln

A1a

Lys

Tyr

Cly

Vel

Ser

A1a

Lys

Gin

Phe

Ale

443

1345

GGG

TCG GTG

GCG

GTA

CTG

GGC

GCG

TTT

CGG

ATT

AGA

CCG

CCA

AGG

GCG

1392

449

Giy

Trp Leu

Arg

Va1

Vel

Ala

Pro

Phe

Ala

Ile

Thr

Pro

Ala

Thr

Pro

464

1393

TTT

TTA GAG

GAA

GTG

TTT

AAG

TCG

CTG

CGG

AGG

TTT

GAT

ACA

GGG

TTT

1440

465

Phe

Leu Asp

Gln

Vel

Phe

Asn

Ser

VAl

Gly

Thr

Phe

Asp

Thr

Pro

Phe

430

1441

GTC

ATA. - GAT

AAT

GAG

GAT

TTT

GTC

TAT

AGA

TTG

AGG

ACC

CGG

CGG

GAT

1433

431

Va1

Ile Asp

Asn

Gln

Asp

Phe

Va1

Tyr

Thr

Leu

Thr

Thr

Giy

Gly

Asp

496

1439

GGG

CGG GGT

GTT

AAG

GAT

ATG

AGC

AGG

CCA

GTG

CGC

CTG

AAT

GAT

GGT

1536

497

Gly

A1a Arg

Vel

Lys

His

Ile

Ser

Thr

Ale

Leu

Gly

Leu

Asn

His

Arg

512

1537

CAG

TTG GTG

TTA

TTG

CGC

GAT

AAT

ATT

CGC

GGT

CAA

CAG

CGG

AAT

GTC

1534

513

Cln

Phe Leu

Leu

Leu

Ala

Asp

Asn

Ile

Ala

Arg

Gln

Cln

Giy

Asn

Va1

523

1535

ACG

GAA AGG

AGA

CTC

AAG

TCT

AAT

GTG

TTT

GTG

GTG

TCA

CCT

TTG

TAC

1632

529

Thr

Gln Ser

Thr

Leu

Asn

Gys

Asn

Leu

Phe

Vel

Va1

Ser

Ale

Phe

Tyr

544

163 3

CCT

CTG GGT

AAT

TTG

CCG

GGC

ACA

TTG

GGG

ATA

AAT

CCA

CAG

TCT

TTC

.330

545

Arg

Leu Ale

Asn

Leu

Ale

Arg

Thr

Leu

Cly

Ile

Asn

Pro

Clu

Ser

Phe

530

1681

TGT

GCC TTG

GTT

CAT

CCA

TTA

CAT

GCA

GCT

AGA

CGG

ATC

CTG

TCG

CAG

7 2 3

186 242

193

9 61

Cys

Ala

Leu

Val

Asp

Arg

Leu

Asp

Ala

- 1 , . Gly

Thr.

Gly

11 o

Val

••p

Gln

576

1725

—AA

TTC

GCA

Ggg

AAA

CCC

ACA

ATC

ACC

GTA

CCA

CAA

AAA

GAT

T—C

-- -

1776

577

Gln

Leu

Ala

Gly

Lys

Pro

Thr

Ile

Thr

Val

Pro

Gln

Lys

Asp

Ser

Pro

5 9 2

177 7 CTG GCG GCG GAT ATT CTG AGT TTG CTG CAA GCG CTA AGT GCG A.TT GCT

1824

553 Leu Ala Ala Asp Ile Leu Ser Leu Leu Gln Ala Leu Ser Ala Ile Al_a 608

1825

CAA

TGG

CAA

CAA

CAG

CAC

GAT

TTA

GAA

TTT

TCA

GCA

—TG

CTT

TTG

CTG

137 2

□ 09

Gln

Trp

Gln

Gln

Gln

His

Asp

Leu

Glu

Phe

Ser

Ala

Leu

Leu

Leu

Leu

624

1373

TTG

AGT

GAC

AAC

C—T

ATT

TCT

ACC

TCG

—AG

GGC

ACT

GAC

GAT

CAA

TTG

1920

625

Leu

Ser

Asp

Asn

Pro

Ile

Ser

Thr

Ser

Gln

Gly

Thr

Asp

Asp

Gln

Leu

640

1921

AAC

TTT

ATC

CGT

—AA

GTG

TGG

CAG

AAC

—TA

GGC

AGT

ACG

TTT

GTG

GGT

1963

641

Asn

Phe

Ile

Arg

Gln

Val

Trp

Gln

Asn

Leu

Gly

Ser

Thr

Phe

Val

Gly

656

1969

GCA

ACA

TTG

TTG

T—C

CGC

AGT

GGG

GCA

—CA

TTA

GTC

GAT

ACC

AAC

GGC

2016

657

Ala

Thr

Leu

Leu

Ser

Arg

Ser

Gly

Ala

Pro

Leu

Val

Asp

Thr

Asn

Gly

67 2

2017

CAC

GCT

ATT

GAC

TGG

TTT

GCT

CTG

CTC

TCA

GCA

GGT

AAT

AGT

—CG

CTT

2064

673

His

Ala

Ile

Asp

Trp

Phe

Ala

Leu

Leu

Ser

Ala

Gly

Asn

Ser

Pro

Leu

638

2065

ATC

GAT

AAG

GTT

GGT

CTG

GTG

ACT

GAT

GCT

GGC

ATA

CAA

AGT

GTT

ATA

2112

689

Ile

Asp

Lys

Val

Gly

Lau

Val

Thr

Asp

Ala

Gly

Ile

Gln

Ser

Val

Ile

704

2113

GCA

ACG

GTG

GTC

AAT

ACA

CAA

AGC

TTA

TCT

GAT

GAA

GAT

AAG

AAG

CTG

2160

705

Ala

Thr

Val

Val

Asn

Thr

Gln

Ser

Leu

Ser

Asp

Glu

Asp

Lys

Lys

Leu

720

2161

GCA

ATC

ACT

ACT

CTG

ACT

AAT

ACG

TTG

AAT

CAG

GTA

CAG

AAA

ACT

CAA

2203

721

Ala

Ile

Thr

Thr

Leu

Thr

Asn

Thr

Leu

Asn

Gln

Val

Gln

Lys

Thr

Gln

736

2209

CAG

GGC

GTG

GCC

GTC

AGT

CTG

TTG

GCG

CAG

ACT

CTG

AAC

GTG

AGT

CAG

2256

737

Gln

Gly

Val

Ala

Val

Ser

Lau

Leu

Ala

Gln

Thr

Leu

Asn

Val

Ser

Gln

752

2257

TCA

CTG

CCT

GCG

TTA

TTG

TTG

CGC

TGG

AGT

GGA

CAA

ACA

ACC

TAC

CAG

2304

753

Ser

Lau

Pro

Ala

Leu

Leu

Lau

Arg

Trp

Ser

Gly

Gln

Thr

Thr

Tyr

Gln

7 63

2305

TGG

TTG

AGT

GCG

ACT

TGG

GCA

TTG

AAG

GAT

GCC

GTT

AAG

ACT

GCC

GCC

2352

769

Trp

Leu

Ser

Ala

Thr

Trp

Ala

Leu

Lys

Asp

Ala

Val

Lys

Thr

Ala

Ala

734

2353

GAT

ATT

CCC

GCT

GAC

TAT

CTG

CGT

CAA

TTA

CGT

GAA

GTG

GTA

CGC

—GC

2400

785

Asp

Ile

Pro

Ala

Asp

Tyr

Leu

Arg

Gln

Leu

Arg

Glu

Val

Val

Arg

Arg

300

2401

T—C

TTG

TTG

ACC

CAA

—AA

TTC

A—G

CTG

AGT

CCT

GCA

ATG

GTG

CAA

AC—

2443

301

Ser

Leu

Leu

Thr

Gln

Gln

Phe

Thr

Leu

Ser

Pro

Ala

Met

Val

Gln

Thr

8 lo

194

186 242

2443 317

4 . sj Leu

CTG Leu

GAC Asp

TAT Tyr

CCA Pro

JL'- Ala

TAT Tyr

TTT Phe

Gly

TCT Ala

TCC Ser

A Ala

GAA Glu

AC A Thr

d k d Tal

Thr

2433 5 j 1

2497

TAT

ATC

AGT

TTG

TGG

ATT

CTT

TAT

ACC

CTG

AGC

TTT

TAT

AGC

GAT

TTA

2544

8 3 3

Asp

Ile

Ser

Leu

Trp

Mec

Leu

T/r

Thr

Leu

Ser

Cys

T/r

Ser

Asp

Leu

343

2545

TTG

CTC

CAA

ATG

GGT

GAA

GCT

GGT

GGT

ACC

GAA

GAT

GAT

GTA

CTT

GCC

2592

849

Lau

Leu

Gln

Mec

Giy

Glu

Aia

Giy

Gly

Thr

Giu

Asp

Asp

Vai

Leu

Aia

864

2593

TAC

TTA

CGC

ACA

GCT

AAT

GCT

ACC

ACA

CCG

TTG

AGG

CAA

TCT

GAT

GGT

2640

865

Tyr

Leu

Arg

Thr

Aia

Asm

Aia

Thr

Thr

Pro

Leu

Sar

GIm

Ser

Asp

Aia

380

2641

GCA

CAG

ACG

TTG

GCA

ACG

CTA

TTG

GGT

TGG

GAG

GTT

AAC

GAG

TTG

CAA

2633

331

Aia

GIm

Thr

Leu

Ala

Thr

Leu

Lau

Giy

Trp

Giu

Val

Asm

Giu

Leu

Gin

396

2639

GCC

GCT

TGG

TCG

GTA

TTG

GGC

GGG'

ATT

GCC

AAA

ACC

ACA

CCG

CAA

CTT

2736

397

Aia

Aia

Trp

Ser

Vai

Leu

Gly

Giy

Iie

Ala

Lys

Thr

Thr

Pro

GlM

Leu

912

2737

GAT

GCG

CTT

CTG

CGT

TTG

CAA

CAG

GCA

CAG

AAC

CAA

ACT

GGT

CTT

GGG

2734

913

Asp

Aia

Leu

Leu

Arg

Lau

Gln

GlM

Aia

GiM

Asn

Gln

Thr

Giy

Lau

Giy

923

2735

GTT

ACA

CAG

CAA

CAG

CAA

GGC

TAT

CTC

CTG

ATT

CGT

GAC

AGT

GAT

TAT

2332

929

Vai

Thr

Gin

GIm

Gin

Gin

Giy

Tyr

Leu

Leu

Ser

Arg

Asp

Ser

Asp

Tyr

944

2833

ACC

CTT

TGT

CAA

AGC

ACC

GGT

CAG

GGG

CTG

GTT

GCT

GTC

GTA

TCC

CAT

2330

945

Thr

Lau

Trp

Gin

Ser

Thr

Giy

Gin

Ala

Leu

Val

Aia

Giy

Vai

Ser

His

960

2331

GTC

AAG

GGC

AGT

AAC

TTA

2898

961

Val

Lys

Gly

Ser

Asn

End

966

( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 57;

(i) 01310^17517^ sekwencji:

( A ) Długość: 965 aminokwasów (B ) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsceczki: białko ( xi ) Opis sekwencji: SEK NR ID: 57 ( jpptyd TccA ); Cechy Od Do Opis

