CN117203243A - 用于预防rsv和piv3感染的组合物和方法 - Google Patents

用于预防rsv和piv3感染的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了免疫原性嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)‑副流感病毒3型(PIV3)化合物和相关组合物，以及治疗、预防和/或诊断RSV‑和PIV3‑相关病症的方法。

Description

用于预防RSV和PIV3感染的组合物和方法
技术领域
本发明一般地涉及病毒病原体。具体地，本发明涉及治疗、预防和/或诊断呼吸道合胞病毒(RSV)-和副流感病毒3型(PIV3)-相关病症的RSV-和PIV3-免疫原性组合物和方法。
背景技术
人呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒3型(PIV3)是婴儿和儿童中急性下呼吸道感染最常见的病原体。RSV是肺病毒科(Pneumoviridae)内的正肺病毒属(Orthopneumovirus)。RSV是高度感染性的；>99％的儿童到2岁时已感染至少一次。RSV的临床表现类似健康的较大的儿童和成人中的感冒，其本身表现为鼻炎、咽喉痛和咳嗽。然而，RSV在婴儿和老年人中导致更加严重的疾病(1,2)。在婴儿中，RSV是细支气管炎和肺炎最常见的病因。尽管抗原性相当稳定，但RSV引起短期免疫应答，但不能引起长期保护应答，从而使个体在整个青春期和成年期间对再次感染敏感。在老年人中，RSV可以引起肺炎和COPD加重(3)。RSV感染鼻咽上皮细胞并且可以扩散至细支气管上皮细胞，从而导致坏死、淋巴细胞细支气管周浸润和粘膜下层水肿。然后，粘液、脱落的上皮细胞和淋巴聚集体堵塞细支气管。
副粘病毒科(Paramyxoviridae)内的人副流感病毒(hPIV)造成上下呼吸道感染(4)并且是RSV后幼小儿童中下呼吸道疾病的第二最常见的原因。尽管有关准确数目的报道不同，但是hPIV占分离自儿科患者的所有病毒的17-18％(5，6)。人副流感病毒主要攻击呼吸道中的上皮细胞。hPIV所引起的常见疾病症状包括鼻液溢(流鼻涕)、咳嗽、格鲁布性喉头炎(急性喉气管支气管炎)、细支气管炎和肺炎，并且在一些情况下，导致高至～40℃的高体温(1,6,2)。仍没有用于RSV或PIV3的有效抗病毒治疗。RSV和PIV3两者是具有单链、非节段化、负义RNA的包膜病毒。基于抗原性和基因分析，PIV已被分成4种亚型，PIV-1至-4。PIV3是PIV最致病的形式并且与婴儿和幼小儿童中显著的发病率和死亡率相关(5,7)。RSV编码两种主要表面糖蛋白，即连接(G)和融合(F)蛋白，然而PIV3编码血球凝集素-神经氨酸酶(HN)和F蛋白。RSV G和PIV3 HN蛋白通过结合至质膜上的受体引起宿主细胞中的病毒感染。RSV和PIV3 F蛋白通过病毒包膜与宿主细胞质膜的融合来辅助穿透。两种糖蛋白在这些病毒的病理发生中起关键作用，并且是中和抗体的主要靶标(7，8，9)，从而使它们成为亚单位疫苗候选。
已开发了针对RSV和PIV3的一些疫苗候选并在啮齿类和人中进行了评价，但是仍没有许可的人疫苗可用于预防这些感染(7，10，11)。由于在动物和人中的不良免疫原性，单独使用纯化的PIV3 F或HN蛋白疫苗接种不足以引起完全保护性免疫(12，13)。
最近，已提议将母体疫苗接种作为在孕妇中引起高水平病原体-特异性中和抗体的方法。将这些抗体转移到子代并在对病原体，如百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)和流感病毒敏感的时间段内为幼小婴儿提供有效的短期保护(14)。已证明母体来源的抗体被被动转移并促进对呼吸病毒症，如RSV的保护(15)。另一个示例是通过对破伤风、白喉和无细胞百日咳母体疫苗接种的临床试验，其在婴儿期显示出更高的抗体水平(16)。
发明内容
在本文中，本发明人已成功设计和鉴定了用于在亚单位疫苗组合物中使用的嵌合RSV-PIV3抗原。
因此，本发明提供了用于在人中治疗和/或预防RSV和/或PIV3感染，如肺炎或细支气管炎的RSV-PIV3亚单位组合物。亚单位疫苗，包括来源于RSV和PIV3分离株的免疫原和免疫原的混合物用于对后续感染提供保护。因此，本发明提供了商业上有用的预防和/或治疗人中RSV和/或PIV3感染的方法。
在一个实施方式中，提供了包含与选自由下列组成的组的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽的免疫原性融合蛋白：
-包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基26至979的多肽，
-包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基26至979的多肽，和
-包含SEQ ID NO：5的氨基酸残基26至979的多肽。
在另一个实施方式中，提供了免疫原性组合物，其包含：
与选自由下列组成的组的融合多肽具有至少90％的序列同一性的多肽：
-包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基26至979的多肽，
-包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基26至979的多肽，和
-包含SEQ ID NO：5的氨基酸残基26至979的多肽，
和药学上可接受的赋形剂。
在其它实施方式中，所述免疫原性组合物还包含免疫佐剂。
在其它实施方式中，所述佐剂包含：(a)聚磷腈；(b)CpG寡核苷酸或聚(I:C)；和(c)宿主防御肽。
在一个实施方式中，将所述组合物用于向人类受试者施用。
在另一个实施方式中，将所述佐剂与粘膜粘附性脂质载体一起配制以产生粘膜粘附性脂质载体系统。
在其它实施方式中，所述系统的粘膜粘附性脂质载体包含阳离子脂质体。
在其它实施方式中，所述粘膜粘附性脂质载体包含一种或多种阳离子脂质，其选自1,2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷(DOTAP)；3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基](DC)；二甲基双十八烷基铵(DDA)；十八烷基胺(SA)；二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；卵L-α-磷脂酰胆碱(EPC)；胆固醇(Chol)；二硬脂酰磷脂酰胆喊(DSPC)；1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲铵-丙烷(DMTAP)；二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)；或者神经酰胺氨基甲酰基-精胺(CCS)。
在一个实施方式中，提供了治疗或预防受试者中RSV和/或PIV3感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所描述的融合蛋白，从而治疗或预防所述受试者中的所述RSV和/或PIV3感染。
在另一个实施方式中，提供了治疗或预防受试者中RSV和/或PIV3感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所描述的免疫原性组合物，从而治疗或预防所述受试者中的所述RSV和/或PIV3感染。
在具体的实施方式中，将如本文所描述的融合蛋白或免疫原性组合物施用于人类受试者。
在另一个具体的实施方式中，肠道外、肌内、静脉内、腹膜内、皮下、口服、鼻内或者作为气溶胶施用如本文所描述的免疫原性组合物。
在另一个实施方式中，提供了如本文所描述的免疫原性组合物，其中所述聚磷腈是以下中的一种或多种：聚[二(钠羧基合苯氧基)磷腈](PCPP)、聚(二-4-氧代苯基丙酸酯)磷腈(PCEP)、化合物37：
或化合物39：
在具体的实施方式中，所述聚磷腈是化合物37。
在另一个具体的实施方式中，所述聚磷腈是化合物39。
考虑到本文中的公开内容，本领域技术人员将容易地想到本发明的这些及其它实施方式。
附图说明
根据其中参考了附图的以下描述，本发明的这些及其它特征将变得更加显而易见，其中：
图1显示了通过SDS-PAGE在非还原条件下分析的纯化的重组蛋白tFrSc6-HN。泳道1，5μL；泳道2，2.5μL。箭头表示标志物245、190、135、100、80和58kDa的迁移。
图2显示了如通过ELISA所确定的，在小鼠试验No.1中，在RSV攻毒前所采集的血清样品的抗体滴度。用空疫苗(PBS)或者三种TriAdj-佐剂化疫苗，tFrSc6-HN+PCEP-TriAdj、tFrSc6-HN+CPZ37-TriAdj和tFrSc6-HN+CPZ39-TriAdj之一免疫两次的5只小鼠的组。图2A显示了IgG1滴度，并且图2B显示了IgG2a滴度。显示了单个值以及具有四分位距的中值。*P<0.05；**P<0.01。
图3显示了小鼠试验No.1中，在尸检时所采集的血清中所确定的RSV(A)和PIV3(B)-中和抗体滴度。将病毒中和滴度(“VN滴度”)表示为导致<50％的细胞显示出细胞病变效应的最高血清稀释。显示了单个值以及具有四分位距的中值。*P<0.05；**P<0.01。
图4显示了来自小鼠试验1的每百万个脾细胞的IFN-γ(A)-分泌和IL-5(B)-分泌T细胞。将细胞因子-分泌细胞数表示为tFrSc6-HN-刺激的孔与培养基-对照孔之间斑点数的差异。显示了单个值以及具有四分位距的中值。*P<0.05；**P<0.01。
图5显示了在小鼠试验no.1中，在RSV攻毒后确定的肺中的病毒复制。将肺中的病毒复制表示为PFU/克肺组织。显示了单个值以及具有四分位距的中值。
图6显示了通过ELISA所确定的，在小鼠试验No.2中，在RSV攻毒后4天所采集的血清样品的抗体滴度。用空疫苗(PBS)、4种TriAdj-佐剂化疫苗，tFrSc6-HN+PCEP-TriAdj、tFrSc6-HN+CPZ37-TriAdj和tFrSc6-HN+CPZ39-TriAdj或者用tFrSc6-HN+氢氧化铝(“alum”)之一免疫两次的5只小鼠的组。图5A显示了IgG1滴度，并且图5B显示了IgG2a滴度。显示了单个值以及具有四分位距的中值。*P<0.05；**P<0.01。
图7显示了小鼠试验No.2中，在尸检时所采集的血清中所确定的RSV(A)和PIV3(B)-中和抗体滴度。将病毒中和滴度(“VN滴度”)表示为导致<50％的细胞显示出细胞病变效应的最高血清稀释。显示了单个值以及具有四分位距的中值。*P<0.05；**P<0.01。
图8显示了在小鼠试验No.2中，在RSV攻毒后确定的肺中的病毒复制。将肺中的病毒复制表示为PFU/克肺组织。显示了单个值以及具有四分位距的中值。
图9显示了小鼠试验No.2中，在尸检时所采集的肺匀浆中的IFN-γ(A)和IL-5(B)的产生。显示了单个值以及具有四分位距的中值。
图10显示了通过ELISA所确定的，在棉鼠试验No.1中，在RSV攻毒后4天所采集的血清样品的抗体滴度。用空疫苗(PBS)、4种TriAdj-佐剂化疫苗，tFrSc6-HN+PCEP-TriAdj、tFrSc6-HN+CPZ37-TriAdj和tFrSc6-HN+A+B-TriAdj或者用tFrSc6-HN+氢氧化铝(“alum”)之一免疫两次的6只棉鼠的组。显示了单个值以及具有四分位距的中值。
图11显示了棉鼠试验No.1中，在尸检时所采集的血清中所确定的RSV(A)和PIV3(B)-中和抗体滴度。将病毒中和滴度(“VN滴度”)表示为导致<50％的细胞显示出细胞病变效应的最高血清稀释。显示了单个值以及具有四分位距的中值。
图12显示了在棉鼠试验No.3中，在RSV攻毒后所确定的肺(A)和洗鼻液(B)中的病毒复制。将肺中的病毒复制表示为PFU/克肺组织和PFU/ml洗鼻液。显示了单个值以及具有四分位距的中值。
具体实施方式
对于优选实施方式的下列描述仅是举例说明并且不限制实施本发明所必需的特征组合。
除非另外说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的病毒学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。在文献中全面解释了这些技术。参见，例如，Fundamental Virology,当前版本,I&II卷(B.N.Fields及D.M.Knipe主编)；Handbook ofExperimental Immunology,I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell主编,BlackwellScientific Publications)；T.E.Creighton,Proteins:Structures and MolecularProperties(W.H.Freeman and Company)；A.L.Lehninger,Biochemistry(WorthPublishers,Inc.,当前版本)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(当前版本)；Methods In Enzymology(S.Colowick及N.Kaplan主编,Academic Press,Inc.)。
本文引用(无论是上文还是下文)的所有出版物、专利和专利申请均以其全部内容作为参考并入本文。
在整个正文中使用了以下氨基酸缩写：
丙氨酸：Ala(A) 精氨酸：Arg(R)
天门冬酰胺：Asn(N) 门冬氨酸：Asp(D)
半胱氨酸：Cys(C) 谷氨酰胺：Gln(Q)
谷氨酸：Glu(E) 甘氨酸：Gly(G)
组氨酸：His(H) 异亮氨酸：Ile(I)
亮氨酸：Leu(L) 赖氨酸：Lys(K)
