JP5474807B2 - 改変アミロイドβペプチド - Google Patents
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Description
(A)(a)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜18番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドと、(b)配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜42番目のうち、28〜36番目のアミノ酸残基を含む9個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを結合させ、さらにそのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド;
(B)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜26番目または1〜27番目からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインまたはシステイン類似体を挿入させたペプチド;
(C)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインまたはシステイン類似体を挿入し、さらにC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド;
(D)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜18番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させ、さらに配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜42番目からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドを結合させたペプチド、または選択的にさらにそのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させたペプチド;
(E)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステイン類似体を結合させたペプチド;
(F)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部からなるペプチドのC末端にシステインまたはシステイン類似体を結合させた2個以上のペプチドを、当該システインまたはシステイン類似体のジスルフィド結合により連結させたペプチド。
・配列番号2から19のいずれか一つのペプチド
・配列番号20からなる2個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
配列番号20からなるペプチドと配列番号21からなるペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
・配列番号21からなる2個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
並びに
・配列番号21からなる複数個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
からなる群より選択されるペプチドである上記(1)から(7)のいずれかに記載のペプチド。
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜42番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-42AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号2)
(2) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜41番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-41AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIC(配列番号3)
(3) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜40番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-40AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVC(配列番号4)
(4) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜39番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-39AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVC(配列番号5)
(5) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜38番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-38AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGC(配列番号6)
(6) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-37AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号7)
(7) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜36番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-10・28-36AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVC(配列番号8)
(8) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜9番目の配列のC末端に、28番目〜37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-9・28-37AACys):
N末-DAEFRHDSGKGAIIGLMVGC(配列番号9)
(9) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から2番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(2-10・28-37AACys):
N末-AEFRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号10)
(10) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から3番目〜10番目の配列のC末端に、28番目〜37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(3-10・28-37AACys):
N末-EFRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号11)
(11) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から2番目〜9番目の配列のC末端に、28番目〜37番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(2-9・28-37AACys):
N末-AEFRHDSGKGAIIGLMVGC(配列番号12)
(12) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜18番目の配列のC末端に、28番目〜42番目の配列を繋ぎ、そのC末端にシステインを付加したペプチド(1-18・28-42AACys):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号13)
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜27番目からなるペプチド(以下、27アミノ酸Aβペプチド)の18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド(1-18Cys19-27AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSN(配列番号14)
(2) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜26番目からなるペプチド(以下、26アミノ酸Aβペプチド)の18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド(1-18Cys19-26AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGS(配列番号15)
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜28番目からなるペプチド(以下、28アミノ酸Aβペプチド)の18番目と19番目の間にシステイン挿入し更にC末端にシステインを繋いだペプチド(1-18Cys19-28AACys)
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNKC(配列番号16)
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜18番目の配列のC末端にシステインを繋ぎさらにその後ろに28番目〜37番目の配列を繋いだペプチド(1-18Cys28-37AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVG(配列番号17)
