KR20220141302A - 코로나 바이러스 백신 제제 - Google Patents

Abstract

백신에 사용하기에 적합한 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질 및 이를 포함하는 나노입자가 본 명세서에 개시된다. 나노 입자는 향상된 안정성과 우수한 면역원성을 초래하는 세제 코어로 둘러싸여 있고 이와 관련된 병원체로부터의 항원을 제시한다. 백신 및 나노입자를 제조하기 위한 투여량, 제형 및 방법이 또한 개시된다.

Description

코로나 바이러스 백신 제제

본 발명은 일반적으로 면역 반응을 자극하는 데 유용한 비천연 발생 코로나바이러스(CoV) 스파이크(S) 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 나노입자 및 백신에 관한 것이다. 나노입자는 선택적으로 세제 코어와 관련된 항원, 예를 들어, 당단백질 항원을 제공하고 일반적으로 재조합 접근법을 사용하여 생산된다. 나노입자는 개선된 안정성과 향상된 에피토프 제공을 가진다. 본 발명은 또한 나노입자를 함유하는 조성물, 이를 생산하는 방법, 및 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.

감염성 질환은 전 세계적으로 문제로 남아 있다. 일부 병원체에 대한 백신 개발에 진전이 있었지만 많은 것이 인간 건강에 위협으로 남아 있다. 급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)(우한 코로나바이러스 및 SARS-CoV-2라고도 함)의 발병은 중국에서 2000명 이상을 감염시켰고 최소 17명을 사망시켰다. 최근, SARS-CoV-2 코로나바이러스가 미국, 태국, 한국, 대만 및 일본으로 확산되었다. SARS-CoV-2 코로나바이러스는 지난 17년 동안 수백 명을 사망시킨 중증 급성 호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV) 및 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)와 같은 바이러스 계열에 속한다. SARS-CoV-2는 질환 COVID-19를 유발한다.

SARS-CoV-2 코로나바이러스와 같은 생명을 위협하는 전염병의 중증도를 예방하거나 감소시키는 백신의 개발이 바람직하다. 그러나, 인간 백신 개발은 병원체의 고도로 정교한 회피 메커니즘과 백신 안정화의 어려움으로 인해 여전히 힘들다. 최적의 경우, 백신은 감염원을 차단하거나 중화하는 항체를 유도하고 냉장이 불가능한 환경을 비롯한 다양한 환경에서 안정적으로 유지되어야 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 SARS-CoV-2(우한 CoV 및 2019-nCoV라고도 함)에 대한 면역 반응을 유도하기에 적합한 비천연 CoV S 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 당단백질을 함유하는 나노입자뿐만 아니라 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 SARS-CoV-2, 중동 호흡기 증후군(MERS) 및 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)을 포함하는 다중 코로나바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기에 적합한 CoV S 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.

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도 1은 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질의 야생형 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1)의 개략도를 나타낸다. 푸린 절단 부위 RRAR(SEQ ID NO: 6)은 굵게 강조 표시되고 신호 펩타이드는 밑줄이 그어진다.
도 2는 비활성 푸린 절단 부위, 융합 펩타이드 결실, 및 K986P 및 V987P 돌연변이를 갖는 SARS-CoV-2 S 폴리펩타이드의 1차 구조를 도시한다. 도메인 위치는 신호 펩타이드를 함유하는 SARS-CoV-2로부터의 야생형 CoV S 폴리펩타이드의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1)과 관련하여 번호가 매겨진다.
도 3은 비활성 푸린 절단 부위, 아미노산 819-828의 융합 펩타이드 결실, 및 K986P 및 V987P 돌연변이를 갖는 BV2378 CoV S 폴리펩타이드의 1차 구조를 나타낸다. 도메인 위치는 신호 펩타이드를 함유하는 SARS-CoV-2로부터의 야생형 CoV S 폴리펩타이드의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1)과 관련하여 번호가 매겨진다.
도 4는 CoV S 폴리펩타이드 BV2364, BV2365, BV2366, BV2367, BV2368, BV2369, BV2373, BV2374, 및 BV2375의 정제를 나타낸다. 데이터는 QQAQ(SEQ ID NO: 7)의 아미노산 서열을 갖는 불활성 푸린 절단 부위를 갖는 BV2365(SEQ ID NO: 4) 및 BV2373(SEQ ID NO: 87)이 단일 사슬(S0)으로 발현된다. 대조적으로, 절단 생성물 S2의 존재에 의해 명백한 바와 같이 온전한 푸린 절단 부위(예를 들어, BV2364, BV2366 및 BV2374)를 함유하는 CoV S 폴리펩타이드는 절단된다.
도 5는 CoV S 폴리펩타이드 BV2361, BV2365, BV2369, BV2365, BV2373 및 BV2374가 생물층 간섭계에 의해 인간 안지오텐-전환 효소 2 전구체(hACE2)에 결합함을 나타낸다.
도 6은 SARS-CoV-2의 BV2361이 MERS-CoV 수용체인 다이펩티딜 펩티다제 IV(DPP4)와 결합하지 않고 MERS S 단백질이 생물층 간섭계에 의해 인간 안지오텐신-전환 효소 2 전구체(hACE2)에 결합하지 않음을 나타낸다.
도 7은 BV2361이 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 hACE2에 결합함을 나타낸다.
도 8은 BV2373 CoV S 폴리펩타이드의 1차 구조 및 푸린 절단 부위, K986P 및 V987P에 대한 변형을 나타낸다.
도 9는 야생형 CoV S 폴리펩타이드 및 CoV S 폴리펩타이드 BV2365 및 BV2373의 정제를 나타낸다.
도 10은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(EMB ID: 21374)의 cryoEM 구조에 중첩된 BV2373 CoV S 폴리펩타이드의 크라이로-전자 현미경(cryoEM) 구조를 보여준다.
도 11a-f는 CoV S 스파이크 폴리펩타이드 BV2365 및 BV2373이 hACE2에 결합함을 보여준다. 생물층 간섭계는 BV2365(도 11b) 및 BV2373(도 11c)이 야생형 CoV S 폴리펩타이드(도 11a)와 유사한 해리 역학으로 hACE2에 결합한다는 것을 보여준다. ELISA는 야생형 CoV S 폴리펩타이(도 11d) 및 BV2365(도 11e)는 유사한 친화도로 hACE2에 결합하는 반면 BV2373은 더 높은 친화도로 hACE2에 결합한다(도 11f).
도 12a-b는 hACE2에 대한 CoV S 폴리펩타이드 BV2373(도 12a) 및 BV2365(도 12b)의 결합에 대한 온도, 2회의 동결/해동 주기, 산화, 교반 및 pH 극한과 같은 스트레스 조건의 효과를 나타낸다.
도 13a-b는 분획 A 및 분획 C 이스컴(iscom) 매트릭스(예를 들어, MATRIX-M^TM)와 함께 또는 없이 0.1㎍ 내지 10㎍의 BV2373의 2회 용량(도 13a) 및 1회 용량(도 13b)에 의한 마우스의 면역화 13일, 21일 및 28일 후에 항-CoV S 폴리펩타이드 IgG 역가를 나타낸다.
도 14는 MATRIX-M^TM과 함께 또는 없이 0.1㎍ 내지 10㎍의 BV2373의 1회 용량 또는 2회 용량로 면역화된 마우스에서 hACE2의 상호작용을 차단하는 항체의 유도를 나타낸다.
도 15는 MATRIX-M^TM과 함께 또는 없이 0.1㎍ 내지 10㎍의 BV2373의 1회 용량 또는 2회 용량으로 면역화된 마우스에서 검출된 바이러스 중화 항체를 나타낸다.
도 16은 MATRIX-M^TM과 함께 또는 없이 14일 간격으로 BV2373의 1회 용량 또는 BV2373의 2회 용량으로 면역화된 Ad/CMV/hACE2 마우스의 폐에서 바이러스 로드(SARS-CoV-2)를 나타낸다.
도 17a-c는 BV2373으로 면역화한 후 마우스에 의해 나타난 체중 감소를 나타낸다. 도 17a는 1회 0.01㎍, 0.1㎍, 1㎍, 또는 10㎍의 BV2373 + MATRIX-M^TM에 의한 체중 감소에 대한 면역화의 효과를 나타낸다. 도 17b는 BV2373(0.01㎍, 0.1㎍, 1㎍)과 MATRIX-M^TM의 2회 용량으로 체중 감소에 대한 면역화 효과를 보여준다. 도 17c는 MATRIX-M^TM의 존재 또는 부재하에 2회 용량의 BV2373(10㎍)에 의한 체중 감소에 대한 면역화의 효과를 나타낸다.
도 18a-b는 SARS-CoV-2 감염 4일(도 18a) 또는 7일(도 18b) 마우스의 폐 조직병리학에 대한 BV2373의 효과를 보여준다.
도 19는 MATRIX-M^TM의 존재하에 BV2373으로 면역화된 마우스와 비교하여 항원보강제의 부재하에서 BV2373으로 면역화된 마우스의 비장에서 생체외 자극 후 IFN-γ 분비 세포의 수를 나타낸다.
도 20a-e는 MATRIX-M^TM의 존재 또는 부재하에서 BV2373으로 면역화된 마우스의 비장에서 CD4+ T 세포를 분비하는 사이토카인의 빈도를 나타낸다. 도 20a는 CD4+ T 세포를 분비하는 IFN-γ의 빈도를 나타낸다. 도 20b는 CD4+ T 세포를 분비하는 TNF-α의 빈도를 나타낸다. 도 20c는 CD4+ T 세포를 분비하는 IL-2의 빈도를 나타낸다. 도 20d는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2로부터 선택된 2개의 사이토카인을 분비하는 CD4+ T 세포의 빈도를 나타낸다. 도 20e는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 발현하는 CD4+ T 세포의 빈도를 나타낸다.
도 21a-e는 MATRIX-M^TM의 존재 또는 부재하에서 BV2373으로 면역화된 마우스의 비장에서 사이토카인 분비 CD8⁺ T 세포의 빈도를 나타낸다. 도 21a는 CD8⁺ T 세포를 분비하는 IFN-γ의 빈도를 나타낸다. 도 21b는 CD8⁺ T 세포를 분비하는 TNF-α의 빈도를 나타낸다. 도 21c는 CD8+ T 세포를 분비하는 IL-2의 빈도를 나타낸다. 도 21d는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2로부터 선택된 2개의 사이토카인을 분비하는 CD8⁺ T 세포의 빈도를 나타낸다. 도 21e는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 발현하는 CD8⁺ T 세포의 빈도를 나타낸다.
도 22는 MATRIX-M^TM의 존재 또는 부재하에서 BV2373으로 면역화된 마우스의 비장에서 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2로부터 선택된 1개(단일), 2개(이중) 또는 3개(삼중) 사이토카인을 발현하는 CD4⁺ 또는 CD8⁺ 세포의 빈도를 예시한다.
도 23a-c는 CD4⁺ T 세포로부터의 유형 2 사이토카인 분비에 대한 MATRIX-M^TM의 존재 또는 부재하에서 BV2373에 의한 면역화의 효과를 예시한다. 도 23a는 IL-4 분비 세포의 빈도를 나타낸다. 도 23b는 IL-5 CD4⁺ 분비 세포의 빈도를 나타낸다. 도 23c는 CD4⁺ T 세포를 분비하는 IL-4에 대한 IFN-γ 분비의 비율을 나타낸다.
도 24a-b는 CD4⁺ T 여포 보조 세포(TFH)의 존재를 평가함으로써 배 중심 형성에 대한 MATRIX-M^TM의 존재 또는 부재하에서 BV2373에 의한 마우스 면역화의 효과를 예시한다. 도 24a는 비장에서 CD4+ T 여포 헬퍼 세포의 빈도를 나타내고, 도 24b는 CD4⁺ T 여포 헬퍼 세포의 표현형(예를 들어, CD4⁺ CXCR5⁺ PD-1⁺)을 나타낸다.
도 25a-b는 배 중심(GC) B 세포의 존재를 평가함으로써 배 중심 형성에 대한 MATRIX-M^TM의 존재 또는 부재하에서 BV2373에 의한 마우스 면역화의 효과를 예시한다. 도 25a는 비장에서 GC B 세포의 빈도를 나타내고, 도 25b는 CD4⁺ T 여포 헬퍼 세포의 표현형(예를 들어, CD19⁺ GL7⁺ CD-95⁺)을 나타낸다.
도 26a-c는 올리브 개코원숭이에서 항체 반응에 대한 MATRIX-M^TM의 존재 또는 부재하에서 BV2373에 의한 면역화의 효과를 나타낸다. 도 26a는 BV2373으로 면역화한 후 개코원숭이에서 항-SARS-CoV-2 S 폴리펩타이드 IgG 역가를 나타낸다. 도 26b는 MATRIX-M^TM의 존재하에서 5㎍ 또는 25㎍의 BV2373에 의한 단일 면역화 후 개코원숭이에서 항체를 차단하는 hACE2의 존재를 나타낸다. 도 26c는 BV2373 및 MATRIX-M^TM으로 단일 면역화 후 바이러스 중화 항체의 역가를 나타낸다.
도 27은 BV2373으로 면역화한 후 올리브 개코원숭이에서 항-SARS-CoV-2 S 폴리펩타이드 IgG와 중화 항체 역가 사이의 유의한 상관관계를 나타낸다.
도 28은 MATRIX-M^TM의 존재 또는 부재하에서 BV2373으로 면역화된 올리브 개코원숭이의 말초혈 단핵 세포(PBMC)에서 IFN-γ 분비 세포의 빈도를 나타낸다.
도 29a-e는 MATRIX-M^TM의 존재 또는 부재하에서 BV2373으로 면역화된 올리브 개코원숭이의 PBMC에서 CD4+ T 세포를 분비하는 사이토카인의 빈도를 나타낸다. 도 29a는 CD4+ T 세포를 분비하는 IFN-γ의 빈도를 보여준다. 도 29b는 CD4+ T 세포를 분비하는 IL-2의 빈도를 나타낸다. 도 29c는 CD4+ T 세포를 분비하는 TNF-α의 빈도를 나타낸다. 도 29d는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2로부터 선택된 2개의 사이토카인을 분비하는 CD4+ T 세포의 빈도를 나타낸다. 도 29e는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 발현하는 CD4+ T 세포의 빈도를 나타낸다.
도 30은 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질(SEQ ID NO: 109)(BV2384)의 개략도를 나타낸다. 푸린 절단 부위 GSAS(SEQ ID NO: 97)는 한 번 밑줄이 그어져 있고, K986P 및 V987P 돌연변이는 두 번 밑줄이 그어져 있다.
도 31은 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질(SEQ ID NO: 86)(BV2373)의 개략도를 나타낸다. 푸린 절단 부위 QQAQ(SEQ ID NO: 7)는 한 번 밑줄이 그어져 있고, K986P 및 V987P 돌연변이는 두 번 밑줄이 그어져 있다.
도 32는 CoV S 폴리펩타이드 BV2373(SEQ ID NO: 87) 및 BV2384(SEQ ID NO: 109)의 정제를 나타낸다.
도 33은 정제 후 BV2384(SEQ ID NO: 109) 순도의 주사 농도계 플롯을 나타낸다.
도 34는 정제 후 BV2373(SEQ ID NO: 87) 순도의 주사 농도계 플롯을 나타낸다.
도 35a-b는 BV2373 및 MATRIX-M^TM의 투여에 반응하여 항-S 항체(도 35a) 및 중화 항체(도 35b)의 유도를 예시한다. 시노몰구스 원숭이는 2.5㎍, 5㎍ 또는 25㎍의 BV2373과 25㎍ 또는 50㎍ MATRIX-M^TM 항원보강제를 1회 또는 2회(0일 및 21일) 용량으로 투여되었다. 대조군은 BV2373 또는 MATRIX-M^TM가 투여되지 않았다. 항체는 21일 및 33일에 측정되었다.
도 36a-b는 사이노몰구스 원숭이의 기관지폐포 세척액(BAL)에서 평가된 바와 같이 본 명세서에 개시된 백신 제제에 의한 SARS-CoV-2 바이러스 복제의 감소를 예시한다. 사이노몰구스 원숭이는 표시된 대로 BV2373 및 MATRIX-M^TM을 투여받았다. 대상은 0일과 0일 및 21일에 2회 용량으로 그룹에서 면역화되었다. 대상 동물은 37일에 1x104 pfu SARS-CoV-2 바이러스로 면역성 검사되었다. 바이러스 RNA(도 36a, 존재하는 총 RNA에 해당) 및 바이러스 서브게놈 RNA(도 36b, 복제 바이러스에 해당) 수준은 감염성 바이러스에 대한 공격 후 2일 및 4일에 세기관지 세척(BAL)에서 평가되었다(d2pi 및 d4pi). 대부분의 대상은 바이러스 RNA를 나타내지 않았다. 2일에 일부 대상에서 소량의 RNA가 측정되었다. 4일까지 2.5㎍의 가장 낮은 용량에서 2명의 대상을 제외하고는 RNA가 측정되지 않았다. 하위 게놈 RNA는 1명의 대상을 제외하고 다시 최저 용량에서 2일 또는 4일에 검출되지 않았다.
도 37a-b는 사이노몰구스 원숭이의 비강 면봉에서 평가된 바와 같이 본 명세서에 개시된 백신 제형에 의한 SARS-CoV-2 바이러스 복제의 감소를 예시한다. 사이노몰구스 원숭이는 표시된 대로 MATRIX-M^TM과 함께 BV2373을 투여받았다. 대상은 0일과 21일에 2회 투여로 그룹으로 면역화되었다. 대상 동물은 37일에 1x10⁴ SARS-CoV-2 바이러스로 면역섬 검사되었다. 바이러스 RNA(도 37a) 및 바이러스 서브게놈(sg) RNA(도 37b)를 감염 2일 및 4일 후에 비강 면봉으로 평가하였다(d2pi 및 d4pi). 대부분의 대상은 바이러스 RNA를 나타내지 않았다. 2일 및 4일에 소량의 RNA가 일부 대상에서 측정되었다. 서브게놈 RNA가 2일 또는 4일에 검출되지 않았다. 대상은 0일과 0일 및 21일에 2회 용량으로 그룹에서 면역화되었다. 이 데이터는 백신이 코 전체 바이러스 RNA를 100 - 1000배 및 sgRNA를 감지할 수 없는 수준으로 감소시키고 백신에 대한 면역 반응이 바이러스 복제를 차단하고 바이러스 확산 방지를 예방할 것임을 확인한다.
도 38a-b는 1회 용량(도 38a) 또는 2회 용량의 BV2373 및 25㎍ 또는 50㎍의 MATRIX-M^TM(도 38b)으로 시노몰구스 원숭이를 면역화한 후 21일 및 35일 후에 항-CoV S 폴리펩타이드 IgG 역가를 나타낸다.
38c-38d는 1회 용량(도 38c) 또는 2회 용량의 BV2373(5㎍) 및 MATRIX-M^TM(25㎍ 또는 50㎍)으로 시노몰구스 원숭이를 면역화 21일 및 35일 후에 시노몰구스 원숭이의 hACE2 억제 역가를 나타낸다(도 38d).
도 38e는 BV2373 및 MATRIX-M^TM의 투여 후 시노몰구스 원숭이에서 항-CoV S 폴리펩타이드 IgG 역가와 hACE2 억제 역가 사이의 유의한 상관관계를 보여준다. 데이터는 표 4의 그룹 2-6에 대해 표시된다.
도 39는 2회 용량의 BV2373 및 MATRIX-M^TM으로 면역화 35일 후 또는 회복기 인간 혈청으로 면역화한 후 시노몰구스 원숭이의 항-CoV S 폴리펩타이드 역가 및 hACE2 억제 역가를 나타낸다(그룹 2, 4 및 6). 이 데이터는 BV2373 및 MATRIX-M^TM으로 면역화된 시노몰구스 원숭이의 항-CoV S 폴리펩타이드 및 hACE2 억제 역가가 회복기 혈청으로 면역화된 시노몰구스 원숭이보다 우수함을 나타낸다.
40a-b는 세포변성 효과(CPE)(도 40a) 및 플라크 감소 중화 테스트(PRNT)(도 40b)에 의해 결정된 BV2373 및 MATRIX-M^TM으로 면역화된 사이노몰구스 원숭이의 SARS-CoV-2 중화 역가를 나타낸다.
도 41은 BV2373 및 선택적으로 MATRIX-M^TM을 포함하는 백신의 안전성 및 효능을 평가한 임상 시험의 투여 시기를 나타낸다. AESI는 특별한 관심의 부작용을 나타낸다. MAEE는 의학적으로 발생하는 유해 사례를 나타내고 SAE는 심각한 유해 사례를 나타낸다.
도 42a-b는 BV2373 및 MATRIX-M^TM을 포함하는 백신을 평가한 임상 시험에서 환자가 경험한 국소(도 42a) 및 전신 유해 사례(도 4b)를 나타낸다. 그룹 A-E는 표 5에 나와 있다. 데이터는 백신이 잘 견디고 안전하다는 것을 나타낸다.
도 43a-b는 BV2373 및 MATRIX-M^TM을 포함하는 백신을 평가한 임상 시험에서 참가자의 면역화 21일 및 35일 후 항-CoV S 폴리펩타이드 IgG(도 43a) 및 중화 역가(도 43b)를 나타낸다. 가로 막대는 각각 사분위수 범위(IRQ)와 곡선 아래의 중앙값을 나타낸다. 수염 끝점은 IQR의 중앙값 ± 1.5배 이하 또는 이상의 최대값 및 최소값과 같다. 회복기 혈청 패널은 베일러 의대의 PCR 확인 COVID-19 참가자의 검체(ELISA 검체 29개, 미세중화 검체 32개(MN IC>99))를 포함한다. COVID-19의 중증도는 입원 환자의 빨간색 표시(중환자실 포함), 외래 치료 환자의 경우 파란색 표시(응급실에서 수집한 검체), 및 무증상(노출된) 환자에 대한 녹색 표시(접촉/노출 평가에서 수집한 검체)로 표시된다.
도 44a-c는 회복기 혈청(도 44a), 2회 25㎍ 용량의 BV2373(도 44b), 및 MATRIX-M^TM과 함께 2회 용량(5㎍ 및 25㎍)의 BV2373(도 44c)이 투여된 환자에서 항-CoV S 폴리펩타이드 IgG와 중화 항체 역가 사이의 상관관계를 보여준다. 회복기 혈청 또는 항원보강제 BV2373으로 치료받은 환자에서 중화 항체 역가와 항-CoV-S IgG 역가 사이에 강한 상관관계가 관찰되었지만 항원보강제가 없는 BV2373으로 치료받은 환자에서는 그렇지 않았다.
도 45a-d는 T 헬퍼 1(Th1) 사이토카인 인터페론-감마(IFN γ), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 및 인터루킨(IL)-2 및 T 헬퍼2(Th2) 사이토카인 IL-5 및 IL 13을 생성하는 항원 특이적 CD4⁺ T 세포의 빈도는 BV2373을 사용한 자극 후 그룹 A(위약, 도 45a), B(25㎍ BV2373, 도 45b), C(5㎍ BV2373 및 50㎍ MATRIX-M^TM, 도 45c) 및 D(25㎍ BV2373 및 50㎍ MATRIX-M^TM, 도 45d)에 있는 참가자의 사이토카인을 나타낸다. Th1 사이토카인 패널에서 "Any 2"는 두 가지 유형의 Th1 사이토카인을 동시에 생성할 수 있는 CD4⁺ T 세포를 의미한다. "모두 3"은 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 동시에 생성하는 CD4⁺ T 세포를 나타낸다. Th2 패널에서 "둘 다"는 Th2 사이토카인 IL-5 및 IL-13을 동시에 생성할 수 있는 CD4⁺ T 세포를 의미한다.
도 46a는 SEQ ID NO: 1과 관련하여 번호가 매겨진 신호 펩타이드를 함유하는 야생형 SARS-CoV-2 S 폴리펩타이드의 1차 구조를 나타낸다. 도 46b는 신호 펩타이드가 없는 SEQ ID NO: 2에 대해 번호가 매겨진 야생형 SARS-CoV-2 S 폴리펩타이드의 야생형의 1차 구조를 나타낸다.

정의

본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에 명백하게 달리 지시되어 있지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "단백질"에 대한 언급은 하나의 단백질 또는 이러한 단백질의 혼합물을 의미할 수 있고, "방법"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 등가 단계 및/또는 방법에 대한 언급을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항원보강제"는 면역원과 조합하여 사용될 때, 면역원에 대해 유도된 면역 반응을 증가시키거나 변경시키거나 변형시키는 화합물을 의미한다. 면역 반응의 변형은 항체 및 세포 면역 반응의 하나 또는 모두의 특이성을 강화시키거나 확대시키는 것을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 수치에 선행할 때 용어 "약" 또는 "대략"은 ±10%의 범위 값을 나타낸다. 예를 들어, "약 100"은 90과 110을 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "면역원", "항원" 및 "에피토프"는 당단백질을 비롯한 단백질 및 면역 반응을 유도할 수 있는 펩타이드와 같은 물질을 의미한다.