蛋氨酸：Met(M) 苯丙氨酸：Phe(F)
脯氨酸：Pro(P) 丝氨酸：Ser(S)
苏氨酸：Thr(T) 色氨酸：Trp(W)
酪氨酸：Tyr(Y) 缬氨酸：Val(V)
1.定义
在本发明的描述中，将使用以下术语，并且旨在如下所示定义这些术语。
必须指出除非上下文另外明确指明，否则如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式的“一个”和“所述”包括多个对象。因此，例如，对“抗原”的提及包括两种或更多种这些抗原的混合物等。
RSV是肺病毒科(Pneumoviridae)内的正肺病毒属(Orthopneumovirus)并且导致一些病症，如本文进一步描述的。RSV感染鼻咽上皮细胞，并且然后可以传播至细支气管上皮细胞。这导致坏死以及随后的淋巴细胞细支气管周浸润和粘膜下层水肿。RSV感染鼻咽上皮细胞并且可以扩散至细支气管上皮细胞，从而导致坏死、淋巴细胞细支气管周浸润和粘膜下层水肿。最终，大面积的粘液栓提高了呼气阻力，并且部分气道阻塞导致气喘、肺不张和过度充气。
RSV是高度感染性的并且占儿童中>60％以及<1岁的婴儿中>80％的急性下呼吸道感染(LRTI)；这使得RSV成为最常见的儿科细支气管炎和肺炎的病因(2)。在2岁前，几乎所有儿童感染过至少一次，并且接近一半的儿童感染过两次(17)。RSV的临床表现类似健康的较大的儿童和成人中的感冒，其本身表现为鼻炎、咽喉痛和咳嗽。然而，RSV在婴儿和老年人中导致更加严重的疾病(1,2)。在婴儿中，RSV是细支气管炎和肺炎最常见的病因。当母体抗体(MatAb)开始减少时，由RSV所引起的疾病在2至3个月大的儿童中特别严重(18)。在早产儿和患有慢性肺病或先天性心脏病的婴儿中，发病和死亡是最普遍的(19)。全世界每年有1:200的婴儿因LRTI住院，死亡率～5％，其折合大于1百万的死亡(19，20)。哮喘发病率的升高与更严重的LRTI有关。尽管抗原性相当稳定，但RSV引起短期免疫应答，但不能引起长期保护应答，从而使个体在整个青春期和成年期间对再次感染敏感(3)。在老年人中，RSV可以引起肺炎和COPD加重(3)。
术语RSV旨在是能够导致疾病的生物的任何亚种、株或分离株。
PIV3是副粘病毒科(Paramyxoviridae)内的呼吸道病毒属(Respirovirus)并且导致一些相关病症，如本文进一步描述的。术语PIV3旨在是能够导致疾病的生物的任何亚种、株或分离株。人副流感病毒是继呼吸道合胞病毒(RSV)后幼小儿童中下呼吸道感染的第二最常见的原因(4)。尽管有关准确数目的报道不同，但是PIV占分离自儿科患者的所有病毒的17-18％(5，6)。人副流感病毒主要攻击呼吸道中的上皮细胞。PIV所引起的常见疾病症状包括鼻液溢(流鼻涕)、咳嗽、格鲁布性喉头炎(急性喉气管支气管炎)、细支气管炎和肺炎，并且在一些情况下，导致高至～40℃的高体温(4)。PIV属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，具有两个属：呼吸道病毒属(Respirovirus，PIV 1和3)和腮腺炎病毒属(Rubulavirus，PIV 2和4)。通过全部4类PIV引起细支气管炎和肺炎，但是更多的病例与hPIV 1和3有关。在20年研究期间，PIV1、PIV2和PIV3分别导致了婴儿和儿童住院治疗的6.0、3.2和11％(21)。PIV还与急性和慢性神经学疾病，包括热性惊厥、脑炎、脑室炎和丛集性头痛有关。在婴儿中，在一些罕见病例中还报道了由于hPIV感染所造成的其它病况，如呼吸暂停和心动过缓的发展，并且大部分死亡是在婴儿中。像RSV一样，PIV3感染最早且最频繁发生在<6个月大的婴儿中；在美国，50％的1-岁大的儿童和几乎所有6-岁大的儿童均感染过PIV3。
术语PIV3旨在是能够导致疾病的生物的任何亚种、株或分离株。
术语“来源于”在本文中用于鉴别分子的原始来源，但是不意味着限制制备所述分子的方法，所述分子可以(例如)通过化学合成或重组方式制备。
“RSV分子”是来源于病毒的分子，其无限制地包括来自多种RSV亚种、株或分离株中的任一种的多肽、蛋白、抗原、多核苷酸、寡核苷酸和核酸分子。“PIV3分子”是来源于病毒的分子，其无限制地包括来自多种PIV3亚种、株或分离株中的任一种的多肽、蛋白、抗原、多核苷酸、寡核苷酸和核酸分子。“RSV-PIV3分子”是包含来源于RSV和PIV3两者的组分的嵌合(即融合)分子，其无限制地包括来自多种RSV和PIV3亚种、株或分离株中的任一种的多肽、抗原、多核苷酸、寡核苷酸和核酸分子。所述分子无需物理来源于所讨论的特定病毒，但是可以合成或重组产生。
来自一些RSV和PIV3分离株的核酸和多肽序列是已知的和/或在本文中进行了描述。在本文中，表2和3提供了用于治疗和/或预防RSV和/或PIV3感染的代表性RSV-PIV3蛋白和编码所述蛋白的多核苷酸。在来自多种哺乳动物的分离株中发现的其它代表性序列综述于Mansi等人,2019(“A Contemporary View of Respiratory Syncytial Virus(RSV)Biology and Strain-Specific Differences”)并且列于国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)数据库(22)。
然而，如本文所定义的，“RSV-PIV3分子”，如抗原不局限于表2、3和图1-5中所示和所述的那些，因为多种RSV和PIV3分离株是已知的并且在它们之间可能发生序列变化。因此，如本文所定义的“RSV-PIV3分子”旨在是包含来自RSV分离株或株的F蛋白组分和来自PIV3分离株或株的HN蛋白组分的嵌合分子。考虑了来自RSV A株和RSV B株两者的组分(22)。
“RSV疾病”或“RSV病症”表示完全或部分由RSV感染引起的疾病或病症。如本文所解释的，RSV侵袭呼吸道以导致疾病的病理发生。因此，该术语旨在是临床和亚临床疾病两者。RSV的临床症状包括鼻液溢(流鼻涕)、咽喉痛、咳嗽、格鲁布性喉头炎(急性喉气管支气管炎)、发热、细支气管炎和肺炎，并且在非常幼小的婴儿中，有时包括气喘、紫绀、呼吸急促、心动过速和/或呼吸喘鸣。
“PIV3疾病”或“PIV3病症”表示完全或部分由PIV3感染引起的疾病或病症。如本文所解释的，PIV3侵袭呼吸道以导致疾病的病理发生。因此，该术语旨在是临床和亚临床疾病两者。尽管成人通常患有轻微上呼吸道感染，但是副流感病毒可以在儿童中引起格鲁布性喉头炎、支气管炎、咽炎和肺炎。副流感肺炎的症状可以包括发热、咳嗽、鼻炎、气喘、啰音或喘鸣。术语“多肽”和“蛋白质”表示氨基酸残基的聚合物，并且不局限于产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等包括在该定义内。该定义涵盖了全长蛋白及其片段两者。这些术语还包括所述多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指包括对天然序列的修饰，如缺失、添加或替换的蛋白质，只要所述蛋白质维持所期望的活性。这些修饰可以是故意的，如通过定点突变，或者可以是偶然的，如通过产生所述蛋白的宿主的突变或者由于PCR扩增所造成的错误。
如本文所使用的术语“肽”是指多肽片段。因此，肽可以包括天然多肽的C-末端缺失、N末端缺失和/或内部缺失，只要整个蛋白序列不存在。肽通常将包括全长分子的至少约3-10个邻接氨基酸残基，并且可以包括全长分子的至少约15-25个邻接氨基酸残基，或者全长分子的至少约20-50个或更多个邻接氨基酸残基，或者3个氨基酸至全长序列中氨基酸数目之间的任何整数，只要所讨论的肽保留了引起所期望的生物反应的能力。
“免疫原性”蛋白、多肽或肽表示包括一个或多个表位并因此可以调节免疫应答的分子。可以使用多种在本领域中熟知的表位定位技术鉴别这些肽。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology(2018)(Johan Rockberg andJohan Nilvebrant,主编)Springer,New York。例如，可以通过(例如)软件程序(参见，例如，Saha等人,Structure,Function,and Bioinformatics(2006)65:40-48)确定线性表位；或者通过在固体载体上同时合成大量的肽，所述肽对应于部分蛋白质分子，并且将所述肽与抗体反应，同时所述肽仍连接至载体。类似地，如通过(例如)X射线晶体学和2-维核磁共振，通过确定氨基酸的空间构象，容易地识别了构象表位。参见，例如，Epitope MappingProtocols，如上。还可以使用标准抗原性和亲水性图识别蛋白质的抗原性区域，所述抗原性和亲水性图如使用(例如)得自Oxford Molecular Group的Omiga软件程序计算的那些。这种计算机程序使用Hopp/Woods法，Hopp等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA(1981)78:3824-3828确定抗原性谱，并且使用Kyte-Doolittle技术，Kyte等人,J.Mol.Biol.(1982)157:105-132获得亲水性图。
出于本发明的目的，免疫原性分子通常将为至少约5个氨基酸长，如(例如)约10至约15个或更多个氨基酸长。对于所述分子的长度无临界上限，其可以包含蛋白质序列的全长或甚至包含两个或更多个表位、蛋白质、抗原等的融合蛋白。
如本文所使用的，术语“表位”一般是指T细胞受体和/或抗体所识别的抗原上的位点。可以通过单一抗原性分子携带几个不同的表位。术语“表位”还包括刺激针对整个生物的应答的修饰的氨基酸序列。可以根据对于氨基酸和多肽的相应DNA序列的认识以及根据特定氨基酸的性质(例如，大小、电荷等)和密码子词典产生表位，而无需过度实验。参见，例如，Ivan Roitt,Essential Immunology；Janis Kuby,Immunology。
对抗原或组合物的“免疫应答”是在受试者中对所关心的组合物中存在的抗原的体液和/或细胞免疫应答的出现。出于本发明的目的，“体液免疫应答”是指通过抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是通过T-淋巴细胞和/或其它白血球介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面包括通过细胞毒T细胞(“CTL”)的抗原-特异性应答。CTL对于结合主要组织相容性复合体(MHC)所编码的并且在细胞表面上表达的蛋白存在的肽抗原具有特异性。CTL帮助引起和促进胞内微生物的破坏或者感染这些微生物的细胞的溶胞。细胞免疫的另一个方面包括通过辅助性T细胞的抗原-特异性应答。辅助性T细胞起作用以帮助刺激非特异性效应细胞针对显示出结合它们表面上的MHC分子的肽抗原的细胞的功能并集中活性。“细胞免疫应答”还表示通过激活的T细胞和/或其它白血球，包括来源于CD4+和CD8+T细胞的那些所产生的细胞因子、趋化因子及其它这些分子的产生。
因此，如本文所使用的免疫应答可以是刺激抗体产生的免疫应答。所关心的抗原还可以引起CTL的产生。因此，免疫应答可以包括以下作用中的一种或多种：通过B细胞的抗体产生；和/或特异性针对所关心的组合物或疫苗中存在的一种或多种抗原的抑制T细胞和/或基因/效应T细胞的激活。这些应答可以用于中和感染性，和/或介导抗体-补体，或者抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以向免疫宿主提供保护。可以使用在本领域中熟知的标准免疫测定和中和测定，如(但不限于)本文实施例中所述的那些来确定这些应答。
哺乳动物的先天性免疫系统也经由免疫细胞上的Toll-样受体和类似受体分子的激活识别致病生物的分子特征并对其应答。一旦先天性免疫系统激活，则多种非适应性免疫应答细胞激活，例如，以产生多种细胞因子、淋巴因子和趋化因子。通过先天性免疫应答激活的细胞包括单核细胞和类浆细胞谱系的未成熟和成熟的树突状细胞(MDC、PDC)以及γ、δ、α和βT细胞和B细胞等。因此，本发明还考虑了免疫应答，其中所述免疫应答包括先天性应答和适应性应答两者。
“免疫原性组合物”是包含免疫原性分子的组合物，其中所述组合物向受试者的施用导致受试者中对所关心的分子的体液和/或细胞免疫应答的出现。
“抗原”是指含有将刺激宿主免疫系统产生体液和/或细胞抗原-特异性应答的一个或多个表位(线性、构象或两者)的分子，如蛋白、多肽或其片段。该术语与术语“免疫原”是可互换使用的。在如本文所使用的抗原的定义下，还包括抗体，如抗-独特型抗体或其片段和可以模拟抗原或抗原决定簇的合成肽模拟表位(mimotope)。类似地，体内，如在DNA免疫应用中，表达抗原或抗原决定簇的寡核苷酸或多核苷酸也包括在本文的抗原的定义中。
“亚单位疫苗”表示包含一个或多个所选抗原，但不包括所有抗原的疫苗组合物，所述抗原来源于来自所关心的病原体的抗原或者与之同源。这种组合物基本不含完整的病原体细胞或致病性颗粒，或者这些细胞或颗粒的裂解物。因此，可以从来自病原体的至少部分纯化的(优选地基本纯化的)免疫原性分子或其类似物制备“亚单位疫苗”。因此，获得亚单位疫苗中所包括的抗原的方法可以包括标准纯化技术、重组产生或合成产生。
“基本纯化的”一般是指物质的分离，从而所述物质占它所存在的样品的较大百分比。通常，在样品中，基本纯化的组分占样品的至少50％，优选地至少80％-85％，并且甚至更优选地至少90％。用于纯化所关心的分子的技术在本领域中是熟知的并且包括(例如)离子交换色谱、亲合色谱和根据密度的沉降。
“分离的”表示所指明的分子与该分子在自然界中与之一起存在的整个生物分离且分开，或者以基本不存在相同类型的其它生物大分子存在。
