ES2634230T3

ES2634230T3 - Péptido beta amiloide modificado

Info

Publication number: ES2634230T3
Application number: ES09820642.8T
Authority: ES
Inventors: Junichi Matsuda; Kazuyoshi Kaminaka; Chikateru Nozaki
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 2008-10-16
Filing date: 2009-10-16
Publication date: 2017-09-27
Anticipated expiration: 2029-10-16
Also published as: EP2348042A1; KR20110071117A; WO2010044464A1; EP2348042B1; JPWO2010044464A1; KR101640147B1; US8512709B2; EP2348042A4; CN102245629A; CN102245629B; US20110268756A1; JP5474807B2

Abstract

Un péptido seleccionado de (A) a (H) de los siguientes: (A) un péptido que consiste en (a) un péptido que consiste en la restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 10 del N- terminal de la SEQ ID NO:1 y (b) un péptido seleccionado de péptidos que consisten en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 36, N.º 28 a N.º 37, N.º 28 a N.º 38, N.º 28 a N.º 39, N.º 28 a N.º 40, N.º 28 a N.º 41, N.º 28 a N.º 42 del N-terminal de la SEQ ID NO:1, uniéndose entre sí el péptido (a) y el péptido (b), en donde la cisteína o un análogo de cisteína se une al C-terminal de la combinación resultante del péptido (a) y el péptido (b); (B) un péptido que consiste en (a) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 2 a N.º 10, N.º 2 a N.º 9, del N-terminal de la SEQ ID NO:1 y (b) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 del N-terminal de la SEQ ID NO:1, uniéndose entre sí el péptido (a) y el péptido (b), en donde la cisteína o un análogo de cisteína se une al C-terminal de la combinación resultante del péptido (a) y el péptido (b); (C) un péptido que consiste en (a) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 del N-terminal de la SEQ ID NO: 1 y (b) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 42 del N- terminal de la SEQ ID NO:1, uniéndose entre sí el péptido (a) y el péptido (b), en donde la cisteína o un análogo de cisteína se une al C-terminal de la combinación resultante del péptido (a) y el péptido (b); (D) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a 26 del N-terminal de la SEQ ID NO:1 en donde la cisteína o un análogo de cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 del N-terminal; (E) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 28 del N-terminal de la SEQ ID NO:1, en donde la cisteína o un análogo de cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 del N-terminal, y en donde la cisteína o el análogo de cisteína se une al C-terminal de dicho péptido; (F) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1 hasta el C-terminal al que se une la cisteína o un análogo de cisteína, al que se une un péptido adicional que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 del N-terminal de la SEQ ID NO:1; (G) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 28 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se une un análogo de cisteína; (H) un péptido que consiste en dos de un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 28 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se une una cisteína o un análogo de cisteína, uniéndose dichos dos péptidos entre sí mediante un enlace disulfuro entre dichas cisteínas o dichos análogos de cisteína.

Description

Péptido beta amiloide modificado

5 Campo técnico

La presente divulgación se refiere a un método para potenciar la capacidad de inducción de respuesta inmunitaria de un péptido β amiloide (en lo sucesivo en el presente documento denominado "Aβ", por el inglés, amyloid β). Más específicamente, la presente invención se refiere a un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de la enfermedad del Alzheimer que comprende un péptido derivado de Aβ, el agente causante de la enfermedad de Alzheimer, o una porción del mismo, en la que la cisteína o su análogo se añade o se inserta.

Antecedentes de la técnica

15 La enfermedad del Alzheimer es un tipo de demencia y se asocia con la disminución de la función cognitiva y cambios en la personalidad como síntomas principales. Con el progreso del envejecimiento de la población, el número de pacientes de enfermedad de Alzheimer sigue en aumento. Se espera que el número de pacientes en Japón, en los Estados Unidos y en Europa llegue a ser de 7,3 millones en 2014 desde los 5,6 millones en 2004. Por lo tanto, el desarrollo temprano de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer es realmente deseado.

Los signos patológicos de la enfermedad de Alzheimer incluyen tres aspectos de la atrofia y/o la disminución de neuronas, la formación de placas seniles debido a la agregación y/o deposición de Aβ y cambios neurofibrilares debido a las proteínas tau anómalas. La enfermedad de Alzheimer se clasifica en dos grupos principales, es decir, la 25 enfermedad de Alzheimer familiar y la enfermedad de Alzheimer esporádica. Para el primero, se ha identificado la mutación genética causante y se descubrió que su fenotipo elucida ese aumento en la producción de péptido β amiloide, especialmente Aβ1-42, que consiste en 42 restos de aminoácidos, en el cerebro es la causa principal de la enfermedad. Sin embargo, una proporción de pacientes diagnosticados de padecer la enfermedad de Alzheimer familiar en un sentido estricto es el 1 % o menos entre los pacientes totales. Es para el caso de la enfermedad de Alzheimer esporádica, que representa el 99 % de los pacientes, para el que se desea el esclarecimiento más inmediato de la causa de la enfermedad. Se cree que la enfermedad de Alzheimer esporádica se genera mediante la duplicación de factores de riesgo genético no identificados, la presencia de genes recesivos, la presencia de factores de riesgo ambiental, y similares. En la actualidad, basándose en el hecho de que las mutaciones genéticas en la enfermedad de Alzheimer familiar son comunes en el aumento final de Aβ42 altamente agregante, se cree que la

35 causa principal de la enfermedad de Alzheimer esporádica, como experimenta un desarrollo patológico similar al de la enfermedad de Alzheimer familiar, podría ser un aumento en Aβ42. Esta idea se llama hipótesis de mieloide y en la actualidad la investigación para el tratamiento está en progreso sobre la base de esta hipótesis.

Aβ se produce a partir de su proteína precursora mediante escisión con una aspartato proteasa unida a membrana. La β-secretasa escinde el N-terminal de Aβ mientras que las γ-secretasas escinde el C-terminal de la misma. Se puede segregar un Aβ escindido durante un tiempo fuera de las células dependiendo de la actividad sináptica. Aβ se autoagrega rápidamente, de manera que un monómero de Aβ, a través de un dímero, trímero y un oligómero soluble, forma protofibril, una estructura prefibrosa, que después forma y acumula fibra amiloide insoluble. En la actualidad ha llegado a ser la idea principal que los efectos negativos del oligómero Aβ soluble agregado en los

45 nervios juega un importante papel en las afecciones patológicas de la enfermedad del Alzheimer. Se han documentado varias formas de oligómero Aβ soluble que podrían bloquear la neurotransmisión, incluyendo un dímero, un trímero, un amiloesferoide (agregado de 53 kDa), Aβ56 (agregado de 56 kDa), agregados de hasta 40 aminoácidos de longitud, y similares.

En la actualidad, la estrategia para la terapia mediante eliminación de Aβ, que puede jugar un papel altamente importante en el mecanismo para el comienzo de la enfermedad de Alzheimer, se hace ampliamente, entre los que se encuentra un estudio de una terapia de anticuerpos con un anticuerpo para Aβ. Se cree que el mecanismo de acción de eliminación de Aβ mediante un anticuerpo anti-Aβ incluye la fagocitosis por microglía mediante un receptor Fc de un anticuerpo, la disolución acelerada o la agregación suprimida de Aβ fibroso y la unión del anticuerpo a Aβ

55 en sangre para acelerar la exclusión de la forma soluble de Aβ en el cerebro. Se han propuesto dos aproximaciones, es decir, la inmunidad activa donde se induce anticuerpos anti-Aβ mediante una vacuna e inmunidad pasiva en donde se administra un anticuerpo anti-Aβ per se.

Para la primera estrategia, la vacuna AN1792 con el uso de Aβ per se como antígeno procedió a un ensayo clínico de fase II, pero el ensayo se interrumpió puesto que el 6 % de los pacientes padecieron meningitis cerebroespinal durante el ensayo. Sin embargo, se observaron diferencias en la parte de la función de alto orden entre pacientes que tenían un título de anticuerpo aumentado y en pacientes que no lo tenían (referencia 1 no de la patente). Además, el cerebro del paciente fallecido durante el ensayo clínico se examinó para revelar que la placa senil desapareció en el neocórtex. Además, la IRM antes y después de la administración demostraron que el grupo de la 65 administración presentaba un menor volumen del cerebro que el del grupo del placebo. Como tal, aunque se interrumpió el ensayo clínico debido a los efectos secundarios adversos, también se demostró que era eficaz una

vacuna con el uso de Aβ per se como un antígeno. En el futuro, se desea el desarrollo de una vacuna más segura.

Se cree que la meningitis cerebroespinal se genera por AN1792 como consecuencia del uso de un adyuvante QS21 potente y la inmunidad celular inducida por un epítopo de linfocito T presente en una secuencia de Aβ per se. Se ha

5 realizado mucha investigación para un epítopo de linfocitos T presente en la secuencia de Aβ per se para revelar que, al menos en el N-terminal de la secuencia de Aβ de los restos 1-10, está presente un epítopo de linfocito T que podría inducir inmunidad humoral pero no está presente un epítopo de linfocito T que pueda inducir inmunidad celular (referencias 2-4 de la patente).