1

10

SEK

NR ID: 8

I

Mec

Asm

GIm

Leu

Aia

Ser

Pro

Leu

Iie

Ser

Arg

Thr

Giu

Giu

Iie

His

16

17

Asm

Leu

Pro

Giy

Lys

Leu

Thr

Asp

Leu

Giy

Tyr

Thr

Ser

Vai

Phe

Asp

32

33

Val

Vai

Arg

Mac

Pro

Arg

Glu

Arg

Phe

Iie

Arg

Glu

His

Arg

Aia

Asp

43

49

Leu

Gly

Arg

Ser

Ala

Giu

Lys

Mec

Tyr

Asp

Leu

Aia

Val

Gly

Tyr

Aia

64

6 5

His

Gin

Vai

Leu

His

His

Phe

Arg

Arg

Asn

Ser

Leu

Ser

Giu

Aia

Vai

30

31

Gin

Phe

Giy

Leu

Arg

Ser

Pro

Phe

Sar

Vai

Ser

Giy

Pro

Asp

Tyr

Ala

3 5

186 242

Asn

Gln

Phe

Lau

Asp

Ala

Asn

Thr

Gly

Trp

Lys

Asp

Lys

Ala

Pro

Gly

Ser

Pro

Glu

Ala

Asn

Asp

Ala

Pro

Val

Ala

Tyr

Leu

Thr

His

Tyr

Gln

Leu

Ala

Leu

Glu

Gln

Glu

Lys

Asn

Gly

Ala

Thr

Thr

Ile

Asn

Thr

Leu

Ala

Glu

Arg

Arg

Pro

Asp

Lau

Gly

A.la

Lau

Leu

Ile

Asp

Lys

Ala

Ile

Asn

Glu

Val

Ile

Pro

Gln

Lau

Gln

Leu

Val

Asn

Ile

Leu

Ser

Lys

Ala

Ila

Gln

Lys

Lys

Lau

Ser

Lau

Thr

Asp

Leu

Ala

Val

Asn

Ala

Arg

Leu

Ser

Thr

Thr

Arg

Tyr

Pro

Asn

Asn

Leu

Tyr

His

Tyr

Gly

His

Gln

Gln

Ile

Gln

Thr

Ala

Gln

Sar

Val

Lau

Thr

Thr

Leu

Gin

Asp

Ila

Thr

Leu

Pro

Gin

Thr

Leu

Asp

Leu

Pro

Asn

Phe

Trp

Ala

Thr

Ala

Lys

Gly

Lys

Leu

Ser

Asp

Thr

Thr

Ala

Ala

Leu

Thr

Arg

Lau

Gin

Ile

Mec

Ala

Ser

Gin

Phe

Ser

Pro

Glu

Gin

Lys

Ile

Ile

Thr

Glu

Thr

Val

Gly

Gin

Asp

Phe

Tyr

Gin

Lau

Tyr

Gly

Asp

Ser

Ser

Leu

Thr

Val

Asn

Ser

Phe

Ser

Asp

Mec

Thr

Mec

Thr

Asp

Arg

Thr

Ser

Leu

Thr

Val

Pro

Gln

Val

Glu

Leu

Met

Cys

Ser

Thr

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Val

Val

Lys

Ser

Asp

Asn

Val

Ser

Gly

Asp

Thr

Thr

Ala

Thr

Pro

Phe

Ala

Tyr

Gly

Ala

Arg

Phe

His

Ala

Gly

Lys

Pro

Glu

Ala

Ile

Thr

Leu

Ser

Arg

Ser

Gly

Ala

Ala

His

Phe

Ala

Leu

Thr

Val

Asn

Asn

Leu

Thr

Asp

Asp

Lys

Lau

Arg

Ile

Asn

Arg

Thr

Val

Arg

Lau

Gln

Lys

Trp

Leu

Asn

Leu

Pro

Glu

Asp

Ile

Asp

Leu

Leu

Val

Thr

Ser

Ala

Met

Asp

Ala

Glu

Thr

Asn

Thr

Ala

Leu

Ser

Mac

Asn

Asp

Asn

Thr

Lau

Arg

Mec

Leu

Gly

Phe

Lys

His

Tyr

Gin

Ala

Lys

Tyr

Gly

Val

Sar

Ala

Lys

Gin

Phe

Gly

Trp

Lau

Arg

Val

Val

Ala

Pro

Phe

Ala

Ile

Thr

Pro

Ala

Thr

Phe

Lau

Asp

Gin

Val

Phe

Asn

Ser

Val

Gly

Thr

Phe

Asp

Thr

Pro

Val

Ile

Asp

Asn

Gln

Asp

Phe

Val

Tyr

Thr

Leu

Thr

Thr

Gly

Gly

Gly

Ala

Arg

Val

Lys

His

Ile

Ser

Thr

Ala

Leu

Gly

Leu

Asn

His

Gln

Phe

Leu

Lau

Lau

Ala

Asp

Asn

Ile

Ala

Arg

Gln

Gln

Gly

Asn

Thr

Gln

Ser

Thr

Lau

Asn

cys

Asn

Leu

Phe

Val

Val

Ser

Ala

Phe

Arg

Leu

Ala

Asn

Leu

Ala

Arg

Thr

Leu

Gly

Ile

Asn

Pro

Glu

Ser

Cys

Ala

Lau

Val

Asp

Arg

Leu

Asp

Ala

Gly

Thr

Gly

Ile

Val

Trp

Gln

Leu

Ala

Gly

Lys

Pro

Thr

Ile

Thr

Val

Pro

Gln

Lys

Asp

Ser

Leu

Ala

Ala

Asp

Ile

Lau

Ser

Leu

Leu

Gln

Ala

Lau

Ser

Ala

Ila

Ser

Ile

Mec

Asn

Glu

Glu

Pro

Gly

Gin

Sar

Gin

Asn

Ile

Leu

Ser

Ile

Glu

Asp

Tyr

Gly

Val

Ala

Pro

Phe

Asp

Arg

Val

Tyr

Pha

Gln

Pro

Ala

Gln Trp Gln Gln Gin His Asp Leu Glu Phe Ser Ala Leu Leu Leu Leu

186 242

Leu

Ser

Asp

Asn

Pro

i l - - i β

Ser

Thr

Ser

Gin

Gly

Thr

Asp

Asp

G l 4*

Leu

1 ·» O

Asn

Phe

Ile

Arg

Gin

Vai

Trp

Gin

Asn

Leu

Gly

Ser

Thr

Phe

Vel

CLy

5 55

Ale

Thr

Leu

Leu

Ser

Arg

Ser

Giy

Aia

Pro

Leu

Vel

Asp

Thr

Asn

Gly

6~ Z

His

Ala

Ile

Asp

Trp

Phe

A1a

Leu

Leu

Ser

Ale

Giy

Asn

Ser

Pro

Leu

633

Ile

Asp

Lys

Vel

Giy

Leu

Va1

Thr

Asp

A1a

Gly

Ile

Gin

Ser

Vel

Ile

704

A1a

Thr

Vel

Val

Asn

Thr

Cln

Ser

Leu

Ser

Asp

Glu

Asp

Lys

Lys

Leu

720

Ala

Iie

Thr

Thr

Leu

Thr

Asn

Thr

Leu

Asn

Gln

Vel

Cln

Lys

Thr

Gin

'3 o

Gin

Giy

Va1

Ala

Val

Ser

Leu

Leu

A1a

Gln

Thr

Leu

Asn

Vel

Ser

Gin

752

Ser

Leu

Pro

Ale

Leu

Leu

Leu

Arg

Trp

Ser

Gly

Cln

Thr

Thr

Tyr

Gin

753

Trp

Leu

Ser

A1a

Thr

Trp

A1a

Lau

Lys

Asp

A1a

Va1

Lys

Thr

Ale

Ala

734

Asp

Ile

Pro

A1a

Asp

Tyr

Lau

Arg

Gin

Leu

Arg

Glu

Val

Vel

Arg

Arg

300

Ser

Leu

Leu

Thr

Gin

Gin

Phe

Thr

Leu

Ser

Pro

A1a

Mec

Vel

Gin

Thr

316

Leu

Leu

Asp

Tyr

Pro

Ale

Tyr

Phe

Gly

Ala

Ser

A1a

Giu

Thr

Vel

Thr

332

Asp

Ile

Ser

Leu

Trp

Mec

Leu

Tyr

Thr

Leu

Ser

Gys

Tyr

Ser

Asp

Leu

843

Leu

Leu

Gln

Mec

Gly

Giu

A1a

Gly

Gly

Thr

Glu

Asp

Asp

Va1

Leu

Ale

364

Tyr

Leu

Arg

Thr

Ale

Asn

A1a

Thr

Thr

Pro

Leu

Ser

Gin

Sar

Asp

Ale

830

A1a

Gin

Thr

Leu

A1a

Thr

Leu

Leu

Gly

Trp

Clu

Va1

Asn

Glu

Lau

Gin

636

A1a

Ala

Trp

Ser

Va1

Leu

Gly

Gly

Ile

Ale

Lys

Thr

Thr

Pro

Gin

Leu

312

Asp

Ale

Leu

Leu

Arg

Leu

Gin

Gln

A1a

Gln

Asn

Gln

Thr

Gly

Leu

Gly

928

Vel

Thr

Gln

Gln

Gln

Gln

Gly

Tyr

Leu

Leu

Sar

Arg

Asp

Ser

Asp

Tyr

944

Thr

Leu

Trp

Gln

Ser

Thr

Gly

Gln

A1a

Leu

Va1

A1a

Gly

Va1

Ser

His

960

Va1

Lys

Gly

Ser

Asn

965

Dane dla sekwencji SEK NR ID: 58;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A) Długość: 4698 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy ( C ) Rodzaj nici: podwójna ( D ) Topologia, liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA ( genomowi) ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 56 (tccB )

1

ATG

TTA

TGC

ACA

ATG

GAA

AAA

GAA

CTG

AAT

GAA

TCC

GAG

CGT

CAT

GCC

43

1

Mec

Leu

Ser

Thr

Mec

Giu

Lys

Gin

Leu

Asn

Glu

Ser

Gln

Arg

Asp

Ala

16

49 TTG CTG

ACT

GGC

TAT

ATG

AAT TTT

GTG

CGG

CCG

ACG

TTC

AAA

Gcg TTo

9 6

17 Leu Vai

Thr

Giy

Tyr

Mec

Asn Phe

Val

Ala

Pro

Thr

Leu

Lys

Cly Val

; o

186 242

197

3

tgT CgT	CAG CCC	GCC	TCC	GCG «Α	GT?* ' *	CAG	GAA	CAC	CTG CCC ATT
Sar Gly	Cln rro	/al	yer	/al Glu	Tsp Lau	h/r	Clu	h/P	Ltu Ltu Ile

144

145

CAG CCG

GTA

CCG

CCC

GAT

GAG

CCT

CAC

ACC

CGT

CCG

CCA

GCA

CAA

CGG

rsp rro

Clu

/al

Cla

Tsp

Clu

/al

Clu

eep

Ser

Arg

/al

Cla

Cln

Cla

192

193 6 5

241

289

337

113

3a5

129

433

145

431

161

529

177

577

193

625

209

673

225

721

241 ó 9 257

317

273

TCT GGG

CCC TCA CCC

CCA Cln

TAC Typ

CCC Mac

ACC cer

CGT Trg

CCG Leu

GTC /al

.AAG Asn

cGC Gl/

TCT Sap

GAT clu

Ile

Ala

Sap

Ila Gln

CCG

GGG

CGT

CAG

CGG

CTG

GAC

CCT

CCT

TCA

CCT

CAG

GAT

CGG

CCC

GAC

rpo

Gly

Apg

Gln

Ala

Mec

Glu

rpo

Str

cep

AIi

Asn

Glu

Cpp

Arg

Asp

TAC

GAT

TAG

GCA

TAT

CCT

ATG

TCG

GGT

GCG

GGG

GCT

CAG

CTT

CCA

-TTC

Tsn

Csp

Csn

Gln

h/p

Cla

Ila

ypp

Cla

Tla

Cly

Ala

Glu

/al

crg

Csn

CAC

GCT

GAA

CAC

CAC

CCT

TGC

GCC

CCG

CCG

CGG

GAG

GAA

.AAA

AGG

CAC

Typ

Ala

Glu

Csn

Typ

Ile

Stp

rro

Ilt

hep

Arg

Gln

Glu

Lys

Ser

Hst

CAT

TTG

CGG

GAG

CTG

GAG

ACC

CCT

CCA

CAT

CAG

TCT

GGA

CTC

GAC

CCG

Typ

ree

Ser

Glu

Leu

Glu

Ter

cer

Lau

Asn

Gln

Asn

Arg

Leu

Csp

rro

CAC

GGT

CCG

CAG

GAC

GGT

CTT

CTG

CCG

CAT

CTC

AAT

GAG

CTT

GTG

GCA

Asp

Arg

/al

Gln

Csp

Ala

/al

Lau

Ala

Typ

Leu

Asn

Glu

re®

Clu

Ala

GCG

AGT

AAT

GTA

CAT

GTG

CTG

AGC

GGT

CCT

ATT

TCT

CAG

CAT

•AAA

CTT

/al

Ser

Asn

Leu

Tyr

/al

Leu

Ser

Gly

C/p

Ilt

Asn

Gln

Asp

Lys

re®

GAG

GTC

GGT

ACC

CAC

TAC

TCT

ACC

CGT

CCC

AGT

ACG

ACT

AAT

CCC

TAC

Asp

Gln

Ala

Ilt

Cyr

C/P

re®

Ilt

Cly

Crg

eer

eer

Tep

Lys

rpo

C/p

GGG

TAC

CAG

CGG

CGT

CAG

ATG

GAT

CCG

ACT

TAG

TTC

GCT

CAT

GAC

GGG

Arg

Tyr

Tyr

Trp

Arg

Cln

Mac

Csp

Lau

Sar

Lys

Asn

Arg

Cln

Asp

rro

GCA

GGG- AAT

GGC

GTG

ACG

CGA

AAC

CGC

CCG

CTT

GAT

CGG

CAG

CAA

ATG

Ala

Gly

Asn

rro

/al

Tep

rpo

Asn

C/s

Crp

Tsn

Asp

Trp

Gln

Glu

Ilt

ACT

TTG

CCC

CTG

CGT

GGT

GAC

ACC

CCG

CCG

GAG

GAT

ACA

GTT

CGC

CCC

Tep

Lau

rro

Leu

Sep

Gly

Asp

TIp

/al

Lau

Glu

His

eer

/al

Crg

rro

GTA

TTT

CAT

TTT

CAC

GGA

GTA

TAC

GTG

CCT

TGG

GTC

GAG

GGT

GAG

CGC

/al

ree

Tyr

Asn

Csp

Arg

Lau

Tyr

/al

Cla

Trp

/an

Glu

Arg

Asp

rro

GGA

GTC

CAG

TTC

CAC

GCT

GAG

GGT

CAA

TAC

ATG

GGT

CAA

ACG

CAT

CGC

Cla

/al

Cln

Lys

Asp

Ala

Asp

Cl/

Lys

Tsn

Ilt

Gly

Lys

Ter

HiS

CIi

CAC

AAG

ATA

TAG

CTT

CGT

TAC

AAA

CGC

CTT

CAT

GAT

ACT

CGG

CGA

ujC3

h/p

Csn

Ila

L/T

re®

Gly

h/r

L/s

Arg

h/r

Asp

Asp

eep

ypp

eep

Cla

240

288

336

384

123

432

144

430

160

528

176

575

192

624

208

672

224

720

240

68 256

316

364

233

65 CCC TTC AGG ACC AGC CTA ACC ACC CTA CCA GCA GGG GAA AGT CCA CAA 912 239 rpo Csn Cer eep Cer Ltu Mac cep Gln Gln Ala Gly Glu Sup Sep Clu 304