“抗体”旨在是“识别”，即特异性结合至抗原中存在的所关心的表位的分子。与在抗体和(例如)包含所述抗体与之反应的测试物质的混合物中的组合之间可能发生的非特异性结合相反，“特异性结合”表示抗体以“锁钥”型相互作用与表位相互作用以在抗原和抗体之间形成复合物。如本文所使用的术语“抗体”包括得自多克隆和单克隆制备两者的抗体，以及下列：杂交(嵌合)抗体分子；F(ab')2和F(ab)片段；Fv分子(非共价异源二聚体；单链Fv分子(sfv)；二聚和三聚抗体片段构建体；微抗体；人源化抗体分子；和得自这些分子的任何功能性片段，其中这些片段保留了亲代抗体分子的免疫结合性质。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指具有同源性抗体群的抗体组合物。该术语对于抗体的种类和来源未进行限制，并且它也不意欲受它的制备方式的限制。该术语涵盖了显示出亲代单克隆抗体分子的免疫结合性质的完整免疫球蛋白和片段，如Fab、F(ab')2、Fv及其它片段，以及嵌合和人源化同源性抗体群。
“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的同一性百分比。当序列在所述分子的限定长度上显示出至少约50％的序列同一性，优选地至少约75％的序列同一性，更优选地至少约80％-85％的序列同一性，更优选地至少约90％的序列同一性并且最优选地至少约95％-99％的序列同一性时，两个核酸或两条多肽序列彼此是“基本同源的”。如本文所使用的，基本同源的还是指与所指明的序列显示出完全同一性的序列。
通常,“同一性”分别是指两条多核苷酸或多肽序列的准确的核苷酸与核苷酸或者氨基酸与氨基酸的对应性。可以通过两个分子之间序列信息的直接比较，通过序列比对，对两条比对序列之间确切的匹配数计数，除以较短序列的长度并将结果乘以100，确定同一性百分比。易于获得的计算机程序可以用于帮助分析。用于确定两条或更多条氨基酸或核苷酸序列之间相似性的计算机程序的列表，参见，例如，molbiol-tools.ca/alignments。使用生产商建议的缺省参数，这些程序是易于使用的。例如，可以以缺省记分表和6个核苷酸位置的空位罚分，使用Smith-Waterman同源性算法确定特定核苷酸序列与参考序列的同一性百分比。
在本发明的背景中，建立同一性百分比的另一种方法是使用由University ofEdinburgh版权所有，由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发并且由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)经销的MPSRCH程序软件包。根据该软件包套装，可以使用Smith-Waterman算法，其中将缺省参数用于记分表(例如，空位开放罚分为12，空位延伸罚分为1并且空位为6)。从所产生的数据，“匹配”值反映了“序列同一性”。其它适合于计算序列间同一性或相似性百分比的程序通常是本领域中已知的，例如，另一种比对程序为以缺省参数使用的BLAST。例如，使用以下缺省参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；预期值＝10；Matrix＝BLOSUM62；描述＝50条序列；排序依据＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR，可以使用BLASTN和BLASTP。这些程序的详细信息是易于获得的。
作为另外一种选择，可以通过以下方式确定同源性：在同源区域之间形成稳定双螺旋的条件下多核苷酸杂交，然后用单链-特异性核酸酶消化并确定消化片段的尺寸。可以在(例如)如对该特定系统所定义的严格条件下，在Southern杂交实验中鉴别基本同源的DNA序列。定义适当杂交条件在本领域的技术范围内。参见，例如，Sambrook等人,MolecularCloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中用于包括任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。该术语仅表示分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链DNA、以及三链、双链和单链RNA。它还包括多核苷酸的修饰，如通过甲基化和/或通过封端修饰，和未修饰形式。更具体地，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)、作为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的多核苷酸的任何其它类型和含有非核苷酸主链的其它聚合物，例如，聚酰胺(例如，肽核酸(PNA))和聚吗啉代(作为Neugene可商购自Anti-Virals,Inc.,Corvallis,Oregon)聚合物和其它合成序列特异性核酸聚合物，只要所述聚合物在允许碱基配对和碱基堆积的构造中含有核碱基，如DNA和RNA中存在的。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”之间在长度上无预期区别，并且将可互换地使用这些术语。因此，这些术语包括(例如)3'-脱氧-2',5'-DNA、寡脱氧核苷酸N3'P5'氨基磷酸酯、2'-O-烷基-取代的RNA、双链和单链DNA以及双链和单链RNA、DNA:RNA杂交体以及PNA和DNA或RNA之间的杂交体，并且还包括已知类型的修饰，例如，在本领域中已知的标记、甲基化、“帽”、一个或多个天然存在的核苷酸被类似物的替换、核苷酸间修饰，如(例如)具有不带电的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、具有带负电的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)和具有带正电的键(例如，氨基烷基磷酰胺、氨基烷基磷酸三酯)的那些、含有侧部分的那些，如(例如)蛋白质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些、含有烷化剂的那些、具有修饰的键(例如，α异头核酸等)的那些以及多核苷酸或寡核苷酸的未修饰形式。具体地，DNA为脱氧核糖核酸。
如本文用于描述核酸分子的“重组”表示基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，根据其来源或操作，其不与它在自然界中所结合的多核苷酸的全部或部分相结合。如相对于蛋白质或多肽所使用的术语“重组”表示通过重组多核苷酸的表达所产生的多肽。通常，克隆所关心的基因，然后在转化生物中表达，如以下进一步所描述的。宿主生物表达外源基因以在表达条件下产生蛋白质。
“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和表示作为单细胞实体培养的微生物或高等真核细胞系的其它这些术语是指可以或已用作重组载体或其它转化DNA的受体的细胞并且包括已转染的原始细胞的原始子代。
“编码”所选多肽的“编码序列”或序列是当置于适当调控序列(或“控制元件”)的控制之下时，体外或体内转录(就DNA来说)并翻译(就mRNA来说)为多肽的核酸分子。可以通过5'(氨基)末端处的起始密码子和3'(羧基)末端处的翻译终止密码子确定编码序列的边界。编码序列可以包括(但不限于)来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA、来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列和甚至合成DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3'。
典型的“控制元件”包括(但不限于)转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、多腺苷酸化序列(定位在翻译终止密码子的3')、用于优化翻译起始的序列(定位在编码序列的5')和翻译终止序列。
“可操作性地连接的”是指其中所述组件配置以发挥它们的常规功能的元件布置。因此，当存在适当的酶时，可操作性地连接至编码序列的给定启动子能够实现编码序列的表达。启动子不需要与编码序列邻接，只要它起作用以指导其表达。因此，例如，间插的未翻译但转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，并且启动子序列仍可以被认为是“可操作性地连接”至编码序列。
“表达盒”或“表达构建体”是指能够指导所关心的序列或基因的表达的组件。表达盒通常包括如以上所描述的控制元件，如可操作性地连接至所关心的序列或基因(以指导所述序列或基因的转录)的启动子，并且通常还包括多腺苷酸化序列。在本发明的某些实施方式内，本文所描述的表达盒可以包含在质粒构建体内。除表达盒的组件外，质粒构建体还可以包括一个或多个可选择标志物、允许质粒构建体作为单链DNA存在的信号(例如，M13复制起点)、至少一个多克隆位点和“哺乳动物”复制起点(例如，SV40或腺病毒复制起点)。
术语“转化”用于表示通过细胞对外源DNA的吸收。当外源DNA已引入到细胞膜内部时，细胞已被“转化”。一些转化技术是本领域中通常已知的。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,NewYork；Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier。这些技术可以用于将一个或多个外源DNA部分引入适合的宿主细胞。该术语是指基因材料的稳定和瞬时吸收两者，并且包括肽-或抗体-连接的DNA的吸收。
“载体”能够将核酸序列输送至靶细胞(例如，病毒载体、非病毒载体、颗粒载体和脂质体)。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”表示能够指导所关心的核酸的表达并且可以将核酸序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达媒介物以及病毒载体。
“基因转移”或“基因递送”是指将所关心的DNA或RNA可靠地插入到宿主细胞中的方法或系统。这些方法可以导致非整合的转移DNA的瞬时表达、转移复制子(例如，附加体)的染色体外复制和表达或者转移基因材料向宿主细胞的基因组DNA中的整合。基因递送表达载体包括(但不限于)来源于细菌质粒载体、病毒载体、非病毒载体、辛德毕斯病毒、痘病毒和牛痘病毒的载体。当用于免疫时，这些基因递送表达载体可以被称为疫苗或疫苗载体。
在本文所描述的免疫原性组合物的背景中，“治疗有效量”表示将引起如本文所描述的用于抗体生产或者用于感染的治疗或预防的免疫应答的免疫原的量。
如本文所使用的，“治疗”无限制地表示以下中的任一种：(i)感染或再感染的预防，如在常规疫苗中，和/或(ii)从感染个体减少或消除症状。可以预防性(感染之前)或者治疗性(感染之后)实施治疗。另外，在本发明的背景中，预防或治疗可以是在所治疗的受试者中存在的RSV和/或PIV3病毒的量的减小。
2.实施本发明的方式
在详细描述本发明之前，应理解本发明不局限于特定制剂或过程参数，并且照此，当然可以改变。还应理解本文所使用的术语仅出于描述本发明的具体实施方式的目的，并且其不意欲进行限制。
尽管可以在本发明的实践中使用与本文所描述的那些类似或等价的一些方法和材料，但是本文描述了优选的材料和方法。
本发明部分基于以下发现：免疫原性嵌合RSV-PIV3分子和它们在抗RSV和PIV3的亚单位疫苗中的有用性。考虑了本发明所述的RSV-PIV3分子和组合物以提供针对RSV A和B株两者以及PIV3株的保护。这些分子包括用于在所关心的受试者中刺激免疫应答的一个或多个表位。作为融合蛋白提供所述分子。可以将本发明所述的嵌合抗原引入药物组合物，如疫苗组合物。如示例中所示，来自用包括RSV和PIV3重组蛋白的亚单位疫苗组合物免疫的动物的血清含有病毒中和抗体。通过RSV攻毒，在接种疫苗的小鼠中未检测到病毒，因此表明这些中和抗体预防RSV。
因此，本发明提供了用于治疗和/或预防RSV和PIV3疾病的免疫组合物和方法。可以通过本领域中已知的任何方法实现免疫，所述方法包括(但不限于)含有RSV和PIV3抗原或者包含多种抗原的融合蛋白的疫苗的使用，或者可以通过使用抗所述抗原的抗体的被动免疫实现免疫。以下详细描述了这些方法。此外，本文所描述的抗原可以用于检测(例如)生物样品中RSV-或PIV3-特异性抗体的存在。
为了进一步理解本发明，对于嵌合RSV-PIV3抗原、其产生、包含它们的组合物和在感染的治疗和/或预防以及感染的诊断中使用这些组合物的方法，以下提供了更详细的讨论。
A.RSV和PIV3抗原
用于在主题组合物中使用的抗原组分可以来源于几种RSV和PIV3株和分离株中的任一种。
表2和表3显示了用于在刺激针对RSV和PIV3的免疫应答的组合物中使用的代表性嵌合RSV-PIV3分子。据发现表2和表3中所列的分子是免疫原性和保护性的，如实施例中所述。
在优选的实施方式中，所述组合物包含如表2和3所列的RSV-PIV3抗原中的至少一种。此外，还考虑存在于所述组合物中的抗原可以包括上述RSV-PIV3抗原的全长氨基酸序列或者这些序列的片段或变体，只要所述抗原刺激免疫应答，优选地，中和和/或保护性免疫应答。因此，可以提供具有不破坏免疫原性的来自N末端或C末端的缺失的抗原，所述缺失无限制地包括N末端蛋氨酸缺失(如果存在)、跨膜结构域的全部或部分缺失(如果存在)、胞质结构域的全部或部分缺失(如果存在)和天然信号序列的缺失(如果存在)。另外，所述分子可以包括与免疫原性无关的氨基酸或序列的其它N末端、C-末端和内部缺失。此外，所述分子可以包括添加，如，如果需要异源信号序列，以及氨基酸接头和/或在蛋白纯化中有用的配体，如组氨酸标签、c-Myc标签、FLAG标签、V5标签、HA标签、谷胱甘肽-S-转移酶或葡萄球菌蛋白A的存在。
以下详细描述了并且在表2和表3中显示了代表性融合蛋白。应理解由于RSV和PIV3的一些株和分离株是已知的，本发明不局限于这些代表性蛋白的使用，并且考虑了来自这些株和分离株的相应RSV F和PIV3 HN蛋白质在类似融合蛋白中的使用并且旨在在本文中记录所述使用。