본 명세서에 사용된 "면역원성 조성물"은 대상에 대한 조성물의 투여가 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 대상에서 발현을 초래하는 항원을 포함하는 조성물이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "서브유닛" 조성물, 예를 들어 백신은 하나 이상의 선택된 항원을 포함하나 병원체의 모든 항원을 포함하지 않는다. 이러한 조성물은 손상되지 않은 바이러스 또는 이러한 세포 또는 입자의 용해물을 실질적으로 함유하지 않고 전형적으로 병원체로부터의 적어도 부분적으로 정제된, 종종 실질적으로 정제된 면역원성 폴리펩타이드로부터 제조된다. 본 발명에 개시된 서브유닛 조성물에서 항원은 종종 바큘로바이러스 시스템을 사용하여 통상적으로 재조합적으로 제조된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "실질적으로"는 물질이 이것이 함유된 샘플의 큰 백분율을 구성하는 물질(예를 들어, 화합물, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드)의 분리를 의미한다. 예를 들어, 한 샘플에서, 실질적으로 정제된 성분은 샘플의 85%, 바람직하게는 85%-90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%-99.5% 및 가장 바람직하게는 99%를 포함한다. 성분이 실질적으로 대체되는 경우, 샘플에 남아있는 양은 약 0.5% 내지 약 10% 이하, 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 1.0% 이하이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"는 유익한 또는 바람직한 결과, 예를 들어 임상 결과를 얻는 접근법을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익한 또는 바람직한 결과는 감염 또는 질환의 개시 또는 진행을 억제 또는 억압; 감염 또는 질환의 증상의 발현을 개선 또는 감소; 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "예방(prevention)"은 "예방(prophylaxis)"과 상호교환적으로 사용되며 감염 또는 질환의 완전한 예방 또는 그 감염 또는 질환의 증상의 발현의 예방; 감염 또는 질환 또는 증상의 개시 지연; 또는 이후에 발현된 감염 또는 질환 또는 이의 증상의 심각성의 감소를 의미할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 병원체 감염의 적어도 하나의 증상을 감소시키는 면역 반응을 유도하기에 충분한 면역원의 양을 의미한다. 유효 투여량 또는 유효량은 예를 들어 중화 분비물 및/또는 혈청 항체의 양을, 예를 들어 플라크 중화, 보체 고정, 효소-결합 면역 흡착제(ELISA) 또는 미세중화 분석에 의해 측정함으로써 결정될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "백신"은 보호 면역(예를 들어, 병원체에 의한 감염에 대항하여 대상을 보호 및/또는 병원체에 의한 감염에 의해 유발된 질환 또는 상태의 심각성을 감소시키는 면역)을 제공하는 병원체에 대항하는 면역 반응을 유도하는데 사용되는 병원체로부터 유래된 면역원과 같은 면역원성 조성물을 의미한다. 보호 면역 반응은 항체의 형성 및/또는 세포-매개 반응의 형성을 포함할 수 있다. 문맥에 따라, 용어 "백신"은 보호 면역을 만들기 위해 대상에게 투여되는 면역원의 현탁액 또는 용액을 의미할 수도 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 인간 및 다른 동물을 포함한다. 통상적으로, 대상은 인간이다. 예를 들어, 대상은 성인, 십대, 어린이(2세 내지 14세), 유아(생후 내지 2년) 또는 신생아(2개월까지)일 수 있다. 특정 양태에서, 대상은 4개월령까지 또는 6개월령까지이다. 일부 양태에서, 성인은 65세 이상, 또는 약 60세 이상의 노인이다. 일부 양태에서, 대상은 임산부 또는 임신하려고 하는 여성이다. 다른 양태에서, 대상은 인간이 아니며; 예를 들어, 비인간 영장류; 예를 들어, 개코원숭이, 침팬지, 고릴라 또는 필리핀 원숭이이다. 특정 양태에서, 대상은 개 또는 고양이와 같은 애완 동물일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 포유류 및 더욱 구체적으로 인간에서의 사용을 위해 미국 연방 정부 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전, 유럽 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다. 이러한 조성물은 척추 동물에서 보호 면역 반응을 유도하기위한 백신 및/또는 항원 조성물로서 유용할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "약"은 표시된 수치의 ±10%를 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "NVX-CoV2373"은 BV2373 스파이크 당단백질(SEQ ID NO: 87) 및 분획 A 및 분획 C 이스컴(iscom) 매트릭스(예를 들어, MATRIX-M^TM)를 포함하는 백신 조성물을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, CoV S 폴리펩타이드를 지칭하는 용어 "변형"은 CoV S 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산의 돌연변이, 결실 또는 첨가를 지칭한다. CoV S 폴리펩타이드 내 변형의 위치는 폴리펩타이드의 서열을 SEQ ID NO: 1(신호 펩타이드를 함유하는 CoV S 폴리펩타이드) 또는 SEQ ID NO: 2(신호 펩타이드가 없는 성숙한 CoV S 폴리펩타이드)에 정렬하는 것에 기초하여 결정될 수 있다.

코로나바이러스(CoV) 스파이크(S) 단백질을 함유하는 백신 조성물

본 발명은 비천연 발생 코로나바이러스(CoV) 스파이크(S) 폴리펩타이드, CoV S 폴리펩타이드를 함유하는 나노입자, 및 비천연 발생 CoV S 폴리펩타이드 또는 CoV S 폴리펩타이드를 함유하는 나노입자를 함유하는 면역원성 조성물 및 백신 조성물을 제공한다. 실시태양에서, 면역 반응을 자극하기 위해 CoV S 폴리펩타이드, 나노입자, 면역원성 조성물 및 백신 조성물을 사용하는 방법이 본 명세서에 제공된다.

또한 나노입자 및 백신 조성물의 제조 방법이 본 명세서에 제공한다. 유리하게는, 방법은 곤충 세포에서 단백질의 재조합 발현과 관련된 단백질과 같은 다른 단백질에 의한 오염이 실질적으로 없는 나노입자를 제공한다. 실시태양에서, 발현은 바큘로바이러스/Sf9 시스템에서 발생한다.

CoV S 폴리펩타이드 항원

본 발명의 백신 조성물은 비-천연 발생 CoV S 폴리펩타이드를 함유한다. CoV S 폴리펩타이드는 SARS-CoV-2, 예를 들어 SARS-CoV-2, MERS CoV 및 SARS CoV를 포함하나 이에 제한되지 않는 코로나바이러스로부터 유래될 수 있다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SARS-CoV-2의 변이체로부터 유래된다. 실시태양에서, SARS-CoV-2의 변이체는 SARS-CoV-2 VUI 202012/01, B. 1.1.7, 501Y.V2, Cal.20C 또는 P.1이다. SARS-CoV S 단백질과 달리, SARS-CoV-2 S 단백질은 S1/S2 절단 부위에 4개의 아미노산이 삽입되어 다염기성 RRAR 푸린 유사 절단 모티프를 생성한다. SARS-CoV-2 S 단백질은 푸린 절단 부위에서 단백질분해적으로 S1 및 S2 소단위로 절단되는 비활성 전구체(S0)로 합성되며, 이는 비공유 결합으로 유지되어 융합 전 삼량체를 형성한다. SARS-CoV-2 S 단백질의 S2 도메인은 융합 펩타이드(FP), 2개의 헵타드 반복부(HR1 및 HR2), 막횡단(TM) 도메인 및 세포질 꼬리(CT)를 포함한다. SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 도메인은 4개 별개의 도메인: N-말단 도메인(NTD) 및 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하는 C-말단 도메인 및 2개의 서브도메인 SD1 및 SD2로 접힌다. 융합 전 SARS-CoV-2 S 단백질 삼량체는 S-단백질 수용체 결합 및 절단 시 융합 전에서 융합 후 형태로 구조적 재배열을 겪는다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 번역 후 글리코실화로 인한 당단백질이다. 당단백질은 신호 펩타이드, S1 서브유닛, S2 서브유닛, NTD, a, RBD, 2개의 서브도메인(SD1 및 SD2, 도 46a-b에서 SD1/2로 표시되고 여기서 "SD1/2"로 지칭됨), 온전한 또는 변형된 융합 펩타이드, HR1 도메인, HR2 도메인, TM 및 CD 중 적어도 하나 이상을 포함한다. 실시태양에서, 각 도메인에 대한 아미노산은 도 2 및 도 46a(SEQ ID NO: 1에 따라 표시됨), 도 46b(SEQ ID NO: 2에 따라 표시됨), 및 도 3(SEQ ID NO: 1에 따라 표시됨)에 제공된다. 실시태양에서, 각 도메인은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에서와 같이 각 도메인데 대한 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일성을 가질 수 있다. 각 도메인은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 표시된 것과 비교하여 최대 약 1개, 최대 약 2개, 최대 약 3개, 최대 약 4개, 최대 약 5개, 최대 약 10개, 최대 약 20개, 또는 최대 약 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다. 각 도메인은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 표시된 것과 비교하여 약 1 내지 약 5개 아미노산, 약 3 내지 약 10개 아미노산, 약 5 내지 10개 아미노산, 약 8 내지 12개 아미노산, 약 10 내지 15개 아미노산, 약 12개 내지 17개 아미노산, 약 15개 내지 20개 아미노산, 약 18개 내지 23개 아미노산, 약 20개 내지 25개 아미노산, 약 22개 내지 약 27개 아미노산, 또는 약 25개 내지 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다. 도 2 및 3은 성숙 펩타이드에 존재하지 않는 13개 아미노산 N-말단 신호 펩타이드를 예시한다. CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 자극하는 데 사용될 수 있다.

실시태양에서, 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)가 변형되어 비천연 생성 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드가 생성된다(도 1). 실시태양에서, CoV 스파이크(S) 당단백질은 S1 서브유닛 및 S2 서브유닛을 포함하고, 여기서 S1 서브유닛은 NTD, RBD, SD1/2, 및 불활성 푸린 절단 부위(아미노산 669-672)를 포함하고, 여기서 S2 서브유닛은 아미노산 973 및 974의 돌연변이를 포함하고;

여기서 NTD(아미노산 1-318)는

(a) NTD로부터 하나 이상의 아미노산의 결실, 선택적으로 하나 이상의 변형은 아미노산 56, 57, 131, 132, 229, 230, 231 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 및

(b) 아미노산 67, 229, 202, 139, 5, 233, 7, 13, 125, 177 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 선택적으로 포함하고;

여기서 RBD는 아미노산 488, 404, 471, 439, 426, 440, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 돌연변이를 선택적으로 포함하고;

여기서 SD1/2는 601, 557, 668, 642, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 돌연변이를 선택적으로 포함하고; 및

여기서 S2 서브유닛은

(a) 676-702, 702-711, 775-793에서 하나 이상의 아미노산의 결실;

(b) 융합 펩타이드로부터 하나 이상의 아미노산(아미노산 806-815)의 결실;

(c) 973, 974, 703, 1105, 688, 969, 및 1014로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 돌연변이; 및

(d) 막횡단 및 세포질 도메인(TMCT)으로부터 하나 이상의 아미노산의 결실(아미노산 1201-1260)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 선택적으로 포함하고,

여기서 CoV S 당단백질의 아미노산은 SEQ ID NO: 2에 대해 번호가 매겨진다.

도 3은 비활성 푸린 절단 부위, 결실된 융합 펩타이드(예를 들어, 아미노산 819-828의 결실), K986P 및 V987 돌연변이를 갖는 BV2378로 불리는 CoV S 폴리펩타이드를 나타내며, 여기서 아미노산은 SEQ ID NO: 1에 대해 번호가 매겨진다. 성숙한 BV2378 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-13인 신호 펩타이드의 하나 이상의 아미노산이 결여되어 있다.

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 융합 전 형태로 존재한다. 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 유연한 HR2 도메인을 포함한다. 달리 언급하지 않는 한 도메인의 유연성은 전이 전자 현미경(TEM) 및 2D 클래스 에버리징(class averaging)에 의해 결정된다. 전자 밀도의 감소는 유연한 영역에 해당한다.

CoV S 폴리펩타이드 항원 - S1 서브유닛에 대한 변형

S1 서브유닛의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 121)은 아래에 도시된다.

QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR

SEQ ID NO: 121의 밑줄 친 영역은 변형될 수 있는 S1 서브유닛 내의 아미노산을 나타낸다.

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 S1 서브유닛에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%의 동일성을 갖는 S1 서브유닛을 포함한다. S1 서브유닛은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 S1 서브유닛의 아미노산 서열과 비교하여 최대 약 1, 최대 약 2, 최대 약 3, 최대 약 4, 최대 약 5, 최대 약 10, 최대 약 15, 최대 약 20, 최대 약 25, 또는 최대 약 30개의 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다. S1 서브유닛은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 S1 서브유닛과 비교하여 약 1개 내지 약 5개 아미노산, 약 3개 내지 약 10개 아미노산, 약 5개 내지 10개 아미노산, 약 8개 내지 12개 아미노산, 약 10개 내지 15개 아미노산, 약 12개 내지 17개 아미노산, 약 15개 내지 20개 아미노산, 약 18개 내지 23개 아미노산, 약 20개 내지 25개 아미노산, 약 22개 내지 약 27개 아미노산, 또는 약 25개 내지 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다.

실시태양에서, S1 서브유닛은 표 1A에 도시된 변형의 임의의 조합을 함유할 수 있다.

[표 1A]

CoV S 폴리펩타이드 항원 - S1 서브유닛에 대한 변형 - NTD

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 NTD에 대한 하나 이상의 변형을 함유한다. 실시태양에서, NTD는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 14-305 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-292에 상응하는 SEQ ID NO: 118의 아미노산 서열을 갖는다.

NTD의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 118)은 아래에 도시된다.

QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKS

SEQ ID NO: 118의 밑줄 친 영역은 변형될 수 있는 NTD 내의 아미노산을 나타낸다.

실시태양에서, NTD는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 14 내지 331 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 318에 상응하는 SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 갖는다. NTD의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 45)은 아래에 도시된다.

QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPN

실시태양에서, NTD 및 RBD는 최대 약 1개 아미노산, 최대 약 5개 아미노산, 최대 약 10개 아미노산, 또는 최대 약 20개 아미노산까지 겹친다.

실시태양에서, 본 명세서에 제공된 NTD는 C-말단에서 최대 5개, 최대 10개, 최대 15개, 최대 20개, 최대 25개, 또는 최대 30개 아미노산까지 연장될 수 있다.

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 NTD에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 NTD를 포함한다. NTD는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 NTD의 아미노산 서열과 비교하여 최대 약 1개, 최대 약 2개, 최대 약 3개, 최대 약 4개, 최대 약 5개, 최대 약 10개, 최대 약 15개, 최대 약 20개, 최대 약 25개, 또는 최대 약 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다. NTD는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 NTD와 비교하여 약 1 내지 약 5개 아미노산, 약 3 내지 약 10개 아미노산, 약 5 내지 10개 아미노산, 약 8 내지 12개 아미노산, 약 10 내지 15개 아미노산, 약 12개 내지 17개 아미노산, 약 15개 내지 20개 아미노산, 약 18개 내지 23개 아미노산, 약 20개 내지 25개 아미노산, 약 22개 내지 약 27개 아미노산, 또는 약 25개 내지 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 N-말단 도메인(NTD)(SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-292에 상응)으로부터 하나 이상의 아미노산의 결실을 함유한다. 일부 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 NTD의 최대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 1220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 또는 292개의 아미노산의 결실을 함유한다.

일부 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 NTD로부터의 하나 이상의 아미노산(서열 번호 2의 아미노산 1-318에 상응)의 결실을 함유한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 NTD의 아미노산 1-318의 결실을 함유한다. 실시태양에서, NTD의 결실은 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드의 단백질 발현을 향상시킨다. 실시태양에서 NTD 결실을 갖는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NOS: 46, 48, 49, 51, 52, 및 54로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 실시태양에서, NTD 결실을 갖는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 50, 및 SEQ ID NO: 53으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분리된 핵산 서열에 의해 암호화된다.

실시태양에서, NTD는 표 1B에 도시된 변형의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 변형은 참조를 위한 성숙한 S 폴리펩타이드 서열인 SEQ ID NO:2와 관련하여 제시된다.

[표 1B]

CoV S 폴리펩타이드 항원 - S1 서브유닛에 대한 변형 - RBD

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 RBD에 대한 하나 이상의 변형을 함유한다. 실시태양에서, RBD는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 331-527 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 318-514에 상응하는 SEQ ID NO: 126의 아미노산 서열을 갖는다.

RBD의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 126)은 아래에 도시된다:

NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGP

SEQ ID NO: 126의 밑줄 친 영역은 변형될 수 있는 RBD 내의 아미노산을 나타낸다.

실시태양에서, RBD는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 335-530 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 322-517에 상응하는 SEQ ID NO: 116의 아미노산 서열을 갖는다. RBD의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 116)은 아래에 도시된다.

LCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKS

SEQ ID NO: 116의 밑줄 친 영역은 변형될 수 있는 RBD 내의 아미노산을 나타낸다.

실시태양에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 RBD는 N-말단 또는 C-말단에서 최대 1개 아미노산, 최대 5개 아미노산, 최대 10개 아미노산, 최대 15개 아미노산, 최대 15개 아미노산, 20개 아미노산, 최대 25개 아미노산 또는 최대 30개 아미노산까지 연장될 수 있다.

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 RBD에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 RBD를 포함한다. RBD는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 RBD의 아미노산 서열과 비교하여 최대 약 1개, 최대 약 2개, 최대 약 3개, 최대 약 4개, 최대 약 5개, 최대 약 10개, 최대 약 15개, 최대 약 20개, 최대 약 25개, 또는 최대 약 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다. RBD는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 RBD와 비교하여 약 1 내지 약 5개 아미노산, 약 3 내지 약 10개 아미노산, 약 5 내지 10개 아미노산, 약 8 내지 12개 아미노산, 약 10 내지 15개 아미노산, 약 12개 내지 17개 아미노산, 약 15개 내지 20개 아미노산, 약 18개 내지 23개 아미노산, 약 20개 내지 25개 아미노산, 약 22개 내지 약 27개 아미노산, 또는 약 25개 내지 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 RBD에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 돌연변이를 갖는다. 실시태양에서, RBD는 표 1C에 나타낸 바와 같은 변형의 임의의 조합을 함유할 수 있다.

[표 1C]

CoV S 폴리펩타이드 항원 - SD1/2에 대한 변형

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 542-681 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 529-668에 상응하는 SEQ ID NO: 122의 아미노산 서열을 갖는 SD1/2에 대한 하나 이상의 변형을 함유한다.

SD1/2의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 122)은 아래에 도시된다.

NFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSP

SEQ ID NO: 122의 밑줄 친 영역은 변형될 수 있는 SD1/2 내의 아미노산을 나타낸다.

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 SD1/2에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일성을 갖는 SD1/2를 포함한다. SD1/2는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 SD1/2의 아미노산 서열과 비교하여 최대 약 1개, 최대 약 2개, 최대 약 3개, 최대 약 4개, 최대 약 5개, 최대 약 10개, 최대 약 15개, 최대 약 20개, 최대 약 25개, 또는 최대 약 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다. SD1/2는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 SD1/2와 비교하여 약 1 내지 약 5개 아미노산, 약 3 내지 약 10개 아미노산, 약 5 내지 10개 아미노산, 약 8 내지 12개 아미노산, 약 10 내지 15개 아미노산, 약 12개 내지 17개 아미노산, 약 15개 내지 20개 아미노산, 약 18개 내지 23개 아미노산, 약 20개 내지 25개 아미노산, 약 22개 내지 약 27개 아미노산, 또는 약 25개 내지 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SD1/2에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개의 돌연변이를 갖는다. 실시태양에서, SD1/2는 표 1D에 나타낸 바와 같은 변형의 임의의 조합을 함유할 수 있다.

[표 1D]

CoV S 폴리펩타이드 항원 - 푸린 절단 부위에 대한 변형

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 하나 이상의 돌연변이에 의해 불활성화되는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 682-685 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 669-672에 해당하는 푸린 부위(RRAR)를 함유한다. 푸린 절단 부위의 불활성화는 푸린이 CoV S 폴리펩타이드를 절단하는 것을 방지한다. 실시태양에서, 불활성화된 푸린 절단 부위를 포함하는 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 단일 사슬로 발현된다.

실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 하나 이상의 아미노산은 임의의 천연 아미노산으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 아미노산은 L-아미노산이다. 아미노산의 비제한적인 예는 알라닌, 아르기닌, 글리신, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 발린, 아이소류신, 류신, 티로신, 트립토판, 및 페닐알라닌을 포함한다.

실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 하나 이상의 아미노산이 글루타민으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산이 글루타민으로 돌연변이될 수 있다. 실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 아르기닌 중 1개는 글루타민으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 아르기닌 중 2개는 글루타민으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 아르기닌 중 3개는 글루타민으로 돌연변이된다.

실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 하나 이상의 아미노산이 알라닌으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산이 알라닌으로 돌연변이될 수 있다. 실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 아르기닌 중 1개는 알라닌으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 아르기닌 중 2개는 알라닌으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 아르기닌 중 3개는 알라닌으로 돌연변이된다.

실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 하나 이상의 아미노산이 글리신으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산이 글리신으로 돌연변이될 수 있다. 실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위의 아르기닌 중 1개는 글리신으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 아르기닌 중 2개는 글리신으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 아르기닌 중 3개는 글리신으로 돌연변이된다.

실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 하나 이상의 아미노산이 아스파라긴으로 돌연변이된다. 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산이 아스파라긴으로 돌연변이될 수 있다. 실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 아르기닌 중 1개는 아스파라긴으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 아르기닌 중 2개는 아스파라긴으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 천연 푸린 절단 부위를 포함하는 아르기닌 중 3개는 아스파라긴으로 돌연변이된다.

CoV S 폴리펩타이드 내에 함유된 불활성화된 푸린 부위의 아미노산 서열의 비제한적인 예는 표 1E에서 찾을 수 있다.

[표 1E]

불활성화된 푸린 절단 부위

실시태양에서, 활성 푸린 절단 부위(SEQ ID NO: 6) 대신에, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유한다. 실시태양에서, 불활성화된 푸린 절단 부위의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7-34 또는 SEQ ID NO: 97 중 어느 하나로 표시된다. 실시태양에서, 불활성화된 푸린 절단 부위의 아미노산 서열은 QQAQ(SEQ ID NO: 7). 실시태양에서, 불활성화된 푸린 절단 부위의 아미노산 서열은 GSAS(SEQ ID NO: 97)이다. 실시태양에서, 불활성화된 푸린 절단 부위의 아미노산 서열은 GSGA(SEQ ID NO: 111)이다.

CoV S 폴리펩타이드 항원 - S2 서브유닛에 대한 변형

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 686-1273 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 673-1260에 상응하는 SEQ ID NO: 120의 아미노산 서열을 갖는 S2 서브유닛에 대한 하나 이상의 변형을 함유한다.

S2 서브유닛의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 120)은 아래에 도시된다.

SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

SEQ ID NO: 120의 밑줄 친 영역은 변형될 수 있는 S2 서브유닛 내의 아미노산을 나타낸다.

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 S1 서브유닛에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%의 동일성을 갖는 S2 서브유닛을 포함한다. S2 서브유닛은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 S2 서브유닛의 아미노산 서열과 비교하여 최대 약 1, 최대 약 2, 최대 약 3, 최대 약 4, 최대 약 5, 최대 약 10, 최대 약 15, 최대 약 20, 최대 약 25, 또는 최대 약 30개의 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다. S2 서브유닛은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 S2 서브유닛과 비교하여 약 1개 내지 약 5개 아미노산, 약 3개 내지 약 10개 아미노산, 약 5개 내지 10개 아미노산, 약 8개 내지 12개 아미노산, 약 10개 내지 15개 아미노산, 약 12개 내지 17개 아미노산, 약 15개 내지 20개 아미노산, 약 18개 내지 23개 아미노산, 약 20개 내지 25개 아미노산, 약 22개 내지 약 27개 아미노산, 또는 약 25개 내지 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다.

실시태양에서, S2 서브유닛은 표 1F에 도시된 변형의 임의의 조합을 함유할 수 있다.