Referencia 1 no de la patente: Gilman S, Koller M, Black RS, Jenkins L, et al., NEUROLOGY, 2005; 64: p15531562 Referencia 2 no de la patente: Michael G, Agadjanyan MG, et al., Journal of Immunology, 2005; 174: p1580-1586 Referencia 3 no de la patente: Bard F, Barbour R, Cannon C, Carretto R, Fox M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100: p2023-2028

15 Referencia 4 no de la patente: Wanga CY. et al., Vaccine, 2007; 25: p3041-3052

Descripción de la invención

(Problema técnico a resolver por la invención)

Tal como se ha descrito anteriormente, existe una preocupación por los efectos secundarios adversos en una terapia de vacuna para la enfermedad del Alzheimer con una combinación de una secuencia de Aβ de longitud completa con un adyuvante potente tal como QS21. Por lo tanto, se desea el desarrollo de un método más seguro y eficaz para la profilaxis y el tratamiento con una combinación de un péptido de Aβ en una forma más segura con un

25 adyuvante más seguro. Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar un péptido para una terapia de vacuna más segura de la enfermedad de Alzheimer diseñando la forma de un péptido de Aβ.

(Medios para solucionar los problemas)

Los presentes inventores han investigado realmente un método para la inmunización y para potenciar la inmunización que es seguro para el organismo vivo, eficaz y que no es caro, y como resultado, han descubierto que una capacidad de inducción de una respuesta inmunitaria potenciada de un péptido de interés se puede potenciar mediante adición o inserción de un resto de cisteína, un aminoácido que constituye una proteína de origen natural, para mostrar, por tanto, que la propiedad de inducir una respuesta inmune potenciada frente a Aβ se puede obtener

35 añadiendo o insertando una molécula de cisteína a una porción de péptido Aβ sin usar una longitud completa de péptido Aβ (PCT/JP2008/057612). De acuerdo con la presente invención, la investigación adicional dio como resultado el descubrimiento de un método para la obtención de una respuesta inmunitaria potenciada para Aβ y nuevos péptidos de Aβ con adición de una molécula de cisteína de los que se espera que induzcan una respuesta inmunitaria celular reducida.

La presente divulgación se refiere a un método novedoso para potenciar una respuesta inmunitaria, más específicamente, un método para potenciar una respuesta inmunitaria caracterizada porque se añade o se inserta una molécula de cisteína en un péptido inmunogénico. La presente invención se refiere a los siguientes aspectos:

45 1. Un péptido seleccionado de (A) a (G) de los siguientes:

(A): un péptido que consiste en (a) un péptido que consiste en la restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 10 del Nterminal de la SEQ ID NO:1 y (b) un péptido seleccionado de péptidos que consisten en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 36, N.º 28 a N.º 37, N.º 28 a N.º 38, N.º 28 a N.º 39, N.º 28 a N.º 40, N.º 28 a N.º 41, N.º 28 a N.º 42 del N-terminal de la SEQ ID NO:1, uniéndose entre sí el péptido (a) y el péptido (b), en donde la cisteína o un análogo de cisteína se une al C-terminal de la combinación resultante del péptido (a) y el péptido (b);

(B): un péptido que consiste en (a) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 2 a N.º 10, N.º 2

55 a N.º 9, del N-terminal de la SEQ ID NO:1 y (b) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 del N-terminal de la SEQ ID NO:1, uniéndose entre sí el péptido (a) y el péptido (b), en donde la cisteína o un análogo de cisteína se une al C-terminal de la combinación resultante del péptido (a) y el péptido (b);

(C) un péptido que consiste en (a) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 del Nterminal de la SEQ ID NO: 1 y (b) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 42 del Nterminal de la SEQ ID NO:1, uniéndose entre sí el péptido (a) y el péptido (b), en donde la cisteína o un análogo de cisteína se une al C-terminal de la combinación resultante del péptido (a) y el péptido (b);

65 (D) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a 26 del N-terminal de la SEQ ID NO:1 en donde la cisteína o un análogo de cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 del N

terminal;

(E) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 28 del N-terminal de la SEQ ID NO:1, en

donde la cisteína o un análogo de cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 del N5 terminal, y en donde la cisteína o el análogo de cisteína se une al C-terminal de dicho péptido;

(F): un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1 hasta el C-terminal al que se une la cisteína o un análogo de cisteína, al que se une un péptido adicional que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 del N-terminal de la SEQ ID NO:1;

(G): un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 28 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se une un análogo de cisteína;

(H): un péptido que consiste en dos de un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 28

15 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se une una cisteína o un análogo de cisteína, uniéndose dichos dos péptidos entre sí mediante un enlace disulfuro entre dichas cisteínas o dichos análogos de cisteína,

en donde dicho péptido se caracteriza porque esta cisteína o análogo de cisteína se añade a o se inserta en una porción de un péptido β amiloide o una secuencia derivada de un péptido β amiloide.

2. El péptido del apartado 1, en donde dicho análogo de cisteína es homocisteína.

3. El péptido del apartado 1 o 2, en donde dicho péptido es un péptido seleccionado del grupo que consiste en lo 25 siguiente:

•: un péptido de una cualquiera de las SEQ ID NO:2 a la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 a la SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO: 19;

•: un péptido que consiste en dos péptidos, cada uno de los péptidos consiste en la SEQ ID NO:20 y se unen entre sí mediante un enlace disulfuro; y

•: un péptido que consiste en un péptido que consiste en la SEQ ID NO:20 y un péptido que consiste en la SEQ

ID NO:21, cada uno de los péptidos se unen entre sí mediante un enlace disulfuro. 35

4.: El péptido tal como se define en cualquiera de los apartados 1 a 3 para su uso en la mejora de la respuesta inmunitaria para β amiloide.

5.: Uso del péptido tal como se define en cualquiera de los apartados 1 a 3 para la preparación de un medicamento para la mejora de la respuesta inmunitaria para β amiloide.

6.: Un medicamento para su uso en la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer caracterizado porque el medicamento comprende como un principio activo el péptido que se expone en uno cualquiera de los apartados 1 a 3.

7.: Uso de un péptido tal como se define en cualquiera de los apartados 1 a 3 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

8.: Una vacuna de ADN eficaz para su uso en la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer caracterizada porque la vacuna comprende un fragmento de gen que codifica la secuencia de aminoácidos del péptido tal como se expone en uno cualquiera de los apartados 1 a 3.

9.: Uso de una vacuna de ADN que comprende un fragmento de gen que codifica para la secuencia de

aminoácidos del péptido tal como se define en uno cualquiera de los apartados 1 a 3 para la preparación de un 55 medicamento para la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

La presente divulgación también se refiere a un método para la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un mamífero que comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz del péptido de la presente invención a dicho mamífero, así como un método para la profilaxis y el tratamiento de enfermedad de Alzheimer en un mamífero que comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de un fragmento de gen que codifica la secuencia de aminoácidos del péptido de la presente invención a dicho mamífero.

La presente invención además se refiere al uso del péptido de la presente invención para la fabricación de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer así como al uso del fragmento de gen

65 que codifica para la secuencia de aminoácidos del péptido de la presente invención para la fabricación de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Efectos de la invención

La presente invención proporciona un péptido inmunogénico que induce una respuesta inmunitaria potenciada y suficiente para un péptido Aβ incluso si se usa solo sin un adyuvante. De acuerdo con la presente invención, solo

5 mediante la adición o inserción de una molécula de cisteína a una porción de un péptido Aβ o una secuencia derivada de un péptido Aβ, se puede potenciar la producción de anticuerpo de un péptido inmunogénico. Por lo tanto, no hay desventaja asociada con el uso de un adyuvante que permita el diseño más sencillo de una formulación de un fármaco.

El péptido inmunogénico de la presente invención que induce una respuesta inmunitaria potenciada para un péptido Aβ, cuando se administra al organismo vivo, puede inducir de manera rápida y abundante un anticuerpo específico para el péptido en sangre. No se conoce toxicidad de cisteína, sino que se sabe que la cisteína y sus sustancias relacionadas tienen un efecto antitóxico en el organismo vivo y por lo tanto el péptido inmunogénico de la presente invención que induce una respuesta inmune mejorada puede usarse en el organismo con mucha seguridad.

15 El péptido inmunogénico de la presente invención que induce una respuesta inmunitaria potenciada se puede preparar mediante un procedimiento no biológico mediante síntesis química y por tanto, en una mayor uniformidad que las vacunas convencionales del componente. Además, con el riesgo más bajo de toxicidad, de infección y de descenso en la calidad debido a la contaminación, se puede proporcionar una vacuna más segura.

Una preparación de péptido que comprende el péptido inmunogénico de la presente invención que induce una respuesta inmunitaria mejorada para un péptido Aβ se puede administrar no solo mediante inyección tal como administración subcutánea o intramuscular, sino también mediante administración oral, transnasal o transdérmica, que evitaría el estrés y los accidentes médicos producidos por la aguja de la jeringa.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra una estructura de péptidos Aβ de 28 restos de aminoácidos con adición de cisteína unida entre sí mediante un enlace disulfuro.

MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

De acuerdo con la presente invención, una molécula de cisteína o un derivado del mismo se puede añadir o insertar directamente al péptido o, como alternativa, se puede añadir o insertar una secuencia que expresa cisteína a la

35 secuencia de ADN o ARN. La posición de adición e inserción de cisteína no está especialmente limitada en la medida en que se puede obtener el efecto potenciador de la respuesta inmunitaria a un péptido Aβ. El número de una molécula de cisteína a insertar puede ser una o más. Cuando se insertan plurales de moléculas de cisteína, se pueden insertar bien de manera consecutiva o no consecutiva. La estructura más simple sería una porción de péptido Aβ, para cualquier N-terminal o C-terminal al que se une una cisteína.