如上所述，表2和3所列的融合蛋白中的任一种及其变体，如与之具有基本序列同一性的蛋白，例如，在所述分子的限定长度上，显示出至少约50％序列同一性，如至少约75％序列同一性，例如，至少约80％或85％序列同一性，例如至少约90％序列同一性，如至少约95％或99％序列同一性或更大的序列同一性，或者这些值内的任何整数的序列同一性的序列将在本文中获得使用。另外，来自RSV和/或PIV的不同株或分离株的相应RSV F和PIV3 HN抗原可以用于产生本文所描述的免疫原性组合物的融合蛋白，以提供针对广泛RSV和PIV3株的保护。
可以通过间臂将存在于所述融合蛋白中的抗原序列隔开。所选的间臂序列可以编码一个或多个氨基酸长的多个部分。所选的间臂基团还可以提供酶切位点，从而可以通过蛋白水解酶体内加工所表达的嵌合体以获得一些肽。
例如，氨基酸可以用作间臂序列。这些间臂通常将包括1-500个氨基酸，如1-100个氨基酸，例如，1-50个氨基酸，如1-25个氨基酸、1-10个氨基酸、1-3、1-4、1-5、1-6个氨基酸或者1-500之间的任何整数个氨基酸。在多种抗原之间，所述间臂氨基酸可以是相同或不同的。用作间臂的特别优选的氨基酸是具有小侧基的氨基酸，如丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸、氨基酸的不同组合或者相同氨基酸的重复。例如，包括特定氨基酸或氨基酸的组合，如甘氨酸或者甘氨酸-丝氨酸等的接头序列可以包括这些重复的2,3、4、5、6、7、8、9、10…20…25…30个等。
尽管在本文中举例说明了包括间臂序列的具体的融合蛋白，但是还将理解融合构建体中存在的一个或多个抗原可以与另一个抗原直接相邻，而无中间间臂序列。
为了增强多个抗原分子的RSV-PIV3融合蛋白的免疫原性，它们可以与载体缀合。“缀合的”表示所关心的蛋白和融合蛋白可以经由非共价相互作用，如通过静电作用力，或者通过共价键等连接至载体。因此，可以经由重组产生将所述载体连接至所关心的蛋白，或者可以在生产之后或者在生产期间将所述蛋白合成或化学连接至载体。“载体”表示当与所关心的抗原结合时，赋予所述抗原免疫原性的任何分子。适合的载体的示例包括大的、缓慢代谢的大分子，如：蛋白质；多糖，如琼脂糖(sepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素、纤维素珠等；聚合氨基酸，如聚谷氨酸、聚赖氨酸等；氨基酸共聚物；无活性的病毒颗粒；细菌毒素，如破伤风类毒素、血清白蛋白、钥孔血蓝素、甲状球蛋白、卵清蛋白、抹香鲸肌红蛋白以及本领域技术人员熟知的其它蛋白。可以使用其它适合于本发明的抗原的载体并且所述载体将是本领域技术人员已知的。
这些载体可以以它们的天然形式使用或者可以通过(例如)赖氨酸残基的琥珀酰化或者与Cys-硫代内酯的反应修饰它们的官能团含量。还可以通过(例如)氨基官能性与2-亚氨基硫烷或者3-(4-二硫代吡啶基丙酸酯的N-羟基琥珀酰亚胺酯的反应将巯基引入载体(或抗原)。还可以修饰适合的载体以引入用于肽的连接的间臂(如己二胺或具有类似尺寸的其它双官能分子)。
如以上所解释的，可以使用标准偶联反应将载体物理缀合至所关心的蛋白。作为另外一种选择，可以重组制备用于在本发明中使用的嵌合分子，如通过将编码适合的多肽载体的基因融合至编码所选的RSV和PIV3多个抗原融合分子的基因或其片段的一个或多个拷贝。
优选地，重组产生上述抗原和融合蛋白。可以将编码这些蛋白的多核苷酸引入可以在适合的表达系统中表达的表达载体。多种细菌、酵母、哺乳动物和昆虫表达系统在本领域中是可用的并且可以使用任何这种表达系统。任选地，可以在无细胞翻译系统中翻译编码这些蛋白的多核苷酸。这些方法在本领域中是熟知的。还可以通过固相蛋白合成构建所述蛋白质。
还考虑本发明的融合蛋白或者这些蛋白的单个组分可以含或可以不含其它天然或异源的氨基酸序列，如氨基酸接头或信号序列，以及在蛋白纯化中有用的配体，如谷胱甘肽S转移酶和葡萄球菌蛋白A。
B.RSV-PIV3多核苷酸
编码用于在主题组合物中使用的嵌合RSV-PIV3抗原的RSV-PIV3多核苷酸可以来源于任何RSV和PIV3株或分离株。
表3显示了编码RSV-PIV3抗原的代表性多核苷酸序列。可以对于在特定宿主细胞，如杆状病毒中的表达修饰所述多核苷酸。
编码RSV-PIV3嵌合抗原的多核苷酸序列将编码全长氨基酸序列或者这些序列的片段或变体，只要所得抗原刺激免疫应答，优选地，保护性免疫应答。因此，所述多核苷酸可以编码如以上所描述的具有缺失或添加的抗原。
一旦分离或合成了所期望的抗原的编码序列，则可以将它们克隆到任何适合于表达的载体或复制子中。多种克隆载体是本领域技术人员已知的，并且适当克隆载体的选择是选择问题。多种细菌、酵母、植物、哺乳动物和昆虫表达系统在本领域中是可用的并且可以使用任何这种表达系统。任选地，可以在无细胞翻译系统中翻译编码这些蛋白的多核苷酸。这些方法在本领域中是熟知的。
用于克隆的重组DNA载体以及它们可以转化的宿主细胞的示例包括噬菌体((大肠杆菌(E.coli))、pBR322(大肠杆菌(E.coli))、pACYC177(大肠杆菌(E.coli))、pKT230(革兰氏阴性细菌)、pGV1106(革兰氏阴性细菌)、pLAFR1(革兰氏阴性细菌)、pME290(非大肠杆菌(E.coli)革兰氏阴性细菌)、pHV14(大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))、pBD9(牙胞杆菌属(Bacillus))、pIJ61(链霉菌属(Streptomyces))、pUC6(链霉菌属(Streptomyces))、YIp5(酵母菌属(Saccharomyces))、YCp19(酵母菌属(Saccharomyces))、牛乳头状瘤病毒(哺乳动物细胞)、pCMV(哺乳动物细胞)、pEB(哺乳动物细胞)和EBNA-基附加型载体(哺乳动物细胞)。一般地，参见Sambrook等人,MolecularCloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York。
还可以使用昆虫细胞表达系统，如杆状病毒系统，并且它们是本领域技术人员已知的。植物表达系统还可以用于产生免疫原性蛋白质。通常，这类系统使用病毒-基载体来用异源基因转染植物细胞。
病毒系统，如牛痘基感染/转染系统还将获得通过本发明的使用。在该系统中，首先用编码噬菌体T7 RNA聚合酶的牛痘病毒重组体体外转染细胞。这种聚合酶显示出精巧的特异性，其中它仅转录具有T7启动子的模板。感染后，受T7启动子驱动，用所关心的DNA转染细胞。在细胞质中表达的来自牛痘病毒重组体的聚合酶将转染的DNA转录为RNA，所述RNA然后被宿主翻译机制翻译成蛋白质。所述方法提供了大量RNA及其翻译产物的高水平、瞬时、细胞质生产。
可以将编码序列置于启动子、核糖体结合位点(对于细菌表达)和任选地操作子(在本文中统称为“控制元件”)的控制之下，从而在通过含有这种表达构造的载体转化的宿主细胞中将编码所期望的抗原的DNA序列转录成RNA。所述编码序列可以含有或可以不含有信号肽或前导序列。可以在翻译后加工中通过宿主除去前导序列。
允许相对于宿主细胞的生长调控蛋白序列的表达的其它调控序列也可以是所期望的。这些调控序列是本领域技术人员已知的，并且示例包括：响应化学或物理刺激，包括调控化合物的存在，引起基因表达打开或关闭的那些调控序列。其它类型的调控元件也可以存在于载体，例如，增强子序列中。
可以在插入到载体中之前，将控制序列及其它调控序列连接至编码序列。作为另外一种选择，可以将编码序列直接克隆到已含有控制程序和适当的限制性位点的表达载体中。
在一些情况下，可能必需修饰所述编码序列，从而使其可以以适当取向连接至控制序列；即维持正确的阅读框。还可以期望产生免疫原性蛋白的突变体或类似物。可以通过编码所述蛋白的序列的一部分的缺失，通过序列的插入和/或通过所述序列内的一个或多个核苷酸的替换来制备突变体或类似物。用于修饰核苷酸序列的技术，如定点突变对于本领域技术人员来说是熟知的。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning,alaboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York。
然后，使用表达载体转化适当的宿主细胞。一些哺乳动物细胞系在本领域中是已知的，并且包括从美国模式培养物保藏所(ATCC)可获得的永生化细胞系，如(但不限于)人胚肾293(HEK293)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)等。类似地，细菌宿主，如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌属(Streptococcus spp.)将与本发明的表达构建体一起获得使用。在本发明中有用的酵母宿主尤其包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、白假丝酵母(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季氏毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)。用于与杆状病毒表达载体一起使用的昆虫细胞尤其包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕(Bombyx mori)、果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。
基于所选的表达系统和宿主，通过在其中表达所关心的蛋白的条件下，使通过以上所描述的表达载体所转化的宿主细胞生长来产生本发明所述的蛋白。适当生长条件的选择本领域的技术范围内。如果不分泌蛋白，则使用化学、物理或机械法破坏细胞，所述方法使细胞裂解，但使所述蛋白保持基本完整。在细胞破环后，通常通过离心除去细胞碎片。无论是胞内产生还是分泌，可以使用标准纯化技术进一步纯化所述蛋白，所述纯化技术如(但不限于)柱色谱、离子交换色谱、尺寸-排阻色谱、电泳、高效液相色谱(HPLC)、免疫吸附剂技术、亲合色谱、免疫沉淀等。
C.抗体
本发明所述的抗原可以用于产生用于治疗(例如，被动免疫)、诊断和纯化目的的抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体制剂、单特异性抗血清或者可以是杂交或嵌合抗体，如人源化抗体、改变的抗体、F(ab')2片段、F(ab)片段、Fv片段，单结构域抗体、二聚或三聚抗体片段构建体、微抗体或者结合至所讨论的抗原的其功能性片段。使用本领域技术人员熟知的技术产生抗体。
对于已知患有RSV-相关疾病的受试者，抗-RSV-抗原抗体可以具有治疗益处并且可以用于赋予所讨论的受试者被动免疫。对于已知患有PIV3-相关疾病的受试者，抗-PIV3-抗原抗体可以具有治疗益处并且可以用于赋予所讨论的受试者被动免疫。作为另外一种选择，抗体可以用于以下进一步描述的诊断应用以及用于所关心的抗原的纯化。
D.组合物
可以将RSV-PIV3嵌合分子配制成用于向受试者递送的组合物以用于引起免疫应答，如用于抑制感染。本发明的组合物可以包括非RSV或非PIV3抗原或者RSV和PIV3抗原的组合或者可以与非RSV或非PIV3抗原或者RSV和PIV3抗原的组合一起共施用，如以上所描述的。制备这些制剂的方法描述于(例如)Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Company,Easton,Pennsylvania,第22版,2012。可以将本发明所述的组合物制备成作为液体溶液或者混悬液的注射剂。还可以制备适合于在注射前在液体媒介物中溶解或混悬的固体形式。还可以使所述制剂乳化，或者将活性成分包封在脂质体媒介物中。活性免疫原性成分通常与相容的药物媒介物混合，如(例如)水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，如果需要，所述媒介物可以含有少量助剂物质，如润湿剂或乳化剂和pH缓冲剂。
还可以将增强所述组合物的有效性的佐剂加入至所述制剂。这些佐剂包括起作用以提高对RSV-或PIV3-抗原或者抗原的组合的免疫应答，因此降低疫苗中必需的抗原的量和/或必需的注射频率以产生充分免疫应答的任何化合物或者化合物的组合。
例如，如在(例如)美国专利No.9,061,001(其以其全部内容作为参考并入本文)中所述的三重佐剂制剂可以用于所述主题组合物。三重佐剂制剂包括与多聚阴离子聚合物，如聚磷腈和具有免疫刺激性性质(ISS)的核酸序列，如具有或不具有CpG基序(胞嘧啶，之后是鸟嘌呤核苷并通过磷酸键连接)或者合成dsRNA类似物聚(I:C)的寡脱氧核苷酸分子组合的宿主防御肽(“HDP”)。
用于在所述组合佐剂中使用以及用于单独与本发明的嵌合抗原一起使用的宿主防御肽的示例无限制地包括HH2(VQLRIRVAVIRA)；IDR-1002(VQRWLIVWRIRK)；IDR-1018(VRLIVAVRIWRR)；Indolicidin(ILPWKWPWWPWRR)；HH111(ILKWKWPWWPWRR)；HH113(ILPWKKPWWPWRR)；HH970(ILKWKWPWWKWRR)；HH1010(ILRWKWRWWRWRR)；乳酸链球菌肽Z(Ile-Dhb-Ala-Ile-Dha-Leu-Ala-Abu-Pro-Gly-Ala-Lys-Abu-Gly-Ala-Leu-Met-Gly-Ala-Asn-Met-Lys-Abu-Ala-Abu-Ala-Asn-Ala-Ser-Ile-Asn-Val-Dha-Lys)；JK1(VFLRRIRVIVIR)；JK2(VFWRRIRVWVIR)；JK3(VQLRAIRVRVIR)；JK4(VQLRRIRVWVIR)；JK5(VQWRAIRVRVIR)；和JK6(VQWRRIRVWVIR)。显示出适当生物活性，如调节免疫应答的能力，从而增强对共递送的抗原的免疫应答的任何上述肽及其片段和类似物将在本文中获得使用。