198

186 242

913 305

ACA CAC Thr Cln

CCA Arg

TCC Ser

ACC CTC

CTC ATT CAT CAA

TCT Ser

ACC Ser

UCC Thr

UCA TTC

G»\_ Arg

9 6 0 3 20

Ser

Leu

Lau

ile

Usp

Glu

Thr

Lcu

961

CAA

CTT

AAT

CTG

TTC

CCT

ACC

UCC

CAT

TTT

ACT

ATC

CAT

CCC

ACC

CUG

loca

321

Cln

Val

Asn

Leu

Lau

Ala

Thr

Thr

Asp

Phe

Scr

Il·

Asp

Pro

Thr

Clu

3 3 6

1009

CAA

ACC

GAC

AGT

AAC

CCC

TAT

CCC

CCC

CTA

ATG

TTC

CCG

GTG

TTT

CTC

105 6

337

Clu

Thr

Asp

Ser

Asn

Pro

Tyr

Gly

Arg

Lau—Mcc

Lcu

Cly

Val

Phc

Val

352

1057

CCT

CAA

TTT

GAA

CGT

GUT

GCG

GCC

AAT

UGA

UUA

AAT

AUU

CCC

CTT

GTT

1104

353

Arg

Gln

Ph·

Clu

Cly

Asp

Gly

Ula

Asn

Arg

Lys

Asn

Lys

Pro

Val

Val

3 68

1105

TAT

CGT

TAT

CTC

TUT

TCT

GAC

TCA

GCT

TTC

UAT

CGT

CAT

GTT

CTC

UGC

1152

369

Tyr

Gly

Tyr

Lcu

Tyr

cys

Usp

Ser

Ala

Pha

Asn

Arg

His

Val

Lcu

Arg

334

1153

CCC

TTA

ACT

AAC

AAC

TTT

TTG

TTC

UGT

UCT

TAC

CCT

GUT

GUA

UCG

CUT

1200

385

Pro

Leu

Ser

Lys

Usn

Phe

Leu

Pha

Ser

Thr

Tyr

Arg

Asp

Glu

Thr

Usp

400

1201

CGT

CAA

AAC

ACC

TTG

CAA

TTT

GCC

GTA

TAC

CAT

UAA

UAC

TAT

CTA

UTT

1243

401

Cly

Gln

Asn

Ser

Leu

Cln

Phc

Ula

Val

Tyr

Usp

Lys

Lys

Tyr

Val

Ila

416

1249

ACT

AAG

GTT

CTT

UCU

GCT

GCA

UCC

GUA

CUT

CCC

GUA

AAT

UCA

GGA

TCC

1296

417

Thr

Lys

Val

Val

Thr

Gly

Ala

Thr

Clu

Usp

Pro

Clu

Usn

Thr

Cly

Trp

432

1297

CTA

UCT

AAA

GTT

GAT

CAC

TTC

AAA

CUU

CGC

ACT

ACT

GCG

GCC

TAT

GTG

13 44

433

Val

Ser

Lys

Val

Asp

Asp

Lau

Lys

Gln

Cly

Thr

Thr

Gly

Ula

Tyr

Val

448

1345

TAT

ATC

CAT

CAA

GAT

GGC

CTC

UCG

CTT

CAT

UTA

CAA

ACC

UCU

ACT

UAT

13 92

449

Tyr

Il·

Usp

Gln

Asp

Gly

Leu

Thr

Leu

His

Il·

Cln

Thr

Thr

Thr

Usn

4 64

1393

CGG

CAT

TTT

ATT

AUC

CGT

CUT

ACG

TTT

GGU

TAT

AAC

CUT

CTT

CTA

TAT

1440

455

Cly

Usp

Ph·

Ile

Usn

Urg

His

Thr

Ph·

Cly

Tyr

Asn

Usp

Lcu

Val

Tyr

430

1441

GAT

TCT

AAG

TCT

CGT

TAT

GGT

TTC

ACG

TGG

TCA

CGA

UAT

CAU

GCT

TTT

1488

481

Asp

Ser

Lys

Sar

Cly

Tyr

Gly

Pha

Thr

Trp

Ser

Cly

Usn

Clu

Gly

Phe

496

1489

TAT

CTG

GAT

TAC

CUT

GAT

GGA

UAT

TUT

TAC

ACC

TTT

CUT

UAT

GCA

ATA

1536

497

Tyr

Leu

Asp

Tyr

His

Asp

Cly

Usn

Tyr

Tyr

Thr

Phe

His

Usn

Ala

Ile

512

1537

ATC

AAC

TAC

TUT

CCC

TCT

GGU

TAT

GCT

GCT

GGA

TCT

GTT

CCT

AAT

CGU

1584

513

Ile

Asn

Tyr

Tyr

Pro

Ser

Gly

Tyr

Cly

Cly

Gly

Ser

Val

Pro

Asn

Gly

523

1585

ACC

TGG

CCC

TTA

CAG

CAA

AGG

ATT

UAT

CAC

CGU

TGG

GCT

ATT

GCT

CCC

16 32

529

Thr

Trp

Ala

Leu

Clu

Cln

Arg

Ile

Usn

Clu

Gly

Trp

Ula

Ilc

Ala

Pro

544

1533

CTC

CTT

CAT

ACT

CTC

CUT

ACT

CTT

UCT

GTC

AAG

GGC

AGT

TAT

UTC

CCT

15 30

545

Lau

Leu

Usp

Thr

Lau

His

Thr

Val

Thr

Val

Lys

Gly

Ser

Tyr

de

Ula

5 o 0

186 242

199

1 6 8 1 5 0 1

TGg Trp

Gsa Glu

GGG Gly

GAA Glu

SCS Thr

CCT Pro

SCC Thr

.ajT Gly

TAT T/r

SAT Ssn

— T*· Ctc Lau

TAT Tyr

STT Ile

CCS Pro

3λΤ Ssp

_rc τ my

1729

SCC

GTG

TTG

CTA

GST

TCG

TTT

GAT

ASA

STA

SAT

TTT

GCT

STT

CTT

CTT

577

Thr

Val

Leu

Leu

Ssp

Trp

Phe

Ssp

Lys

Ile

Ssn

Phe

Ala

Ile

Gly

Leu

1177

SAT

SAG

CTT

GAG

TCT

GTA

TTT

SCG

TCG

CCS

GAT

TGG

CCA

SCA

CTA

ACC

553

Ssn

L/S

Leu

Glu

Ser

Val

Phe

Thr

Ser

Pro

Ssp

Trp

Pro

Thr

Lau

Thr

1723

576

177 6 592

1824

608

1325

SCT

ATC

SAA

SAT

TTC

AGT

ASA

STC

TCC

GST

SAC

CGC

ASA

TTC

TAT

CAG

609

Thr

Ile

Lys

Ssn

Phe

Ser

Lys

Ile

Ala

Ssp

Ssn

Srg

Lys

Phe

Tyr

Gln

1373

GAS

ATC

SAT

TCT

GAT

ACT

TCG

GAT

GGA

CGC

ASC

CTG

TTT

SAS

CCT

TAC

625

Glu

Ile

Ssn

Ala

Glu

Thr

Ala

Asp

Tl/

Srg

Ssn

Leu

Phe

L/s

Srg

T/r

1921

SCT

SCT

CAA

ACT

TTC

GGA

CTT

ACC

ATC

GTT

TCT

ACT

TAT

TCT

SCA

ACT

641

Ser

Thr

Gln

Thr

Phe

Gly

Leu

Thr

Ser

Gl/

Ala

Thr

Tyr

Ser

Thr

Thr

1969

TAT

ACT

TTG

TCT

GAG

GCG

GAT

TTC

TCC

SCT

TAT

CCG

GAC

ASA

ASC

TAC

657

T/r

Thr

Lau

Ser

Glu

Sla

Ssp

Phe

Ser

Thr

Ssp

Pro

Ssp

L/s

Ssn

Tyr

2017

CTA

CAT

GTT

TTT

TTT

AST

GTC

GTT

TTG

GAT

CAT

TAT

TAC

CTC

CCG

TCA

673

Leu

Tln

Val

Cys

Leu

Ssn

Val

Val

Trp

Ssp

His

Tyr

Asp

Arg

Pro

Ser

2065

GTG

ASA

SAA

TGG

GCT

TAT

TCT

TGG

TTC

AGT

SAG

TGG

TTT

SAC

TTC

TAT

689

Gly

L/s

Lys

Tly

Ala

Tyr

Ser

Trp

Val

Ser

Lys

Trp

Phe

Ssn

Val

T/r

2113

GTT

GCT

TTG

CSA

TAT

ATC

SAS

GCT

CCT

GAT

GCC

ATT

CCT

CGA

TTA

GTT

705

Val

Ala

Leu

Tln

Ssp

Ser

L/s

Ala

Pro

Ssp

Ala

Ile

Pro

Srg

Leu

Val

2161

TCC

CTT

TAC

GAT

AGT

AAA

CGT

GGT

CTG

GTG

CAA

TAT

CTT

GAC

TTC

TTG

721

Ser

Arg

Tyr

Asp

Ser

L/s

Srg

Gl/

Leu

Val

Tln

Tyr

Leu

Ssp

Phe

Trp

2209

ACC

TCA

TCA

TTA

CCC.

GCG

SAS

ACC

CGT

CTT

SAC

ACC

ACC

TTT

TTG

CGT

737

Thr

Ser

Ser

Leu

Pro

Sla

L/s

Thr

Arg

Leu

Asn

Thr

Thr

Phe

Val

Arg

2257

ACT

TTG

ATT

GAG

SAG

GCT

SAT

CTG

GGG

CTT

TAT

STT

TTG

CTG

GAT

TAC

753

Thr

Leu

Ile

Tlu

Lys

Ala

Asn

Leu

Tly

Leu

Ssp

Ser

Leu

Leu

Asp

Tyr

2305

ACC

TTG

CSG

TCA

TST

CCT

TCT

CTG

GSA

GCS

GAT

TTA

CTG

ACT

GAC

CGC

769

Thr

Leu

Gln

Ala

Ssp

Pro

Ser

Leu

Tlu

Sla

Asp

Leu

Val

Thr

Asp

Gly

2353

SAA

ATC

GSA

CCA

ATG

GAC

TTT

SAT

TGT

TCA

ASC

GGT

CTC

TAT

TTC

TGG

785

L/s

Ser

Glu

Pro

Mec

Ssp

Phe

Asn

Tly

Ser

Asn

Gly

Leu

Tyr

Phe

Trp

2401

CSA

TTG

TTC

TTT

CAC

CTG

CCG

TTT

TTG

TTT

GCT

ACA

CTC

TTT

CCC

SAC

301

Glu

Leu

Phe

Phe

His

Lau

Pro

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Srg

Phe

Sla

Ssn

2449

GSA

CAG

CSA

TTT

TCG

CCG

GCA

CSA

SAT

SGT

TTT

CAT

TAC

ATC

TTT

GAC

317

Glu

Gln

Gln

Phe

Ser

Pro

Sla

Gln

Lys

Ser

Leu

His

T/r

Ile

Phe

Ssp

1372

624

1920

640

1963

656

2016

672

2064

638

2160

720

2208 7 3 6

2256

752

2304 / 63

2352

734

2400

300

443

16

2456

332

2112

704

200

186 242

2457 333

—CG Pro

Ala Ala

ATG Met

ggg Lys

AAC Asn

GGT Lys

—CA Pro

CAC His

AAT Asn

a,*» x» Ala

—CG Pro

GCT Ala

TAT Tyr

TGG Trp

AAT Asn

T . * a «

2644 848

2545

—GT

CCG

TT—

GTT

GAA

GGA

.AAC

AGC

GAT

TTG

TCA

CGT

CAT

TTG

GAC

GA.T

-592

849

Arg

Pro

Leu

Val

Glu

Gly

Asn

Ser

A.sp

Leu

Ser

Arg

His

Leu

Asp

Asp

8 84

2993

T—T

ATA

GAC

CCA

GAT

ACT

CAA

GCT

TAT

GCT

CAT

CCG

GTG

ATA

TAC

a.’,U

2 6 4 0

365

Ser

Ile

Asp

Pro

Asp

Thr

Gln

Ala

Tyr

Ala

His

Pro

Val

Ile

Tyr

Gln

880

2641

AAA

GCG

GTG

TTT

ATT

GCC

TAT

GTC

AGT

AAC

CTG

ATT

GCT

CAG

GGA

gAT

2688

881

Lys

Ala

Val

Phe

Ile

Ala

Tyr

Val

Ser

Asn

Leu

Ile

Ala

Gln

Gly

As p

89 0

2589

ATG

TGG

TAT

CGC

CAA

TTG

ACT

CGT

GAC

GGT

CTG

ACT

CAG

GCC

CGT

GTC

2736

897

Met

Trp

Tyr

Arg

Gln

Leu

Thr

Arg

Asp

Gly

Leu

Thr

Gln

Ala

Arg

Val

512

27 37

TAT

TAC

AAT

—TG

GCC

GCT

GAA

TTG

CTA

GGG

—CT

CGT

CCG

GAT

GTA

S e rJ

2734

313

Tyr

Tyr

Asn

Leu

Ala

Ala.