El péptido de la presente invención eficaz para la profilaxis y el tratamiento de enfermedad de Alzheimer puede incluir un péptido que es una porción de, o que deriva de, péptido Aβ (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA: SEQ ID NO:1) que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 42, al que se añade la cisteína (Cys) o su análogo. Los ejemplos de tales péptidos incluyen

45 aquellos enumerados a continuación en el presente documento. Un análogo de cisteína, tal como se usa en el presente documento se refiere a un precursor y un metabolito de cisteína e incluye típicamente homocisteína.

(A) Un péptido que comprende (a) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 del Nterminal de la SEQ ID NO:1 o un péptido que consiste en una porción de los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 del N-terminal de la SEQ ID NO:1 y (b) un péptido que consiste en 9 o más restos de aminoácidos que incluyen los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 36 del N-terminal de la SEQ ID NO:1 con los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 42 del N-terminal de la SEQ ID NO:1, uniéndose entre sí el péptido (a) y el péptido (b), en donde la cisteína o un análogo de cisteína se une al C-terminal de la combinación resultante del péptido (a) y el péptido (b)

(1): Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 10 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, al C-terminal al que se une un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 42 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se añade la cisteína (1-10 · 28-42AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC (SEQ ID NO:2)

(2): Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 10 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, al C-terminal al que se une un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 41 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se añade la cisteína (1-10 · 28-41AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIC (SEQ ID NO:3)

(3): Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 10 desde el N-terminal de la SEQ ID

65 NO:1, al C-terminal al que se une un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 40 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se añade la cisteína (1-10 · 28-40AACys): N

terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVC (SEQ ID NO:4)

(4): Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 10 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, al C-terminal al que se une un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 39 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se añade la cisteína (1-10 · 28-39AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVC (SEQ ID NO:5)

(5): Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 10 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, al C-terminal al que se une un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 38 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se añade la cisteína (1-1028-38AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGC (SEQ ID NO:6)

(6): Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 10 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, al C-terminal al que se une un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se añade la cisteína (1-1028-37AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGC (SEQ ID NO:7)

(7): Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 10 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, al C-terminal al que se une un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 36 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se añade la cisteína (1-10 · 28-36AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVC (SEQ ID NO:8)

(8): Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 10 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:2, al C-terminal al que se une un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se añade la cisteína (2-10 · 28-37AACys): N-terminal-AEFRHDSGYKGAIIGLMVGC (SEQ ID NO:10)

(9): Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 9 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:2, al C-terminal al que se une un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se añade la cisteína (2-9 · 28-37AACys): N-terminal-AEFRHDSGKGAIIGLMVGC (SEQ ID NO:12)

(10): Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, al C-terminal al que se une un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 42 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se añade la cisteína (1-18 · 28-42AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGGVVIAC (SEQ ID NO:13)

(B): Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 26 o N.º 1 a N.º 27 del N-terminal de la SEQ ID NO:1 en donde la cisteína o un análogo de cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 del N-terminal

(1) Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 26 del N-terminal de la SEQ ID NO:1 (en lo sucesivo, en el presente documento, referido como "péptido Aβ de 26 aminoácidos") en donde la cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 del N-terminal (1-18Cys19-26AA): N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGS (SEQ ID NO:15)

(C): Un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 o un péptido que consiste en una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, en donde la cisteína o un análogo de cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 del N-terminal, y en donde la cisteína o el análogo de cisteína se une al C-terminal de dicho péptido

(1) Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 28 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1 (en lo sucesivo en el presente documento referido como "péptido Aβ de 28 aminoácidos"), en donde la cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 del N-terminal, y en donde la cisteína se une al C-terminal de dicho péptido (1-18Cys19-28AACys) N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNKC (SEQ ID NO:16)

(D): Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 del N-terminal de la SEQ ID NO:1 o un péptido que consiste en una porción de los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se une una cisteína o un análogo de cisteína, al que se une adicionalmente un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 42 del N-terminal de la SEQ ID NO:1 o un péptido que consiste en una porción de los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 42 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se une una cisteína o un análogo de cisteína

(1) Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se une una cisteína, al que se une adicionalmente un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 del N-terminal de la SEQ ID NO:1 (1-18Cys28-37AA) N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVG (SEQ ID NO:17)

(E): Un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 o un péptido que consiste en una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se une una cisteína o un análogo de cisteína

(1) Un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 28 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se une la homocisteína (28AA-homocisteína) N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKX (SEQ ID NO:19) (X: homocisteína)

5 (F) Un péptido que consiste en dos o más de un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 o un péptido que consiste en una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se une una cisteína o un análogo de cisteína;, en donde dichos dos o más péptidos están unidos entre sí mediante un enlace disulfuro entre dichas cisteínas o análogos de cisteína

(1): Péptido Aβ de 28 aminoácidos con adición de cisteína (28AAC) N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC (SEQ ID NO:20)

(2): Péptido Aβ de 28 aminoácidos con adición de dos cisteínas (28AACC) N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCC (SEQ ID NO:21)

15 Un péptido que consiste en 28AAC y 28AAC unidos entre sí mediante un enlace disulfuro (28AACdisulfuro28AAC), un péptido que consiste en 28AAC y 28AACC unidos entre sí mediante un enlace disulfuro (28AACdisulfuro28AACC), un péptido que consiste en 28AACC y 28AACC unidos entre sí mediante un enlace disulfuro (28AACCdisulfuro28AACC; que incluye uno con un enlace disulfuro formado entre cisteínas cada uno en el N-terminal, uno con un enlace disulfuro formado entre cisteínas cada uno en el C-terminal, uno con un enlace disulfuro formado entre cisteína en el N-terminal y cisteína en el C-terminal, uno con enlaces disulfuro cada uno formado entre cisteínas cada uno en el N-terminal y entre cisteínas cada uno en el C-terminal, y uno con enlaces disulfuro formados cada uno entre cisteína en el N-terminal y cisteína en el C-terminal), y un péptido que consiste en una pluralidad de 28AACC unidos entre sí mediante enlaces disulfuro (28AACC(28AAC)-producto de unión). La Fig. 1 muestra la estructura de estos péptidos.

25 Entre los péptidos Aβ con adición o inserción de cisteína tal como se describe anteriormente, un péptido que consiste en péptido Aβ con una porción de su secuencia de aminoácidos siendo eliminada con la adición de cisteína tal como 1-10 · 28-42AACys (SEQ ID NO:2), 1-10 · 28-41AACys (SEQ ID NO:3), 1-10 · 228-40AACys (SEQ ID NO:4), 1-10 · 28-3-39AACys (SEQ ID NO:5), 1-10 · 28-38AACys (SEQ ID NO:6), 1-10 · 28-37AACys (SEQ ID NO:7), 1-10 · 28-36AACys (SEQ ID NO:8), 2-10 · 28-37AACys (SEQ ID NO:10) y 1-18 · 28-42AACys (SEQ ID NO:13); un péptido que consiste en un péptido Aβ de 28 aminoácidos con adición o inserción de cisteína tal como 1-18Cys1928AACys (SEQ ID NO:16), 1-18Cys19-26AA (SEQ ID NO:15), 1-18Cys28-37AA (SEQ ID NO:17); un péptido que consiste en un péptido Aβ de 28 aminoácidos con adición de homocisteína tal como 28AA-homocisteína (SEQ ID NO:19); y 28AACdisulfuro28AAC y 28AACdisulfuro28AACC puede inducir una reacción inmunitaria particularmente

35 potenciada y por tanto, se puede usar de manera eficaz para la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

De acuerdo con la presente invención, un péptido que puede inducir una respuesta inmunitaria potenciada se puede preparar mediante la adición o inserción de cisteína o un análogo de cisteína a una porción de un péptido Aβ o una secuencia derivada de un péptido Aβ. Se puede corroborar si un péptido obtenido tras la adición o inserción de cisteína ejerce un efecto potenciador de respuesta inmunitaria mediante la inmunización de ratones con el péptido usando las técnicas convencionales y determinando un título de anticuerpo IgG anti-Aβ en sangre. Por lo tanto, la presente divulgación también proporciona un método para potenciar una respuesta inmunitaria caracterizado porque se usa un péptido obtenido mediante adición o inserción de cisteína o de un análogo de cisteína a una porción de un

45 péptido Aβ o una secuencia derivada de un péptido Aβ.

Se puede administrar una preparación de péptido que contiene el péptido con adición de cisteína obtenida por la presente invención mediante cualquier ruta de administración tal como subcutánea, transdérmica, intramuscular, oral, o transnasal. Lo más preferentemente, se puede administrar por vía subcutánea o intramuscular.

Mientras que el péptido inmunogénico con adición de cisteína de la presente invención puede proporcionar suficiente inmunización incluso si se administra solo sin un adyuvante, puede proporcionar suficiente inmunización adicional si se combina con un adyuvante. Un adyuvante que se puede usar en el presente documento incluye uno que puede activar preferentemente la inmunidad humoral pero puede no estimular la inmunidad celular, y típicamente una sal

55 de aluminio.