用于在三重佐剂组合物中使用或单独使用的ISS的示例性、非限制性示例包括CpG寡核苷酸或者非CpG分子。“CpG寡核苷酸”或者“CpG ODN”表示含有至少一个胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列的免疫刺激性核酸(即5'胞嘧啶核苷，之后是3'鸟嘌呤核苷并通过磷酸键连接)并且激活免疫系统的免疫刺激性核酸。“未甲基化的CpG寡核苷酸”是含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即未甲基化的5'胞嘧啶核苷，之后是3'鸟嘌呤核苷并通过磷酸键连接)并且激活免疫系统的核酸分子。“甲基化的CpG寡核苷酸”是含有甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸序列(即甲基化的5'胞嘧啶核苷，之后是3'鸟嘌呤核苷并通过磷酸键连接)并且激活免疫系统的核酸。CpG寡核苷酸在本领域中是熟知的并且描述于(例如)美国专利No.6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；和6,339,068；PCT专利公开No.WO 01/22990；PCT专利公开No.WO 03/015711；美国专利公开No.20030139364，所述专利和专利公开以其全部内容作为参考并入本文。
这些CpG寡核苷酸的示例无限制地包括，5’TCCATGACGTTCCTGACGTT3’，称为CpGODN 1826，B类CpG；5’TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT3’，称为CpG ODN 2007，B类CpG；5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3’，也称为CpG 7909或10103，B类CpG；5'GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3'，称为CpG 8954，A类CpG；和5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’，也称为CpG 2395或CpG10101，C类CpG。所有上述B类和C类分子是完全磷硫酰化的。
用于在本发明的组合物中使用的非CpG寡核苷酸包括双链聚核糖肌苷酸：聚核糖胞苷酸，也称为聚(I:C)；和非CpG寡核苷酸5'AAAAAAGGTACCTAAATAGTATGTTTCTGAAA3'。
用于在三重组合佐剂中使用或单独使用的多聚阴离子聚合物包括聚磷腈。通常，用于与本发明的佐剂组合物一起使用的聚磷腈将采取处于水溶液中的聚合物或者聚合物微粒的形式，其具有或不具有包封或吸附的物质，如抗原或其它佐剂。例如，聚磷腈可以是可溶性聚磷腈，如具有含有(例如)羧酸、磺酸或羟基部分的电离的或可电离侧基和在用于赋予所述聚合物生物可降解性质的条件下对水解敏感的侧基的聚磷腈聚电解质。这些聚磷腈聚电解质是熟知的并且描述于(例如)美国专利No.5,494,673；5,562,909；5,855,895；6,015,563；和6,261,573，以上专利以其全部内容作为参考并入本文。作为另外一种选择，处于交联微粒形式的聚磷腈聚合物也将在本文中获得使用。这些交联聚磷腈聚合物微粒在本领域中是熟知的并且描述于(例如)美国专利No.5,053,451；5,149,543；5,308,701；5,494,682；5,529,777；5,807,757；5,985,354；和6,207,171，以上专利以其全部内容作为参考并入本文。
本领域技术人员将理解“聚磷腈”是环状或非环状(除非另作说明)高分子量水溶性聚合物，其含有磷和氮原子交替的主链以及在每个磷原子处连接的有机侧基或配体。参见，例如，Payne等人,Vaccine(1998)16:92-98；Andrianov&Payne,Adv.Drug.Deliv.Rev.(1998)31:185-196。用于在本文中使用的直链聚磷腈聚合物的示例包括处于多种形式，如钠盐或酸形式的聚[二(钠羧基合苯氧基)磷腈](PCPP)和聚(二-4-氧代苯基丙酸酯)磷腈(PCEP)，以及由PCPP或PCEP与羟基处于不同百分比的共聚物，如90:10PCPP/OH组成的聚合物。用于合成这些化合物的方法是已知的并且描述于以上参考的专利，以及Andrianov等人,Biomacromolecules(2004)5:1999；Andrianov等人,Macromolecules(2004)37:414；Mutwiri等人,Vaccine(2007)25:1204。用于在本文中使用的环状聚磷腈的示例如下所述，如CPZ37和CPZ39。
在另一个实施方式中，可以将上述三重佐剂制剂与粘膜粘附性阳离子脂质载体进一步配制以形成粘膜粘附性脂质载体系统，如WO/2020/056524中所述，该专利以其全部内容作为参考并入本文。在优选的实施方式中，肌内或粘膜施用本发明的抗原或其与粘膜粘附性载体和三重佐剂一起的组合物。
其它佐剂包括壳聚糖-基佐剂，以及本领域中已知的多种皂苷、油剂和其它物质中的任一种，如AMPHIGENTM，其包含溶于油，通常轻液体石蜡中的去油卵磷脂。在疫苗制备中，将AMPHIGENTM作为水包油乳液分散在免疫抗原的水溶液或混悬液中。其它佐剂是LPS、细菌细胞壁提取物、细菌DNA、合成寡核苷酸及其组合(Schijns等人,Curr.Opi.Immunol.(2000)12:456)、草分枝杆菌(Mycobacterial phlei)(M.phlei)细胞壁提取物(MCWE)(美国专利No.4,744,984)、M.phlei DNA(M-DNA)和M-DNA-M phlei细胞壁复合物(MCC)。例如，在本文中可以用作乳化剂的化合物包括天然和合成乳化剂，以及阴离子、阳离子和非离子化合物。在合成化合物中，阴离子乳化剂包括(例如)月桂酸和油酸的钾、钠和铵盐、脂肪酸的钙、镁和铝盐(即金属皂)和有机磺酸盐，如月桂基硫酸钠。合成阳离子试剂包括(例如)溴化十六烷基三甲基铵，而通过甘油酯(例如，单硬脂酸甘油酯)、聚氧乙二醇酯和醚，以及山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如，一棕榈酸山梨聚糖酯)和它们的聚环氧乙烷衍生物(例如，聚环氧乙烷一棕榈酸山梨聚糖酯)举例说明了合成非离子试剂。天然乳化剂包括阿拉伯胶、明胶、卵磷脂和胆固醇。
可以与油组分，如单一的油、油的混合物、油包水乳剂或水包油乳剂一起形成其它适合的佐剂。佐剂MONTANIDETM也将在本文中获得使用。适合的动物油包括(例如)鳕鱼肝油、比目鱼油、鲱油、橙连鳍鲑油和鲨鱼肝油，它们均是可商购的。适合的植物油无限制地包括菜籽油、杏仁油、棉籽油、玉米油、橄榄油、花生油、红花油、芝麻油、豆油等。
作为另外一种选择，一些脂族含氮碱可以与疫苗制剂一起用作佐剂。例如，已知的免疫佐剂包括胺、季铵化合物、胍、苯甲脒和硫脲(Gall,D.(1966)Immunology 11:369386)。具体的化合物包括二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)(得自Kodak)和N,N-双十八基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺(“AVRIDINE”)。已描述了DDA作为免疫佐剂的用途；参见，例如，theKodak Laboratory Chemicals Bulletin 56(1):1 5(1986)；Adv.Drug Deliv.Rev.5(3):163 187(1990)；J.Controlled Release 7:123 132(1988)；Clin.Exp.Immunol.78(2):256262(1989)；J.Immunol.Methods 97(2):159 164(1987)；Immunology 58(2):245 250(1986)；和Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.68(3):201 208(1982)。AVRIDINE也是熟知的佐剂。参见，例如，美国专利No.4,310,550，以上专利以其全部内容作为参考并入本文，其描述了一般地N,N-高级烷基-N',N'-双(2-羟乙基)丙二胺并且具体地AVRIDINE作为疫苗佐剂的用途。授权给Babiuk的美国专利No.5,151,267(以其全部内容作为参考并入本文)和Babiuk等人.(1986)Virology 159:57 66也涉及AVRIDINE作为疫苗佐剂的用途。
一旦制备，制剂将含有活性成分的“药物有效量”，即能够在施用所述组合物的受试者中实现所期望的反应的量。在RSV或PIV3疾病的治疗和预防中，“药物有效量”将优选地为预防、减少或改善所讨论的疾病的症状的量。本领域技术人员使用标准测试容易地确定了准确的量。活性成分通常将在所述组合物的约1％至约95％(w/w)的范围内，或者在适合的情况下，甚至更高或更低。使用本发明的制剂，当向每位受试者施用0.5至2mL的剂量时，每mL注射溶液中1μg至2mg，如10μg至1mg，例如，25μg至0.5mg、50μg至500μg或者这些活性成分范围之间的任何值应足以治疗或预防感染。要施用的量取决于要治疗的受试者、受试者免疫系统合成抗体的能力以及所期望的保护程度。通过建立剂量反应曲线的常规试验，本领域的技术人员可以容易地建立有效剂量。
可以肠道外施用，例如，通过气管内、肌内、皮下、腹膜内或静脉内注射施用所述组合物。向所述受试者施用所述组合物的至少一个剂量。此外，可以向所述受试者施用产生所期望的生物作用所需的数目的剂量。
适合于其它施用形式的其它制剂包括栓剂，和在一些情况下，气溶胶、鼻内、口服制剂和缓释制剂。对于栓剂，媒介物组合物将包括常规结合剂和载体，如碱性聚乙二醇(polyalkaline glycols)或者甘油三酯。这些栓剂可以由含有约0.5％至约10％(w/w)，优选约1％至约2％的范围内的活性成分的混合物形成。口服媒介物包括常用赋形剂，如(例如)药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些口服疫苗组合物可以采取溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末剂的形式，并且含有约10％至约95％，优选约25％至约70％的活性成分。
鼻内制剂通常将包括即不对鼻粘膜产生刺激也不明显干扰纤毛功能的媒介物。稀释剂，如水、盐水或其它已知的物质可以用于本发明。鼻制剂还可以含有防腐剂，如(但不限于)氯代丁醇和苯扎氯铵。可以存在表面活性剂以增强鼻粘膜对主题抗原的吸收。
通过将抗原引入载体或媒介物，如脂质体、非可再吸收的不可渗透的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯共聚物和HYTREL共聚物、溶胀性聚合物，如水凝胶、可再吸收聚合物，如胶原蛋白和某些聚酸或聚酯，如用于制备可再吸收缝线的那些、聚磷腈、海藻酸盐、微粒、明胶纳米球、壳聚糖纳米颗粒等来制备控制或缓释制剂。还可以使用在本领域中熟知的植入的微型泵递送本文所描述的抗原。
还可以将疫苗施用于任何年龄组，包括成人、儿童、新生儿或老年人，或者可以作为母体免疫的方法实施于孕妇。
可以使用初免-加强法，其中在“初免”步骤中递送一种或多种组合物，并且随后在“加强”步骤中递送一种或多种组合物。在某些实施方式中，在使用本文所述的一种或多种组合物的初免和加强后是额外的加强。所递送的组合物可以包括以任何顺序并且经由任何施用途径所提供的相同抗原或不同抗原。
E.确定免疫应答的效力的测试
评价预防性治疗的效力的一种方法包括在所述组合物施用后，通过经由ELISA测试受试者血清，通过病毒中和测定或者通过经由免疫印迹法筛选受试者血清，监测对本发明所述的组合物中的RSV和/或PIV3抗原的抗体应答。阳性反应表示受试者先前对RSV和PIV3抗原具有免疫应答，即RSV-PIV3蛋白是免疫原。该方法还可以用于识别表位。可以通过ELISPOT测定或流式细胞术测量细胞-介导的免疫应答，即抗原-诱导的CD4和/或CD8 T细胞。
检查预防性治疗的效力的另一种方法包括在本发明所述组合物的施用之后，监测RSV或PIV3的感染。所述免疫原性组合物可以或可以不来源于与病毒攻毒株相同的株。优选地，所述免疫原性组合物可来源于与攻毒株相同的病毒株。检查预防性治疗的效力的一种方式包括在所述组合物的施用之后，全身(如监测IgG1和IgG2a产生水平)和粘膜(如监测IgA产生水平)监测对本发明所述的组合物中的抗原的免疫应答。通常，在免疫后但在攻毒前确定血清-特异性抗体应答，然而在免疫后且在攻毒后确定粘膜特异性抗体应答。
可以在人施用之前在体外和体内动物模型中评价本发明所述的免疫原性组合物。
所述免疫应答可以是TH1-型免疫应答和TH2-型应答之一或两者。所述免疫应答可以是改善的或增强的或者改变的免疫应答。所述免疫应答可以是全身和粘膜免疫应答之一或两者。增强的全身和/或粘膜免疫性反映在增强的TH1-型和/或TH2-型免疫应答。优选地，增强的免疫应答包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA的产生的增加。
激活的TH2细胞增强抗体生产并因此在对胞外感染的反应中具有价值。激活的TH2细胞可以分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2-型免疫应答可以导致IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞的产生以用于未来的保护。通常，增强的TH2-型免疫应答将包括IgG1产生的增加。
