JP5349297B2 - ペプチド免疫応答増強方法 - Google Patents
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Description
(1)アミロイドβペプチドまたはその一部に、システインが付加もしくは挿入またはシステインを含むペプチドが付加されていることを特徴とする免疫応答の増強した免疫原性ペプチド。
(2)システインがアミロイドβペプチドまたはその一部のN末端、C末端またはその両方に付加されていることを特徴とする上記1に記載の免疫原性ペプチド。
(3)システインがアミロイドβペプチドまたはその一部のC末端に付加されていることを特徴とする上記1または2に記載の免疫原性ペプチド。
(4)付加されるシステインが1または2分子である上記1から3のいずれかに記載の免疫原性ペプチド。
(5)システインを含むペプチドがアミロイドβペプチドまたはその一部のC末端に付加されていることを特徴とする上記1に記載の免疫原性ペプチド。
(6)アミロイドβペプチドまたはその一部に、システインが挿入されていることを特徴とする上記1に記載の免疫原性ペプチド。
(7)アミロイドβペプチドまたはその一部のN末端から、18番目と19番目の間、25番目と26番目の間、または28番目と29番目の間のいずれかにシステインが挿入されていることを特徴とする上記6に記載の免疫原性ペプチド。
(8)当該アミロイドβペプチドまたはその一部が、配列番号34のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその一部である上記1から7のいずれかに記載の免疫原性ペプチド。
(9)当該ペプチドが、配列番号6、配列番号8、配列番号12、配列番号21、配列番号23、配列番号29、配列番号32、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54または配列番号56からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドである、上記1から8のいずれかに記載の免疫原性ペプチド。
(10)上記1から9のいずれかに記載の免疫原性ペプチドを有効成分として含有することを特徴とするアルツハイマー病の予防または治療薬。
(11)上記1から9のいずれかに記載の免疫原性ペプチドを有効成分とし、さらにアジュバントを添加することを特徴とするアルツハイマー病の予防または治療薬。
(12)上記1から9のいずれかに記載の免疫原性ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子断片を含有することを特徴とするアルツハイマー病の予防または治療に有効なDNAワクチン。
(13)アミロイドβペプチドまたはその一部にシステインが付加もしくは挿入またはシステインを含むペプチドが付加されてなる免疫応答の増強した免疫原性ペプチドを使用することを特徴とする免疫応答増強方法。
(14)アミロイドβペプチドまたはその一部にシステインが付加もしくは挿入またはシステインを含むペプチドが付加されてなる免疫応答の増強した免疫原性ペプチドにアジュバントを添加して使用することを特徴とする免疫応答増強方法。
(15)アミロイドβペプチドまたはその一部にシステインが付加もしくは挿入またはシステインを含むペプチドが付加されてなる免疫応答の増強した免疫原性ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子断片を含有するベクターをDNAワクチンとして用いることを特徴とする免疫応答増強方法。
(1)C末端1分子付加したペプチド:
28AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC(配列番号6)
29AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGC(配列番号8)
30AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAC(配列番号10)
31AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIC(配列番号12)
35AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMC(配列番号21)
36AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVC(配列番号23)
37AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGC(配列番号25)
38AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGC(配列番号27)
39AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVC(配列番号29)
40AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVC(配列番号32)
42AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAC(配列番号36)
(2)C末端2分子付加したペプチド:
28AACysCys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCC(配列番号38)
(3)N末端1分子付加したペプチド:
Cys28AA:CDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK(配列番号40)
(4)C末端およびN末端各1分子付加したペプチド:
Cys28AACys:CDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC(配列番号42)
(5)1分子挿入したペプチド:
28AA18Cys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNK(配列番号46)
28AA25Cys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGCSNK(配列番号48)
33AA28Cys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCGAIIG(配列番号50)
35AA28Cys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCGAIIGLM(配列番号52)
(6)C末端1分子付加+外来ペプチド付加したペプチド(外来性ペプチド部分は、付加したシステイン残基のC末端側の配列である):
28AACysTTD:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCTTD(配列番号54)
28AACysEIFEFTTD:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCEIFEFTTD(配列番号56)
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc
atagcg(配列番号35)
26AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcatgt(配列番号2)
27AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa ctgt(配列番号4)
28AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaatgt(配列番号7)
29AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggttgt(配列番号9)
30AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca tgt(配列番号11)
31AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atctgt(配列番号13)
32AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcatttgt(配列番号15)
33AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggat gt(配列番号17)
34AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tctgt(配列番号19)
35AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatgtgt(配列番号22)
36AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtgtg t(配列番号24)
37AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg ctgt(配列番号26)
38AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggttgt(配列番号28)
39AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgtttgt(配列番号30)
40AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc
tgt(配列番号33)
42AACysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc
atagcgtgt(配列番号37)
28AACysCysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaatgttgt(配列番号39)
Cys28AAをコードする遺伝子断片:
tgtgatgcag aattccgaca tgactcagga tatgaagttc atcatcaaaa attggtgttc
tttgcagaag atgtgggttc aaacaaa(配列番号41)
Cys28AACysをコードする遺伝子断片:
tgtgatgcag aattccgaca tgactcaggatat gaagttc atcatcaaaa attggtgttc
tttgcagaag atgtgggttc aaacaaatgt(配列番号43)
28AA18Cysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgtgtttc
tttgcagaag atgtgggttc aaacaaa(配列番号47)
28AA25Cysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttgttcaaa caaa(配列番号49)
33AA28Cysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaatgtggt gcaatcattg ga(配列番号51)
35AA28Cysをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaatgtggt gcaatcattg gactcatg(配列番号53)
28AACysTTDをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaatgtact actgac(配列番号55)
28AACysEIFEFTTDをコードする遺伝子断片:
gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt
gcagaagatg tgggttcaaa caaatgtgaa atcttcgaat tcactactga c(配列番号57)
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
28AA:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK(配列番号5)
28AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC(配列番号6)
35AA:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM(配列番号20)
35AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMC(配列番号21)
上記のペプチドを合成し(北海道システム・サイエンス社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで−80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
16匹のマウスを4匹ずつ4群に分け、第1群:28AA投与群、第2群:28AACys投与群、第3群:35AA投与群、第4群:35AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(1個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
2回目免疫の7日目に、尾静脈より50〜150μLの採血を行った。また、3回目の最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
Aβペプチド(1-40のアミノ酸配列:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(配列番号31)、北海道システム・サイエンス社合成)を0.1Mカルボネートバッファー、pH9.6で10μg/mLに希釈し8ウェルストリップス(ナルジェ ヌンク社、イモビライザーアミノ)に100μL/ウェル加え、4℃で一夜静置して固相化した。翌日、各ウェルを300μLの0.05%Tween20含有PBS(PBST)で3回洗浄し、10mM エタノールアミンを300μL/ウェルずつ添加して、室温で1時間静置した。
(1)システインを付加したAβペプチドおよびキャリア結合Aβペプチドの調製
28AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC(配列番号6)
28AA-KLH:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK-C-KLH
上記のペプチドを合成し(北山ラベス株式会社)、生理食塩液で1mg/mLに調製しこれを原液とし、使用時まで−80℃以下で保存した。なお、KLH(スカシ貝ヘモシアニン)は約60kDaのキャリア蛋白で、28AA-KLH中のCysは28AAペプチドとKLHとの連結のためのリンカーとして用いたものであり、免疫応答増強効果を意図するものではない。また、このキャリア蛋白をCysで免疫原性ペプチドに連結する方法はペプチド免疫を行う際の一般的な手法である。