[표 1F]

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 676-685 내의 하나 이상의 결실에 상응하는 결실을 함유한다. 실시태양에서, 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 676-685의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산이 결실된다. 실시태양에서, 아미노산 676-685 내의 아미노산의 결실은 연속적이며, 예를 들어, 아미노산 676 및 677이 결실되거나 아미노산 680 및 681이 결실된다. 실시태양에서, 아미노산 676-685 내의 아미노산의 결실은 비연속적이며, 예를 들어, 아미노산 676 및 680이 결실되거나 아미노산 677 및 682가 결실된다. 실시태양에서, 아미노산 676-685 내의 하나 이상의 결실에 상응하는 결실을 함유하는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 62 및 SEQ ID NO: 63으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 702-711 내의 하나 이상의 결실에 상응하는 결실을 함유한다. 실시태양에서, 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 702-711의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산이 결실된다. 실시태양에서, 아미노산 702-711 내의 아미노산의 하나 이상의 결실은 연속적이며, 예를 들어, 아미노산 702 및 703이 결실되거나 아미노산 708 및 709가 결실된다. 실시태양에서, 아미노산 702-711 내의 아미노산의 결실은 비연속적이며, 예를 들어, 아미노산 702 및 704가 결실되거나 아미노산 707 및 710이 결실된다. 실시태양에서, 아미노산 702-711 내의 하나 이상의 결실에 상응하는 결실을 함유하는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 64 및 SEQ ID NO: 65로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV S 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 775-793 내의 하나 이상의 결실에 상응하는 결실을 함유한다. 실시태양에서, 천연 SARS-CoV-2 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 775-793의 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19개의 아미노산이 결실된다. 실시태양에서, 아미노산 775-793 내의 아미노산의 하나 이상의 결실은 연속적이며, 예를 들어, 아미노산 776 및 777이 결실되거나 아미노산 780 및 781이 결실된다. 실시태양에서, 아미노산 775-793 내의 아미노산의 결실은 비연속적이며, 예를 들어, 아미노산 775 및 790이 결실되거나 아미노산 777 및 781이 결실된다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 806-815에 상응하는 융합 펩타이드(SEQ ID NO: 104)의 결실을 함유한다. 실시태양에서, CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 융합 펩타이드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산이 결실된다. 실시태양에서, 융합 펩타이드 내의 아미노산의 결실은 연속적이며, 예를 들어, 아미노산 806 및 807이 결실되거나 아미노산 809 및 810이 결실된다. 실시태양에서, 융합 펩타이드 내의 아미노산의 결실은 비연속적이며, 예를 들어, 아미노산 806 및 808이 결실되거나 아미노산 810 및 813이 결실된다. 실시태양에서, 융합 펩타이드의 하나 이상의 아미노산에 상응하는 결실을 함유하는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NOS: 66, 77, 및 105-108로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 Lys-973에 돌연변이를 함유한다. 실시태양에서, Lys-973은 임의의 천연 아미노산으로 돌연변이된다. 실시태양에서, Lys-973은 프롤린으로 돌연변이된다. 실시태양에서, Lys-973은 글리신으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 아미노산 973에 돌연변이를 함유하는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 84-89, 105-106, 및 109-110으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 Val-974에서 돌연변이를 함유한다. 실시태양에서, Val-974는 임의의 천연 아미노산으로 돌연변이된다. 실시태양에서, Val-974는 프롤린으로 돌연변이된다. 실시태양에서, Val-974는 글리신으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 아미노산 974에 돌연변이를 함유하는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 84-89, 105-106, 및 109-110으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 Lys-973 및 Val-974에서 돌연변이를 함유한다. 실시태양에서, Lys-973 및 Val-974는 임의의 천연 아미노산으로 돌연변이된다. 실시태양에서, Lys-973 및 Val-974는 프롤린으로 돌연변이된다. 실시태양에서, 아미노산 973 및 974에 돌연변이를 함유하는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NOS: 84-89, 105-106, 및 109-110에서 선택된다.

CoV S 폴리펩타이드 항원 - S2 서브유닛 - HR1 도메인에 대한 변형

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 912-984 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 889-971에 상응하는 SEQ ID NO: 119의 아미노산 서열을 갖는 HR1 도메인에 대한 하나 이상의 변형을 함유한다.

HR1 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 119)은 아래에 도시된다.

MAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRL

SEQ ID NO: 119의 밑줄 친 영역은 변형될 수 있는 HR1 도메인 내의 아미노산을 나타낸다.

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 HR1 도메인에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%의 동일성을 갖는 HR1 도메인을 포함한다. HR1 도메인은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 HR1 도메인의 아미노산 서열과 비교하여 최대 약 1, 최대 약 2, 최대 약 3, 최대 약 4, 최대 약 5, 최대 약 10, 최대 약 15, 최대 약 20, 최대 약 25, 또는 최대 약 30개의 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다. HR1 도메인은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 HR1 도메인과 비교하여 약 1개 내지 약 5개 아미노산, 약 3개 내지 약 10개 아미노산, 약 5개 내지 10개 아미노산, 약 8개 내지 12개 아미노산, 약 10개 내지 15개 아미노산, 약 12개 내지 17개 아미노산, 약 15개 내지 20개 아미노산, 약 18개 내지 23개 아미노산, 약 20개 내지 25개 아미노산, 약 22개 내지 약 27개 아미노산, 또는 약 25개 내지 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다.

실시태양에서, HR1 도메인은 표 1G에 도시된 변형의 임의의 조합을 함유할 수 있다.

[표 1G]

CoV S 폴리펩타이드 항원 - S2 서브유닛 - HR2 도메인에 대한 변형

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1163-1213 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1150-1200에 상응하는 SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 갖는 HR2 도메인에 대한 하나 이상의 변형을 함유한다.

HR2 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 125)은 아래에 도시된다.

DVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWP

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 HR1 도메인에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%의 동일성을 갖는 HR2 도메인을 포함한다. HR2 도메인은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 HR2 도메인의 아미노산 서열과 비교하여 최대 약 1, 최대 약 2, 최대 약 3, 최대 약 4, 최대 약 5, 최대 약 10, 최대 약 15, 최대 약 20, 최대 약 25, 또는 최대 약 30개의 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다. HR2 도메인은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 HR2 도메인과 비교하여 약 1개 내지 약 5개 아미노산, 약 3개 내지 약 10개 아미노산, 약 5개 내지 10개 아미노산, 약 8개 내지 12개 아미노산, 약 10개 내지 15개 아미노산, 약 12개 내지 17개 아미노산, 약 15개 내지 20개 아미노산, 약 18개 내지 23개 아미노산, 약 20개 내지 25개 아미노산, 약 22개 내지 약 27개 아미노산, 또는 약 25개 내지 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다.

CoV S 폴리펩타이드 항원 - TM 도메인에 대한 변형

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1214-1237 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1201-1244에 상응하는 SEQ ID NO: 123의 아미노산 서열을 갖는 TM 도메인에 대한 하나 이상의 변형을 함유한다.

TM 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 123)은 아래에 도시된다.

WYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCM

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 TM 도메인에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%의 동일성을 갖는 TM 도메인을 포함한다. TM 도메인은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 TM 도메인의 아미노산 서열과 비교하여 최대 약 1, 최대 약 2, 최대 약 3, 최대 약 4, 최대 약 5, 최대 약 10, 최대 약 15, 최대 약 20, 최대 약 25, 또는 최대 약 30개의 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다. TM 도메인은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 TM 도메인과 비교하여 약 1개 내지 약 5개 아미노산, 약 3개 내지 약 10개 아미노산, 약 5개 내지 10개 아미노산, 약 8개 내지 12개 아미노산, 약 10개 내지 15개 아미노산, 약 12개 내지 17개 아미노산, 약 15개 내지 20개 아미노산, 약 18개 내지 23개 아미노산, 약 20개 내지 25개 아미노산, 약 22개 내지 약 27개 아미노산, 또는 약 25개 내지 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다.

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 전체 TM 도메인이 결여되어 있다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 TM 도메인을 포함한다.

CoV S 폴리펩타이드 항원 - CT 도메인에 대한 변형

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1238-1273 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1225-1260에 상응하는 SEQ ID NO: 124의 아미노산 서열을 갖는 CT 도메인에 대한 하나 이상의 변형을 함유한다.

CT의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 124)은 아래에 도시된다.

TSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 CT에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%의 동일성을 갖는 CT를 포함한다. CT는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 CT의 아미노산 서열과 비교하여 최대 약 1, 최대 약 2, 최대 약 3, 최대 약 4, 최대 약 5, 최대 약 10, 최대 약 15, 최대 약 20, 최대 약 25, 또는 최대 약 30개의 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다. CT는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 CT와 비교하여 약 1개 내지 약 5개 아미노산, 약 3개 내지 약 10개 아미노산, 약 5개 내지 10개 아미노산, 약 8개 내지 12개 아미노산, 약 10개 내지 15개 아미노산, 약 12개 내지 17개 아미노산, 약 15개 내지 20개 아미노산, 약 18개 내지 23개 아미노산, 약 20개 내지 25개 아미노산, 약 22개 내지 약 27개 아미노산, 또는 약 25개 내지 30개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다.

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 전체 CT가 결여되어 있다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 CT를 포함한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 TM 및 CT를 포함한다. 실시태양에서, CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드는 막횡단 및 세포질 꼬리(TMCT)(아미노산 1201-1260에 상응)로부터 하나 이상의 아미노산의 결실을 함유한다. TMCT의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 39로 표시된다. 실시태양에서, TMCT의 하나 이상의 잔기가 결실된 CoV S 폴리펩타이드는 증진된 단백질 발현을 갖는다. 실시태양에서, TMCT로부터 하나 이상의 결실을 갖는 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 40, 41, 42, 52, 54, 59, 61, 88, 및 89로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다. 실시태양에서, TM-CD로부터 하나 이상의 결실을 갖는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 39, 43, 53, 및 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분리된 핵산 서열에 의해 암호화된다.

CoV S 폴리펩타이드 항원 - 돌연변이의 비제한적 조합

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 56 및 57의 결실을 함유한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 131 및 132의 결실을 함유한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 56 및 131의 결실을 함유한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 57 및 131의 결실을 함유한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 56, 57, 및 131의 결실을 함유한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 56 및 132의 결실을 함유한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 57 및 132의 결실을 함유한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 56, 57, 및 132의 결실을 함유한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 56, 57, 131, 및 132의 결실을 함유한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 CoV S 폴리펩타이드의 융합전 형태를 안정화시키는 돌연변이를 함유한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 융합전 형태를 안정화시키는 프롤린 또는 글리신 치환을 함유한다. 이 전략은 다음 문서에 기술된 바와 같이 사전융합 안정화된 MERS-CoV S 단백질을 개발하는 데 활용되었으며, 이 문서는 각각 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다: Proc Natl Acad Sci USA.　2017 Aug 29;114(35):E7348-E7357; Sci Rep.　2018 Oct 24;8(1):15701; 미국 공개 번호 2020/0061185; 및 PCT 출원 번호 PCT/US2017/058370.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 Lys-973 및 Val-974에서의 돌연변이 및 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이 및 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유한다. Lys-973 및 Val-974에서의 돌연변이 및 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유하는 예시적인 CoV S 폴리펩타이드가 도 8에 도시되어 있다. 실시태양에서, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이 및 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유하는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NOS: 86 또는 87의 아미노산 서열 및 SEQ ID NOS: 96의 핵산 서열을 갖는다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 Lys-973 및 Val-974에서의 돌연변이, 불활성화된 푸린 절단 부위, 및 융합 펩타이드의 하나 이상의 아미노산의 결실을 함유한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위 및 융합 펩타이드의 하나 이상의 아미노산의 결실을 함유한다. 실시태양에서, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 불활성화된 푸린 절단 부위, 및 융합 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 결실을 함유하는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 105 또는 106의 아미노산 서열을 가진다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 Leu-5의 페닐알라닌으로의 돌연변이, Thr-7의 아스파라긴으로의 돌연변이, Pro-13의 세린으로의 돌연변이, Asp-125의 티로신으로의 돌연변이, Arg-177의 세린으로의 돌연변이, Lys-404의 트레오닌으로의 돌연변이, Glu-471의 라이신으로의 돌연변이, Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, His-642의 티로신으로의 돌연변이, Thr-1014의 아이소류신으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)와 비교하여 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 Trp-139의 시스테인으로의 돌연변이, Leu-439의 아르기닌으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)와 비교하여 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 Trp-152의 시스테인으로의 돌연변이, Leu-452의 아르기닌으로 돌연변이, Ser-13의 아이소류신으로의 돌연변이, Lys-986 및 Val-987의 프롤린으로의 돌연변이, 및 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 1)와 비교하여 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 Lys-404의 트레오닌 또는 아스파라긴으로의 돌연변이, Glu-471의 라이신으로의 돌연변이, Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Leu-5의 페닐알라닌으로의 돌연변이, Asp-67의 알라닌으로, Asp-202의 글리신으로의 돌연변이, 하나 이상의 아미노산 229-231의 결실, Arg-233의 아이소류신으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)와 비교하여 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)와 비교하여 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유한다. 실시태양에서, Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 갖는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 112의 아미노산 서열을 포함한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 Asp-601의 글리신으로의 돌연변이, Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)와 비교하여 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유한다. 실시태양에서, Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 갖는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 113의 아미노산 서열을 포함한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 아미노산 56, 57, 및 131의 결실, Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Ala-557의 아스파르테이트로의 돌연변이, Asp-601의 글리신으로의 돌연변이, Pro-668의 히스티딘으로의 돌연변이, Thr-703의 아이소류신으로의 돌연변이, Ser-969의 알라닌으로의 돌연변이, Asp-1105의 히스티딘으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)와 비교하여 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유한다. 실시태양에서, 아미노산 56, 57 및 131의 결실, Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Ala-557의 아스파르테이트로의 돌연변이, Asp-601의 글리신으로의 돌연변이, Pro-668의 히스티딘으로의 돌연변이, Thr-703의 아이소류신으로의 돌연변이, Ser-969의 알라닌으로의 돌연변이, Asp-1105의 히스티딘으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 갖는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 114의 아미노산 서열을 포함한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 아미노산 56, 57, 및 131의 결실, Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Ala-557의 아스파르테이트로의 돌연변이, Asp-601의 글리신으로의 돌연변이, Pro-668의 히스티딘으로의 돌연변이, Thr-703의 아이소류신으로의 돌연변이, Ser-969의 알라닌으로의 돌연변이, Asp-1105의 히스티딘으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)와 비교하여 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유한다. 실시태양에서, 아미노산 56, 57 및 132의 결실, Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Ala-557의 아스파르테이트로의 돌연변이, Asp-601의 글리신으로의 돌연변이, Pro-668의 히스티딘으로의 돌연변이, Thr-703의 아이소류신으로의 돌연변이, Ser-969의 알라닌으로의 돌연변이, Asp-1105의 히스티딘으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 갖는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 114의 아미노산 서열을 포함한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Asp-67의 알라닌으로의 돌연변이, Leu-229의 히스티딘으로의 돌연변이, Asp-202의 글리신으로의 돌연변이, Lys-404의 아스파라긴으로의 돌연변이, Glu-471의 라이신으로의 돌연변이, Ala-688의 발린으로의 돌연변이, Asp-601의 글리신으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)와 비교하여 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 함유한다. 실시태양에서, Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Asp-67의 알라닌으로의 돌연변이, Leu-229의 히스티딘으로의 돌연변이, Asp-202의 글리신으로의 돌연변이, Lys-404의 아스파라긴으로의 돌연변이, Glu-471의 라이신으로의 돌연변이, Ala-688의 발린으로의 돌연변이, Asp-601의 글리신으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 QQAQ(SEQ ID NO: 7) 또는 GSAS(SEQ ID NO: 96)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위는 SEQ ID NO: 115의 아미노산 서열을 포함한다.

실시태양에서, CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 링커를 포함한다. 실시태양에서, 폴리펩타이드 링커는 글리신 및 세린을 함유한다. 실시태양에서, 링커는 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100% 글리신를 가진다.

실시태양에서, 폴리펩타이드 링커는 (SGGG)_n(SEQ ID NO: 91)의 반복체를 가지며, 여기서 n은 1 내지 50(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50)의 정수이다. 실시태양에서, 폴리펩타이드 링커는 SEQ ID NO: 90에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다.

실시태양에서, 폴리펩타이드 링커는 (GGGGS)_n(SEQ ID NO: 93)의 반복체를 가지며, 여기서 n은 1 내지 50(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50)의 정수이다.

실시태양에서, 폴리펩타이드 링커는 (GGGS)_n(SEQ ID NO: 92)의 반복체를 가지며, 여기서 n은 1 내지 50(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50)의 정수이다.

일부 실시태양에서, 폴리펩타이드 링커는 폴리(Gly)n 링커이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20이다. 다른 실시태양에서, 링커는 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 및 사중펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 실시태양에서, 링커는 알라닌-세린(AS), 류신-글루탐산(LE), 및 세린-아르기닌(SR)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 다이펩타이드이다.

실시태양에서, 폴리펩타이드 링커는 자연 발생 CoV S 폴리펩타이드 또는 본 명세서에 개시된 CoV S 폴리펩타이드의 1 내지 100개의 연속 아미노산을 포함한다. 실시태양에서, 폴리펩타이드 링커는 SEQ ID NO: 94에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다.

실시태양에서, CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드는 폴돈을 포함한다. 실시태양에서, TMCT는 폴드온으로 대체된다. 실시태양에서, 폴돈은 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드의 삼량체화를 유발한다. 실시태양에서, 폴돈은 당업계에 공지된 아미노산 서열이다. 실시태양에서, 폴돈은 SEQ ID NO: 68의 아미노산 서열을 갖는다. 실시태양에서, 폴돈은 T4 피브리틴 삼량체화 모티프이다. 실시태양에서, T4 피브리틴 삼량체화 도메인은 SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열을 갖는다. 실시태양에서, 폴돈은 폴리펩타이드 링커에 의해 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드로부터 아미노산 서열로 분리된다. 폴리펩타이드 링커의 비제한적인 예는 본 발명 전반에 걸쳐 발견된다.

실시태양에서, 본 발명은 코로나바이러스 S 단백질의 단편 및 이를 포함하는 나노입자 및 백신을 포함하는 CoV S 폴리펩타이드를 제공한다. 실시태양에서, 코로나바이러스 S 단백질의 단편은 10 내지 1500개의 아미노산 길이(예를 들어, 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100 , 약 150, 약 200, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900 950, 약 1000, 약 1050, 약 1100, 약 1150, 약 1200, 약 1250, 약 1300, 약 1350, 약 1400, 약 1450, 또는 약 1500개의 아미노산 길이)이다. 실시태양에서, 코로나바이러스 S 단백질의 단편은 수용체 결합 도메인(RBD), 서브도메인 1, 서브도메인 2, 상부 나선, 융합 펩타이드, 연결 영역, 7면체 반복체 1, 중심 나선, 7면체 반복체 2, NTD 및 TMCT로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 RBD 및 서브도메인 1을 포함한다. 실시태양에서, RBD 및 서브도메인 1을 포함하는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 319 내지 591이다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 코로나바이러스 S 단백질의 단편을 함유하고, 여기서 코로나바이러스 S 단백질의 단편은 RBD이다. RBD의 비제한적 예는 SARS-CoV-2의 RBD(아미노산 서열 = SEQ ID NO: 69), SARS의 RBD(아미노산 서열 = SEQ ID NO: 70), 및 MERS의 RBD( 아미노산 서열 = SEQ ID NO: 71)를 포함한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 2개 이상의 RBD를 함유한다. 실시태양에서, 폴리펩타이드 링커는 SEQ ID NO: 90 또는 SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 갖는다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 RBD를 함유한다.

일부 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 2개 이상의 SARS-CoV-2 RBD를 함유한다. 실시태양에서, 2개 이상의 SARS-CoV-2 RBD를 함유하는 항원은 SEQ ID NOS: 72-75 중 하나에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SARS-CoV-2 RBD 및 SARS RBD를 함유한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SARS-CoV-2 RBD 및 SARS RBD를 포함하며, 여기서 각각의 RBD는 폴리펩타이드 링커에 의해 분리된다. 실시태양에서, SARS-CoV-2 RBD 및 SARS RBD를 포함하는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NOS: 76-79로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SARS-CoV-2 RBD 및 MERS RBD를 포함한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SARS-CoV-2 RBD 및 MERS RBD를 포함하고, 여기서 각각의 RBD는 폴리펩타이드 링커에 의해 분리된다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SARS RBD 및 MERS RBD를 포함한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SARS RBD 및 MERS RBD를 포함하며, 여기서 각각의 RBD는 폴리펩타이드 링커에 의해 분리된다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SARS-CoV-2 RBD, SARS RBD 및 MERS RBD를 함유한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SARS-CoV-2 RBD, SARS RBD 및 MERS RBD를 포함하며, 여기서 각각의 RBD는 폴리펩타이드 링커에 의해 분리된다. 실시태양에서, SARS-CoV-2 RBD, SARS RBD 및 MERS RBD를 포함하는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NOS: 80-83으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 N-말단 신호 펩타이드로 발현된다. 실시태양에서, N-말단 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 5(MFVFLVLLPLVSS)의 아미노산 서열을 갖는다. 실시태양에서, N-말단 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 117(MFVFLVLLPLVSI)의 아미노산 서열을 갖는다. 실시태양에서, 신호 펩타이드는 CoV S 단백질의 발현을 가능하게 하는 임의의 신호 펩타이드로 대체될 수 있다. 실시태양에서, CoV S 단백질 신호 펩타이드 아미노산 중 하나 이상이 결실되거나 돌연변이될 수 있다. 개시 메티오닌 잔기는 발현을 개시하기 위해 유지된다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 96, 및 SEQ ID NO: 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 암호화된다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드의 N-말단 신호 펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 신호 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 5)에 비해 Ser-13에서 돌연변이를 함유한다. 실시태양에서, Ser-13은 임의의 천연 아미노산으로 돌연변이된다. 실시태양에서, Ser-13은 알라닌, 메티오닌, 아이소류신, 류신, 트레오닌 또는 발린으로 돌연변이된다. 실시태양에서, Ser-13은 아이소류신으로 돌연변이된다.

숙주 세포에서 CoV S 단백질의 발현 후, N-말단 신호 펩타이드는 절단되어 성숙한 CoV 단백질 서열(SEQ ID NOS: 2, 4, 38, 41, 44, 48, 51, 54, 58, 61, 63, 65, 67, 73, 75, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 89, 106, 및 110)을 제공한다. 실시태양에서, 신호 펩타이드는 숙주 세포 프로테아제에 의해 절단된다. 양태에서, 전장 단백질은 숙주 세포로부터 분리되고 신호 펩타이드는 후속적으로 절단될 수 있다.

발현 및 정제 동안 SEQ ID NOS: 1, 3, 36, 40, 42, 46, 49, 52, 56, 59, 62, 64, 66, 72, 74, 76, 77, 80, 81, 84, 86, 87, 105, 107, 88, 및 109에 상응하는 아미노산 서열에 의한 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드로부터의 신호 펩타이드의 절단 이후, SEQ ID NOS: 2, 4, 38, 41, 44, 48, 51, 54, 58, 61, 63, 65, 67, 73, 75, 78, 79, 82, 83, 85, 106, 108, 89, 및 110, 또는 112-115로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 성숙 폴리펩타이드가 얻어지고 CoV S 나노입자 백신 또는 CoV S 나노입자를 생산하는 데 사용된다.

유리하게는, 개시된 CoV S 폴리펩타이드는 천연 CoV 스파이크(S) 단백질에 비해 향상된 단백질 발현 및 안정성을 가질 수 있다.

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 천연 코로나바이러스 S 단백질(SEQ ID NO: 2)로부터의 추가 변형을 함유한다. 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 코로나바이러스 S 단백질은 천연 코로나바이러스 S 단백질에 대해 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 99% 동일성을 나타낸다. 당업자는 공지된 기술을 사용하여 천연 단백질 또는 본 명세서에 기술된 임의의 CoV S 폴리펩타이드에 대한 재조합 코로나바이러스 S 단백질의 백분율 동일성을 계산할 것이다. 예를 들어, 백분율 동일성은 온라인에서 사용할 수 있는 도구 CLUSTALW2 또는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 계산할 수 있다. 다음 디폴트 매개변수는 CLUSTALW2 쌍별 정렬: 단백질 중량 매트릭스 = Gonnet; 갭 오픈 = 10; 간격 확장 = 0.1에 사용될 수 있다.