(2) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜18番目の配列のC末端にシステインを繋ぎさらにその後ろに28番目〜37番目の配列を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチド(1-18Cys28-37AACys):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVGC (配列番号18)
(1) 配列番号1のアミノ酸配列のN末から1番目〜28番目の配列のC末端にホモシステインを付加したペプチド(28AA-ホモシステイン)
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKX(配列番号19)(X:ホモシステイン)
(1) 28アミノ酸Aβペプチドにシステインを付加したペプチド(28AAC)
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC(配列番号20)
(2) 28アミノ酸Aβペプチドにシステインを2個付加したペプチド(28AACC)
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCC(配列番号21)
上記28AACと28AACをジスルフィド結合により連結したもの(28AACジスルフィド28AAC)、28AACと28AACCをジスルフィド結合により連結したもの(28AACジスルフィド28AACC)、28AACCと28AACCをジスルフィド結合により連結したもの(28AACCジスルフィド28AACC;N末側のシステイン同士がジスルフィド結合したもの、C末側のシステイン同士がジスルフィド結合したもの、C末側とN末側のシステインがジスルフィド結合したもの、C末側同士とN末側同士のシステインがジスルフィド結合したもの、および、それぞれC末側とN末側のシステインがジスルフィド結合したものを含む)、および複数の28AACCをジスルフィド結合により連結したもの(28AACC(28AAC)の結合体)で、その構造を図1に示した。
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc atagcg (配列番号22)
・1-10・28-42AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtca tagcgtgt (配列番号23)
・1-10・28-41AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtca tatgt (配列番号24)
・1-10・28-40AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgttgtct gt (配列番号25)
・1-10・28-39AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggtgtttgt (配列番号26)
・1-10・28-38AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc ggttgt (配列番号27)
・1-10・28-37AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgggc tgt (配列番号28)
・1-10・28-36AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat aaaggtgcaa tcattggact catggtgtgt (配列番号29)
・1-9・28-37AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggaaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt (配列番号30)
・2-10・28-37AACysをコードする遺伝子断片:
gcagaattcc gacatgactc aggatataaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt (配列番号31)
・3-10・28-37AACysをコードする遺伝子断片:
gaattccgac atgactcagg atataaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt (配列番号32)
・2-9・28-37AACysをコードする遺伝子断片:
gcagaattcc gacatgactc aggaaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggctgt (配列番号33)
・1-18・28-42AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgaaaggt gcaatcattg gactcatggt gggcggtgtt gtcatagcgt gt (配列番号34)
・1-18Cys19-27AAをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc aaac (配列番号35)
・1-18Cys19-26AAをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc a (配列番号36)
・1-18Cys19-28AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc tttgcagaag atgtgggttc aaacaaatgt (配列番号37)
・1-18Cys28-37AAをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggc (配列番号38)
・1-18Cys28-37AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtaaa ggtgcaatca ttggactcat ggtgggctgt (配列番号39)
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・システイン付加1から10+30から42アミノ酸Aβペプチド(1-10・30-42AACys):
N末- DAEFRHDSGYAIIGLMVGGVVIAC(配列番号40)
・システイン付加1から10+29から42アミノ酸Aβペプチド(1-10・29-42AACys):
N末- DAEFRHDSGYGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号41)
・システイン付加1から10+28から42アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-42AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号2)
・1から10+28から42アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-42AA):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIA(配列番号42)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで−80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
16匹のマウスを4匹ずつ4群に分け、第1群:1-10・30-42AACys投与群、第2群:1-10・29-42AACys投与群、第3群:1-10・28-42AACys投与群、第4群:1-10・28-42AA投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
Aβペプチド(1-40のアミノ酸配列: N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (配列番号43)、北海道システム・サイエンス社合成)を0.1Mカルボネートバッファー、 pH9.6で10μg/mLに希釈し8ウェル ストリップス(ナルジェ ヌンク社、イモビライザーアミノ)に100μL/ウェル加え、4℃で一夜静置して固相化した。翌日、各ウェルを300μLの0.05%Tween20含有PBS(PBST)で3回洗浄し、10mM エタノールアミンを300μL/ウェルずつ添加して、室温で1時間静置した。
算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表1に示した。表1に示すように、1-10・28-42AACys投与群及び1-10・28-42AA投与群でAβに対する抗体誘導が認められた。またシステインを付加していないペプチド(1-10・28-42AA)で免疫した場合より、システインを付加したペプチド(1-10・28-42AACys)で免疫した場合がAβに対する高い抗体価を示した。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・システイン付加1から10+28から42アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-42AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号2)
・システイン付加1から10+28から41アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-41AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIC(配列番号3)
・システイン付加1から10+28から40アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-40AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVC(配列番号4)