Glu

Leu

Leu

Gly

Pro

Arg

Pro

Asp

Val

Ser

928

2735

—TG

AGT

AGC

ATT

TGG

ACG

CCG

CAA

AC—

CTG

GAT

ACC

TTA

GCA

GCC

GgG

2332

929

Leu

Ser

Ser

Ile

Trp

Thr

Pro

Gln

Thr

Leu

Asp

Thr

Leu

Ala

Ala

Gly

944

2833

—AA

AAA

GCG

GTT

TTA

CGT

GAT

TTT

GAG

CAC

CAG

TTG

GCT

AAT

AGT

GAT

2330

945

Gln

Lys

Ala

Val

Lau

Arg

Asp

Phe

Glu

His

Gln

Leu

Ala

Asn

Ser

Asp

960

2881

ACC

GCT

TTA

CCC

GCA

TTG

CCG

GGC

CGC

AAT

GTC

AGC

TAC

TTG

AAA

—TG

-928

961

Thr

Ala

Leu

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Arg

Asn

Val

Ser

Tyr

Leu

Lys

Leu

976

2929

GCA

GAT

AAT

GGC

TAC

TTT

AAT

GAA

CCG

CTC

AAT

GTT

CTG

ATG

TTG

T—T

2976

977

Ala

Asp

Asn

Gly

Tyr

Phe

Asn

Glu

Pro

Leu

Asn

Val

Leu

Met

Leu

Ser

992

2977

—AC

TGG

GAT

ACG

TTG

GAT

GCA

CGG

TTA

TAC

AAT

CTG

CGT

CAT

AAC

—TG

3024

993

His

Trp

Asp

Thr

Leu

Asp

Ala

Arg

Leu

Tyr

Asn

Leu

Arg

His

Asn

Leu

1008

3025

ACC

GTT

GAT

GGC

AAG

—CG

CTT

TCG

CTG

CCG

—TG

TAT

GCT

GCG

CCT

GTT

3 072

1009

Thr

Val

Asp

Gly

Lys

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

Leu

Tyr

Ala

Ala

Pro

Val

1024

3073

GAT

CCG

GTA

GCG

TTG

TTG

GCT

CAG

CGT

GCT

CAG

TCC

GGC

ACG

TTG

G

3 120

1025

Asp

Pro

Val

Ala

Leu

Leu

Ala

Gln

Arg

Ala

Gln

Ser

Gly

Thr

Leu

Thr

1040

3121

AAT

GGC

GTC

AGT

GGC

GCC

ATG

TTG

ACG

GTG

CCG

CCA

TAC

CGT

TTC

AGC

3158

1041

Asn

Gly

Val

Ser

Gly

Ala

Met

Leu

Thr

Val

Pro

Pro

Tyr

Arg

Phe

Ser

1056

3 169

GCT

ATG

TTC

CCG

—GA

GCT

TAC

AGC

GCC

GTG

GGT

ACG

TTG

ACC

AGT

TTT

3 216

1057

Ala

Met

Leu

Pro

Arg

Ala

Tyr

Ser

Ala

Val

Gly

Thr

Leu

Thr

Ser

Phe

1072

3217

GCT

CAG

AAC

CTG

CTT

AGT

TTG

TTG

GAA

CGT

AGC

GAA

CGA

GCC

TCT

C.-A

1073

Gly

Gln

Asn

Leu

Leu

Ser

Leu

Leu

Glu

Arg

Ser

Glu

Arg

Ala

Cys

— i n

10 86

186 242

201

2 55 GAA GAG TTG GCG GAA CAG C.AA CTG TTG GAT ATG TCC AGC TAT GCC ACC 3 3 22,

1039 Giu Glu Lau Ala Gln Gln Gln Lau Lau Asp Mec Sar Ser Tyr Ala Ha 1164

3 L3 ACG TTG CAA C.AA CAG GCG CTG GAT GGA TTG GCG GCA GAT CGT CTG GCG 3 350

1105 Thr Leu Gln Gln Gln Ala Lau Asp Gly Leu Ala Ala Asp Arg Leu Ala 1123

3 3 51 1121	CTG CTA GCT AGT CAG GCT ACG GCA C.AA CAG CGT CAT GAC CAT TAT TAC 3 403 Lau Lau Ala Ser Gln Ala Thr Aia Gln Gln Arg His Asp His Tyr Tyr 1156
3409 1137	ACT CTG TAT CAG AAC AAC ATC TCC AGT GCG GAA CAA CTG GTG ATG GAC 3 456 Thr Leu Tyr Gln Asn Asn Ile ser Ser Ala Glu Gln Leu Val Mec Asp ii~2
3457 1153	ACC CAA ACG TCA GCA CAA TCC CTG ATT TCT TCT TCC ACT GGT GTA CAA 3 504 Thr Gln Thr Ser Ala Gln Ser Leu Ile Ser Ser Ser Thr Gly Yal Gln 1163
3505 1169	ACT GCC AGT GGG GCA CTG .AAA GTG ATC CCG AAT ATC TTT GGT TTG GCT 3 552 Thr Ala ser Gly Ala Leu Lys Val Ile Pro Asn Ile Phe Gly Leu Ala 1134
3553 1135	GAT GGC GGC TCG CGC TAT GAA GGA GTA ACG GAA GCG ATT GCC ATC GGG 3 600 Asp Gly Gly Ser Arg Tyr Giu Gly Val Thr Glu Ala Ile Ala Ile Gly 1200
3601 1201	TTA ATG GCT GCC GGA CAA GCC ACC AGC GTG GTG GCC GAG CGT CTG GCA 3 643 Leu Mec Ala Ala Gly Gln Ala Thr Ser Val Val Ala Glu Arg Leu Aia 1215
3649 1217	ACC ACG GAG AAT TAC CGC CGC CGC CGT GAA GAG TGG CAA ATC CAA TAC 3 59 6 Thr Thr Glu Asn Tyr Arg Arg Arg Arg Glu Glu Trp Gln Ile Gln Tyr 123 2
3697 1233	CAG CAG GCA CAG TCT GAG GTC GAC GCA TTA CAG AAA CAG TTG GAT GCG 3744 Gln Gln Ala Gln Ser Glu Val Asp Ala Leu Gln Lys Gln Leu Asp Ala 1243
3745 1249	CTG GCA GTG CGC GAG AAA GCA GCT CAA ACT TCC CTG CAA CAG GCG AAG 3 79 2 Leu Ala Val Arg Glu Lys Ala Ala Gln Thr Ser Leu Gln Gln Ala Lys 1264
3793 1265	GCA CAC-CAG GTA CAA ATT CGG ACC ATG CTG ACT TAC TTA ACT ACT CGT 3 340 Ala Gln Gln Val Gln Ile Arg Thr Mec Leu Thr Tyr Leu Thr Thr Arg 1230
3341 1231	TTC ACC CAG GCG ACT CTG TAC CAG TGG CTG AGT GCT CAA TTA TCC GCG 3 333 Phe Thr Gln Ala Thr Leu Tyr Gln Trp Leu Ser Gly Gln Leu Ser Ala 1296
3339 1297	TTG TAT TAT CAA GCG TAT GAT GCC GTG GTT GCT CTC TGC CTC TCC GCC 3 5 3 6 Leu Tyr Tyr Gln Ala Tyr Asp Ala Val Val Ala Leu Cys Leu Ser Ala 1312
3937 1313	CAA GCT TGC TGG CAG TAT GAA TTG GGT GAT TAC GCT ACC ACT TTT ATC 3 934 Gln Ala Cys Trp Gln Tyr Glu Leu Gly Asp Tyr Ala Thr Thr Phe Ile 1323
3935 1329	CAG ACC GGT ACC TGG AAC GAC CAT TAC CGT GGT TTG CAA GTG GGG GAC 4 03 2 Gln Thr Gly Thr Trp Asn Asp His Tyr Arg Gly Leu Gln Yal Gly Glu 1344
4033 1345	ACA CTG CAA CTC AAT TTG CAT CAG ATG GAA GCG GCC TAT TTA GTT CGT 4 03 0 Thr Leu Gln Leu Asn Leu His Gln Mec Glu Ala Ala Tyr Leu Yal Arg i55O

202

186 242

4031 1361

CAC His

GAA Glu

CGC Arg

CTT Arg

CTT Leu

Asn

SJ CtG

Ile

CTT Arg

A Thr

TTG Val

TCG Ser

CTC Leu

AAA Lys

AGC Ser

/“«Τ·» - fc Λ Leu

412 3 1376

4129

TTG

GGT

GAT

TAT

TGT

TTT

GG i

aAG

TTA

AAA

ACC

TAA

GGC

AAA

GTC

416

1377

Leu

Giy

Asp

Asp

Giy

Phe

Giy

Lys

Leu

Lys

Thr

Glu

Gly

Lys

Vai

Asp

1352

4177

TTT

CCA

TTA

Agc

GAA

AAG

CTG

TTT

GAC

AAC

GAC

TAT

CCG

GOT

CAC

TAT

4224

1393

Phe

Pro

Leu

Ser

Giu

Lys

Leu

Phe

Asp

Asn

Asp

T/r

Pro

Gly

His

T/r

1403

4225

TTG

CGC

CAG

ATT

AAA

ACT

GTT

TCA

TTG

ACG

TTG

CCG

ACG

TTA

TTC

GgG

4272

1409

Leu

Arg

GIm

Iie

Lys

Thr

Val

Ser

Vai

Thr

Leu

Pro

Thr

Leu

Val

Gly

1424

4273

CCG

TAT

CAA

AAC

GTT

AAG

GCA

ACG

CTC

ACT

CAG

ACC

AGC

AGG

AGT

ATA

4320

1425

Pro

Tyr

GIm

Asn

Vai

Lys

Aia

Thr

Leu

Thr

GIm

Thr

Sar

Sar

Ser

Iie

1440

4321

TTG

TTA

GCA

GCA

GAT

ATC

AAT

GOT

TTT

AAA

CGT

CTG

AAT

GAT

CCG

ACA

4363

1441

Leu

Leu

Aia

Aia

Asp

Iie

Asm

Giy

Vai

L/s

Arg

Leu

Asm

Asp

Pro

Thr

1456

4369

GGT

AAA

GAG

TTT

GAT

GCG

ACG

CAT

ATT

GTC

ACC

AAT

CTO

CGT

GCC

AGG

4415

1457

Gly

Lys

Giu

Giy

Asp

Aia

Thr

His

Iie

Val

Thr

Asm

Leu

Arg

Aia

Ser

1472

4417

CAG

CAG

GTT

GCG

CTC

TCT

TGT

GOC

ATT

AAT

GAT

GCC

GOT

AGC

TTT

GAG

4464

1473

GlM

Gln

Vai

Aia

Leu

Ser

Ser

Giy

Iie

Asn

Asp

Aia

Gly

Ser

Phe

Giu

1433

4465

TTT

CTT

TTG

GAA

GAT

GAG

CGC

TAT

CTA

TCA

TTT

TAG

GGT

ACT

GGA

GCT

4512

1439

Leu

Arg

Leu

Giu

Asp

Giu

Arg

Tyr

Leu

Ser

Phe

Giu

Giy

Thr

Giy

Aia

1504

4513

GTT

TCC

AAA

TGG

ACT

CTT

AAC

TTC

CCG

CGT

TCT

GTG

GAT

GAG

CAT

ATT

4550

1505

Vai

Ser

Lys

Trp

Thr

Leu

Asn

Phe

Pro

Arg

Sar

Val

Asp

Giu

His

Ile

1520

4561

GAC

GAT

AAT

ACA

TTG

AAA

GCG

GAT

GAG

ATT

CAG

GCC

GCA

CTG

TTG

GCG

4603

1521

Asp

Asp

Lys

Thr

Leu

Lys

Ala

Asp

Tiu

Mec

Gin

Aia

Ala

Leu

Leu

Ala

1536

4609

AAT

ATG

GAT

GAT

GTG

CTT

GTT

CAO

TTG

CAT

TAT

ACC

GCC

TGC

GAC

GGC

4656

1537

Asn

Mec

Asp

Asp

Val

Leu

Val

GIm

Vai

His

Tyr

Thr

Aia

Cys

Asp

GIy

1552

4657

GGC

GCC

ATT

TTC

GCA

AAC

CAG

GTC

AAG

AAA

ACA

CTG

TCT

TAA

4693

1553

Giy

Ala

Ser

Phe

Aia

Asm

Gin

Vai

Lys

Lys

Thr

Leu

Ser

End

156 6

( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 59;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A) Długość: 1665 aminokwasów (B ) Typ: aminokwas ( C ) Topologia: liniowa ( i ) Typ cz^sieczki: białko ( xi) Opis sekwencji SEK NR ID: 57 ( peptyd TccB ); Cechy Od Do Opis