Además, un vector que comprende un fragmento de gen que codifica un péptido que induce una respuesta inmunitaria potenciada obtenida mediante adición o inserción de cisteína o un análogo de cisteína a una porción de un péptido Aβ o una secuencia derivada de un péptido Aβ se puede usar como una vacuna de ADN para prevenir eficazmente y tratar la enfermedad de Alzheimer. Una secuencia de nucleótidos que codifica cisteína incluye, por ejemplo, tgt pero puede ser cualquier secuencia en la medida en que codifique cisteína. Un fragmento de gen que codifica el péptido Aβ que consiste en los 42 restos de aminoácidos mencionados anteriormente se describe a continuación. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos descrita a continuación representa una secuencia de genes típica del péptido Aβ pero se puede emplear cualquier secuencia de genes siempre que codifique la misma

65 secuencia de aminoácidos. gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac

tcatggtggg cggtgttgtc atagcg (SEQ ID NO:22)

Un ejemplo de un fragmento de genes que codifican un péptido obtenido mediante adición o inserción de cisteína (Cys) a una porción de un péptido Aβ o a una secuencia derivada de un péptido Aβ incluye aquellos descritos a

5 continuación. Sin embargo, las secuencias de nucleótidos descritas a continuación representan una secuencia de genes típica que codifica cada uno de los péptidos mencionados anteriormente pero se puede emplear cualquier secuencia de genes siempre que codifique la misma secuencia de aminoácidos.

· Un fragmento de genes que codifica 1-10 · 28-42AACys gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtca tagcgtgt (SEQ ID NO:23) · Un fragmento de genes que codifica 1-10 · 28-41AACys gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtca tatgt (SEQ ID NO:24) · Un fragmento de genes que codifica 1-10 · 28-40AACys gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtct gt (SEQ ID NO:25)

15 · Un fragmento de genes que codifica 1-10 · 28-39AACys gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgtttgt (SEQ ID NO:26) · Un fragmento de genes que codifica 1-10 · 28-38AACys gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggttgt (SEQ ID NO:27) · Un fragmento de genes que codifica 1-10 · 28-37AACys gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc tgt (SEQ ID NO:28) · Un fragmento de genes que codifica 1-10 · 28-36ACys gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgtgt (SEQ ID NO:29) · Un fragmento de genes que codifica 2-10 · 28-37AACys gcagaattcc gacatgactc aggatataaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt (SEQ ID NO:31)

25 · Un fragmento de genes que codifica 2-9 · 28-37AACys gcagaattcc gacatgactc aggaaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt (SEQ ID NO:33) · Un fragmento de genes que codifica 1-18 · 28-42AACys gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcgtgt (SEQ ID NO:34) · Un fragmento de genes que codifica 1-18Cys19-26AA gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc a (SEQ ID NO:36) · Un fragmento de genes que codifica 1-18Cys19-28AACys gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc aaacaaatgt (SEQ ID NO:37)

35 · Un fragmento de genes que codifica 1-18Cys28-37AA gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggc (SEQ ID NO:38)

La presente invención se explica en más detalle por medio de los siguientes Ejemplos, pero no debería interpretare como limitante de la misma.

Ejemplo 1

Comparación de capacidad inductora de anticuerpos entre péptidos que consisten en los restos de aminoácidos N.º 45 1 a N.º 10 de péptido Aβ, al que se une cada uno de los diversos péptidos de C-terminal, al C-terminal al que se añade la cisteína

(1) Preparación de péptidos Aβ con adición de cisteína

•: péptido Aβ de aminoácidos 1-10+30-42 con adición de cisteína (1-10 · 30-42AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYAIIGLMVGGVVIAC (SEQ ID NO:40)

•: péptido Aβ de aminoácidos 1-10+29-42 con adición de cisteína (1-10 · 29-42AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYGAIIGLMVGGVVIAC (SEQ ID NO:41)

• péptido Aβ de aminoácidos 1-10+28-42 con adición de cisteína (1-10 · 28-42AACys): N-terminal55 DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC (SEQ ID NO:2)

• péptido Aβ de aminoácidos 1-10+28-42 (1-10 · 28-42AA): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO:42)

Los péptidos anteriores se sintetizaron (Sigma Aldrich, Japón) y se diluyeron con solución salina para obtener una solución madre de 5 mg/ml. A 100 μl de solución madre se le añadieron 900 μl de solución salina a 0,5 mg/ml de concentración y la mezcla se dispensó en un tubo de 1,5 ml (inmunógeno) y se almacenó a -80 °C o menos hasta su uso.

(2) Ratones inmunizados

65 Los ratones C57BL/6 machos (7 semanas de edad, SPF) se compraron de Japan Charles River Co., Ltd. y se

criaron en medio SPF.

(3) Grupos de inmunización

5 Los 16 ratones se dividieron en 4 grupos, cada uno comprendiendo 4 ratones: Grupo 1 administrado con 1-10 · 3042AACys; Grupo 2 administrado con 1-10 · 29-42AACys; Grupo 3 administrado con 1-10 · 28-42AACys y Grupo 4 administrado con 1-10 · 28-42AA.

(4) Inmunización y pautas

10 Cada 200 μl/ratón de un inmunógeno se administraron a los ratones usando una jeringa de 1 ml de tuberculina (Terumo, SS-01T2613S) por vía intradérmica o subcutánea en el abdomen (dosis por ratón: 100 μg). Los ratones se inmunizaron 3 veces en intervalos de 2 semanas.

15 (5) Muestreo de sangre

En el día 7 desde el final de la 3ª inmunización, se extrajo sangre desde la aorta abdominal de todos los ratones con anestesia con pentobarbital sódico (Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentilo). El muestreo de sangre se transfirió al Microtainer (Becton Dickinson Co., Ltd), la coagulación adecuada se produjo a temperatura ambiente y

20 después se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos. Cada uno de los sueros separados se dispensó en dos tubos de 0,5 ml y se almacenó a -80 °C hasta la medición.

(6) Medición de anticuerpo IgG anti-Aβ

25 El péptido Aβ (secuencia de aminoácidos 1-40: N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 43) sintetizado por Hokkaido System Science Co., Ltd.), diluido a 10 μg/ml con tampón carbonato 0,1 M, a pH 9,6, se añadió a tiras de 8 pocillos (nalge Nunc K.K., Immobilizer Amino) a 100 μl/pocillo y se dejó incubar a 4 °C durante toda la noche para la inmovilización. Al día siguiente, cada pocillo se lavó 3 veces con 300 μl de PBS que contiene Tween20 al 0,05 % (PBST), se añadió

30 con etanolamina 10 mM a 300 μl/pocillo y se dejó incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.

Tras 1 hora, la etanolamina 10 mM se retiró por completo y se añadió un espécimen diluido con PBST de 50 a 10000 veces a cada pocillo a 100 μl/pocillo. Tras la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora, el suero diluido añadido se descartó y cada pocillo se lavó 3 veces con 300 μl/pocillo de PBST. Tras el lavado, la solución de lavado 35 en el pocillo se retiró por completo, un anticuerpo de cabra IgG anti-ratón marcado con HRP (American Curlex, A131PS) diluido con la solución para la dilución del espécimen a 2000 veces se añadió a 100 μl/pocillo mediante reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción, la solución para dilución del anticuerpo marcado se descartó y se lavó cada pocillo dos veces con 300 μl/pocillo de PBST y dos veces con la cantidad equivalente de agua destilada, a la que se le añadieron 100 μl/pocillo de solución de sustrato cromogénico TMB+ (Dako Inc.)

40 seguido de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos a oscuras. Después, se añadieron 100 μl/pocillo de ácido sulfúrico 1 N para detener el desarrollo y se midió la densidad óptica a 450 nm (valor de DO450).

Se usó un anticuerpo monoclonal para Aβ disponible comercialmente (CHEMI-CON Corporation, MAB1560) como suero patrón. El suero patrón se diluyó con PBST a 0,156, 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 ng/ml para preparar

45 patrones para la medición de título de anticuerpo. Se determinó un anticuerpo IgG anti-Aβ de cada espécimen de suero murino midió de manera simultánea el valor de DO450 de cada espécimen diluido. Se calculó el título de anticuerpo IgG anti-Aβ de cada espécimen de suero murino usando la unidad de los patrones resultantes y la curva patrón del valor de DO450.

50 La Tabla 1 muestra el título de anticuerpo anti-Aβ del suero murino en cada uno de los grupos de inmunización. Tal como se muestra en la Tabla 1, la inducción de un anticuerpo para Aβ se observó en el grupo administrado con 1-10 · 28-42AACys y en el grupo administrado con 1-10 · 28-42AA. Asimismo, en comparación con la inmunización con fragmentos de péptido Aβ sin adición de cisteína (1-10 · 28-42AA), la inmunización con fragmentos de péptido Aβ con adición de cisteína (1-10 · 28-42AACys) proporcionó un mayor título de anticuerpo frente a Aβ.