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 갖는 CoV S 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 비교하여 최대 약 1개, 최대 약 2개, 최대 약 3개, 최대 약 4개, 최대 약 5개, 최대 약 10개, 최대 약 15개, 최대 약 20개, 최대 약 25개, 최대 약 30개, 최대 약 35개, 최대 약 40개, 최대 약 45개, 또는 최대 약 50개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다. CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 갖는 CoV S 폴리펩타이드와 비교하여 약 1 내지 약 5개 아미노산, 약 3개 내지 약 10개 아미노산, 약 5개 내지 10개 아미노산, 약 8개 내지 12개 아미노산, 약 10개 내지 15개 아미노산, 약 12개 내지 17개 아미노산, 약 15개 내지 20개 아미노산, 약 18 내지 23개 아미노산, 약 20 내지 25개 아미노산, 약 22 내지 약 27개 아미노산, 약 25 내지 30개 아미노산, 약 30 내지 35개 아미노산, 약 35 내지 40개 아미노산, 약 40개 내지 약 45개 아미노산 또는 약 45개 내지 50개 아미노산의 결실, 삽입 또는 돌연변이를 가질 수 있다. 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 코로나바이러스 S 단백질(SEQ ID NO: 87)과 비교하여 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개, 또는 약 25개의 치환을 포함한다.

실시태양에서, 코로나바이러스 S 폴리펩타이드는 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 모두에서 연장된다. 일부 양태에서, 연장은 정제 또는 검출과 같은 기능에 유용한 태그이다. 일부 양태에서 태그는 에피토프를 함유한다. 예를 들어, 태그는 폴리글루타메이트 태그, FLAG-태그, HA-태그, 폴리히스-태그(약 5-10개의 히스티딘을 가짐)(SEQ ID NO: 101), 헥사히스티딘 태그(SEQ ID NO: 100), 8X-His-태그(8개의 히스티딘을 가짐)(SEQ ID NO: 102), Myc-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제-태그, 녹색 형광 단백질-태그, 말토스 결합 단백질-태그, 티오레독신 -태그, 또는 Fc-태그일 수 있다. 다른 양태에서, 연장은 발현을 향상시키기 위해 단백질에 융합된 N-말단 신호 펩타이드일 수 있다. 이러한 신호 펩타이드는 종종 세포에서 발현되는 동안 절단되지만, 일부 나노입자는 온전한 신호 펩타이드를 갖는 항원을 함유할 수 있다. 따라서, 나노입자가 항원을 포함하는 경우, 항원은 연장을 함유할 수 있고 따라서 나노입자에 혼입될 때 융합 단백질일 수 있다. 서열에 대한 동일성을 계산하기 위해, 연장은 포함되지 않는다. 실시태양에서, 태그는 프로테아제 절단 부위이다. 프로테아제 절단 부위의 비제한적 예는 HRV3C 프로테아제 절단 부위, 키모트립신, 트립신, 엘라스타제, 엔도펩티다제, 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-3, 카스파제-4, 카스파제-5, 카스파제-6, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-10, 엔테로키나제, 인자 Xa, 그랜자임 B, TEV 프로테아제 및 트롬빈을 포함한다. 실시태양에서, 프로테아제 절단 부위는 HRV3C 프로테아제 절단 부위이다. 실시태양에서, 프로테아제 절단 부위는 SEQ ID NO: 98의 아미노산 서열을 포함한다.

실시태양에서, CoV S 당단백질은 융합 단백질을 포함한다. 실시태양에서, CoV S 당단백질은 N-말단 융합 단백질을 포함한다. 실시태양에서, Cov S 당단백질은 C-말단 융합 단백질을 포함한다. 실시태양에서, 융합 단백질은 단백질 발현, 정제 또는 검출에 유용한 태그를 포함한다. 시릿태양에서, 태그는 폴리히스-태그(약 5-10개의 히스티딘을 가짐), Myc-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제-태그, 녹색 형광 단백질-태그, 말토스 결합 단백질-태그, 티오레독신-태그, 스트렙-태그, 트윈-스트렙-태그 또는 Fc-태그이다. 실시태양에서, 태그는 Fc-태그이다. 실시태양에서, Fc-태그는 단량체, 이량체 또는 삼량체이다. 실시태양에서, 태그는 헥사히스티딘 태그, 예를 들어 6개의 히스티딘을 포함하는 폴리히스-태그(SEQ ID NO: 100)이다. 실시태양에서, 태그는 SEQ ID NO: 99의 아미노산 서열을 갖는 트윈-스트렙-태그이다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 다른 코로나바이러스 단백질을 포함하는 융합 단백질이다. 실시태양에서, 다른 코로나바이러스 단백질은 동일한 코로나바이러스에서 유래된다. 실시태양에서, 다른 코로나바이러스 단백질은 다른 코로나바이러스로부터 유래된다.

일부 양태에서, CoV S 단백질은 절단될 수 있다. 예를 들어, N-말단은 약 10개의 아미노산, 약 30개의 아미노산, 약 50개의 아미노산, 약 75개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 또는 약 200개의 아미노산으로 절단될 수 있다. C-말단은 N-말단 대신 또는 N-말단에 부가하여 절단될 수 있다. 예를 들어, C-말단은 약 10개의 아미노산, 약 30개의 아미노산, 약 50개의 아미노산, 약 75개의 아미노산, 약 100개의 아미노산 또는 약 200개의 아미노산으로 절단될 수 있다. 절단을 갖는 단백질에 대한 동일성을 계산하기 위해, 동일성은 단백질의 나머지 부분에 대해 측정된다.

CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드를 포함하는 나노입자

실시태양에서, 성숙한 CoV S 폴리펩타이드 항원이 코로나바이러스 S 나노입자를 포함하는 백신을 생산하는 데 사용된다. 실시태양에서, 본 발명의 나노입자는 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드를 포함한다. 실시태양에서, 본 발명의 나노입자는 세제 코어와 연관된 CoV S 폴리펩타이드를 포함한다. 세제의 존재는 항원을 조직화하고 제시하는 코어를 형성함으로써 나노입자의 형성을 촉진한다. 실시태양에서, 나노입자는 머리 영역이 바깥쪽으로 돌출하고 소수성 영역과 PS80 세제가 당단백질에 의해 둘러싸인 중심 코어를 형성하는 다중 올리고머 당단백질 세제(예: PS80) 나노입자로 조립된 CoV S 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 단백질의 세제 코어로의 결합을 촉진하기 위해 본질적으로 막횡단 도메인을 함유하거나 함유하도록 적응된다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 헤드 도메인을 포함한다. 도 10은 본 발명의 CoV S 폴리펩타이드의 예시적인 구조를 도시한다. 주로 CoV S 폴리펩타이드 삼량체의 막횡단 도메인은 세제와 결합한다. 그러나, 폴리펩타이드의 다른 부분도 상호작용할 수 있다. 유리하게는, 나노입자는 세제 주위에 단백질의 다중 복제물의 조직화로 인해 향상된 안정성 및/또는 면역계에 대한 개선된 제시를 제공하도록 환경 스트레스에 대한 개선된 내성을 갖는다.

실시태양에서, 세제 코어는 비이온성 세제 코어이다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 비이온성 세제 코어와 결합된다. 실시태양에서, 세제는 폴리소르베이트-20(PS20), 폴리소르베이트-40(PS40), 폴리소르베이트-60(PS60), 폴리소르베이트-65(PS65) 및 폴리소르베이트-80(PS80)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

실시태양에서, 세제는 PS80이다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 삼량체를 형성한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드 나노입자는 비이온성 세제 코어를 둘러싸는 다중 폴리펩타이드 삼량체로 구성된다. 실시태양에서, 나노입자는 적어도 약 1개의 삼량체를 함유한다. 실시태양에서, 나노입자는 스파이크 단백질의 적어도 약 5개의 삼량체 내지 약 30개의 삼량체를 함유한다. 실시태양에서, 각각의 나노입자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 15, 20, 25, 또는 30개의 삼량체를 함유할 수 있으며, 그 사이의 모든 값과 범위를 포함한다. 본 명세서에 개시된 조성물은 상이한 수의 삼량체를 갖는 나노입자를 함유할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 삼량체의 수가 2-9 범위인 나노입자를 함유할 수 있으며; 실시태양에서, 조성물의 나노입자는 2-6개의 삼량체를 함유할 수 있다. 실시태양에서, 조성물은 나노입자당 2 내지 6개의 삼량체, 또는 나노입자당 2 내지 9개의 삼량체를 갖는 나노입자의 이종 집단을 함유한다. 실시태양에서, 조성물은 실질적으로 균질한 나노입자 집단을 함유할 수 있다. 예를 들어, 집단은 5개의 삼량체를 갖는 약 95% 나노입자를 함유할 수 있다.

본 명세서에 개시된 나노입자는 입자 크기의 범위이다. 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 나노입자는 입자 크기가 약 20nm 내지 약 60nm, 약 20nm 내지 약 50nm, 약 20nm 내지 약 45nm, 약 20nm 내지 약 35nm, 약 20nm 내지 약 30nm, 약 25nm 내지 약 35nm, 또는 약 25nm 내지 약 45nm의 Z-avedml 입자 크기에 이른다. 입자 크기(Z-ave)는 달리 명시되지 않는 한 Zetasizer NanoZS(Malvern, UK)를 사용하여 동적 광산란(DLS)에 의해 측정된다.

실시태양에서, 본 명세서에 개시된 CoV S 폴리펩타이드를 포함하는 나노입자는 야생형 CoV S 폴리펩타이드를 포함하는 나노입자와 비교하여 감소된 입자 크기를 갖는다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 입자 크기가 적어도 약 40% 더 작으며, 예를 들어 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85% 더 작다.

본 명세서에 개시된 CoV S 폴리펩타이드를 포함하는 나노입자는 야생형 CoV S 폴리펩타이드를 포함하는 나노입자보다 크기, 모양 및 질량이 더 균질하다. 이질성의 척도인 다분산 지수(PDI)는 달리 명시되지 않는 한 Malvern Setasizer를 사용하여 동적 광산란에 의해 측정된다. 실시태양에서, 본 명세서에서 측정된 입자는 약 0.2 내지 약 0.45, 예를 들어, 약 0.2, 약 0.25, 약 0.29, 약 0.3, 약 0.35, 약 0.40, 또는 약 0.45의 PDI를 갖는다. 실시태양에서, 본 명세서에서 측정된 나노입자는 야생형 CoV S 폴리펩타이드를 포함하는 나노입자의 PDI보다 적어도 약 25% 이상 더 작은 PDI, 예를 들어 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60% 더 작은 PDI를 가진다.

CoV S 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 나노입자는 야생형 CoV S 폴리펩타이드 또는 이의 나노입자에 비해 개선된 열적 안정성을 갖는다. CoV S 폴리펩타이드의 열 안정성은 달리 명시되지 않는 한 시차 주사 열량계(DSC)를 사용하여 측정된다. 전이 엔탈피(ΔHcal)는 CoV S 폴리펩타이드를 펼치는 데 필요한 에너지이다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 야생형 CoV S 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 ΔHcal을 갖는다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드의 ΔHcal은 야생형 CoV S 폴리펩타이드의 ΔHcal보다 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배 또는 약 10배 더 크다.

몇몇 나노입자 유형이 본 발명에 개시된 백신 조성물에 포함될 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 유형은 이량체 또는 단량체일 수 있는 이방성 막대의 형태이다. 다른 양태에서, 나노입자 유형은 구형 올리고머이다. 또 다른 양태에서, 나노입자는 중간 나노입자로 기술될 수 있으며, 처음 두 가지 유형의 침강 특성 중간을 갖는다. 나노입자 유형의 형성은 생산 과정에서 세제 및 단백질 농도를 제어하여 조절될 수 있다. 나노입자 유형은 침강 계수를 측정함으로써 결정될 수 있다.

CoV S 폴리펩타이드 항원을 함유하는 나노입자의 생산

본 발명의 나노입자는 천연적으로 발생하지 않는 생성물이며, 그 성분은 자연에서 함께 존재하지 않는다. 일반적으로, 본 발명에 개시된 방법은 제 1 세제를 사용하여 단백질을 분리시킨 후 제 1 세제를 제 2 세제와 교환하여 나노입자를 형성시키는 세제 교환 접근법을 사용한다.

나노입자에 함유된 항원은 전형적으로 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 생성된다. 표준 재조합 기술이 사용될 수 있다. 실시태양, CoV S 폴리펩타이드는 곤충 숙주 세포에서 바큘로바이러스 시스템을 사용하여 발현된다. 실시태양에서, 바큘로바이러스는 카텝신-L 낙아웃 바큘로바이러스, 키티나제 낙아웃 바큘로바이러스이다. 선택적으로, 바큘로바이러스는 카텝신-L 및 키티나제 모두에 대한 이중 낙아웃이다. 높은 수준의 발현은 곤충 세포 발현 시스템에서 얻을 수 있다. 곤충 세포의 비 제한적인 예는 담배거세미나방종(Spodoptera frugiperda)(Sf) 세포, 예를 들어, Sf9, Sf21, 무늬밤나방(Trichoplusiani) 세포, 예를 들면, 하이 파이브(High Five) 세포, 드로소필라(Drosophila) S2 세포이다. 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 CoV S 폴리펩타이드는 임의의 적합한 숙주 세포에서 생산된다. 실시태양에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다. 실시태양에서, 곤충 세포는 Sf9 세포이다.

전형적인 형질 감염 및 세포 성장 방법이 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 벡터, 예컨대 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 당업계에 공지된 방법에 따라 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 핵산을 진핵 세포에 도입하는 것은 칼슘 포스페이트 공-침전, 전기천공, 마이크로인젝션, 리포펙션 및 폴리아민 형질감염 시약을 이용한 형질감염에 의해 달성될 수 있다. 한 실시태양에서, 벡터는 재조합 바큘로바이러스이다.

숙주 세포를 성장시키는 방법은 배치, 배치-공급, 연속 및 관류 세포 배양 기술을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 세포 배양은 세포가 증식 및 분리를 위해 단백질(예를 들어, 재조합 단백질)을 증식 및 발현하는 생물 반응기(발효 챔버)에서 세포의 성장 및 증식을 의미한다. 전형적으로, 세포 배양은 생물 반응기에서 무균, 제어된 온도 및 대기 조건하에 수행된다. 생물 반응기는 온도, 대기, 교반 및/또는 pH와 같은 환경 조건을 모니터할 수 있는 세포 배양에 사용되는 챔버이다. 한 실시태양에서, 생물 반응기는 스테인리스 강 챔버이다. 다른 실시태양에서, 생물 반응기는 사전 멸균된 비닐 백(예를 들어, Cellbag®, Wave Biotech, Bridgewater, NJ)이다. 다른 실시태양에서, 사전 멸균된 비닐 백은 약 50 L 내지 3500 L 백이다.

CoV 스파이크(S) 단백질 항원을 함유하는 나노입자의 추출 및 정제

숙주 세포의 성장 후, 단백질은 세제 및 정제 프로토콜을 사용하여 숙주 세포로부터 수확될 수 있다. 일단 숙주 세포가 48 내지 96 시간 동안 성장하면, 배양액으로부터 세포를 분리하고 세제 함유 용액을 첨가하여 세포막을 용해시켜 세제 추출물 중에 단백질을 방출시킨다. 트리톤 X-100과 NP-9으로도 알려진 TERGITOL® 노닐페놀 에톡실레이트는 추출을 위해 각각 선호되는 세제이다. 세제는 약 0.1% 내지 약 1.0%의 최종 농도로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 농도는 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.5%, 약 0.7%, 약 0.8% 또는 약 1.0%일 수 있다. 상기 범위는 약 0.1% 내지 약 0.3%일 수 있다. 양태에서, 농도는 약 0.5%이다.

다른 양태에서, 상이한 제 1 세제는 단백질을 숙주 세포로부터 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제 1 세제는 비스(폴리에틸렌 글리콜 비스[이미다조 일카본일]), 노녹시놀-9, 비스(폴리에틸렌 글리콜 비스[이미다조일 카본일]), BRIJ® 폴리에틸렌 글리콜 도데실 에터 35, BRIJ® 폴리에틸렌 글리콜(3) 세틸 에터 56, BRIJ® 알코올 에톡실레이트 72, BRIJ® 폴리옥실 2 스테아릴 에터 76, BRIJ® 폴리에틸렌 글리콜 모노올레릴 에터 92V, BRIJ® 폴리옥시에틸렌(10) 올레일 에터 97, BRIJ® 폴리에틸렌 글리콜 헥사데실 에터 58P, CREMOPHOR® EL 마크로골글리세롤 리시놀레이트, 데카에틸렌글리콜 모노도데실 에터, N-데카노일-N-메틸글루카민, n-데실 알파-D-글루코피라노시드, 데실 베타-D-말토피라노시드, n-도데카노일-N-메틸글루카미드, n-도데실 알파-D-말토사이드, n-도데실 베타-D-말토사이드, n-도데실 베타-D-말토사이드, 헵타 에틸렌 글리콜 모노데실 에터, 헵타 에틸렌 글리콜 모노도데실 에터, 헵타 에틸렌 글리콜 모노테트라 데실 에터, n-헥사데실 베타-D-말토사이드, 헥사 에틸렌 글리콜 모노도데실 에터, 헥사에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에터, 헥사에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에터, 헥사에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에터, Igepal CA-630, Igepal CA-630, 메틸-6-0-(N-헵틸 카바모일)-α-D-글루코피라노사이드, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에터, N-노마노일-N-메틸글루카민, N-노나노일-N-메틸글루카민, 옥타에틸렌 글리콜 모노데실 에터, 옥타에틸렌 글리콜모노도데실 에터, 옥타에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에터, 옥타에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에터, 옥타에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에터, 옥틸-β-D-글루코피라노사이드, 펜타에틸렌 글리콜 모노데실 에터, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에터, 펜타에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에터, 펜타에틸렌 글리콜 모노헥실 에터, 펜타에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에터, 펜타에틸렌 글리콜 모노옥틸 에터, 폴리에틸렌 글리콜 다이글리시딜 에터, 폴리에틸렌 글리콜 에터 W-1, 폴리옥시에틸렌 10 트라이데실 에터, 폴리옥시에틸렌 100 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 20 아이소헥사데실 에터, 폴리옥시에틸렌 20 올레일 에터, 폴리옥시에틸렌 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 50 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 8 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 비스(이미 다졸일 카본일), 폴리옥시에틸렌 25 프로필렌 글리콜 스테아레이트, 킬라자 껍질의 사포닌, SPAN® 20 소르비탄 라우레이트, SPAN® 40 소르비탄 모노팔미테이트, SPAN® 60 소르비탄 스테아레이트, SPAN® 65 소르비탄 트리스테아레이트, SPAN® 80 소르비탄 모노올리에이트, SPAN® 85 소르비탄 트리올레에이트, TERGITOL® 2차 알코올 에톡실레이트 유형 15-S-12, TERGITOL® 2차 알코올 2차 알코올 에톡실레이트 유형 15-S-30, TERGITOL® 2차 알코올 에톡실레이트 유형 15-S-5, TERGITOL® 2차 알코올 에톡실레이트 유형 15-S-7, TERGITOL® 2차 알코올 에톡실레이트 유형 15-S-9, TERGITOL® 노닐페놀 에톡실레이트 유형 NP-10, TERGITOL® 노닐페놀 에톡실레이트 유형 NP-4, TERGITOL® 노닐페놀 에톡실레이트 유형 NP-40, TERGITOL® 노닐페놀 에톡실레이트 유형 NP-7, TERGITOL® 노닐페놀 에톡실레이트 유형 NP-9, TERGITOL® 분지형 2차 알코올 에톡실레이트 유형 TMN-10, TERGITOL® 분지형 2차 알코올 에톡실레이트 유형 TMN-6, TRITON^TM X-100 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에터 또는 이들의 조합일 수 있다.

그런 후에 나노입자는 원심 분리를 사용하여 세포 파편으로부터 분리될 수 있다. 일부 실시태양에서, 염화 세슘, 수크로오스 및 아이딕사놀을 사용하는 구배 원심분리가 사용될 수 있다. 예를 들어 이온 교환, 친화성 및 겔 여과 크로마토그래피를 포함하는 표준 정제 기술과 같은 다른 기술이 대안으로서 또는 부가적으로 사용될 수 있다.

예를 들어, 제 1 컬럼은 FRACTOGEL® EMD 메타크릴레이트 기반 폴리머 비드 TMAE(EMD Millipore)와 같은 이온 교환 크로마토그래피 수지일 수 있고, 제 2 컬럼은 렌틸(Lens culinaris) 렉틴 친화성 수지일 수 있으며, 제 3 컬럼은 FRACTOGEL® EMD 메타크릴레이트 기반 폴리머 비드 SO3(EMD Millipore) 수지와 같은 양이온 교환 컬럼일 수 있다. 다른 양태에서, 양이온 교환 컬럼은 MMC 컬럼 또는 누비아 C 프라임 컬럼(Bio-Rad Laboratories, Inc)일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 개시된 방법은 세제 추출 컬럼; 예를 들어 소수성 상호작용 컬럼을 사용하지 않는다. 이러한 컬럼은 정제 과정에서 세제를 제거하는데 종종 사용되지만 여기에 공개된 방법에 부정적인 영향을 줄 수 있다.

CoV 폴리펩타이드 항원을 함유하는 나노입자의 세제 교환

나노입자를 형성하기 위해, 숙주 세포로부터 단백질을 추출하는데 사용되는 제 1 세제는 실질적으로 제 2 세제로 대체되어 나노입자 구조에 도달한다. NP-9는 바람직한 추출 세제이다. 전형적으로, 나노입자는 HPLC로 측정했을 때 검출 가능한 NP-9를 함유하지 않는다. 제 2 세제는 전형적으로 PS20, PS40, PS60, PS65 및 PS80으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 제 2 세제는 PS80이다.

특정 양태에서, 세제 교환은 그들의 탄수화물 잔기를 통해 당단백질을 결합시키는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 수행된다. 예를 들어, 친화성 크로마토그래피는 레귐 렉틴 컬럼을 사용할 수 있다. 레귐 렉틴은 식물에서 처음 발견된 단백질로 탄수화물 잔여물과 특이적으로 가역적으로 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, Sharon and Lis, "Legume lectins--a large family of homologous proteins," FASEB J. 1990 Nov;4(14):3198-208; Liener, "The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine," Elsevier, 2012 참조. 적절한 렉틴은 콘카나발린(concanavalin) A(con A), 완두 렉틴, 세인포인(sainfoin) 렉팀 및 렌즈 렉틴을 포함한다. 렌틸 렉틴은 이의 결합 특성 때문에 세제 교환을 위한 바람직한 컬럼이다. 렉틴 컬럼은 시판되고 있다; 예를 들어, 캅토 렌틸 렉틴은 GE 헬스케어에서 구입할 수 있다. 특정 양태에서, 렌틸 렉틴 컬럼은 재조합 렉틴을 사용할 수 있다. 분자 수준에서, 탄수화물 모이어티는 렌틸 렉틴에 결합하여 단백질의 아미노산을 유리시켜 세제 주위에 결합시켜 항원, 예를 들어, 세제에 고정된 이량체, 삼량체 또는 사량체일 수 있는 당단백질 올리고머의 여러 복제물을 갖는 나노입자를 제공하는 것으로 생각된다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 삼량체를 형성한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드 삼량체는 세제에 고정되어 있다. 실시태양에서, 각각의 CoV S 폴리펩타이드 나노입자는 비이온성 코어와 관련된 적어도 하나의 삼량체를 함유한다.

세제 교환 동안 나노입자를 형성하기 위해 단백질과 함께 배양될 때, 세제는 조기 정제 단계 동안 약 0.1%(w/v)까지 존재할 수 있고, 이 양은 최적 안정성을 갖는 최종 나노입자를 얻기 위해 낮아진다. 예를 들어, 비이온성 세제(예를 들어, PS80)는 약 0.005%(v/v) 내지 약 0.1%(v/v), 예를 들어, 약 0.005%(v/v), 약 0.006%(v/v), 약 0.007%(v/v), 약 0.008 %(v/v), 약 0.009%(v/v), 약 0.01%(v/v), 약 0.015%(v/v), 약 0.02%(v/v), 약 0.025%(v/v), 약 0.03%(v/v), 약 0.035%(v/v), 약 0.04%(v/v), 약 0.045%(v/v), 약 0.05%(v/v), 약 0.055% (v/v), 약 0.06%(v/v), 약 0.065%(v/v), 약 0.07%(v/v), 약 0.075%(v/v), 약 0.08%(v/v), 약 0.085%(v/v), 약 0.09%(v/v), 약 0.095%(v/v), 또는 약 0.1%(v/v) PS80일 수 있다. 실시태양에서, 나노입자는 약 0.03% 내지 약 0.05% PS80을 함유한다. 실시태양에서, 나노입자는 약 0.01%(v/v) PS80을 함유한다.