186 242

203

11 SEK NR ID: 7

Mec

Leu

Ser

Thr

Mec

Giu

Lys

Gln

Leu

Asn

Glu

Ser

-j 1 n

Arg

Asp

Aia

1 6

17

Leu

Cal

Thr

Gly

T/r

Mec

Asn

Phe

Cal

Ala

Pro

Thr

Lau

Lys

Gly

Cal

- -> —

3 3

Ser

Giy

Gln

Pro

Cal

Thr

Cal

Glu

Asp

Leu

Tyr

Glu

T/r

Leu

Leu

Ile

43

49

Asp

Pro

Glu

Cal

Aia

Asp

Glu

Cal

Glu

Thr

Ser

Arg

Cal

Ala

Gln

Ala

64

ó 5

Ile

Ala

-Ser

Ile

Gin

Gln

Tyr

Mec

Thr

Arg

Leu

Cal

Asn

Gly

Ser

Glu

30

31

Pro

Gly

Arg

Gln

Ala

Mec

Glu

Pro

Ser

Thr

Ala

Asn

Glu

Trp

Arg

Asp

36

97

Asn

Asp

Asn

Gln

T/r

Ala

Ile

Trp

Ala

Ala

Gly

Ala

Glu

Cal

Arg

Asn

112

113

Tyr

Ala

Glu

Asn

Tyr

Ile

Ser

Pro

Ile

Thr

Arg

Gln

Glu

Lys

Ser

His

123

129

Tyr

Phe

Ser

Glu

Leu

Glu

Thr

Thr

Leu

Asn

Gln

Asn

Arg

Leu

Asp

Pro

144

145

Asp

Arg

Cal

Gln

Asp

Ala

cal

Leu

Ala

Tyr

Leu

Asn

Glu

Phe

Glu

Aid

150

1 ó 1

Cal

Ser

Asn

Leu

Tyr

Cal

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Asn

Gln

Asp

Lys

Phe

176

177

Asp

Gln

Ala

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Ile

Gly

Arg

Thr

Thr

Thr

Lys

Pro

T/r

192

193

Arg

Tyr

Tyr

Trp

Arg

Gln

Mec

Asp

Leu

Ser

Lys

Asn

Arg

Gln

Asp

Pro

203

209

Ala

Gly

Asn

Pro

Val

Thr

Pro

Asn

Cys

Trp

Asn

Asp

Trp

Gln

Glu

Ile

224

225

Thr

Leu

Pro

Leu

Ser

Gly

Asp

Thr

Cal

Leu

Glu

His

Thr

Cal

Arg

Pro

240

241

Cal

Phe

Tyr

Asn

Asp

Arg

Leu

Tyr

Cal

Ala

Trp

Cal

Glu

Arg

Asp

Pro

256

257

Ala

Cal

Gln

Lys

Asp

Ala

Asp

Gly

Lys

Asn

Ile

Gly

Lys

Thr

His

Ala

272

273

Tyr

Asn

Ile

Lys

Phe

Gly

Tyr

Lys

Arg

Tyr

Asp

Asp

Thr

Trp

Thr

Ala

238

289

Pro

Asn

Thr

Thr

Thr

Leu

Mec

Thr

Gln

Gln

Ala

Gly

Glu

Ser

Ser

Glu

304

305

Thr

Gln

Arg

Ser

Ser

Leu

Leu

Ile

Asp

Glu

Ser

Ser

Thr

Thr

Leu

Arg

.20

321

Gln

Val

Asn

Leu

Leu

Ala

Thr

Thr

Asp

Phe

Ser

Ile

Asp

Pro

Thr

Glu

3 3 6

337

Glu

Thr

Asp

Ser

Asn

Pro

Tyr

Gly

Arg

Leu

Mec

Leu

Gly

Cal

Phe

Cal

352

353

Arg

Gln

Phe

Glu

Gly

Asp

Gly

Ala

Asn

Arg

Lys

Asn

Lys

Pro

Cal

Val

3 63

369

Tyr

Gly

Tyr

Leu

Tyr

Cys

Asp

Ser

Ala

Phe

Asn

Arg

His

Cal

Leu

Arg

334

385

Pro

Leu

Ser

Lys

Asn

Phe

Leu

Phe

Ser

Thr

Tyr

Arg

Asp

Glu

Thr

Asp

400

401

Gly

Gln

Asn

Ser

Leu

Gln

Phe

Ala

Cal

Tyr

Asp

Lys

Lys

Tyr

Cal

Ile

416

417

Thr

Lys

Cal

Cal

Thr

Gly

Ala

Thr

Glu

Asp

Pro

Glu

Asn

Thr

cly

Trp

432

433

Cal

Ser

Lys

Val

Asp

Asp

Leu

Lys

Gln

Gly

Thr

Thr

Gly

Ala

Tyr

Cal

443

449

Tyr

Ile

Asp

Gln

Asp

Gly

Leu

Thr

Leu

His

Ile

Gln

Thr

Thr

Thr

Asn

4 6 4

465

Gly

-Asp

Phe

Ile

Asn

Arg

His

Thr

Phe

Gly

Tyr

Asn

Asp

Lau

Cal

T/r

430

431

Asp

Ser

Lys

Ser

Gly

Tyr

Gly

Phe

Thr

Trp

Ser

Gly

Asn

Glu

Gly

Phe

4 96

497

Tyr

Leu

Asp

Tyr

His

Asp

Gly

Asn

Tyr

T/r

Thr

Phe

His

Asn

Aid

Ile

512

204

186 242

:1ί

Ile

Asn

Tyr

Tyr

Pro

Ser

G

Tyr

Gly

Gly

Gly

Ser

Val

Pro

Asn

Gly

5 2 8

529

Thr

Trp

Ala

Leu

Glu

Gln

Arg

Ile

Asn

Glu

Gly

Trp

Ala

Ile

Ala

Pro

644

5 -i 5

Leu

Leu

Asp

Thr

Leu

His

Thr

Val

Thr

Val

Lys

Gly

Ser

Tyr

Ile

Ala

560

5 61

Trp

Glu

Gly

Glu

Thr

Pro

Thr

Gly

Tyr

Asn

Leu

Tyr

Ile

Pro

Asp

Gly

576

= --

Thr

Val

Leu

Leu

Asp

Trp

Phe

Asp

Lys

Ile

Asn

Phe

Ala

He

Gly

Leu

592,

553

Asn

Lys

Leu

Glu

Ser

Val

Phe

Thr

Ser

Pro

Asp

Trp

Pro

Thr

Leu

Thr

603

605

Thr

Ile

Lys

Asn

Phe

Ser

Lys

Ile

Ala

Asp

Asn

Arg

Lys

Phe

Tyr

Gln

624

625

Glu

Ile

Asn

Ala

Glu

Thr

Ala

Asp

Gly

Arg

Asn

Leu

Phe

Lys

Arg

Tyr

640

541

S<r r

Thr

Gln

Thr

Phe

Gly

Leu

Thr

Ser

Gly

Ala

Thr

Tyr

Ser

Thr

Thr

65 5

657

T/r

Thr

Leu

Ser

Glu

Ala

Asp

Phe

Ser

Thr

Asp

Pro

Asp

Lys

Asn

Tyr

6“2

57 3

Leu

Gln

Val

Cys

Leu

Asn

Val

Val

Trp

Asp

His

Tyr

Asp

Arg

Pro

Ser

633

635

Gly

Lys

Lys

Gly

Ala

Tyr

Ser

Trp

Val

Ser

Lys

Trp

Phe

Asn

Val

Tyr

704

705

Val

Ala

Leu

Gln

Asp

Ser

Lys

Ala

Pro

Asp

Ala

Ile

Pro

Arg

Leu

Val

720

721

Ser

Arg

Tyr

Asp

Ser

Lys

Arg

Gly

Leu

Val

Gln

Tyr

Leu

Asp

Phe

Trp

736

737

Thr

Ser

Ser

Leu

Pro

Ala

Lys

Thr

Arg

Leu

Asn

Thr

Thr

Phe

Val

Arg

752

753

Thr

Leu

Ile

Glu

Lys

Ala

ten

Leu

Gly

Leu

Asp

Ser

Leu

Leu

Asp

Tyr

763

769

Thr

Leu

Gln

Ala

Asp

Pro

Ser

Leu

Glu

Ala

Asp

Leu

Val

Thr

Asp

Gly

734

735

Lys

Ser

Glu

Pro

Mec

Asp

Phe

Asn

Gly

Ser

Asn

Gly

Leu

Tyr

Phe

Trp

300

301

Glu

Leu

Phe

Phe

His

Leu

Pro

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Arg

Phe

Ala

Asn

816

817

Glu

Gln

Gln

Phe

Ser

Pro

Ala

Gln

Lys

Ser

Leu

His

Tyr

Ile

Phe

Asp

332

333

Pro

Ala

Mec

Lys

Asn

Lys

Pro

His

ten

Ala

Pro

Ala

Tyr

Trp

Asn

Val

343

349

Arg

Pro

Leu

Val

Glu

Gly

Asn

Ser

Asp

Leu

Ser

Arg

His

Leu

Asp

Asp

364

365

Ser

Ile

Asp

Pro

Asp

Thr

Gln

Ala

Tyr

Ala

His

Pro

Val

Ile

Tyr

Gln

380

881

Lys

Ala

Val

Phe

Ile

Ala

Tyr

Val

Ser

Asn

Leu

Ile

Ala

Gln

Gly

Asp

396

357

Mec

Trp

Tyr

Arg

Gln

Leu

Thr

Arg

Asp

Gly

Leu

Thr

Gln

Ala

Arg

Val

912

913

Tyr

Tyr

Asn

Leu

Ala

Ala

Glu

Leu

Leu

Gly

Pro

Arg

Pro

Asp

Val

Ser

928

929

Leu

Ser

Ser

Ile

Trp

Thr

Pro

Gln

Thr

Leu

Asp

Thr

Leu

Ala

Ala

Gly

344

945

Gln

Lys

Ala

Val

Leu

.Arg

Asp

Phe

Glu

His

Gln

Leu

Ala

Asn

Ser

Asp

9 60

961

Thr

Ala

Leu

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Arg

Asn

Val

Ser

Tyr

Leu

Lys

Leu

977

Ala

Asp

Asn

Gly

Tyr

Phe

Asn

Glu

Pro

Leu

Asn

Val

Leu

Mec

Leu

Ser

992

993

His

Trp

Asp

Thr

Leu

Asp

Ala

Arg

Leu

Tyr

Asn

Leu

Arg

HiS

Asn

Leu

.00 3

1009

Thr

Val

Asp

Gly

Lys

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

Leu

Tyr

Ala

Ala

Pro

Val

* 1 1 • - _ ·4

25

Asp

Pro

Val

Ala

Leu

Leu

Ala

Gln

Arg

Ala

Gln

Ser

Gly

Thr

Leu

Thr

.14 0

186 242

205

1041

Asn Gly Val Ser

Gly

Aia

. Mec

Leu

Thr

Tal

Pro

Pro

T/r

Arg

Phe

3τ=·Γ

1056

105“

Ala Mec Leu Pro

Arg

Ala

T/r

Ser

Ala

’/al

•w i7

Thr

LĆU

Thr

Ser

Phe

1072

1073

Gly Gln Asn Leu

Leu

Ser

Leu

Leu

Glu

Arg

Ser

Glu

Arg

Ala

Gys

Gln

10 33

1039

Glu Glu Leu Ala

Gln

Gln

Gln

Leu

Leu

Asp

Mec

Ser

Ser

Tyr

Aia

Ile

1104

1105

Thr Leu Gln Gln

Gln

Ala

Leu

Asp

Gly

Leu

Ala

Ala

Asp

Arg

Ala

1120

1121

Leu Leu Ala Ser

Gln

Ala

Thr

Ala

Gln

Gin

Arg

His

Asp

His

Tyr

T/r

1135

1137

Thr Lau Tyr Gln

Asn

Asn

Ile

Ser

Ser

Ala

Glu

Gln

Leu

Val

Mec

Asp

1152

1153

Thr Gln Thr Ser

Ala

Gln

Ser

Leu

Ile

Ser

Ser

Ser

Thr

Gly

7’a 1

Gln

1163

1169

Thr Ala Ser Gly

Ala

Leu

Lys

Val

Ile

Pro

Asn

Ile

Phe

Gly

Leu

Ala

1134

1135

Asp Gly Gly Ser

Arg

Tyr

Glu

Gly

Val

Thr

Glu

Ala

Ile

Ala

Ile

Gly

1200

1201

Leu Mec Ala Ala

Gly

Gln

Ala

Thr

Ser

Val

Val

Ala

Glu

Arg

Leu

Ala

1215

1217

Thr Thr Glu Asn

Tyr

Arg

Arg

Arg

Arg

Glu

Glu

Trp

Gln

Ile

Gln

Tyr

1232

1233

Gln Gln Ala Gln

Ser

Glu

Val

Asp

Ala

Leu

Gln

Lys

Gln

Leu

Asp

Aia

1243

1249

Leu Ala Val Arg

Glu

Lys

Ala

Ala

Gln

Thr

Ser

Leu

Gln

Gln

Ala

Lys

1264

1265

Ala Gln Gln Val

Gln

Ile

Arg

Thr

Mec

Leu

Thr

Tyr

Leu

Thr

Thr

Arg

1230

1231

Phe Thr Gln Ala

Thr

Leu

T/r

Gln

Trp

Leu

Ser

Gly

Gln

Leu

Ser

Ala

1296

1297

Leu Tyr Tyr Gln

Ala

Tyr

Asp

Ala

Val

Val

Ala

Leu

cys

Leu

Ser

Ala

1312

1313

Gln Ala Cys Trp

Gln

Tyr

Glu

Leu

Gly

Asp

Tyr

Ala

Thr

Thr

Phe

Ile

1323

1329

Gln Thr Gly Thr

Trp

Asn

Asp

His

Tyr

Arg

Gly

Leu

Gln

Val

Gly

Glu

1344

1345

Thr Leu Gln Leu

Asn

Leu

His

Gln

Mec

Glu

Ala

Aia

Tyr

Leu

val

Arg

13 60

1361

His Glu Arg Arg

Leu

Asn

Val

Ile

Arg

Thr

Val

Ser

Leu

Lys

Ser

Leu

1375

1377

Leu Gly Asp Asp

Gly

Phe

Gly

Lys

Leu

Lys

Thr

Glu

Gly

Lys

Val

Asp

1392

1393

Phe Pro Leu Ser

Glu

Lys

Leu

Phe

Asp

Asn

Asp

Tyr

Pro

Gly

His

Tyr

1403

1409

Leu Arg Gln Ile

Lys

Thr

Val

Ser

Val

Thr

Leu

Pro

Thr

Lau

Val

Gly

1424

1425

Pro Tyr Gln Asn

Val

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Gln

Thr

Ser

Ser

Ser

Ile

1440

1441

Leu Leu Ala Ala

Asp

Ile

Asn

Gly

Val

Lys

Arg

Leu

Asn

Asp

Pro

Thr

1456

1457

Gly Lys Giu Gly

Asp

Ala

Thr

His

Ile

Val

Thr

Asn

Leu

Arg

Ala

Ser

1472

1473

Gln Gln Val Ala

Leu

Ser

Ser

Gly

Ile

Asn

Asp

Ala

Gly

Ser

Phe

Glu

1433

1439

Leu Arg Leu Glu

Asp

Glu

Arg

Tyr

Leu

Ser

Phe

Glu

Gly

Thr

Gly

Aid

1504

1505

7al Ser Lys Trp

Thr

Leu

Asn

Phe

Pro

Arg

Ser

Val

Asp

Glu

His

Ile

1520

1521

Asp Asp Lys Thr

Leu

Lys

Ala

Asp

Glu

Mec

Gln

Ala

Ala

Leu

Leu

ΛΧΛ

15 0 6

1537

Asn Mec Asp Asp

'/al

Leu

/a 1

Gin

Val

His

T/r

Thr

.Aid

cys

Asp

cly

1511

1553 Gly Ala Ser Phe Ala Asn Gln Val Lys L/s Thr Leu Ser

1565

206

186 242 ( 2 ) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 60;

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 3132 par zasad ( B ) Typ: kwas nukleinowy ( C ) Rodzaj nici: podwójna ( D ) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA ( genomowa ) ( xi) Opis sekwencji: SEK NR ID: 56 (tccC )