・システイン付加1から10+28から39アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-39AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVC(配列番号5)
・システイン付加1から10+28から38アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-38AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGC(配列番号6)
・システイン付加1から10+28から37アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-37AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号7)
・システイン付加1から10+28から36アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-36AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMVC(配列番号8)
・システイン付加1から10+28から35アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-35AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLMC(配列番号44)
・システイン付加1から10+28から34アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-34AACys):
N末- DAEFRHDSGYKGAIIGLC(配列番号45)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで−80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
36匹のマウスを4匹ずつ9群に分け、第1群:1-10・28-42AACys投与群、第2群:1-10・28-41AACys投与群、第3群:1-10・28-40AACys投与群、第4群:1-10・28-39AACys投与群、第5群:1-10・28-38AACys投与群、第6群:1-10・28-37AACys投与群、第7群:1-10・28-36AACys投与群、第8群:1-10・28-35AACys投与群及び第9群:1-10・28-34AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表2に示した。表2に示すように、1-10・28-42AACys、1-10・28-41AACys、1-10・28-40AACys、1-10・28-39AACys、1-10・28-38AACys、1-10・28-37AACysおよび1-10・28-36AACysのペプチドでAβに対する高い抗体価を示した。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・システイン付加1から9+28から37アミノ酸Aβペプチド(1-9・28-37AACys):
N末- DAEFRHDSGKGAIIGLMVGC(配列番号9)
・システイン付加1から8+28から37アミノ酸Aβペプチド(1-8・28-37AACys):
N末- DAEFRHDSKGAIIGLMVGC(配列番号46)
・システイン付加1から7+28から37アミノ酸Aβペプチド(1-7・28-37AACys):
N末- DAEFRHDKGAIIGLMVGC(配列番号47)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで−80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
12匹のマウスを4匹ずつ3群に分け、第1群:1-9・28-37AACys投与群、第2群:1-8・28-37AACys投与群及び第3群:1-7・28-37AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表3に示した。表3に示すように、1-9・28-37AACysのペプチドでAβに対する抗体の誘導が認められた。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・システイン付加2から10+28から37アミノ酸Aβペプチド(2-10・28-37AACys):
N末- AEFRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号10)
・システイン付加3から10+28から37アミノ酸Aβペプチド(3-10・28-37AACys):
N末- EFRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号11)
・システイン付加4から10+28から37アミノ酸Aβペプチド(4-10・28-37AACys):
N末- FRHDSGYKGAIIGLMVGC(配列番号48)
・システイン付加2から9+28から37アミノ酸Aβペプチド(2-9・28-37AACys):
N末- AEFRHDSGKGAIIGLMVGC(配列番号12)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで−80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
16匹のマウスを4匹ずつ4群に分け、第1群:2-10・28-37AACys投与群、第2群:3-10・28-37AACys投与群、第3群:4-10・28-37AACys投与群及び第4群:2-9・28-37AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表4に示した。表4に示すように、2-10・28-37AACys、3-10・28-37AACysおよび2-9・28-37AACysのペプチドでAβに対する抗体の誘導が認められた。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・システイン付加1から18+28から42アミノ酸Aβペプチド(1-18・28-42AACys):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号13)
・システイン付加1から10+28から42アミノ酸Aβペプチド(1-10・28-42AACys):
N末-DAEFRHDSGYKGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号2)
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
8匹のマウスを4匹ずつ2群に分け、第1群:1-18・28-42AACys投与群及び第2群:1-10・28-42AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表5に示した。表5に示すように、1-18・28-42AACys投与群及び1-10・28-42AACys投与群共にAβに対する同程度の抗体の誘導が認められた。
・28アミノ酸Aβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド(1-18Cys19-28AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNK(配列番号49)
・28アミノ酸Aβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入し更にC末端にシステインを繋いだペプチド(1-18Cys19-28AACys):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNKC(配列番号16)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで−80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
8匹のマウスを4匹ずつ2群に分け、第1群:1-18Cys19-28AA投与群及び第2群:1-18Cys19-28AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表6に示した。表6に示すように、1-18Cys19-28AA投与群及び1-18Cys19-28AACys投与群共にAβに対する同程度の抗体の誘導が認められた。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・27アミノ酸Aβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド(1-18Cys19-27AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSN(配列番号14)
・26アミノ酸Aβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド(1-18Cys19-26AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGS(配列番号15)
・25アミノ酸Aβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチド(1-18Cys19-25AA):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVG(配列番号50)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで−80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