실시태양에서, 정제된 CoV S 폴리펩타이드는 투석된다. 실시태양에서, 투석은 정제 후에 발생한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드는 인산나트륨, NaCl 및 PS80을 포함하는 용액에서 투석된다. 실시태양에서, 인산나트륨을 포함하는 투석 용액은 약 5mM 내지 약 100mM의 인산나트륨, 예를 들어 약 5mM, 약 10mM, 약 15mM, 약 20mM, 약 25mM, 약 30mM, 약 30mM, 35mM, 약 40mM, 약 45mM, 약 50mM, 약 55mM, 약 60mM, 약 65mM, 약 70mM, 약 75mM, 약 80mM, 약 85mM, 약 90mM, 약 95mM 또는 약 100mM 인산나트륨을 함유한다. 실시태양에서, 인산나트륨을 포함하는 용액의 pH는 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5이다. 실시태양에서, 염화나트륨을 포함하는 투석 용액은 약 50mM NaCl 내지 약 500mM NaCl, 예를 들어, 약 50mM, 약 60mM, 약 70mM, 약 80mM, 약 90mM, 약 100mM, 약 110mM, 약 120mM, 약 130mM, 약 140mM, 약 150mM, 약 160mM, 약 170mM, 약 180mM, 약 190mM, 약 200mM, 약 210mM, 약 220mM, 약 230mM, 약 240mM, 약 250mM, 약 260mM, 약 270mM, 약 280mM, 약 290mM, 약 300mM, 약 310mM, 약 320mM, 약 330mM, 약 340mM, 약 350mM, 약 360mM , 약 370mM, 약 380mM, 약 390mM, 약 400mM, 약 410mM, 약 420mM, 약 430mM, 약 440mM, 약 450mM, 약 460mM, 약 470mM, 약 480mM, 약 490mM, 또는 약 500mM NaCl을 포함한다. 실시태양에서, PS80을 포함하는 투석 용액은 약 0.005%(v/v), 약 0.006%(v/v), 약 0.007%(v/v), 약 0.008%(v/v), 약 0.009%(v/v), 약 0.01%(v/v), 약 0.015%(v/v), 약 0.02%(v/v), 약 0.025%(v/v), 약 0.03%(v/v), 약 0.035%(v/v), 약 0.04%(v/v), 약 0.045%(v/v), 약 0.05%(v/v), 약 0.055%(v/v), 약 0.06%(v/ v), 약 0.065%(v/v), 약 0.07%(v/v), 약 0.075%(v/v), 약 0.08%(v/v), 약 0.085%(v/v), 약 0.09 %(v/v), 약 0.095%(v/v), 또는 약 0.1%(v/v) PS80을 포함한다. 실시태양에서, 투석 용액은 약 25mM 인산나트륨(pH 7.2), 약 300mM NaCl, 및 약 0.01%(v/v) PS80을 포함한다.

세제 교환은 위에서 논의된 바와 같이 정제된 단백질로 수행되어 정제되고, 저장을 위해 냉동되고, 이어서 세제 교환을 위해 해동될 수 있다.

본 명세서에 개시된 조성물의 안정성은 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 한 접근법에서, 가혹한 저장 조건을 모방함으로써 나노입자에 스트레스를 가하도록 설계된 다양한 처리 후에 항원 단백질의 무결성을 결정하기 위해 펩티드 맵이 제조될 수 있다. 따라서, 안정성의 척도는 대조군 샘플과 비교하여 스트레스를 받은 샘플에서 항원 펩타이드의 상대적 존재비이다. 예를 들어, CoV S 폴리펩타이드를 함유하는 나노입자의 안정성은 나노입자를 다양한 pH, 프로테아제, 염, 과산화수소를 포함하나 이에 제한되지 않는 산화제, 다양한 온도, 동결/해동 주기 및 교반에 노출시킴으로써 평가될 수 있다. 도 12a-b는 BV2373(SEQ ID NO: 87) 및 BV2365(SEQ ID NO: 4)가 다양한 스트레스 조건하에서 hACE2에 대한 결합을 유지함을 보여준다. 세제 코어에 고정된 당단백질의 위치는 바람직하지 않은 상호작용을 감소시켜 향상된 안정성을 제공하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 프로테아제 기반 분해에 대한 개선된 보호는 차폐 효과를 통해 달성될 수 있으며, 이에 의해 당단백질을 본 명세서에 개시된 몰비로 고정시켜 프로테아제 접근을 차단하는 입체 장애를 초래한다. 안정성은 손상되지 않은 단백질을 모니터링하여 측정될 수 있다. 도 33 및 도 34는 각각 SEQ ID NO: 109 및 87의 아미노산 서열을 갖는 CoV 폴리펩타이드를 함유하는 나노입자를 비교한다. 도 34는 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 갖는 CoV 폴리펩타이드가 정제 동안 특히 우수한 안정성을 보이는 것을 나타낸다. 도 34의 폴리펩타이드는 QQAQ(SEQ ID NO: 7)의 아미노산 서열을 갖는 푸린 절단 부위를 포함한다.

CoV S 폴리펩타이드 항원을 함유하는 백신 조성물

본 발명은, 예를 들어, 나노입자에 CoV S 폴리펩타이드를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 백신 조성물은 동일한 종의 바이러스로부터의 하나 초과의 바이러스 균주로부터의 항원을 갖는 나노입자를 함유할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 백신 조성물의 성분 중 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다.

본 명세서에 개시된 조성물은 예방적으로 또는 치료적으로 사용될 수 있지만, 전형적으로 예방적이다. 따라서, 본 발명은 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 본 발명의 면역원성 조성물의 치료적 또는 예방적 양을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 보호 효과를 제공하는 백신 조성물이다. 다른 양태에서, 보호 효과는 노출된 집단의 비율에서 감염과 관련된 증상의 개선을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 치료되지 않은 대상과 비교하여 발열 피로, 근육통, 두통, 인후통, 구토, 설사, 발진, 신장 및 간 기능 장애 증상, 내부 출혈 및 외부 출혈로부터 선택된 하나 이상의 바이러스 질환 증상을 예방 또는 감소시킬 수 있다.

나노입자는 다양한 부형제, 버퍼 등의 존재하에 백신으로서 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 백신 조성물은 인산나트륨, 염화나트륨 및/또는 히스티딘을 함유할 수 있다. 인산나트륨은 약 10mM 내지 약 50mM, 약 15mM 내지 약 25mM, 또는 약 25mM; 특별한 경우에, 약 22mM 인산 나트륨이 존재한다. 히스티딘은 약 0.1%(w/v), 약 0.5%(w/v), 약 0.7%(w/v), 약 1%(w/v), 약 1.5%(w/v), 약 2%(w/v), 또는 약 2.5%(w/v)로 존재할 수 있다. 염화나트륨은 존재할 때 약 150mM일 수 있다. 특정 조성물에서, 염화나트륨은 더 높은 농도, 예를 들어 약 200mM 내지 약 500mM으로 존재할 수 있다. 구현예에서, 염화나트륨은 약 200mM, 약 250mM, 약 300mM, 약 350mM, 약 400mM, 약 450mM, 또는 약 500mM을 포함하나 이에 제한되지 않는 고농도로 존재한다.

실시태양에서, 본 명세서에 기술된 나노입자는 특정 pH 수준에서 개선된 안정성을 갖는다. 실시태양에서, 나노입자는 약산성 pH 수준에서 안정하다. 예를 들어, 나노입자는 약산성 pH, 예를 들어 pH 5.8 내지 pH 7.0에서 안정하다. 실시태양에서, 나노입자 및 나노입자를 함유하는 조성물은 약 pH 5.9 내지 약 pH 6.8, 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.5, 약 pH 6.1 내지 약 pH 6.4, 약 pH 6.1 내지 약 pH 6.3, 또는 약 pH 6.2를 포함하는 약 pH 5.8 내지 약 pH 7.0 범위의 pH에서 안정할 수 있다. 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 나노입자 및 조성물은 약 pH 7.0 내지 약 pH 7.4를 포함하는 중성 pH에서 안정하다. 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 나노입자 및 조성물은 약 알칼리성 pH, 예를 들어, 이 사이의 모든 값과 범위를 포함하는 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.5, 약 pH 7.0 내지 약 pH 8.0, 또는 pH 7.0 내지 약 pH 7.5에서 안정하다.

항원보강제

특정 실시태양에서, 본 발명에 개시된 조성물은 면역 반응을 향상시키기 위해 하나 이상의 항원보강제와 조합될 수 있다. 다른 실시태양에서, 조성물은 항원보강제 없이 제조되며, 따라서 항원보강제 없는 조성물로서 투여되도록 이용될 수 있다. 유리하게는, 본 발명에 개시된 항원보강제 없는 조성물은 단일 투여량으로 투여될 때 보호 면역 반응을 제공할 수 있다. 견고한 면역 반응을 유도하는 명반이없는 조성물은 성인 약 60세 이상에서 특히 유용하다.

알루미늄 기반 항원보강제

실시태양에서, 항원보강제는 명반(예를 들어, AlPO₄ 또는 Al(OH)₃)일 수 있다. 전형적으로, 나노입자는 실질적으로 명반에 결합된다. 예를 들어, 나노입자는 명반에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 결합될 수 있다. 종종, 나노입자는 조성물에서 명반에 92% 내지 97% 결합된다. 투여량 당 존재하는 명반의 양은 전형적으로 약 400㎍ 내지 약 1250㎍의 범위이다. 예를 들어, 명반은 약 300㎍ 내지 약 900㎍, 약 400㎍ 내지 약 800㎍, 약 500㎍ 내지 약 700㎍, 약 400㎍ 내지 약 600㎍, 또는 약 400㎍ 내지 약 500㎍의 투여량 당 존재할 수 있다. 전형적으로, 명반은 120㎍의 단백질 나노입자의 투여량에 대해 약 400㎍으로 존재한다.

사포닌 항원보강제

사포닌을 함유하는 항원보강제는 또한 본 발명에 개시된 면역원과 조합될 수 있다. 사포닌은 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina) 나무의 껍질에서 추출한 글리코사이드이다. 전형적으로, 사포닌은 다단계 정제 공정을 사용하여 여러 분획으로 제조된다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "퀼라야 사포나리아 몰리나로부터의 사포닌 분획"은 퀼라야 시포나리아의 반정제 또는 정의된 사포닌 분획 또는 이의 실질적으로 순수한 분획을 기술하기 위해 일반적으로 사용된다.

사포닌 분획

사포닌 분획을 생산하기 위한 몇 가지 접근법이 적합하다. 분획 A, B 및 C는 미국 특허 제6,352,697호에 기술되어 있으며 다음과 같이 제조될 수 있다. 미생물 인 퀼라야 사포나리아 몰리나 추출물인 Quil A의 친유성 분획을 크로마토그래피로 분리하고 물 속 70% 아세토나이트릴로 용출시켜 친유성 분획을 회수하였다. 그런 후에 이 친유성 분획은 산성수 속 25% 내지 60% 아세토나이트릴 구배를 사용하는 용출에 의한 반-분취용 HPLC에 의해 분리된다. 본 발명에서 "분획 A" 또는 "QH-A"로 불리는 분획은 약 39% 아세토나이트릴에서 용출되는 분획이거나, 분획에 상응한다. 본 발명에서 "분획물 B" 또는 "QH-B"로 불리는 분획은 약 47% 아세토나이트릴에서 용출되는 분획이거나, 분획에 상응한다. 본 발명에서 "분획 C" 또는 "QH-C"로 불리는 분획은 약 49% 아세토나이트릴에서 용출되는 분획이거나, 분획에 상응한다. 분획의 정제에 관한 추가 정보는 미국 특허 제5,057,540호에서 발견된다. 본 발명에 기술된 바와 같이 제조 될 때, 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A, B 및 C는 각각 정의 가능한 특성을 갖는 화학적으로 밀접하게 관련된 분자의 그룹 또는 패밀리를 나타낸다. 이들이 얻어지는 크로마토그래피 조건은 용출 프로파일 및 생물학적 활성의 면에서 배치-투-배치(batch-to-batch) 재현성이 매우 일정한 것이다.

다른 사포닌 분획이 기술되어 있다. 분획 B3, B4 및 B4b가 EP 0436620에 기술된다. 분획 QA1-QA22는 EP 03632279 B2, Q-VAC(Nor-Feed, AS 덴마크), Quillaja saponaria Molina Spikoside(lsconova AB, Ultunaallen 2B, 756 51 Uppsala, Sweden)에 기술되어 있다. EP 03632279 B2의 분획 QA-1, QA-2, QA-3, QA-4, QA-5, QA-6, QA-7, QA-8, QA-9, QA-10, QA-11, QA-12, QA-13, QA-14, QA-15, QA-16, QA-17, QA-18, QA-19, QA-20, QA-21 및 QA-22, 특히 QA-7, QA-17, QA-18 및 QA-21이 사용될 수 있다. 이들은 EP 0 3632 279 B2, 특히 6 페이지 및 8 페이지 및 9 페이지의 실시예 1에 기술된 바와 같이 얻어진다.

본 발명에 기술되고 항원보강제를 형성하기 위해 사용되는 사포닌 분획은 종종 실질적으로 순수한 분획이다; 즉, 분획은 다른 물질로부터의 오염의 존재가 실질적으로 없다. 특정 양태에서, 실질적으로 순수한 사포닌 분획은 40중량% 이하, 30중량% 이하, 25중량% 이하, 20중량% 이하, 15중량% 이하, 10중량% 이하, 7 중량% 이항, 5중량% 이하, 2중량% 이하, 1중량% 이하, 0.5중량% 이하 또는 0.1중량% 이하의 다른 사포닌 또는 다른 항원보강제 물질과 같은 다른 화합물을 함유할 수 있다.

ISCOM 구조

사포닌 분획은 ISCOM(Immune Stimulating COMplex)이라 불리는 우리-유사(cage-like) 입자의 형태로 투여될 수 있다. ISCOM은 EP0109942B1, EP0242380B1 및 EP0180546B1에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 특정 실시태양에서, EP 9600647-3(PCT/SE97/00289)에 기술된 바와 같이 트랜스포트 및/또는 패신저 항원이 사용될 수 있다.

매트릭스 항원보강제

실시태양에서, ISCOM은 ISCOM 매트릭스 복합체이다. ISCOM 매트릭스 복합체는 적어도 하나의 사포닌 분획 및 지질을 포함한다. 지질은 적어도 콜레스테롤과 같은 스테롤이다. 특정 양태에서, ISCOM 매트릭스 복합체는 또한 인지질을 함유한다. ISCOM 매트릭스 복합체는 또한 반드시 글리코사이드가 아닌 하나 이상의 다른 면역조절(항원보강제-활성) 물질을 함유할 수 있으며 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 EP0436620B1에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.

다른 양태에서, ISCOM은 ISCOM 복합체이다. ISCOM 복합체는 적어도 하나의 사포닌, 적어도 하나의 지질 및 적어도 하나의 항원 또는 에피토프를 함유한다. ISCOM 복합체는 항원의 일부가 입자 내로 통합되도록 세제 처리에 의해 결합된 항원을 함유한다. 대조적으로, ISCOM 매트릭스는 항원과의 혼합물로서 제제화되며, ISCOM 매트릭스 입자와 항원 사이의 결합은 정전기 및/또는 소수성 상호작용에 의해 매개된다.

하나의 실시태양에 따르면, ISCOM 매트릭스 복합체 또는 ISCOM 복합체에 통합된 사포닌 분획 또는 ISCOM 또는 ISCOM 매트릭스 복합체에 통합되거나 이와 혼합 된 적어도 하나의 추가 항원보강제는 퀼라야 사포나리아, 퀼라야 사포나리아의 반정제 제제, 퀼라야 사포나리아의 정제 제제의 분획 A, 분획 B 또는 분획 C 또는 임의의 정제된 서브-분획, 예를 들어, QA 1-21로부터 선택된다.

특정 태양에서, 각각의 ISCOM 입자는 적어도 2개의 사포닌 분획을 함유할 수 있다. 상이한 사포닌 분획의 중량%의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 임의의 두 분획의 중량%의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 예를 들어, 입자는 분획 A의 임의의 중량% 및 미정제 사포닌 분획 또는 분획 C와 같은 다른 사포닌 분획의 임의의 중량%를 함유할 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 각각의 ISCOM 매트릭스 입자 또는 각각의 ISCOM 복합체 입자는 0.1 내지 99.9중량%, 5 내지 95중량%, 10 내지 90중량%, 15 내지 85중량%, 20 내지 80중량%, 25 내지 75중량%, 30 내지 70중량%, 35 내지 65중량%, 40 내지 60중량%, 45 내지 55중량%, 40 내지 60중량% 또는 50중량% 사포닌 분획, 예를 들어, 분획 A 및 각각의 경우 나머지 100%까지의 다른 사포닌, 예를 들어, 임의의 미정제 분획 또는 임의의 다른 분획, 예를 들어, 분획 C를 함유할 수 있다. 중량은 사포닌 분획의 총 중량으로 계산된다. ISCOM 매트릭스 복합체 및 ISCOM 복합체 항원보강제의 예는 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 공개 출원 제2013/0129770호에 개시되어 있다.

특정 실시태양에서, ISCOM 매트릭스 또는 ISCOM 복합체는 5 내지 99중량%의 한 분획, 예를 들어, 분획 A 및 나머지 100중량%까지의 다른 분획, 예를 들어, 미정제 사포닌 분획 또는 분획 C을 포함한다. 중량은 사포닌 분획의 총 중량으로 계산된다.

또 다른 실시태양에서, ISCOM 매트릭스 또는 ISCOM 복합체는 40중량% 내지 99중량%의 한 분획, 예를 들어, 분획 A 및 1중량% 내지 60중량%의 다른 분획, 미정제 사포닌 분획 또는 분획 C를 포함한다. 중량은 사포닌 분획의 총 중량으로 계산된다.

또 다른 실시태양에서, ISCOM 매트릭스 또는 ISCOM 복합체는 70중량% 내지 95중량%의 한 분획, 예를 들어, 분획 A 및 30중량% 내지 5중량%의 다른 분획, 미정제 사포닌 분획 또는 분획 C를 포함한다. 중량은 사포닌 분획의 총 중량으로 계산된다. 다른 실시태양에서, 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터의 사포닌 분획은 QA 1-21의 임의의 하나로부터 선택된다.

사포닌 분획의 혼합물을 함유하는 입자 이외에, ISCOM 매트릭스 입자 및 ISCOM 복합체 입자는 단지 하나의 사포닌 분획을 사용하여 형성될 수 있다. 본 발명에 개시된 조성물은 다수의 입자를 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 입자는 단 하나의 사포닌 분획을 함유한다. 즉, 특정 조성물은 하나 이상의 상이한 유형의 ISCOM-매트릭스 복합체 입자 및/또는 하나 이상의 상이한 유형의 ISCOM 복합체 입자를 함유할 수 있으며, 각각의 개별 입자는 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터의 하나의 사포닌 분획을 함유하며, 여기서 한 복합체의 하나의 사포닌 분획은 다른 복합체 입자의 사포닌 분획과는 상이하다.

특정 양태에서, 하나의 유형의 사포닌 분획 또는 미정제 사포닌 분획은 하나의 ISCOM 매트릭스 복합체 또는 입자로 통합될 수 있고 다른 유형의 실질적으로 순수한 사포닌 분획 또는 미정제 사포닌 분획은 다른 ISCOM 매트릭스 복합체 또는 입자 A로 통합될 수 있다. 조성물 또는 백신은 적어도 두 유형의 복합체 또는 입자를 포함할 수 있으며 각 유형은 물리적으로 상이한 입자로 통합된 하나의 유형의 사포닌을 갖는다.

조성물에서, ISCOM 매트릭스 복합체 입자 및/또는 ISCOM 복합체 입자의 혼합물이 사용될 수 있고 여기서 하나의 사포닌 분획 퀼라야 사포나리아 몰리나 및 다른 사포닌 퀼라야 사포나리아 몰리나는 상이한 ISCOM 매트릭스 복합체 입자 및/또는 ISCOM 복합체 입자에 개별적으로 혼입된다.

하나의 사포닌 분획을 각각 갖는 ISCOM 매트릭스 또는 ISCOM 복합체 입자는 중량%의 임의의 조합으로 조성물에 존재할 수 있다. 특정 양태에서, 조성물은 0.1중량% 내지 99.9중량%, 5중량% 내지 95중량%, 10중량% 내지 90중량%, 15중량% 내지 85중량%, 20중량% 내지 80중량%, 25중량% 내지 75중량%, 30중량% 내지 70중량%, 35중량% 내지 65중량%, 40중량% 내지 60중량%, 45중량% 내지 55중량%, 40중량% 내지 60중량% 또는 50중량%의 제 1 사포닌 분획을 함유하는 ISCOM 매트릭스 또는 복합체를 함유할 수 있고 나머지 부분은 상이한 사포닌 분획을 함유하는 ISCOM 매트릭스 또는 복합체로 구성되었다. 일부 양태에서, 나머지 부분은 하나 이상의 ISCOM 매트릭스 또는 각 매트릭스 또는 복합 입자가 오직 하나의 사포닌 분획만을 함유하는 복합체이다. 다른 측면에서, ISCOM 매트릭스 또는 복합체 입자는 하나 이상의 사포닌 분획을 함유할 수 있다.

특정 조성물에서, 제 1 ISCOM 매트릭스 또는 ISCOM 복합 입자의 최적 사포닌 분획은 분획 A이고, 제 2 ISCOM 매트릭스 또는 ISCOM 복합 입자의 최적 사포닌 분획은 분획 C이다.

바람직한 조성물은 분획 A를 함유하는 제 1 ISCOM 매트릭스 및 분획 C를 함유하는 제 2 ISCOM 매트릭스를 포함하며, 여기서 분획 A ISCOM 매트릭스는 총 사포닌 항원보강제의 중량 당 약 70%를 구성하고, 분획 C ISCOM 매트릭스는 총 사포닌 항원보강제의 중량 당 약 30%를 구성한다. 또 다른 바람직한 조성물에서, 분획 A ISCOM 매트릭스는 총 사포닌 항원보강제의 중량 당 약 85%를 구성하고, 분획 C ISCOM 매트릭스는 총 사포닌 항원보강제의 중량 당 약 15%를 구성한다. 따라서, 특정 조성물에서, 분획 A ISCOM 매트릭스는 약 70% 내지 약 85%의 범위로 존재하고, 분획 C ISCOM 매트릭스는 조성물에서 사포닌 항원보강제의 총 중량의 약 15% 내지 약 30%의 범위로 존재한다. 실시태양에서, 분획 A ISCOM 매트릭스는 중량으로 50-96중량%를 차지하고 분획 C ISCOM 매트릭스는 항원보강제에서 분획 A ISCOM 매트릭스 및 분획 C ISCOM의 중량의 합계의 나머지를 각각 차지한다. 본 명세서에서 MATRIX-M^TM으로 지칭되는 특히 바람직한 조성물에서, 분획 A ISCOM 매트릭스는 조성물 중 사포닌 항원보강제의 총 중량의 약 85%로 존재하고 분획 C ISCOM 매트릭스는 약 15%로 존재한다. MATRIX-M^TM은 Matrix-M1으로 상호 교환 가능하게 지칭될 수 있다.

예시적인 QS-7 및 QS-21 분획, 이들의 생산 및 이들의 용도는 미국 특허 제5,057,540호; 제6,231,859호; 제6,352,697호; 제6,524,584호; 제6,846,489호; 제7,776,343호 및 제8,173,141호에 개시되며, 이들은 본 명세서에 참고로 포함된다.

일부 조성물에서, 다른 항원보강제가 추가로 또는 대안으로서 사용될 수 있다. 본 발명에 전문이 참조로 포함된 Vogel et al., "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition),"에 기술된 임의의 항원보강제의 포함은 본 발명의 범위 내에서 구상된다. 다른 항원보강제는 완전 프로인트 항원보강제(살상균 결핵균이 함유된 면역 반응의 비특이적 자극제), 불완전 프로인트 항원보강제 및 수산화 알루미늄 항원보강제를 포하한다. 다른 항원보강제는 GMCSP, BCG, thur-MDP 및 nor-MDP와 같은 MDP 화합물, CGP(MTP-PE), 지질 A 및 모노포스포릴 지질 A(MPL), MF-59, 박테리아, MPL, 트레할로스 다이미콜레이트(TDM)으로부터 추출된 3개 구성요소를 함유하는 RIBI 및 2% 스쿠알렌/TWEEN® 폴리소르베이트 80 에멀젼 속 세포벽 골격성분을 포함한다. 실시태양에서, 항원보강제는 소수층상 지질 소포일 수 있다; 예를 들어, 노바좀(NOVASOMES)®. 노바좀(NOVASOMES)®은 약 100nm 내지 약 500nm 범위의 소수층상 비인지질 소포이다. 이들은 BRIJ® 알코올 에톡실레이트 72, 콜레스테롤, 올레산 및 스쿠알렌을 포함한다. NOVASOMES®은 효과적인 항원보강제인 것으로 나타났다(미국 특허 제5,629,021호, 제6,387,373호 및 제4,911,928호 참조).