1

ATG

AGT

CCG

TCT

GAG

ACT

ACT

CTT

TAT

ACT

CAA

ACC

CCA

ACA

GTC

AGC

48

i

Mec

Ser

Pro

Ser

Glu

Thr

Thr

Leu

Tyr

Thr

Gln

Thr

Pro

Thr

Val

Ser

1 6

49

GTG

TTA

GAT

AAT

CGC

GGT

CTG

TCC

ATT

CGT

GAT

ATT

GGT

TTT

CAC

CGT

9 6

17

Val

Leu

Asp

Asn

Arg

Gly

Leu

Ser

Ile

Arg

Asp

Ile

Giy

Phe

His

Arg

32

97

ATT

GTA

ATC

GGG

GGG

GAT

ACT

GAC

ACC

CGC

GTC

ACC

CGT

CAC

CAG

TAT

144

3 3

Ile

Val

Ile

Gly

Gly

Asp

Thr

Asp

Thr

Arg

Val

Thr

Arg

His

Gln

Tyr

43

145

GAT

GCC

CGT

GGA

CAC

CTG

AAC

TAC

AGT

ATT

GAC

CCA

CGC

TTG

TAT

GAT

192

49

Asp

Ala

Arg

Gly

His

Leu

Asn

Tyr

Ser

Ile

Asp

Pro

Arg

Leu

Tyr

Asp

64

193

GCA

AAG

CAG

GCT

GAT

AAC

TCA

GTA

AAG

CCT

AAT

TTT

GTC

TGG

CAG

CAT

24 0

6 5

Ala

Lys

Gln

Ala

Asp

Asm

Ser

Val

Lys

Pro

Asm

Phe

Val

Trp

Glm

His

80

241

GAT

CTG

GCC

GGT

CAT

GCC

CTG

CGG

ACA

GAG

AGT

GTC

GAT

GCT

GGT

CGT

283

ai

Asp

Lau

Ala

Gly

His

Ala

Leu

Arg

Thr

Glu

Ser

Val

Asp

Ala

Gly

Arg

9 5

289

ACT

GTT

GCA

TTG

AAT

GAT

ATT

GAA

GGT

CGT

TCG

GTA

ATG

ACA

ATG

AAT

335

57

Thr

Val

Ala

Leu

Asm

Asp

Ile

Glu

Gly

Arg

Ser

Val

Mec

Thr

Mec

Asm

112

337

GCG

ACC

GGT

GTT

CGT

CAG

ACC

CGT

CGC

TAT

GAA

GGC

AAC

ACC

TTG

CCC

334

113

Ala

Thr

Gly

Val

Arg

Glm

Thr

Arg

Arg

Tyr

Glu

Gly

Asm

Thr

Leu

Pro

128

385

GGT

CGC

TTG

TTA

TCT

GTG

AGC

GAG

CAA

GTT

TTC

AAC

CAA

GAG

AGT

GCT

432

129

Gly

Arg

Leu

Leu

Ser

Val

Ser

Glu

Gln

Val

Phe

ton

Gln

Glu

Ser

Ala

144

433

AAA

GTG

ACA

GAG

CGC

TTT

ATC

TGG

GCT

GGG

AAT

ACA

ACC

TCG

GAG

AAA

430

145

Lys

Val

Thr

Glu

Arg

Phe

Ile

Trp

Ala

Gly

ton

Thr

Thr

Ser

Glu

Lys

160

481

GAG

TAT

AAC

CTC

TCC

GGT

CTG

TGT

ATA

CGC

CAC

TAC

GAC

ACA

GCG

GGA

528

161

Glu

Tyr

Asm

Leu

Ser

Gly

Leu

Cys

Ile

Arg

His

Tyr

top

Thr

Ala

Gly

17 6

529

GTG

ACC

CGG

TTG

ATG

AGT

CAG

TCA

CTG

GCG

GGC

GCC

ATG

CTA

TCC

CAA

5 7 5

177

Val

Thr

Arg

Leu

Met

Ser

Gln

Ser

Leu

Ala

Gly

Ala

Mec

Leu

Ser

Gin

192

577

TCT

CAC

CAA

TTG

CTG

GCG

GAA

GGG

CAG

GAG

GCT

AAC

TGG

AGC

GGT

GAC

524

153

Ser

His

Glm

Leu

Leu

Aid

Giu

Gly

Glm

Glu

Aia

Asm

Trp

Ser

Gly

Asp

2 03

186 242

207

= 25

X TAA

t/Α

' TTT CAC

» ATA

: TAA

i AAA

! Ga .A GAA

: TTA

i TAA

AGA

TAT

672

2 0 9

Nsp

i Tlu

. Thr

’ V η 1

Arp

t Aln

l G(y

' Mec

Leu

; Git

. Ser

Tlu

Val

/y -r» y u

Chr

Ahr

224

573

ATT

. TAA

' TAA

CAT

' TAA

GCA

aGa

TT!

TAA

AAT

GCC

AGG

Λ'α —

TTA

TGt

720

22 =

Tln

. Ser

Chr

Chr

Gsn

G la

He

Aiy

Ala

Leu

Leu

Ahr

Aln

Ahr

Gsp

Cla

240

721

GGC

AAC

GCA

TCA

GgT

ATA

ACA

TAC

TGA 1 Λ X

ATA

GAA

AAA

AGA

ATG

AGN

763

241

Lys

Tly

Tsn

Ile

Tin

Grg

Leu

Gla

Ayr

Gsp

Iie

Gla

Gly

Tln

Leu

Lys

2 56

7 5 9

WWW

CAA

TGG

TAA

GAT

TAG

GGG

AGA

AGG

GTA

TGG

CGG

ATA

GTA

TAA

Cna

8 16

257

Giy

Ser

Trp

Leu

Ahr

Val

Lys

Gly

Tln

Ser

Tlu

Aln

Vai

Ile

Vai

Lys

272

317

CAA

CAT

TAC

TAA

AAG

TAC

TAT

ATA

AGA

GGG

TAG

ATA

GGG

AgG

ACA

AAA

3 64

273

Ser

Leu

Ser

Arp

Ser

Gla

Tla

Gly

His

Lys

Leu

Grg

Glu

Glu

His

Gly

288

865

GGA

AGA

TAG

GAA

GAA

TGG

ACA

GAA

TGA

TGA

AAG

AGA

GAA

CGA

AAA

AAA

512

239

.Asn

Tly

Val

Vsl

Ahr

Tlu

Ayr

Ser

Ayr

Tlu

Pro

Alu

Ahr

Aln

Grg

Leu

304

913

GAC

AAA

CAC

CAA

GCA

AAG

CTA

ACA

TCG

TGG

GAA

ACG

AAG

AGG

AAA

GAG

960

305

Ile

Gly

Ile

Ahr

Ahr

Grg

Grg

Gla

Tlu

Tly

Ser

Gln

Ser

Gly

Cla

Grg

320

961

GAC

TCT

AGA

GGA

AAG

AAA

AGA

GGG

TGA

AGA

CAG

ACG

AAG

gna

AAA

GAC

1008

321

Val

Leu

Tln

Asp

Leu

Grg

Ayr

Lys

Ayr

Gsp

Pro

Val

Gly

Gsn

Val

Ile

336

1009

GAC

CAC

ACC

AGA

AGA

TAC

AGG

TCA

TAA

ATA

aga

TGG

CTA

gna

AGA

can

1056

337

Ser

Ile

His

Gsn

Gsp

Gla

Alu

Gla

Ahr

Grg

Phe

Arp

Arg

Gsn

Tln

Lys

352

1057

TCA

TAG

AAT

GAG

GGA

ATA

AGC

AAA

CGA

TGA

AAA

CAG

AGA

AAG

AAA

GAA

1104

353

Val

Tlu

Pro

Alu

Gsn

Grg

Ayr

Val

Ayr

Gsp

Ser

Leu

Ayr

Aln

Leu

Mec

3 63

1105

CTA

TCA

CAC

GGG

CTA

AGG

GAG

TCA

GGA

GAA

aaa

AGA

CTG

GAA

GAC

CTG

1152

369

Ser

Cla

Ahr

Gly

Grg

Tlu

Mac

Gla

Gsn

Ile

Tly

Gln

Gln

Ser

Gsn

Aln

334

1153

AAA

AAA

TAC

CCA

AAA

GAG

AAA

AAA

AAA

GAA

GGA

AGC

GAA

GAA

ACA

GCA

1200

385

Leu

Pro

Ser

Pro

Vsl

Ile

Pro

Val

Pro

Chr

Gsp

Gsp

Ser

Ahr

Ayr

Ahr

400

1201

GAA

AAC

AAA

CTA.

GCA

AGA

GCA

AGA

TGC

ATA

GAA

AAA

GGA

AAA

TAA

ATA

1248

401

Gsn

Ayr

Leu

Arg

Ahr

Ayr

Ahr

Ayr

Gsp

Grg

Gly

Tly

Gsn

Leu

Val

Aln

416

1249

TAA

AAA

ACA

CAA

AAG

AAC

TCT

GCA

AGG

GAA

GAA

AGC

GAA

CCA

TCA

TAA

1296

417

Ile

Trg

His

Ser

Ser

Pro

Gla

Chr

Tln

Gsn

Ser

Ayr

Ahr

Ahr

Gsp

Ile

432

1297

TCA

TAA

CAC

CGA

ATA

GGA

GGA

ATG

TAT

TCC

AAA

GGA

GCG

AAA

TAA

TAG

1344

433

Chr

Val

Ser

Ser

Grg

Ser

A.sn

Grg

Gla

Val

Leu

Ser

Ahr

Leu

Chr

Ahr

4 43

1345

TCA

can

CAA

AAC

ACA

TGA

TAT

AAC

TAA

TGC

AAA

—C—

aga

AGA

AGG

gna

13 92

4 4 9

-Asp

Pro

Thr

Grg

Val

Gsp

Gla

Leu

Phe

Asp

Ser

Tly

Tly

His

Tin

Lys

464

13 9 3

TCT

TAT

CCT

C. A )A

———

AGG

GGC

AAA

TTA

TTA

GGA

GAA

ATA

AaA

Gcg

CAT

- 4 4 W

208

186 242

455

Mec

Leu

Ile

Pro

Gly

Gln

Asn

Leu

Asp

Trp

Asn

Tle

Arg

Gly

LeU

4 30

1441

CAA

CGA

GTC

ACA

CcG

GTG

AGC

CGT

GAA

AAT

AGC

AGT

Gac

AGT

GaA

Tgg

1488

431

Gln

Arg

Yal

Thr

Pro

Yal

Ser

-Arg

Glu

Asn

Ser

Ser

Asp

Ser

Giu

Trp

4 5 o

1489

TAT

CGC

TAT

AGC

AGT

GAT

GGC

ATG

CGG

CTG 1 kj

CTA

AAA

GTG

AGT

GAA

15 3 6

4 5“

Tyr

Arg

T/r

Ser

Ser

Asp

Gly

Mec

-Arg

Leu

Leu

Lys

'Yal

Ser

Glu

912

153 7

CAG

ACG

GGC

AAG

AGT

ACT

CAA

GTA

CAA

CGG

GTG

ACT

TAT

CTG

CCG

1534

513

Gln

Thr

Gly

Asn

Ser

Thr

Gln

Yal

Gln

Arg

Yal

Thr

Tyr

Leu

Pro

Gly

523

1585

TTA

GAG

CTA

CGG

ACA

ACT

GGG

GTT

GCA

GAT

AAA

ACA

ACC

GAA

GAT

TTG

16 3 2

529

Leu

Glu

Leu

•Arg

Thr

Thr

Gly

Yal

Ala

Asp

Lys

Thr

Thr

Glu

Asp

Leu

544

1633

CAG

GTG

ATT

ACG

GTA

GGT

GAA

GCG

GGT

CGC

GCA

CAG

GTA

AGG

GTA

TTG

1630

545

Gln

Yal

Ile

Thr

Val

Gly

Glu

Ala

Gly

-Arg

Ala

Gln

Yal

Arg

Yal

Leu

5 60

1631

CAC

TGG

GAA

AGT

GGT

.AAG

CCG

ACA

GAT

ATT

GAC

AAC

AAT

CAG

GTG

CGC

1723

5 61

His

Trp

Glu

Ser

Gly

Lys

Pro

Thr

Asp

Ile

Asp

Asn

Asn

Gln

Yal

Arg

576

1729

TAC

AGC

TAC

GAT

AAT

CTG

CTT

GGC

TCC

AGC

CAG

CTT

GAA

CTG

GAT

AGC

177 6

577

Tyr

Ser

Tyr

Asp

Asn

Leu

Leu

Gly

Ser

Ser

Gln

Leu

Glu

Leu

Asp

Ser

592

1777

GAA

GGG

CAG

ATT

CTC

AGT

CAG

GAA

GAG

TAT

TAT

CCG

TAT

GGC

GGT

ACG

1324

593

Glu

Gly

Gln

Ile

Leu

Ser

Gln

Glu

Glu

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Gly

Gly

Thr

603

1325

GCG

ATA

TGG

GCG

GCG

AGA

AAT

CAG

ACA

GAA

GCC

AGC

TAC

AAA

TTT

a

1872

609

Ala

Ile

Trp

Ala

Ala

Arg

Asn

Gln

Thr

Glu

Ala

Ser

Tyr

Lys

Phe

Ile

624

1373

CGT

TAC

TCC

GGT

AAA

GAG

CGG

GAT

GCC

ACT

GGA

TTG

TAT

TAT

TAC

GGC

1520

625

Arg

Tyr

Ser

Gly

Lys

Glu

Arg

Asp

Ala

Thr

Gly

Leu

Tyr

Tyr

Tyr

Gly

640

1521

TAC

CGT

TAT

TAT

CAA

CCT

TGG

GTG

GGT

CGA

TGG

TTG

AGT

GCT

GAT

1563

641

T/r

Arg

Tyr

T/r

Gln

Pro

Trp

val

Gly

Arg

Trp

Leu

Ser

Ala

Asp

Pro

6 56

1969 657

GCG Ala

GGA ACC GTG GAT GGG

CTG AAT

TTG TAC CGA ATG

GTG Yal

AGG Arg

AAT Asn

Asn

2016 6“2

Gly Thr

Yal

Asp

Gly

Leu

Asn

Leu

Tyr

Arg

Mec

2017

CCC

ATC

ACA

TTG

ACT

GAC

CAT

GAC

GGA

TTA

GCA

CCG

TCT

CCA

AAT

2064

67 3

Pro

Ile

Thr

Leu

Thr

Asp

His

Asp

Gly

Leu

Ala

Pro

Ser

Pro

Asn

Arg

633

2065

AAT

CGA

AAT

ACA

TTT

TGG

TTT

GCT

TCA

TTT

TTG

TTT

CGT

AAA

CCT

GAT

2112

639

Asn

Arg

Asn

Thr

Phe

Trp

Phe

Ala

Ser

Phe

Leu

Phe

Arg

Lys

Pro

Asp

“04

2113

GAG

GGA

ATG

TCC

GCG

TCA

ATG

AGA

CGG

GGA

CAA

AAA

ATT

GGC

AGA

216 0

“05

Glu

Gly

Mee

Ser

Ala

Ser

Mec

Arg

Arg

Gly

Gln

Lys

Ile

Gly

-Arg

A. a.

720

2151

ATT

GCC

GGC

GGG

ATT

GCG

ATT

GGC

GGT

CTT

GCG

GCT

ACC

ATT

GCC

2208

721

Ile

Ala

Gly

Gly

Ile

Ala

Ile

Gly

Gly

Leu

.Ala

Ala

Thr

Ile

Ala

Ala.