TH1-型免疫应答可以包括CTL增加、一种或多种与TH1-型免疫应答有关的细胞因子(如IL-2、IFNγ和TNF-α)的增加、活化巨噬细胞的增加、NK活性增加或者IgG2a产生增加中的一种或多种。通常，增强的TH1-型免疫应答将包括IgG2a产生的增加。
本发明所述的免疫原性组合物将优选地引起持久的免疫性，其一旦对一种或多种传染剂暴露，则可以快速应答。
在治疗应用的情况下，将在RSV或PIV3感染后施用本发明的组合物，随后监测感染的发展。
F.环聚磷腈
以下是可以在本文所公开的组合物中使用的环聚磷腈的示例。化学式I所示的环聚磷腈的制备、测试和使用方法的支持数据可见于2021年4月22日提交的标题为环聚磷腈、相关制备方法和使用方法的美国临时专利申请NO.63/178,214，该专利申请的全部内容作为参考并入本文。
本文公开了化学式I所示的化合物：
及其互变异构体、立体异构体、多晶型物、水合物、溶剂化物或药物可用的盐。
在本文所公开的实施方式中，Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14、Z15、Z16、Z17、Z18、Z19、Z20、Z21、Z22、Z23、Z24、Z25、Z26、Z27、Z28、Z29和Z30中的每一个，在本文中称为Z1-30，可以独立地选自：H或化学式II：
在一些实施方式中，Z1-30中的至少一种被化学式II取代。每个化学式II对Z1-30的取代可以是相同的或不相同的。
本领域技术人员将理解“Z1-30中的每一个可以是相同的或不相同的”可以表示其中可以通过不相同的化学式II所示的基团表示Z1-30中的每一个的实施方式。每个A、B和/或R基团可以在一个或多个Z1-30取代之间是相同的或者可以是彼此独特的。例如，可以用其中A基团是氧原子的化学式II取代Z1，并且可以用其中A基团是氮原子的化学式II取代Z13。
在本文所公开的实施方式中，如果存在，一个或多个A基团选自C1-C7烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、O、S和N。C1-C7烷基、C2-C7烯基和/或C2-C7炔基可以是直链或支链的，并且任选地被选自由下列组成的组的一个或多个取代基取代：1°氨基、2°氨基、3°氨基、4°氨基、乙缩醛、酰卤、酰基、醛、烷氧基、酰胺、芳基、叠氮化物、甲脒基、羧酸、氰基、二硫化物、环氧化物、酯、醚、羟基、亚酰胺、亚胺、酮、腈、硝基、肟、过氧化物、磺酸、磺胺基、硫酯、硫醚、硫醇、氨基芴基甲氧基羰基(NH-Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)和氨基叔丁氧羰基(-NH-Boc)。
本领域技术人员将理解“如果存在”是指基团在整个结构内是任选的。在其中存在所述基团的实施方式中，周围基团的连接性如所示。在其中化学式II中的基团，例如“A”不存在的实施方式中，侧接基团将直接彼此连接。在此情况下，化学式II的羰基将直接连接至适当的Z-基团位置，如Z1。
在本文所公开的实施方式中，一个或多个B-基团可以选自C1-C7烷基、C2-C7烯基、C2-C7炔基、H、O、S和N，其中C1-C7烷基、C2-C7烯基和/或C2-C7炔基是直链或支链的，并且任选地被选自由下列组成的组的一个或多个取代基取代：1°氨基、2°氨基、3°氨基、4°氨基、乙缩醛、酰卤、酰基、醛、烷氧基、酰胺、芳基、叠氮化物、甲脒基、羧酸、氰基、二硫化物、环氧化物、酯、醚、羟基、亚酰胺、亚胺、酮、腈、硝基、肟、过氧化物、磺酸、磺胺基、硫酯、硫醚、硫醇、氨基芴基甲氧基羰基(NH-Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)和氨基叔丁氧羰基(-NH-Boc)。
在本文所公开的实施方式中，如果存在，一个或多个R-基(在本文中有时称为“配体”)选自H、C1-C45烷基、C2-C45烯基和C2-C45炔基，其中C1-C45烷基、C2-C45烯基和C2-C45炔基是直链或支链的并且是任选地取代的。所述一个或多个R-基可以包含一个或多个选自由下列组成的组的取代基：1°氨基、2°氨基、3°氨基、4°氨基、乙缩醛、酰卤、酰基、醛、烷氧基、酰胺、芳基、叠氮化物、甲脒基、羧酸、氰基、二硫化物、环氧化物、酯、醚、羟基、亚酰胺、亚胺、酮、腈、硝基、肟、过氧化物、磺酸、磺胺基、硫酯、硫醚、硫醇、氨基芴基甲氧基羰基(NH-Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)和氨基叔丁氧羰基(-NH-Boc)。在本文所描述的一些实施方式中，R-基可以选自表1。
表1：可能的R-基(配体)的示例。
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在本文所公开的实施方式中，环聚磷腈可以处于其多种互变异构形式、立体异构体、多晶型物、水合物、溶剂化物或药物可用的盐。
在本文所公开的实施方式中，寡聚结构可以包含如本文所定义的两个或更多个环聚磷腈化合物。本领域技术人员将理解“寡聚”可以表示共价连接的相同或不相同的环聚磷腈的重复单元。其中连接两个相同的环聚磷腈的实施方式可以被称为同源二聚体。其中连接三个不相同的环聚磷腈的实施方式可以被称为异三聚体。寡聚结构可以包含两个或更多个单元，包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个单元。
如本文所公开的，寡聚结构中的两个或更多个化合物可以经由适合的连接进行连接。在一些情况下，适合的连接是酰胺或酯键。可以经由激活的酯，如N-羟基琥珀酰亚胺酯和亲核基团，如游离羟基或胺基形成酰胺或酯键。在一些情况下，寡聚结构中的每个环聚磷腈单元包含激活的酯和亲核基团以用于自组装成大的寡聚结构。
在本文所描述的一些实施方式中，所述环聚磷腈是具有化学式37的化合物：
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其互变异构体、立体异构体、多晶型物、水合物、溶剂化物或药物可用的盐。在本文中，可以通过命名CPZ37表示化合物37。
在本文所描述的一些实施方式中，所述环聚磷腈是具有化学式6的化合物：
其互变异构体、立体异构体、多晶型物、水合物、溶剂化物或药物可用的盐。
在本文所描述的一些实施方式中，所述环聚磷腈是具有化学式11的化合物：
其互变异构体、立体异构体、多晶型物、水合物、溶剂化物或药物可用的盐。
在本文所描述的一些实施方式中，所述环聚磷腈是具有化学式9的化合物：
其互变异构体、立体异构体、多晶型物、水合物、溶剂化物或药物可用的盐。
在本文所描述的一些实施方式中，所述环聚磷腈是具有化学式39的化合物：
其互变异构体、立体异构体、多晶型物、水合物、溶剂化物或药物可用的盐。在本文中，可以通过命名CPZ39表示化合物39。
本领域技术人员将理解可以通过适合的保护基(PG)保护本文所描述的任何官能团或取代。例如，可以通过叔丁基氨基甲酸酯(Boc)基团保护胺。保护基的其它示例包括：9-芴基甲基氨基甲酸酯(Fmoc)、氨基甲酸苄酯(Cbz)、酰基、三氟酰基、邻苯二酰亚胺、苄基(Bn)、p-甲苯磺酰胺、二噻烷、乙缩醛(环或非环)、腙、烷基或芳基酯、烯丙基、甲氧基甲基醚(MOM醚)、烷基甲硅烷基基团(如TBDMS等)、四氢吡喃基(THP)和本领域中已知的其它保护基。可以经由本领域中已知的适合的脱保护条件除去保护基。
本领域技术人员将理解在如本文所提及的这些实施方式中，C1-C7烷基或C1-C45烷基可以表示1至7个碳之间的烷基。这可以理解为包括直链或支链烷基，包括例如：甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、正丁基、仲丁基等。还考虑了大于7个碳的烷基链，例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个或更多个碳的烷基链。
本领域技术人员将理解在如本文所提及的这些实施方式中C2-C7烯基或C2-C45烯基可以表示包含至少一个双键的1至7个碳之间的烷基。这可以理解为包括包含至少一个双键的直链或支链烯基基团。C1-C7烯基可以表示具有两个或更多个处于共轭的双键的链。还考虑了大于7个碳的烯基链，例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个或更多个碳的烯基链。
本领域技术人员将理解在如本文所提及的这些实施方式中C2-C7炔基或C2-C45炔基可以表示包含至少一个三键的1至7个碳之间的烷基。这可以理解为包括包含至少一个三键的直链或支链炔基基团。C1-C7炔基可以表示具有两个或更多个处于共轭的三键的链。还考虑了大于7个碳的炔基链，例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个或更多个碳的炔基链。
可以通过一个或多个适合的取代基取代C1-C7烷基、C1-C45烷基、C2-C7烯基、C2-C45烯基、C2-C7炔基和/或C2-C45炔基。例如，可以用以下中的一个或多个取代一个或多个C1-C7烷基、C1-C30烷基、C2-C7烯基、C2-C30烯基、C2-C7炔基和/或C2-C30炔基链的每个碳：羟基、醛、1°氨基、2°氨基、3°氨基、叔丁氧羰基(-NH-Boc)、氰基、酰胺、芳基、烷氧基、乙缩醛、酮、酯、酰基、醚、硫醚、硫酯、硫醇、二硫化物、过氧化物、亚胺、亚酰胺、肟、酰卤、硝基、腈、环氧化物、磺酸、磺胺基、甲脒基、叠氮化物等。
本领域技术人员将理解磺胺基可以被理解是连接至母体基团的磺酰胺基团，其中氮任选地被0-2个取代基，如烷基、芳基等取代。
本领域技术人员将理解伯氨基(1°)、仲氨基(2°)、叔氨基(3°)和季氨基(4°)可以表示分别具有0、1、2和3个其它取代基(除母体基团外)的胺。在不背离本发明所考虑的内容的情况下，取代基可以是烷基、烯基、炔基、芳基等。本领域技术人员将理解如权利要求中所列的酰胺可以是烷基链主链的一部分或其取代基。酰胺可以是伯(1°)、仲(2°)或叔(3°)酰胺。
本领域技术人员将理解芳基基团可以表示一个或多个任何适合的芳环，如芳烃和杂环。示例包括：苯(苯基)、苄基、萘(萘基)、蒽(蒽基)、芘(芘基)、茚、联苯基、菲、吡啶、咪唑、呋喃、皮考啉基、唑、吗啉(吗啉基)、苯并噻唑、噻唑等。
本领域技术人员将理解烷氧基是指包含连接至母体基团的烷基，如C1-C45烷基、C1-C45烯基、C1-C45炔基链的醚键。醚键可以将其它非烷基基团，如芳基连接至母体基团。
本领域技术人员将理解乙缩醛可以表示两个成对的烷氧基。半缩醛将被理解为在相同碳作为羟基连接的烷氧基。
本领域技术人员将理解酰基或烷酰基可以表示经由酮连接至母体基团的烷基或芳基基团。酰卤可以表示包含键合至卤化物的羰基的酰基基团，如酰基氯或酰基溴。
本领域技术人员将理解卤代基团或卤化物可以表示任何适合的卤素，例如氟(F)、溴(Br)、碘(I)等。
佐剂组合物中存在的聚磷腈的典型的量将显示为约0.01至约2500μg/kg，通常约0.05至约500μg/kg，如0.5至100μg/kg，或者1至50μg/kg，或者这些值内的任何量。本领域技术人员可以确定佐剂组合物中聚磷腈的量以及聚磷腈与其它组分之比。
G.试剂盒
本发明还提供了包含本发明的组合物的一个或多个容器的试剂盒。组合物可以处于液体形式或者可以是冻干的，单个抗原也可以处于液体形式或者可以是冻干的。所述组合物的适合容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料，包括玻璃或塑料形成。容器可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或者具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。
所述试剂盒还可以包含第二容器，所述第二容器包含药物可用的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。它还可以含有对最终用户有用的其它材料，包括其它药物可用的配制溶液，如缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器或者其它递送装置。所述试剂盒还可以包括包含佐剂的第三组分。
所述试剂盒还可以包含包装说明书，所述包装说明书含有引起免疫性或治疗感染的方法的书面说明书。包装说明书可以是未经批准的包装说明书草案或者可以是经过食品和药物管理局(FDA)或者其它管理机构批准的包装说明书。
本发明还提供了预填充本发明的免疫原性组合物的递送装置。
类似地，可以在试剂盒中提供抗体，以及适合的说明书和其它必需的试剂。基于所述抗体是否将用于免疫测定，所述试剂盒还可以含有适合的标记以及其它包装试剂和材料(即清洗缓冲液等)。可以使用这些试剂盒实施标准免疫测定。
3.实验
以下是用于实施本发明的具体实施方式的示例。仅出于说明性目的提供了实施例，并且它们不意欲以任何方式限制本发明的范围。
已进行了工作以确保相对于所使用数值的准确度(例如，量、温度等)，但是当然应允许一些实验误差和偏差。
A.材料和方法
重组蛋白的表达和纯化：
设计开放阅读框(ORF)以表达与人PIV3的胞外域(株JS；核苷酸登录号Z11575；5'3'框架2翻译中所识别的第三蛋白的氨基酸87-572)融合的RSV F的N末端胞外域，具有信号肽(Gen Bank登录号P03420序列；氨基酸1-513，包括以下氨基酸替换：L4P、T16A、G25S、I79M、P102A、T103A、A122T、V152I、S213R、A241V、I379V、M447V)。通过产生GS接头的BamHI位点将tF和HN结构域连接在一起。
另外，将编码tF结构域的pep27(氨基酸110-136)的DNA缺失并使弗林蛋白酶识别位点突变(以下提供了替换)以表达tF的单链变体。制备C末端结构域以含有GSGSG(H)12组氨酸-标签以辅助纯化。
表2列出了所制备的构建体以及它们的特征。表3列出了所述构建体的序列。
表2.