アジュバントとして市販のフロイント完全アジュバント(FREUND'S COMPLRTE ADJUVANT(以下「FCA」と略す))、フロイント不完全アジュバント(FREUND'S INCOMPLRTE ADJUVANT(以下「FICA」と略す))、ゲルブ社、#1841、#1842)、ゲルブ アジュバント MM(GERBU、ゲルブ社、#3001.0106)およびアルハイドロゲル '85' 2%(ALHYDROGEL '85' 2%、ブレンタッグ社)を用いた。
雄のC57BL/6(9週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
25匹のマウスを5匹ずつ5群に分け、第1群:28AACys投与群、第2群:28AA-KLH投与群、第3群:28AA-KLH+FCA/FICA投与群、第4群:28AA-KLH+ ゲルブ アジュバント MM投与群、第5群:28AA-KLH+ アルハイドロゲル '85' 2%投与群とした。
初回投与用量はAβペプチドを1個体当たり100μg、2回目、3回目投与用量は1個体当たり50μgとした。すなわち、28AACys投与群の初回投与分は28AACys 0.5mLに生理食塩液0.5mLを混合することで調製し、2回目、3回目投与分は28AACys 0.25mLに生理食塩液0.75mLを混合することで調製した。28AA-KLH投与群の初回投与分は28AA-KLH 0.5mLに生理食塩液0.5mLを混合することで調製し、2回目、3回目投与分は28AA-KLH 0.25mLに生理食塩液0.75mLを混合することで調製した。28AA-KLH+FCA/FICA投与群の初回投与分は28AA-KLH 0.5mLにFCAを0.5mL混合しエマルジョン化したものを調製し、2回目、3回目投与分は28AA-KLH 0.25mLに生理食塩液0.25mL、FICAを0.5mL混合しエマルジョン化したものを調製した。28AA-KLH+ ゲルブ アジュバント MM投与群の初回投与分は28AA-KLH 0.5mLに生理食塩液0.4mL、ゲルブ アジュバント MM 0.1mLを混合することで調製し、2回目、3回目投与分は28AA-KLH 0.25mLに生理食塩液0.65mL、ゲルブ アジュバント MM 0.1mLを混合することで調製した。28AA-KLH+ アルハイドロゲル '85' 2%投与群の初回投与分は28AA-KLH 0.5mLにアルハイドロゲル '85' 2% 0.5mLを混合することで調製し、2回目、3回目投与分は28AA-KLH 0.25mLに生理食塩液0.25mL、アルハイドロゲル '85' 2% 0.5mLを混合することで調製した。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
3回目の最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表2に示した。表2に示すように、Aβペプチド断片にキャリアのKLHを付加しアジュバントとしてフロイント完全/不完全アジュバントと混合したものが、Aβに対する最も高い抗体価を示した。システインを付加したAβペプチド断片は次に高い抗体価を示し、アジュバントとしてゲルブ アジュバントMM(GERBU)やアルハイドロゲル(ALHYDROGEL) '85' 2%を用いたものや、Aβペプチド断片にキャリアのKLH付加したものより明らかに高い抗体価を示した。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
26AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSC(配列番号1)
27AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNC(配列番号3)
28AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC(配列番号6)
29AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGC(配列番号8)
30AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAC(配列番号10)
31AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIC(配列番号12)
32AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIC(配列番号14)
33AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGC(配列番号16)
34AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLC(配列番号18)
35AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMC(配列番号21)
36AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVC(配列番号23)
37AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGC(配列番号25)
38AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGC(配列番号27)
39AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVC(配列番号29)
40AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVC(配列番号32)
上記のペプチドを合成し(北海道システム・サイエンス社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで−80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
60匹のマウスを4匹ずつ15群に分け、第1群:26AACys投与群、第2群:27AACys投与群、第3群:28AACys投与群、第4群:29AACys投与群、第5群:30AACys投与群、第6群:31AACys投与群、第7群:32AACys投与群、第8群:33AACys、第9群:34AACys投与群、第10群:35AACys投与群、第11群:36AACys投与群、第12群:37AACys投与群 、第13群:38AACys投与群、第14群:39AACys投与群、第15群:40AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(1個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
3回目の最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表3に示した。表3に示すように、システインを付加した26から40アミノ酸配列長のAβペプチド投与群において、28アミノ酸配列長以上においてAβに対する抗体誘導能が認められ、特に28AACys、29AACys、31AACys、35AACys、36AACys、39AACys、40AACysが高い抗体価を示した。