7 38

186 242

209

2209 ACC GCT GGC GCG GCT ATC CCC GTC ATT CTG GGG GTT GCG GCC GTA GCG 335 6 ⁷³⁷ Thr·Ala Gly Ala Ala ib ?ro (/al Ile Leu Gly 7al Ala Ala Val Gly 753

2257 GCG GGG ATT GCG GCG TTG ATG GGA TAT AAC GTC GGT AGC CTG CTG GAA 27₀₄

753 Ala Gly Ile Gly Ala Leu Mec Gly Tyr Asn Val Gly Ser Lau Leu Glu 768

2305 AAA GGC GGG GCA TTA CTT GCT CGA CTC GTA CAG GGG AAA TCG ACG TTA 2352

769 Lys Gly Gly Ala Leu Leu Ala Arg Leu Val Gln Gly Lys Ser Thr Leu 784

2353 GTA CAG TCG GCG GCT GGC GCG GCT GCC GGA GCG AGT TCA GCC GCG _GCT 2₄0C

735 Val Gln Ser Ala Ala Gly Aia Ala Ala Gly Ala Ser Ser Ala ALa Ala 300

2401 TAT GGC GCA CGG GCA CAA GCT GTC GCT GTT GCA TCA GCC GCC GGG GCG 2448

801 Tyr Gly Ala Arg Ala Gln Gly Val Gly Val Ala Ser Ala Ala Gly Ala 816

2449 GTA ACA GGG GCT GTG GGA TCA TGG ATA AAT AAT GCT GAT CGC GGG _ATT 2496

817 Val Thr Gly Ala Val Gly Ser Trp Ile Asn Asn Ala Asp Arg Gly Ile 332

2497 GGC GGC GCT ATT GGG GCC GGG AGT GCG GTA GGC ACC ATT GAT ACT ATG 2544

333 Gly Gly Ala Ile Gly Ala Gly Ser Ala val Gly Thr Ile Asp Thr Mec 343

2545 TTA GGG ACT GCC TCT ACC CTT ACC CAT GAA GTC GGG GCA GCG GCG GGT 2592

349 Leu Gly Thr Ala Ser Thr Leu Thr His Glu Val Gly .Ala Ala Ala Gly 364

2593 GGG GCG GCG GCT GGG ATG ATC ACC GGT ACG CAA GGG AGT ACT CGG GCA 2 640

355 Gly Ala Ala Gly Gly Mec Ile Thr Gly Thr Gln Gly Ser Thr Arg Aia 330

2641 GCT ATC CAT GCC GGT ATT GGC ACC TAT TAT GGC TCC TGG ATT GGT TTT 2538

331 Gly Ile His ALa Gly Ha Gly Thr Tyr Tyr Gly Ser Trp Ile Gly Phe 896

2639 GGT TTA GAT GTC GCT AGT AAC CCC GCC GGA CAT TTA GCG AAT TAC GCA 2736

897 Gly Leu Asp Val ALa Ser Asn Pro Ala Gly His Lsu Ala Asn Tyr Ala 912

2737 GTG GGT TAT GCC GCT GGT TTG GGT GCT GAA ATG GCT GTC AAC AGA ATA 2734

913 Val Gly Tyr ALa Ala Gly Leu Gly Ala Glu Mec Ala Val ten Arg Ile 928

2785 ATG GGT GGT GGA TTT TTG AGT AGG CTC TTA GGC CGG GTT GTC AGC CCA 2832

929 Mec Gly Gly Gly Phe Leu Ser Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Ssr Pro 944

2333 TAT GCC GCC GGT TTA GCC AGA CAA TTA GTA CAT TTC AGT GTC GCC aga 2330

545 Tyr Ala Ala Gly Leu ALa Arg Gln Leu Val His Phe Ser Val Ala Arg 960

2881 CCT GTC TTT GAG CCG ATA TTT AGT GTT CTC GGC GGG CTT GTC GGT GGT 2928

961 Pro Val Phe Glu Pro Ile Phe Ser Val Lau Gly Gly Leu Val Gly Gly 976

2929 ATT GGA ACT GGC CTG CAC AGA GTG ATG GGA AGA GAG AGT TGG ATT TCC 2975

977 He Gly Thr Gly Leu His .Arg Val Mec Gly Arg Glu Ser Trp Ile Ser ⁹⁹²

977 AGA GCG TTA AGT GCT GCC GGT AGT GGT ATA GAT CAT GTC GCT GGC ATG 3 2 2 4

210

186 242

993

Arg

Ala

Leu

Ser

Aia

Aid

Gly

Ser

-“I

Ile

Asp

His

Val

Ala

•J — /

Net

1115

3 025

ATT

GGT

.AAT

CAG

ATC

aGA

GGC

^G

GTC

TTG

ACC

ACA

ACC

GGG

ATC

2j( k

9971

1009

Ile

Gly

Asn

Gln

Ile

Arg

Gly

Arg

Val

Leu

Thr

Thr

Thr

Gly

Ile

Ala

102 4

3O3

AAT

GCG

ATA

CAC

TAT

CGC

ACC

AGT

GCT

GTG

gGA

CCC

CGA

CGA

C TA

GTT

3 120

2922

Asn

Ala

Iie

•Asp

Tyr

Gly

Thr

Ser

Ala

VAi

Giy

Ala

* A A .-i^d

Arg

Arg

Vai

1340

3 121

TTT

TCT

TTC

TAA

3132

1041

Phe

Ser

Leu

End

1043

O O (2) Dane dla sekwencji SEK NR ID: 61;

(i) Charakterystyka sekwencji:

( A ) Długość: 1043 aminokwasów (B ) Typ: aminokwas ( C ) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko ( x) Opis sekwencji: SEK NR ID: 61 ( peptydTccC);

1

Mec

Ser

Pro

Ser

Giu

Thr

Thr

Leu

Tyr

Thr

Gln

Thr

Pro

Thr

Va1

Ser

15

17

Vel

Leu

Asp

Asn

Arg

Gly

Leu

Ser

Ile

Arg

Asp

Iie

Gly

Phe

His

Arg

32

33

Ile

Va1

Ile

Giy

Giy

Asp

Thr

Asp

Thr

Arg

Vel

Thr

Arg

His

Cln

Tyr

43

49

Asp

A1a

Arg

Gly

His

Leu

Asn

Tyr

Ser

Ile

Asp

Pro

Arg

Leu

Tyr

Asp

G 4

65

Ala

Lys

Cln

Ala

Asp

Asn

Ser

Va1

Lys

Pro

Asn

Phe

Vei

Trp

Gln

His

30

31

Asp

Leu

A1a

Gly

His

A1a

Leu

Arg

Thr

Glu

Ser

Va1

Asp

A1a

Cly

Arg

96

97

Thr

Va1

A1a

Leu

Asn

Asp

Ile

Glu

Gly

Arg

Ser

Vel

Mec

Thr

Mec

Asn

112

113

Ala

Thr

Cly

Va1

Arg

Gln

Thr

Arg

Arg

Tyr

Glu

Gly

Asn

Thr

Leu

Pro

123

129

Giy

Arg

Leu

Leu

Ser

Va1

Ser

Glu

Gln

Vel

Phe

Asn

Cln

Clu

Ser

Aia

144

145

Lys

Val

Thr

Glu

Arg

Phe

Ile

Trp

Ala

Gly

Asn

Thr

Thr

Ser

Glu

Lys

160

161

Glu

Tyr

Asn

Leu

Ser

Gly

Leu

Cys

Ile

Arg

His

Tyr

Asp

Thr

Ala

Giy

1 6

177

Vel

Thr

Arg

Leu

Mec

Ser

Gln

Ser

Leu

Ala

Cly

Ala

Met

Leu

Ser

Gin

192

193

Ser

His

Gln

Leu

Leu

AiA

Glu

Cly

Gln

Glu

Ale

Asn

Trp

Ser

Gly

Asp

208

209

Asp

Glu

Thr

Vel

Trp

Gln

Gly

Mec

Leu

Ale

Ser

Glu

Vel

Tyr

Thr

Thr

224

225

Gln

Ser

Thr

Thr

Asn

Ale

Ile

Gly

Ale

Leu

Leu

Thr

Gln

Thr

Asp

Aia

-40

241

Lys

Gly

Asn

Ile

Gln

Arg

Leu

Ale

Tyr

Asp

Ile

Ale

Gly

Gln

Leu

Lys

256

257

Gly

Ser

Trp

Leu

Thr

Va1

Lys

Giy

Gln

Ser

Ciu

Gin

Val

Ile

Vel

Ly s

273

Ser

Leu

Ser

Trp

Ser

A1a

Ala

Gly

His

Lys

Leu

Arg

Clu

Glu

His

L'/

283

289

Asn

Gly

Va1

Va1

Thr

Glu

Tyr

Ser

Tyr

Clu

Pro

clu

Thr

Cln

Arg

Leu

3 0 4

305

Ile

Giy

Iie

Thr

Thr

Arg

Arg

Ala

Glu

Giy

Ser

Gin

Ser

Giy

Ala

Trg

32 0

186 242 /al Leu Gln Asp Leu Arg Tyr Lys Tyr

Ser Ile His Asn Asp Ala Glu Ala Thr

Asp Pro /al Gly Asn /al

Arg Phe Trp Arg Asn Gln

/al

. Glu

1 Pro

G U 1U

Asn

. Arg

Tyr

• /al

Tyr

•Asp

Ser

Leu

Tyr

Gln

Leu

Mec

Ser

' Ala

. Thr

Gly

Arg

Glu

Mec

Ala

Asn

Ile

Gly

Gln

Gln

Ser

Asn

Gln

Leu

Pro

Ser

rro

/al

Ile

Pro

/al

Pro

Thr

Asp

Asp

Ser

Thr

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Leu

Arg

Thr

Tyr

Thr

Tyr

Asp

Arg

Gly

Gly

Asn

Leu

/al

Gln

Ile

Arg

His

Ser

Ser

Pro

Ala

Thr

Gln

Asn

Ser

Tyr

Thr

Thr

Asp

Iie

Thr

/al

Ser

Ser

Arg

Ser

Asn

Arg

Ala

'/al

Leu

Ser

Thr

Leu

Thr

Thr

Asp

Pro

Thr

Arg

/al

Asp

Ala

Leu

Phe

Asp

Ser

Gly

Gly

His

Gln

Lys

Mec

Leu

Ile

Pro

Gly

Gln

Asn

Leu

^p

Trp

Asn

Ile

Arg

Gly

Glu

Leu

Gln

Arg

/al

Thr

Pro

/al

Ser

Arg

Glu

Asn

Ser

Ser

Asp

Ser

Glu

Trp

Tyr

.Arg

Tyr

Ser

Ser

Asp

Gly

Mec

•Arg

Leu

Leu

Lys

/al

Ser

Glu

Gin

G ln

Thr

Gly

Asn

Ser

Thr

Gln

/al

Gln

•Arg

/al

Thr

Tyr

Leu

Pro

Gly

Leu

Glu

Leu

Arg

Thr

Thr

Gly

/al

Ala

Asp

Lys

Thr

Thr

Glu

Asp

Leu

Gln

/al

Ile

Thr

/al

Gly

Glu

Ala

Gly

Arg

Ala

Gln

/al

Arg

/al

Leu

His

Trp

Glu

Ser

Gly

Lys

Pro

Thr

Asp

Ile

Asp

Asn

Asn

Gln

/al

Arg

Tyr

Ser

Tyr

Asp

Asn

Leu

Leu

Gly

Ser

Ser

Gln

Leu

Glu

Leu

Asp

Ser

Glu

Gly

Gln

Ile

Leu

Ser

Gln

Glu

Glu

Tyr

Tyr

Pro

Tyr

Gly

Gly

Thr

.Ala

Ile

Trp

Ala

Ala

Arg

Asn

Gln

Thr

Glu

Ala

Ser

Tyr

Lys

Phe

Ile

Arg

Tyr

Ser

Gly

Lys

Glu

Arg

^p

Ala

Thr

Gly

Leu

Tyr

Tyr

Tyr

Gly

Tyr

Arg

Tyr

Tyr

Gln

Pro

Trp

/al

Gly

Arg

Trp

Leu

Ser

Ala

Asp

Pro

Ala

Gly

Thr

/al

Asp

Gly

Leu

Asn

Leu

Tyr

Arg

Mac

/al

Arg

Asn

.A>n

Pro

Ile

Thr

Leu

Thr

Asp

His

Asp

Gly

Leu

Ala

Pro

Ser

Pro

Asn

-Arg

Asn

Arg

Asn

Thr

Phe

Trp

Phe

Ala

Ser

Phe

Leu

Phe

Arg

Lys

Pro

Asp

Glu

Gly

Mec

Ser

Ala

Ser

Mec

Arg

Arg

Gly

Gln

Lys

Ile

Gly

•Arg

Ala

Ile

Ala

Gly

Gly

Ile

Ala

Ile

Gly

Gly

Leu

Ala

Ala

Thr

Ile

.Ala

Ala

Thr

Ala

Gly

Ala

Ala

Ile

Pro

/al

Ile

Leu

Gly

/al

Ala

Ala

/al

Gly

Ala

Gly

Ile

Gly

Ala

Leu

Mec

Gly

Tyr

Asn

/al

Gly

Ser

Leu

Leu

Glu

Lys

Gly

Gly

Ala

Leu

Leu

Ala

Arg

Leu

/al

Gln

Gly

Lys

Ser

Thr

Leu

/al

Gln

Ser

Ala

Ala

Gly

Ala

Ala

Ala

Gly

Ala

Ser

Ser

Ala

Ala

Ala

Tyr

Gly

Ala

Arg

Ala

Gln

Gly

/al

Gly

/al

Ala

Ser

Ala

Ala

Gly

Ala

/al

Thr

Gly

Ala

/al

Gly

Ser

Trp

Ile

Asn

Asn

Ala

Asp

Arg

Gly

Ile

Gly Gly Ala Ile Gly .Ala Gly Sep Ala /al Gly Thr Ile Asp Thr Mec

212

186 242

8 4 9

Leu

Gly

Thr

.Ala

Ser

Thr

Leu

Thr

His

Glu

Val

Gly

Aia

Aia

Ala

Gly

(i-i

565

Gly

Ala

Ala

Gly

Gly

Mee

Ile

Thr

Gly

Thr

Gln

Gly

Ser

Thr

Arg

Ala

ISO

881

Gly

Ile

His

.Ala

kj ly

Ile

Gly

Thr

Tyr

Tyr

Gly

Ser

Trp

Ile

Gly

Phe

89 6

897

Gly

Leu

Asp

Val

Ala

Ser

Asn

Pro

Ala

Gly

His

Leu

Ala

Asn

Tyr

Ala

912

9 33

Val

Gly

Tyr

Ala

Ala

Gly

Leu

Gly

Ala

Glu

Mee

Ala

Val

Asn

Arg

Ile

92 8

929

Mec

Gly

Gly

Gly

Phe

Leu

Ser

Arg

Leu

Leu

Gly

-Arg

Val

Val

Ser

Pro

944

945

Tyr

Ala

.Ala

Gly

Leu

Ala

Arg

Gln

Leu

Val

His

Phe

Ser

Val

Ala

Arg

960

961

Pro

Val

Phe

Glu

Pro

Ile

Phe

Ser

Val

Leu

Gly

Gly

Leu

Val

Gly

Gly

976

977

Ile

Gly

Thr

Gly

Leu

His

Arg

Val

Mec

Gly

Arg

Glu

Ser

Trp

Ile

Ser

992

993

-Arg

Ala

Leu

Ser

Ala

Ala

Gly

Ser

Gly

Ile

Asp

His

Val

Ala

Gly

Mec

100S

1009

I le

Gly

Asn

Gln

Ile

Arg

Gly

Arg

Val

Leu

Thr

Thr

Thr

Gly

Ile

Aia

1024

1025

Asn

Ala

Ile

Asp

Tyr

Gly

Thr

ser

Ala

Val

Gly

Ala

Ala

Arg

Arg

Val

1040

1041

Phe

Ser

Leu

1043

186 242 g§s mm Bśs o

Λ* o υ o H rf >. 88o

88® H rf W * v? υ rf UDU rf H 3

Sii

8tS P OO O OO W sa#

2 o o o.