55 Tabla 1

Título de anticuerpo (ng/ml)

Grupo

Promedi

Animal N.º 1 2 3 4

o

1-10 30-42AACys 9 7 11 8 8,4 1-1029-42AACys 16 16 87 11 32,6 1-1028-42AACys 46266 19854 40681 33 26708,6 1-1028-42AA 66 715 3559 13 1088,5

Ejemplo 2

Comparación de capacidad inductora de anticuerpos entre péptidos que consisten en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 10 de péptido Aβ, a los que se une cada una de las secuencias de restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 42, N.º 5 28 a N.º 41, N.º 28 a N.º 40, N.º 28 a N.º 39, N.º 28 a N.º 38, N.º 28 a N.º 37, N.º 28 a N.º 36, N.º 28 a N.º 35 y N.º 28 a N.º 34 de péptido Aβ al C-terminal al que se añade la cisteína

(1) Preparación de péptidos Aβ con adición de cisteína

•: péptido Aβ de aminoácidos 1-10+28-42 con adición de cisteína (1-10 · 28-42AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC (SEQ ID NO:2)

•: péptido Aβ de aminoácidos 1-10+28-41 con adición de cisteína (1-10 · 28-41AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIC (SEQ ID NO:3)

•: péptido Aβ de aminoácidos 1-10+28-40 con adición de cisteína (1-10 28-40AACys): N-terminal15 DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVC (SEQ ID NO:4)

•: péptido Aβ de aminoácidos 1-10+28-39 con adición de cisteína (1-10 · 28-39AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVC (SEQ ID NO:5)

•: péptido Aβ de aminoácidos 1-10+28-38 con adición de cisteína (1-10 · 28-38AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGC (SEQ ID NO:6)

•: péptido Aβ de aminoácidos 1-10+28-37 con adición de cisteína (1-10 · 28-37AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAAIIGLMVGC (SEQ ID NO:7)

•: péptido Aβ de aminoácidos 1-10+28-36 con adición de cisteína (1-10 · 28-36AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVC (SEQ ID NO:8)

•: péptido Aβ de aminoácidos 1-10+28-35 con adición de cisteína (1-10 · 28-35AACys): N-terminal25 DAEFRHDSGYKGAIIGLMC (SEQ ID NO:44)

• péptido Aβ de aminoácidos 1-10+28-34 con adición de cisteína (1-10 · 28-34AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYKGAIIGLC (SEQ ID NO:45)

(2) Ratones inmunizados

35 Los ratones C57BL/6 machos (7 semanas de edad, SPF) se compraron de Japan Charles River Co., Ltd. y se criaron en medio SPF.

(3) Grupos de inmunización

Los 36 ratones se dividieron en 9 grupos, cada uno comprendiendo 4 ratones: Grupo 1 administrado con 1-10 · 2842AACys, Grupo 2 administrado con 1-10 · 28-41AACys, Grupo 3 administrado con 1-10 · 28-40AACys, Grupo 4 administrado con 1-10 · 28-39AACys, Grupo 5 administrado con 1-10 28-38AACys, Grupo 6 administrado con 1-10 · 28-37AACys, Grupo 7 administrado con 1-10 · 28-36AACys, Grupo 8 administrado con 1-10 · 28-35AACys y Grupo 9

45 administrado con 1-10 · 28-34AACys.

(4): Inmunización y pautas

Cada 200 μl/ratón de un inmunógeno se administraron a los ratones usando una jeringa de 1 ml de tuberculina (Terumo, SS-01T2613S) por vía intradérmica o subcutánea en el abdomen (dosis por ratón: 100 μg). Los ratones se inmunizaron 3 veces en intervalos de 2 semanas.

(5): Muestreo de sangre

55 En el día 7 desde el final de la 3ª inmunización, se extrajo sangre desde la aorta abdominal de todos los ratones con anestesia con pentobarbital sódico (Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentilo). El muestreo de sangre se transfirió al Microtainer (Becton Dickinson Co., Ltd), la coagulación adecuada se produjo a temperatura ambiente y después se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos. Cada uno de los sueros separados se dispensó en dos tubos de 0,5 ml y se almacenó a -80 °C hasta la medición.

(6) Medición de anticuerpo IgG anti-Aβ

La medición de anticuerpo IgG anti-Aβ se realizó tal como se describe anteriormente. La Tabla 2 muestra el título de anticuerpo anti-Aβ del suero murino en cada uno de los grupos de inmunización. Tal como se muestra en la Tabla 2,

65 la inducción de un anticuerpo para Aβ se observó en 1-10 · 28-42AACys, 1-10 · 28-41AACys, 1-10 · 28-40AACys, 110 · 28-39AACys, 1-10 · 28-38AACys, 1-10 · 28-37AACys y 1-10 · 28-36AACys.

Tabla 2

Título de anticuerpo (ng/ml)

Grupo

Animal N.º 1 2 3 4 Promedio

1-1028-42AACys 32 30482 33623 2072 16552,3 1-1028-41AACys 292 1000 48460 422012 117941,1 1-1028-40AACys 4560 148622 5118 4988 40822,0 1-1028-39AACys 139361 10808 13326 230453 98487,0 1-1028-38AACys 19149 34270 108780 61824 56005,8 1-1028-37AACys 79708 1531 24694 100619 51638,0 1-1028-36AACys 11821 259763 77 44922 79145,6 1-1028-35AACys 44 19 8361 220 2161,0 1-1028-34AACys 29 30 26 25 27,4

Ejemplo 3

5 Comparación de capacidad inductora de anticuerpos entre péptidos que consisten en cada uno de los diversos péptidos de N-terminal de péptido Aβ, a los que se unen los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 de péptido Aβ, al C-terminal al que se añade la cisteína

(1) Preparación de péptidos Aβ con adición de cisteína

10 · péptido Aβ de aminoácidos 1-9+28-37 con adición de cisteína (1-9 · 28-37AACys): N-terminal-DAEFRHDSGKGAIIGLMVGC (SEQ ID NO:9) · péptido Aβ de aminoácidos 1-8+28-37 con adición de cisteína (1-8 · 28-37AACys): N-terminal-DAEFRHDSKGAIIGLMVGC (SEQ ID NO:46)

15 · péptido Aβ de aminoácidos 1-7+28-37 con adición de cisteína (1-7 · 28-37AACys): N-terminal-DAEFRHDKGAIIGLM-VGC (SEQ ID NO:47)

Los péptidos anteriores se sintetizaron (Sigma Aldrich, Japón) y se diluyeron con solución salina para obtener una solución madre de 5 mg/ml. A 100 μl de solución madre se le añadieron 900 μl de solución salina a 0,5 mg/ml de 20 concentración y la mezcla se dispensó en un tubo de 1,5 ml (inmunógeno) y se almacenó a -80 °C o menos hasta su uso.

(2) Ratones inmunizados

25 Los ratones C57BL/6 machos (7 semanas de edad, SPF) se compraron de Japan Charles River Co., Ltd. y se criaron en medio SPF.

(3) Grupos de inmunización

30 Los 12 ratones se dividieron en 3 grupos, cada uno comprendiendo 4 ratones: Grupo 1 administrado con 1-9 · 2837AACys, Grupo 2 administrado con 1-8 · 28-37AACys y Grupo 3 administrado con 1-7 · 28-37AACys.

(4) Inmunización y pautas

35 Cada 200 μl/ratón de un inmunógeno se administraron a los ratones usando una jeringa de 1 ml de tuberculina (Terumo, SS-01T2613S) por vía intradérmica o subcutánea en el abdomen (dosis por ratón: 100 μg). Los ratones se inmunizaron 3 veces en intervalos de 2 semanas.

(5) Muestreo de sangre

40 En el día 7 desde el final de la 3ª inmunización, se extrajo sangre desde la aorta abdominal de todos los ratones con anestesia con pentobarbital sódico (Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentilo). El muestreo de sangre se transfirió al Microtainer (Becton Dickinson Co., Ltd), la coagulación adecuada se produjo a temperatura ambiente y después se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos. Cada uno de los sueros separados se dispensó en dos tubos

45 de 0,5 ml y se almacenó a -80 °C hasta la medición.

(6) Medición de anticuerpo IgG anti-Aβ

La medición de anticuerpo IgG anti-Aβ se realizó tal como se describe anteriormente. La Tabla 3 muestra el título de 50 anticuerpo anti-Aβ del suero murino en cada uno de los grupos de inmunización. Tal como se muestra en la Tabla 3,

la inducción de un anticuerpo para Aβ se observó en el péptido 1-928-37AACys. Tabla 3

Título de anticuerpo (ng/ml)

Grupo

Animal N.º 1 2 3 4 Promedio

1-928-37AACys 398 249 2772 8899 3079,5 1-828-37AACys 16 16 43 31 26,4 1-728-37AACys 26 27 34 15 25,6

5 Ejemplo 4

Comparación de capacidad inductora de anticuerpos entre péptidos que consisten en los restos de aminoácidos N.º 2 a N.º 10 o N.º 3 a N.º 10 o N.º 4 a N.º 10 de péptido Aβ, a los que se unen los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 de péptido Aβ, al C-terminal al que se añade la cisteína

(1) Preparación de péptidos Aβ con adición de cisteína

· péptido Aβ de aminoácidos 2-10+28-37 con adición de cisteína (2-10 · 28-37AACys): N-terminal-AEFRHDSGYKGAIIGLMVGC (SEQ ID NO:10)

15 · péptido Aβ de aminoácidos 3-10+28-37 con adición de cisteína (3-10 · 28-37AACys): N-terminal-EFRHDSGYKGAIIGLMVGC (SEQ ID NO:11) · péptido Aβ de aminoácidos 4-10+28-37 con adición de cisteína (4-10 · 28-37AACys): N-terminal-FRHDSGYKGAIIGLMVGC (SEQ ID NO:48) · péptido Aβ de aminoácidos 2-9+28-37 con adición de cisteína (2-9 · 228-37AACys): N-terminal

20 AEFRHDSGKGAIIGLMVGC (SEQ ID NO:12)

Los péptidos anteriores se sintetizaron (Sigma Aldrich, Japón) y se diluyeron con solución salina para obtener una solución madre de 5 mg/ml. A 100 μl de solución madre se le añadieron 900 μl de solución salina a 0,5 mg/ml de concentración y la mezcla se dispensó en un tubo de 1,5 ml (inmunógeno) y se almacenó a -80 °C o menos hasta su

25 uso.