(1)システイン非付加およびシステイン付加Aβペプチドの調製
28AA:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK(配列番号5)
28AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC(配列番号6)
28AACysCys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCC(配列番号38)
上記のペプチドを合成し(北海道システム・サイエンス)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、使用時まで-80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
12匹のマウスを4匹ずつ3群に分け、第1群:28AA投与群、第2群:28AACys投与群および第3群:28AACysCys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(1個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
4回目の最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブに分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表4に示した。表4に示すように、28AACys投与群および28AACysCys投与群にほぼ同様な抗体誘導能が認められた。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
28AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC(配列番号6)
Cys28AA:CDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK(配列番号40)
Cys28AACys:CDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC(配列番号42)
上記のペプチドを合成し(北海道システム・サイエンス)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、使用時まで-80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
12匹のマウスを4匹ずつ3群に分け、第1群:28AACys投与群、第2群:Cys28AA投与群および第3群:Cys28AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(1個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
4回目の最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血して殺処分した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブに分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表5に示した。表5に示すように、Cys付加位置に関係なく、全群に抗体誘導能が認められた。
(1)システインを挿入したAβペプチドの調製
28AA7Cys:DAEFRHDCSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK(配列番号44)
28AA10Cys:DAEFRHDSGYCEVHHQKLVFFAEDVGSNK(配列番号45)
28AA18Cys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVCFFAEDVGSNK(配列番号46)
28AA25Cys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGCSNK(配列番号48)
33AA28Cys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCGAIIG(配列番号50)
35AA28Cys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCGAIIGLM(配列番号52)
28AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC(配列番号6)
上記のペプチドを合成し(シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、使用時まで-80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
28匹のマウスを4匹ずつ7群に分け、第1群:28AA7Cys投与群、第2群:28AA10Cys投与群、第3群:28AA18Cys投与群、第4群:28AA25Cys投与群、第5群:33AA28Cys投与群、第6群:35AA28Cys投与群および第7群:28AACys投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(1個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
4回目の最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブに分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表6に示した。表6に示すように、28AA18Cys投与群、28AA25Cys投与群、33AA28Cys投与群、35AA28Cys投与群および28AACys投与群に抗体誘導能が認められた。特に28アミノ酸Aβペプチドの18番目と19番目の間にシステイン挿入したペプチドの28AA18Cys投与群はC末端にシステインを付加した28アミノ酸Aβペプチドの28AACys投与群と比較しても高い抗体誘導能が認められた。
(1)システイン非付加およびシステイン付加Aβペプチドの調製
28AA:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK(配列番号5)
28AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC(配列番号6)
28AACysTTD:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCTTD(配列番号54)
28AACysEIFEFTTD:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKCEIFEFTTD(配列番号56)
上記のペプチドを合成し(北海道システム・サイエンス)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、使用時まで-80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