12匹のマウスを4匹ずつ3群に分け、第1群:1-18Cys19-27AA投与群、第2群: 1-18Cys19-26AA投与群及び第3群1-18Cys19-25AA投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表7に示した。表7に示すように、1-18Cys19-27AA投与群及び1-18Cys19-26AA投与群にAβに対する抗体の誘導が認められた。また1-18Cys19-25AA投与群は4例中1例にAβに対する抗体の誘導が認められた。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・Aβペプチドの1番目から18番目の配列のC末端にシステインを繋ぎさらにその後ろに28番目から37番目の配列を繋いだペプチド(1-18Cys28-37AA)
N末- DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVG(配列番号17)
・Aβペプチドの1番目から18番目の配列のC末端にシステインを繋ぎさらにその後ろに28番目から37番目の配列を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチド(1-18Cys28-37AACys):
N末- DAEFRHDSGYEVHHQKLVCKGAIIGLMVGC(配列番号18)
・Aβペプチドの1番目から18番目の配列のC末端に28番目から37番目の配列を繋ぎそのC末端にシステインを付加したペプチド(1-18・28-37AACys)
N末- DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVGC(配列番号51)
・Aβペプチドの1番目から18番目の配列のC末端に28番目から37番目の配列を繋いだペプチド(1-18・28-37AA)
N末- DAEFRHDSGYEVHHQKLVKGAIIGLMVG(配列番号52)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで−80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
16匹のマウスを4匹ずつ4群に分け、第1群:1-18Cys28-37AA投与群、第2群: 1-18Cys28-37AACys投与群、第3群:1-18・28-37AACys投与群及び第4群:1-18・28-37AAとした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表8に示した。表8に示すように、1-18Cys28-37AA投与群及び1-18Cys28-37AACys投与群にAβに対する抗体の誘導が認められた。
(1)システインの前駆体または代謝産物を付加したAβペプチドの調製
・28アミノ酸Aβペプチドにホモシステインを付加したペプチ(28AA-ホモシステイン):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-Homocysteine(配列番号19)
・28アミノ酸Aβペプチドにグルタチオンを付加したペプチ(28AA-グルタチオン):
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-Glutathione(配列番号53)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、使用時まで−80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
8匹のマウスを4匹ずつ2群に分け、第1群:28AA-ホモシステイン投与群及び第2群:28AA-グルタチオン投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表9に示した。表9に示すように、28AA-ホモシステイン投与群ではAβに対する抗体の誘導が認められた。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
・28アミノ酸Aβペプチドにシステインを付加したペプチド(28AAC)
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-C(配列番号20)
・28アミノ酸Aβペプチドにシステインを2つ付加したペプチド(28AACC)
N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-CC(配列番号21)
28AACと28AACをジスルフィド結合したもの(28AACジスルフィド28AAC)、および28AACと28AACCをジスルフィド結合したもの(28AACジスルフィド28AACC)を調製した。得られるペプチドの構造は、2個のペプチドがC末端のシステインを介したジスルフィド結合により連結される構造の他、N末-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-CCを含む二量体に更にジスルフィド結合し三量体、多量体化したものが考えられる(図1)。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
8匹のマウスを4匹ずつ2群に分け、第1群:28AACジスルフィド28AAC投与群及び第2群:228AACジスルフィド28AACC投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(一個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表10に示した。表10に示すように、ジスルフィド結合させたシステイン付加28アミノ酸Aβペプチドは、28AACジスルフィド28AAC投与群及び228AACジスルフィド28AACC投与群両方とも、Aβに対する抗体の誘導が認められた。
Claims (4)
- 以下の(A)〜(F)のいずれかから選択される、改変アミロイドβペプチド:
(A)下記の組み合わせからなるペプチド(a)のC末端にペプチド(b)のN末端を結合させ、さらにそのC末端にシステインを結合させたペプチド;
・配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜9番目の配列からなるペプチド(a)と、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜37番目の配列からなるペプチド(b)との組み合わせ、
・配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜10番目の配列からなるペプチド(a)と、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜36番目、28〜37番目、28〜38番目、28〜39番目、28〜40番目、28〜41番目、または28〜42番目のいずれかの配列からなるペプチド(b)との組み合わせ、
・配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜18番目の配列からなるペプチド(a)と、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜42番目の配列からなるペプチド(b)との組み合わせ、
・配列番号1のアミノ酸配列のN末から2〜9番目の配列からなるペプチド(a)と、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜37番目の配列からなるペプチド(b)との組み合わせ、
・配列番号1のアミノ酸配列のN末から2〜10番目の配列からなるペプチド(a)と、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜37番目の配列からなるペプチド(b)との組み合わせ、または
・配列番号1のアミノ酸配列のN末から3〜10番目の配列からなるペプチド(a)と、配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜37番目の配列からなるペプチド(b)との組み合わせ;
(B)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜26番目または1〜27番目からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインを挿入させたペプチド;
(C)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜28番目からなるペプチドの、N末から18番目と19番目のアミノ酸残基の間にシステインを挿入し、さらにC末端にシステインを結合させたペプチド;
(D)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜18番目からなるペプチドのC末端にシステインを結合させ、さらに配列番号1のアミノ酸配列のN末から28〜37番目からなるペプチドを結合させたペプチド、または選択的にさらにそのC末端にシステインを結合させたペプチド;
(E)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜28番目からなるペプチドのC末端にシステインまたはホモシステインを結合させたペプチド;
(F)配列番号1のアミノ酸配列のN末から1〜28番目からなるペプチドのC末端にシステインを結合させたペプチドを、当該システインのジスルフィド結合により連結させたペプチド。 - 当該改変アミロイドβペプチドが、
・配列番号2から19のいずれか一つのペプチド
・配列番号20からなる2個のペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
並びに
・配列番号20からなるペプチドと配列番号21からなるペプチドをジスルフィド結合により結合させたペプチド
からなる群より選択されるペプチドである請求項1に記載のペプチド。 - 請求項1または2に記載の改変アミロイドβペプチドを有効成分として含有することを特徴とするアルツハイマー病の予防または治療薬。
- 請求項1または2に記載の改変アミロイドβペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子断片を含有することを特徴とするアルツハイマー病の予防または治療に有効なDNAワクチン。
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