(2) Ratones inmunizados

Los ratones C57BL/6 machos (7 semanas de edad, SPF) se compraron de Japan Charles River Co., Ltd. y se 30 criaron en medio SPF.

(3) Grupos de inmunización

Los 16 ratones se dividieron en 4 grupos, cada uno comprendiendo 4 ratones: Grupo 1 administrado con 2-10 · 2835 37AACys, Grupo 2 administrado con 3-10 · 28-37AACys, Grupo 3 administrado con 4-10 · 28-37AACys y Grupo 4 administrado con 2-9 · 28-37AACys.

(4) Inmunización y pautas

40 Cada 200 μl/ratón de un inmunógeno se administraron a los ratones usando una jeringa de 1 ml de tuberculina (Terumo, SS-01T2613S) por vía intradérmica o subcutánea en el abdomen (dosis por ratón: 100 μg). Los ratones se inmunizaron 3 veces en intervalos de 2 semanas.

(5) Muestreo de sangre

45 En el día 7 desde el final de la 3ª inmunización, se extrajo sangre desde la aorta abdominal de todos los ratones con anestesia con pentobarbital sódico (Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentilo). El muestreo de sangre se transfirió al Microtainer (Becton Dickinson Co., Ltd), la coagulación adecuada se produjo a temperatura ambiente y después se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos. Cada uno de los sueros separados se dispensó en dos tubos

50 de 0,5 ml y se almacenó a -80 °C hasta la medición.

(6) Medición de anticuerpo IgG anti-Aβ

La medición de anticuerpo IgG anti-Aβ se realizó tal como se describe anteriormente. La Tabla 4 muestra el título de

55 anticuerpo anti-Aβ del suero murino en cada uno de los grupos de inmunización. Tal como se muestra en la Tabla 4, la inducción de un anticuerpo para Aβ se observó en los péptidos 2-10 · 28-37AACys, 3-10 · 28-37AACys y 2-9 · 2837AACys.

Tabla 4

Título de anticuerpo (ng/ml)

Grupo

Animal N.º 1 2 3 4 Promedio

2-1028-37AACys 72890 57573 6094 42593 44787,5 3-1028-37AACys 3203 1456 4500 52 2302,8 4-1028-37AACys 24 31 53 27 33,8 2-9 28-37AACys 7038 29489 16 17 9139,9

Ejemplo 5

5 Comparación de capacidad inductora de anticuerpos entre péptidos que consisten en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 10, a los que se unen los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 42 de péptido Aβ, al C-terminal al que se añade la cisteína, y péptidos que consisten en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18, a los que se unen los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 42 de péptido Aβ, al C-terminal al que se añade la cisteína

10 (1) Preparación de péptidos Aβ con adición de cisteína

• péptido Aβ de aminoácidos 1-18+28-42 con adición de cisteína (1-18 · 28-42AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGGVVIAC (SEQ ID NO: 13)

• péptido Aβ de aminoácidos 1-10+28-42 con adición de cisteína (1-10 · 28-42AACys): N-terminal15 DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC (SEQ ID NO:2)

20 uso.

(2) Ratones inmunizados

Los ratones C57BL/6 machos (7 semanas de edad, SPF) se compraron de Japan Charles River Co., Ltd. y se 25 criaron en medio SPF.

(3) Grupos de inmunización

Los 8 ratones se dividieron en 2 grupos, cada uno comprendiendo 4 ratones: Grupo 1 administrado con 1-18 · 2830 42AACys y Grupo 2 administrado con 1-10 · 28-42AACys.

(4) Inmunización y pautas

Cada 200 μl/ratón de un inmunógeno se administraron a los ratones usando una jeringa de 1 ml de tuberculina

35 (Terumo, SS-01T2613S) por vía intradérmica o subcutánea en el abdomen (dosis por ratón: 100 μg). Los ratones se inmunizaron 3 veces en intervalos de 2 semanas.

(5) Muestreo de sangre

40 En el día 7 desde el final de la 3ª inmunización, se extrajo sangre desde la aorta abdominal de todos los ratones con anestesia con pentobarbital sódico (Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentilo). El muestreo de sangre se transfirió al Microtainer (Becton Dickinson Co., Ltd), la coagulación adecuada se produjo a temperatura ambiente y después se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos. Cada uno de los sueros separados se dispensó en dos tubos de 0,5 ml y se almacenó a -80 °C hasta la medición.

(6) Medición de anticuerpo IgG anti-Aβ

La medición de anticuerpo IgG anti-Aβ se realizó tal como se describe anteriormente. La Tabla 5 muestra el título de anticuerpo anti-Aβ del suero murino en cada uno de los grupos de inmunización. Tal como se muestra en la Tabla 5,

50 la inducción similar de un anticuerpo para Aβ se observó tanto en el grupo administrado con 1-18 · 28-42AACys como en el grupo administrado con 1-10 · 28-42AA.

Tabla 5

Título de anticuerpo (ng/ml)

Grupo

Animal N.º 1 2 3 4 Promedio

1-18·26-42AACys 69336 41211 51611 7004 42290,5 1-10·28-42AACys 886,2 463379 414,8 3314 116998,5

Ejemplo 6

5 Comparación de capacidad inductora de anticuerpos entre péptidos que consisten en péptido Aβ en donde se inserta la cisteína entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 de péptido Aβ y dicho péptido, al C-terminal al que se une la cisteína

• un péptido que consiste en péptido Aβ de 28 aminoácidos en donde la cisteína se inserta entre los restos de

10 aminoácidos N.º 18 y 19 del péptido Aβ (1-18Cys19-28AA): N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNK (SEQ ID NO:49)

• un péptido que consiste en péptido Aβ de 28 aminoácidos en donde la cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 del péptido Aβ, hasta el C-terminal al que se añade la cisteína (1-18Cys19-28AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNKC (SEQ ID NO:1.6)

15 Los péptidos anteriores se sintetizaron (Sigma Aldrich, Japón) y se diluyeron con solución salina para obtener una solución madre de 5 mg/ml. A 100 μl de solución madre se le añadieron 900 μl de solución salina a 0,5 mg/ml de concentración y la mezcla se dispensó en un tubo de 1,5 ml (inmunógeno) y se almacenó a -80 °C o menos hasta su uso.

(2) Ratones inmunizados

Los ratones C57BL/6 machos (7 semanas de edad, SPF) se compraron de Japan Charles River Co., Ltd. y se criaron en medio SPF.

(3) Grupos de inmunización

Los 8 ratones se dividieron en 2 grupos, cada uno comprendiendo 4 ratones: Grupo 1 administrado con 1-18Cys1928AA y Grupo 2 administrado con 1-18Cys19-28AACys.

(4) Inmunización y pautas

Cada 200 μl/ratón de un inmunógeno se administraron a los ratones usando una jeringa de 1 ml de tuberculina (Terumo, SS-01T2613S) por vía intradérmica o subcutánea en el abdomen (dosis por ratón: 100 μg). Los ratones se

35 inmunizaron 3 veces en intervalos de 2 semanas.

(5) Muestreo de sangre

En el día 7 desde el final de la 3ª inmunización, se extrajo sangre desde la aorta abdominal de todos los ratones con

40 anestesia con pentobarbital sódico (Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentilo). El muestreo de sangre se transfirió al Microtainer (Becton Dickinson Co., Ltd), la coagulación adecuada se produjo a temperatura ambiente y después se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos. Cada uno de los sueros separados se dispensó en dos tubos de 0,5 ml y se almacenó a -80 °C hasta la medición.

45 (6) Medición de anticuerpo IgG anti-Aβ

La medición de anticuerpo IgG anti-Aβ se realizó tal como se describe anteriormente. La Tabla 6 muestra el título de anticuerpo anti-Aβ del suero murino en cada uno de los grupos de inmunización. Tal como se muestra en la Tabla 6, la inducción similar de un anticuerpo para Aβ se observó tanto en el grupo administrado con 1-18Cys19-28AA como

50 en el grupo administrado con 1-18Cys19-28AACys.

Tabla 6

Título de anticuerpo (ng/ml)

Grupo

Animal N.º 1 2 3 4 Promedio

1-18Cys19-28AA 448154 97146 233411 57794 209126,3 1-18Cys19-28AACys 119908 361259 4161 29412 103685,0

Ejemplo 7

Evaluación de la inducción de anticuerpos en péptido Aβ de 25 aminoácidos, péptido Aβ de 26 aminoácidos y péptido Aβ de 27 aminoácidos, en donde la cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 de dichos 5 péptidos Aβ

(1) Preparación de péptidos Aβ con adición de cisteína

· péptido Aβ de 27 aminoácidos en donde la cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 (1

10 18Cys19-27AA): N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSN (SEQ ID NO:14) · péptido Aβ de 26 aminoácidos en donde la cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 (118Cys19-26AA): N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGS (SEQ ID NO:15) · péptido Aβ de 25 aminoácidos en donde la cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 (118Cys19-25AA): N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVG (SEQ ID NO:50)

(2) Ratones inmunizados

Los ratones C57BL/6 machos (7 semanas de edad, SPF) se compraron de Japan Charles River Co., Ltd. y se criaron en medio SPF. 25

(3) Grupos de inmunización

Los 12 ratones se dividieron en 3 grupos, cada uno comprendiendo 4 ratones: Grupo 1 administrado con 1-18Cys1927AA, Grupo 2 administrado con 1-18Cys19-26AA y Grupo 3 administrado con 1-18Cys19-25AA. 30

(4) Inmunización y pautas

Cada 200 μl/ratón de un inmunógeno se administraron a los ratones usando una jeringa de 1 ml de tuberculina (Terumo, SS-01T2613S) por vía intradérmica o subcutánea en el abdomen (dosis por ratón: 100 μg). Los ratones se 35 inmunizaron 3 veces en intervalos de 2 semanas.