表3.
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对编码tFrSc6-HN的DNA密码子优化，用N末端Kozak序列(GCCACCATGG)合成并克隆到游离基因哺乳动物表达载体pEB4.3(Genbank：MG182339)的NheII、NotI位点。该载体的调控组件包括上游人CMV启动子以及内含子IA以及下游元件WPRE(旱獭肝炎病毒转录后调控元件)和BGHpA(牛生长激素多腺苷酸化信号)。
将构建体转染到HEK293T细胞中并且通过嘌罗霉素抗性选择稳定维持游离基因构建体的细胞。使稳定转染的细胞在SFM4HEK293培养基(Hyclone)中生长。将通过离心获得的上清液浓缩5倍，并通过切向流相对于平衡缓冲液(50mM磷酸Na，300mM NaCl，pH 8.0)透析。通过亲合色谱纯化蛋白，更具体地根据生产商的说明，使用Ni60 Superflow(Clontech)通过固定化金属色谱(IMAC)纯化蛋白。最终，相对于2×PBS透析蛋白。
对重组蛋白进行SDS-PAGE以确认纯度(图1)。
B.制剂
对于每只小鼠，制剂由0.4μg tFrSc6-HN蛋白和佐剂(在下文中称为“TriAdj”)在50μL可递送体积中组成，并且对于每只棉鼠，由2μg tFrSc6-HN蛋白和佐剂TriAdj在100μL可递送体积中组成。TriAdj由10μg聚I:C、20μg HDP IDR-1002肽和10μg聚磷腈组成。聚磷腈是PCEP、CPZ37或CPZ39。
在第二小鼠试验和第一棉鼠试验中，还评价了氢氧化铝(“alum”)；对于小鼠，将30％v/v氢氧化铝(明矾；Invivogen；产品目录号Vac-Alu-250)与0.4μg tFrSc6-HN蛋白一起在50μL可递送体积中配制，并且对于棉鼠，将2μg tFrSc6-HN蛋白在100μL可递送体积中配制。
C.小鼠中的免疫应答
小鼠试验No.1
以三周间隔，用PBS(对照)或者用通过含有PCEP、CPZ37或CPZ39的TriAdj配制的tFrSc6-HN蛋白对BALB/c小鼠(n＝5只每组)肌内接种疫苗两次。在第二次疫苗接种后3周，用RSV株A2(5×105PFU)对所有组进行攻毒，并在4天后安乐死。
通过ELISA对攻毒前收集的血清确定tFrSc6-HN-特异性IgG1和IgG2a滴度。将ELISA滴度表示为最高稀释的倒数，从而产生了大于阴性对照血清的两个标准偏差的值。检测下限为40的滴度。
对尸检时单独采集的血清，对于RSV和PIV3实施病毒中和(VN)测定。将VN滴度表示为导致<50％的细胞显示出细胞病变效应的最高血清稀释。
实施酶联免疫斑点(ELISPOT)测定以评价脾细胞中tFrSc6-HN-诱导的IFN-γ和IL-5分泌细胞的诱导。将细胞因子-分泌细胞数表示为tFrSc6-HN-刺激的孔和培养基对照孔之间斑点数目之差。
对RSV测试尸检时采样的肺中的病毒复制。将病毒复制表示为PFU/克肺组织。
小鼠试验No.2
以三周间隔，用PBS(阴性对照)，用通过含有PCEP、CPZ37或CPZ39的TriAdj配制的tFrSc6-HN蛋白质，或者用通过氢氧化铝配制的tFrSc6-HN对BALB/c小鼠(n＝5只每组)肌内接种疫苗两次。在第二次疫苗接种后6周，用RSV株A2(5×105PFU)对所有组进行攻毒。4天后将所有动物安乐死。
如对于小鼠试验1所述，确定tFrSc6-HN-特异性IgG1和IgG2a滴度和RSV和PIV3中和滴度。如对于小鼠试验1所述，对RSV测试尸检时采样的肺中的病毒复制。
将细胞因子多重测定用于确定所有小鼠中IFN-γ和IL-5的量。根据生产商的说明书，使用电化学发光(ECL)检测-基Meso-scalediscovery(MSD)多路平台和Sector Imager2400(MSD,Gaithersburg,MD,USA)，在肺匀浆的无细胞上清液中定量肺细胞因子。
棉鼠试验No.1
在该试验中，将tFrSc6-HN与不同佐剂组合：在不同制剂方法中，含有多聚I:C、IDR-1002肽和作为PCEP、CPZ37、PCEP中任一种的聚磷腈的三重佐剂制剂(TriAdj)，或者氢氧化铝(Alum)。以4周间隔，用tFrSc6-HN制剂使6只棉鼠的组免疫两次。用肝RSV或PBS使对照组免疫。在最后一次免疫后3周，用RSV株A2(1×106PFU)对所有棉鼠攻毒，并在4天后安乐死。
如对于小鼠试验1所述，确定tFrSc6-HN-特异性IgG滴度和RSV和PIV3中和滴度。如对于试验1所述，对RSV测试尸检时采样的肺中和洗鼻液中的病毒复制。
D.统计分析：
使用用于Windows的GraphPad PRISM 7版(GraphPad Software)分析所有数据。使用单因素方差分析检验所有组间差异。如果组间存在显著性差异，则通过使用曼-惠特尼检验比较成对组间的中位秩。如果P<0.05，则认为差异显著。
4.实施例
A.实施例1：通过在小鼠中施用RSV-PIV3抗原所产生的免疫应答和保护
在小鼠试验No.1中，在小鼠中评价了RSV-PIV3抗原tFrSc6-HN对于病毒攻毒引起免疫性和保护的能力。将tFrSc6-HN与三重佐剂制剂组合，所述三重佐剂制剂的差异在于它们的聚磷腈组分：PCEP、CPZ37或CPZ39。以4-周间隔，对5只小鼠的组接种疫苗两次，并在3周后，用RSV攻毒。其它的组接受PBS。与PBS对照相比，所有佐剂化疫苗能够引起显著更高的IgG1(图2A)和IgG2a(图2B)滴度，从而证实了免疫原性。接种tFrSc6-HN+CPZ39-TriAdj的小鼠组显示出比其它两个TriAdj组tFrSc6-HN+PCEP-TriAdj和tFrSc6-HN+CPZ37-TriAdj低的IgG1滴度，而tFrSc6-HN+PCEP-TriAdj引起了比tFrSc6-HN+CPZ37-TriAdj更高的抗体应答。然而，三个疫苗接种组之间在IgG2a滴度方面无显著差异。
对于tFrSc6-HN+PCEP-TriAdj和tFrSc6-HN+CPZ37-TriAdj疫苗组，IgG1和IgG2a的滴度类似，为约107，从而证实了平衡的TH2/TH1应答。尽管tFrSc6-HN+CPZ39-TriAdj组出现了较低的抗体滴度，但是应答也是平衡的。
通过三种佐剂化疫苗所产生的血清抗体显示在病毒中和(VN)测定中中和RSV和PIV3两者，其中在这些组中引起了比通过PBS所引起的血清抗体显著更高的滴度(图3)。在三种佐剂化疫苗内，tFrSc6-HN+CPZ39-TriAdj引起了比tFrSc6-HN+PCEP-TriAdj低的RSV-和PIV3-中和抗体滴度，而tFrSc6-HN+CPZ39-TriAdj组中的RSV-和PIV3-VN滴度倾向于小于tFrSc6-HN+CPZ37-TriAdj组的那些滴度。然而，tFrSc6-HN+PCEP-TriAdj和tFrSc6-HN+CPZ37-TriAdj引起了类似的VN抗体水平(图3A和B)。
三种佐剂化疫苗制剂引起了tFrSc-HN刺激的IFN-γ和IL-5分泌T细胞两者的产生，这进一步支持了平衡免疫应答的诱导(图4)。三种佐剂制剂之间无差异。
在用RSV A2株攻毒后，确定了所有小鼠的肺中存在的病毒的量。三种佐剂化疫苗tFrSc6-HN+PCEP-TriAdj、tFrSc6-HN+CPZ37-TriAdj和tFrSc6-HN+CPZ39-TriAdj引起完全保护，如通过三组中的肺中的任一种中病毒的不存在所观察到的，而接种PBS的小鼠的肺显示出病毒的高水平(图5)。
B.实施例2：通过在小鼠中施用RSV-PIV3抗原所产生的免疫应答和保护
在小鼠试验No.2中，评价了RSV-PIV3抗原tFrSc6-HN引起免疫应答的能力。在该试验中，将tFrSc6-HN与不同佐剂组合：含有多聚I:C、IDR-1002肽和作为PCEP、CPZ37或CPZ39中任一种的聚磷腈的三重佐剂制剂(TriAdj)；或者氢氧化铝。
用这些疫苗制剂之一免疫5只小鼠的组两次。作为对照，用PBS免疫小鼠的一个组。6周后，用RSV A2对所有小鼠进行攻毒，并在攻毒后4天将小鼠安乐死。
用含有tFrSc6-HN的疫苗免疫的所有组显示出比接种PBS的组更高的IgG1和IgG2a水平(图6A和6B)。用tFrSc6-HN+CPZ39-TriAdj免疫的组的IgG1滴度小于接受tFrSc6-HN+PCEP-TriAdj的动物的滴度，但是tFrSc6-HN+PCEP-TriAdj和tFrSc6-HN+CPZ37-TriAdj组之间无差异。tFrSc6-HN+Alum组引起了比用任何其它佐剂配制的tFrSc6-HN更高的IgG1和更低的IgG2a产生。
用含有TriAdj(PCEP-TriAdj、CPZ37-TriAdj和CPZ39-TriAdj)的疫苗接种的3个组出现了平衡的TH1/TH2免疫应答，如通过接近于1的IgG2a/IgG1比所观察到的。alum-佐剂化疫苗引起了典型的TH2应答，其中IgG1水平(大于107)大于IgG2a水平(约105)。
此外，接种疫苗的小鼠的所有组对于RSV和PIV3出现了VN滴度(图7A和7B)。在接种疫苗的组内，PCEP-TriAdj和alum组出现了比CPZ37-TriAdj和CPZ39-TriAdj组更高的SV-中和滴度，并且CPZ37介导了比CPZ39更高的RSV-中和滴度的诱导。相对于PIV3的中和，PCEP-TriAdj和alum组具有比CPZ37-TriAdj组更高的滴度，并且倾向于具有比CPZ39-TriAdj组更高的滴度。
4种佐剂化疫苗tFrSc6-HN+PCEP-TriAdj、tFrSc6-HN+CPZ37-TriAdj、tFrSc6-HN+CPZ39-TriAdj和tFrSc6-HN+alum引起对RSV攻毒的完全保护，如通过三组中的肺中的任一种中病毒的不存在所观察到的，而接种PBS的小鼠的肺显示出病毒的高水平(图8)。
作为免疫应答偏差的进一步测量，在RSV攻毒后，在肺中测量了IFN-γ和IL-5水平。IL-5是alum-佐剂化疫苗组的肺中生产的主要细胞因子，而接种含有TriAdj(PCEP-TriAdj、CPZ37-TriAdj和CPZ39-TriAdj)的疫苗的小鼠的肺含有IFN-γ和IL-5两者，其中在CPZ37-TriAdj和CPZ39-TriAdj组中IFN-γ具有一定优势，从而支持了TH1向平衡免疫应答的诱导。
C.实施例3：通过在棉鼠中施用RSV-PIV3抗原所产生的免疫应答和保护
在棉鼠中进一步评价了tFrSc6-HN从RSV诱导保护性免疫的能力，棉鼠是对于RSV和PIV3建立的模型。在该试验中，将tFrSc6-HN与不同佐剂组合：在不同制剂方法(A+B)中，含有多聚I:C、IDR-1002肽和作为PCEP，或CPZ37，或PCEP中任一种的聚磷腈的TriAdj，或者氢氧化铝(Alum)。以4周间隔，用tFrSc6-HN制剂使6只棉鼠的组免疫两次。用肝RSV或PBS使对照组免疫。在最后一次免疫后3周，用RSV株A2对所有棉鼠攻毒，并在攻毒后4天安乐死。
所有棉鼠出现高tFrSc6-HN-特异性血清IgG滴度。在第28和49天，通过肝RSV诱导的滴度小于通过RSV-PIV3疫苗制剂引起的滴度(图10)，但是这可以是由于板上的抗原是tFrSc6-HN。在TriAdj-配制的tFrSc6-HN疫苗组之间无差异。与PBS组相比，所有疫苗接种组中RSV-中和抗体滴度更高，并且任何这些组之间无差异(图11A)。所有佐剂化tFrSc6-HN-接种组中PIV3-中和抗体滴度较高，但是如所期望的，在RSV-接种组中并非如此。因此，所有接种疫苗的棉鼠对于RSV攻毒完全保护；在肺或洗鼻液中未检测到病毒(图12A和12B)。
已相对于一个或多个实施方式描述了本发明。然而，对于本领域技术人员将显而易见的是可以在不背离如权利要求所定义的本发明的范围的情况下做出一些改变和修改。
参考文献
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序列表
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<120> 用于预防RSV和PIV3感染的组合物和方法
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<140> PCT/CA2022/050621
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<151> 2021-04-22
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1540 1545 1550
Cys Ala Ala Thr Thr Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Ala Cys Ala
1555 1560 1565
Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly
1570 1575 1580
Ala Gly Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Gly
1585 1590 1595 1600
Ala Ala Ala Thr Cys Ala Cys Thr Ala Thr Thr Cys Gly Cys Ala Ala
1605 1610 1615
Thr Gly Ala Thr Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly
1620 1625 1630
Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Cys Ala Thr Cys Ala
1635 1640 1645
Cys Cys Cys Ala Thr Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Gly Cys Ala Thr
1650 1655 1660
Cys Ala Ala Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly Ala Ala Cys Cys Cys Cys
1665 1670 1675 1680
Gly Ala Cys Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr
1685 1690 1695
Gly Cys Ala Cys Thr Thr Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Cys Cys
1700 1705 1710
Thr Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys Cys
1715 1720 1725
Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Thr Cys Cys Gly Ala Cys Thr Gly Ala
1730 1735 1740
Thr Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr
1745 1750 1755 1760
Gly Cys Thr Gly Gly Cys Ala Ala Thr Gly Cys Cys Ala Ala Cys Cys
1765 1770 1775
Ala Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly Cys Gly
1780 1785 1790
Thr Cys Cys Gly Ala Ala Cys Cys Cys Cys Cys Thr Cys Thr Cys Thr
1795 1800 1805
Gly Gly Thr Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly
1810 1815 1820
Ala Thr Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Thr Ala Thr Ala Cys Thr Ala
1825 1830 1835 1840
Gly Thr Ala Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Cys Ala Cys Cys Cys Gly
1845 1850 1855
Cys Gly Gly Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Thr Thr
1860 1865 1870
Gly Gly Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly Gly
1875 1880 1885
Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Cys Gly Gly Cys Ala Thr
1890 1895 1900
Cys Ala Thr Thr Ala Cys Ala Gly Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Thr
1905 1910 1915 1920
Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Thr Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys
1925 1930 1935
Thr Gly Ala Ala Thr Cys Cys Thr Cys Gly Cys Ala Thr Cys Thr Cys
1940 1945 1950
Ala Cys Ala Cys Ala Cys Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Thr Cys
1955 1960 1965
Ala Ala Cys Gly Ala Thr Ala Ala Cys Cys Gly Ala Ala Ala Gly Thr
1970 1975 1980
Cys Ala Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr
1985 1990 1995 2000
Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Gly Thr Gly