투여 및 투여량

실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 코로나바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 실시태양에서, 반응은 SARS-CoV-2 바이러스, MERS 및 SARS 중 하나 이상에 대한 것이다. 이 방법은 나노입자를 함유하거나 재조합 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드를 함유하는 조성물의 면역학적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 유리하게는, 본 명세서에 개시된 단백질은 특히 유용한 항-코로나바이러스 반응 중 하나 이상을 유도한다.

실시태양에서, 나노입자 또는 CoV S 폴리펩타이드는 항원보강제와 함께 투여된다. 다른 양태에서, 나노입자 또는 CoV S 폴리펩타이드는 항원보강제 없이 투여된다. 일부 양태에서, 항원보강제는 예를 들어 비공유 상호작용에 의해 나노입자에 결합될 수 있다. 다른 양태에서, 항원보강제는 나노입자와 함께 투여되지만, 항원보강제와 나노입자는 실질적으로 상호작용하지 않는다.

실시태양에서, 나노입자는 SARS-CoV-2 감염, SARS 감염, 또는 MERS 감염 중 하나 이상의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스, MERS 및 SARS 중 하나 이상에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 방법은 나노입자 또는 CoV S 폴리펩타이드를 함유하는 조성물의 면역학적 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 유리하게는, 본 명세서에 개시된 단백질은 특히 유용한 항-코로나바이러스 반응을 유도한다.

본 발명에 개시된 조성물은 전신 경로 또는 점막 경로 또는 경피 경로를 통해 또는 특정 조직 내로 직접 투여될 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이 용어 "전신 투여"는 비경구 투여 경로를 포함한다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복강내, 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 흉골내 주사, 정맥내 또는 신장 투석 주입 기술을 포함한다. 전형적으로, 전신 비경구 투여는 근육내 주사이다. 본 발명에 사용된 바와 같이 용어 "점막 투여"는 경구, 비강내, 질내, 직장내, 기관내, 장 및 안과 투여를 포함한다. 바람직하게는, 투여는 근육내 투여이다.

조성물은 단일 투여량 계획 또는 다중 투여량 계획으로 투여될 수 있다. 다중 투여량은 1차 접종 일정이나 부스터 예방 접종 일정에 사용될 수 있다. 다중 투여량 계획에서, 다양한 투여량은 동일한 또는 상이한 경로, 예를 들어 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등에 의해 제공될 수 있다. 일부 양태에서, 후속 부스트 투여량은 사전 투여 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주 또는 약 6주 후에 투여될 수 있다. 실시태양에서, 후속 부스트 투여량은 이전 용량의 투여 후 3주에 투여된다. 실시태양에서, 제 1 투여량은 0일에 투여되고, 부스트 투여량은 21일에 투여된다. 실시태양에서, 제 1 투여량은 0일에 투여되고, 부스트 투여량은 28일에 투여된다.

일부 실시태양에서, ㎍ 단위로 측정된 투여량은 용질을 포함하는 투여량의 총 중량, 또는 CoV S 폴리펩타이드 나노입자의 중량, 또는 CoV S 폴리펩타이드의 중량일 수 있다. 투여량은 A280 또는 ELISA의 단백질 농도 분석을 사용하여 측정된다.

소아 투여를 포함하는 항원의 투여량은 약 5㎍ 내지 약 25㎍, 약 1㎍ 내지 약 300㎍, 약 90㎍ 내지 약 270㎍, 약 100㎍ 내지 약 160㎍, 약 110㎍ 내지 약 150㎍, 약 120㎍ 내지 약 140㎍, 또는 약 140㎍ 내지 약 160㎍의 범위일 수 있다. 실시태양에서, 투여량은 명반과 함께 투여된 약 120㎍이다. 일부 양태에서, 소아 투여량은 약 1㎍ 내지 약 90㎍의 범위일 수 있다. 실시태양에서, CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드의 용량은 이 사이의 모든 값과 범위를 포함하는 약 1㎍, 약 2㎍, 약 3㎍, 약 4㎍, 약 5㎍, 약 6㎍, 약 7㎍, 약 8㎍, 약 9㎍, 10㎍, 약 11㎍, 약 12㎍, 약 13㎍, 약 14㎍, 약 15㎍, 약 16㎍, 약 17㎍, 약 18㎍, 약 19㎍, 약 20㎍, 약 21㎍, 약 22㎍, 약 23㎍, 약 24㎍, 약 25㎍, 약 26㎍, 약 27㎍, 약 28㎍, 약 29㎍, 약 30㎍, 약 40㎍, 약 50㎍, 약 60㎍, 약 70㎍, 약 80㎍, 약 90㎍, 약 100㎍, 약 110㎍, 약 120㎍, 약 130㎍, 약 140㎍, 약 150㎍, 약 160㎍, 약 170㎍, 약 180㎍, 약 190㎍, 약 200㎍, 약 210㎍, 약 220㎍, 약 230㎍, 약 240㎍, 약 250㎍, 약 260㎍, 약 270㎍, 약 280㎍, 약 290㎍, 또는 약 300㎍이다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드의 투여량은 5㎍이다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드의 투여량은 25㎍이다.

특정 집단은 항원보강제와 함께 또는 항원보강제 없이 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 조성물은 첨가된 항원보강제가 없을 수 있다. 그러한 상황에서 투여량은 약 10% 증가될 수 있다.

실시태양에서, 비-천연 CoV S 폴리펩타이드와 함께 투여되는 항원보강제의 투여량은 약 1㎍ 내지 약 100㎍, 예를 들어, 약 1㎍, 약 2㎍, 약 3㎍, 약 4㎍, 약 5㎍, 약 6㎍, 약 7㎍, 약 8㎍, 약 9㎍, 약 10㎍, 약 11㎍, 약 12㎍, 약 13㎍, 약 14㎍, 약 15㎍, 약 16㎍, 약 17㎍, 약 18㎍, 약 19㎍, 약 20㎍, 약 21㎍, 약 22㎍, 약 23㎍, 약 24㎍, 약 25㎍, 약 26㎍, 약 27㎍, 약 28㎍, 약 29㎍, 약 30㎍, 약 31㎍, 약 32㎍, 약 33㎍, 약 34㎍, 약 35㎍, 약 36㎍, 약 37㎍, 약 38㎍, 약 39㎍, 약 40㎍, 약 41㎍, 약 42㎍, 약 43㎍, 약 44㎍, 약 45㎍, 약 46㎍, 약 47㎍, 약 48㎍, 약 49㎍, 약 50㎍, 약 51㎍, 약 52㎍, 약 53㎍, 약 54㎍, 약 55㎍, 약 56㎍, 약 57㎍, 약 58㎍, 약 59㎍, 약 60㎍, 약 61㎍, 약 62㎍, 약 63㎍, 약 64㎍, 약 65㎍, 약 66㎍, 약 67㎍, 약 68㎍, 약 69㎍, 약 70㎍, 약 71㎍, 약 72㎍, 약 73㎍, 약 74㎍, 약 75㎍, 약 76㎍, 약 77㎍, 약 78㎍, 약 79㎍, 약 80㎍, 약 81㎍, 약 82㎍, 약 83㎍, 약 84㎍, 약 85㎍, 약 86㎍, 약 87㎍, 약 88㎍, 약 89㎍, 약 90㎍, 약 91㎍, 약 92㎍, 약 93㎍, 약 94㎍, 약 95㎍, 약 96㎍, 약 97㎍, 약 98㎍, 약 99㎍, 또는 약 100㎍의 항원보강제이다. 실시태양에서, 항원보강제의 투여량은 약 50㎍이다. 실시태양에서, 항원보강제는 사포닌 항원보강제, 예를 들어 MATRIX-M^TM이다.

실시태양에서, 투여량은 약 0.1mL 내지 약 1.5mL, 예를 들어, 약 0.1mL, 약 0.2mL, 약 0.25mL, 약 0.3mL, 약 0.4mL, 약 0.5mL, 약 0.5mL, 약 0.5mL의 부피로 투여된다. 0.6mL, 약 0.7mL, 약 0.8mL, 약 0.9mL, 약 1.0mL, 약 1.1mL, 약 1.2mL, 약 1.3mL, 약 1.4mL, 또는 약 1.5mL의 부피로 투여된다. 실시태양에서, 투여량은 0.25mL의 부피로 투여된다. 실시태양에서, 투여량은 0.5mL의 부피로 투여된다. 실시태양에서, 투여량은 0.6mL의 부피로 투여된다.

MERS, SARS 또는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대한 백신에 대한 특정 실시태양에서, 투여량은 약 1㎍/mL 내지 약 50㎍/mL, 약 10㎍/mL 내지 약 100㎍/mL, 약 10㎍/mL 내지 약 50㎍/mL, 약 175㎍/mL 내지 약 325㎍/mL, 약 200㎍/mL 내지 약 300㎍/mL, 약 220㎍/mL 내지 약 280㎍/mL, 또는 약 240㎍/mL 내지 약 260㎍/mL의 CoV S 폴리펩타이드 농도를 포함할 수 있다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 나노입자 또는 CoV S 폴리펩타이드를 조성물에 첨가하는 단계를 포함하여 포유동물에 대한 감염 또는 이의 하나 이상의 질환 증상에 대한 면역을 유도하는 백신 조성물을 제제화하는 방법을 제공한다. 개시된 CoV S 폴리펩타이드 및 나노입자는 감염원에 대한 면역 또는 실질적인 면역을 부여하는 면역 반응을 자극하는 조성물을 제조하는 데 유용하다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 적어도 1회 유효 용량의 나노입자 및/또는 CoV S 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하여 대상에서 감염 또는 이의 하나 이상의 질환 증상에 대한 면역을 유도하는 방법을 제공한다.

실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 나노입자는 추가의 면역원성 조성물과 조합하여 투여된다. 실시태양에서, 추가의 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도한다. 실시태양에서, 추가의 면역원성 조성물은 개시된 CoV S 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 나노입자의 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16 시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일 일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 약 24일, 약 25일, 약 26일, 약 27일, 약 28일, 약 29일, 약 30일, 또는 약 31일 내에 투여된다. 실시태양에서, 추가 조성물은 CoV S 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 제 1 투여량과 함께 투여된다. 실시태양에서, 추가 조성물은 CoV S 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물의 부스트 투여량과 함께 투여된다.

실시태양에서, 추가 면역원성 조성물은 SARS-Cov-2 스파이크 당단백질을 암호화하는 mRNA, SARS-Cov-2 스파이크 당단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA, SARS-Cov-2 스파이크 당단백질을 암호화하는 바이러스 벡터, 또는 불활성화된 SARS-CoV-2 바이러스를 포함한다.

실시태양에서, 추가 면역원성 조성물은 CoV S 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 실시태양에서, mRNA는 SEQ ID NO: 1의 위치 986 및 987에서 프롤린 치환을 포함하는 CoV S 폴리펩타이드를 암호화한다. 실시태양에서, mRNA는 온전한 푸린 절단 부위를 포함하는 CoV S 폴리펩타이드를 암호화한다. 실시태양에서, mRNA는 SEQ ID NO: 1의 위치 986 및 987에서 프롤린 치환 및 온전한 푸린 절단 부위를 포함하는 CoV S 폴리펩타이드를 암호화한다. 실시태양에서, mRNA는 SEQ ID NO: 1의 위치 986 및 987에서 프롤린 치환 및 불활성 푸린 절단 부위를 포함하는 CoV S 폴리펩타이드를 암호화한다. 실시태양에서, mRNA는 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 갖는 CoV S 폴리펩타이드를 암호화한다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA는 지질 나노입자에 캡슐화된다. CoV S 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA를 포함하는 예시적인 면역원성 조성물은 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 Jackson et al. N. Eng. J. Med. 2020. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2- preliminary report에 기술된다. 실시태양에서, CoV S 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA를 포함하는 조성물은 25㎍, 100㎍, 또는 250㎍의 투여량으로 투여된다.

실시태양에서, 추가 면역원성 조성물은 CoV S 폴리펩타이드를 암호화하는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 실시태양에서, AAV 벡터는 야생형 CoV S 폴리펩타이드를 암호화한다. 실시태양에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1의 위치 986 및 987에서 프롤린 치환 및 온전한 푸린 절단 부위를 포함하는 CoV S 폴리펩타이드를 암호화한다. 실시태양에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 1의 위치 986 및 987에서 프롤린 치환 및 불활성 푸린 절단 부위를 포함하는 CoV S 폴리펩타이드를 암호화한다. 실시태양에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 갖는 CoV S 폴리펩타이드를 암호화한다. 다음 간행물은 CoV S 폴리펩타이드를 암호화하는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 설명하며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다: van Doremalen N. et al.　A single dose of ChAdOx1 MERS provides protective immunity in rhesus macaques.　Science Advances, 2020; van Doremalen N. et al. ChAdOx1 nCoV-19 vaccination prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques. bioRxiv, (2020).

실시태양에서, 추가 면역원성 조성물은 데옥시리보핵산(DNA)을 포함한다. 실시태양에서, 추가 면역원성 조성물은 플라스미드 DNA를 포함한다. 실시태양에서, 플라스미드 DNA는 CoV S 폴리펩타이드를 암호화한다. 실시태양에서, DNA는 SEQ ID NO: 1의 위치 986 및 987에서 프롤린 치환 및 온전한 푸린 절단 부위를 포함하는 CoV S 폴리펩타이드를 암호화한다. 실시태양에서, DNA는 SEQ ID NO: 1의 위치 986 및 987에서 프롤린 치환 및 불활성 푸린 절단 부위를 포함하는 CoV S 폴리펩타이드를 암호화한다. 실시태양에서, DNA는 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 갖는 CoV S 폴리펩타이드를 암호화한다.

실시태양에서, 추가 면역원성 조성물은 불활성화된 바이러스 백신을 포함한다.

실시태양에서, CoV S 단백질 또는 CoV S 단백질을 포함하는 나노입자는 MERS, SARS 및 SARS-CoV-2 중 하나 이상에 대한 면역 또는 실질적인 면역을 부여하는 면역 반응을 자극하는 면역원성 조성물을 제조하는 데 유용하다. 점막 면역과 세포 면역 모두는 감염과 질환에 대한 면역에 기여할 수 있다. 상기도에서 국소적으로 분비되는 항체는 자연 감염에 대한 내성의 주요 요인이다. 분비성 면역글로불린 A(sIgA)는 상기도 보호에 관여하고 혈청 IgG는 하기도 보호에 관여한다. 감염에 의해 유도된 면역 반응은 동일한 바이러스 또는 항원적으로 유사한 바이러스 균주에 의한 재감염으로부터 보호한다.

본 명세서에 개시된 나노입자로 면역화된 후 숙주에서 생성된 항체는 또한 다른 사람에게 투여될 수 있으며, 이로써 대상에서 수동 투여를 제공할 수 있다.

실시태양에서, CoV S 단백질 또는 CoV S 단백질을 포함하는 나노입자는 다음으로부터 선택된 하나 이상의 변형이 있는 S 단백질을 함유하는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 교차 중화 항체를 유도한다:

(a) NTD의 하나 이상의 아미노산의 결실, 여기서 하나 이상의 아미노산은 아미노산 56, 57, 131, 132, 229, 230, 231 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다; 및

(b) NTD의 하나 이상의 아미노산의 돌연변이, 여기서 하나 이상의 돌연변이는 아미노산 67, 229, 202, 139, 5, 233, 7, 13, 125, 177, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다;

(c) RBD의 하나 이상의 아미노산의 돌연변이, 여기서 하나 이상의 돌연변이는 아미노산 488, 404, 471, 439, 426, 440 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다;

(d) SD1/2의 하나 이상의 아미노산으로의 돌연변이, 여기서 하나 이상의 아미노산은 601, 557, 668, 642 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다;

(e) 불활성 푸린 절단 부위(아미노산 669-672의 하나 이상의 돌연변이에 해당);

(f) S2 서브유닛의 하나 이상의 아미노산의 결실, 여기서 아미노산은 676-702, 702-711, 775-793, 806-815; 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다;

(g) S2 서브유닛의 하나 이상의 아미노산의 돌연변이, 여기서 아미노산은 973, 974, 703, 1105, 688, 969, 및 1014; 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다;

(h) TMCT로부터 하나 이상의 아미노산(아미노산 1201-1260)의 결실, 여기서 CoV S 당단백질의 아미노산은 SEQ ID NO: 2에 대해 번호가 매겨진다.

실시태양에서, CoV S 단백질 또는 CoV S 단백질을 포함하는 나노입자는 아미노산 56의 결실, 아미노산 57의 결실, 아미노산 131의 결실, N488Y, A557D, D601G, P668H, T703I, S969A, D1105H, N426K, 및 Y440F의 결실로부터 선택된 하나 이상의 변형을 갖는 S 단백질을 함유하는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 교차-중화 항체를 유도하며, 여기서 아미노산은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 CoV S 폴리펩타이드에 대해 번호가 매겨진다.

실시태양에서, 본 발명은 고친화성 항-MERS-CoV, 항-SARS-CoV, 및 항-SARS-CoV-2 바이러스 항체 중 하나 이상을 생산하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 개시된 나노입자로 면역화에 의해 생성된 고친화성 항체는 S CoV 폴리펩타이드 또는 S CoV 폴리펩타이드를 포함하는 나노입자를 포함하는 면역원성 조성물을 동물에게 투여하고, 동물로부터 혈청 및/또는 혈장을 수집하고, 혈청 및/또는 혈장으로부터의 항체를 정제하여 생산된다. 한 실시태양에서, 동물은 인간이다. 실시태양에서, 동물은 닭, 마우스, 기니피그, 래트, 토끼, 염소, 인간, 말, 양 또는 소이다. 한 실시태양에서, 동물은 소 또는 말이다. 다른 실시태양에서, 소 또는 말 동물은 형질전환이다. 다른 실시태양에서, 형질전환 소 또는 말 동물은 인간 항체를 생산한다. 실시태양에서, 동물은 모노클로날 항체를 생산한다. 실시태양에서, 동물은 다클론 항체를 생산한다. 한 실시태양에서, 방법은 항원보강제 또는 면역 자극 화합물의 투여를 추가로 포함한다. 추가 실시태양에서, 정제된 고친화성 항체는 인간 대상에게 투여된다. 한 실시태양에서, 인간 대상은 MERS, SARS 및 SARS-CoV-2 중 하나 이상에 감염될 위험이 있다.

실시태양에서, CoV S 단백질 또는 나노입자는 인플루엔자 당단백질 또는 인플루엔자 당단백질을 포함하는 나노입자와 함께 투여된다. 적합한 당단백질 및 나노입자는 미국 공개 번호 2018/0133308 및 미국 공개 번호 2019/0314487에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 실시태양에서, CoV S 단백질 또는 나노입자는 (a) 세제-코어 나노입자, 여기서 세제-코어 나노입자는 B형 인플루엔자 균주로부터의 재조합 인플루엔자 혈구응집소(HA) 당단백질을 포함한다; 및 (b) 헤마글루티닌 사포닌 매트릭스 나노입자(HaSMaN), 여기서 HaSMaN은 A형 인플루엔자 균주 및 ISCOM 매트릭스 항원보강제로부터의 재조합 인플루엔자 HA 당단백질을 포함한다. 실시태양에서, CoV S 단백질 또는 나노입자는 비이온성 세제 코어 및 인플루엔자 HA 당단백질을 포함하는 나노입자와 공동 투여되며, 여기서 인플루엔자 HA 당단백질은 비이온성 세제 코어 및 비이온성 세제 코어와 결합하는 막횡단 도메인으로부터 바깥쪽으로 돌출하는 헤드 영역을 함유하며, 여기서 인플루엔자 HA 당단백질은 HA0 당단백질이고, 인플루엔자 HA 당단백질의 아미노산 서열은 천연 인플루엔자 HA 단백질의 아미노산 서열과 100% 동일성을 갖는다. 실시태양에서, 인플루엔자 당단백질 또는 나노입자는 CoV S 단백질 또는 나노입자와 공동제제화된다.

본 발명에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 참고문헌 및 저널 기사는 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 여기에 명시적으로 포함된다.

실시예

실시예 1

코로나바이러스 스파이크(S) 폴리펩타이드 나노입자의 발현 및 정제

천연 코로나바이러스 스파이크(S) 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2) 및 SEQ ID NOS: 3, 4, 38, 41, 44, 48, 51, 54, 58, 61, 63, 65, 67, 73, 75, 78, 79, 82, 83, 85, 87, 106, 108, 및 89에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 CoV 스파이크 폴리펩타이드는 바큘로바이러스 발현 시스템에서 발현되었고 코로나바이러스 스파이크(S) 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 플라크를 선별하고 확인하였다. 각각의 경우에 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 5이다. 도 4 및 도 9는 CoV 스파이크 폴리펩타이드 BV2364, BV2365, BV2366, BV2367, BV2368, BV2369, BV2373, BV2374, 및 BV237의 성공적인 정제를 보여준다. 표 2는 앞서 언급한 CoV 스파이크 폴리펩타이드의 서열 특성을 보여준다.

[표 2]

선택된 CoV 스파이크 폴리펩타이드

야생형 BV2361 단백질(SEQ ID NO: 2)은 인간 안지오텐신 전환효소 2 전구체(hACE2)에 결합한다. CoV S 폴리펩타이드의 결합을 평가하기 위해 생물층 간섭계 및 ELISA를 수행하였다.

생물층 간섭계(BLI):

Octet QK384 시스템(Pall Forte Bio, Fremont, CA)을 사용하여 BLI 실험을 수행하였다. His 태그가 붙은 인간 ACE2(2㎍ mL-1)를 니켈 충전 Ni-NTA 바이오센서 팁에 고정하였다. 기준선 후, SARS-CoV-2 S 단백질 함유 샘플을 연속적으로 2배 희석하고 600초 동안 결합되도록 한 후 추가로 900초 동안 해리하였다. 데이터는 Octet 소프트웨어 HT 101:1 글로벌 커브 핏으로 분석되었다.

CoV S 폴리펩타이드 BV2361, BV2365, BV2369, BV2365, BV2373, BV2374는 hACE2에 결합하는 능력을 보유한다(도 5, 도 11a-c). 해리 동역학은 S-단백질이 유체상 S 단백질의 부재하에서 관찰의 900초에 걸쳐 최소 또는 해리 없음에 의해 명백한 바와 같이 단단히 결합된 채로 남아 있음을 보여주었다(도 11a-c).

또한, 결합은 특이적이다. 야생형 CoV S 단백질 BV2361과 CoV S 폴리펩타이드 BV2365 및 BV2373은 MERS-CoV 수용체 다이펩티딜 펩티다제 IV(DPP4)에 결합하지 않는다. 또한, MERS S 단백질은 인간 안지오텐신 전환 효소 2 전구체(hACE2)에 결합하지 않는다(도 6 및 도 11d-f).

ELISA

hACE2에 대한 CoV S 폴리펩타이드의 특이성은 ELISA에 의해 확인되었다. 96개의 웰 플레이트를 4℃에서 밤새 100μL SARS-CoV-2 스파이크 단백질(2μg/mL)로 코팅하였다. 플레이트를 0.05% Tween(PBS-T) 완충액이 포함된 인산염 완충 식염수로 세척하고 TBS Startblock 차단 완충액(ThermoFisher, Scientific)으로 차단하였다. His-태그된 hACE2 및 hDPP4 수용체를 3배 연속 희석하고(5-0.0001㎍/mL) 실온에서 2시간 동안 코팅된 웰에 첨가하였다. 플레이트를 PBS-T로 세척하였다. 최적으로 희석된 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 접합된 항히스티딘을 첨가하고 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 퍼옥시다제 기질(TMB, T0440-IL, Sigma, St. Louis, MO, USA)을 첨가하여 발색하였다. SpectraMax Plus 플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450nm의 OD에서 플레이트를 읽고 SoftMax 소프트웨어로 데이터를 분석하였다. EC50 값은 GraphPad Prism 7.05 소프트웨어를 사용하여 4-파라미터 피팅에 의해 계산하였다.

ELISA 결과는 야생형 CoV S 폴리펩타이드(BV2361), BV2365 및 BV2373 단백질이 hACE2에 특이적으로 결합했지만 MERS-CoV(IC₅₀ > 5000ng mL-1)에 의해 사용되는 hDPP-4 수용체에는 결합하지 못함을 보여주었다. 야생형 CoV S 폴리펩타이드와 BV2365는 유사한 친화도로 hACE2에 결합한 반면(IC50 = 36-38ng/mL), BV2373은 2배 더 낮은 농도(IC₅₀ = 18ng/mL)에서 hACE2 결합의 50% 포화에 도달하였다(도 7, 도 11d-f).

단백질 및 나노입자 생산

재조합 바이러스는 Sf9 곤충 세포의 감염에 의해 증폭된다. 곤충 세포의 배양물은 ~3 MOI(감염 다중도 = 바이러스 ffu 또는 pfu/cell)에서 바큘로바이러스로 감염시킨다. 배양물 및 상청액을 감염 후 48-72시간에 수확한다. 대략 30mL의 조 세포 수확물을 대략 800 x g에서 15분 동안 원심분리하여 정화한다. 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질을 함유하는 생성된 미정제 세포 수확물은 하기에 기술된 바와 같이 나노입자로 정제된다.