16匹のマウスを4匹ずつ4群に分け、第1群:28AA投与群、第2群:28AACys投与群、第3群:28AACysTTD投与群および第4群:28AACysTTD投与群とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(1個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
4回目の最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブに分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表7に示した。表7に示すように、28AACys投与群、28AACysTTD投与群および28AACysEIFEFTTD投与群に抗体誘導能が認められた。よって、Aβ配列にCysを付けることで抗体誘導能を付加したものに、さらに外来のペプチド配列をつないでも、その抗体誘導能は保持できることが分かった。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
35AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMC(配列番号21)
上記のペプチドを合成し(北海道システム・サイエンス)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、使用時まで−80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
9匹のマウスを3匹ずつ3群に分け、第1群:経鼻投与群、第2群:経皮投与群、第3群:経口投与群とした。
《初回免疫》
各群共通に、まず原液200μLに生理食塩液1800μLを加え0.5mg/mLの濃度とし、マウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(1個体あたりの投与量:100μg)。2回目、3回目、4回目(最終)免疫に関しては、各群において初回免疫後1週間間隔で、下記に示すようにそれぞれマウスへの免疫を行った。
原液をマウス1匹あたり20μLずつピペットマンP-20(ギルソン社)を用いて鼻腔より投与した(1個体あたりの投与量:100μg)。
投与前日にマウスの背部を剃毛した。イソフルラン麻酔下、投与前に70%アルコールで剃毛部を消毒し乾燥した後に、原液をマウス1匹あたり20μLずつピペットマンP-20(ギルソン社)を用いて滴下投与した(1個体あたりの投与量:100μg)。
2回目および3回目免疫は、原液200μLに生理食塩液2300μLを加え0.2mg/mLの濃度とし、マウス1匹あたり500μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)に経口ゾンテ針(夏目製作所、KN-348、マウス用)を装着し胃内に投与した(1個体あたりの投与量:200μg)。4回目(最終)免疫は、原液100μLに生理食塩液2400μLを加え0.2mg/mLの濃度とし、マウス1匹あたり500μLずつ1mLツベルクリン用注射器に経口ゾンテ針を装着し胃内に投与した(1個体あたりの投与量:100μg)。
1回目免疫の6日目、2回目免疫の6日目、3回目免疫の6日目に尾静脈より50〜150μLの採血を行った。また、4回目の最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表8に示した。表8に示すように、システインを付加したAβペプチド断片は経鼻、経皮、経口投与共に、Aβに対する抗体誘導能が認められた。
(1)システイン非付加およびシステイン付加Aβペプチドの調製
35AA:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLM(配列番号20)
35AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMC(配列番号21)
上記のペプチドを合成し(北海道システム・サイエンス)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、使用時まで-80℃以下で保存した。
雄のC57BL/6(7週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
10匹のマウスを5匹ずつ2群に分け、第1群:システイン付加35アミノ酸Aβペプチド群、第2群:システイン非付加35アミノ酸Aβペプチド群とした。
実施例8と同様の方法で初回免疫を行い、2回目、3回目、4回目(最終)免疫に関しては、初回免疫後1週間間隔で、以下のように行った。投与前日にマウスの背部を剃毛した。イソフルラン麻酔下、投与前に70%アルコールで剃毛部を消毒しサジカールテープ(ニチバン)の貼り/剥しを10回繰り返すことで表皮角質層を除去した後、原液をマウス1匹あたり20μLずつピペットマンP-20(ギルソン社)を用いて滴下投与した。(1個体あたりの投与量:100μg)。
4回目の最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブに分注し、測定まで-80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表9に示した。表9に示すように、システインを付加したAβペプチド断片はシステインを付加しないものに対して10倍以上の抗体誘導能が認められた。
(1)システイン付加および非付加Aβペプチドの調製
28AA:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK(配列番号5)
28AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKC(配列番号6)
上記のペプチドを合成し(北海道システム・サイエンス社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで−80℃以下で保存した。
アジュバントとして市販のQuil-A (アキュレート ケミカル&サイエンティフィック コーポレーション)およびMPL+TDM エマルジョン(コリクサ社)を用いた。Quil-Aは生理食塩液に5mg/mLの濃度で溶解したものを原液とした。またMPL+TDMエマルジョンは1バイアルを1mLの生理食塩液に溶解したものを原液とし使用時まで4℃に保存した。
雄のC57BL/6(9週齢、SPF)を日本チャールスリバー社より購入し、SPF環境下で飼育した。
24匹のマウスを4匹ずつ6群に分け、第1群:28AA投与群、第2群:28AA + Quil-A投与群、第3群:28AA + MPL+TDMエマルジョン投与群、第4群:28AACys投与群、第5群:28AACys+ Quil-A投与群、第6群:28AACys + MPL+TDMエマルジョン投与群とした。
Aβペプチドの投与用量は1個体当たり100μgとし、500μg/mL濃度の投与物を0.2mL投与した。28AA投与群および28AACys投与群は各原液20μLに生理食塩液180μLを混合することで調製し投与時まで−80℃に保存した。28AA + Quil-A投与群および28AACys + Quil-A投与群は、各原液20μLに5mg/mLのQuil-Aの原液を10μL(1個体あたり50μg)および生理食塩液170μLを混合することで調製し投与時まで−80℃に保存した。28AA + MPL+TDMエマルジョン投与群および28AACys + MPL+TDMエマルジョン投与群は、各原液90μLに生理食塩液660μLを混合したものを投与前の原液として−80℃に保存し、投与直前にMPL+TDMエマルジョン原液を0.5mL加え懸濁させることで調製した(4.5個体分)。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した。マウスへの免疫は2週間隔で3回の免疫を行った。