(5) Muestreo de sangre

45 (6) Medición de anticuerpo IgG anti-Aβ

La medición de anticuerpo IgG anti-Aβ se realizó tal como se describe anteriormente. La Tabla 7 muestra el título de anticuerpo anti-Aβ del suero murino en cada uno de los grupos de inmunización. Tal como se muestra en la Tabla 7, la inducción de un anticuerpo para Aβ se observó tanto en el grupo administrado con 1-18Cys19-27AA como en el

50 grupo administrado con 1-18Cys19-26AA. En el grupo administrado con 1-18Cys19-25AA, la inducción de un anticuerpo para Aβ se observó en uno de cuatro casos.

Tabla 7

Título de anticuerpo (ng/ml)

Grupo

Animal N.º 1 2 3 4 Promedio

1-18Cys19-27AA 2482 3125 2631 17,2 2063,8 1-18Cys19-26AA 127,5 7001 15779 164 5767,9 1-18Cys19-25AA 1,5 6,6 71,4 1398 369,4

55 Ejemplo 8 Evaluación de inducción de anticuerpos en péptidos que consisten en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 de péptido Aβ, a los que se unen los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 de péptido Aβ, con adición de cisteína

(1) Preparación de péptidos Aβ con adición de cisteína

· un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 de péptido Aβ, hasta el C-terminal al que se une una cisteína, al que se une adicionalmente una secuencia que consiste en los restos de aminoácidos N.º

5 28 a N.º 37 de un péptido Aβ (1-18Cys28-37AA): N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVG (SEQ ID NO:17) · un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 de péptido Aβ, hasta el C-terminal al que se une una cisteína, al que se une adicionalmente una secuencia que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 de un péptido Aβ, al C-terminal al que se une la cisteína (1-18Cys28-37AACys): N-terminal

10 DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVGC (SEQ ID NO:18) · un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 de péptido Aβ, al que se une adicionalmente una secuencia que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 de un péptido Aβ, al Cterminal al que se une la cisteína (1-18 · 28-37AACys): N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGANGLMVGC (SEQ ID NO:51)

15 · un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 de péptido Aβ, al que se une adicionalmente una secuencia que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 de un péptido Aβ (1-18 · 28-37AA): N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVG (SEQ ID NO:52)

Los péptidos anteriores se sintetizaron (Sigma Aldrich, Japón) y se diluyeron con solución salina para obtener una

20 solución madre de 5 mg/ml. A 100 μl de solución madre se le añadieron 900 μl de solución salina a 0,5 mg/ml de concentración y la mezcla se dispensó en un tubo de 1,5 ml (inmunógeno) y se almacenó a -80 °C o menos hasta su uso.

(2) Ratones inmunizados

(3) Grupos de inmunización

30 Los 16 ratones se dividieron en 4 grupos, cada uno comprendiendo 4 ratones: Grupo 1 administrado con 1-18Cys2837AA, Grupo 2 administrado con 1-18Cys28-37AACys, Grupo 3 administrado con 1-18 · 28-37AACys y Grupo 4 administrado con 1-18 · 28-37AA.

35 (4) Inmunización y pautas

(5) Muestreo de sangre

En el día 7 desde el final de la 3ª inmunización, se extrajo sangre desde la aorta abdominal de todos los ratones con anestesia con pentobarbital sódico (Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentilo). El muestreo de sangre se

45 transfirió al Microtainer (Becton Dickinson Co., Ltd), la coagulación adecuada se produjo a temperatura ambiente y después se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos. Cada uno de los sueros separados se dispensó en dos tubos de 0,5 ml y se almacenó a -80 °C hasta la medición.

(6) Medición de anticuerpo IgG anti-Aβ

50 La medición de anticuerpo IgG anti-Aβ se realizó tal como se describe anteriormente. La Tabla 8 muestra el título de anticuerpo anti-Aβ del suero murino en cada uno de los grupos de inmunización. Tal como se muestra en la Tabla 8, la inducción de un anticuerpo para Aβ se observó tanto en el grupo administrado con 1-18Cys28-37AA como en el grupo administrado con 1-18Cys28-37AACys.

55 Tabla 8

Título de anticuerpo (ng/ml)

Grupo

Animal N.º 1 2 3 4 Promedio

1-18Cys28-37AA 12541 1964 599 25102 10051,5 1-18Cys28-37AACys 1073 43 10 4864 1497,5 1-18·28-37AACys 11 9 10 13 10,75 1-18·28-37AA 11 11 11 9 10,5

Ejemplo 9

Evaluación de inducción de anticuerpos en péptidos que consisten en péptido Aβ de 28 aminoácidos con adición de homocisteína, un precursor de cisteína, y glutatión, un metabolito de cisteína 5

(1) Preparación de péptidos Aβ con adición de precursor o metabolito de cisteína

· un péptido que consiste en un péptido Aβ de 28 aminoácidos con adición de homocisteína (28AAhomocisteína): N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-Homocisteína (SEQ ID NO:19) · un péptido que consiste en un péptido Aβ de 28 aminoácidos con adición de glutatión (28AA-glutatión): Nterminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-Glutatión (SEQ ID NO:53)

Los péptidos anteriores se sintetizaron (Sigma Aldrich, Japón) y se diluyeron con solución salina para obtener una solución madre de 5 mg/ml. A 100 μl de solución madre se le añadieron 900 μl de solución salina a 0,5 mg/ml de 15 concentración y la mezcla se dispensó en un tubo de 1,5 ml (inmunógeno) y se almacenó a -80 °C o menos hasta su uso.

(2): Ratones inmunizados

(3): Grupos de inmunización

25 Los 8 ratones se dividieron en 2 grupos, cada uno comprendiendo 4 ratones: Grupo 1 administrado con 28AAhomocisteína y Grupo 2 administrado con 28AA-glutatión.

(4): Inmunización y pautas

(5): Muestreo de sangre

35 En el día 7 desde el final de la 3ª inmunización, se extrajo sangre desde la aorta abdominal de todos los ratones con anestesia con pentobarbital sódico (Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentilo). El muestreo de sangre se transfirió al Microtainer (Becton Dickinson Co., Ltd), la coagulación adecuada se produjo a temperatura ambiente y después se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos. Cada uno de los sueros separados se dispensó en dos tubos de 0,5 ml y se almacenó a -80 °C hasta la medición.

(6) Medición de anticuerpo IgG anti-Aβ

La medición de anticuerpo IgG anti-Aβ se realizó tal como se describe anteriormente. La Tabla 9 muestra el título de 45 anticuerpo anti-Aβ del suero murino en cada uno de los grupos de inmunización. Tal como se muestra en la Tabla 9, la inducción de un anticuerpo para Aβ se observó en el grupo administrado con 28AA-homocisteína.

Tabla 9

Título de anticuerpo (ng/ml)

Grupo

Animal N.º 1 2 3 4 Promedio

28AA-Homocisteína 178 10525 4975 35154 12708 28AA-Glutatión 150 134 133 146 141

Ejemplo 10

Evaluación de inducción de anticuerpos en péptidos que consisten en péptido Aβ de 28 aminoácidos con adición de cisteína que forma enlace disulfuro

55 (1) Preparación de péptidos Aβ con adición de cisteína

· un péptido que consiste en un péptido Aβ de 28 aminoácidos con adición de cisteína (28AAC): N-terminal- DAEFRHDS-GYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-C (SEQ ID NO:20) · un péptido que consiste en un péptido Aβ de 28 aminoácidos con adición de dos cisteínas (28AACC): N- terminal-DAEFRH-DSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-CC (SEQ ID NO:21)

(2) Preparación de péptidos que consisten en péptido Aβ de 28 aminoácidos con adición de cisteína que forma enlace disulfuro

Se preparó un péptido que consiste en 28AAC y 28AAC unidos entre sí mediante enlace disulfuro

5 (28AACdisulfuro28AAC) y un péptido que consiste en 28AAC y 28AACC unidos entre sí mediante enlace disulfuro (28AACdisulfuro28AACC). Los péptidos obtenidos tenían la estructura en la que los dos péptidos están unidos entre sí con cisteínas en el C-terminal mediante enlace disulfuro, o las estructuras en las que un dímero que comprende N-terminal-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-CC se somete adicionalmente a enlaces disulfuro para formar un trímero y un polímero (Fig. 1).

(2) Ratones inmunizados

(3) Grupos de inmunización

Los 8 ratones se dividieron en 2 grupos, cada uno comprendiendo 4 ratones: Grupo 1 administrado con 28AACdisulfuro28AAC y Grupo 2 administrado con 228AACdisulfuro28AACC.