2005 2010 2015
Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly Thr Gly Cys Thr Cys Thr Ala
2020 2025 2030
Cys Thr Cys Cys Thr Ala Ala Ala Gly Thr Cys Gly Ala Thr Gly Ala
2035 2040 2045
Ala Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly Cys Ala
2050 2055 2060
Ala Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Gly Ala Gly Gly
2065 2070 2075 2080
Ala Thr Ala Thr Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr
2085 2090 2095
Cys Gly Thr Cys Ala Ala Thr Thr Ala Cys Gly Ala Thr Gly Gly Gly
2100 2105 2110
Thr Cys Cys Ala Thr Thr Thr Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys Cys Ala
2115 2120 2125
Gly Ala Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Thr Ala Ala
2130 2135 2140
Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Thr Thr Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly
2145 2150 2155 2160
Cys Cys Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Cys Thr Cys Thr Gly Thr
2165 2170 2175
Ala Thr Cys Cys Ala Thr Cys Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Cys Cys
2180 2185 2190
Ala Gly Gly Ala Ala Thr Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly
2195 2200 2205
Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Thr Cys Ala Thr Thr Thr Thr Cys Cys
2210 2215 2220
Thr Gly Gly Gly Cys Thr Ala Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly Cys Thr
2225 2230 2235 2240
Gly Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys
2245 2250 2255
Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Thr Gly Ala Thr Thr Thr Gly Cys Ala
2260 2265 2270
Ala Cys Ala Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys
2275 2280 2285
Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly
2290 2295 2300
Gly Ala Thr Thr Gly Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala
2305 2310 2315 2320
Gly Thr Cys Ala Thr Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Thr
2325 2330 2335
Thr Ala Gly Thr Gly Ala Thr Cys Gly Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly
2340 2345 2350
Gly Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Ala Ala Thr Cys Ala Thr Thr Gly
2355 2360 2365
Thr Gly Gly Thr Cys Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly Gly Cys Thr
2370 2375 2380
Gly Ala Ala Thr Ala Gly Cys Ala Thr Cys Cys Cys Thr Ala Ala Gly
2385 2390 2395 2400
Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala
2405 2410 2415
Thr Thr Thr Cys Ala Ala Thr Gly Cys Gly Ala Cys Ala Gly Ala Ala
2420 2425 2430
Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Cys Gly Ala Ala
2435 2440 2445
Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys
2450 2455 2460
Thr Gly Gly Gly Cys Ala Ala Thr Ala Ala Gly Ala Thr Cys Thr Ala
2465 2470 2475 2480
Cys Ala Thr Cys Thr Ala Cys Ala Cys Thr Cys Gly Gly Ala Gly Cys
2485 2490 2495
Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Thr Cys Cys Ala
2500 2505 2510
Ala Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr
2515 2520 2525
Cys Ala Thr Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Gly Ala Thr
2530 2535 2540
Thr Ala Thr Thr Cys Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys Cys Gly Gly Ala
2545 2550 2555 2560
Thr Thr Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Cys Ala
2565 2570 2575
Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Thr Cys Ala Ala Gly Ala
2580 2585 2590
Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala Cys Gly Ala Gly Thr
2595 2600 2605
Gly Thr Cys Cys Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Thr Ala Gly
2610 2615 2620
Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly Thr
2625 2630 2635 2640
Ala Thr Cys Ala Cys Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala Cys Ala
2645 2650 2655
Cys Ala Gly Ala Cys Gly Cys Thr Thr Ala Thr Cys Cys Thr Cys Thr
2660 2665 2670
Gly Ala Ala Cys Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Thr
2675 2680 2685
Ala Thr Cys Gly Thr Gly Thr Cys Thr Ala Gly Thr Gly Thr Cys Ala
2690 2695 2700
Thr Thr Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Ala Ala
2705 2710 2715 2720
Ala Ala Gly Thr Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Ala Thr Cys Cys Cys
2725 2730 2735
Gly Thr Cys Ala Thr Cys Ala Cys Ala Thr Ala Cys Ala Gly Cys Ala
2740 2745 2750
Cys Cys Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr
2755 2760 2765
Gly Ala Ala Cys Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Thr
2770 2775 2780
Cys Thr Gly Ala Ala Thr Ala Gly Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala
2785 2790 2795 2800
Gly Cys Gly Cys Cys Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ala Cys Cys Ala Cys
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Ala Ala Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys
2820 2825 2830
Cys Ala Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Thr
2835 2840 2845
Ala Thr Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Ala Cys Ala Thr Cys Gly Thr
2850 2855 2860
Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Cys Cys Ala Thr Ala Ala Ala
2865 2870 2875 2880
Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys
2885 2890 2895
Ala Gly Cys Cys Cys Ala Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Thr Ala Ala
2900 2905 2910
Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Ala Thr Thr Cys Cys Thr Ala Ala Ala
2915 2920 2925
Ala Gly Thr Thr Gly Thr Thr Cys Ala Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly
2930 2935 2940
Gly Gly Thr Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala
2945 2950 2955 2960
Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Cys
2965 2970 2975
Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Thr Gly Ala
2980 2985 2990

Claims (17)

1.一种免疫原性融合蛋白，包含与选自由下列组成的组的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽：
-包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基26至979的多肽，
-包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基26至979的多肽，和
-包含SEQ ID NO：5的氨基酸残基26至979的多肽。
2.一种免疫原性组合物，包含：
与选自由下列组成的组的融合多肽具有至少90％的序列同一性的多肽：
-包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基26至979的多肽，
-包含SEQ ID NO：3的氨基酸残基26至979的多肽，和
-包含SEQ ID NO：5的氨基酸残基26至979的多肽，
和药学上可接受的赋形剂。
3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物还包含免疫佐剂。
4.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其中，所述佐剂包含：(a)聚磷腈；(b)CpG寡核苷酸或聚(I:C)；和(c)宿主防御肽。
5.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述组合物用于向人类受试者施用。
6.根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，将所述佐剂与粘膜粘附性脂质载体一起配制以产生粘膜粘附性脂质载体系统。
7.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中，所述系统的所述粘膜粘附性脂质载体包含阳离子脂质体。
8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中，所述粘膜粘附性脂质载体包含选自以下各项的一种或多种阳离子脂质：1,2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷(DOTAP)；3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基](DC)；二甲基双十八烷基铵(DDA)；十八烷基胺(SA)；二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；卵L-α-磷脂酰胆碱(EPC)；胆固醇(Chol)；二硬脂酰磷脂酰胆喊(DSPC)；1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲铵-丙烷(DMTAP)；二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)；或者神经酰胺氨基甲酰基-精胺(CCS)。
9.一种治疗或预防受试者中RSV和/或PIV3感染的方法，包括向所述受试者施用根据权利要求1所述的融合蛋白，从而治疗或预防所述受试者中的所述RSV和/或PIV3感染。
10.一种治疗或预防受试者中RSV和/或PIV3感染的方法，包括向所述受试者施用根据权利要求2所述的免疫原性组合物，从而治疗或预防所述受试者中的所述RSV和/或PIV3感染。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述免疫原性组合物还包含免疫佐剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述佐剂包含：(a)聚磷腈；(b)CpG寡核苷酸或聚(I:C)；和(c)宿主防御肽。
13.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述受试者是人类受试者。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，将所述佐剂与粘膜粘附性脂质载体一起配制以产生粘膜粘附性脂质载体系统。
15.根据权利要求14所述的免疫原性组合物，其中，所述系统的所述粘膜粘附性脂质载体包含阳离子脂质体。
16.根据权利要求15所述的免疫原性组合物，其中，所述粘膜粘附性脂质载体包含选自以下各项的一种或多种阳离子脂质：1,2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷(DOTAP)；3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基](DC)；二甲基双十八烷基铵(DDA)；十八烷基胺(SA)；二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；卵L-α-磷脂酰胆碱(EPC)；胆固醇(Chol)；二硬脂酰磷脂酰胆喊(DSPC)；1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲铵-丙烷(DMTAP)；二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)；或者神经酰胺氨基甲酰基-精胺(CCS)。
17.根据权利要求9或10所述的方法，其中，肠道外、肌内、静脉内、腹膜内、皮下、口服、鼻内或者作为气溶胶施用所述组合物。
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