나노입자를 생성하기 위해, 비이온성 계면활성제 TERGITOL® 노닐페놀 에톡실레이트 NP-9가 막 단백질 추출 프로토콜에 사용된다. 미정제 추출은 음이온 교환 크로마토그래피, 렌틸 렉틴 친화도/HIC 및 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 추가로 정제된다. 세척된 세포는 세제 처리에 의해 용해된 다음 BV 및 Sf9 숙주 세포 DNA 및 단백질의 침전을 유도하는 낮은 pH 처리를 받는다. 중화된 저 pH 처리 용해물은 두 번째 저 pH 처리가 수행되기 전에 정화되고 음이온 교환 및 친화성 크로마토그래피에서 추가로 정제된다.

친화성 크로마토그래피는 Sf9/BV 단백질, DNA 및 NP-9를 제거할 뿐만 아니라 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질을 농축하는 데 사용된다. 간단히 말해서, 렌즈콩 렉틴은 칼슘과 망간을 함유하는 금속 단백질로, 글루코스 또는 만노오스를 함유하는 글리코실화 단백질과 다당류에 가역적으로 결합한다. 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질 함유 음이온 교환 흐름 통과 분획은 렌틸 렉틴 친화성 크로마토그래피 수지(Capto Lentil Lectin, GE Healthcare)에 적재된다. 글리코실화된 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질은 수지에 선택적으로 결합되는 반면 글리코실화되지 않은 단백질과 DNA는 컬럼 흐름을 통해 제거된다. 약하게 결합된 당단백질은 높은 염도와 낮은 몰 농도의 메틸 알파-D-만노피라노사이드(MMP)를 함유하는 완충액에 의해 제거된다.

컬럼 세척은 또한 NP-9 세제를 계면활성제 폴리소르베이트 80(PS80)으로 세제 교환하는 데 사용된다. 코로나바이러스 스파이크(S) 폴리펩타이드는 MMP 농도가 높은 렌즈콩 렉틴 컬럼에서 나노입자 구조로 용출된다. 용출 후, 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질 삼량체는 세제 코어에 포함된 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질 삼량체와 PS80으로 구성된 나노입자로 조립된다.

실시예 2

마우스에서 코로나바이러스 스파이크(S) 폴리펩티드 나노입자 백신의 면역원성

실시예 1에 기술된 바와 같은 SEQ ID NO: 87의 CoV S 폴리펩타이드("BV2373"으로도 불림)를 포함하는 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질 조성물을 암컷 BALB/c 마우스(7-9주령; Harlan Laboratories Inc., Frederick, MD)를 사용하여 쥐 모델에서 면역원성 및 독성에 대해 평가하였다. 조성물은 사포닌 항원보강제, 예를 들어 MATRIX-M^TM의 존재 및 부재하에서 평가되었다. MATRIX-M^TM을 함유하는 조성물은 5㎍의 MATRIX-M^TM을 함유하였다. 0.01㎍, 0.1㎍, 1㎍ 및 10㎍을 포함한 다양한 투여량의 코로나바이러스 스파이크(S) 폴리펩타이드를 함유하는 백신은 단일 투여량(단일 프라이밍 투여량이라고도 함)(연구 14일차) 또는 14일 간격으로 2회 투여량(프라임/부스트 요법이라고도 함)(연구 0일 및 14일)으로 근육내 투여되었다. 위약 그룹은 면역되지 않은 대조군으로 사용되었다. 연구일-1, 13, 21 및 28일에 분석을 위해 혈청을 수집하였다. 백신을 접종한 동물과 대조군 동물은 1회(단일 투여량) 또는 2회(2회 투여량) 면역 접종 후 42일에 SARS-CoV-2로 비강내로 면역성 검사를 받았다.

백신 면역원성

0.1-10㎍ BV2373 및 MATRIX-M^TM의 단일 프라이밍 투여량으로 면역화된 동물은 단일 면역화 후 21-28일에 검출된 상승된 항-S IgG 역가를 가졌다(도 13b). 10㎍ 투여량의 BV2373 및 MATRIX-M^TM으로 면역화된 마우스는 단일 프라이밍 투여량 후 21-28일에 검출된 CoV S 단백질 및 바이러스 중화 항체에 대한 hACE2 수용체 결합을 차단하는 항체를 생성하였다(도 14 및 도 15). 프라임/부스트 요법(2회 투여량)으로 면역화된 동물은 모든 투여량 수준에 걸쳐 추가 면역화 후 7-16일에 검출된 유의하게 상승된 항-S IgG 역가를 가졌다(도 13a). BV2373(1㎍ 및 10㎍) 및 MATRIX-M^TM으로 면역화된 동물은 면역화 후 유사한 높은 항-S IgG 역가를 가졌다(각각 GMT = 139,000 및 84,000). BV2373(0.1㎍, 1㎍ 또는 10㎍) 및 MATRIX-M^TM으로 면역화된 마우스는 항원보강제 없이 10㎍ BV2373으로 면역화된 마우스에 비해 유의하게(p ≤ 0.05 및 p ≤ 0.0001) 더 높은 항-S IgG 역가를 가졌다(도 13a). 이러한 결과는 MATRIX-M^TM 항원보강제가 제공하는 10-100배 투여량 절약 가능성을 나타낸다. 또한, BV2373 및 MATRIX-M^TM의 2회 투여량에 의한 면역화는 모든 투여량 수준에서 S-단백질(IC50 = 218 - 1642)에 대한 hACE2 수용체 결합을 차단하고 Vero E6 세포에 대한 SARS-CoV-2의 세포변성 효과(CPE)를 중화시키는(CPE의 100% 차단 = 7680 - 20,000) 고역가 항체를 유도하였다(도 14 및 도 15).

SARS CoV-2 면역성 검사

보호 면역의 유도를 평가하기 위해, 면역화된 마우스를 SARS-CoV-2로 면역성검사하였다. 마우스는 야생형 SARS-CoV-2 바이러스의 복제를 지원하지 않기 때문에 초기 백신 접종 후 52일째에, 마우스를 hACE2(Ad/hACE2)를 발현하는 아데노바이러스로 비강 내 감염시켜 허용 가능하게(permissive) 만들었다. 마우스에 1.5 x 10⁵ pfu의 SARS-CoV-2를 콧구멍 사이에 나누어 50μL로 비강 접종하였다. 면역성 검사된 마우스의 체중을 감염 당일 및 감염 후 최대 7일 동안 매일 칭량하였다. 감염 4일 및 7일 후, 각 백신 및 대조군에서 5마리의 마우스를 희생시키고, 폐를 채취하여 폐 조직학을 위해 준비하였다.

바이러스 역가는 플라크 분석에 의해 정량화되었다. 간략하게, 수확된 폐는 1.0mm 유리 비드(Sigma Aldrich) 및 비드럽터(Beadruptor)(Omini International Inc.)를 사용하여 PBS에서 균질화되었다. 균질물은 융합 배양물 근처의 Vero E6에 첨가되었고 SARS-CoV-2 바이러스 역가는 6점 희석 곡선을 사용하여 플라크 형성 단위(pfu)를 계산하여 결정되었다.

감염 4일 후, 위약 처리된 마우스는 10⁴ SARS-CoV-2 pfu/lung를 갖는 반면, MATRIX-M^TM 없이 BV2363으로 면역화된 마우스는 10³ pfu/lung를 가졌다(도 16). MATRIX-M^TM 프라임 전용 마우스 그룹이 있는 BV2373은 바이러스 역가에서 투여량 의존적 감소를 나타냈으며, 10㎍ BV2373 투여량의 수용자는 감염 후 4일째에 검출 가능한 바이러스가 없었다. 1㎍, 0.1㎍ 및 0.01㎍ BV2373 투여량을 받은 마우스는 모두 위약 백신을 접종한 마우스와 비교하여 역가의 현저한 감소를 보여주었다. 프라임/부스트 그룹에서, 10㎍, 1㎍ 및 0.1㎍ 투여량으로 면역화된 마우스는 거의 검출할 수 없는 폐 바이러스 부하를 가졌던 반면, 0.01㎍ 그룹은 위약 동물에 비해 1 log 감소의 감소를 나타냈다.

체중 감소는 바이러스 부하 결과와 유사하였다. BV2373(0.1㎍, 1㎍ 및 10㎍) 및 MATRIX-M^TM의 단일 투여량을 투여받은 동물은 백신 접종되지 않은 위약 동물과 비교하여 체중 감소로부터 현저한 보호를 나타냈다(도 17a). 항원보강제와 함께 프라임 및 부스트 투여량을 받은 마우스는 또한 모든 투여량 수준에서 체중 감소에 대해 상당한 보호를 나타냈다(도 17b-c). 체중 감소에 대한 보호에 대한 항원보강제의 존재 효과를 평가하였다. 프라임/부스트(2회 투여량)와 항원보강제를 투여받은 마우스는 위약에 비해 체중 감소로부터 유의하게 보호된 반면, 항원보강제 없이 면역화된 그룹은 그렇지 않았다(도 17c). 이러한 결과는 BV2373이 SARS-CoV-2에 대한 보호를 제공하고 낮은 혈청학적 반응과 관련된 낮은 투여량의 백신이 체중 감소를 악화시키거나 과장된 질환을 나타내지 않는다는 것을 보여주었다.

폐 조직병리학을 감염 후 4일 및 7일에 평가하였다(도 18a 및 도 18b). 감염 후 4일째에, 위약-면역된 마우스는 혼합 염증 세포 집단으로 둘러싸인 폐포 중격의 비후와 함께 큰 기도에서 상피 세포의 박리를 나타냈다. 주로 호중구와 대식세포로 이루어진 염증 세포와 함께 폐 전체에서 동맥주위 커핑이 관찰되었다. 감염 후 7일까지, 위약 처리된 마우스는 증가된 동맥주위 커핑과 함께 기관지주위 염증을 나타냈다. 두꺼워진 폐포 중격은 폐포 중격 전체에 걸쳐 증가된 확산 간질 염증과 함께 남아 있었다(도 18b).

BV2373 면역화된 마우스는 투여량 의존적 방식으로 감염 후 4일 및 7일 모두에서 폐 병변의 유의한 감소를 나타내었다. 주요 단독 그룹은 위약 마우스와 비교하여 기관지 및 세동맥 주변의 염증 감소와 함께 10㎍ 및 1㎍ 투여량에서 감소된 염증을 나타낸다. 프라임 전용 그룹의 더 낮은 투여량에서, 폐 염증은 위약 그룹과 유사하며 체중 감소 및 폐 바이러스 역가와 관련이 있다. 프라임/부스트 면역화된 그룹은 시험된 모든 투여량에 대해 폐 염증의 상당한 감소를 나타내었고, 이는 다시 폐 바이러스 역가 및 체중 감소 데이터와 상관관계가 있다. 4일과 7일에 크고 작은 기관지의 상피 세포는 최소한의 세기관지 박리 및 바이러스 감염 징후로 실질적으로 보존되었다. 10㎍, 1㎍ 및 0.1㎍ 투여량으로 면역화된 동물의 세동맥은 위약과 유사하게 0.01㎍ 투여량으로 볼 수 있는 중간 정도의 커핑과 함께 최소한의 염증을 나타낸다. 폐포 염증은 염증과 관련된 더 낮은 0.01㎍ 투여량으로 더 높은 투여량을 받은 동물에서 감소되었다(도 18a-18b). 이들 데이터는 BV2373이 면역성 검사 후 폐 염증을 감소시키고 검출 가능한 중화 활성을 최소화하거나 전혀 유발하지 않는 BV2373의 투여량 및 요법조차도 바이러스에 대한 염증 반응의 악화와 관련이 없음을 입증한다. 또한, 백신은 면역성 검사 받은 마우스에서 백신 관련 강화 호흡기 질환(VAERD)을 일으키지 않는다.

T 세포 반응

T 세포 반응에 대한 SEQ ID NO: 87의 CoV S 폴리펩타이드를 포함하는 백신 조성물의 효과를 평가하였다. BALB/c 마우스(그룹당 N = 6)는 21일 간격으로 2회 투여량으로 5㎍ MATRIX-M^TM와 함께 또는 없이 10㎍ BV2373으로 근육내 면역화시켰다. 2차 면역화 7일 후(연구일 28) 비장을 수집하였다. 백신을 접종하지 않은 그룹(N = 3)을 대조군으로 사용하였다.

항원-특이적 T 세포 반응은 ELISPOT^TM 효소 결합 면역흡착 분석법 및 두 번째 면역화(연구 28일) 후 7일에 수집된 비장으로부터의 세포내 사이토카인 염색(ICCS)에 의해 측정되었다. 생체 외 자극 후 IFN-γ 분비 세포의 수는 ELISPOT^TM 분석에 의해 측정된 바와 같이 BV2373 단독에 비해 BV2373 및 MATRIX-M^TM으로 면역화된 마우스의 비장에서 20배(p = 0.002) 증가하였다(도 19). CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 개별적으로 조사하기 위해, ICCS 분석을 표면 마커 염색과 함께 수행하였다. 표시된 데이터는 CD44hi CD62L - 효과기 메모리 T 세포 집단에 대해 게이팅된다. IFN-γ+, TNF-α+ 및 IL-2+ 사이토카인 분비 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도는 항원보강제 없이 면역화된 마우스와 비교하여 BV2373으로 면역화된 마우스의 비장에서 유의하게 더 높았다(p <0.0001)(도 20a-c 및 도 21a-c). 또한, 동시에 적어도 2개 또는 3개의 사이토카인을 생성하는 다기능 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도도 항원보강제의 부존재하에서 면역화된 마우스에 비해 BV2373/MATRIX-M^TM 면역화된 마우스의 비장에서 유의하게 증가하였다(p <0.0001)(도 20d-e 및 도 21d-e). BV2373/MATRIX-M^TM에 의한 면역화는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단 내에서 더 높은 비율의 다기능 표현형(예를 들어, IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 중 하나 이상을 분비하는 T 세포)을 초래하였다. 기억 CD4+ T 세포에서 검출된 다기능 표현형의 비율은 CD8+ T 세포에서보다 높았다(도 22).

CD4+ T 세포로부터의 유형 2 사이토카인 IL-4 및 IL-5 분비도 각각 ICCS 및 ELISPOT^TM에 의해 결정되었다. BV2373/MATRIX-M^TM에 의한 면역은 또한 BV2373 단독 면역과 비교하여 유형 2 사이토카인 IL-4 및 IL-5 분비(2배)를 증가시켰지만, 유형 1 사이토카인 생산의 증가(예를 들어, IFN-γ 증가 20배)보다는 더 적은 정도로 증가시켰다(도 23a-c). 이러한 결과는 MATRIX-M^TM 항원보강제의 투여가 CD4+ T 세포 발달을 Th1 반응 쪽으로 치우치게 함을 나타낸다.

배아 중심 형성에 대한 면역화의 효과는 비장에서 CD4+ T 여포 헬퍼(TFH) 세포 및 배아 중심(GC) B 세포의 빈도를 측정함으로써 평가하였다. MATRIX-M^TM 투여는 TFH 세포(CD4+ CXCR5+ PD-1+)의 빈도를 유의하게 증가시켰고(p=0.01), GC B 세포(CD19+GL7+CD95+)의 빈도도 비장에서 유의하게 증가시켰다(p=0.0002)(도 24a-b 및 도 25a-b).

실시예 3

올리브 개코원숭이에서 코로나바이러스 스파이크(S) 폴리펩타이드 나노입자 백신의 면역원성

개코원숭이에서 BV2373을 포함하는 백신 조성물의 면역원성을 평가하였다. 성체 올리브 개코원숭이는 투여량 범위(1㎍, 5㎍ 및 25㎍)의 BV2373과 21일 간격으로 2회 투여량으로 근육내(IM) 주사에 의해 투여된 50㎍ MATRIX-M^TM 항원보강제로 면역화되었다. 비인간 영장류에서 MATRIX-M^TM의 항원보강 활성을 평가하기 위해, 다른 동물 그룹을 MATRIX-M^TM 없이 25㎍의 BV2373으로 면역화하였다. 항-S 단백질 IgG 역가는 모든 투여량 수준(GMT = 1249-19,000)에 걸쳐 BV2373/MATRIX-M^TM으로 면역화된 동물에서 단일 프라이밍 면역화의 21일 이내에 검출되었다. 항-S 단백질 IgG 역가는 모든 투여량 수준에 걸쳐 추가 면역화(28일 및 35일) 후 1 내지 2주 이내에 log(GMT = 33,000-174,000)에 걸쳐 증가하였다(도 26a).

낮은 수준의 hACE2 수용체 차단 항체가 BV2373(5㎍ 또는 25㎍) 및 MATRIX-M^TM(GMT = 22-37)을 사용한 단일 면역화 후 동물에서 검출되었다. 수용체 차단 항체 역가는 BV2373/MATRIX-M^TM(GMT = 150-600)으로 면역화된 모든 그룹에 걸쳐 추가 면역화의 1 내지 2주 내에 유의하게 증가하였다(도 26b). 바이러스 중화 항체는 BV2373/MATRIX-M^TM으로 단일 면역화한 후 모든 투여량 그룹에 걸쳐 증가되었다(GMT = 190-446). 25㎍ BV2373 단독으로 면역화된 동물은 hACE2에 대한 S-단백질 결합을 차단하는 검출가능한 항체를 갖지 않았다(도 26c). 중화 역가는 추가 접종 후 1주일에 6배 내지 8배 증가하였다(GMT = 1160-3846). 중화 역가는 2차 면역화(GMT = 6400-17,000) 후 추가로 25배 내지 38배 증가하였다(도 26c). 항-S IgG 수준과 중화 항체 역가 사이에는 상당한 상관관계(p<0.0001)가 있었다(도 27). 비인간 영장류에서 항원보강된 백신의 면역원성은 실시예 2의 결과와 일치하며 중화 항체의 생성 및 투여량 절약을 촉진하는 MATRIX-M^TM의 역할을 추가로 뒷받침한다.

2차 면역화 7일 후(28일째) PBMC를 수집하고, T 세포 반응을 ELISPOT 분석에 의해 측정하였다. BV2373(5㎍ 또는 25㎍) 및 MATRIX-M^TM으로 면역화된 동물의 PBMC는 가낭 높은 수의 IFN-γ 분비 세포를 가졌으며, 이는 25㎍ BV2373 단독 또는 BV2373(1㎍) 및 MATRIX-M^TM에 의해 면역화된 동물과 비교하여 5배 더 컸다(도 28). ICCS 분석에 따르면, BV2373(5㎍) 및 MATRIX-M^TM에 의한 면역화는 IFN-γ+, IL-2+ 및 TNF-α+ CD4+ T 세포의 가장 높은 빈도를 나타내었다(도 29a-c). 이러한 경향은 또한 적어도 2개 또는 3개의 유형 1 사이토카인이 동시에 생성된 다기능 CD4+ T 세포에 대해 사실이었다(도 29d-e).

실시예 4.

코로나바이러스 스파이크(S) 폴리펩티드 나노입자 백신의 구조적 특징화

투과 전자 현미경(TEM) 및 2차원(2D) 클래스 평균을 사용하여 BV2373의 미세구조를 결정하였다. 음성으로 염색된 BV2373의 고배율(67,000x 및 100,000x) TEM 이미지는 S-단백질 동종삼량체에 해당하는 입자를 보여주었다.

자동화된 선택 프로토콜을 사용하여 2D 클래스 평균 이미지를 구성하였다(Lander G.C. et al. J Struct Biol. 166, 95-102 (2009); Sorzano C.O. et al., J Struct Biol. 148, 194-204 (2004.)). 동종삼량체 구조의 2D 클래스 평균화의 두 라운드는 길이가 15nm이고 너비가 13nm인 삼각형 입자 모양을 나타냈다(도 10, 왼쪽 상단). 최근 해결된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(EMD ID: 21374)의 cryoEM 구조를 2D BV2373 이미지 위에 오버레이하면 왕관 모양의 S1(NTD 및 RBD) 및 S2 줄기와 잘 일치함을 나타내었다(도 10, 왼쪽 하단). 또한 2D 이미지에서 명백한 것은 NTD/RBD 크라운 반대쪽의 삼량체 구조의 끝에서 돌출된 희미한 돌출이었다(도 10, 오른쪽 상단). 더 큰 상자 크기를 사용한 2D 클래스 평균은 이러한 희미한 투영이 S-삼량체와 비정질 구조 사이의 연결을 형성함을 보여주었다.(도 10, 오른쪽 하단).

동적 광산란(DLS)은 야생형 CoV S 단백질이 BV2365(33.4nm) 및 BV2373(27.2nm)의 2배 더 작은 입자 크기와 비교하여 69.53nm의 Z-평균 입자 직경을 가짐을 보여준다. 다분산 지수(PDI)는 BV2365 및 BV2373 입자가 야생형 스파이크-단백질(PDI = 0.46)과 비교하여 크기, 모양 및 질량(PDI = 0.25-0.29)이 일반적으로 균일함을 나타내었다(표 3).

[표 3]

SARS-CoV-2 삼량체 스파이크 단백질의 입자 크기 및 열안정성

S-삼량체의 열 안정성은 시차 주사 열량계(DSC)에 의해 결정하였다. 야생형 CoV S-단백질의 열전이 온도(T_max = 58.6℃)는 각각 T_max = 61.3℃ 및 60.4℃로 BV2365 및 BV2373과 유사하였다(표 3). 더 중요한 것은 WT 스파이크 단백질을 펼치는 데 필요한 더 낮은 엔탈피(ΔHcal = 153kJ/mol)와 비교하여 BV2365 및 BV2373 변이체를 펼치는 데 필요한 전이 엔탈피의 3-5배 증가이었다(각각 ΔHcal = 466 및 732kJ/mol). 이러한 결과는 WT 스파이크 단백질의 열 안정성과 비교하여 BV2365 및 BV2373의 개선된 열 안정성과 일치한다(표 3).

CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드 나노입자 백신의 안정성을 동적 광 산란에 의해 평가하였다. 다양한 pH, 온도, 염 농도 및 프로테아제를 사용하여 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드 나노입자 백신의 안정성을 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드를 함유하는 나노입자 백신과 비교하였다.

실시예 5.

코로나바이러스 스파이크(S) 폴리펩타이드 나노입자 백신의 안정성

CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드 나노입자 백신의 안정성을 동적 광 산란에 의해 평가하였다. 다양한 pH, 온도, 염 농도 및 프로테아제를 사용하여 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드 나노입자 백신의 안정성을 천연 CoV 스파이크(S) 폴리펩타이드를 함유하는 나노입자 백신과 비교하였다. 2-프롤린 치환이 없는 BV2365 및 2개의 프롤린 치환이 있는 BV2373의 안정성은 hACE2 포획 ELISA를 사용하여 다양한 환경 스트레스 조건에서 평가되었다. 극한의 pH(pH 4 및 pH 9에서 48시간), 장기간 교반(48시간), 동결/해동(2 주기) 및 승온(25℃ 및 37℃에서 48시간)에서 BV2373의 배양은 hACE2 수용체 결합에 영향을 미치지 않았다(IC50 = 14.0 - 18.3ng mL-1).

과산화수소에 의한 산화 조건은 BV2373에 대한 hACE2 결합의 결합을 8배 감소시켰다(IC50 = 120ng mL-1)(도 12a). 2-프롤린 치환이 없는 BV2365는 다중 조건 하에서 hACE2 결합의 상당한 손실에 의해 결정되는 바와 같이 덜 안정하였다(도 12b).

BV2384(SEQ ID NO: 110) 및 BV2373(SEQ ID NO: 87)의 안정성을 비교하였다. BV2384는 GSAS의 푸린 절단 부위 서열(SEQ ID NO: 97)을 갖는 반면, BV2373은 QQAQ(SEQ ID NO: 7)의 푸린 절단 부위를 갖는다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 입증된 바와 같이, BV2384는 BV2373과 비교하여 광범위한 분해를 나타냈다(도 32). 또한, 주사 농도계 및 회수 데이터는 BV2373(도 34)과 비교하여 전체 길이 CoV S 단백질 BV2384의 예상치 못한 손실, 더 낮은 순도 및 회수(도 33)를 보여준다.

실시예 6

시노몰구스 원숭이의 면역 반응

본 발명자들은 SARS-CoV-2 감염의 시노몰구스 원숭이 모델에서 BV2373에 의해 유도된 면역 반응을 평가하였다. 그룹 1-6은 표 4에 표시된 대로 처리되었다.