3回目の最終免疫から7日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。算出した各免疫群におけるマウス血清中の抗Aβ抗体価を表10に示した。表10に示すように、28AAにQuil-Aを加えてもAβに対する抗体誘導はほとんど認められなかったが、MPL+TDMエマルジョン(Emulsion)を加えた場合、抗体誘導が認められた。28AACysにおいてはQuil-AおよびMPL+TDMエマルジョン共に高い抗体価を示した。また28AACys単独の抗体誘導は28AAにMPL+TDMエマルジョンを加えた場合と同程度であった。
(1)システインを付加したAβペプチドの調製
35AACys:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMC(配列番号21)
上記のペプチドを合成し(北海道システム・サイエンス社)、生理食塩液で5mg/mLに調製しこれを原液とし、原液100μLに生理食塩液900μLを加え0.5mg/mLの濃度とし1.5mLチューブに分注した(免疫物)。使用時まで−80℃以下で保存した。
ヒトのAβ前駆体蛋白質を発現させることにより、脳内にヒトAβが蓄積したアルツハイマー様病態を示すトランスジェニックマウス(TG2576、雌、11週齢、SPF)をタコニック社より購入し、SPF環境下で飼育した。
6匹のマウスを3匹ずつ2群に分け、第1群:35AACys投与群、第2群:無投与群(コントロール)とした。
各免疫物をマウス1匹あたり200μLずつ1mLツベルクリン用注射器(テルモ、SS-01T2613S)を用いた腹部皮内もしくは皮下内に投与した(1個体あたりの投与量:100μg)。マウスへの免疫は18週齢目より2週間間隔で4回投与し、その後は1ヶ月間隔で合計11回の免疫を行った。
最終免疫から13日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム(共立製薬、ソムノペンチル)麻酔下腹部大静脈より採血した。採取した血液はマイクロティナ(ベクトン ディッキンソン社)に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで−80℃にて保存した。
採血後、開頭し大脳を摘出した。前頭葉部の一部を切り出して、重量を測定しプロテネース インヒビター(ロッシュ、コンプリート プロテアーゼ インヒビター カクテル セット、50mL溶液に1錠)を含んだTBS(20mM Tris、137mM NaCl、pH7.6;以下、CP/TBSと呼ぶ)を150mg(脳の湿重量)/mLになるように加え、テフロン(登録商標)製のホモジナイザーでホモジナイズした。その後、12,000g、4℃で10分間遠心し、上清を捨て、1%TritonX-100/CP/TBSに再懸濁(上述のCP/TBS添加と同量)してボルテックスで1分間処理した。再び12,000g、4℃で10分間遠心し、上清を捨て、2%SDS/CP/TBSに再懸濁(上述のCP/TBS添加と同量)してボルテックスで1分間処理した。さらに12,000g、4℃で10分間遠心し、得られた上清を脳内沈着ヒトAβを含む試料分画として測定に用いた。
抗AβIgG抗体の測定は既述と同様に実施した。
測定はヒトβアミロイド(1-42)ELISAキットワコー(ワコー、コード番号 296-64401)を用いて行った。ヒトAβに対する抗体(BAN50)が固相化されたマイクロプレートに、50倍希釈したヒトAβを含む試料を100μL/wellにて添加した。4℃で一晩反応後、添加した各希釈試料を捨て350μL/wellの洗浄液(キットに付属)で5回洗浄した。各ウェルにHRP標識抗体(BC05)溶液を100μLずつ加え、4℃で1時間反応させた。反応後、標識抗体溶液を捨て350μL/wellの洗浄液で5回洗浄した。各ウェルにTMB溶液(発色剤)を100μLずつ加え、室温暗所で30分間反応させた。その後、停止液を100μL/well添加して酵素反応を停止させ、450nmの吸光度(OD450値)を測定した。標準曲線は付属のスタンダード溶液(ヒトβアミロイド(1-42)、20pmoL/L)を用いて作製した。試料測定時に、スタンダード希釈液で0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10pmol/mLとなるように希釈し調製した。各試料の測定と同時に、各希釈検体のOD450値を測定した。得られたスタンダードの単位とOD450値の標準直線より各試料のヒトAβ濃度を算出した。
Claims (5)
- アミロイドβペプチドまたはアミロイドβペプチドのアミノ酸配列の少なくとも1〜28番目のアミノ酸を含むアミロイドβペプチド断片に、システインが付加もしくは挿入またはシステインを含むペプチドが付加されていることを特徴とする免疫応答の増強した免疫原性ペプチドであって、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号21、配列番号23、配列番号27、配列番号29、配列番号32、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54および配列番号56からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチド。
- 請求項1に記載の免疫原性ペプチドを有効成分として含有することを特徴とするアルツハイマー病の治療薬。
- 請求項1に記載の免疫原性ペプチドを有効成分とし、さらにアジュバントを添加することを特徴とするアルツハイマー病の治療薬。
- アミロイドβペプチドまたはアミロイドβペプチドのアミノ酸配列の少なくとも1〜28番目のアミノ酸を含むアミロイドβペプチド断片にシステインが付加もしくは挿入またはシステインを含むペプチドが付加されてなる免疫応答の増強した免疫原性ペプチドであって、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号21、配列番号23、配列番号27、配列番号29、配列番号32、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54および配列番号56からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを使用することを特徴とする免疫応答増強剤。
- アミロイドβペプチドまたはアミロイドβペプチドのアミノ酸配列の少なくとも1〜28番目のアミノ酸を含むアミロイドβペプチド断片にシステインが付加もしくは挿入またはシステインを含むペプチドが付加されてなる免疫応答の増強した免疫原性ペプチドであって、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号21、配列番号23、配列番号27、配列番号29、配列番号32、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54および配列番号56からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドにアジュバントを添加して使用することを特徴とする免疫応答増強剤。
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