5§5 £ rf H Frf f-· H as e $

<-* < w <h H

8S £4

O

2

U O o. H rf OT sa &

Hrf O.

a m

ga s rf f-· X

Ρί J

953 953 9Bg 893

Si 8· 85S 88 & SB E

U O rf O O O* Hrf H O O rf H rf O H rf «9 O O >, rf F* ·

88£ 88S 883 ga :

g§^ m gga m

883 883 883 m 853 68E gaa es z o O rf rf H rf O. OOP

H rf C O O >, Hrf O O O >W sea 883 88£ 883^

883 m 883 gga

583 88» Si S S83

O O < H < w rfH rf OO O rf H 3 H rf 3 Hrf >. O O M §83 8§3 883 agi

953 88£ 853 883 gas iss ess 68 e rf Η X H rf P rfH OT O O rf rf H O OOC O O M

88£ SP5 aB3

0 3 OO Μ H rf ®

853 aga ss3

595 8§£885 oc wi ri s

LL i O O >» iS8 3

H rf C sea gaa rf Η

O O rf *5 3 es * f~»rf « OOP rfR M sas rf Η X

CD O OT OT CN (D Ok u-» ci cn r- ot cn ,-ł «Μ CN

186 242 co co co

CO

ECOR I (707)

b~ o

b» bw o

b.

cc

CC

O

O

Ul

in

FIG. 2

186 242

ΤΗ-5 (N-term)

3000

FIG. 3

ΤΗ-10 ΤΗ-18 ΤΗ-17 (TcbA-PT81) (TcbA-PT56) (TcbA-PT103)

1000

186 242

TchA

TcaBi

TchA

TcaBi

TchA

TcaBi

TchA

TcaBi

TchA

TcaBii

TchA

TcaBii

TcbA

TcaBii

1740 1750 1760 1770 1780

SSAQALKNDS EPMDFSGANA LYFWELFYYT PMMMAHRLLQ EQNFDAANHW

η I	1
|450 {	460 1	470	480

_gS nPvDFSGpyg iYlWEiFfhi PflvtvRmqt EQryedAdtW>

ΛΑ ΑΑΛΑΛΛΛ

ΛΛΑΛΑΑΛΑ A AA

A A _ A A ___ A A^.A

NR

1790 1800 1810 1820 1830

FRYVWSPSGY IVDGKIAIYH WNVRPLEEDT SWNAQQLDST DPDAVAQDDP rdangąl | | j

490 | 510 520 530 ykYifrsaGY IinDGskprY- WNVmPLqlDT aWdttQpatT DPDviAmaDP>

| A A A Λ A A Λ Λ

ΛΑΛΑ ΑΛΛΛ AAAA

1840 1850 1860 1870 1880

MHYKVATFMA TLDLLMARGD AAYRQLERDT LAEAKMWYTQ ALNLLGDEPQ

I I I I

540 550 560 570 580

MHYKlAiFlh TLDLLiARGD sAYRQLERDT LvEAKMyYiQ AqqLLGprPd>

'w'

1890 1900 1910 1920 1930

VMLSTIWANP TLGNAASKTT QQVRQQVLTQ LR1NSRVKTP LLGTANSLTA

600 ihttnTWpNP TLsk>

1940 1950 1960 1970 1980

LFLPQENSKL KGYWRTLAQR MFNLRHNLSI DGQPLSLPLY AKPADPKALL lilii

30 40 50 60 _FLPpyNdvL lGYWdkLelR lyNLRHNLSl DGQPLnLPLY AtPvDPKtLq>

ΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Α ~ Λ

1990 2000 2010 2020 2030

SAAVSASQGG ADLPKAPLTI HRFPQMLEGA RGLVNQLIQF GSSLLGYSER

I law

80 | 90 100 110 rqqaggdgtG sspaggqgsv qRyPllvErA RsaVslLtQF GnSLqttlEh>

-v'-ν^Λν^/'-ν^Λ

Λ ΛΛΛ

A——A AA AAAA.

v—w^Zk/

2040 2050 2060 2070 2080

QDAEAMSQLL QTQASELILT SIRMQDNQLA ELDSEKTALQ VSLAGVQQRF

120

130

140

150

160

QDnEkMtiLL QTQqeailkh qhdiQqNnLk gLqhslTALQ aSrdGdtlRq> 'ν -^ΛΛν-ν^ΛΛ'''' -^Λν-^Λννν^Λν

FIG. 4A

186 242

TchA

TcaBii

TchA

TcaBii

TchA

TcaBii

TchA

TcaBii

TchA

TcaBii

TchA

TcaBii

TchA

TcaBii

TcbA

TcaBii

2090 2100 2110 2120 2130

DSYSQLYEEN INAGEQRALA LRSESAIESQ GAQISRMAGA GOTMAPNIFG

III ^a

170 I 180 I 190I 200 | 210 khYSdLingg lsAaEiagLt LRStaml-tn Gvatglliag GinavPNvFG>

-ν^ΛΛΛΛν^Λ--AAAAAyyAAA AAA_AyA AA Λ---Λ,^Λ,^ΛΛ AAAy_AAA/

2140 2150 2160 2170 2180

LADGGMHYGA IAYAIADGIE LSASAKMTOA EKVAQSE1YR RRRQEWKIQR

220

250

230 I 240

LAnGGsewGA pligsgqatq vgAgiqdqsA gisevtagYq RRqeEWalQR>

Λ Λ Λ Λ _ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ _— Λ Λ Λ Λ Λ Λ /

260

2190 2200 2210 2220 2230

ENAQAEZNQL NAQLESLSIR REAAEMQKEY LKTQQAQAQA QLTFLRSKFS

270

300

310

280 I 290

DiAdnEItQL dAQiqSLqeq itmAqkQitl seTeQAnAQA iydlqttrFt>

Α_νΛΛ_ΛΛ_ΛΛ Λ Λ A Λ Λ Λ. Α^Λ Λ Λ Α Λ Λ Λ Λ Λ yy_ Α Λ Λ S.

2240 2250 2260 2270 2280

NQALYSWLRG RLSGIYFQFY DLAVSRCLMA EQSYQWEAND NSISFVKPGA

320 | 330 | 340 | | | 360 | gQALYnWmaG RLSalYyQmY DstlpiCLqp kaalvqEgek eSdSlfqvpv>

„AAAAAAAyA ΛΛΑΛΑΛΑΛ_Λ AyA A AyA AyA AyyyA Λ Λ _ A Λ Λ yy_

2290 2300 2310 2320 2330

WQGTYAGLLC GEALIQNLAQ MEEAYLKWES RALEVERTVS LAWYDSLEG

370

410

380 I 390 I 400 WndlwqGLLa GEgLsseLqk IdaiwLargg igLEaiRTVS Ldtlfgt—G> '_v—^ΛΛΛν

2340 2350 2360 2370 2380

NDRFNLAEQI PALLDKGEGT AGTKKNGLSL ANAILSASVK LSDLKLGTDY

420 | 430 j 440 | 450

---tLsEnl nkvLn-GEtv spsggvtLaL tgdlfgAtld LSqLgLdnsY>

'--AAyA

2390 2400 2410 2420 2430

PDSIVGSNKV ERIKQISVSL PALVGPYQDV QAMLSYGGST QLPKGCSALA

	i
480	490 |	500

460 I 470 -n—lGneKk RRIKrIaVtL PtLlGPYQDl eAtLvmGaea aLshGvndgg>

A ---AZXy AAAA---AAA AAAAAAAAAA AAyAyyAA.A _ A A _ A yA _

2440 2450 2460 2470

VSHGTNDSGQ FQLDFNDGKY LPFEGIALDD QGTLNLQFPN

510

520

530 rfvtdfndsr F-LpF-eGrd attgtleLn>

FIG. 4B

186 242 <Λ

Σ3

Ό η

to

α.

$

Ό

Ο.

ω

Ν w

ω c

to

C $

ο

Ο

0.

Xł* Et75

LO

LO

CKI.

e>

8- cc Xf

ΟΟ ο θ CJ *—I -r- CJ ΙΟ »— oj oo ζ <ί· σ» οο —_ κ> «ο ιο co χ ου οο σ> ο -·— oj OO xj- tO UO ΙΟ

FIG. 5

186 242

CJ o

c o

t©

o.

o

ir *

£ ω

y o

I— u:

o.

_i ω

_j <z>

>

UJ

0.

w o

σ

O <o u

łω «

o ł— £0 (0

O f— <

<0 o

H <

(0 o

H io •β

1)

T3

CO £

o •a o

•a &

o •o <u •o ω xn oo s s s

Η- Η H « jS c o IZ IZ 3 3

-o Ό υ w Ό -3 r r !ź ω

UJ μ_

E ω O z co ω

o -»

Ο ω z ω h

s^ł

< (0	_ Ό < £? cog-	< CO o	< CO o
o	o 8·		H
H	i O ‘ O.

s o

<

<0 a

H l·—

-Q

O

<

XI o

HCC

H

O

LL o

ω >

O σ

<

-g

FIG. 6A

186 242 ω

□ o

o _J

co υ

o tu

CD

O o

ł<

o o

H

UJ ω

_j

Σ ώ

.8 tu ł—

CC ω

_J

CL ω

H73 υ

4w

O

O <

Ό α

Ł— <

cc o

<

x>

o

H w

u.

Z

Z >

O <

T3 £

<D

o.

7Ξ3 φ O o. I— o

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

£ o

-o o

Ό £

O •o υ

Ό

UJ ω

y:

—I >

Q

ą.

UJ ić >

ω

UJ

FIG. 6B

Claims (14)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Polinukleotyd funkcjonalnie związany z heterologicznym promotorem, który koduje białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom, znamienny tym, że cząsteczka nukleotydowa kodująca to białko utrzymuje hybrydyzację z komplementarną sekwencją kwasu nukleinowego, po hybrydyzacji w 25°C, w 0,45 M chlorku sodu i 0,045 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu, i przemyciu, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmującej: SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:36 i SEQ ID NO:46.
2. 2. Polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że przemywanie prowadzone jest w 0,9 M chlorku sodu i 0,09 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu w 65°C.
3. 3. Polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że przemywanie prowadzone jest w 0,0375 M chlorku sodu i 0,00375 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,2% dodecylosiarczanie sodu w 68°C.
4. 4. Polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest zmodyfikowany tak, że zawiera kodon do ekspresji i produkcji białka w gospodarzu innym niż gospodarz naturalny.
5. 5. Polinukleotyd funkcjonalnie związany z heterologicznym promotorem, który koduje białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom, znamienny tym, że polinukleotyd ten utrzymuje hybrydyzację z komplementarną sekwencją kwasu nukleinowego po hybrydyzacji w 25°C, w 0,45 M chlorku sodu i 0,045 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu, i przemyciu, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmującej: SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:36 i SEQ ID NO:46.
6. 6. Polinukleotyd według zastrz. 5, znamienny tym, że przemywanie prowadzone jest w 0,9 M chlorku sodu i 0,09 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu w 65°C.
7. 7. Polinukleotyd według zastrz. 5, znamienny tym, że przemywanie prowadzone jest w 0,0375 M chlorku sodu i 0,00375 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,2% dodecylosiarczanie sodu w 68 °C.
8. 8. Polinukleotyd według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:37 i SEQ ID NO:47.
9. 9. Polinukleotyd kodujący białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom, znamienny tym, że koduje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:37 i SEQ ID NO:47 i jest funkcjonalnie połączony z heterologicznym promotorem.
10. 10. Komórka rośliny transgenicznej zawierająca polinukleotyd i/lub w której zachodzi ekspresja polinukleotydu funkcjonalnie związanego z heterologicznym promotorem, który koduje białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom, znamienna tym, że cząsteczka nukleotydowa kodująca to białko utrzymuje hybrydyzację z komplementarną sekwencją kwasu nukleinowego, po hybrydyzacji w 25°C, w 0,45 M chlorku sodu i 0,045 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu, i przemyciu, przy czym sekwencja kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmującej: SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:36 i SeQ ID NO:46.
11. 11. Zrekombinowane białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom, znamienne tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca to białko utrzymuje hybrydyzację z sekwencją kwasu nukleinowego po hybrydyzacji w 25°C, w 0,45 M chlorku sodu i 0,045 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu, i przemyciu, przy czym sekwencja

    186 242 kwasu nukleinowego jest wybrana z grupy obejmującej: SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:60, SEQ IDNO:36 i SEQ ID NO:46.
12. 12. Białko według zastrz. 11, znamienne tym, że przemywanie prowadzone jest w 0,9 M chlorku sodu i 0,09 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,1% dodecylosiarczanie sodu w 65°C.
13. 13. Białko według zastrz. 11, znamienne tym, że przemywanie prowadzone jest w 0,0375 M chlorku sodu i 0,00375 M cytrynianie sodu pH 7,0, i 0,2% dodecylosiarczanie sodu w 68°C.
14. 14. Zrekombinowane białko o aktywności toksycznej przeciwko szkodliwym owadom, znamienne tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:37 i SEQ ID NO:47.