[표 4]

시노몰구스 원숭이 연구의 그룹 1-6

BV2373을 포함하는 백신의 투여는 중화 항체(도 35b)를 포함하는 항-CoV-S 항체(도 35a)의 유도를 초래하였다. 항-CoV-S 항체는 BV2373의 1회 투여량(도 38a) 또는 2회 투여량(도 38b)의 투여 후에 유도되었다. BV2373을 포함하는 백신의 투여는 또한 hACE2에 대한 CoV S 단백질의 결합을 차단하는 항체의 생성을 초래하였다(도 38c 및 도 38d). BV2373 투여 후 시노몰구스 원숭이에서 항-CoV S 폴리펩타이드 IgG 역가와 hACE2 억제 역가 사이에 상당한 상관관계가 있었다(도 38e). 중화 항체의 생산을 유도하는 BV2373의 능력은 세포변성 효과(CPE)(도 40a) 및 플라크 감소 중화 테스트(PRNT)(도 40b)에 의해 평가되었다. 데이터는 표 4의 백신 제제가 대조군과 대조적으로 SARS-CoV-2 중화 역가를 생성함을 나타내었다.

항-CoV-S 항체를 유도하는 BV2373의 능력 및 시노몰구스 원숭이에서 CoV S 단백질에 대한 hACE2의 결합을 차단하는 항체를 포함하는 백신을 인간 회복기 혈청과 비교하였다. 데이터는 BV2373 백신 제제가 인간 회복기 혈청과 비교하여 우수한 항-CoV S 폴리펩타이드 및 hACE2 억제 역가를 유도함을 나타내었다(도 39).

BV2373 백신 제제는 또한 SARS-CoV-2 바이러스 복제의 감소를 야기하였다(도 36a-b). 바이러스 RNA(도 36a, 존재하는 총 RNA에 해당) 및 바이러스 서브게놈 RNA(sgRNA)(도 36b, 복제 바이러스에 해당) 수준을 감염성 바이러스에 의한 면역섬 검사 2일 및 4일(d2pi 및 d4pi) 후에 세기관지 세척(BAL)에서 평가하였다. 대부분의 대상은 바이러스 RNA를 나타내지 않았다. 2일째에, 일부 대상에서 소량의 RNA가 측정되었다. 4일째에, 2.5㎍의 가장 낮은 투여량에서 2명의 대상을 제외하고는 RNA가 측정되지 않았다. 서브게놈 RNA는 1명의 대상을 제외하고 2일 또는 4일에서 검출되지 않았고, 다시 최저 용량에서 검출되었다. 바이러스 RNA(도 37a) 및 바이러스 서브게놈(sg) RNA(도 37b)를 감염 후 2일 및 4일(d2pi 및 d4pi) 후에 비강 면봉으로 평가하였다. 대부분의 대상은 바이러스 RNA를 나타내지 않았다. 2일 및 4일에 일부 대상에서 소량의 RNA가 측정되었다. 2일 또는 4일에 서브게놈 RNA가 검출되지 않았다. 대상은 0일 및 0일과 21일에 2회 투여량으로 그룹에서 면역화되었다. 이 데이터는 백신이 코 총 바이러스 RNA를 100 - 1000배 감소시키고 sgRNA를 검출할 수 없는 수준으로 감소시키고 백신에 대한 면역 반응이 바이러스 복제를 차단하고 바이러스 확산을 방지할 것임을 확인시킨다.

실시예 7

인간에서 CoV S 폴리펩타이드 나노입자 백신의 평가

본 발명자들은 18-59세의 건강한 참가자 131명을 대상으로 무작위, 관찰자 맹검, 위약 대조 1상 임상 테스트에서 BV2373을 포함하는 백신의 안전성과 효능을 평가하였다. 참가자들은 21일 간격으로 2회의 근육 주사로 면역화되었다. 참가자들은 MATRIX-M^TM(n=106) 또는 위약(n=25)이 있거나 없는 BV2373을 받았다. 그룹 A-E는 표 5에 표시된 대로 처리되었다. 도 41은 임상 종점 평가의 타임라인을 보여준다.

[표 5]

1상 인간 연구의 그룹 A-E

전반적인 반응원성은 온화했고 백신 접종은 잘 견뎠다. 국소 반응원성은 BV2373 및 MATRIX-M^TM으로 치료받은 환자에서 더 빈번하였다(도 42a-b).

MATRIX-M^TM이 있거나 없는 BV2373의 면역원성을 평가하였다. 백신 접종 21일 후, 항-CoV-S 항체가 모든 백신 요법에서 검출되었다(도 43a). MATRIX-M^TM을 포함하는 백신 요법에서 기하 평균 배수 증가(GMFR)는 비항원보강 BV2373에 의해 유도된 것을 초과하였다. 두 번째 백신 접종 후 7일(28일)에, 항-CoV-S 역가는 첫 번째 백신 접종보다 8배 증가했으며 14일 이내에(35일) 반응이 다시 두 배 이상 증가하여 GMFR이 BV2373 단독으로 관찰된 것에 비해 약 100배 도달하였다. BV2373/MATRIX-M^TM에 의한 단일 백신 접종은 무증상(노출된) COVID-19 환자와 유사한 항-CoV-S 역가 수준을 달성하였다. 두 번째 백신 접종은 외래 치료를 받은 COVID-19 환자의 회복기 혈청을 6배 초과한 GMEU 수준을 달성하였고, COVID 19로 입원한 환자의 회복기 혈청과 유사한 수준을 달성하였고, 전체 회복기 혈청 항-CoV-S 항체를 거의 6배 초과하였다. 2회 투여량 5㎍ 및 25㎍ BV2373/MATRIX-M^TM 요법의 반응은 유사하였다. 이것은 투여량 절약을 가능하게 하는 항원보강제(MATRIX-MTM)의 능력을 강조한다.

중화 항체는 BV2373으로 처리된 모든 그룹에서 유도되었다(도 43b). BV2373 및 MATRIX-M^TM 요법으로 처리된 그룹은 BV2373 단독으로 처리된 그룹보다 대략 5배의 GMFR을 나타내었다(도 43b). 항원보강제에 의한 두 번째 백신 접종은 항체 역가를 중화하는 데 중대한 영향을 미쳐서 항원보강제가 없는 단일 백신 접종에 비해 >100배 증가를 유도하였다. BV2373/MATRIX-M^TM에 의한 두 번째 백신 접종은 회복기 혈청과 비교했을 때 외래 치료를 받은 COVID-19 환자보다 4배 더 높은 GMT 수준을 달성했으며, 이는 COVID-19로 입원한 환자의 수준에 걸쳐 있었고 전체 회복기 혈청 GMT를 4배 초과하였다.

치료가 필요한 임상 증상이 있는 COVID-19 환자로부터 얻은 회복기 혈청은 질환 중증도에 따라 증가하는 비례적인 항-CoV-S IgG 및 중화 역가를 나타내었다(도 43a-b).

회복기 혈청으로 치료된 환자(r= 0.958)(도 44a)에서 관찰된 것과 유사한 BV2373 및 MATRIX-M^TM으로 치료된 환자(r=0.9466, 도 44c)에서 중화 항체 역가와 항-CoV-S IgG 사이에 강한 상관관계가 관찰되었다. 이러한 상관관계는 항원보강되지 않은 BV2373(r=0.7616)을 투여받은 대상에서 관찰되지 않았다(도 44b). 5㎍ 및 25㎍ BV2373/MATRIX-M^TM 그룹(표 5의 그룹 C-E)은 유사한 크기의 2회 투여량 반응을 보여주었고 모든 참가자는 2회 투여량 요법을 사용할 때 두 가지 분석 측정 중 하나를 사용하여 혈청 전환되었다.

16명의 참가자(그룹 A부터 D까지 각각 4명의 참가자)의 T 세포 반응은 BV2373/MATRIX-M^TM 요법이 BV2373으로 자극시 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α 생산의 면에서 항원-특이적 다기능성 CD4+ T-세포 반응을 유도하였다. Th1 사이토카인의 생산에 대한 강한 편향이 있었다(도 45a-d).

실시예 8

차세대 CoV S 폴리펩타이드 나노입자의 발현, 정제 및 평가

SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, 또는 SEQ ID NO: 115의 아미노산 서열을 갖는 CoV S 폴리펩타이드는 바큘로바이러스 발현 시스템에서 발현되고 코로나바이러스 스파이크 (S) 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 플라크가 선택되고 확인된다. SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, 및 SEQ ID NO: 115의 서열을 갖는 CoV S 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 N-말단 신호 펩타이드를 사용하여 발현된다.

SEQ ID NO: 112의 서열을 갖는 CoV S 폴리펩타이드는 Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 QQAQ(SEQ ID NO: 7)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화된 푸린 절단 부위를 포함한다.

SEQ ID NO: 113의 서열을 갖는 CoV S 폴리펩타이드는 Asp-601의 글리신으로의 돌연변이, Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 QQAQ(SEQ ID NO: 7)의 불활성화된 푸린 절단을 포함한다.

SEQ ID NO: 114의 서열을 갖는 CoV S 폴리펩타이드는 아미노산 56, 57, 및 131의 결실, Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Ala-557의 아스파르테이트로의 돌연변이, Asp-601의 글리신으로의 돌연변이, Pro-668의 히스티딘으로의 돌연변이, Thr-703의 아이소류신으로의 돌연변이, Ser-969의 알라닌으로의 돌연변이, Asp-1105의 히스티딘으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974의 프롤린으로의 돌연변이, 및 QQAQ(SEQ ID NO: 7)의 아미노산 서열을 갖는 불활성화 푸린 절단 부위를 포함한다.

SEQ ID NO: 115의 서열을 갖는 CoV S 폴리펩타이드는 Asn-488의 티로신으로의 돌연변이, Asp-67의 알라닌으로의 돌연변이, Leu-229의 히스티딘으로의 돌연변이, Asp-202의 글리신으로의 돌연변이, 돌연변이 Lys-404에서 아스파라긴으로의 돌연변이, Glu-471에서 라이신으로의 돌연변이, Ala-688에서 발린으로의 돌연변이, Asp-601에서 글리신으로의 돌연변이, Lys-973 및 Val-974에서 프롤린으로의 돌연변이, 및 QQAQ의 아미노산 서열을 갖는 불활성화 푸린 절단 부위를 포함한다.

CoV S 폴리펩타이드 나노입자는 실시예 1에서와 같이 생성된다. SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, 및 SEQ ID NO: 113 및 SEQ ID NO: 115의 아미노산 서열을 갖는 CoV S 폴리펩타이드의 안정성 및 면역원성은 실시예 2-7에서와 같이 평가된다.

번호를 매긴 실시태양

1. 다음을 포함하는 면역원성 조성물:

(i) SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 갖는 코로나바이러스 S(CoV S) 당단백질, 및 비이온성 세제 코어를 포함하는 나노입자;

(ii) 약학적으로 허용 가능한 완충제, 및

(iii) 사포닌 항원보강제.

2. 실시태양 1에 있어서,

약 5㎍ 내지 약 25㎍의 CoV S 당단백질을 포함하는 면역원성 조성물.

3. 실시태양 2에 있어서,

약 5㎍의 CoV S 당단백질을 포함하는 면역원성 조성물.

4. 실시태양 1에 있어서,

사포닌 항원보강제는 적어도 2개 iscom 입자를 포함하고, 여기서:

제 1 iscom 입자는 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 C가 아닌 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 A를 포함하며; 및

제 2 iscom 입자는 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 A가 아닌 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 C를 포함하는 것인 면역원성 조성물.

5. 실시태양 4에 있어서,

퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A는 항원보강제에서 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C의 전체 중량의 50-96중량%를 차지하고 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C는 항원보강제에서 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C의 전체 중량의 나머지를 차지하는 것인 면역원성 조성물.

6. 실시태양 4에 있어서,

퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C는 각각 항원보강제에서 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C의 전체 중량의 약 85중량% 및 약 15중량%를 차지하는 것인 면역원성 조성물.

7. 실시태양 1에 있어서,

약 50㎍의 사포닌 항원보강제를 포함하는 면역원성 조성물.

8. 실시태양 1에 있어서,

비이온성 세제 코어는 폴리소르베이트-20(PS20), 폴리소르베이트-40(PS40), 폴리소르베이트-60(PS60), 폴리소르베이트-65(PS65) 및 폴리소르베이트-80(PS80)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.

9. 실시태양 1의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하여 대상에서 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 자극하는 방법.

10. 실시태양 9에 있어서,

약 5㎍ 내지 약 25㎍의 CoV S 당단백질을 포함하는 방법.

11. 실시태양 10에 있어서,

5㎍의 CoV S 당단백질을 포함하는 방법.

12. 실시태양 9에 있어서,

사포닌 항원보강제는 적어도 2개 iscom 입자를 포함하고, 여기서:

제 1 iscom 입자는 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 C가 아닌 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 A를 포함하며; 및

제 2 iscom 입자는 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 A가 아닌 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 C를 포함하는 것인 방법.

13. 실시태양 12에 있어서,

퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A는 항원보강제에서 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C의 전체 중량의 50-96중량%를 차지하고 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C는 항원보강제에서 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C의 전체 중량의 나머지를 차지하는 것인 방법.

14. 실시태양 12에 있어서,

퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C는 각각 항원보강제에서 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C의 전체 중량의 약 85중량% 및 약 15중량%를 차지하는 것인 방법.

15. 실시태양 9에 있어서,

약 50㎍의 사포닌 항원보강제를 포함하는 방법.

16. 실시태양 9에 있어서,

비이온성 세제 코어는 폴리소르베이트-20(PS20), 폴리소르베이트-40(PS40), 폴리소르베이트-60(PS60), 폴리소르베이트-65(PS65) 및 폴리소르베이트-80(PS80)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.

17. 실시태양 9에 있어서,

대상은 0일에 제 1 투여량을 투여받고 21일에 부스트 투여량을 투여받는 것인 방법.

18. 실시태양 9에 있어서,

단일 투여량의 면역원성 조성물이 투여되는 것인 방법.

19. 실시태양 9에 있어서,

제 1 면역원성 조성물과 상이한 제 2 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.

20. 실시태양 19에 있어서,

제 2 면역원성 조성물은 SARS-Cov-2 스파이크 당단백질을 암호화하는 mRNA, SARS-Cov-2 스파이크 당단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA, SARS-Cov-2 스파이크 당단백질을 암호화하는 바이러스 벡터 또는 불활성화된 SARS-CoV-2 바이러스를 포함하는 것인 방법.

본 명세서에 인용된 모든 참고문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 포함된다. 그러나, 본 명세서에 인용된 참고 문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허 출원에 대한 언급은 그들이 유효한 선행 기술을 구성하거나 세계 어느 나라의 일반적인 지식의 일부를 구성한다는 승인 또는 제안 형식이 아니며 그렇게 받아들여서도 안 된다.

Claims (57)

1. 다음을 포함하는 코로나바이러스(CoV) 스파이크(S) 당단백질:
   (i) 불활성화된 푸린 절단 부위를 갖는 S1 서브유닛, 여기서 S1 서브유닛은 N-말단 도메인(NTD), 수용체 결합 도메인(RBD), 서브도메인 1 및 2(SD1/2)를 포함하고, 여기서 불활성화된 푸린 절단 부위는 QQAQ의 아미노산 서열을 갖는다;
   여기서 NTD는
   (a) 아미노산 56, 57, 131, 132, 229, 230, 231 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 결실; 및
   (b) 아미노산 67, 229, 202, 139, 5, 233, 7, 13, 125, 177 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 임의로 포함한다;
   여기서 RBD는 아미노산 488, 404, 471, 439, 426, 440, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 돌연변이를 임의로 포함하고;
   여기서 SD1/2 도메인은 601, 557, 668, 642, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 돌연변이를 임의로 포함한다; 및
   (ii) S2 서브유닛, 여기서 아미노산 973 및 974가 프롤린이고,
   여기서 S2 서브유닛은
   (a) 676-702, 702-711, 775-793, 806-815 및 이들의 조합에서 하나 이상의 아미노산의 결실;
   (b) 703, 1105, 688, 969, 및 1014 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산의 돌연변이; 및
   (c) TMCT로부터 하나 이상의 아미노산의 결실로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 임의로 포함한다.
2. 제 1 항에 있어서,
   아미노산 676-685의 결실을 포함하는 코로나바이러스 S 당단백질.
3. 제 1 항에 있어서,
   아미노산 702-711의 결실을 포함하는 코로나바이러스 S 당단백질.
4. 제 1 항에 있어서,
   아미노산 806-815의 결실을 포함하는 코로나바이러스 S 당단백질.
5. 제 1 항에 있어서,
   아미노산 775-793의 결실을 포함하는 코로나바이러스 S 당단백질.
6. 제 1 항에 있어서,
   NTD의 아미노산 1-292의 결실을 포함하는 코로나바이러스 S 당단백질.
7. 제 1 항에 있어서,
   막관통 및 세포질 꼬리(TMCT)의 아미노산 1201-1260의 결실을 포함하는 코로나바이러스 S 당단백질.
8. 제 1 항에 있어서,
   SEQ ID NOS: 85-89, 105, 106, 및 112-115로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 코로나바이러스 S 당단백질.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
   신호 펩타이드를 포함하고, 임의로 신호 펩타이드는 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 117의 아미노산 서열을 포함하는 것인 코로나바이러스 S 당단백질.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    C-말단 융합 단백질을 포함하는 코로나바이러스 S 당단백질.
11. 제 10 항에 있어서,
    C-말단 융합 단백질은 헥사히스티딘 태그인 코로나바이러스 S 당단백질.
12. 제 10 항에 있어서,
    C-말단 융합 단백질은 폴돈인 코로나바이러스 S 당단백질.
13. 제 12 항에 있어서,
    폴돈은 SEQ ID NO: 68에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것인 코로나바이러스 S 당단백질.
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ΔHcal은 야생형 CoV S 당단백질(SEQ ID NO: 2)의 ΔHcal보다 적어도 2배 더 큰 코로나바이러스 S 당단백질.
15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    S2 서브유닛, NTD, RBD 및 SD1/2는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 CoV S 당단백질의 상응하는 서브유닛 또는 도메인과 95% 동일한 것인 코로나바이러스 S 당단백질.
16. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    S2 서브유닛, NTD, RBD 및 SD1/2는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 CoV S 당단백질의 상응하는 서브유닛 또는 도메인과 97% 동일한 것인 코로나바이러스 S 당단백질.
17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    S2 서브유닛, NTD, RBD 및 SD1/2는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 CoV S 당단백질의 상응하는 서브유닛 또는 도메인과 99% 동일한 것인 코로나바이러스 S 당단백질.
18. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    S2 서브유닛, NTD, RBD 및 SD1/2는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 CoV S 당단백질의 상응하는 서브유닛 또는 도메인과 99.5% 동일한 것인 코로나바이러스 S 당단백질.
19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 S 당단백질을 암호화하는 분리된 핵산.
20. 제 19 항의 핵산을 포함하는 벡터.
21. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 코로나바이러스 S 당단백질을 포함하는 나노입자.
22. 제 21 항에 있어서,
    나노입자는 약 20nm 내지 약 35nm의 Zavg 직경을 갖는 것인 나노입자.
23. 제 21 항에 있어서,
    나노입자는 약 0.2 내지 약 0.45의 다분산 지수를 갖는 것인 나노입자.
24. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 코로나바이러스 S 당단백질을 발현하는 세포.
25. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 코로나바이러스 S 당단백질 및 약학적으로 허용 가능한 완충액을 포함하는 백신 조성물.
26. 제 25 항에 있어서,
    항원보강제를 포함하는 백신 조성물.
27. 제 26 항에 있어서,
    사포닌 항원보강제는 적어도 2개 iscom 입자를 포함하고, 여기서:
    제 1 iscom 입자는 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 C가 아닌 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 A를 포함하며; 및
    제 2 iscom 입자는 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 A가 아닌 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 C를 포함하는 것인 백신 조성물.
28. 제 27 항에 있어서,
    퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C는 각각 항원보강제에서 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C의 전체 중량의 약 92중량% 및 약 8중량%를 차지하는 것인 백신 조성물.
29. 제 26 항에 있어서,
    항원보강제는 약 50㎍의 투여량으로 투여되는 것인 백신 조성물.
30. 제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하여 대상에서 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 자극하는 방법.
31. 제 30 항에 있어서,
    대상은 0일에 제 1 투여량을 투여받고 21일에 부스트 투여량을 투여받는 것인 방법.
32. 제 30 항에 있어서,
    대상은 약 5㎍ 내지 약 25㎍의 코로나바이러스 S 당단백질을 투여받는 것인 방법.
33. 제 30 항에 있어서,
    대상은 약 5㎍의 코로나바이러스 S 당단백질을 투여받는 것인 방법.
34. 제 30 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 조성물은 근육내 투여되는 것인 방법.
35. 제 30 항, 제 32 항, 제 33 항 및 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 조성물의 단일 투여량이 투여되는 것인 방법.
36. 제 30 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다중 투여량의 백신 조성물이 투여되는 것인 방법.
37. 제 30 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 조성물은 인플루엔자 당단백질과 공동 투여되는 것인 방법.
38. 다음을 포함하는 면역원성 조성물:
    (i) SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 갖는 코로나바이러스 S(CoV S) 당단백질, 및 비이온성 세제 코어를 포함하는 나노입자;
    (ii) 약학적으로 허용 가능한 완충제, 및
    (iii) 사포닌 항원보강제.
39. 제 38 항에 있어서,
    약 5㎍ 내지 약 25㎍의 CoV S 당단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
40. 제 39 항에 있어서,
    약 5㎍의 CoV S 당단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
41. 제 38 항에 있어서,
    사포닌 항원보강제는 적어도 2개 iscom 입자를 포함하고, 여기서:
    제 1 iscom 입자는 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 C가 아닌 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 A를 포함하며; 및
    제 2 iscom 입자는 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 A가 아닌 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 C를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
42. 제 41 항에 있어서,
    퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A는 항원보강제에서 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C의 전체 중량의 50-96중량%를 차지하고 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C는 항원보강제에서 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C의 전체 중량의 나머지를 차지하는 것인 면역원성 조성물.
43. 제 41 항에 있어서,
    퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C는 각각 항원보강제에서 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C의 전체 중량의 약 85중량% 및 약 15중량%를 차지하는 것인 면역원성 조성물.
44. 제 38 항에 있어서,
    약 50㎍의 사포닌 항원보강제를 포함하는 면역원성 조성물.
45. 제 38 항에 있어서,
    비이온성 세제 코어는 폴리소르베이트-20(PS20), 폴리소르베이트-40(PS40), 폴리소르베이트-60(PS60), 폴리소르베이트-65(PS65) 및 폴리소르베이트-80(PS80)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
46. 제 38 항의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하여 대상에서 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 자극하는 방법.
47. 제 46 항에 있어서,
    약 5㎍ 내지 약 25㎍의 CoV S 당단백질을 포함하는 방법.
48. 제 47 항에 있어서,
    5㎍의 CoV S 당단백질을 포함하는 방법.
49. 제 46 항에 있어서,
    사포닌 항원보강제는 적어도 2개 iscom 입자를 포함하고, 여기서:
    제 1 iscom 입자는 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 C가 아닌 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 A를 포함하며; 및
    제 2 iscom 입자는 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 A가 아닌 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 분획 C를 포함하는 것인 방법.
50. 제 49 항에 있어서,
    퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A는 항원보강제에서 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C의 전체 중량의 50-96중량%를 차지하고 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C는 항원보강제에서 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C의 전체 중량의 나머지를 차지하는 것인 방법.
51. 제 49 항에 있어서,
    퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C는 각각 항원보강제에서 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 A 및 퀼라야 사포나리아 몰리나의 분획 C의 전체 중량의 약 85중량% 및 약 15중량%를 차지하는 것인 방법.
52. 제 46 항어서,
    약 50㎍의 사포닌 항원보강제를 포함하는 방법.
53. 제 46 항에 있어서,
    비이온성 세제 코어는 폴리소르베이트-20(PS20), 폴리소르베이트-40(PS40), 폴리소르베이트-60(PS60), 폴리소르베이트-65(PS65) 및 폴리소르베이트-80(PS80)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
54. 제 46 항에 있어서,
    대상은 0일에 제 1 투여량을 투여받고 21일에 부스트 투여량을 투여받는 것인 방법.
55. 제 46 항에 있어서,
    단일 투여량의 면역원성 조성물이 투여되는 것인 방법.
56. 제 46 항에 있어서,
    제 1 면역원성 조성물과 상이한 제 2 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
57. 제 56 항에 있어서,
    제 2 면역원성 조성물은 SARS-Cov-2 스파이크 당단백질을 암호화하는 mRNA, SARS-Cov-2 스파이크 당단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA, SARS-Cov-2 스파이크 당단백질을 암호화하는 바이러스 벡터 또는 불활성화된 SARS-CoV-2 바이러스를 포함하는 것인 방법.

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