(4) Inmunización y pautas

25 inmunizaron 3 veces en intervalos de 2 semanas.

(5) Muestreo de sangre

30 anestesia con pentobarbital sódico (Kyoritsu Seiyaku Corporation, Somnopentilo). El muestreo de sangre se transfirió al Microtainer (Becton Dickinson Co., Ltd), la coagulación adecuada se produjo a temperatura ambiente y después se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos. Cada uno de los sueros separados se dispensó en dos tubos de 0,5 ml y se almacenó a -80 °C hasta la medición.

35 (6) Medición de anticuerpo IgG anti-Aβ

La medición de anticuerpo IgG anti-Aβ se realizó tal como se describe anteriormente. La Tabla 10 muestra el título de anticuerpo anti-Aβ del suero murino en cada uno de los grupos de inmunización. Tal como se muestra en la Tabla 10, para los péptidos que consisten en péptido Aβ de 28 aminoácidos con adición de cisteína que forma enlace

40 disulfuro, la inducción de un anticuerpo para Aβ se observó tanto en el grupo administrado con 28AACdisulfuro28AAC como para el grupo administrado con 228AACdisulfuro28AAC.

Tabla 10

Título de anticuerpo (ng/ml)

Grupo

Animal N.º 1 2 3 4 Promedio

28AAC disulfuro 28 AAC 244 2 428 770668 6683 195005,7 28AAC disulfuro 28AACC 2110 136610 49129 1058945 311688,6

45 Aplicabilidad industrial

Un método para potenciar una respuesta inmunitaria caracterizada porque un péptido obtenido mediante adición o inserción de cisteína o un análogo de cisteína a un péptido Aβ o a una secuencia derivada de un péptido Aβ se usa de acuerdo con la presente divulgación se espera usar para un medio seguro y sencillo para potenciar una respuesta

50 inmunitaria en una vacuna de péptido o una vacuna de ADN enfocada a la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute 5 <120> Péptidos beta amiloides modificados

<130> T1645 EP S3

<140> EP 09 82 0642.8 10 <141>

<150> JP 2008-267992

<151> 15 <160> 53

<170> PatentIn versión 3.4

<210> 1 20

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25 <400> 1

<210> 2 30 <211> 26

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 35 <221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 2

<210> 3

<211> 25

<212> PRT 45 <213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado” 50

<400> 3

<210> 4

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial 5

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

10 <400> 4

<210> 5 15 <211> 23

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 20 <221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 5

<210>6

<211> 22

<212> PRT 30 <213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado” 35

<400> 6

40 <210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

45 <220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 7 50

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial 5

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

10 <400> 8

<210>9 15 <211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 20 <221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 9

<210> 10

<211> 20

<212> PRT 30 <213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 10

40 <210> 11

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

45 <220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial 5

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

10 <400> 12

<210> 13 15 <211> 34

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 20 <221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 13

<210> 14

<211> 28

<212> PRT 30 <213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 14

40 <210> 15

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial

45 <220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<210> 16

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 17

<210> 18

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 18

<210> 19

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial

45 <220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<220>

<221> misc_feature

<222> (29) .. (29)

<223> Xaa es Homocisteína

<400> 19 55

<210> 20

<211> 29 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> fuente 10 <223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 20

<210> 21

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial 20

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

25 <400> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<210> 23

<211> 78 40 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

45 <223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de péptido sintetizado”

<400> 23

<210> 24

<211> 75

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de péptido sintetizado”

<400> 24

<210> 25

<211> 72

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 25

<210> 26

<211> 69

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 26

<210> 27

<211> 66

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 27

<210> 28

<211> 63

<212> ADN

<213> Artificial 5

<220>

<221> fuente

<400> 28

<210> 29

<211> 60

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 29 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgtgt 60

<210> 30

<211> 60

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 30 gatgcagaat tccgacatga ctcaggaaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt 60

<210>31

<211> 60

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 31 gcagaattcc gacatgactc aggatataaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt 60

<210> 32

<211> 57

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 32 gaattccgac atgactcagg atataaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt 57

<210> 33

<211> 57

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 33 gcagaattcc gacatgactc aggaaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt 57

<210> 34

<211> 102

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 34

<210> 35

<211> 84

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 35

<210> 36

<211> 81

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 36

<210> 37

<211> 90

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<400> 37

<210> 38 5 <211> 87

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 10 <221> fuente

<210> 39

<211> 90 20 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

25 <223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de péptido sintetizado”

<400> 39

<210> 40

<211> 24

<212> PRT 35 <213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado” 40

<400> 40

45 <210>41

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial

50 <220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 41 55

<210> 42

<211> 25 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<400> 42

15 <210> 43

<211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20 <400> 43

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 30 <221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 44

<210> 45

<211> 18

<212> PRT 40 <213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado” 45

<400> 45

<210> 46

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 46

<210> 47 15 <211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 47

<210> 48

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 48

<210> 49

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial

45 <220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 49

<210> 50

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<400> 50

<210> 51

<211> 29

<212> PRT 15 <213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado” 20

<400> 51

25 <210> 52

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

30 <220>

<221> fuente

<223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<210> 53

<211> 29 40 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> fuente 45 <223> /nota= “Descripción de secuencia artificial: Péptido Sintetizado”

<220>

<221> misc_feature

<222> (29) .. (29) 50 <223> Xaa es Glutatión

<400> 53

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido seleccionado de (A) a (H) de los siguientes:

5 (A) un péptido que consiste en (a) un péptido que consiste en la restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 10 del Nterminal de la SEQ ID NO:1 y (b) un péptido seleccionado de péptidos que consisten en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 36, N.º 28 a N.º 37, N.º 28 a N.º 38, N.º 28 a N.º 39, N.º 28 a N.º 40, N.º 28 a N.º 41, N.º 28 a N.º 42 del N-terminal de la SEQ ID NO:1, uniéndose entre sí el péptido (a) y el péptido (b), en donde la cisteína o un análogo de cisteína se une al C-terminal de la combinación resultante del péptido (a) y el péptido (b);

(B) un péptido que consiste en (a) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 2 a N.º 10, N.º 2 a N.º 9, del N-terminal de la SEQ ID NO:1 y (b) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 del N-terminal de la SEQ ID NO:1, uniéndose entre sí el péptido (a) y el péptido (b), en donde la cisteína o un análogo de cisteína se une al C-terminal de la combinación resultante del péptido (a) y el péptido (b);

15 (C) un péptido que consiste en (a) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 del Nterminal de la SEQ ID NO: 1 y (b) un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 42 del Nterminal de la SEQ ID NO:1, uniéndose entre sí el péptido (a) y el péptido (b), en donde la cisteína o un análogo de cisteína se une al C-terminal de la combinación resultante del péptido (a) y el péptido (b);

(D)

un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a 26 del N-terminal de la SEQ ID NO:1 en donde la cisteína o un análogo de cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 del N-terminal;

(E)

un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 28 del N-terminal de la SEQ ID NO:1, en donde la cisteína o un análogo de cisteína se inserta entre los restos de aminoácidos N.º 18 y 19 del N-terminal, y en donde la cisteína o el análogo de cisteína se une al C-terminal de dicho péptido;

(F)

un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 18 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1

25 hasta el C-terminal al que se une la cisteína o un análogo de cisteína, al que se une un péptido adicional que consiste en los restos de aminoácidos N.º 28 a N.º 37 del N-terminal de la SEQ ID NO:1;

(G)

un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 28 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se une un análogo de cisteína;

(H)

un péptido que consiste en dos de un péptido que consiste en los restos de aminoácidos N.º 1 a N.º 28 desde el N-terminal de la SEQ ID NO:1, hasta el C-terminal al que se une una cisteína o un análogo de cisteína, uniéndose dichos dos péptidos entre sí mediante un enlace disulfuro entre dichas cisteínas o dichos análogos de cisteína.
2. El péptido de la reivindicación 1, en donde dicho análogo de cisteína es homocisteína. 35
3. El péptido de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho péptido es un péptido seleccionado del grupo que consiste en lo siguiente:

•

un péptido de una cualquiera de las SEQ ID NO:2 a la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 a la SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO: 19;

•

un péptido que consiste en dos péptidos, cada uno de los péptidos consiste en la SEQ ID NO:20 y se unen entre sí mediante un enlace disulfuro; y

•

un péptido que consiste en un péptido que consiste en la SEQ ID NO:20 y un péptido que consiste en la

SEQ ID NO:21, cada uno de los péptidos se unen entre sí mediante un enlace disulfuro. 45
4.

El péptido tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en la mejora de la respuesta inmunitaria para β amiloide.
5.

Uso del péptido tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un medicamento para la mejora de la respuesta inmunitaria para β amiloide.
6.

Un medicamento para su uso en la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer caracterizado porque el medicamento comprende como un principio activo el péptido que se expone en uno cualquiera de los apartados 1 a 3.
7.

Uso de un péptido tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
8.

Una vacuna de ADN eficaz para su uso en la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer caracterizada porque la vacuna comprende un fragmento de gen que codifica la secuencia de aminoácidos del péptido tal como se expone en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
9.

Uso de una vacuna de ADN que comprende un fragmento de gen que codifica para la secuencia de aminoácidos

del péptido tal como se define en uno cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un 65 medicamento para la profilaxis y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.